This article was downloaded by: [Nipissing University]On: 16 October 2014, At: 12:44Publisher: Taylor & FrancisInforma Ltd Registered in England and Wales Registered Number: 1072954Registered office: Mortimer House, 37-41 Mortimer Street, London W1T 3JH,UK
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Etude de l'origine et de larépartition des granulesvacuolaires dans les hyphesd'une endomycorhize àvésicules et arbusculesJean Dexheimer a , Joëlle Gérard a , Hassan Ayatti b
& Jaafar Ghanbaja ca Laboratoire de Biologie forestière , associé àl'INRA , équipe “Cytophysiologie des Symbiosesmycorhiziennes”b Service commun d'Etudes biologiques enMicroscopie électroniquec Service commun de Microscopie électronique àTransmission, Université Henri Poincaré , B.P. 239,F-54506 , Vandœuvre CedexPublished online: 27 Apr 2013.
To cite this article: Jean Dexheimer , Joëlle Gérard , Hassan Ayatti & JaafarGhanbaja (1996) Etude de l'origine et de la répartition des granules vacuolaires dansles hyphes d'une endomycorhize à vésicules et arbuscules, Acta Botanica Gallica:Botany Letters, 143:2-3, 167-180, DOI: 10.1080/12538078.1996.10515337
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Acta bot. Gallica, 1996, 143 (213), 167-180.
Etude de l'origine et de Ia repartition des granules vacuolaires dans les hyphes d 'one endomycorhize a vesicules et arbuscules
par Jean Dexheimer C), Joelle Gerard C), Hassan Ayatti () et Jaafar Ghanbaja C)
( 1) Laboratoire de Biologiej(Jrestiere. associti c/ /'1NRA. equipe "Cytophysiologie des Symbioses mycorhiziennes", ('Service commun d'Etudes biologiques en Microscopie e/ectronique, (''Service C0/11/11Wl de Microscopie e/ectronique c) Transmission, Universite Henri Poincare, B.P. 239, F-54506 Vand(ruvre Cedex
( Manuscrit rep1 en amlt 1995: accepte en janvier 1996)
Resume.- Les auteurs ont observe trois types d'inclusions dans les hyphes de I' endophyte : des granules vacuolaires arrondis et denses, des granules vacuolaires moins denses et plus diffus, des granules inclus dans de petites vesiculas. Ces diverses inclusions son! etudiees a l'aide de techniques cytochimiques et de !'analyse par spectroscopie d'electrons en perle d'energie. Les granules cytoplasmiques denses correspondent aux granules de polyphosphates deja decrits par de nombreux auteurs. lis renferment du phosphore et du calcium, associes a une fraction proteique. Les granules cytoplasmiques et les granules vacuolaires peu denses et diffus son! uniquement proteiques. Les auteurs emettent !'hypothese que les granules intracytoplasmiques proteiques son! les precurseurs des granules vacuolaires de polyphosphates. Ces granules se torment dans des vesiculas don! Ia nature n'a pas pu eire precisee. Les granules vacuolaires diffus son! les restes des granules de polyphosphates apres le transfer! du phosphore vers Ia plante-h6te. Les granules de polyphosphate son! communs dans les hyphes intercellulaires, mais plus rares et souvent absents dans les hyphes de l'arbuscules. Pour les auteurs, cette repartition est en relation avec Ia dynamique des echanges entre les partenaires.
Summary.- The authors have observed three different types of inclusions in hyphae of the endophyte : dense vacuolar granules, less dense and often diffuse vacuolar granules and granules included in small cytoplasmic vesicles. These inclusions were studied by cytochemical techniques and by energy electron loss spectroscopy. Dense granules correspond to polyphosphate granules already described by many authors. They contain phosphorus and calcium associated with a proteic fraction. Cytoplasmic granules and diffuse vacuolar granules are protein-rich inclusions without phosphorus and calcium. The authors suggest that the cytoplasmic inclusions are precursors of polyphosphate granules. These inclusions are contained in unknown origin vesicles. The
©Societe botanique de France 1996. ISSN 1253-8078.
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diffuse protein-rich vacuolar granules are the remaining of polyphosphate granules after the transfer of phosphorus to the host. The polyphosphate granules are common in intracellular hyphae, but more rare and often absent in the hyphae of the arbuscule. For the authors, this repartition is linked with the dynamic of exchanges between the partners of the symbiosis.
