Métabolisme du Tryptophane et cancer
Audrey Le GouëllecLaboratoire TIMC/TheREx UMR5525
Stratégie thérapeutique innovante
Tryptophane Kynurénine
Indoléamine 2,3 dioxygénase
Aliments riches en Trp
Trp/ LNAAs
LAT‐1
Tryptophane
Serotonine Kynurenine
ProtéinesIDO
TDO
95%
Melatonine
NAD+
Acide anthraniliqueAcide quinolinique
Hydroxykynurenine
1956
1998
2006
Cancer, Immunotolérance et métabolisme du Tryptophane
3
Mise en évidence de métabolites du Trp dans l’urine de patients atteints de cancer de la vessie Boyland et al. (PMID: 13373811)
Kynurenine, IDO et tolérance du fœtus chez la femme enceinte Munn et al. Science (PMID: 9712583)
Kynurenines, Immuno‐tolerance et progression du cancer Uyttenhove et al. Nature med. (PMID: 14502282) , Munn et al. (PMID: 1857253)
Lien mécanistique
Biomarqueurs cliniques et développement de nouvelles thérapies
Y. Suzuki et al. / Lung Cancer 67 (2010) 361–365Augmentation du ratio Kyn/Trp chez les patients atteints du cancer du poumon.
Et Hepatocarcinome (com. Personnelle P. Hainaut)
Mode d’action des métabolites de la voie
Austin et al. Drug Discov Today PMID: 25478733
Deproteinization
Samples are spiked with stable 13C‐labeled internal standard
Metabolites and internal standart (IS)
LC‐MS/MS Analysis
M M+n
IMIM+n
Absolute Quantification(M+n known)
Advantages:
Reduction of analysis errors (matrix effects) Improved linearity of calibration curves
Métabolomique ciblée quantitative de la voiedu Tryptophane
HPLCPhase inverse
ElectrosprayMass
spectrometry
R² = 0,999
0
50
100
150
0 100 200
R² = 0,9987
0
20
40
60
0 20 40 60
R² = 0,9971
0
20
40
60
0 20 40 60
R² = 0,999
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6
R² = 0,9908
0
20
40
60
0 20 40 60
R² = 0,9997
0
20
40
60
0 20 40 60
R² = 0,9994
0
1
2
3
4
5
0 1 2 3 4 5
Trp KYN Sero
5-HTP 3-HK
AK
3-HA AA
R² = 0,9980
0
20
40
60
0 20 40 60
Courbe de calibration: Linéarité de la méthode
12C
/13C
C (μM)
Répétabilité
Molécule Niveau du CQI Ecart‐type CV (%)
3HK60 nM 4 6
24 nM 1 6
13 nM 1 5
Kyn4 µM 0,2 6
1,9 µM 0,1 4
0,8 µM 0,03 4
5HTP50 nM 7 15
23 nM 2 11
11 nM 1 10
5‐HT4,3 µM 0,3 7
2 µM 0,1 5
1 µM 0,08 8
Trp150 µM 6 4
80 µM 2 3
30 µM 1 3
AK57 nM 3 6
24 nM 1 5
11 nM 0,7 6
AA58 nM 4 7
26 nM 1,6 6
12 nM 1,2 11
Limite de linéarité
Molécule LOD LOQLimite de linéarité haute
Valeurs normales
dans le sang (littérature)
3HK 0,88 nM 1,76 nM 90 nM 20‐30 nM
Kyn 67 nM 132 nM 4 µM 1‐2,5 µM
5HTP 5,11 nM 10,2 nM 110 nM 30‐50 nM
Séro 3,7 nM 4,5 nM 5 µM 500 nM‐1,7 µM
Trp 13 nM 32,5 nM 465 µM 40‐80 µM
AK 0,15 nM 0,45 nM 64 nM 30‐40 nM
3HA 11,6 nM 35 nM 74 nM 20‐30 nM
AA 0,05 nM 0,13 nM 65 nM 10‐20 nM
BacVacTM: Bacterial vaccine for active and specific immunotherapy
2 International patents UJF :EP 1 692 162 B1 et WO 2013/087667
MCCVaxTM : 1er candidat vaccin développé par APCure
POC CLARA 2014
BacVac et réponse mémoire
Memory marker at Day 90 on Ova CD8+ T cells in splenocytes
* p<0.05***p<0.001
Conclusions et Perspectives
Développement de l’immunothérapie active et spécifique: BacVac : Bactérie avec un métabolisme du Trp actif => Etude de l’impact de la
production de ces métabolites sur la polarisation de la réponse immune lorsde la vaccination BacVacTM.
Combinaison Immunothérapie active et spécifique et Inhibiteurs de l’IDO => Evaluation de l’efficacité du traitement.
Recherche de nouveaux modèles tumoraux à tester
Métabolomique ciblée et quantitative de la voie de catabolisme du Trp:
Validation de la méthode en plasma☐Validation de la méthode autres matrices en cours (LBA, Urine, LCR, …)☐Evaluation de l’intérêt du suivi de ces métabolites dans différentes pathologies: maladies neurodégénératives, infections chroniques, SAOS
VOIE TRP
CANCER
MÉTABic
CIBLEE
IMMUNITE
MERCI
Pr Bertrand ToussaintEt tous les autres TheRexiens …
Pr Benoit Polack
12
Pr Patrice FaureDr V. DucrosLysiane BouletJulien MonteremalCandice Trocme
TheRex Day Juillet 2014
Dr L. Buffat
ANR GEFLUC
Lavoué et al. J Transl Med. 2013 Jun 13;11:147
Pseudomonas aeruginosa
Pathogène opportuniste extracellulaire (intra?)
