Session Mai 2018
L'apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l'évaluation précoce de la maladie résiduelle
dans les leucémies aiguës myéloïdes
MEMOIRE PRESENTE PAR :Docteur AMRANI Kawthar
Née le 03 Octobre 1982 à Fès
POUR L'OBTENTION D DIPLOME DE SPECIALITE MEDECINEU EN OPTION : BIOLOGIE MEDICALE
Professeurs: AMRANI HASSANI MONCEF TLAMCANI IMANE
Sous la direction de :
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2.1 Epidémiologie............................................................................ 8
2.2 Physiopathologie ....................................................................... 9
2.3 Présentation clinico-biologique ............................................... 11
2.4 Classification actuelle des leucémies aiguës myéloïdes et
néoplasies associées selon l’OMS 2016 (tableau 3) ................. 266
2.5 Les bases thérapeutiques actuelles ........................................ 277
2.6 Les facteurs pronostiques ...................................................... 288
4.1 La Cytométrie en Flux .............................................................. 31
4.2 Biologie moléculaire ................................................................ 51
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BIOMOL : Biologie moléculaire
CIVD : Coagulation intraveineuse disséminée
CMF : Cytométrie en flux
FAB : French American British
LAIP : Immunophénotype(s) aberrant(s) associé(s) à la leucémie
LAM : Leucémie myéloïde aigue
LDH : Lactates déshydrogénases
MDR : La maladie résiduelle
MRC : Medical research council
NASDA : Estérases non spécifiques
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Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) est l’ensemble de proliférations
clonales aboutissant à l’accumulation dans la moelle, le sang et éventuellement
d’autres organes, de précurseurs hématopoïétiques de nature myéloïde avec blocage
à un stade précoce de leur différenciation.
Bien que la majorité des patients atteints de leucémie aiguë obtienne une
rémission complète à l’issue de la chimiothérapie d’induction, près d’un patient sur
deux rechutes à plus ou moins long terme.
Il existe des facteurs pronostiques qui permettent d’identifier plus
précocement ces patients à risque et qui sont:
les facteurs pré thérapeutiques liés au patient lui-même (âge, comorbidités)
les facteurs liés à sa maladie (leucocytose, immunophénotype et surtout
anomalies cytogénétiques et/ou moléculaires) constituent généralement de bons
indicateurs pronostiques.
Par ailleurs, ces facteurs ne permettent pas de prendre en compte les
différences inter-individuelles dans le métabolisme des molécules ou la réponse
immune anti-leucémique, c’est dans ce contexte que vient se placer l’évaluation de
la maladie résiduelle (MRD) comme un outil de choix qui permet l’évaluation précise,
sensible et objective de la réponse thérapeutique à l’échelle individuelle.
La MRD est ainsi définie comme la persistance de cellules leucémiques ayant
survécu à la chimiothérapie et présentes en nombre inférieur au seuil de détection
des méthodes cytologiques classiques.
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L’importance de la MRD est devenue en quelques années l’un des facteurs
pronostiques majeurs pour le risque de rechute dans les leucémies aiguës. Elle
permet de suivre l’évolution de la masse tumorale et permet ainsi de mieux
apprécier la sensibilité des cellules tumorales aux divers traitements et d’évaluer la
qualité de la rémission complète.
Les contrôles réguliers et suffisamment rapprochés permettent de détecter
une ré-ascension, synonyme de rechute moléculaire. Elle permet ainsi de prédire la
rechute hématologique avant qu’elle ne se manifeste cliniquement et d’orienter plus
précocement le patient vers une intensification thérapeutique.
Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) constituent un groupe de maladies
agressives hétérogènes, caractérisées par une prolifération clonale et non contrôlée
de cellules hématopoïétiques immatures, communément appelées blastes, qui ont
perdu leur capacité de différenciation et s’accumulent dans la moelle osseuse et le
sang [1].
Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) représentent 1 % des cancers et 80 %
des leucémies aiguës de l’adulte dont l’incidence est en constante augmentation.
Selon les données du réseau FRANCIM, les LAM, tous types confondus, ont
un taux d’incidence brute de 4,7/100 000 h/an et un taux standardisé à la
population mondiale de 2,8/100 000 h/an chez l’homme et de 2,5/100 000 h/an
chez la femme. En termes de nombre de cas, on estime qu’en 2012 en France, il y a
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eu environ 2 000 nouveaux cas (1 470 cas chez les hommes et 1 514 chez les
femmes) [2].
L’incidence des LAM est globalement stable au cours du temps avec des taux
d’évolution annuels de -1,1 % chez l’homme et de 1,1 % chez la femme en France,
entre 2005 et 2012 [3]. En Europe et aux USA, ces taux d’évolution sont
sensiblement identiques (3, 4). Aux USA, le taux d’incidence est ainsi passé de
3,8/100 000 h/an en 2000 à 4,06/100 000 h/an en 2011 [4].
Le phénotype leucémique est conféré à une cellule-souche hématopoïétique
(CSH) normale ou à un progéniteur déjà engagé dans la différenciation, par
l’addition d’au moins deux événements mutationnels [5].
Au moins deux altérations géniques aux conséquences fonctionnelles
distinctes sont nécessaires à l’apparition d’une LAM selon la théorie de « two-hit
model »:
une mutation de type I, aboutissant à un avantage de survie ou de
prolifération suite à l’activation anormale d’une voie de transduction.
une mutation de type II, aboutissant à un blocage de différenciation. Celles-
ci sont des mutations de facteurs de transcription ou de co-activateurs.
La caractérisation des anomalies moléculaires issues de ces événements
chromosomiques ou mutationnels a permis de démontrer que des traitements ciblés
sur des oncogènes peuvent changer le cours de la maladie.
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Malgré une apparente uniformité, l’hématopoïèse leucémique conserve des
caractéristiques comparables à celle de l’hématopoïèse normale. Le clone
leucémique est schématiquement organisé de façon hiérarchique en trois
compartiments distincts :
un compartiment minoritaire de cellules souches leucémiques pour la plupart
quiescentes, mais capables d’auto renouvellement ou d’engagement dans un
processus de prolifération/maturation ;
un compartiment plus mature de progéniteurs leucémiques ayant perdu des
capacités d’auto renouvellement, mais hautement proliférant et ayant des
propriétés clonogènes ;
un compartiment majoritaire de cellules leucémiques (blastes leucémiques)
ayant des capacités de différenciation limitée à un stade donné de
différenciation granulomonocytaire, représentant la grande majorité des
cellules leucémiques retrouvées dans le sang et la moelle osseuse, et
définissant la classification morphologique du French American British (FAB).
Les chimiothérapies conventionnelles sont très efficaces pour éradiquer les blastes
et les progéniteurs leucémiques, mais beaucoup moins sur les compartiments
souches expliquant les taux élevés de rémission, mais également de rechute.
L’hématopoïèse leucémique est associée à une inhibition de l’hématopoïèse normale
par des mécanismes mal connus et qui conduisent à un état d’insuffisance
médullaire majeure qui fait la gravité de cette maladie.
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La présentation clinique d’une leucémie aiguë est très variable. Parfois
asymptomatique et suspectée sur la seule biologie, elle peut au contraire entrainer
des complications inaugurales bruyantes nécessitant une prise en charge urgente en
milieu spécialisé.
Sur le plan clinique, deux syndromes témoins d’une prolifération tumorale sont
classiquement retrouvés :
L’insuffisance médullaire, manifestation la plus fréquente de la maladie,
reflète l’infiltration médullaire blastique et est caractérisée par un syndrome
anémique, un syndrome hémorragique et/ou un syndrome infectieux.