Ker ll'lmls : vesicular-arbuscular mycorrhiza- polyphosphate granules- cytochemistry - energy electron loss spectroscopy - phosphorus - protein.
INTRODUCTION
Les endomycorhizes a vesicules et arbuscules (mycorhizes VA ou YAM) sont le type mycorhizien le plus repandu chez les vegetaux vasculaires herbacees et ligneux. Comme toutes les mycorhizes, elles ameliorent de maniere tres sensible Ia nutrition minerale de Ia plante-h6te, notamment Ia nutrition phosphatee (Harley, 1969 ; Sanders et Tinker, 1971 ; Bowen et a/., 1975 : Callow et a/., 1978 ; Walker et Powell, 1979 ; Cappacio et Callow, 1982 ; Strullu eta/., 1981a et b; Strullu eta/., 1982a et b).
Tous les auteurs, qui ont etudie Ia cytologie des endomycorhizes VA, ont decrit dans les vacuoles du champignon de petites inclusions rondes, opaques aux electrons. Ces inclusions, observees en microscopie photonique apres une coloration par le bleu de toluidine, sont colorees en rouge. II s'agit des granules metachromatiques signales dans les hyphes de diverses especes de champignons (Chi Ivers et at., 1985 ; Simonet a!., 1984 ), y compris les champignons formant des ectomycorhizes ou des endomycorhizes. Par des microanalyses en rayons X, il a ete montre que ces granules sont riches en phosphore sous forme de polyphosphates (Ashford et a/., 1975 ; Strullu et a!., 1981 a et b ; Strullu et a!., 1986) et, eventuellement, en d'autres elements (calcium, aluminium). Pour Callow eta/. ( 1978), ces granules de polyphosphates renfennent 40 % du phosphore total present dans le champignon.
II est couramment admis qu'ils sont une forme de transport du phosphore par le champignon, entre le sol et Ia plante-h6te
(Cox eta/., 1980), et sont done directement impliques dans Ia nutrition phosphatee de Ia plante-h6te.
Toutefois, dans une etude recente, et pour un champignon ectomycorhizien (Pisolithus tinctorius), Orlovich et Ashford ( 1993) emettent !'hypothese que les granules de polyphosphate sont des artefacts induits par Ia deshydratation par I 'alcool. Dans les echantillons, traites par cryo-substitution, ces inclusions ne sont pas observees.
En utilisant une deshydratation par !'acetone, des techniques cytochimiques (mise en evidence des polysaccharides, coloration des proteines) et surtout !'analyse par spectroscopie d'electron en perte d'energie, nous avons etudie les granules vacuolaires d'un champignon des endomycorhizes a vesicules et arbuscules de merisier. Nous nous sommes attaches a preciser Ia nature et l'origine de ces granules.
MATERIEL ET METHODES
Techniques cytologiques Le materiel et les techniques cytologiques ont deja
ete presentes dans de precedentes publications (Dexheimer et al., 1979; Kreutz-Jeanmaire eta/., 1988) et nous ne reprendrons ici que les points essentiels. En particulier, nous rappellerons que pour eviler des artefacts dus ala deshydratation par l'alcool, les objets ont ete deshydrates par !'acetone.
Les coupes des objets inclus dans l'epon ont ete utili sees sans contraste (analyse en spectroscopie d'electrons), contrastees par Ia double coloration classique (acetate d'uranyle et citrate de plomb) ou ont ete soumises a des reactions cytochimiques, pour mettre en evidence les polysaccharides (test PATAg), les proteines (coloration Gomori) ou identifier les membranes (coloration des membranes plasmalemmiques par l'acide phosphotungstique).
Elles ont ete observees avec differents microscopes electroniques . SIEMENS 102, ZEISS 902Aou PHILIPS CM20.
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Etude spectroscopique par perte d'energie des electrons transmis
Ces etudes ont ete effectuees par le microscope electronique Zeiss 902 A, equipe d'un double prisme permettant de realiser des images filtrees (ESI ou Electron Spectroscopy Imaging) et le microscope Phillips CM 20 equipe d'un spectrometre PEELS Gatan 66. Les techniques ESI et PEELS permettent respectivement de realiser des images filtrees et des analyses qualitatives et quantitatives des elements presents dans Ia zone analysee. Ces techniques ont ete utilisees pour etudier des ectomycorhizes (Kottke, 1991, 1994), mais n'ont jamais ete appliquees a l'etude des endomycorhizes.
