doc technique

8/4/2019 Doc Technique

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2J~NMISO 7218

2001../Indice de ctassement NM 08.0_! 01

Micrologie des alimentsRegles generales pour les examensmicrobioloaiques

."

..- _,--._,,-~Par arr~tecoujointd.u Min.is:tede I'Industrte; du Cominera; , o e - i i E n e r ~= - - _ - -gie et des Mines et du Ministrc de I'Agrfculture, du DeveloppementRural et des Eaux et Forets

Cor-rcspo uda neeLa presente norme rcprend integralement la nnrme ISOo7218199'6.

M o d ifi c a ti o a s"

E~ .am .i _m ' !~t : '! '~QPh~~a r l e con-lite teehmque de nOII1l~':Il.isaUon d es mn eth od~ d;~mniyses et d;echantUioruH11.g'e.d ~~.dtlll.I'IiCS alim entairesE(l i1~h Itl d it fu sl !Q lP 3 .I :" ]~S er vi ce d e; Nonmli!satiOIl Jn du strje lle M nro ca in e (SNIMA)

_ . _ .1 J _ . ~ __ -._....-,..- .. --.- ..- ...""".~:" "..,....-- --:_..if' ~.~


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NM {SO 721~

SOrvIMAIRE

" 2 Her&renet normative ,.....,........., , .e- .,. '

4 IV iateri el s et equipement, ' ' ' ' ,,,.............

II P repa I,'~!io n du materi el ....... . ' '.' ,.... '. .. ' '. ........... , , 7 Preparation et stertlisatlon des milieux de culture et des reaetlfs, ........R Ec han t i . 1 Ions pour labora wire , '......, '."."" '..' ' ..9 Techniques d 'examen et expression des resuUats .

PaceI : : >1114

.1

1 5 -1 ,619

23

25..._-- - ---- - - =.- -:-:'-:-.'-..... .. . ... ':' . -: ...:..-- ---

:.--~--.:..-- ..._-- --- - - ~ .. Annexe-A '. . ., ; ,. . , .,.. . It! Itn......~;,".,....,~i'f-! l:ti,'i"'~.;;;-;-;";;.-;:;;;rn:;;;;;;i:;;... ' ~;.,-.-:.:;;;;;~~-;:;!-;;~.. ;;;.-;;;;,. '.~--42A nnex e B , ' ., !!~.oor,.,."' ! ! ! ! ! ! , ; , i < '!!" ~~"~7&" i i..., ,.. ,.,.,..!!'!!'!!.~";t,;ti.iI!ii.. 1 i 44An nexe C j ;,. o t i , , . !!PII! ~r "" !!,! e e , .. . . ~~~~I ~ l.ri IF Ii" i 'l &- 111 ~!!!!! .'''1 ;toil!iI!..1I 46Annex: D '.. .. 48


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NOFtME ~NTERNATIONAl .E e ISO

Microbiologie des allments .........egles ge.neraies pour le sexemens microbi,oio'gi.q ues1 Doma.inred'appUoationLa pnasente N orm e m te rn atlorra le donn e de s reg ies ~iener8Jespour la realisation d'exarnensm i: crob jo~ogiques e ft e c tu es seton des norm es spec rr i ~ ties.La but de ia presents N orm e in ternationate est d 'a loer a g :aran tir la validite des e xa rn sn s , as'assure r que les techn ique s generales utillsees pour eff,ectuer ces exam ens sont les m@lm es dansto us la s la bc ra to ir es , a p an ic ip er a in si . 8 . 'homogene~se r les resultats obtenus dens difiekents1eb o ra to i re s e t a contribuer a la protect ion de la sante du personnel d e laborato ire len evitant lesnsquesd'intectlon.La presents N:orm e i n te mat i onal e pe t J t etre u:tUsee dans 6011 enssmb lie 0 u parti eilemen t p o u r la saccredl tat l 0ne de laboratoi re pa ries orqan ism es nat! onaux,

::2': Reference nerrnatlve -.-_;._-c'_:_- . ~. --:- .--..-_..,.-----:---::---_ . .- _._ - -- - - - .--=- ::.' -_":_ '''::__- .. . . -. -. " .._.,---La norme suivante contient des dispositions qul, pa r sulte de ~areference qU I en est farte,constitue nt des dia pusillons va lab 'es pour la pres snte N orm a lrrte rnation ale . A u m om ent de lap ub flc afio n, le s e ditio ns incl iquees eta ient en v igueur. Touts norm e est .sujette a . revtslon et lesparties prenantas des accords fcndessur la presents Norms lntsmaucnale sent invltees . 8 .recherehsr is . po ,s sib ilite d'a ppliqu er le s e ditio ns le s plu s re oe nte s de s n orm es ln dique es cl-a prs s,Lee me mbres de la GEl et de 1 :'1 0 pcssedent ie re g i sire de s N a,rm es inte rnatlo nales s,n v ig u e u r aun m om ent donne.ISO 6887 :1 . 98 3 M fc ro bio fog ie - D ire ctive's 9{m ~rales pour la prepa.ration tie e dJlu ,t io n s envue deI'sxarnen microbiologique ..

