dosage de la bilirubine non liee a l'albumine (bnl

ACTUALITES EN IMMUNO-HEMATOLOGIE CHEZ LA FEMME ENCEINTE

Dr Agnès Mailloux, Responsable médical - UF de biologie du CNRHP

Centre National de Référence en Hémobiologie Périnatale Pôle de Biologie-Imagerie

Hôpital Saint-Antoine – AP-HP - Paris

ACNBH

ODPC N°1495

DECLARATION D’INTERETDANS LE CADRE DE MISSIONS DE FORMATION

REALISEES POUR L’ACNBH

45ème Colloque National des Biologistes des Hôpitaux

Paris, 22-24 juin 2016

Dr, Mailloux Agnès……………… Exerçant au CNRHP ( Hôpital St Antoine- GHU Est Parisien)………déclare sur l’honneur

ne pas avoir d'intérêt, direct ou indirect (financier) avec les entreprises pharmaceutiques, du diagnostic ou d’édition de logiciels susceptible de modifier mon jugement ou mes propos, concernant le DMDIV et/ou le sujet présenté.

But du suivi Immuno-hématologique :Intérêt Fœtal – prévention et diagnostic des IFM érythrocytaire

IFM érythrocytaire : situation obstétricale rare

= fixation Ac maternels circulants sur les Ag fœtaux érythrocytaires correspondants

Gravité : Immuno-hémolyse fœtale et néonatale

Survenue d’une anémieHyper-production de bilirubine avec accumulation post-natale et risque d’ictère nucléaire dès la première semaine de vie

Incidence clinique 4/1000 naissances

INTRODUCTION

A Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

EPIDEMIOLOGIE

Moise 2008Brossard Y, 20021

6,5

/1000

2,7

/10

00

1,6

/10

00

3,2

/10

00

• Diminution de l’allo-immunisation anti-RH1 depuis l’immunoprophylaxie par IgRh dans les années 70

• Incidence des cas symptomatiques :

– anti-D (RH1) : 0,8 / 1000

– anti-c (RH4) : 0,1 / 1000

– anti-Kell (KEL1) : 0,05 /1000

Part croissante des allo-immunisations autres qu’anti-D (RH1) : anti-Kell (KEL1) et anti-c (RH4)


ORIGINE DE L’IMMUNISATION MATERNELLE

• Hétéro-immunisation : immunisation induite par des antigènes partagés par d’autres espèces (bactéries,parasites,mammifères,végétaux)

• Iso-immunisation transfusionnelle : très efficace, mais pas obligatoire

• Iso-immunisation foeto-maternelle : par microtransfusiontransplacentaire de sang fœtal (Hémorragie Foeto-

Maternelle): concerne les antigènes les plus immunogènes.

HEMORRAGIE FOETO-MATERNELLE (HFM)

• Passage de sang fœtal dans la circulation maternelle durant la grossesse ou à l’accouchement.

• Spontanée ou induite par des gestes obstétricaux ou traumatismes.

Formes mineures Risque d’alloimmunisation maternelle

Formes sévères Anémie fœtale + alloimmunisation maternelle.

OUTIL BIOLOGIQUE POUR LA DETECTION ET QUANTIFICATION DE L’HEMORRAGIE FOETO-MATERNELLE : TEST DE KLEIHAUER

3

INDICATIONS DU TEST DE KLEIHAUER

DETECTION ET QUANTIFICATION

D’UNE HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE

• Diagnostic étiologique d’une anémie fœtale ounéonatale, ou d’une mort fœtale

• Dépistage et suivi d’une HFM spontanée ou induitepar des traumatismes ou des gestes obstétricaux(amniocentèse, version par manœuvre externe,ponction sang fœtal), indépendant du groupe rhésus

• Adaptation posologique des IgG anti-RH1(prophylaxie rhésus) chez la femme RH1 négatifenceinte ou accouchée

Urgence relative

6h

Non urgent 72h

• REACTIFS DISPONIBLES POUR LE TEST DE KLEIHAUER- SureTech Fœtal hemoglobin , Oxytele

- Labo Moderne

- Immucor

- Techniques maisons (exemple : CNRHP)

HEMORRAGIE FOETOMATERNELLEDETECTION ET QUANTIFICATION

• TEST DE KLEIHAUER : TEST DE REFERENCEKleihauer et al , 1957

Test cytochimique sur frottis sanguin fixé à l’éthanol

- Elimination sélective de l’hémoglobine adulte sous l’action d’une solution tampon pH acide, tout en préservant le contenu en hémoglobine fœtale des hématies.