ESI et traitement des images Le flux d'electrons, correspondant a un niveau de
perte d'energie, ne represente qu'une tres Iaibie part du faisceau d'electrons incident. Les images qui sont produites sont done tres peu lumineuses, et leur photographie exige des temps de pose assez longs (2 ou 3 minutes). Nous avons mis au point une autre technique pour obtenir des documents exploitables.
Le microscope ZEISS 902 A est equipe d'une camera video type SIT 66 DAGE MTI. Les images obtenues par Ia camera sont, d'une part envoyees sur un moniteur de contr61e, d'autre part, enregistrees sur une bande video.
Les documents video ont ete ensuite numerises en reliant un magnetoscope a un micro-ordinateur de type 486 DX2 50 equipe d'une carte de capture video.
L'etude du phosphore a ete realisee en utilisant le seuil L2, 3, situe a 132 eV (Ahnet a/., 1983).
Pour ameliorer Ia detection, le bruit de fond peut etre eli mine en utilisant des techniques de traitement d'images. On peut considerer que le fond cy1oplasmique represente, avec une bonne approximation, ce bruit de fond etant donne qu'il ne contient pas ou Ires peu de phosphore. II est done constitue par un masque ayant l'inten· site du fond cy1oplasmique, et ce masque est soustrait de l'image originale. Seules les zones presentant une intensite plus forte que le fond cy1oplasmique sont conservees et correspondent aux zones riches en phosphore. Cette image traitee peut ensuite etre additionnee a l'image originale, ce qui augmente Ia brillance des zones riches en phosphore et les rend particulierement evidentes.
Une autre methode pour eliminer le bruit de fond consiste a trailer l'image originale par un filtre creant un faux relief. Les zones les plus claires, done les plus riches en phosphore, apparaissent Ires saillantes sur un fond cy1oplasmique relativement uniforme.
Analyse par spectroscopie d'electrons (EELS) Cette etude est realisee sur une gamme de pertes
d'energie comprise entre 100 et 600 eV Les spectres obtenus ont ete traites a l'aide du programme EUP Galan. Le fond continu est soustrait des spectres. Certaines parties des spectres ont ete amplifiees (16 ou 32 lois) pour rendre visibles les pies correspondant a I' azote eta I' oxygene.
RESULTATS
Repartition des granules vacuolaires Nous avons precedemment decrit )'orga
nisation des endomycorhizes VA de merisier (Kreutz-Jeanmaire eta!., 1988) et nous rappellerons seulement les caracteristiques principales en nous interessant essentiellement a Ia repartition des granules vacuolaires.
Comme toutes les endomycorhizes VA, les mycorhizes de merisier sont caracterisees par un reseau d'hyphes intercellulaires (Kreutz-Jeanmaire eta!., 1988) et des formations intracellulaires, les arbuscules et les pelotons. Dans le materiel que nous avons utilise pour notre etude, le reseau d'hyphes intercellulaires est parfois important, les arbuscules sont nombreux, mais les vesicules sont rares.
Les pelotons sont surtout presents dans les cellules corticales superficielles, alors que les arbuscules occupent toujours une position plus profonde et sont communs dans les cellules corticales au contact de l'endoderme.
Les hyphes, qui forment le reseau intercellulaire, sont surtout localisees dans les meats entre les cellules corticales. Ces hyphes ont un diametre important (50 a I 00 J..l.m) et sont etroitement appliquees sur Ia surface externe des parois cellulaires. Leur section peut occuper toute Ia cavite du meat.
Les cellules, qui sont colonisees par le champignon, renferment un grand nombre de sections d'hyphes intracellulaires, depuis les grosses branches de l'arbuscule jusqu'aux fines branches.
Le cytoplasme de !'endophyte, dense et riche en ribosomes, renferme un systeme vacuolaire constitue de petites vacuoles (Pl. I, figs. I, 2, 3, 4 ). Elles conservent leur individualite meme dans les hyphes agees ou elles ne sont plus separees les unes des autres que par les tonoplastes affrontes (Pl. I, fig. 4 ).
