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Méthodes d’étude des virus et de diagnostic virologique
Chapitre 9 du cours de Virologie Générale
MATIERE D’EXAMEN
Vous disposez de deux heures pour :
Evoluer dans ce diaporama relatif au chapitre 9 du cours de virologie générale
Visionner les films relatifs à plusieurs méthodes définis par l’assistante
Les questions pourront être posées lors des jours suivants de TP
Objectifs
Intérêt en virologie : production de virus en laboratoire
Les différents typesdifférents types de cultures cellulaires
Culture de cellules primaires :cellules mises en culture à partir de l’organe prélevé chez l’animal (souvent un fœtus), utilisées dès la 1ère culture.
Lignée diploïde :nombre de chromosomes constant, durée de vie limitée (cellules meurent après un certain nombre de divisions)
Lignée continue :transformées in vitro ou provenant de tumeurs, aneuploïdes, durée de vie illimitée
Milieu de cultureMilieu de culture : liquide, riche en acides aminés, minéraux, tampon pH, source d’énergie, facteurs de croissance, facteurs d’attachement.
9.1 La culture de cellules
La culture de cellules
Cellules adhérentes :Cellules adhérentes :2 types de morphologies : épithéliale (polygonale) et 2 types de morphologies : épithéliale (polygonale) et fibroblastique (étiré).fibroblastique (étiré).
Cellules non adhérentes :Cellules non adhérentes :Flottent dans le milieu de cultureFlottent dans le milieu de cultureSphériquesSphériquesDestinées à la production cellulaire en masse.Destinées à la production cellulaire en masse.
Les cellules
Les supports
Supports de cultures cellulaires
Supports de cultures cellulaires
Plaque de 6 puits Plaque de 96 puits
La notion du passage cellulaire
9.2 Dénombrement des particules virales
Définitions : Particules physiques = infectieuses + non infectieuses Particules infectieuses =
particules dénombrées par la méthode des plages de
lyse ou de la méthode des DICC50
Méthode des plages de lyse
Détermination de la dose infectieuse en culture de cellules
Dénombrement de particules physiques
Effet cytopathogène
Méthode des plages de lyse-Particules infectieuses
ND 10-1 10-2 10-3 10-4 T-
Concentration virale de départ (non diluée) ?
200 µl / puits
ND 10-1 10-2 10-3 10-4 T-2
9
7
7
Méthode des plages de lyse-Particules infectieuses
Moyenne de 6,25 Plages de lyse à la dilution 10-3
La concentration virale de départ est de 3,1 104 UFP / ml.
Détermination de la dose infectieuse en culture de cellules (DICC 50)
On cherche la dilution virale pour laquelle 50% des On cherche la dilution virale pour laquelle 50% des supports de cellulles montrent un effet cytopathogène supports de cellulles montrent un effet cytopathogène (cette dilution est celle dont le volume contient une (cette dilution est celle dont le volume contient une DICCDICC5050).).
Détermination de la dose infectieuse en culture de cellules
T -
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
DICC 50
50 µl par
puits
Dilution Dilution viralevirale
Nbre d’infectés/ Nbre d’infectés/ Nbre d’inoculésNbre d’inoculés
Nbre Nbre Nbre Nbre d’infectés de non d’infectés de non
infectés infectés
SommeSomme
I I non non II
% % d’infectésd’infectés
1010-2-2 10/1010/10 10 010 0 37 037 0 100100
1010-3-3 10/1010/10 10 010 0 27 027 0 100100
1010-4-4 10/1010/10 10 010 0 17 017 0 100100
1010-5-5 6/106/10 6 4 6 4 7 4 7 4
6464
1010-6-6 1/101/10 1 91 9 1 131 13 77
1010-7-7 0/100/10 0 100 10 0 230 23 00
1010-8-8 0/100/10 0 100 10 0 330 33 00
1010-9-9 0/100/10 0 100 10 0 430 43 00
Le point d’infectivité à 50 % se situe entre 10-5 et 10-6 : (64-50) / (64-7) = 0.25
Cela signifie que 50 µl d’une dilution à 10-5,25 contient 1 DICC50,
donc, le titre de la suspension virale 1/10-5,25 X 1000/50 = 3,6 .106 DICC50 / ml
Dénombrement des particules physiques - Microscopie électronique
Particules physiques : microscopie électronique
Particules physiques enveloppées
Particules physiques non enveloppées
Récapitulatif Récapitulatif :