• RESULTAT DU TEST DE KLEIHAUER

Erythrocytes adultes ayant

perdu Hb = formes

cellulaires fantomatiques,

sphériques , incolores

Erythrocytes avec Hb

fœtale fixant phloxine :

rose vif et réfringent

RESULTAT : 500 HF /10 000 HA : soit 250 ml de sang fœtal (gros passage)

Quantifier L’HFM par un Test de Kleihauer et adapter les doses d’IgRH.- 200µg pour couvrir une HFM jusqu’à 24 HF/10 000- Puis: 20 µg par tranche de 4 HF/10 000 suppl…

Tableau : Adaptation de la dose d’immunoglobulines IgRH en fonction du Volume d’hémorragie foeto-maternelle estimé par le test de Kleihauer.

KLEIHAUER(HF / 10.000 HA)

Dose de 200 µg* Dose de 300 µgVoie d’administration

Doses µg Doses µg

0-4 1 200 1 300IV directe

5-24 1 200 1 300

25-44 2 400 1 300

45-64 2 400 2 600

PERFUSIONsur 4 heuresDilué dans 250 ml de NaCl à 9 pour mille

65-84 3 600 2 600

85-104 3 600 2 600

105-124 4 800 3 900

125-144 4 800 3 900

145-164 5 1000 3 900

165-184 5 1000 4 1200

185-204 6 1200 4 1200

205-224 6 1200 4 1200

225-244 7 1400 5 1500

245-264 7 1400 5 1500

265-284 8 1600 5 1500

285-304 8 1600 6 1800Recommandation CNGOF

• INCONVENIENTS DU TEST DE KLEIHAUER (1)

Technique souvent décriée

- Technique manuelle, non standardisée, nécessitant un personnel formé et entraîné

- Difficulté dans le décompte des cellules (grande variabilité inter-opérateur)


• Résultat EEQ Asqualab : mis en place en 2015 (n= 57)

- Inter-laboratoire 14 122

- Inter-opérateur 0 140


0

2

4

6

8

10

12

11

0

12

0

14

0

16

0

18

0

20

0

22

0

24

0

26

0

28

0

30

0

32

0

34

0

36

0

38

0

40

0

42

0

44

0

46

0

48

0

50

0

52

0

54

0

56

0

58

0

60

0

62

0

64

0

66

0

EEQ Test de Kleihauer - Echantillon KHL1501Répartition des résultats

Mélange de sang calibréValeur cible à 32 +/-13 HF/10000HA moyenne robuste (45 +/-18 HF/10 000HA)

0

2

4

6

8

10

12

12

19

26

33

40

47

54

61

68

75

82

89

96

10

3

11

0

11

7

12

4

13

1

13

8

14

5

15

2

15

9

16

6

17

3

18

0

18

7

19

4

20

1

EEQ Test de Kleihauer - Echantillon KHS1501Répartition des résultats

Frottis coloréValeur cible à 192 HF/ 10000 HAMoyenne robuste : 220 HF/HA (CV : 25,1 %).Par rapport à la moyenne robuste calculée, 22 % (12/55) des résultats présentent une différence d'exactitude supérieure à la limite de +/-40 %

• INCONVENIENTS DU TEST DE KLEIHAUER (2)

Technique souvent décriée

- Difficultés dans l’interprétation des frottis :

Problème des hématies maternelles avec un contenu élevé en HbF

Fcells liés à la grossesse ou hémoglobinopathie

Considérés à tort comme des tests de Kleihauer positifs

Cellules ininterprétables



• DIFFICULTES DU KLEIHAUER

NEGATIFPOSITIF

ININTERPRETABLES

ININTERPRETABLES

Réaliser un témoin positif et négatif

15

• FREQUENCE DES RESULTATS

De Janvier 2013 à Décembre 2014 : 37736 tests de Kleihauer

HF = Hématies foetales - HA = Hématies adultes

* Difficultés à différentier les vraies cellules foetales des cellules maternelles contenant de l’hémoglobine F (HbF). (Faux positifs)

NOMBRE FREQUENCE

0 HF / 10000 HA 30944 82 %

Cellules ininterprétables (F-cells)* 2264 6 %

< 1 à 807 HF/10000 HA

≥25 HF/10000 HA

4528 12 %

0,9%

(7,5% des 12%)


• AUTRES TECHNIQUES DE DETECTIONS ET DE QUANTIFICATION DES HFM

- Technique des rosettes (dépistage)

- Mesure de la consommation en anti-D : (FMH Screening-test sur gel Diamed)

- Techniques de comptage par cytométrie de flux des hématies fœtales immunomarquées :

- anti-HbF

- anti-RH1 : BRAD3

- anti-HbF et anti-anhydrase carbonique : (Fetal cell Count Kit, distribué par Jacques Boy)


UNIQUEMENT FEMME RH1 NEG



ANALYSE RETROSPECTIVE DES PRATIQUES EN ILE DE FRANCE

ETUDE CNRHP

De Janvier 2013 à Décembre 2014 : 37736 tests de Kleihauer

2013 : 19272 Tests de Kleihauer (53/jour) 126 établissements 2014 : 18464 Tests de Kleihauer (51/jour) 115 établissements

