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MOYENS ET MODES DE DÉTECTION D’UN
AGENT INFECTIEUX CHEZ L’HOMME
DU PRÉLÈVEMENT À L’EXAMEN
MICROBIOLOGIQUE
Robin STEPHAN
6/12/2011
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PLAN
1. Eléments pour le diagnostic d’une infectionA. Etiologie d’une infection
2. Recherche directeA. Pré-requis pour un prélèvement réussiB. Les différents prélèvementsC. Analyses microbiologiques des prélèvementsD. Recherche d’antigènes par techniques
immunochromatographiqueE. Autres Techniques de diagnostique
3. Diagnostic indirect : sérologie
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ELÉMENTS POUR LE DIAGNOSTIC D’UNE INFECTION
Elément de base : la clinique Signes généraux d’infection (fièvre, tension,
température, diarrhée) Signes spécifiques ( tâches purpuriques,
éruptions diverses).
Examens complémentaires : Imagerie. Biologie (CRP, PCT, NFS…).
Recherche étiologies de l’infection
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ETIOLOGIE D’UNE INFECTION (DÉTAIL)
Recherche directe de la bactérie, du virus, du parasite… : Par examen direct Par culture Par recherche antigénique Par biologie moléculaire
Recherche indirecte Recherche d’une production d’anticorps dirigées
spécifiquement contre l’agent.
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RECHERCHE DIRECTE
Base fondamentale pour obtenir un diagnostic fiable et interprétable pour une prise en charge optimale d’un patient.
Pont entre le laboratoire, l’infirmière et le médecin.
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PRÉ-REQUIS POUR UN PRÉLÈVEMENT RÉUSSI
Prescription obligatoire.
Guidés par la symptomatologie et l’observation clinique
Localisation ? dans les organes cibles(LCR, abcès profonds,
épanchements...) dans le sang au cours de la dissémination à la porte d'entrée (cutanéo-muqueuse, matériel
implantables…) Dans les liquides et sécrétions biologiques.
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PRÉ-REQUIS POUR UN PRÉLÈVEMENT RÉUSSI
A quels moments? le plus tôt possible, avant tout traitement. Lors de pic fébrile Lors d’échec thérapeutique ou d’évolution
défavorable.
Précautions indispensable? Stérilement en suivant les recommandations à la
fois pour protéger le patient et la qualité du prélèvement.
Transport rapide au laboratoire Utilisation du matériel et des milieux appropriés.
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LES DIFFÉRENTS PRÉLÈVEMENTS
Urines Classiquement utilisée pour la réalisation d’un
ECBU (bandelettes préalable conseillée ) : Nitrites, sang, leucocytes. Attention pédiatrie et patients sondés. Toilettes + milieu de jet.
Urines de 24h pour le diagnostic de Tuberculose, bilharzioses… Recherche d’antigènes bactériens ou virales
(CMV)
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Prélèvements ORL
Aspiration nasopharyngée Recherche virale principalement (VRS,CMV, coqueluche, rougeole).
Prélèvements pulmonaires
Crachats (ECBC) (BK) Le matin au réveil, après rinçage bucco-dentaire Effort de toux (les crachats salivaires sont à éliminer)
LES DIFFÉRENTS PRÉLÈVEMENTS (SUITE)
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LBA (Lavage Broncho-Alvéolaire) Fibroscope Instillation de sérum physiologique dansBronche et réaspiration (4 à 6 fois) Tolérance mauvaise et contamination. Avantage : recheche de germes opportunistes
(Pneumocystis, CMV, Nocardia), intracellulaire(Legionelle)
PDP (Prélèvement Distal Protégé) Sans fibroscopie Volume faible Sans contamination par la flore oro-pharyngée
LES DIFFÉRENTS PRÉLÈVEMENTS (SUITE)
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Selles (coproculture)
Aliquote d’une grosse noix dans pot stérile Préférer les fragments muqueux, glaireux,
sanglants. Renseignements indispensables pour orienter les
recherches : Copro standard avec recherche de Salmonella,
Shigella, Yersinia, Campylobacter, Choléra (voyage)… Recherche de BMR : à préférer aux écouvillons. Recherche de toxines à Clostridium difficileATB ou épidémie seule indication. Recherche de parasite : attention à ne pas mettreÀ +4°C.
LES DIFFÉRENTS PRÉLÈVEMENTS (SUITE)
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Prélèvements sites opératoires
Attention à la contamination par la flore commensale Éviter les écouvillons Prélèvements à la seringue
Foyers infectieux ouverts (désinfecter les berges) infections fermées (désinfectées la peau)
Si recherche d’anaérobies : flacons d’hémocultures peuvent être ensemencés avec le prélèvement.
LES DIFFÉRENTS PRÉLÈVEMENTS (SUITE)
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LCR (Liquide Céphalo-Rachidien) Urgence absolue en cas de suspicion de
méningite Transport urgent +++ car germes fragiles
Ponctions (ascite, articulaire,Pleurale)
LES DIFFÉRENTS PRÉLÈVEMENTS (SUITE)
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Hémocultures
Une hémoculture = un flacon aérobie + un flacon anaérobie.