Le syndrome tumoral, plus rare.
Le syndrome anémique est d’autant plus bruyant que l’anémie s’est installée de
manière rapidement progressive. Ses symptômes sont en rapport avec une
diminution de l’hémoglobine et une diminution du transport de l’oxygène aux
organes : pâleur cutanéo-muqueuse, tachycardie, douleur thoracique, dyspnée et
asthénie.
Les hémorragies, secondaires à la diminution du taux de plaquettes, sont
essentiellement cutanéo-muqueuses et peuvent être aggravées en cas d’association
à une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD).
Les infections, secondaires à la neutropénie, sont volontiers de localisation ORL.
Elles sont souvent associées à des signes de gravité hémodynamique plus précoces
ou se présentent sous la forme d’une hyperthermie résistante aux antibiotiques.
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Le syndrome tumoral peut se manifester sous plusieurs formes:
atteinte des organes hématopoïétiques secondaires : hépatomégalie,
splénomégalie et adénopathies,
atteinte extramédullaire:
les leucémides fréquemment associées aux LAM à composante
monoblastique ou monocytaire,
l’hypertrophie gingivale surtout retrouvée dans les LAM à composante
monocytaire ou monoblastique,
l’atteinte neuroméningée suspectée devant la présence d’une paralysie des
nerfs crâniens le plus souvent mais aussi de céphalées,
les sarcomes granulocytaires (masses de cellules blastiques) pouvant
atteindre toutes les localisations extramédullaires.
Les formes hyperleucocytaires des LAM peuvent être associées à une leucostase
dans les capillaires dont les manifestations très variées sont principalement
pulmonaires, neurologiques et oculaires.
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Cet examen permet dans la majorité des cas d’évoquer le diagnostic.
L’atteinte peut porter d’emblée sur les trois lignées avec une pancytopénie mais elle
peut être dissociée et n’atteindre qu’une ou deux lignées.
L’anémie est classiquement arégénérative, normo ou macrocytaire. La
thrombopénie est profonde souvent inférieure à 20 G/L. Cette pancytopénie
s’associe de manière inconstante à une blastose circulante. Dans certains cas, une
hyperleucocytose majeure dépassant 100 G/L est retrouvée définissant les formes
hyperleucocytaires (le plus souvent associées aux leucémies à composante
monocytaire ou monoblastique).
Ce bilan peut mettre en évidence un syndrome de lyse spontané associant
une hyperuricémie, une hausse des lactates déshydrogénases (LDH),
hyperphosphorémie, hypocalcémie et une hyperkaliémie. Ce syndrome de lyse se
complique souvent d’une insuffisance rénale.
- Des troubles de la coagulation à type de CIVD peuvent être mis en évidence
notamment dans les leucémies aigues promyélocytaires et dans les formes
hyperleucocytaires. Ils doivent être systématiquement recherchés car ils imposent
une prise en charge urgente.
Le diagnostic de leucémie aiguë repose sur l’analyse cytologique du
médullogramme et/ou des frottis sanguins. Après coloration des frottis par la
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coloration de May-Grunwald-Giemsa, un décompte cellulaire est réalisé. Selon les
critères de qualité, le décompte cellulaire doit être établi sur plus de 200 leucocytes
pour l’étude du frottis sanguin et sur plus de 500 cellules nucléées pour l’étude des
frottis médullaires [4]. Une blastose médullaire ou sanguine supérieure à 20%
permet de retenir le diagnostic de leucémie aiguë. Ce chiffre peut être revu à la
baisse pour les leucémies présentant une translocation équilibrée t (15;17), t (8;21),
inv(16) ou t(16;16) (5).
Afin de déterminer le caractère myéloïde ou lymphoïde de la leucémie aiguë,
des analyses cytochimiques permettent de compléter l’analyse cytologique. La
réaction cytochimique de la myélopéroxidase est la plus souvent pratiquée et
permet la mise en évidence de cette enzyme dans les granules cytoplasmiques des
cellules myéloïdes (l’enzyme dégrade le perhydrol et oxyde la benzidine qui
précipite sous forme de granulations colorées en brun-noir, on peut utiliser le
chloronaphtol qui précipite en un produit rouge). Une positivité sur les blastes
supérieure ou égale à 3% en en faveur d’une LAM. Sa négativité n’exclut cependant
pas le diagnostic. D’autres analyses cytochimiques peuvent présenter un intérêt
dans certains cas particuliers. Ainsi les estérases non spécifiques (NASDA) sont par
exemple très positives dans la majorité des monoblastes, promonocytes et
monocytes et plus faiblement dans les myéloblastes et cette positivité est seulement
inhibée dans la lignée monocytaire par le fluorure de sodium.
Le groupe coopératif FAB (French American British) a proposé une
classification en 1976 [6] révisée en 1985 [6-7] puis en 1991 [7] qui se base sur les
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caractéristiques cytologiques et cytochimiques du myélogramme et celles du frottis
sanguin pour répartir les LAM en 8groupes distincts (Tableau 1).
A noter que les diagnostics de LAM0 et LAM7 ne peuvent pas être retenu sur
de simples critères morphologiques mais nécessite une analyse
immunophénotypique (6, 7).
Le diagnostic cytologique présente un intérêt majeur dans le cadre des LAP
(ou LAM3) qui sont associées presque exclusivement à une translocation (15;17).
Dans ces leucémies, les complications initiales grèvent le pronostic et le diagnostic
doit donc être posé rapidement afin d’initier un traitement dans les plus brefs
délais, sans attendre de confirmation cytogénétique.
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L’utilisation de la cytométrie en flux (CMF) au diagnostic est fondamentale et fait
partie intégrante des examens réalisés sur les prélèvements initiaux. Cette
technique repose sur la détection de marqueurs antigéniques membranaires ou
cytoplasmiques à l’aide d’anticorps spécifiques couplés à un fluorochrome.
Les panels de détection antigénique utilisés en pratique courante permettent :
d’identifier la lignée d’une leucémie aiguë, même pauci cellulaire, par
un panel d’orientation incluant des marqueurs myéloïdes, lymphoïdes B
ou T et d’immaturité [8, 9]. La positivité d’au moins 2 marqueurs
appartenant à une même lignée est nécessaire [10]. Un marqueur est
généralement considéré comme positif lorsque son expression intéresse
au moins 10-20% des blastes[8]. En outre, la comparaison des
marqueurs immunophénotypiques des blastes avec les marqueurs de
différenciation des précurseurs hématopoïétiques permet de déterminer
le niveau du blocage de maturation des cellules blastiques [8, 10].
d’établir le diagnostic des LAM peu différenciées (LAM0),
mégacaryoblastiques (LAM7) ou de leucémie aiguë avec ambiguïté de
lignée dont le diagnostic ne peut être retenu sur les seuls arguments
cytologiques [9, 11].
de rechercher des marqueurs dont l’expression aberrante constituera la
base d’un suivi de maladie résiduelle par CMF [7].
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D’utiliser des thérapies ciblées, notamment des anticorps monoclonaux
( le Gemtuzumab Ozogamicin dans le cadre de la prise en charge des
LAM CD33+) .
Le tableau 2 ci-dessous présente les différents marqueurs de surface ou
cytoplasmiques utilisés dans le cadre du diagnostic d’une leucémie aiguë myéloïde.