9.2 Dénombrement des particules virales
Particules infectieuses : 2 méthodes
- Plages de lyse
- DICC50
Particules physiques :
Microscopie électronique
9.3 Purification des virus Par cPar centrifugationentrifugation : :
– 1.Centrifugations différentielles1.Centrifugations différentielles ::» Centrifugation à Centrifugation à basse basse accéléraccélérationation » Centrifugation àCentrifugation à haute haute accéléraccélérationation sur surnageant sur surnageant
Obtention d’un culot contenant le virus semi-purifiéObtention d’un culot contenant le virus semi-purifié
– 2.Ultracentrifugation2.Ultracentrifugation ::séparation virus-impuretés par propriétés physiquesséparation virus-impuretés par propriétés physiques
» ""en gradient de densité à l’équilibreen gradient de densité à l’équilibre" " (séparation sur base de la (séparation sur base de la densité)densité)
» ""zonalezonale" " (séparation sur base de la vitesse de sédimentation)(séparation sur base de la vitesse de sédimentation)
Obtention d’une suspension de virus très purifiéeObtention d’une suspension de virus très purifiée
9.4 Etude de l’acide nucléique viral
Analyse de restriction et hybridation moléculaireAnalyse de restriction et hybridation moléculaire Amplification génique (PCR) Amplification génique (PCR)
– ConventionnelleConventionnelle
– PCR en temps réelPCR en temps réel
SéquençageSéquençage
La PCR en temps réel
La PCR en temps réelChimie des intercalants
Chimie des intercalantsChimie des intercalants : :
Molécules (SYBR Green, bromure Molécules (SYBR Green, bromure d’éthidium) ayant la propriété de d’éthidium) ayant la propriété de s’intercaler de façon aspécifique s’intercaler de façon aspécifique dans les doubles brins d’ADN, dans les doubles brins d’ADN, conformation qui les rend conformation qui les rend fluorescentes.fluorescentes.
Excitation (UV) Excitation (UV) émission de émission de fluorescence fluorescence lecturelecture
PCR en temps réel
Chimie des sondesChimie des sondes : :Fixation d’une sonde spécifique du Fixation d’une sonde spécifique du fragment amplifié, lié à 2 fragment amplifié, lié à 2 fluorochromes, 1 émetteur (en vert) et fluorochromes, 1 émetteur (en vert) et 1 récepteur (en rouge).1 récepteur (en rouge).Sonde intègre : émission uniquement Sonde intègre : émission uniquement par fluo récepteur (rouge)par fluo récepteur (rouge)
Polymérisation Polymérisation action action exonucléasique de la polymérase exonucléasique de la polymérase sonde lysée sonde lysée séparation fluo séparation fluo émetteur et fluo récepteurémetteur et fluo récepteur
Emission par fluo émetteur (vert)Emission par fluo émetteur (vert)
Chimie des sondes Ex. : TaqMan
Séquençage de l’ADN
Détermination précise de la séquence en nucléotides Détermination précise de la séquence en nucléotides (laboratoires spécialisés)(laboratoires spécialisés)
Méthode de Sanger (plus rarement Maxam et Gilbert)Méthode de Sanger (plus rarement Maxam et Gilbert) Si virus à ARN : ADN complémentaire nécessaireSi virus à ARN : ADN complémentaire nécessaire A partir du produit de PCR ou clonage de la séquenceA partir du produit de PCR ou clonage de la séquence
Application : Lors d’épidémie (ex. : intoxication Application : Lors d’épidémie (ex. : intoxication alimentaire), isolement d’un virus, puis envoi au labo alimentaire), isolement d’un virus, puis envoi au labo qui séquence une partie déterminée du génome de la qui séquence une partie déterminée du génome de la souche pour permettre un typage très fin du virus.souche pour permettre un typage très fin du virus.
9.5 Etude des protéines virales Marquage radioactif : un acide aminé essentiel du milieu Marquage radioactif : un acide aminé essentiel du milieu
remplacé par le même ayant incorporé un isotope radioactif remplacé par le même ayant incorporé un isotope radioactif (méthionine marquée S(méthionine marquée S3535). Marquage de toutes les protéines ). Marquage de toutes les protéines néosynthétisées.néosynthétisées.