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Planche I
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La plupart des vacuoles presentent une lumiere claire, transparente aux electrons, mais nous avons aussi observe des vacuoles dont le contenu presente un aspect floculeux plus ou moins dense.
Les vacuoles contiennent souvent des granules arrondis, de contour bien defini, et denses aux electrons (Pl. I, fig. I). Ces granules sont observes aussi bien dans des vacuoles a contenu clair qu'a contenu floculeux.
Dans les sections des grosses branches, les inclusions vacuolaires sont moins courantes, et elles ont un diametre plus faible que celui des granules des hyphes intercellulaires (Pl. I, fig. 2).
Dans les petites branches de l'arbuscule, leur repartition varie suivant l'echantillon ou, dans un meme objet, suivant les cellules. Dans Ia plupart des arbuscules, les vacuoles des petites branches ne renferment pas de granules denses (Pl. I, fig. 4) ou, lorsqu'ils sont presents, ils sont toujours de petite taille.
Nous avons aussi observe des inclusions vacuolaires moins denses. Certaines sont rondes, mais d'autres ont un contour plus diffus. Ces inclusions, presentes dans toutes les parties de Ia mycorhize, sont particulierement abondantes dans les vacuoles des hyphes de l'arbuscule (Pl. I, fig. 4 ).
Enfin, le cytoplasme du champignon renferme aussi des inclusions sombres sou vent moins denses que les granules vacuo! aires. Elles presentent une section arrondie a legerement ovale et un diametre comparable ou legerement superieur a celui des granules vacuolaires (Pl. I, fig. 3) des hyphes·intercellulaires.
Ces inclusions, que nous appellerons granules cytoplasmiques, sont incluses dans des vesicules limitees par une membrane continue dont le contraste, apres un test PATAg, est beaucoup plus marque que celui des autres membranes cytoplasmiques, et notamment que le tonoplaste (Pl. II, fig. 2). Seulle plasmalemme et surtout les membranes des formations plasmalemmiques sont contrates aussi nettement par le test de polysaccharides (Pl. II, fig. I). A pres une coloration par l'acide phosphotungstique, specifique des membranes plasmalemmiques, cette membrane n'est pas co Ioree (Pl. II, fig. 6 ), contrairement a celles des formations plasmalemmiques (Pl. II, fig. 5). A cote de ces vesicules contenant une inclusion bien definie, nous avons aussi observe des vesicules limitees par une membrane de meme nature mais dont le contenu est a l'etat diffus. Elles pourraient correspondre a l'etat initial de Ia formation de ces granules (Pl. II, fig. 2) avant Ia condensation de leur contenu.
Planche I Fig. 1.- Hyphe intercellulaire. La vacuole (v) renferme un granule sombre arrondi (fleche). La lumiere de Ia vacuole
presente un contenu legerement floculeux. (x 45000). Fig. 2.- Hyphe intracellulaire. Grosse branche de l'arbuscule. Quelques vacuoles contiennent de petits granules
sombres (fleches). mais Ia plupart d'entre elles paraissent vides. (x 15000). Fig. 3.- Hyphe intracellulaire. Grosse branche de l'arbuscule. Les granules cytoplasmiques ant une section plus ou
mains ovale et son! inclus dans de petites vesicules doni Ia membrane limitante est particulierement nette. En bas a droite, Ia vesicule qui contient le granule est etroitement appliquee contre une vacuole (v) doni elle delorme le contour. (x 40000).
Fig. 4.- Hyphe intracellulaire. Petite branche de l'arbuscule. Certaines vacuoles contiennent des inclusions mains denses et d'aspect plus diffus (fleches) que les granules des vacuoles des hyphes intercellulaires. (x 30000).
Plate I Fig. 1.- Intercellular hypha. The vacuole contains a dense rounded granule (arrow) and a diffuse fibrillar content.
(x 45000). Fig. 2.- Intracellular hypha. Large branch. Some vacuoles contain small dense granules (arrows). but most of them
seem empty (x 15000). Fig. 3.- Intracellular hypha. Large branch. The cy1oplasmic granules have a section more or less oval and are
included in small vesicles. Notice an inclusion applied on a vacuole (arrow). (x 40000). Fig. 4.- Intracellular hypha. Small branch. The inclusions of some vacuoles are less dense and more diffuse than the
polyphosphate granules (compare with Fig. 1 ). (x 30000).