Ils doivent être réalisés lors de la prise en charge au diagnostic de chaque
nouvelle leucémie aigüe. Ils apportent des données importantes dans le diagnostic,
le pronostic et le suivi des leucémies. On distingue traditionnellement le caryotype
conventionnel de la technique d’hybridation in situ en fluorescence (FISH,
Fluorescence In Situ Hybridization).
Cette technique repose sur l’observation des chromosomes permettant de
déterminer des anomalies de nombre et/ou de structure. Elle peut être réalisée sur
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des prélèvements sanguins ou médullaires. Elle consiste à placer les cellules en
culture pendant 24 à 48 heures dans un milieu contenant du G-CSF (Granulocytes
Colony-Stimulating Factor). Les cellules sont ensuite traitées afin d’obtenir le plus
grand nombre de cellules en métaphases qui seront ultérieurement éclatées afin
d’analyser les chromosomes grâce à plusieurs méthodes de coloration (quinacrine,
Giemsa). Pour une interprétation optimale, une analyse sur un minimum de 20
cellules en métaphase est recommandée [12].
Selon les études, un caryotype est interprétable pour environ 80% des
patients atteints de LAM [13, 15]. Chez les sujets jeunes, environ 40% des patients
présentent un caryotype normal et 12-14% des patients présentent un caryotype
complexe au diagnostic [12-13]. Un caryotype complexe est défini, selon les études
[14-15], par la présence de 3 ou 4 anomalies au caryotype à l’exclusion des
anomalies récurrentes.
Environ un tiers des patients atteint de LAM présentent une translocation
équilibrée au diagnostic.
Certaines de ces anomalies sont associées à des types particuliers de
leucémies d’après la classification FAB:
Les LAM avec t(15;17) sont exclusivement des LAP (ou LAM3) (15).
Les LAM avec t(8;21) sont associées aux LAM2 (80%) et inversement 25% des
LAM2 présentent une t(8;21) [32, 33].
A noter que la présence d’une translocation t(8;21) confère aux LAM2 un
aspect cytologique et phénotypique particulier : les blastes présentent un
cytoplasme basophile à l’intérieur duquel on retrouve un corps d’Auer unique, piqué
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dans le noyau. Un excès d’éosinophiles ou de mastocytes peut être retrouvé (15). Le
phénotype est fréquemment CD33+ et CD13+, associé parfois à des marqueurs
aberrants (CD19, Tdt, CD56) (16).
- Les LAM associées à une t(16 ;16) ou une inv (16) sont des LAM4 avec éosinophiles
anormaux (LAM4Eo).
Ces translocations équilibrées aboutissent à la naissance de transcrits de fusions
détectables par biologie moléculaire (BM) dont nous aborderons par la suite les
caractéristiques
Cette technique repose sur la détection de séquences d’acides nucléiques à l’aide de
sondes d’hybridation constituées d’ADN complémentaire et couplées à un
fluorochrome. Elle peut être réalisée sur des préparations cytogénétiques (noyaux en
métaphase) ou cytologiques (noyaux en interphase). Il existe une grande variété de
sondes : des sondes de fusion pour détecter des gènes de fusion et des sondes de
réarrangement (break-apart) pour la détection des réarrangements géniques. C’est
une technique intéressante car elle peut être réalisée sur des noyaux en interphase,
les résultats sont donc en général obtenus plus rapidement. Cependant, cette
technique d’étude est ciblée (dépendante des sondes utilisées) ce qui en limite
l’utilisation.
Dans l’étude des LAM, la FISH est utilisée dans certains contextes :
- Détection d’anomalies cryptiques :
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Les réarrangements de KMT2A (MLL) (du fait des nombreux partenaires et
des nombreux points de cassure existants) (19, 36) qui constituent son
principal intérêt en pratique clinique.
L’inv(16) ou la t(16;16)
- Caryotype conventionnel non réalisable (pas assez de métaphases, défaut de
culture) : l’étude par FISH peut permettre de rechercher des anomalies génétiques
pronostiques.
L’utilisation de la cytogénétique a constitué une avancée majeure dans la prise en
charge des LAM, toutefois une proportion non négligeable des LAM (environ 40%)
présentent un caryotype normal au diagnostic [14-16]. Le développement récent des
nouvelles méthodes de séquençage haut débit a permis de compléter nos
connaissances sur les bases moléculaires des LAM. Ces nouvelles données sont
particulièrement pertinentes dans le cas des LAM à caryotype normal (LAM-CN).
Malgré l’engouement actuel pour ces nouvelles technologies, les recommandations
établies par l’European Leukemia Net (ELN) en 2010 limitent le recours à la BM:
- A la validation d’un diagnostic en cas d’échec des techniques de cytogénétique,
- A la recherche de mutation de NPM1, FLT3, CEBPA lorsque le caryotype est
normal [17].
Au vu de la littérature récente, la quantification de ces anomalies est
souhaitable, même en dehors du cadre des recommandations actuelles (uniquement
recommandé pour les LAP [15] ). En effet, les données quantitatives permettent de
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mieux apprécier la profondeur de la réponse au traitement et de suivre la maladie
résiduelle (MRD).
Nous présentons ici quelques exemples d’anomalies moléculaires retrouvées
et/ou apparaissant dans la classification de l’Organisation Mondiale de la Santé
(OMS) 2016. Ces anomalies sont regroupées ci-dessous en catégories fonctionnelles
telles qu’elles sont décrites par le Cancer Genome Atlas Research Network.
RUNX1-RUNX1T1 : Ce gène de fusion est issu de la t(8;21)(q22;q22) , Les
LAM avec transcrit de fusion RUNX1-RUNX1T1 représentent environ 5 à 10% des
LAM de l’adulte. Le gène RUNX1 est situé sur le chromosome 21 et code pour la
sous-unité transcriptionnelle α du Cord Binding Factor (CBF) qui est essentielle dans
la régulation de la croissance et de la différenciation granulocytaire. Elle possède un
domaine RHD (Runt Homology Domain) de liaison à l’ADN. Le gène RUNX1T1 est
quant à lui situé sur le chromosome 8 et code une protéine interagissant avec des
récepteurs nucléaires ayant une fonction de corépresseurs (par le recrutement
d’histone désacétylase (HDAC) et de la protéine Sin3A. La protéine chimérique
générée par la fusion de ces deux gènes est responsable d’une répression
transcriptionnelle des gènes cibles de RUNX1[18] . Cette anomalie moléculaire est
associée dans environ 70% des cas à des anomalies cytogénétiques additionnelles et
environ 50% des cas à des anomalies géniques [17].
CBFB-MYH11 : La présence d’une t(16;16)(p13;q22) ou d’une inv(16), aboutit
à la fusion du gène CBFB présent sur le chromosome 16q22 avec le gène MYH11 en
16p13.1 [39]. Le gène CBFB code pour la sous-unité β de l’hétérodimère CBF. Cette
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sous unité stabilise la liaison à l’ADN de la sous unité α et participe donc également
à la régulation de l’hématopoïèse normale. Le gène MYH11 code pour la chaîne
lourde de la myosine muscle lisse. La protéine de fusion de ces deux gènes se lie à
la sous unité α et la séquestre aboutissant à des anomalies transcriptionnelles des
gènes cibles de RUNX1 [18]. Plus d’une dizaine de formes du transcrit de fusion sont
décrites dans la littérature parmi lesquelles les formes A, D ou E représentent 95 %
des transcrits.