CH publics et privésCliniquesLabos privés Sages femmes à domicile (10 à 20 prlvt / an)Etablissements

Stéphanie Huguet-Jacquot et al : SFTS 2015

18

BILAN DES INDICATIONS DU TEST DE KLEIHAUER EN IDF

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

Accouchement(RH-1)

Diminution desmouvements actifs

Metrorragies Traumatismes version

2013

2014

Autres indications : Menace d’accouchement prématurée, hydramnios, placenta recouvrant, post amniocentèse et biopsie trophoblastique, Anémie ou tachycardie du nouveau-né, MFIU/FCNon précisé : environ 10% Contrôles : environ 2%

Stéphanie Huguet-Jacquot et al : SFTS 2015

RECOMMANDATION DU CNGOF

Patiente RH-1

2013 : 49,6%

2014 : 45,4%

20

TESTS DE KLEIHAUER FORTEMENT POSITIFS

≥ 25 HF/10000HA100 HF/10000HA

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

≥25 2013

≥100 2013

≥25 2014

≥100 2014

Risque d’anémie fœtale ou d’anémie néonatale

Correspondance 1 HF /10 000 HA (= 0,5 ml de sang fœtal)À terme : masse sanguine d’un nouveau-né 80 ml/kg

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

0 10 20 30 40

Poids estimé du fœtus

Terme SA

Po

ids e

n g

Tout dépend du terme et du volume sanguin du foetus

0

50

100

150

200

250

300

350

0 10 20 30 40

Volume circulant

Terme SA

vo

lum

e e

n m

l

Grand maximum HFM de 700 HF/10000 HA = perte de 350 ml de sang fœtal (mais possibilité de régénération)

Foeto-placentaire

(placenta et cordon

renferment la moitié du

volume foetal)

TEST DE KLEIHAUER POSITIFINTERPRETATION ET CONSEILS DE PRISE EN CHARGE


CONTEXTE ANTENATAL

• Volume suffisamment important pour provoquer une anémie fœtale sévère (<7g/100ml)? HFM massive à transmettre en urgence à l’obstétricien pour une prise en charge clinique rapide (échographie doppler avec mesure du pic systolique de vélocité au niveau de l’artère cérébrale moyenne à la recherche de signes indirects d’anémie fœtale)

• HFM séquelle d’un saignement passé ou témoigne d’une hémorragie continuelle ? Nécessité de demander un prélèvement à 24h puis à 48h

• Suite à un événement (ex : amniocentèse) demander un contrôle à 24h

• Si Femme est RH1 négatif, est-ce que les hématies fœtales sont RH1+ ? Faire cytométrie de flux ou génotypage RHD fœtal (En cas de MFIU, dès qu’il y a expulsion, plus de possibilité de faire le génotypage RHD foetal)

• Coexistence d’une immunisation , incompatibilité ABO (Possibilité d’accélération de l’élimination des hématies foetales) ?


Risque d’allo-immunisationPatiente RH1 négatif

Patiente à l’accouchement (MFI et IMG) • Adaptation posologique à partir de

25HF/ 10000 HA si le nouveau-né est RH1 positif

• KLEIHAUER à contrôler avant l’injection et 24 h après l’injection (48h si supérieur à 100 HF/ 10000 HA)

• RAI à contrôler 6 mois après injection

Patiente non accouchée• Adaptation posologique à partir de

25HF/ 10000 HA (Statut du RH1 du fœtus inconnu)

• KLEIHAUER à contrôler avant l’injection et 24 h après l’injection (48h si supérieur à 100 HF/ 10000 HA)si Kleihauer persiste positif hypothèse de fœtus RH1 négatif (intérêt test complémentaire cytométrique)



Risque d’allo-immunisationPatiente RH1 positif

• Persistance du Test de Kleihauer positif (= durée de vie du GR)

• RAI à contrôler dans 2 à 3 mois car risque d’immunisationmaternelle par les hématies fœtales


OUTILS BIOLOGIQUES POUR LE DIAGNOSTIC ET LE SUIVI DES

INCOMPATIBILTES FOETO-MATERNELLES


SUIVI DE GROSSESSE : Les RAI

• RAI D’INTERET MATERNEL (transfusionnel) :

en fin de grossesse

• RAI D’INTERET FŒTAL :

Femme RH:1 : au 1er trimestre

Femme RH:-1 ou RH:1 avec ATCD transfusionnels :

au 1er, 2ème et 3ème trimestre (sauf si injt° d’IgRH)


ALLO-ANTICORPS COURANTS ET RISQUE DE MALADIE HEMOLYTIQUE

Spécificité(nomenclature

traditionnelle)


numérique)