3 t.ceaux

L'e nsem ble des locaux psrm etta nt de rea liser les diversee m anlpula tions inh ere ntes a unlaboratolre de m ic ra b! o l, og l e s o n t:~~a .reception j le stockaqe, Ia pre pa ra tlon at Ie traits rnent des E l e n a ntHions,;.~I,apreparation et l a s terH isa tion des milieux de culture et du materiel;-18.realisation des ana ly se s: passes, . dllutlons, ensemence rnents , r e:p iqua .ge , incubation,ccnse rva tio n de s so uche s, etc.;

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~ISO

- la decontamination et le r1Elooya.ge des rnateriels d'analyse, alnsl que leuaitement desdeo'hets d 'a rnaJ. yse . .

Son t co nSl d e res dans c !tte ca teQ'o ri e, p ar e :x:emp le , ~e s lo ca ux S'Uivants:

- 'Ies.locaux adm~nistratifs (secretaJiat, bureaux, salles de dceumentatlcn, etc.):

~.las magasins.

L ', en vi ronnern e n t dan s l .eq:Lle~ h'l!S an aiy se.s m ic ro b~ o ,lo gi q u a s s on t e ffe ctu ee s n e do~ t p as a ffec te rIsur fiabilite.Lea locaux doivsnt eire irripl.antes defa~6fYa eviienes rlsques de contarriinafion croise.-~~L",appJica:bion du prina]pe de!la' marehe ern!ilvariltj~ p s u t aider a ~'obtentiG:nd'un te l r,esulta.t.Une protection co ntre les co nditio ns extr@m95 tel!1e,s q ue ~ ~excesde te mp era tu re , de poussle re,d'h urn icilte, de vap eur, de bruit, de 'libra tlon, d 'exp osition au); rayon n em ents solairas, etc. d o lt M reassuree.L a. s urfa ce do lt etre suifisante pour mel ntenl r las zen es de irav a i 1 propres eten o re !re , II e st1 '18Comm8.l1dede eompter '9l1viron20 ,m2pa r analyste pour Ir"ensemb~El des ~Qcauxd'e ssais ..Au eo u rs des essa is.Paocesaux iocaux d'e ss al s don e~reIimlle au>:seules p e rso rmes nscessa lr esa la realise tion de ass derrii e r s ,D es saU es ind\sqJendanlles lit/a ll d es z on es s ep are es a t/a u d es e ncei;rrte s s pe~mq u'e s d oiv ent etrepnivues po u r:

- la rE ic ep ti, cm e tie s~ockage dies echantil h:ms:~Ie. p repara flon de!5 c'hanii llions., em partlcu ~ir dans Ie cas des mat1res pre rnleres (pare xe rn ph 1! ~ es p ro du im e n poudre c en te ne nt llIn n omore , Elle v, e, e m lcro org aJ liIisme s):

- la p re pa ra io n e t la s te ri~ is atio n d es m ilism:: d e c:u ~;tu .reet dt ! materie~:~.~enetlcryag e del a venerie Elt des autres ma te:rl sis a~ nsi q u s la daco ntami nat ion du mate rU el atdes mi Ilew:: de cu~tu:re conriamiruas;

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@:ISO

- le con trellie de la s te r r m e de s pmduits allrn ante.ires.]1oonvlent. d' :E:nvisage:regal .ement ~a s:e:pa:ratiorl de s loc au x s lJ liv an ts:

.~les locaux de preparation des mmliel!llxde cutitursst ~e i c u : ! a i [ de stEmUis8.tiondes mi:ii!uxdeculture et du m a t e n sl; at- la zone de dec"Onta.mination et la zone de I,avage.

L~'S 'etI!JFVeS, refdg '8 'rate u rs at cong e . i la m e u , r : s . peu\I"snt e t J , e plaees dans des 1 0cauxspe,cl~ iques etspsc iaJ 'sment ' adapti :=s . .

3.4 Amenagement des Ioeaux3.4.1 l.ss lccaux d'essals doivent etre amenages de fa.90n a reciuire les rtsques de contaminat1.onp,8{r~a.poussl ere et done pa r Ias m~croorganismes:.

~ ~ e sm u rs , p la fon ds e ts ols de vra ie nt e~re I lsses, fac ites . , a nettoyer, resistants, ,am::prociutlsd ete rg elilts et a ux d es i:n fe ctants !JbH~sesau [a1i:MJreto;ir1e;- . 8 . mains d'etrEl herrnetiquement enfs1rmees, lesccndcites de fl.uides n e de vra ie nt p as tra ve rs er~es~ocauxen hauteur;- des s ys temes de p rote cti Oil oontre: . Iesray()nnements so~amres doiven~. l~r6 h'lstalles a _l 'ext:erieIJr ales fenetres s'!uf 'C 2s--:exce:pth?nnel;- - :- .:::-_ - -_._ - - _ = - _- -_ _~ _~ .les fenetreset las portes dolvsnt pouv,otr etre fe rmees de ta90111h .e rme tiQue Ions des e ssalsafin de rn ln im ls er tout coura nt d 'a ir: d1autr ' part, I;em con ceptio n d on : p erme ttm d":v~ter~ Snicsit poussi e re et de fa ci[1its r a i n sl le u r n eUoy .a ge ,