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Souvent, Ia vesicule qui les contient est en contact etroit avec une vacuole. Les Iumieres vacuolaires et vesiculaires ne sont plus separees que par Ie tonoplaste et Ia membrane limitante de Ia vesicule (Pl. I, fig. 3 ; Pl. II, fig. 2).
Analyse des granules vacuolaires et cytoplasmiques
En combinant des techniques cytochimiques et Ia spectroscopie d'electrons en perte d'energie, nous avons essaye de preciser Ia nature et, eventuellement, Ies relations entre les granules vacuolaires et les granules cytoplasmiques.
• Test PATAg Le test PATAg de mise en evidence des
polysaccharides contraste tres fortement les parois fongiques et les rosettes de glycogene du cytoplasme. Au contraire, les granules vacuolaires ou cytoplasmiques ne sont pas reactifs, montrant ainsi )'absence de polysaccharides dans leur constitution. Nous rappelons que Ia membrane des vesicules cytoplasmiques est tres reactive (Pl. II, fig. 2).
• Coloration des proteines de Gomori Apres une coloration des proteines se-
Ion Ia methode de Gomori, les granules vacuolaires et les granules cytoplasmiques sont fortement contrastes. Ils renferment done une importante fraction proteique (Pl. II, fig. 3 et 4).
• Imagerie par spectroscopie d'electrons Avec une perte d'energie de 132 eV cor
respondant au seuil L2,3 du phosphore, les granules vacuolaires des hyphes intercellulaires sont lumineux (Pl. III, fig. 2). L'elimination du bruit de fond (Pl. III, figs. 3 et 4) rend ces granules encore plus evidents. Ils renferment done une forte concentration de phosphore. Cependant, apres quelques minutes d'observation, Ia luminosite decroit, indiquant une vaporisation du materiel irradie par le faisceau d'electrons.
Au contraire, les inclusions cytoplasmiques sont peu ou pas lumineuses a ce niveau de perte d'energie et elles sont noyees dans le bruit de fond. Elles contiennent done peu de phosphore.
Analyse par spectroscopie d't!lectrons en perte d'energie
Nous avons analyse les granules vacuolaires denses et Ies granules cytoplasmiques.
Planche II Fig. 1.· Test PATAg mettant en evidence Ia reactivite des membranes d'un plasmalemmasome. (x 40000). Fig. 2.- Test PATAg. Les membranes des vesicules renfermant les inclusions cytoplasmiques son! nettement reacti·
ves contrairement aux autres membranes cytoplasmiques. Certaines vesicules, limitees par une membrane reactive, ant un contenu diffus (etoiles). Une des vesicules contenant une inclusion est appliquee contre une vacuole (fleche). (x 40000).
Fig. 3.· Mise en evidence des proteines par Ia reaction de Gomori. Les granules vacuolaires son! reactifs (fleche). (x 15000).
Fig. 4.- Mise en evidence des proteines par Ia reaction de Gomori. Le granule cytoplasmique est marque (fleche). (x 30000).
Fig. 5.- Coloration des membranes d'un plasmalemmasome par l'acide phosphotungstique. (x 30000). Fig. 6.- La membrane limitante de Ia vesicule avec une inclusion (flilche) n'est pas coloree par l'acide phosphotungs
tique. (x 30000). Plate II
Fig. 1.- Reactivity of plasmalemmasoma membranes with PATAg test. (x 40000). Fig. 2.- Membranes of vesicles with inclusions are stained by PATAg test contrarily to the other cytoplasmic mem
branes. Some vesicles, surrounded by a stained membrane, have a diffuse content (stars). Notice a vesicle applied on a vacuole (arrow). (x 40000).
Fig. 3.- Staining of proteins by the Gomori reaction. Polyphosphate granules are stained. (x 15000). Fig. 4.- Staining of proteins by the Gomori reaction. The cytoplasmic inclusion is marked (arrow). (x 30000). Fig. 5.- Staining of plasmalemmasoma membranes by phosphotungstic acid. (x 30000). Fig. 6.- Membranes of vesicles containing a proteinic inclusion (arrow) are not stained by phosphotungstic acid.