Risque d’anémie fœtale Maladie

hémolytique

néonatale

Anti-D Anti-RH1 OUI après 15 SA OUI

Anti-Kell Anti-KEL1 OUI après 15SA OUI

Anti-c Anti-RH4 OUI après 20 SA OUI

Anti-E Anti-RH3 RARE (3ème trimestre) OUI

Anti-e Anti-RH5 Exceptionnel OUI

Anti-Fya Anti-FY1 Exceptionnel OUI

Anti-Jka Anti-JK1 Exceptionnel OUI

Anti-Kpa Anti-KEL3 Exceptionnel OUI

Anti-M Anti-MNS1 Exceptionnel OUI

DIAGNOSTIC-SUIVI BIOLOGIQUE



traditionnelle)


numérique)

Risque d’anémie fœtale Maladie

hémolytique

néonatale

Anti-A Anti-ABO1 NON OUI

Anti-B Anti-ABO2 NON OUI

Anti-C Anti-RH2 NON OUI

Anti-Fyb Anti-FY2 NON OUI

Anti-Jkb Anti-JK2 NON OUI

Anti-S Anti-MNS3 NON OUI

Anti-G Anti-RH12 NON OUI

ALLO-ANTICORPS COURANTS ET RISQUE DE MALADIE HEMOLYTIQUE



Sa spécificité : déterminée par la RAI + IAI

Affinité : différente selon la spécificité

donnée par le titrage en Coombs indirect sur hématies tests natives

Pouvoir d’activation des récepteurs Fc :

fonction de la sous-classe IgG1 ou IgG3 et de la glycosylation Fcg

déterminée par des tests fonctionnels (type ADCC)

Concentration : très grande variation (de 1 ng à 100 µg/ml)

déterminée / dosage pondéral ou approchée / titrage


Paramètres de l’Ac influençant le risque hémolytique


I- LA TECHNIQUE DE DOSAGE PONDERAL


anti-RH1, anti-RH4, Anti-RH5, anti-RH3, Anti-RH2

Dosage précis de la concentration en anticorps

DIAGNOSTIC-SUIVI BIOLOGIQUEDosage pondéral des anticorps

Technique lourde CV de la technique : 5 % à 20 %

Variante 2 temps : hématies tests traitées au préalable par broméline : haut rendement de fixation (résultat proche de la concentration réelle)Variante 1 temps : broméline introduite directement dans le circuit, destruction des IgG3 (dosage des IgG1 de haute affinité)


II- LA TECHNIQUE DE TITRAGE


• Pour les autres anticorps : Titrage en technique de Coombs indirect en tube (test indirect à l’antiglobuline-hématies tests normales-lecture macroscopique des agglutinats)

• Lecture directe : IgM

• Addition de l’anti-IgG : lecture en test indirect à l’antiglobuline

• Réalisation en parallèle d’un témoin titrage

• Titrage comparatif / sérum précédent

DIAGNOSTIC-SUIVI BIOLOGIQUETitrage des anticorps


III- LA TECHNIQUE DE MICROTITRAGE DES ANTI-RH1


3 QUESTIONS

1- ANTICORPS TROUVE DANS LE SERUM UNIQUEMENT EXPLICABLE PAR ANTI-RH1 PASSIF ( ANTI-RH1 immun?)

2- EST-CE QUE LA QUANTITE D’ANTICORPS EST SUFFISANTE POUR PROTEGER ?

Apport IgG anti-D ≥ à 20 µg/ml GR RH:1 efficacité 100%

INTERET DU MICROTITRAGE

3- EST-CE QU’UN DOSAGE PONDERAL EST NECESSAIRE ?µT ≥ 24ng/ml


TECHNIQUE DE MICROTITRAGE

6 ng/ml 3 1.5 0.75

STANDARD PATIENT

Pur 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32

Concentration approchée = 8 x 1.5= 12 ng/ml

Inverse de la dernière dilution réactive de

l’échantillon

Concentration de la dilution du standard

avec la même intensité de réaction

XConcentration en anti-D =

Technique simple d’hémagglutination en support gel

Terme SA

0

50

100

150

200

250

300

350

28 30 32 34 36 38 40 42

45 ng/ml

22 ng/ml

11 ng/ml

6 ng/ml

3 ng/ml

INTERPRETATION DU MICROTITRAGE

½ VIE 3 SEMAINES DIMINUTION DE MOITIE TOUTES LES 3 SEMAINES

ANTICORPS TROUVE DANS LE SERUM UNIQUEMENT EXPLICABLE PAR ANTI-D PASSIF (ALLO-IMMUNISATION EN PLUS) ?