3,.4.2 La ternperanne am blante et ta qu.ame de l 'alr (mneur en mioroor~lan1smes. hy~gtrom.etrie, tauxd 'empouss~e rem e rltj 's ic . . dolvent etre compa tlbles a vecta real isane n de s e ss als . D aJ rls c e b:J Jt ilest r eeornrnande dl~nstaHer un systeme de vnti lab l.cm a mtre pour I 'a i lr aspi re.S i des es sa i s dolv ent eire reaiis.es e nennesphere ires peU CCH1.taminee. le l o ea ' do lt i tres,peciaiemen~ equipe dI'U119 hot!:: a ~hJIXd'ai.r ~amili1laJre!holi ilzonta~, 01Ll 'l'eri:jca~ et/obl d'UijEl hOfie desecurite.

3 .4 .3 Les pa ll lasaes et les m oblh ers d~ la bera toire daiv :nt eire oon~srl:itue:sde materi.aux l lsses,'mp ermeabl lS,,' fac]ies a Ulsttoyer at a d estrnec:ter.. J ! i . n n d"Eivlter l 'a c c l ll m u ~ a . l 1 . ( J ] i1 I de Floussie re ,.~ISSarmoires d oiv em ,s i p o~ sib le j attelndre le plaf,ond.L e 8 mODi !~ers de ~a:t :Dor .a . io i re ,do ivernt eire C Q I 1 9 1 l 1 S po u rfa di.iite r Ie n e t lG y a g e 1 L ! 'E lSsols (p a ir lexem p h emeuble s mob ll, es ).D e s m e u b les 'fa rm as do l VEl nt ietre m is adlsposltion pou r 'I.era.ng erne nt des docu m ente utll ises !orsd es man ~p uta t1 .o ns d es e ch an tmon s, de s mmeux de c i l J ll . tu r e , d ie s re acms , e tc .

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iso 721S:~996(F) I:SO

NOTE. -II est souhaltab'e que lss documents otJ llvres qui n8 sont pas,Ire quemmemt uW isessoient p laces a 1 : ' 6 x f e rle u r d as locaux d iessals.3.4.4 l .es Iccs ux d.Q ~ v el1 i~ t l l n 3 i bien e c ~ a i r e s en . e'Vitant 1 8 cr,E1a. tionde ref~ets g 'e r lants .. ~~co'l1!lli:enitc l'e v~te r au maximum j:'expasition directs e .n .! o le ll d es e~spacesde tra.vail at a u mate ria ! sens ib le(etuves en perticulier) ..

, t ' i "\Lss sols, m u rs, p1aionds" pa_1 Iasaes et me ijiUe rs de I:abora toire doivent etre reg ui~re meri tentretenus ,afrin dl leviter tl,appari~:on de dei,Buts de ,oont~n l !l itequ i e re en t d es lOO:E':S 'encrassementp riv ille gie es a t a on t d on e.sQu rc es d e con tam in al]a n.

Un r:letioy.age et una desinfectlcm dolvent ,et re ,ef iectues feguUere ru -en ta fin de ma iln ltenir la s beauxdaJ1Sun Istat oompa~tble avec I~atea:~isa.t~Qndesessai s.. .'\ ...__ IlEIS system es de venti~ation e t le urs , fiUres doiv en t , etr e regu~,ierementerdretenus e t le s ~itreschan ges autant q ue necessa~ re,

_ La contamtnation _ d i e s surfa tc es peu t i :twee stime9 - pa.r l'a ppHcatia n d ire c1 s d 'un m l:lie u d ie cultureg6' los,s:conte nant de s a ge nts n eu tra lis an ta a.pprcip'ri as . 'La quai~tede li',airpeuntre El,x.am~rIleepa re xpos itio n - p e i l o a n t 15' m i n - d Iu n e boite' a e _ ' : _ P s t r i -au'vEl rte CCH1tena.rl l t un m i t ie 'll de' ou I tu re ge Ios e In0 rl --'s ele ctif (p ,a r e xam p iie - pila te oou rru t ag ar'" ' (PCA}l

NOTE - D 'a utres method as peuvent ega l em e nt ,etre u tilis e es pou r estlmer la c on ta rn i n aflo ndes surfaces et de l'alr ..