Prélèvement veineux stérile avec un volume précis
indications Hyperthermie >38,5 °C Hypothermie <36,5°C Frissons
Prélèvements répétés (3 en général) avant toute antibiothérapie.
Possibilité de réaliser des différentiels de pousse entre prélèvements périphériques et sur chambre implantable.
LES DIFFÉRENTS PRÉLÈVEMENTS (SUITE)
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Prélèvements cutanéo-muqueux
Charger un maximum l’écouvillon Sérum physiologique Eviter écouvillonnage des plaiesChroniques sauf si indications Particulières. Curette, brossette, milieu detransport…
LES DIFFÉRENTS PRÉLÈVEMENTS (SUITE)
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Analyses microbiologiques des prélèvements
Bactériologie «classique»
Examen macroscopique Examen microscopique Mise en culture Identification Antibiogramme
Mycologie-parasitologie et virologie
Recherche d’antigènes solubles
Méthodes moléculaires
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EXAMEN MACROSCOPIQUE
Les infections bactériennes peuvent s’accompagner de signes visibles : Trouble Hématurie Autres colorations Odeur (anaérobies, pyo) Consistance (selles)
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EXAMEN MICROSCOPIQUE
Intérêt diagnostic : +++Milieux de cultures à sélectionner
Examen cytologique État frais : quantitatif ou semi-quantitatif
leucocytes, hématies, germes (Malassez ou kova slide) Microscope à fond noir
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Coloration (MGG) : qualitatif à visée cytologique pour observer les
polynucléaires, macrophages, lymphocytes... Les bactéries peuvent être visible comme le
pneumocoque
EXAMEN MICROSCOPIQUE (SUITE)
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Examen bactériologique Gram : information importante qui conditionne la
prise en charge efficace d’une infection avec notamment le choix des antibiotiques.
Coloration différentielle : Compte tenu des différences structurales de la paroi des bactéries : Gram positif : coloré en violet Gram négatif : coloré en rose
Attention certaines bactéries ne se colore pas au Gram (Mycobactéries, tréponèmes)
EXAMEN MICROSCOPIQUE (SUITE)
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Cocci à Gram positif
EXAMEN MICROSCOPIQUE (SUITE)
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Bacille gram positif
EXAMEN MICROSCOPIQUE (SUITE)
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Cocci Gram négatif
EXAMEN MICROSCOPIQUE (SUITE)
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Bacille Gram négatif
EXAMEN MICROSCOPIQUE (SUITE)
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AUTRES COLORATIONS Coloration de Ziehl-Neelsen :
Encre de chine :
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EXAMEN MICRO –MACRO : 1° ÉLÉMENTS DE DIAGNOSTIQUES
l'examen macroscopique et surtout microscopique fournissent souvent des arguments diagnostiques de très forte présomption.
Mise en route d'une thérapeutique adaptée
Choix des milieux de cultures à ensemencer
Résultats des cultures permettront : Identification, test des sensibilités aux traitements besoins en nouvelles orientations diagnostiques
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CULTURE ET ISOLEMENT
Les bactéries étant des êtres vivants plus ou moins fragiles un certains nombres de conditions sont requis : les géloses doivent répondre aux besoins nutritifs et
énergétiques Incubation à 37°C Délai d’incubation de 24h à plusieurs jours (42 pour les BK) Atmosphère : aérobie, anaérobie, sous 5% de CO2…
Existence de milieux sélectifs pour éliminer certaines bactéries commensales, détection spécifiques de BMR…
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ELÉMENTS DE DIAGNOSTIQUES
Type de milieux où pousse la bactérie
Type respiratoire : culture en aérobiose et/ou en anaérobiose
Aspect des colonies
Présence d'une hémolyse (alpha, bêta)
Quantification du nombre de colonies
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ANALYSES DES CULTURES
Cultures uni-ou pauci-microbiens
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Prélèvements plurimicrobiens
ANALYSES DES CULTURES
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IDENTIFICATION DÉFINITIVE
Demande de 6 à 24h de plus tests d'orientation rapide : oxydase,
catalase, coagulase... Propriétés biochimiques (métabolisme
respiratoire, glucidique, enzymatique).
+/-biologie moléculaire Spectrométrie de masse
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INTERPRÉTATION
Prélèvements monomicrobiens: provenant de sites normalement stériles (sang,
urine, LCR, tissus...) d’interprétation assez facile Examen direct capital, rapide, très informatif
Prélèvements polymicrobiens: du revêtement cutanéo-muqueux avec flore
commensale (gorge, selles, vagin, peau) diagnostic plus difficile: repérer une bactérie
pathogène au milieu de bactéries commensales souvent très abondantes
Examen direct peu contributif
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ANTIBIOGRAMME
Détermination de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques.
Panel de molécules testées fonction de l’espèce bactérienne.
Adaptation du traitement antibiotique Mesure isolement? Epidémiologie
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MYCOLOGIE, PARASITOLOGIE ET VIROLOGIE
Mycologie : Suit les mêmes principes que la bactériologie avec
un examen microscopique, cultures, identification +/- antifungigramme.