Concentration en anti-D comparée à la concentration théorique

IV- LES TECHNIQUES DE

GENOTYPAGE FOETAL


le génotypage fœtal par PCR

INVASIF

Liquide amniotique ou villosités choriales : RHD, RHc, RHE, KEL1…

Méthodes validées

Indications : immunisations sévères anti-KEL1 ou anti-RHc avec géniteur hétérozygote

NON INVASIF

Sang maternel (ADN plasmatique) : RHD (2004), KEL1(2010), RH4(2015), RH3 (2016)

Méthodes accréditées pour le RHD et le KEL1

Indications : toutes immunisations anti- D ou anti-Kell avec géniteur RHD ou KEL1 positif

DIAGNOSTIC-SUIVI BIOLOGIQUES


LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL NON INVASIF

Amplification par PCR des séquences spécifiques du gène RHD et ADN Maïs :

- EXON 10 (plus sensible mais moins spécifique)

- EXON 7 (plus spécifique mais moins sensible)

- EXON 5 (permet de génotyper le fœtus chez une mère possédant un variant silencieux Dpsi)

Free DNA Fetal Kit® RhDKit de génotypage foetal RHD à partir d’ADN fœtal libre du sang

maternel (Technique PCR Temps réel)

Amplification positiveFŒTUS RHESUS D POSITIF

Car : Absence de séquence du gène RHDchez la mère RH1 négatif

PERMET DE LEGITIMER UNE SURVEILLANCE ANTENATALE

Amplification négative FŒTUS RHESUS D NEGATIF

(diagnostic par défaut)Ou amplification défectueuse

Ou concent° très faible d’ADN fœtal


GENOTYPAGE RHD FOETALINDICATIONS

Femme immunisée

anti-RH1

Réalisation à partir de 12 SA

Foetus RHD+ Fœtus RHD-

exemption de surveillance

Incompatibilité fœto-maternellelégitime surveillance lourde

Besoins:- certitude des négatifs- diagnostic avant 26SA

Besoins:- certitude des positifs- certitude des négatifs- diagnostic précoce

Prophylaxie systématique de la 28ème semaine

Réalisation avant 26 SA

Fœtus RHD-

injection IgRH à 28 SA

Fœtus RHD+exemption de prévention et surveillance (40%)

Avant amniocentèse

Réalisation 8-15 jours avant le geste

Fœtus RHD-

Femme RH1 négatif non-immunisée

injection IgRH aussitôt après amniocentèse

Fœtus RHD+

évite injection d’IgRH

19ème salon GynObs 20 mars 2009

Projet STIC : Génotypage RHD fœtal non invasif systématique

à l’aide d’un kit marqué CE (Institut Jacques Boy)

Paris / Marseille / Lille / Poissy / Nantes

Objectif principalÉvaluer le rapport coût-efficacité (4000 patientes) de l’application systématique dugénotypage RHD fœtal non invasif

Objectifs secondairesFaisabilité de la stratégie de génotypage RHD fœtal systématiqueAnalyser les génotypages « indéterminés » et les discordances génotypesphénotypesAide à la décision publique de diffusion du génotypage RHD fœtal non invasif ausein du réseau français de soin en obstétrique et du tarif de remboursement dutest.

GENOTYPAGE RHD FOETALETUDE GENIFERH


-1 000 €

-800 €

-600 €

-400 €

-200 €

0 €

200 €

400 €

600 €

800 €

1 000 €

-0,5 -0,3 -0,1 0,1 0,3 0,5

Dif

fére

nces d

es c

oû

ts

Différences des performances

• Génotypage fœtal RHD sur sang maternel plus performant que l’absence de génotypage pour mettre en œuvre une stratégie préventive adaptée

• Amélioration de la performance de la prévention de l’allo immunisation foeto maternelle par génotypage a un surcoût

Génotypage est associé à un coût plus élevé et à une meilleure performance que le groupe contrôle

Rapport partiel : données non publiées

GENOTYPAGE RHD FOETALETUDE GENIFERH

ATTENTE INSCRIPTION NABM

GENOTYPAGE KEL1 FŒTAL NON INVASIF

Examen basé sur 1- PCR allèle KEL1 spécifique en temps réel (SyberGreen) réalisé en triplicate (91 pb)

mise en évidence d’ADN foetal KEL1

2- PCR de l’exon 7 du gène ABO en temps réel (SyberGreen) réalisé en simplicate (128 pb)

représentation de la quantité d’ADN maternelle

3- PCR d’un ADN traceur (Maïs) en temps réel (TaqMan) Validation de l’étape d’extraction

Tous les résultats doivent être confirmés sur un 2ème prélèvement réalisé plus tard au cours de la grossesse.