I\...._-"

De tagoll1 9,enemile, taus has materiels at equlpement doiv~:nt etre msintsnus propres et 1.3nbo n etstde ' ro:nctl ,o:nnement. n o on vis rn t d 'a ss u re r 1 I In i S u i v i i de s , o p e r a t i Q n s de ma_miiernanc. Les in.stt"lUlmentsde mesurs doivent elrevel1iies. rn,gll.diellement4.1 Hones miCJobiologi ques

Un a hotteest UI a paste dEl travai l de p 0 tJsslere . i l l : e;oat.II,~metnt cI'a.lr 'Iaminatre ho rilO nt.al 0 L J vert,; cal.lEn m~.crC!lbi,oiogie, un a hotle de seeurite e st u tillis 'S8 pOnJIrliemfJir ~8Sm1croorganti ,smessur dies fi~.tres.Conl'il'sn:ti onnel ism e n r , i.e nombm: maXilmaltolrrablel de psrticul es d:~ dimenstonS!IJ ~ e r n e l ure 8 !0,.5 1 1m par metre ell be rep res nte la elasse d Iem pOUS5 1em ment d 'u ne h oite de s e cu rtte , Pour liesb otte s u tiil sees en micmbi a iag ie a llmenta i re , lie nornbre de p 8 . l ' i t i j cules ne doit pas d epasser 4 C lOOpar metres cubes.

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elsel.ss honesi sent de deux types:

a) hotte sa~ iu>: laminam re , qu~ 'em!pour but de p:l lo~egerle prOOuit des oontamtnat ions exterieuresre t:de m ln irn is er le s contaminations dues a I'!operateur;! J } h ottes de secu rite, q w i ant pcu r but (je prQ t~ g 9 r le prcde it des CCl'I:1ta m i na tio n s e xte rle u r es re tegaJement de pmte.g.er l'Oiperats.lIJret 1I'8Il'vir(mnement.

4.1.2 Entll'sti en et contrQleL 'e ffic ac ite d 1une hctte de securite dolt e tre , oo ntr6 le e lors de s a reCip lio n re t a . i nt er va lles regu li ls rSpa r un s pe r~ cm ne habmtee tu ne f requenoeannueHe est recom rn ande e). O an 81 ~ ec as d es flo tID e savec prefHtres~ csux-ci dolvsnt t!tre changes regwlierement.It Y a Heu de r lrs :troye r si t d e des~nfecter I es notl:e s apre s uttii:sa:~ion.U oonvient deli~ansJe r d iesveri1 1 i atio ns , p erio dique :s des . con tam i:n 8~iQ:ns :micro!b~8inn~spair de s con troies de la Sillrtaee de lazone ds tJna.va~I,etdes parois,Une ve ri~ ic a ti on p erio d tq u e au raux de m ~ croorgarliism es p resents dolt etre effeduee e n uW i sa ntI'equilpement habitueLPar ex.emple en xposant plusleurs boltes de Petri ouvertes ocntenant unrnil~e'LJIg~iosenon S:ie ciu if (parexemple peA) pendant 3U min scus ehaque holt.e. O'auuesm-etnod,es p euver: rr ega le rnent etre uti lisees. _::

----- ----------~~-- ==------ ---4.2 Batanee

Un laboratolrs de microhiOiogre a :Um.e li lt ai re don e tre equipe de batarees ada:pte8,S en p(jrte~ et 811p re :c :is lo n aux d if fe ren ts p rodu lts a pe se r. D eux s en sibilite s s en t en g:eneral necessaires: 0 ,.0 1 g ! 0,0001 g.

ces balances sont princ ipaJemel '1 l lt u ti li sees. pour la pesee de la prise cPessai de .r,!a'lllantUlon aanalyse r et cellie des eompcsante c ! ElS milieux de eultureet des reactim. Elias . s e J ' V ' l s : r n te ve ntu e ll em 8 nt a effectue r des m eSLI ra'g:ss pan d e r8UX de vol urne de d U uant.

E~~edoi~ e tre verif[ ee regu !iEm~ ,; :me .n ta vec des maasssstalons de tra va il ( de preference c ha qu e jo ure j , ' u t i i U c s a t i l o n ) . Eills doit Eiir'El. v eri.iie e sur ~ 'elilsem bl:e de sa porte e pa r une pe:r sO 'U1ne na.bnUee aumain.s une fOi[S par an.Le plateau de is. balance d olt at r'e nettoye, 8 1 n e ce ss a 1is , apres chiaque utilisation et au rn ci ns u nefol spar jom. Un netl.-oyageet un contra I.edum ecan isms dolvs n . t etr,e e ffe cru \'.lisp ar une pers onneC ; hablUtee Btl m ol na 'LJ];19 T al s pa r an .s

..=.


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ISO 7218:199$(F)

4.3.1 D e80 ri pth::mCetappareU est uWise pour preparerla suspension mere a . panNr de l 'echantiHon pour sssal desprodults autres que las prodults llquidee.l 'un ou l'autre des appare lis suivents peutetre uti 1.188:

- hom ogeneiSL8.te ur de type pe rlstaUhqus avec des s acs s te rH es e n p ~aEUque e t c orn po rta nteventuellement un variateur de vltesse et un rnlnuteur:~ h omog en el(5 ate ur d e ty pe rota .m ~don t la v lte ss e de rotation est com prise entre 8 000 tr/min et45 (l.O0 tr!min, avec des bois en verre 0u en metal sterHisables et m unis de oouvercles.