Electrophorèse en gel de polyacrylamide : séparation des Electrophorèse en gel de polyacrylamide : séparation des protéines selon leur masse moléculaire, révélation par protéines selon leur masse moléculaire, révélation par radioactivité ou colorants spécifiques des protéines.radioactivité ou colorants spécifiques des protéines.
Western blotting ou Immunoblot : électrophorèse, transfert sur Western blotting ou Immunoblot : électrophorèse, transfert sur membrane puis identification des déterminants antigéniques membrane puis identification des déterminants antigéniques par des anticorps spécifiques et révélation par une méthode par des anticorps spécifiques et révélation par une méthode immuno-enzymatique.immuno-enzymatique.
Immunoprécipitation
Extraction d’une protéine d’un mélange de protéines Extraction d’une protéine d’un mélange de protéines marquées radioactives, par des anticorps spécifiques liés marquées radioactives, par des anticorps spécifiques liés à des billes de sépharose, Centrifugation, Analyse par à des billes de sépharose, Centrifugation, Analyse par électrophorèse.électrophorèse.
Marquage radioactif Immunoprécipitation Electrophorèse
Récapitulatif Récapitulatif : METHODES D’ETUDE
9.4 De l’acide nucléique viral 9.5 Des protéines
Analyse de restriction Marquage radioactif
Southern blot Immunoprécipitation
PCR Electrophorèse
Séquençage Western blot
9.6 Diagnostic des infections virales
Pathologie clinique observée, récolte des signes cliniques
Diagnostic différentiel
Confirmation de l’étiologie par :
- Mise en évidence de l’agent pathogène (direct)
- Mise en évidence de la réponse immunitaire (indirect)
Diagnostic des infections virales
B. Méthodes de diagnostic indirect (mise en évidence de la réponse immune, Ac)
Elisa indirect Immunofluorescence indirecte Séroneutralisation Inhibition de l’hémagglutination
A.1 Non spécifiquesDétermination de l’origine virale, sans identification de l’agent étiologiqueEffet cytopathogèneTest d’hémadsorption
A. Méthodes de diagnostic direct(mise en évidence du virus, Ag)
A.2 Spécifiques Mise en évidence directe d’un constituant du virus
Détection du génomeDétection des protéines
A.1 Méthodes de diagnostic direct non spécifique
I. Effet cytopathogène en culture de
cellules
Méthodes de diagnostic direct non spécifique
II. Test d’hémadsorption :
Virus des oreillons virus Sendai(paramyxovirus)
A.2 Méthodes de diagnostic direct spécifique
Enveloppe
Tégument
DNA
Capside
Glycoprotéines
Méthodes de diagnostic direct spécifique
I. Visant la détection de l’ADN viral à partir du prélèvement
II. Visant la détection des protéines virales :
Techniques immunoenzymatiques (ELISA)
Techniques immunofluorescence
ELISA directRéactifs
Réactifs
Réactifs
- Ac spécifiques des Ag d’intérêt
- Echantillon inconnu
Laisser incuber (temps de réaction)
Lavages (enlève toutes substances non liées)
- Ac couplés à une enzyme (E) spécifique des Ag d’intérêt
Laisser incuber (temps de réaction)
Lavages (enlève tous les Ac-E non liés)
- Substrat de l’E
POSITIF : substrat converti en produit coloré
NEGATIF : pas de coloration
Echantillon positif Echantillon négatifAg présents
et fixation aux Ac
Ag absentEtape 1 : Ajout de l’échantillon sur le support
Etape 3 : Révalation par ajout du substrat de l’enzyme
Etape 2 : Ajout des anticorps couplés à une enzyme
Immunofluorescence (direct spécifique)
Ac anti-gC d’isotype IgG2a
Ac anti-gE d’isotype IgG1
Goat anti-IgG2a de souris couplé à la FITC
Goat anti-IgG1 de souris couplé à la R-PE
* *
gEgC
Immunofluorescence
FITC emissionanti-gC
R-PE emissionanti-gE
Merge
Sample 1
Sample 2