…AAC CGA ACG CTG AGA……TTG GCT TGC GAC TCT…

…AAC CGA ATG CTG AGA……TTG GCT TAC GAC TCT…

KEL2 (Thr) KEL1 (Met)Mutation de substitution

(transversion)


GENOTYPAGE KEL1 FOETALINDICATION

Femme immunisée

anti-KEL1

-Risque d’anémie fœtale sévère fonction du titre de l’anticorps anti-KEL1 maternel et l’âge gestationnel : risque d’anémie fœtale sévère dès 16 SA -Surveillance clinique spécifique démarrée à partir d’un titre supérieur au 1/32 (50 % des patientes)

Besoins:- certitude des positifs- certitude des négatifs- diagnostic précoce

Fœtus KEL1 + Fœtus KEL1 -

exemption de surveillance

Incompatibilité fœto-maternellelégitime surveillance lourde

- Réalisation à partir de 13 SA- Proposé lorsque titre en anti-KEL1 > au 1/32- Conjoint hétérozygote KEL1/KEL2

Le gène RHCE code pour 4 allèles majeurs RHce, RHcE, RHCe et RHCE code pour une protéines de surface non glycosylée comportant 12 domaines transmembranaires

RHD RHCE

COOH

NH2

RHC (Ser)/RHc (Pro)

aa103

-aa 103 est codé par l’exon 2

…TTC CCT CCT GGG AGG…

…AAG GGA GGA CCC TCC…

…TTC CCT TCT GGG AGG…

…AAG GGA AGA CCC TCC…

RHC (Ser) RHc (Pro)Mutation de substitution

(transversion)

GENOTYPAGE RHc

BASE MOLECULAIRE

GENOTYPAGE RHc FOETAL

INDICATION

Femme immunisée

anti-RH4 (anti-c)

350 patientes/an suivies au CNRHP pour

immunisation anti-RH4

100 patientes avec des taux > à 500 UCHP/ ml

(seuil de déclenchement d’une surveillance

spécifique)

50 patientes avec des taux > à 1000 UCHP/ml

(immunisation sévère)

Besoins:

- certitude des positifs

- certitude des négatifs

- diagnostic précoce

Fœtus RHc + Fœtus RHc-

exemption de

surveillance

Incompatibilité fœto-maternelle

légitime

surveillance lourde

- Réalisation à partir de 13 SA

- Proposé quelque soit la concentration en anticorps car risque de réactivation

- Conjoint hétérozygote RH2/RH4 (45%)

DIAGNOSTIC ET SUIVI BIOLOGIQUEEN PRATIQUE


Dépistage et surveillance des incompatibilités foetomaternelles au cours de la grossesse

Anti-RH1, anti-RH4, anti-RH3, Anti-KEL1

Risque d’anémie fœtale sévère in utéro

1- Phénotyper procréateurSi phéno-incompatible : 2- Génotypage fœtal3- Titrage et dosage pondéral toutes les 2 à 3 semaines

ANTI-RH5, Anti-FY1, FY2, Anti-JK1, Anti-JK2, Anti-MNS3, Anti-MNS4, Anti-MNS1, Anti-RH2

Risque de maladie hémolytique postnatale

1- Phénotyper procréateurSi phéno-incompatible : 2- Titrage et dosage pondéral à 3 et 8 mois

Anti-LE1, LE2, Anti-P1, Anti-H, Anti-HI, auto-anticorps froid, auto-papaïne

Pas de risque de maladie hémolytique

Pas d’examen complémentaire

RAI positive

Identification


ANTICORPSDANS LES CAS D’ANEMIE FŒTALE SEVERE

Anti-D (RH1) Anti-c (RH4) Anti-Kell (KEL1)

Présence de

l’anticorps

1er trimestre.

parfois limite

de détection

Tjs au 1er

trimestre

Tjs au 1er

trimestre

Titre en TIA

d’emblée très

élevé

GR test

enzymatique

Détection

facilité

Détection très

facilité

Aucun intérêt

Pièges Confusion

anti-D passif

Réactivation

fréquente

Titre en TIA

souvent faible

non prédictif

d’une atteinte

sévère

Agglutination

parfois faible

Grande variabilité

du titrage inter-

laboratoireA Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

Schéma de Titrage- Dosage


Anti-RH1 Anti-RH4 Anti-Kell Anti-RH3 Autres

Dosage /

Titrage de

référence

+ sur GR

natifs

+ sur GR

natifs

+ sur GR

natifs

NON

Dosage

pondéral

≥1/8 ≥1/4 NON ≥1/8 NON

sauf public

RH2 RH5

Réactivat° Fréquente

ts trim

Fréquente

ts trim

Rare

3ème trim

Rare

3ème trim

Rare

3ème trim

Fréquence

dosages

2 sem 2 à 4 sem Tous les

mois

6è, 7è et 8è

mois

3è et 8è

mois

Taux

critiques

250 UCHP 500 UCHP

titre≥1/4

1/32 700 UCHP

titre≥1/8


Grossesse avec allo-immunisation anti-RH1Schéma de prise en charge

Anti-RH1 < 1 µg/ml(250 UCHP/ml)

- Surveillance échographique standard- Dosage + titrage anti-RH1 tous les 15 jours à partir de 18 SA

Anti-RH1 > 1 µg/ml

- Surveillance hebdomadaire dès 18 SA écho + vélocimétrie doppler- Dosage + titrage anti-RH1 tous les 15 jours à partir de 18 SA