D ans eertal ns cas particuliers, I'~ homogene l sa f i.on peut eire realises avec des b Hies d e ve rre8ierilHsablEls de diamatre appropne (environ 6 mm; vo ir no rrnes specrr iqu8s).

4..3.:2 UUlisationLa clun~e habitueUe de tonctl 0 rmern nt d' un hom ogl1eisa ts ur p e ristaltiq usest de 1 m in a 2 min.Ge type d'apparell ne doit pas elliS uW is ~ p ou r c e rta ln s 'f:w odu its a li m enta l re s, tels que:

- la s produ~ ts risquantd'entralner des perforations du sac (presence de particLlies paintues J.. _~dures OU ~Ch!3SJ;,9_!1 ~_ ... _ ... ~ -_ .=:-. -. - --.-- ', ----- . ,--. . -.'.~ ~__..: __ ..-=~'.~-~..~----------~ ~~,,,, . . . .--- . . . . . . ~-

- le s pro dults diffh:iU as a bemagsnsl se r de pa rt Iau r textu re {p a r e xe rn p le eauc is sc n sec }.L ' hom ogens lsateur m tatif d oit fonctlon ner pendant une d uree te lie que !Ie nom bre total de tourssolt ccmprls entra16 000 et ~O000, M:me avec !Ihomogs 'neis ateu r ~eplus ient, cette duree nedolt pas exceder 2 ,5< min.Les bmes de verre peuvent e tre utmsees pour is . p re pa ra tio n, p a r a gita tio n, c is s suspe n s lo n s mere sde certains prodults viSqU9UX au epais, notarnment ce rtains p rodu tts ~aiMrs (voir normesspecifiq ues),

C es cH fferents apparells dolvent etre controles at enltretsnus se~Of1Is s in str uc tio ns du tab rlcan t,

,\ ._ .


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Le pl- l- rn e ire est utmse pou r mesure r la d [fferenoe de p H ) [ l S n t i 1 e i , a une ts mperatu r e d le te rm l n ee,entre U I1 i S e~ctrod e d ,9 m es u re ef une Elleetrede de refere n ce, toutes de ux eJant introdultF.5 s dans iep rccu it. ~doitetre capabl e de r,ea [ is e r des rnesures a 0 ,1 unite pH pres, etson seui I rn in imal cjernes ure d oit etre de O~01 Uln]te pH .. La pH - rnetre dlo,]l;et!fe equip ' d 'U r l systeme de c-ompensa. th .J fIdetemp 8r ;a 'l: ue so lt manue lso lt 8:lItomatJIque.

4.4.2. Uti'l isali e iiiLe pl- l -rnetre sert a mesurer Ie pH de chaque fabrication d ~ m iH 1 !Jde cuU ure et de reacitif (7 ..2 )pour V E l rniU r sl un a] ustement du p H sst t r l J soessai re , U peut egah ! m e nt se r v~ r a mas u rs r s t/o u aa jius te r l ie pH die .I 'ecnan ti j, i~ :ol fl pour essai au de la suspension meue. DlUltmisatior i d!~.mpH~me:ttre estme.ntioll l1i1ee dans 1 8 norma specifique du p roouH a anaff iyser qu i p reoi:s e ra .le s c onditio n s de ladete rm i n atii o n du p H~ del 'aj ;usteme:nt au J ] I H , alnsi qu e 18.:methode de nettoyage ,et deeJieoontam~ nanon de'S electrodes.

_. - Le pH ~me~r'e doiH!tre 'et 'ahlnne;-s,e~on les hiistroctions-I(jIll-taorR:1l'rrut,-avE:c ,aumoins-deiJ i sGiutions --_.tampon s eta lons, au mains ehaq u e J our a va nt l 'utiUsation. Le s so 1 1 U'!]n 8 eta.lonS ont des va.le u rn d epH connues, a la seconds ch~dm9.~eres, a ~ a temperature a u mesurage (en gelnera:l, pH 4.00 etpH 7j. o o a 2 0 C ). Ellies doivenlI encadre:r :1 ,e8 a ' l , e . l l . I l r s de pH m e s u re s ,Lies etectroc:iJ9s c1awent e ire ver ifi'E l es et eimirreiE]'IIUes selon les lnstru cUOr;tSctufaibric8:t1It.. nestneo9ssa 1lre , en particuH (3r. de SUI "VE lmer re gu~ ieremeni:

-Ie viellllssernent et l'enerassernent des e~ectro(]es;.~ .e te rn p s d e repol1!se et ~a.stabHile.

A va nt e ha qu e u ti:U sa tio n, verlner que le b u~ be d e rn esu re de s e le ctrod es tre rn pe entTerement dansl'e au cH siiU Eie au tout autre liqu lc:l~ , selon lss instructions a u f .ab r ican t; s lnon , le ' fairs trem per .2 4 havsn t I e ! I effectuer tout m ssu r.ag;e.N etloye r lese ie ctm de s a:pr-e se ha q ue ul]lisation. Pou r '[ en~ r co rnp~e de l 'encn1assementet duvi emisse m ent des eiectrodes, proceder a un nettoyag s periodiq W I 'S pius soigneuxj selon laslnstruct~onsa u fabr~cant. .Go r ise r \li 'e r la s e I:s ctro de s s elo n Is s in s, tru cti oms a u fa.bricant.