(x 30000).
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Les analyses montrent que les granules vacuolaires denses renferment du phosphore, du calcium, du carbone, de !'oxygene et de !'azote (Fig. I, a et b), tandis que les granules cytoplasmiques ne contiennent que du carbone, de !'oxygene et de )'azote (Fig. 2, a et b). Les etudes cytochimiques ont montre que ces derniers granules sont de nature proteique, ce qui est confirme par Ia mise en evidence d'oxygene et d'azote.
La presence de phosphore, de calcium, d'azote et d'oxygene dans les granules vacuolaires indique probablement que le phosphore est sous Ia forme de polyphosphates de calcium associes a une fraction proteique.
Dans tous les objets analyses, le pic du carbone amorphe (280 eV) est constamment present mais il est peu significatif puisqu'il s'agit d'un materiel biologique, riche en carbone et inclus dans une resine renfermant aussi de grandes quantites de carbone.
Nous avons aussi analyse le deuxieme type de granule vacuolaire, moins dense et plus diffus que les granules de polyphosphates. Dans ces granules, nous n'avons pas detecte de phosphore, mais seulement, comme dans les granules cytoplasmiques, du carbone, de !'azote et de !'oxygene. lis sont done de meme nature que ces derniers.
DISCUSSION ET CONCLUSION
Dans le cytoplasme de !'endophyte, nous avons observe trois types d'inclusions granulaires : des granules inclus dans de petites vesicules cytoplasmiques, des granules vacuolaires denses et arrondis et des granules vacuolaires moins denses et plus ou moins diffus.
Les techniques de cytochimie ultrastructurale, couplees a !'analyse par spectroscopie d'electrons en perte d'energie, nous ont permis de montrer sans ambigu'ite que les granules vacuolaires denses sont riches en phosphore et en calcium. Les analyses effectuees par Ia spectroscopie d'electrons en perte d'energie confirment done les resultats de Strullu et at. ( 1981) obtenus par analyse en rayons X dans les mycorhizes avesicules et arbuscules de Taxus baccata. lis cmTespondent done bien aux granules de polyphosphate analyses avec d'autres methodes dans diverses mycorhizes et microorganismes (Ashford eta!., 1986 ; Chi Ivers eta!., 1978 ; Chi Ivers et Harley, 1980 ; Chi Ivers eta!., 1985 ; Grellier eta!., 1989 ; Martin et a!., 1985 ; Moore et a!., 1991 ; Orlovich eta!., 1989, 1990; Simonet al., 1984 ; Strullu eta!., 1981 a et b ; Strullu et a!., 1982a et b ; Yare, 1990). Ces granules renferment des proteines qui servent probablement de trame pour fixer les polyphosphates.
Planche Ill Fig. 1.· Image obtenue sans coloration de contraste avec une perte d'energie nulle (0 eV). Les vacuoles (v) et les
granules vacuolaires sont bien visibles. (x 30000). Fig. 2.- Image du meme objet obtenue avec une perte d'energie de 132 eV, correspondant au phosphore. Les
granules vacuolaires sont brillants. (x 25000). Fig. 3.- Meme cliche que l'image precedente. L'utilisation d'un filtre creant un faux relief met bien en evidence les
parties les plus lumineuses, correspondant a une accumulation de phosphore. Le fond est tres attenue. (x 25000). Fig. 4.- Meme cliche que Ia figure 2, mais apres elimination du bruit de fond. Les granules sont toujours visibles,
confirmant bien Ia presence de phosphore. (x 25000). Plate Ill
Fig. 1.- Image obtained without staining at 0 eV energy loss. Vacuoles (v) and dense granules are evident. (x 30000). Fig. 2.- Image of the same object but at 132 eV energy loss (phosphorus). Vacuolar granules are very luminous.
(x 25000). Fig. 3.- Previous image, but processed with an emboss filter. The background is reduced and the phosphorus-rich
granules appear clearly. (x 25000). Fig. 4.- Same image than figure 2, but after subtraction of background noise. As image processed by a relief filter, the
phosphorus-rich granules appear very clearly. (x 25000).