Génotypage RHD fœtal sur sang maternel à partir de 12 SA

Titrage ET Dosage

Si fœtus RHD positif

RAI positive au premier trimestre

Identification = Anti-RH1

Si fœtus RHD négatif sur 2 prélèvements

Surveillance levée


EXEMPLE DE SUIVI DESPATIENTES RH:-1


Risque d’erreur dans l’interprétation de

la présence d’un anti-RH1


Mme M. RH1 négatif, 3ème gesteUne grossesse 14 ans auparavant, et une fausse couche

• 7 SA: RAI négatives mais métrorragies injection Rhophylac® 200

• 11 SA: métrorragies

– RAI + injection N°2 de Rhophylac® 200

– RAI positives CNRHP: identification anti-RH1 et microtitrage :6-12ng/ml; µtitrage compatible avec l’injection à 7 SA

• 13 SA et 18 SA: RAI positives EFS X: anti-RH1 « résiduel »

• 25 SA: RAI positives Laboratoire centralisateur: anti-RH1 identifié de titre <1 : « anti-RH1 passif résiduel »


Mme M. RH1 négatif, 3ème geste

• 32 SA: Consultation à la maternité pour « Cholestase gravidique »

– Anomalies du RCF sur J1

– Anasarque sur J1 avec accélération des vitesses cérébrales

Extraction en urgence

• Deux jumelles anémiques et ictèriquesavec mauvaise adaptation et détresse respiratoire

– J1 Hb:2,9g/dl et bili:100µmoles/l TNN+EST

– J2 Hb:7,9g/dl et bili:120 µmoles/l EST


• RAI positive dans un contexte d’injection d’IgRHDErreur d’interprétation : anti-D faussement étiqueté comme

passif résiduelSeul le dosage des anti-RH1 permet de se prononcer

• Obstétricien n’avait aucun moyen de mettre en doute le résultat donné par le laboratoire, pas de connaissance sur :techniques à réalisersensibilité des techniquestransmission des examens à laboratoire de référence

INTERET DU MICROTITRAGE

ECHEC DE LA PRISE EN CHARGE D’UNE FEMME ENCEINTE IMMUNISEE

ROLE DU BIOLOGISTE EST ESSENTIEL


EXEMPLES DE SUIVI DESPATIENTES RH:1

Risque de diagnostic trop tardif

Anti-KEL1<1/32

- Surveillance échographique standard- Titrage anti-KEL1 tous les mois à partir de 18 SA

Anti-KEL≥1/32

- Surveillance hebdomadaire dès 18 SA écho + vélocimétrie doppler- Titrage anti-KEL1 tous les mois à partir de 18 SA

Génotypage KEL fœtal sur sang maternel à partir de 13 SA

Titrage

Si fœtus KEL1 positifsur 2 prélèvements


Identification = Anti-KEL1

Si fœtus KEL1 négatif sur 2 prélèvements

Surveillance levée

Grossesse avec allo-immunisation anti-KEL1Schéma de prise en charge


Grossesse avec allo-immunisation anti-RH4


Identification = Anti-RH4

Titrage / dosage pondéral

dépistage

Anti-RH4 < 500 UCHP

- Surveillance échographique standard- Titrage/dosage anti-RH4 tous les mois ou 15 jours selon terme et concentration

Anti-RH4 ≥ 500 UCHP

- Surveillance hebdomadaire dès 20 SA écho + vélocimétrie doppler- Titrage/dosage anti-RH4 tous les 15 jours à partir de 20 SA

suivi

Accouchement : bilan d’incompatibilité à la naissance et prise en charge néonatale adaptée

Surveillance levée

Phénotypes RH2/RH4 du conjoint

Situation d’incompatibilité foetomaternelle avérée ou à

risque

Absence de situation d’incompatibilité foeto-

maternelle

Génotypage RH4 fœtal sur sang maternel


Mme G. RH1 positif

• DDG : en août 2013

• Pas de RAI pendant la grossesse

• 35 SA fin mars 2014 : MFIURAI positive : identification d’un anti-RH4 + anti-RH3 (EFS X)31/03/14 : prélèvement envoyé au CNRHP :Titrages : Anti-RH4: saline <1/2 TCI 1/128

Anti-RH3 : saline <1/2 TCI <1/2Dosage pondéral : 2 temps : 8720 UCHP/ml

1 temps : 5175 UCHP/ml

• MAIS anti-RH4 connu en 2010

• 11/07/14 Foetopathologie : anémie profonde + erythroblastose trèsimportante. Anti-RH4 à l’origine de la MFIU

Région Limousin


• Réception des sérothèques de Toxoplasmose pour dosages pondérauxrétrospectifs :