CEBPA : Ce gène, situé en 19q13, code pour un facteur de transcription
impliqué dans la régulation de la prolifération et de la différentiation des
progéniteurs myéloïdes. Deux principaux types de mutations ont été décrits. Des
mutations non sens dans la région N-terminale et des mutations dans le cadre de
lecture de la région C-terminale leucine zipper. Dans plus de 50% des cas, les deux
allèles sont touchés. Ces mutations sont retrouvées dans environ 10% des LAM-CN
[19] .
RUNX1 : Les mutations de ce gène sont plus rares et concernent 5-15% des
LAM-CN. Dans les populations plus âgées (>70ans), la mutation est retrouvée dans
environ 15% des cas (20). La mutation peut être biallélique. Les mutations sont
localisées à la partie C-terminale de la protéine et entrainent la synthèse d’une
sous-unité α du CBF tronquée qui ne peut plus s’hétérodimériser avec CBF- β . Il en
résulte une perte de stabilité de la liaison de CBF-α à l’ADN et des anomalies
transcriptionnelles. Des mutations germinales de ce gène sont associées à des cas
de thrombopénie familiale et à une prédisposition familiale aux LAM [15].
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FLT3 : Ce gène, situé en 13q12, code pour un récepteur de tyrosine kinase
jouant un rôle dans la prolifération et la survie des CSH. On retrouve deux types de
mutations : le plus fréquent dénommé FLT3-ITD est associé à une duplication en
tandem de la partie interne de FLT3 ce qui entraine une activation constitutive du
récepteur. FLT3-ITD est retrouvé dans 25-30% des LAM de novo de l’adulte[15], 35-
40% des LAM-CN[17] et des LAP [19]. Le second type de mutation appelé FLT3-TKD
regroupe l’ensemble des mutations non sens localisées au niveau de la boucle
d’activation du domaine tyrosine kinase. Il est retrouvé dans 10-15% des LAM.
KIT : Le gène KIT, situé en 4q12, code pour un récepteur tyrosine kinase.
Plusieurs mutations ont été décrites et sont retrouvées dans environ 5% ou moins
des LAM (18) et plus fréquemment dans les LAM du groupe CBF[19] :
- Des mutations en position D816 qui touchent la boucle d’activation du domaine
kinase et aboutissent à un récepteur constitutionnellement actif sont retrouvées
dans 15 à 20% des LAM avec t(8;21) et dans 10 à 15% des LAM avec inv(16).
- Des mutations de l’exon 8 du gène, qui touchent la partie extracellulaire et
empêchent l’hétérodimérisation du récepteur, sont retrouvées dans 5-10% des
LAM t(8;21) et 15-20% des LAM avec inv(16).
RAS : La famille de gènes RAS code pour des protéines qui interviennent dans la
transduction du signal de nombreux récepteurs cellulaires (petite protéine à activité
GTPase). Elles sont notamment impliquées dans des voies de prolifération, survie, ou
différenciation cellulaire. Les mutations rencontrées dans les LAM intéressent les
gènes NRAS et KRAS. NRAS est muté dans 10-15% des LAM et KRAS dans seulement
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar25
5%. Leur fréquence est augmentée dans les LAM du groupe CBF (30-40% pour les
LAM avec inv(16) et 10-20% pour les LAM avec t(8;21)) [54].
IDH : Il a été décrit deux gènes : IDH1 et 2 situés respectivement en 2q32 et
15q26. Ils codent pour des enzymes intervenant dans la régulation du cycle de
Krebs. La mutation R132H a été décrite pour IDH1 et les mutations R172K et R140Q
au niveau d’IDH2. Ces mutations sont retrouvées dans les gliomes et les LAM. Le
plus souvent monoalléliques elles entrainent l’accumulation intracellulaire de
l’onco-métabolite 2-hydroxy-glutarate (2HG). L’augmentation de 2HG est
responsable d’une inhibition du gène TET2 ce qui va entrainer des perturbations de
la méthylation de l’ADN. De plus, l’accumulation de 2HG est un marqueur diagnostic
et permet le suivi de la maladie résiduelle.
WT1 : Le gène de la tumeur de Wilms situé en 11p13 code pour un régulateur
trasncriptionnel jouant un rôle dans la croissance cellulaire et le développement
embryonnaire. Les mutations de WT1 sont associées à une dysfonction de TET2 et
entrainent donc des changements de méthylation de l’ADN qui vont altérer
l’expression de certains gènes notamment de gènes suppresseurs de tumeurs. Dans
les leucémies, on peut retrouver des mutations de ce gène dans environ 10% des
LAM-CN[20] mais surtout une surexpression du gène touchant environ 70% des LAM
[68] et permettant le suivi de la MRD.
De nombreuses études soulignent les liens entre ces anomalies moléculaires.
Certaines sont fréquemment associées alors que d’autres semblent exclusives.
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar26
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar27
La prise en charge des LAM est adaptée à l’âge et aux comorbidités du
patient d’une part et aux caractéristiques de la maladie d’autre part, dont les
anomalies cytogénétiques et moléculaires présentes au diagnostic. La décision
thérapeutique est prise en réunion de concertation pluridisciplinaire, où sont réunis
cliniciens et biologistes. Les comorbidités et les facteurs pronostiques sont
soigneusement analysés en particulier chez les sujets âgés avant de débuter une
chimiothérapie intensive, en raison de l’importante toxicité liée à ce traitement ,
avec un nombre non négligeable de décès précoces même si le taux de décès à
l’induction ne cesse de diminuer avec le temps.
Le traitement s’articule en deux grandes phases : la première est le
traitement d’induction dont l’objectif est d’obtenir la rémission complète (RC),
condition nécessaire à une survie prolongée, et a fortiori à la guérison, dont la
définition d’usage est la persistance de la rémission complète pendant plus de cinq
ans.
Une fois la rémission complète atteinte, la deuxième phase du traitement
consiste en un traitement de consolidation, qui a pour but de réduire le risque de
rechute.
Différentes stratégies existent et la décision est guidée par l’état général du
patient (âge, comorbidités) et les caractéristiques de la maladie (indications
d’allogreffe en première RC en fonction des caractéristiques cytogénétiques et plus
récemment moléculaires). La poursuite de la chimiothérapie est une des possibilités
de traitement de consolidation.
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar28
Aux côtés des facteurs pronostiques liés au patient, ceux liés à la maladie
sont principalement le taux de globules blancs au diagnostic, le statut secondaire de
la leucémie et les anomalies cytogénétiques et moléculaires. La cytogénétique est un
facteur pronostique indépendant majeur et un examen incontournable au
diagnostic.
La classification du groupe coopérateur britannique Medical research council (MRC),
mise à jour en 2010, est communément utilisée.
Plus récemment ont été individualisés les caryotypes monosomiques, de pronostic
catastrophique et définis par la présence d’une monosomie autosomique (délétion
d’un chromosome entier) associée à une autre monosomie autosomique ou à au
moins une autre anomalie de structure.
La découverte au cours de la dernière décade de l’importance pronostique de
certaines anomalies génétiques a permis d’affiner encore la classification
pronostique des LAM surtout au sein du groupe à caryotype normal dans lequel trois
gènes sont particulièrement importants par leur fréquence et leur impact
pronostique: il s’agit du gène de la nucléophosmine (NPM1), de la Fms-like tyrosine
kinase 3 (FLT3) et de la CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBPA).