(.. . -

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ISO 72.1B:1996(F) I,SO

4.5 Autoclave

U n autoclave est ap pare il pe rm ettant d'obten ~ ru n e vapeur S8uree 8 : uns tempe ra tu re m in im a .~ ede121 QG" en 'lila e c i e detil'ui re les m Icroorg.an~s:mes.

4.5.:2. 'UtiUsationl.o rs a u meme c ycle d e smr~ lis a.iio n.. I~ ia uto c~ a.v erlS d oit pa s , lre u tilise po ur ste riH ser un mate rte 1propre (eV ou un mi]ieu de culture). eft p our deoonta:miner ' I L I J i i mater ie :~ de ja u~] ii se (et/olJJ!un mmeu dlecultu re d e ] a t utilise). H es t p nferab!e d ' uti Ilser d e sa uto cla ve s s ep .a re s pou r r e i i l . n s:sr ce s de uxope rat ions.L'autoc!lave doit e i ! i E l : muni :

_ .. .p r evue: . _ . - - - '- - - - . . . . : ~ . = - - ; '_. _ - -

ll est :ga~ementpr- efera b le de mU!ili r ~ 'autoclave dIU n ind l Ciateu r de d IJ 1i,eo1.Jdunp rag ramm e u r-ml nuteur,La strmsat~on it ~a.vape!ur ccmpor te I! ob :~gal ii lond1expulser tow.I'aili avant 19man~ee en . pression..S i l .'autoc la .ve n'est pa s mun i dun d is po sltlf d'ev acua tlo n autcmatlque, I I ,es t necessaire de lepurger deson ai r ju sq u 'a emis s.~ cme ' u n j'e t co ntin u d e v a.p ,e ur..

4.5.3 Eillt:ret~enet controieLis1lJtoc:ia.ved6tf~tre maintenu en parfait e t a t de foncdonoem entet dait e tre r ,e g u H S I I " lm e : n t o O J 1 t r o l, epar ! e s s ,e rv h::e s compete nrm s e d a n les insnuet iens diU f a b r i c : : a r u LTou S lfe-sinst ru rne rns de controi,s d oive:nt etre m sln te nu sen parfait etat et do lvent etr ere g u ijerement v e r i n e s .Las opera tkm s c] e deta,l1ra ge , si be sc in est,et de v idan g e dolv ern e tn3 reg ulierement efh~duees"


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C ISO ISO7.218:19'96(F)

4.6.1 Descr'iptionU ne s tu ve est une encelnts perm sttant de m aintenir una temperature stable et uniforms a 1 . QCpres, saul specifi C ia ti o n eon tra l re ,4.6.2 UtmsationLes etuves dolvent etre squlpees d'un systems de regulation psrmettant de maintenir unetem pera ture un iform s st sta ble dans l'en sem ble de le ur v olum e, utlie .S i 1 8.temperature ambianteest p ro ch e ou s uperle ure a . Iatemperature de I le tu :v i ~ i r est necessa lr sd e mun ir l'e nc ein ts dLun systsrne de refrcictssernent.H oenvlsnt de prc rl: eger 18sparols ds l'etuve de is. Ju:miers sola ir e d tr ec te .

(~~~~I~_.' , ; : , , - 1 II est rscornrnande de ne pas rem p!ir eernpleternent I"'e tuve en uns seule operation car !e temps.d'e,quilibrage de la temperature dans Ie miiieu de culture gelose sera tres long, quel que soit:letype d'etuvs utilise {convection d 'a ir fm ,o OLI autre}.

Lars du eharqement des etuves,. fI y a l ieu de veiller a tacillter la clrculatlcn d'alr; en aucun cas lasbcttes de P etri' au 1,9Subes r H 3 - dolvent e t r e p~aces a mains de 25 mm de s parols internes del'etuve. Las pilee, d'au maximum 6 bottes, ooivent :tre espacees d'au moins 25 mm les ames desautre'S" . _ . _ .- .~ .. - - ' _ ' - _ . . . . . . ; . . . . : . _ - - . - _ ' = - -

. " _.;..... .-.:..::-~--=--------..:.-._. _"_" --_.=.._" _" _ ..._-- _ . . . _ . _ 1 "'_==- _4.6.3 EntreUen et contro~el'homogeneite'de la temperature ill I'interi'eur du volume utlls dolt eire contr6lee a l'aide deptus ieu rs thermcmetres OU sondes,U convlertt que la precision de rnes ure solt qua tre 'fois rn alile ure que la precision demaodee (paraxernple po u r une p recision d e m a n d ee de 2 fIC , la precis i Qn devralt etlie, de : 0.75 ~C).