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10
2
0
50
C-K
200 300
• 32
Ca-1.2.3
400 500
Energy Loss ( e V)
Ca-1.2.3
a
0-K
Fig. 1.- a :spectre d'un granule vacuolaire nivelant Ia presence de phosphore (P), de carbone (C), de calcium (Ca) et d'oxygeme (0). Les indications (L2,3; K ... ) correspondent aux couches electroniques utilisees pour Ia detection. b : spectre d'ensemble d'une inclusion vacuolaire. L'amplification 32 lois de Ia zone comprise entre 320 eV et 600 eV revele Ia presence d'azote. Les pies du calcium et de !'oxygene son! aussi bien visibles.
Fig. 1.- a : spectrum of a vacuolar granule revealing the presence of phosphorus (P), carbon (C), calcium (Ca) and oxygen (0). L2,3, K ... indicate edges used for detection. b : spectrum of a vacuolar inclusion. The amplification 32 time of the zone between 320 and 600 eV reveals the presence of nitrogen. Notice the edges of calcium and oxygen.
ol_~--2~oo~~~3~oo~~~400~==~~s;oo~~~6oo~~_j Energy Loss ( e V)
No us remarquerons que Kottke ( 1991 ), en utilisant Ia meme methode pour analyser des granules de polyphosphates dans une ectomycorhize, a aussi montre Ia presence de phosphore, de calcium, d'azote et d'oxygene_ Mais contrairement a cet auteur, nous n'avons pas detecte d'aluminium.
Dans un recent travail effectue sur le champignon ectomycorhizien Pisolithus tinctorius, Orlovich et Ashford ( 1993) considerent que les granules de polyphosphate
b
sont des artefacts puisqu'ils ne sont pas observes apres utilisation de techniques de cryosubstitution_ Pour ces auteurs, les polyphosphates seraient presents sous forme soluble dans Ia vacuole des hyphes vivantes et seraient precipites par !'ethanol utilise dans Ia deshydratation des objets_
Dans le present travail, nous n'avons pas utilise d'ethanol pour deshydrater nos objets, mais de !'acetone et, neanmoins, nous avons observe des granules riches en phos-
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Energy Loss (eV)
Fig. 2.· a : spectre d'ensemble d'une inclusion cytoplasmi· que. Absence de pic a 132 eV (marque par P) correspondant au phosphore et 3350 eV, correspondant au calcium (comparer avec le spectre precedent, courbe non amplifiee). b : Ia zone comprise entre 350 et 700 eV a ete amplifiee 16 lois. Les pies de I' azote et de !'oxygene sont bien visibles.
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Fig. 2.· a : spectrum of a cytoplasmic inclusion. Absence of edge at 132 eV (phosphorus = P) and at 350 eV (calcium) (compare with the previous spectrum). b : the zone between 350 and 650 eV has been amplified 16 time. Notice the edges of nitrogen and oxygen.
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phore dans les vacuoles. De plus. s'il s'agissait d'un artefact. il n'y a aucune raison pour qu'il n'apparaisse pas dans toutes les vacuoles. Or. meme dans les hyphes intercellulaires. ou ces granules sont communs. un nombre important de vacuoles ne renferment pas d'inclusion de ce type. Enfin. il convient d'insister sur Ia grande labilite de ces structures qui peuvent etre tres facilement dispersees par une fixation inadequate ou vaporisees au cours de l'observation.
b
II n'est pas certain que les techniques de cryosubstitution soient adaptees a leur conservation.
Les granules cytoplasmiques sont communs dans tous les champignons des mycorhizes VA. mais les auteurs ne les distinguent pas des granules de polyphosphate vacuolaires. lis sont inclus dans des vesicules dont Ia membrane limitante presente des proprietes cytochimiques differentes de toutes les autres membranes cytoplas-
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miques, et nous n'avons pu preciser sa nature. Elle est reactive au test PATAg, comme les membranes plasmalemmiques, mais elle n'est pas coloree par l'acide phosphotungstique, reactif caracteristique de ces membranes. Comme les granules vacuolaires, ils ne contiennent pas de polysaccharides, mais renferment une fraction proteique importante. Cependant, ils different de ces demiers par !'absence de phosphore. Les contacts tres nombreux entre Ies vacuoles et Ies vesicules contenant les granules proteiques suggerent Ia possibilite de coalescence entre les vesicules et les vacuoles et done !'existence d'une filiation entre les granules vacuolaires et les granules cytoplasmiques. lis pourraient representer les precurseurs des granules denses, riches en polyphosphates fixes sur Ia trame proteique.