La mise en évidence d’un avantage de survie chez les patients ayant un caryotype
normal et une mutation du gène NPM1 ou de CEBPA sans mutation de FLT3-ITD,
permet de les classer dans le sous-groupe favorable, aux côtés des anomalies du
sous-groupe CBF t (8;21)
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar29
(q22;q22) et inv(16)(p13.1;q22)], confirmant l’importance des mutations de ces
deux gènes, déjà soulignée par la classification OMS 2008. Les mutations de CEBPA
sont considérées de bon pronostic si elles sont bi-alléliques.
Mais la mise au point de ces classifications pronostiques n’est pas définitive.
D’autres anomalies moléculaires sont intensément étudiées et pourraient venir
complexifier encore ces classifications ; il s’agit des mutations de la DNA methyl
transférase 3A (DNMT3A), des isocitrate déshydrogénases (IDH) 1 et 2, de tet
oncogene family member 2 (TET2), ou d’autres gènes.
La définition actuelle de la rémission complète(RC) se base sur des critères
cytologiques. Et notamment sur le compte cellulaire. Malgré les avancées sur le plan
moléculaire, la définition de la RC est restée la même au cours du temps. Elle est
définie, selon les critères ELN [19] par :
la présence de moins de 5% de blastes médullaires,
l’absence de blastes contenant des corps d’Auer,
l’absence de localisation extramédullaire,
une indépendance transfusionnelle
la sortie d’aplasie (caractérisée par la présence de polynucléaires
neutrophiles à plus de 1 G/L et d’un taux plaquettaire supérieur à 100 G/L).
La rémission cytologique est le reflet d’une diminution de la charge
leucémique et correspond au passage de 1012 ou plus de cellules au diagnostic à
1010 ou moins en post induction [21]. Cette définition ne permet donc pas
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar30
d’apprécier la profondeur de la réponse et de distinguer différents groupes de
patients en fonction de la qualité de leur réponse. La RC est obtenue chez près de
80% des patients atteints de LAM. L’obtention d’une RC est un facteur de bon
pronostic mais ne signifie pas que le patient est guéri. En effet, la plupart des
patients va rechuter au cours du suivi. La MRD est définie comme la persistance,
après obtention d’une RC, d’une maladie détectable par d’autres techniques que la
cytologie. Le seuil à partir duquel on affirmera la présence d’une MRD est dépendant
du type de technique considérée (cytogénétique, FISH, cytométrie en flux, biologie
moléculaire) (Figure1).
Pour ces LAM, il n’existe cependant pas d’étude l’incluant dans la prise en charge
thérapeutique. Le suivi de la MRD est donc un domaine de recherche très dynamique
en particulier pour les LAM dépourvues de marqueurs propres de suivi.
Au cours des LAM, le suivi de la MRD est particulièrement utile dans plusieurs cas de
figure:
- Pour apprécier la profondeur de la réponse au traitement
- Pour réajuster le traitement du patient de façon évolutive (consolidation ou
intensification)
- Pour prévenir la rechute clinique en proposant un traitement dès la rechute
moléculaire
A l’avenir, son utilisation sera donc probablement de plus en plus recommandée afin
d’offrir une prise en charge personnalisée aux patients atteints de LAM.
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar31
La CMF est une technique permettant l’analyse de cellules en suspension.
Les cellules sont injectées à grande vitesse au sein d’un flux liquide. Elles adoptent
alors une configuration en file indienne puis traversent différents lasers couplés à
une série de détecteurs ce qui permet d’analyser individuellement un grande
nombre de cellules en peu de temps. L’étude de la lumière réémise par diffusion ou
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar32
fluorescence lors du passage d’une cellule permet d’obtenir des informations sur sa
taille, sa granulosité ou la présence d’un éventuel fluorochrome qui lui serait
adjoint. On peut ainsi quantifier au sein d’un échantillon des sous-types cellulaires
en fonction de leurs propriétés physiques et des marqueurs d’intérêt.
Au moment du diagnostic de LAM, les blastes isolés à partir des
prélèvements du patient sont étudiés en CMF avec des panels d’anticorps. Ainsi, il
est parfois possible de déterminer un ou plusieurs LAIP. Au cours du suivi, les
prélèvements ultérieurs sont techniqués de manière identique afin de quantifier le
nombre de cellules présentant le ou les LAIP, c’est à dire la MRD du patient.
La stratégie d’analyse actuelle est basée sur le fenêtrage des blastes puis la
recherche d’un LAIP.
Définition de la fenêtre « blastes » au diagnostic et lors du suivi (figure 2 et
3)
Un premier diagramme « TIME » permet de visualiser le nombre
d’événements acquis en fonction du temps. Il reflète ainsi la stabilité de l’acquisition
sur le cytomètre au cours du temps. Les diagrammes « FSint/FSpeak » et «
FSint/SSint » permettent respectivement d’éliminer les doublets puis les éléments de
petite taille (débris) ou de taille et/ou structure trop importante. Un premier
fenêtrage « cellules » définit la population d’intérêt pour la suite de l’analyse.
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar33
Ce diagramme permet de distinguer les éléments CD45+ (sous-populations
leucocytaires) des populations CD45- (débris). La fenêtre « leucocytes » totalise le
nombre d’évènements leucocytaires acquis et servira de dénominateur pour la
quantification de la MRD.
On délimite ensuite les différentes fenêtres contenant les populations
granuleuses, les monocytes, les lymphocytes et les blastes selon l’expression du
CD45 et l’hétérogénéité de structure. La fenêtre « blastes » est délimitée
puis validée par un fenêtrage rétrograde à partir des éléments CD45faible/CD34+
(cf. Diagramme CD45/CD34).
L’analyse des leucocytes sur le diagramme CD45/CD34 permet de réaliser
plusieurs contrôles. Le fenêtrage des évènements CD45faible/CD34+ est appelé «
CD34+ ».
Celui-ci permet de vérifier le fenêtrage « blastes » réalisé sur
l’intensité du CD45 et la structure. Eventuellement, cette fenêtre est alors redessinée
si le nuage de point « CD34+ » n’est pas entièrement inclus dans la fenêtre blastes.
D’autre part, en rapportant le nombre d’événements CD34+ sur le nombre
d’événements CD45+, on obtient un pourcentage de blastes médullaires nous
permettant de juger de l’hémodilution du prélèvement. Un prélèvement non
hémodilué contient environ 3 à 4% de blastes lors des évaluations de MRD. Il est
ainsi possible d’évaluer le seuil technique qui permettrait de mettre en évidence une
MRD (définie par un nuage composé de 50 événements dans un prélèvement non
dilué ayant le même nombre de blastes).
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar34
Les
granuleux apparaissent en rouge. Les monocytes sont colorés en vert et les
lymphocytes en rose. Les blastes sont initialement fenêtrés sur le
diagramme CD45/SS et apparaissent en bleu. Ils représentent la majorité des
cellules dans ce prélèvement. La population CD34+ est sélectionnée sur le
diagramme CD45/CD34 et apparait en orange. Par rétrocontrôle, on observe que la
population CD34+ de couleur orange est bien contenue dans la sélection blastes.
Les blastes de couleur noir représentent les blastes présentant le LAIP étudié.
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar35
Les granuleux apparaissent en rouge. Les monocytes sont colorés en vert et
les lymphocytes en rose. Les blastes sont initialement fenêtrés sur le
diagramme CD45/SS et apparaissent en bleu. Les blastes ne représentent alors
qu’une fraction des leucocytes. La population CD34+ est sélectionnée sur le
diagramme CD45/CD34 et apparait en orange. Par rétrocontrôle, on observe que la
population CD34+ de couleur orange est bien contenue dans la sélection blastes.