• 7 prélèvements

Date Titre saline

Titre TCI 2 temps 1 temps

21/08/13 <1/2 <1/2 40 <40

24/09/13 <1/2 <1/2 40 <40

22/10/13 <1/2 <1/2 <40 <40

21/11/13 <1/2 <1/2 40 <40

27/12/13 <1/2 <1/2 85 <40

30/01/14 <1/2 <1/2 280 55

04/03/14 <1/2 1/16 1360 520

Début de réactivation

non vue avec le titrage

22 SA


Mme M. RH1 positif

• DDG : mi-octobre 2012

• 28 SA : RAI positives 24/04/13laboratoire privé Laboratoire centralisateurIdentification : anti- RH4, Titrage <1/1Pas de dosage pondéral : « Quantité insuffisante pour transmettre le

prélèvement au CHP pour dosage pondéral. Prévoir 10mL de sang total et 5mLde sérum lors du prochain prélèvement. » paragraphe sur la dangerosité del’anti-RH4 dans un contexte de grossesse et les recommandations de suivi.

• AUCUN AUTRE PRELEVEMENT

•37 SA : 09/07/13 (Clinique) extraction en urgence pour souffrance fœtale d’ungarçon

• Groupe : A DCcee Kell neg• TCD 4+ élution positive anti-RH4


• Mauvaise adaptation initiale transfert Hôpital XAnémie à 5g/dL et détresse respiratoire sévère transfert enréanimation dans nouvel Hôpital YJ0 : Transfusion en urgence vitale immédiate en O RhD neg car la mère n’a

pas le même nom que l’enfant et absence de notion de RAI chez la mère.

• RAI de l’accouchement du 09/07/13: anti-RH4 identifié à l’EFS X prévientl’Hôpital Y mais la 1ère transfusion a déjà eu lieu.

• 11/07/13 : 1er prélèvement CNRHP : anti-c (RH4)Anti-RH4 : Titrage 1/16Dosage pondéral : 2 temps : 1650 UCHP/ml

1 temps : 1000 UCHP/ml

CONCLUSION• Absence de surveillance adaptée d’une immunisation anti-RH4.• Retard à la prise en charge adaptée à la maladie hémolytique.• Absence de connaissance de cette femme au niveau des EFS régionaux

délivrant les produits : conséquences transfusionnelles pour l’enfant.

SUVI IMMUNO-HEMATOLOGIQUE DE LA FEMME ENCEINTE

• Test de Kleihauer largement prescrit dans le cadre de la prévention permet d’optimiser la prise en charge des patientes et de leurs nouveau-nés

• Diagnostic des IFM : purement biologique

• Pathologie rare dépistable si respect du calendrier des RAI

• Rôle du biologiste dans la connaissance des techniques à mettre en œuvre, dans leur interprétation, dans le choix de l’orientation des prélèvements pour techniques complémentaires

• Diagnostic biologique spécialisé : Existence d’un Centre de Référence avec une biologie et une clinique périnatale de référence

- Biologie donne l’alerte pour le déclenchement d’un suivi spécifique- Interactions étroites entre biologiste / biologiste de référence / clinicien


REMERCIEMENTS

UF biologie CNRHP

Dr S. HUGUET-JACQUOT

Dr C. TOLY-NDOUR

Dr L. TAIBI

Nelly DA SILVA

Pôle biologie médicale et pathologie : Dr M. VAUBOURDOLLE

UF clinique CNRHP

Dr A. CORTEY

Dr E.MAISONNEUVE

Pauline THOMAS

Pr. B. CARBONNE

Pr J.M. JOUANNIC

Pôle de périnatalité : Pr D. MITANCHEZ


BIBLIOGRAPHIE

• Sur le suivi biologique de la femme enceinte allo-immunisée:

- Diagnostic et suivi biologiques des allo-immunisations anti-érythrocytaires chez la femme enceinte Huguet-Jacquot S et al, RFL Vol 2015 - N° 470 - mars 2015 Page :73-80

- Dosage pondéral des anticorps IgG anti-D. Brossard Y et al. Feuillets Biol 2002;43:11-7.

- Apport du génotypage foetal non invasif sur sang maternel pour la prise en charge des allo-immunisations antiérythrocytaires et la prévention Rhésus. Mailloux A et al., Rev. Méd. Périnat. (2013) 5:203-207

• Sur le suivi clinique et échographique de la femme enceinte allo-immunisée:

- Le point sur le suivi des allo-immunisations érythrocytaires, Carbonne B et al. Gynécologie Obstétrique et Fertilité 38 (2010) 205-213

• Sur la prise en charge néonatale:

- Incompatibilités foetomaternelles érythrocytaires. Cortey A et al. EMC - Pédiatrie 2012;7(3):1-22

- Prise en charge néonatale des formes sévères d’incompatibilités foeto-maternelles érythrocytaires, Rev. Méd. Périnat. Cortey A et al, 2013

• Site internet www.cnrhp.fr :articles, présentations et posters des UF biologique et clinique du CNRHP

http://www.cnrhp.fr/

dosage de la bilirubine non liee a l'albumine (bnl

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