Recherche de levures (candida spp, Cryptococcus neoformans) responsables d’infections systémiques chez les patients immunodéprimés ou locales.
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MYCOLOGIE, PARASITOLOGIE ET VIROLOGIE
recherche de dermatophytes : phanères et peaux responsables d’infections localisées : herpès circiné,
teigne, onycho-mycoses.
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PARASITOLOGIE
Peu ou pas de culture Tout repose sur l’examen macrosopique et
microscopique avant ou après technique de concentration
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VIROLOGIE Culture rare, uniquement pour Herpes virus
simplex ou CMV.
Diagnostic principalement par sérologie, biologie moléculaire ou recherche d’antigènes.
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RECHERCHE D’ANTIGÈNES PAR TECHNIQUES IMMUNOCHROMATOGRAPHIQUE
Avantages : précocité, simplicité, rapidité, diagnostic tardif
Sensibilité variable Urines : pneumocoque, Legionella pneumophila… LCR Selles : toxines de Clostridium difficile, Helicobacter pylori,
kystes de Giardia, rota adéno et norovirus…. Sang : galactomanane Inconvénient:
pas d’isolement du germe responsable, certaines souches peuvent ne pas être détectées
(lésionnelle), Positivité peut rester plusieurs mois après guérison.
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Recherche d’antigènes solubles pneumocoque
RECHERCHE D’ANTIGÈNES PAR TECHNIQUES IMMUNOCHROMATOGRAPHIQUE (SUITE)
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AUTRES TECHNIQUES DE DIAGNOSTIQUE
La microbiologie «traditionnelle» peut être prise en défaut: Culture impossible (traitement antibiotique
préalable, Treponema…) culture trop complexe (Chlamydiae trachomatis) culture trop lente par rapport à l’urgence
(Mycobacterium tuberculosis, Neisseria meningitidis, …).
Incontournable pour la virologie : +++
On utilise des méthodes moléculaires et plus récemment la spectrométrie de masse.
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LA BIOLOGIE MOLÉCULAIRE
PCR et séquençage : détection et identification des microorganismes dans les prélèvements biologiques ou après isolement (ARNr 16S ou gène sodA pour strepto).
PCR temps réel : détection qualitative des CT et NG et quantitative avec charge virale
PCR et hybridation sur sondes (Exemple de l'identification d'une espèce de mycobactérie avec le réactif Inno-Lipa)
Epidémiologie: détection de gènes de résistance ou de virulence.
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Avantages : Gain de sensibilité Gain de spécificité Gain de temps dans certains cas
Inconvénients : Centre spécialisé Coût Main d’œuvre qualifiée Délai de réalisation Attention aux résultats négatifs (Mycobactérie et
LCR).
LA BIOLOGIE MOLÉCULAIRE
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SPECTROMÉTRIE DE MASSE Technique d’ionisation ionisation douce Permet l’analyse analyse de la composition de
biomolécules (peptides, protéines, sucres, polymères… )
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peut remplacer rapidement l’identification phénotypique en routine ( rapide et économique)
Efficace pour l’identification des bactéries d’hémocultures.
Limites : richesse et fiabilité des banques.
Perspectives: Autres échantillons comme les urines, le LCR
SPECTROMÉTRIE DE MASSE
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DIAGNOSTIC INDIRECT : SÉROLOGIE
Le sérodiagnostic : Principe
Réaction de l’hôte contre des antigènes exprimés par les bactéries, virus, parasites et qui lui sont étrangers.
Entraine production d’anticorps spécifiques.
Réponse humorale détectable après 8 à 10 jours.
spécificité relative(réactions croisées) et sensibilité variable.
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DIAGNOSTIC INDIRECT : SÉROLOGIE
Confirmer résultat dans un délai de quinze jours.
Intérêts limités en bactériologie, plus utilisé en virologie et parasitologie : Infection due à une bactérie à croissance difficile ou
impossible Diagnostic rétrospectif d’une infection récente Études épidémiologiques : séroprévalence
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CINÉTIQUE DES ANTICORPS
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SÉROLOGIES D’INTÉRÊT CLINIQUES
Bactéries responsables d’infections pulmonaires (germes intracellulaires non cultivables) : Chlamydiae pneumoniae Mycoplasma pneumoniae
Bactéries responsables d’infections génitales Treponema pallidum
Bactéries responsables de maladies disséminées : Brucellose Maladie de Lyme
Exemple de sérologie parasitaire : Toxoplasmose : suivi femme enceinte +++
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Seul élément avec la biologie moléculaire utilisable pour établir un diagnostic.
Utilisation de techniques de confirmation par exemple : Western blot
Notion d’avidité pour apprécier l’ancienneté des Ig G. Sérologies de diagnostiques :
HIV (couplée avec un Ag p24), Hépatites, Herpes viridae, rubéole (femme enceinte)…
SÉROLOGIES VIRALES
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CONCLUSION
Le but : orienter le plus rapidement possible sur l’agent infectieux responsable : Examen direct Culture Biologie moléculaire, spectrométrie…
Importance de la qualité des prélèvements et des renseignements
Faisceau d’arguments clinico-biologiques.