Les blastes de couleur noire représentent les blastes présentant le LAIP étudié.
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar36
Recherche et mesure des LAIP (figures 4et 5)
La recherche et la quantification de la MRD sur un LAIP sont réalisées en
visualisant les blastes dans divers diagrammes permettant de caractériser leurs
profils d’expression pour les antigènes marqués. Au diagnostic, pour chaque
diagramme, la population blastique est fenêtrée. En combinant les événements
contenus dans ces fenêtres, on obtient le nombre de blastes présentant le
phénotype aberrant. En rapportant celui-ci au nombre de leucocytes, on obtient le
pourcentage de blastes présentant le phénotype aberrant. Un rétrocontrôle de la
population blastique fenêtrée est enfin réalisé sur un diagramme CD45/SS (figure 4).
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar37
Le
profil phénotypique des blastes est visualisé dans plusieurs diagrammes. Le
fenêtrage permet de définir la population exprimant le LAIP (« MRD ») par une
fenêtre combinant les événements « Blastes+Y1+Y2+Y3+Y4+Y5+Y6 ». Celle-ci est
colorée en noir. Enfin, la quantification des blastes exprimant le LAIP est exprimée
en pourcentage du nombre de leucocytes total (ici 53%).
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar38
Pour évaluer la MRD à un point de suivi ultérieur, le masque des fenêtrages
déterminés lors du diagnostic est appliqué sur les cellules étudiées. Un rétrocontrôle
de la position de ces blastes sur un diagramme CD45/SS est de nouveau effectué
permettant d’en apprécier la position, la dispersion et d’éviter un biais de sélection
(figure 5).
Pour une LAM, plusieurs types de LAIP peuvent ainsi être suivis.
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar39
.
Le profil phénotypique des blastes est visualisé sur les mêmes diagrammes qu’au diagnostic. Le masque du fenêtrage réalisé au diagnostic est appliqué sur les cellules étudiées. Les nombre de blastes exprimant le LAIP (« MRD ») est obtenu en combinant les événements « Blastes+Y1+Y2+Y3+Y4+Y5+Y6 » qui sont colorés en noir. Enfin, la quantification des blastes exprimant le LAIP est exprimée en pourcentage du nombre de leucocytes total (ici 0.49%).
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar40
L’évaluation de la MRD passe par le calcul du pourcentage d’événements
présentant un phénotype inhabituel parmi les leucocytes totaux.
l’analyse est basée sur la comparaison des résultats par rapport à un pool de
moelles de « référence ». On utilise pour chaque combinaison antigénique 5 à 9
moelles témoins qui ont été marquées avec le même panel d’anticorps que le
prélèvement d’intérêt. Le nombre d’événements obtenus sur les moelles de
référence permet de déterminer l’expression normale ou physiologique d’un LAIP
donné et de calculer la valeur du seuil de positivité. Le seuil de positivité est alors
égal à la moyenne plus 2 écart-types du pourcentage de leucocytes exprimant le
LAIP observé dans les moelles de référence.
La CMF est un outil essentiel non seulement lors du diagnostic de LAM mais
aussi pour le suivi de la MRD [19]. Chez les adultes, on estime ainsi qu’environ 75-
95% des patients [19-22] présentent un ou plusieurs immunophénotype(s) aberrants
associé(s) à la leucémie (LAIP) au diagnostic. Il est donc possible de suivre la MRD
par CMF à différents temps du traitement chez une majorité de patients avec LAM.
Les avantages de cette technique sont une bonne disponibilité du matériel dans les
centres hospitaliers, un rendu rapide des résultats et un coût inférieur comparé aux
techniques de biologie moléculaire. Toutefois, l’analyse des données nécessite une
expertise importante, l’évaluation est dépendante du manipulateur [24] et des
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar41
variations phénotypiques peuvent être présentes à la rechute, ce qui peut en limiter
l’utilisation [18-22] .
L’évaluation de la MRD par CMF se fait au travers de l’analyse des LAIP, plus
récemment décrite comme une analyse des « différences par rapport à la normale ».
Ces LAIP peuvent être regroupés en 4 classes :
- Marqueurs d’infidélité de lignée
- Marqueurs d’asynchronisme de maturation
- Marqueurs non exprimés ou sous-exprimés
- Marqueurs surexprimés.
La sensibilité de ces marqueurs dépend de leur expression initiale sur les
cellules leucémiques (dans l’étude de Feller ils sont considérés comme
sensibles au-delà de 50%, peu sensibles entre 10 et 20% d’expression et enfin non
considérés comme marqueur de suivi en dessous de 10%) et leur spécificité de leur
expression sur moelles normales [22].
La détection de ces marqueurs est fonction du panel d’anticorps utilisé au
diagnostic. Initialement réalisée à l’aide de cytomètres 2 ou 3 couleurs, l’utilisation
plus récente de cytomètres 6-8 couleurs a permis un confort d’utilisation, un gain
de temps technique et une augmentation du seuil de détection.
Actuellement le suivi de la MRD est réalisé sur moelle osseuse compte tenu
du manque de sensibilité du phénotypage sur sang [24]. L’évaluation de la MRD par
CMF a montré un intérêt pronostique à différents temps du traitement à la fois dans
des études rétrospectives et prospectives (tableau 4) :
- lors de l’aplasie post-induction,
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar42
- au terme d’une cure d’induction,
- au terme des cures de consolidation.
Toutefois, la portée de ces résultats est limitée car ces études sont
majoritairement rétrospectives et incluent une population restreinte. De plus, seule
l’étude prospective AML02 sur une population pédiatrique, a intégré le suivi de la
MRD par CMF dans l’adaptation du traitement et la prise en charge des patients.
D’autres données prospectives sur l’intérêt ou non de fonder en partie la décision
thérapeutique sur les résultats de la MRD en CMF sont donc nécessaires. Enfin,
l’analyse de la MRD par CMF manque actuellement de standardisation et il existe
une grande hétérogénéité des seuils de positivité retenus dans chaque étude
(tableau 4).
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar43
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Dr.AMRANI kawthar44
L’évaluation de la MRD par CMF se fait au travers de l’analyse des LAIP, plus
récemment décrite comme une analyse des « différences par rapport à la normale ».
Ces LAIP peuvent être regroupés en 4 classes :
- Marqueurs d’infidélité de lignée
- Marqueurs d’asynchronisme de maturation
- Marqueurs non exprimés ou sous-exprimés
- Marqueurs surexprimés.
La sensibilité de ces marqueurs dépend de leur expression initiale sur les cellules
leucémiques [22].
La détection de ces marqueurs est fonction du panel d’anticorps utilisé au
diagnostic. Initialement réalisée à l’aide de cytomètres 2 ou 3 couleurs, l’utilisation
plus récente de cytomètres 6-8 couleurs a permis un confort d’utilisation, un gain
de temps technique et une augmentation du seuil de détection.
Actuellement le suivi de la MRD est réalisé sur moelle osseuse compte tenu
du manque de sensibilité du phénotypage sur sang [23]. L’évaluation de la MRD par
CMF a montré un intérêt pronostique à différents temps du traitement à la fois dans
des études rétrospectives et prospectives:
lors de l’aplasie post-induction [24],
au terme d’une cure d’induction [23-24-25],
au terme des cures de consolidation [16, 22, 24].