"_ La s ta billte d e Is .tempe ra tu re dolt E itre controles, pa r exe rnple a ve c un ow plusle urs th errn orne tres. a minima-maxima.La te mpsr a tu r e de lie tuve doif @tre controls e au meln s to IJS. 1 es jours dLutHisat]on. Dans ce but,chaque etuve dolt eontenir au mains un thermornetrs dent Ie reservoir est immerge dans oug.~ycerol place da ns un fla con terrne, D'aotres systemes de v erifica tio n d 'e ffic ac ite equ iv a.t, en tepsuvent egalem ent etre utilises .

.- ~ - - -Les parols lntemes etextemss doivent etre nett'Oyees et dsslntectees regulii1l.rement et, s'H y alieu, Ie systeme de venthatlon doit eire depoussiere.

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@iSQ

4.7 Refrigerat~ur, ellamore frclda4.7.,10s'scri ptlcnUn refrigeratem et u ne 'cn,amiJre froide sont c J es ,9 n ee ln tes pe rm e ttan il de gara n t i r un econservation en froid positif. La temperature, sauf specification contralre, doi1 ~tre de+ ,3"C 2 Q e saui pour Ia conservation des echanUlloriis pour analyse, ou 1 8 temperature dolt etrede + 2 C 2, "C.4.7.2 UtmsaUon,II es t necessai re de disposer d'encelntes cHffsnmtes pour la cons 9rvafio n:

- des miHeux de culture non ensernenees et des reacms;- des echant iUons pour analyse;- des souchss de microorganisms's et des miileux ,incube.s.

Le s re frig 's ra te urs , e t ch arn bre s tro ld es dolv en t M ra charges en vellla nt a malntenlr LIne circulationd 'a i r appropriee.4.7.3 Entretien et eontn51'eLa tamperanire de chaeune desenceintes doit eire v9,r[iiee-chaque jour de travail' a [-aide dun-thermornene ou dune sonde places a demeure. (Voir 4.6.3 pour la precision de l~apparelL)Le s operations d'entrene n suivan te s dolve nt tre regulierement effectu9'9S:

- depoLlss ierage des ailettes O L J des plaques d 'e :c i1ang:e the rm lque extemes ;- deg iv rag e ;- nettoyage It d~sinfection de '!'interieur des enceintes.

4.8 Cong,elateuflUI.1 Desc ripiionUn conge '~ a t, eu r es t u ne encein te permettant de garantir une ecneervation en froid negatii. Latemperature, saut specification eontralrs, doli: etre inferieure a -18 C, ' C h 3 preference ega!.e a-24 C2 CG .

4.8.2 UtiiisationII est necessai re de dis poser d's nee ~ ntes differe ntes pou r la co ns erv an o n :

I,

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ISO liS 0 72 1 ,8: 1 996 (F )

L e ca ng eia tem dolt eire ch arg e e n v sllla nt a rn aln te nlr u na temper,ature suffisa mm ent baase et 'CStparti cu,~ ierement lo rsq u sen t in tra d u its de s prod L J its no n 0 0 1 1 1 ge ~es.

La tempe rature de en acun e des encei ntes d ali elir ve.r ii ieit5 ehaeu e jou r de ira vaH a I~aide_.d Iunthermornelrecu e J iune sonde plaaeea dem eure.(V o'ir 4.6 .3 pour la precis ian de !'appareU ..)"

~ d spa Ussl erags d es aIletl:es ou des pi aqu es c i I~ch.ang e therrn 1qu e e xte rnes:

4.9 Bai:n.thermostats

- U n baj n 'therrnostate est un ba:iif p ermeftanl de r i i , a . i n f E ; n ~rde- f a ' 9 o n stab te u n e - t e m I = H ! i r a - t u resp8Ic~ih3l.L a p r- ec isian, saul spsclfica,tion oon tr ai re , daitetre de 0 ,5 C . Les te mperatUIresd 'u iiis atio n so:n .t pre cJ 's ees dans cheque method,) d'appiica.tiarl.

4.9.2 lilt] li,sationtss p r n nc ipale s uU ii is ations semi;

~ l 'in cuba lio n d s m ilie ux de eu~ ltu re en se rn en ce s a une tempe ra tu re c on sta nte :- la p re pa ra .U a rl, de s ;uspens~ons meres a une tsm.peratUlre main IflUe constante (pa.r exem p! e ~ap r , e p a J ; a t ' ~ o n des ,suspens ions meres de ease lna tes necessi~e leur ma.inlDen pe:ncia.nl1 S mi nda ns un ba i n d? e,a 1!l8J7' "C);- is tra ite rn en t th e rm i q us de s U'S pension s m e re s a un e te rn per,ah.lr~ mal nten ue constants (pare xamp le , le d en orn brement d es s pa re s peut nec i6ss iter la dest.ructton des cellu le s vege ia tiv ,e s ),

Pour unreglage precis della tempera 1 u re . le b ain ~h ermos ta .tB d elt eire equipe d'une pam pe acirculatinn d'eeu et d~UlI'iIysreme d e l l r1egiage auiornauque du .o11l.8100ag8.L ' ,a _ l g i m N o : n l du liquide medoit p,ss pmvoqu s r la proj actio n de gOLittes,