Immunofluorescence
B. Méthodes de diagnostic indirect
ELISA indirect
Immunofluorescence indirecte
Séroneutralisation
Inhibition de l’hémagglutination
ELISA indirectRéactifs
Réactifs
Réactifs
- Ag
- Echantillon inconnu
Laisser incuber (temps de réaction)
Lavages (enlève toutes substances non liées)
- Ac couplés à une enzyme (E) spécifiques des Ac (antiglobuline)
Laisser incuber (temps de réaction)
Lavages (enlève tous les Ac-E non liés)
- Substrat de l’E
POSITIF : substrat converti en produit coloré
NEGATIF : pas de coloration
Echantillon positif Echantillon négatifAc spécifiques présents
et se fixent aux Ag
Ac spécifique absent ; les autres Ac sont
éliminés aux lavagesEtape 1 : Ajout de l’échantillon sur le support
Etape 3 : Révalation par ajout du substrat de l’enzyme
Etape 2 : Ajout des anticorps couplés à une enzyme
ELISA indirect de blocageRéactifs
Réactifs
Réactifs
- Ag
- Echantillon inconnu
Laisser incuber (temps de réaction)
Lavages (enlève toutes substances non liées)
- Ac couplés à une enzyme (E) spécifiques des Ag
Laisser incuber (temps de réaction)
Lavages (enlève tous les Ac-E non liés)
- Substrat de l’E
POSITIF : pas de coloration
NEGATIF : substrat converti en produit coloré
Echantillon positif Echantillon négatifAg viraux fixés ; les Ac
spécifiques s’y fixent
Ac spécifique absent ; les autres Ac sont
éliminés aux lavages Etape 1 : Ajout de l’échantillon sur le support
Etape 3 : Révalation par ajout du substrat de l’enzyme
Etape 2 : Ajout des anticorps couplés à une enzyme
SéroneutralisationBasée sur la capacité des Ac à empêcher le virus d’infecter un tapis cellulaire.
Réactifs
Réactifs
- virus- Echantillon inconnu
Laisser le temps à la réaction Ag-Ac de se produire
Ajouter le mélange sérum-Ag à la culture de cellules
Laisser incuber (temps de multiplication du virus)
POSITIF : les Ac ont empêché la multiplication virale : le tapis cellulaire est intact
NEGATIF : le virus s’est multiplié et a détruit le tapis cellulaire
Echantillon positif Echantillon négatifAc spécifiques se fixent aux virus
Ac spécifique absentEtape 1 : Mélange du sérum à tester avec une suspension virale
Etape 3 : Lecture du résultat après coloration
Etape 2 : Mise en contact du mélange avec un tapis cellulaire confluent
Séroneutralisation
T -
Sérum 1 Sérum 2 Sérum 3 Sérum 4
1/2
1/4
1/8
1/32
1/16
1/64
T +
Inhibition de l’hémagglutinationBasé sur la capacité des Ac à neutraliser le virus Pas de fixation du virus aux GR
Réactifs
Réactifs- Virus- Echantillon inconnu
Laisser le temps à la réaction Ag-Ac de se produire
Ajouter une suspension de globules rouges (GR)
POSITIF : les Ac ont empêché la fixation des GR aux virusinhibition de l’hémagglutination
NEGATIF : le virus se fixe aux GRhémagglutination
Echantillon positifAc spécifiques se fixent aux virus
Echantillon négatifAc spécifique absent
Inhibition de la fixation des virus aux GR
Fixation des virus aux GR
Etape 1 : Mélange du sérum à tester avec une suspension virale
Etape 3 : Lecture du résultat (voir photo dia suivante)
Etape 2 : Mélange avec une suspension de globules rouges
Récapitulatif Récapitulatif : 9.6 METHODES DE DIAGNOSTIC
B. Méthodes de diagnostic indirect (mise en évidence de la réponse immune, Ac)
Elisa indirectImmunofluorescence indirecteSéroneutralisationInhibition de l’hémagglutination
A.1 Non spécifiquesDétermination de l ’origine
virale, sans identification de l’agent étiologique
Effet cytopathogène Test d’hémadsorption
A. Méthodes de diagnostic direct(mise en évidence des virus, Ag)
A.2 SpécifiquesMise en évidence directe
d’un constituant du virus
Détection du génome Détection des protéines