La recherche et la quantification de la MRD sur un LAIP sont réalisées en
visualisant les blastes dans divers diagrammes permettant de caractériser leurs
profils d’expression pour les antigènes marqués. Au diagnostic, pour chaque
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar45
diagramme, la population blastique est fenêtrée. En combinant les événements
contenus dans ces fenêtres, on obtient le nombre de blastes présentant le
phénotype aberrant. En rapportant celui-ci au nombre de leucocytes, on obtient le
pourcentage de blastes présentant le phénotype aberrant. Un rétrocontrôle de la
population blastique fenêtrée est enfin réalisé sur un diagramme CD45/SS.
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Le profil
phénotypique des blastes est visualisé dans plusieurs diagrammes. Le fenêtrage permet de définir la population exprimant le LAIP (« MRD ») par une fenêtre combinant les événements « Blastes+Y1+Y2+Y3+Y4+Y5+Y6 ». Celle-ci est colorée en noir. Enfin, la quantification des blastes exprimant le LAIP est exprimée en pourcentage du nombre de leucocytes total (ici 53%).
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Pour évaluer la MRD à un point de suivi ultérieur, le masque des fenêtrages
déterminés lors du diagnostic est appliqué sur les cellules étudiées. Un rétrocontrôle
de la position de ces blastes sur un diagramme CD45/SS est de nouveau effectué
permettant d’en apprécier la position, la dispersion et d’éviter un biais de sélection
(figure5).
Pour une LAM, plusieurs types de LAIP peuvent ainsi être suivis.
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
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.
Le profil phénotypique des blastes est visualisé sur les mêmes diagrammes qu’au diagnostic. Le masque du fenêtrage réalisé au diagnostic est appliqué sur les cellules étudiées. Les nombre de blastes exprimant le LAIP (« MRD ») est obtenu en combinant les événements « Blastes+Y1+Y2+Y3+Y4+Y5+Y6 » qui sont colorés en noir. Enfin, la quantification des blastes exprimant le LAIP est exprimée en pourcentage du nombre de leucocytes total (ici 0.49%).
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar49
L’évaluation de la MRD passe par le calcul du pourcentage d’événements
présentant un phénotype inhabituel parmi les leucocytes totaux.
L’analyse est basée sur la comparaison des résultats par rapport à un pool de
moelles de « référence ». On utilise pour chaque combinaison antigénique 5 à 9
moelles témoins qui ont été marquées avec le même panel d’anticorps que le
prélèvement d’intérêt. Le nombre d’événements obtenus sur les moelles de
référence permet de déterminer l’expression normale ou physiologique d’un LAIP
donné et de calculer la valeur du seuil de positivité. Le seuil de positivité est alors
égal à la moyenne plus 2 écart-types du pourcentage de leucocytes exprimant le
LAIP observé dans les moelles de référence.
Il est donc possible de suivre la MRD par CMF à différents temps du
traitement chez une majorité de patients avec LAM. Les avantages de cette
technique sont une bonne disponibilité du matériel dans les centres hospitaliers, un
rendu rapide des résultats et un coût inférieur comparé aux techniques de biologie
moléculaire. Toutefois, l’analyse des données nécessite une expertise importante,
l’évaluation est dépendante du manipulateur [22]et des variations phénotypiques
peuvent être présentes à la rechute, ce qui peut en limiter l’utilisation [22, 23].
Enfin, l’analyse de la MRD par CMF manque actuellement de standardisation
et il existe une grande hétérogénéité des seuils de positivité retenus dans chaque
étude (tableau7).
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Dr.AMRANI kawthar50
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar51
Le suivi de la MRD en biologie moléculaire s’effectue essentiellement en routine par
la quantification de différents marqueurs moléculaires par PCR quantitative en
temps réel (RQ-PCR). L’intérêt de cette technique repose sur sa grande sensibilité
avec une limite de détection pouvant atteindre 10-6 pour certaines cibles. Pour cela,
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar52
il faut disposer d’un marqueur le plus spécifique possible des cellules tumorales et
stable dans le temps. Il peut s’agir d’un transcrit de fusion récurrent, d’une mutation
génique, de la surexpression de certains gènes ou encore d’un réarrangement.
Le choix du marqueur constitue une étape déterminante. Si les transcrits de fusion
constituent une cible alliant à la fois spécificité, stabilité, applicabilité au plus grand
nombre et faisabilité technique en routine pour un coût acceptable, ceux-ci ne
concernent qu’environ 30 à 40 % rares imposant le design d’amorces spécifiques
d’un patient donné, approche à la fois lourde et consommatrice de temps. De
même, l’évolution clonale ou l’émergence de sous-clones peuvent parfois induire de
véritables échecs de suivi.
Les avancées de ces dernières années en matière de séquençage haut débit viennent
aujourd’hui révolutionner la façon d’appréhender le suivi de ces hémopathies. Outre
une excellente sensibilité, ces techniques sont capables de fournir une quantité
considérable d’informations permettant la prise en compte du caractère multiclonal
de ces pathologies et le suivi de plusieurs marqueurs simultanément en un temps
réduit. Il est aujourd’hui possible de suivre un clone minoritaire au sein d’une
population leucémique, voire d’observer l’émergence d’un clone résistant non
détecté au diagnostic. Les progrès continuels ayant contribué à abaisser les coûts,
les laboratoires disposant de ces techniques sont de plus en plus nombreux et le
séquençage de nouvelle génération va s’imposer peu à peu comme un outil de choix
dans l’évaluation de la maladie résiduelle [26].
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar53
Il n’existe pas de marqueur de BM associé à l’ensemble des LAM. Dans un
certain nombre de cas, il est possible de suivre de manière quantitative l’évolution
d’un transcrit de fusion associé spécifiquement à un type de leucémie. Lorsqu’il
s’agit d’une leucémie aigüe dépourvue de transcrit spécifique, le suivi moléculaire
repose alors sur la détection des mutations du gène NPM1 et sur la surexpression
du gène WT1.
Dans les leucémies aiguës promyélocytaires (LAP), la détection de la MRD
repose sur la mise en évidence du produit de la translocation t(15;17), le transcrit
PML-RARA, retrouvé dans 99% des cas. L’obtention de la rémission moléculaire
complète en fin de consolidation est nécessaire pour obtenir la guérison. Une MRD
positive après traitement ou la repositivation au cours du suivi précédent le plus
souvent la rechute hématologique. Dans le cas de la LAP,
la MRD permet de guider les thérapeutiques interventionnelles précoces par
chimiothérapie ou transplantation de cellules souches. De plus, des études ont
montré un gain de survie lié à l’intervention précoce devant une rechute moléculaire
[27].
Dans les LAM à core binding factor, le suivi des transcrits de fusion RUNX1-
RUNX1T1 et CBFB-MYH11 retrouvés respectivement dans les LAM avec t(8;21) et les
LAM inv(16), a montré un intérêt pronostique sur le risque de rechute.
Concernant les LAM avec réarrangement du gène MLL, la grande diversité des
gènes partenaires possibles ainsi que la grande variabilité des points de cassure
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Dr.AMRANI kawthar54
rendent difficile leur utilisation comme cible de MRD en pratique courante,
nécessitant souvent le design d’oligonucléotides patient-spécifiques.
Le gène de la nucléophosmine est muté dans environ 30% des LAM et dans
plus de la moitié des LAM-CN. Cette mutation est stable au cours du temps ce qui
en fait un marqueur de suivi intéressant pour détecter la rechute. Ainsi, chez des
patients présentant une mutation au diagnostic, la mutation est également
présente à la rechute dans la majorité des cas [27-28].