Ces formations ne sont certainement pas des artefacts ; en effet, compte tenu du faible volume des vesicules cytoplasmiques, il est impensable que les granules, qui occupent Ia quasi totalite de Ia Iumiere de Ia vesicule, resultent d'une precipitation provoquee par Ia fixation. Nous rappelons aussi que certaines de ces vesicules, probablement moins evoluees, ont un contenu diffus. II est evident que si Ia formation des granules etait due a Ia fixation ou a Ia deshydratation, il n'y aurait aucune raison pour que Ie contenu de ces vesicules ne soit pas aussi condense.
Une partie importante du phosphore n'est pas associee aces granules puisque Callow eta/. (I 978) ont montre que, puisque seulement 40 % du phosphore est present dans les granules de polyphosphate, Ia plus grande part du phosphore doit done se trouver sous forme soluble comme le suggerent Orlovich et Ashford ( 1993). Les granules de polyphosphate ne represente done pas Ia seule forme de transport du phosphore dans ces mycorhizes.
Si les granules de polyphosphate ont souvent ete signales dans les endomycorhizes VA, peu d'etudes sont consacrees a leur repartition dans les diverses parties de Ia
mycorhize. Dans le present travail, nous avons mis en evidence un gradient de repartition. Les granules sont relativement volumineux et bien representes dans les vacuoles des hyphes intercellulaires. Dans les grosses branches de l'arbuscule, ils sont moins abondants et leur taille est plus reduite. Enfin, dans Ia plupart des arbuscules, les vacuoles des branches Ies plus fines, ne montrent pas de granules. Strullu et a/., (1981 a), dans les mycorhizes VA de Taxus baccata, observent des granules vacuolaires dans toutes les parties de Ia mycorhize, y compris Ies hyphes des jeunes arbuscules. Les granules disparaissent lorsque l'arbuscule est degenerescent.
Contrairement a ces observations, nous avons observe un gradient de repartition qui nous semble traduire Ia dynamique de fonctionnement de I'endomycorhize. En effet, Ies granules sont absents ou tres reduits dans Ies branches de I'arbuscule, formations directement impliquees dans les echanges actifs entre les partenaires. II est d'autre part bien connu que Ie champignon symbiote transfere de grandes quantites de phosphore a Ia plante-h6te (Harley, I 969 ; Sanders et Tinker, 1971 ; Bowen et al., 1975 ; Callow et al., 1978 ; Walker et Powell, 1979). En fait, dans une endomycorhize active, les granules de polyphosphate, resultant de Ia polymerisation de phosphore preleve dans le sol, sont transportes jusqu'aux arbuscules par les hyphes intercellulaires (Strullu et al., 1981 ). Pour le phosphore, ces demieres jouent done essentiellement le role de transport et leurs vacuoles renferment des granules abondants et de taille importante. Au niveau des arbuscules, Ie phosphore est Iibere par Ia lyse des polyphosphates et done, lorsque Ia mycorhize est active, il est normal que cette lyse se traduise par une reduction de taille des granules puis par leur disparition. Toutefois, Ia fraction proteique peut, dans certains cas, persister apres Ia liberation du phosphore et correspondrait aux granules proteiques moins denses et plus diffus que
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nous avons signales dans les vacuoles des branches de l'arbuscule.
Dans quelques cas, nous avons observe des arbuscules dont les branches les plus fines montrent quelques granules de polyphosphates. Cela traduit probablement un etat metabolique moins actif de Ia cellule infectee et une reduction des echanges.
Cette etude confirme done l'existence de granules vacuolaires riches en phosphore et calcium associes a une fraction proteique. Nos observations suggerent qu'ils evo-
luent a partir d'inclusions cytoplasmiques riches en proteines contenus dans des vesicules dont nous n'avons pu preciser l'origine. Enfin Ia repartition des granules de polyphospahtes dans Ia mycorhize n'est pas homogene et traduit fidelement Ia dynamique du fonctionnement de Ia mycorhize : les hyphes intercellulaires et les grosses branches de l'arbuscule sont essentiellement impliques dans le transport du phosphore, les petites branches sont les sites de transfert du phosphore entre le champignon et Ia plante-h6te.
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