Infections aigues ou chroniques
« Intelligente » : >6000 gènes, régulations, furtivité
SST3 (injectisome) dédié à l’injection d’exotoxines ExoS, ExoT and ExoU dans les cellules de l’hôte
Le Gouellec et al. 2012
14
SST3‐ SST3 +100% bactéries tuées 100% PMNS tuésDacheux et al., J.Bact., 1999
Une histoire de 15 ans
Preuve de conceptHow does it work?
15
Cellulesanormales
Structure du SST3 de P.aeruginosa :une seringue moléculaire
Translocon
Aiguille
Base
PcrV
PscF
Effector or Toxins
16
De P. aeruginosa a BacVac®(bacterial vaccine)
17
De P. aeruginosa a BacVac®(bacterial vaccine)
18
Exos 1-54 Antigène d’intérêt
Preuve de concept avec un Xeno‐antigène modèle OVA
In vitro
DC activation Ag processing !and presentation
CD11c
IAb
Control BacVac - OVA
BacteriaSecretion Signal
OVA Ag
---
+++
+-+
++-
A B C
D‐14 D‐7
C57BL/6j7 weeks old
Epaulard et al. 2006Molecular Therapy
xOST S54‐OVAOSTΔBD S54‐OVA unable to translocate protein through T3SS OST S54‐GFP
OST S0‐OVA unable to secrete and translocate protein through T3SSPBS
Controls
!9
In vivo
Induction of Ag specific T cells Prophylactic Protection!against Tumor Challenge
SIINFEKL Tetramer
CD
8
A B C
Epaulard, Mol Ther 2006
19
Résultats‐ Chapitre3:Evaluationdelʼimmunitéanti‐vecteurpréexistante
SoutenancedeThèse_YanWANG_18/04/2012
‐3M ‐2M ‐ 14D/‐7D Day0Tumor challenge
Une immunité préexistente ne chage pas l’efficacité de BacVac
20
Groupe1:PBS‐PBS‐PBSGroupe2:OST‐OST‐OSTGroupe3:OST‐OST‐OST‐OVAGroupe4:OST‐OVA
Résultats‐ Chapitre3:Evaluationdelʼimmunitéanti‐vecteurpréexistante
21Une immunité préexistente ne chage pas l’efficacité de BacVac
Padre‐GP100Padre‐TRP2L
Résultats ‐ Chapitre 1 : Amélioration de lʼefficacité du vecteur bactérien
Vaccination avec antigènes naturels TRP2 & GP100 : Tumor associated antigens expressed by melanoma and glioblastoma cells
Mice model of glioblastoma (GL261 cells)
Wang et al., J. of Immunotherapy, 2012
6X
C57BL/6j TumorGL261
Therapeutic setting
22
Stratégies d’attenuation
1. Virulence genes deletion2. Photochemical treatment23
De la preuve de concept à
l’utilisation cliniqueThe decision to test live bacteria is a balancing actbetween benefits to patients and risks to patients and the environment « Theodore Friedman »
Strategies d’attenuation de la virulence de P. aeruginosa
CLIN1Adapted to chemicallydefined medium
and lasI
24
Killed But Metabollically Active (MMA)
Traitement photochimique pour l’obtention du KBMA
Principe du traitement photochimique: Une souche inactivée dans le système Nucleotide excision repair (NER) est exposée
exposed a un psoralen et soumise à une irradiation UVA
KBMA bacteria combine the advantages of live attenuated (efficacy) and Killed(safety) vaccine (Brockstedt et al. Nat med. 2005)
Amotosalen
25
Optimisation du traitement photochimique
Concentration d’amotosalen, durée et énergie de l’exposition aux UVA
0µM 2µM 5µM 10µM 15µM 20µMEGTA
1/1.25x108 replicating bacteria
26
Les bactéries KBMA induisent une réponse CD8 spécifique dans la souris
activatednon-activated
27
KBMA induisent la lyse de cellules (OVA)
B16-OVA
28
KBMA se dissémine comme la souche non traitée mais ne se réplique pas
Nuclear imaging SPECT/CT with Tc99m labeled‐Bacteria
29
KBMA induit une réponse inflammatoire systémique modérée
Systemic response in mouseCytokine assay xMAP Technology (Luminex)
30
Etudes précliniques
J‐14 J‐7 J0
Prime Boost Challenge Tumoral
J0 J+1 J+24
Challenge Tumoral Vaccination
31
KBMA‐M1 est sûre et induit une réponse CD8 spécifique dans les PNH
32
KBMA induit une réponse long terme
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Memory marker at Day 90 on Ova CD8+ T cells in splenocytes
* p<0.05***p<0.001
APPLICATIONS Infections virales, maladies émergentesGrippe , M1 (CD8) et M2e (humorale)
Cancers viro induits : Merkel Cell Carcinoma
Infections à pathogènes intracellulaires Bactériens ou parasitaires
Vaccins anti P.aeruginosa Conférer des attributs favorisant la réponse vaccinale En inhibant des facteurs de furtivité (QS, Kyn, FliC, CIF,..) En surexprimant des antigènes de surface (OprF,..)
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Valorisation 2 Brevets mondiaux: B.Polack, B.Toussaint, L. Quénée. Tool for the transfer and production of proteins using the pseudomonas type III secretion system. International patent UJF (EP 1 692 162 B1). 2004
A Le Gouellec, B Polack, B Toussaint Attenuated and adapted strain of P. aeruginosa for delivering antigens International patent UJF/CHU (Brevet WO 2013/087667)
APCure SAS fondée en 2012 par Dr. Laurent Buffat développe des stratégies d’immunothérapie active spécifique sur la platform BacVac : cancers viro‐induits (Preuve de Concept CLARA 2014)
35