La quantification de la mutation de dans le cadre de l’évaluation de la
MRD repose sur l’utilisation de la PCR quantitative en temps réel (RQ-PCR) réalisée à
partir d’ARN/ADNc le plus souvent. L’évaluation sur ADN semble moins sensible [24]
. L’expression de la mutation est rapportée à l’activité du gène de référence
dans la plupart des cas.
Dans les différentes études évaluant l’impact de la MRD basée sur , la
MRD a été évaluée à plusieurs temps : en post-induction, en post-consolidation ou
encore en fin de traitement. Il a été mis en évidence un impact pronostique du suivi
de la MRD à des temps précoces (post induction voire au cours de l’aplasie) ou plus
tardifs (post consolidation ou en fin de traitement), aussi bien sur le risque de
rechute que sur la survie
Le gène de la nucléophosmine est muté dans environ 30% des LAM et dans
plus de la moitié des LAM-CN. Cette mutation est stable au cours du temps ce qui
en fait un marqueur de suivi intéressant pour détecter la rechute.
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Dr.AMRANI kawthar55
Toutefois, les seuils évalués pour définir une maladie résiduelle négative ou
positive varient selon les études et aucune étude publiée n’a intégré la MRD basée
sur dans la prise en charge thérapeutique des patients.
Le gène WT1 est exprimé chez les sujets sains et sa surexpression est
retrouvée dans la majorité des LAM (70-90% des cas). Le niveau de surexpression
varie entre les différents types de leucémies. Ainsi, une surexpression marquée de
WT1 est notamment détectée chez les patients atteints de LAM du groupe CBF ou
ayant une mutation de NPM1 alors que les LAM 5 selon la classification FAB
semblent présenter des taux inférieurs d’expression de WT1 [29].
C’est un marqueur stable. Ainsi, chez la plupart des patients ayant au
diagnostic une surexpression de , celle-ci sera retrouvée à la rechute [27-28].
C’est également un bon marqueur pour suivre la profondeur de la réponse au
traitement puisque ses variations quantitatives sont corrélées au statut de la
maladie. L’expression physiologique de chez les sujets sains est moins
importante dans le sang périphérique (quasiment indétectable) que dans la moelle
osseuse. Le seuil de détection a donc été abaissé dans le sang par rapport à la
moelle osseuse. Les taux de retrouvés au diagnostic ne varient pas
significativement entre ces deux types d’échantillons [30].
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
Dr.AMRANI kawthar56
Ce travail permet de mettre en évidence l’intérêt de l’utilisation de la
cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation de la MRD. Obtenir
une quantification de la MRD de manière précoce pourrait permettre d’identifier les
patients à plus haut risque d’évolution et de proposer un schéma thérapeutique
incluant une intensification par allogreffe de cellules souches hématopoïétiques plus
précocement.
La cytométrie en flux est un moyen rapide, accessible permettant le suivi
d’une maladie résiduelle chez les patients, y compris ceux qui ne présentent pas de
marqueur de suivi par RQ-PCR et qui sont nombreux.
la biologie moléculaire occupe aujourd’hui une place de choix dans la prise
en charge des LA, du diagnostic à l’évaluation du pronostic, au suivi voire même à la
stratification thérapeutique. Elle a grandement contribué à étoffer nos
connaissances de la leucémogenèse humaine et permet aujourd’hui d’envisager une
prise en charge « à la carte » de chaque patient. Il est très probable qu’avec des
techniques toujours plus sensibles, standardisées et robustes, utilisables en routine,
la biologie moléculaire devrait occuper une place de plus en plus importante.
L’ensemble des données présentées valident l’intérêt d’une évaluation
précoce de la maladie résiduelle, quelle que soit la technique utilisée. Cependant,
une uniformisation des pratiques concernant l’évaluation de la MRD par CMF est
nécessaire.
Ainsi à plus long terme et après validation prospective, ces données
pourraient être utilisées dans des stratégies de stratifications thérapeutiques.
L’apport de la cytométrie en flux et de la biologie moléculaire dans l’évaluation précoce de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes
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Dr.AMRANI kawthar63
Bien que la majorité des patients atteints de leucémie aiguë obtienne une
rémission complète à l’issue de la chimiothérapie d’induction, près d’un patient sur
deux « rechute » à plus ou moins long terme. De nombreux facteurs pronostiques
ont été développés afin d’identifier plus précocement ces patients à risque. Si les
facteurs préthérapeutiques liés au patient lui-même (âge, comorbidités) ou à sa
maladie (leucocytose, immunophénotype et surtout anomalies cytogénétiques et/ou
moléculaires) constituent généralement de bons indicateurs pronostiques, aucun
d’entre eux ne permet de prendre en compte les différences interindividuelles dans
le métabolisme des molécules ou la réponse immune anti-leucémique.
On considère en général que le nombre de cellules tumorales au diagnostic
de LA est de l’ordre de 10 puissances 12 cellules. Dès que ce nombre passe en
dessous de 10 puissances 10 sous l’action de la chimiothérapie, les cellules
leucémiques ne sont plus détectées par l’examen cytologique du sang et de la
moelle osseuse. Le patient est alors considéré en rémission hématologique
complète. Ceci ne signifie pas pour autant que les cellules tumorales aient
totalement disparu de l’organisme mais qu’elles sont présentes à des taux inférieurs
aux limites de détection des techniques cytologiques. En plus d’une sensibilité assez
faible, ces techniques s’avèrent parfois difficiles d’interprétation (moelle de richesse
variable, présence de blastes de régénération). C’est dans ce contexte que vient se
placer l’évaluation de la maladie résiduelle (MRD) comme un outil de choix
permettant l’évaluation précise, sensible et objective de la réponse thérapeutique à
l’échelle individuelle.
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La MRD est ainsi définie comme la persistance de cellules leucémiques ayant
survécu à la chimiothérapie et présentes en nombre inférieur au seuil de détection
des méthodes cytologiques classiques.
L’importance de la MRD est devenue en quelques années l’un des facteurs
pronostiques majeurs pour le risque de rechute dans les leucémies aiguës. Elle
permet de suivre l’évolution de la masse tumorale et permet ainsi de mieux
apprécier la sensibilité des cellules tumorales aux divers traitements et d’évaluer la
qualité de la rémission complète.
La MRD prend alors progressivement sa place comme un outil de
stratification thérapeutique dans les essais cliniques.
Le suivi de la MRD permet ainsi de prédire la rechute hématologique avant
qu’elle ne se manifeste cliniquement et d’orienter plus précocement le patient vers
une intensification thérapeutique.
Les techniques de cytogénétique conventionnelle ou de FISH peuvent être
utilisées mais leur sensibilité est relativement voisine de celles de la cytologie (10 -
à 10 - ). Depuis les années 2000, le développement de la MRD par
immunophénotypage en cytométrie en flux, fondée sur l’expression
d’immunophénotype aberrant associé à la leucémie (LAIP) par les blastes
leucémiques, constitue une alternative séduisante en particulier en absence de
marqueur moléculaire, mais avec une sensibilité généralement inférieure à celle de
la biologie moléculaire (de l’ordre de 10 - à 10 - ).
Le suivi de la MRD en biologie moléculaire s’effectue essentiellement en
routine par la quantification de différents marqueurs moléculaires par PCR
quantitative en temps réel (RQ-PCR).