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4.9.2 Ent.reUen et controlsC he que bain doit 6 :tre rnun l d'un th errn cm stre au dune sonde i l1dependant du systsme dere gula tin n (v oir 4 .6 .3 p ou r la p re cision de l'a pp are il),La tempe ra ture do ba .in dolt e rre conir61ea lors de ch eque utlllsatlon et, de preference, una Iois parjour.L.e nlveau cu H quide du beln (eau, e th y lene g ly co l, etc.) dolt etra regul1erement contro le .Pour e vite r touts p roU fe ra tion rnlcroblenne, l e l1qu ld ,e d 'o it e tr el change frequemment

4.10 Fou r a sterUissr4.10.1 Description

ULl foul' aste r[IJ ser e st une en ce in te perm ettant d 'a nein dre lin e tem perature de 1 70 C a 1 80 ' ; I e ,en vue de de trulre la s rnlcroorpan lsm es pa r ch aleur sech e,

S euls Ie s m aterie ls m etaU iq u.es au en verre s ent sterllis es au fo ur a steriUser. La aurae desteriHs,aUon est d'au mclns 1h iorsque I,a temperature corrects est a.tteilnts.AVERTISSEMENT: : A u , c u n ' e ven'eri,e- g r a d u e e ne cairetie sieriUsee dans un 'f, ou r , 8 .s te rU is ef'.- '- -.. . ._- .. -- -~--:_ -- __:_----:---=::: ..:-=-~-'- ---_._:- .._:. .......:...---_:_.__ .._--- .- -_ -_ ._-- .La re partltion de tatem perature dan s l'encelnts dolt e tre h om og ene .le four dolt tre mun t:

- dun d ispositi ,t de reguta tion ( thermosta t) ;- d'un tn errn om etre o u d'u n th erm om stre e nre gjs tre ur.

II est egalem ent preferable que Ie four snit m uni d'un indicateur de dmes au d un p ro qram rn eu r-- .rnlnuteur.

4.10.3 Entretien et ,controteL 'homOogene ite oe ~a.temperatures l'interisLiT du volume utile dolt et re contro lee.Le four dolt e ire m aln tenu en parfait etat d e ton etlon ne rn en te t le s in strum en ts d e corrtre le do iv sn tetre veriM-s regulierement.un n et to ya g e reguUer est recommande.

,I.

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4.11,.1 OesoriptionUn fou r a rn lcre -o nd es e st U iii epparef pe rm etta nt de ch 8ufOOr U r:I P rOGuit par ~iu tmsa. tionde mic~Q-andes.4.11..2 UU'li,s~tionl~EtrI'etat a olue ~ de nos eonnaissances, seule ~ 'u:tmsationpour la fusion des miHeux: ( j'e culture9 eioses est pos si ~ le.l'appa rsil utilise fon ctlon ne s ous p r e s . s ~ D I i 1 a!tmosph,eriqu. II I doH.pO i i . J \ I 'o i r cl1auft :er~es m i 'i i: U l x deculture de fa~ on ocnntr{j~ eepar un cyde diem issi ons mlo ro -end es , La r epar 1 ltio n des rnle ro -ondesdnit etre ham Q 'S 8 ne a ~! in ter lau r d u proch. l~ta :~fnO i ,e V l le r J e s po in ts d e s u r eh au ffe . P ' D U runemeiH eure distribution de la chaleur, H e on vle nt de munir l'a pP ' ar eUd 'un p la teau teuman t,,ATI"ENTUlN ~ rilan i : ~ : l ' l J I l ler avec soin ~ le el' l ,auff 's,ge des mUiet ix de e'l:ilhJJfe ge~o'sesdans u I'llfe E . I I r it m iere-ondes pe ut entlrai ner 1 . 1 1 n ,retard r e P e b u U ition.

NOTE -En l'absenee de demonstrati ion suftisante de I 'ef f rcac~te des m~:cro-onde~our lasterilisa'Uof11 des mU ieu:x: d e cu~~u'r'9,ette utJiiisa.~i.onne peut , a cL u e : n ,e m e n t pas etr,e prevuedans Ie cadre de la presents NQ li'm e in te rnauiona ie .

.----=-=- - -~--. ==----4 ..12.1 UtiU,sa.tionUn m ic roscop ,e op'~ iq 'Uepr es9n - te des () ib jeoC 'tiffi . dif f2 rernts groos issememts. Afar!: grossiisSiement eta 1 ! ~ limme rs ton ,~ Ipermet d 'obse rve r ta morphoiogi'9; d es m ie re erqa nisme s e n s us pe ns io n a .q ue us ou a pre s colora ti 0n. :~ ~st preretabl,s C ! ue ~em .ic ro scope salt equ ips 0 'un c:llsposUifa co nfra ste d ephase pour amenorer ~esobservations e, I 'etat frals,

NOTE - D '8s 9 :ppa'l" 's H s(m lcro sco pe sa lame) it f alD~e 'g ross isse rnen t a t ~:dealementste re oscoplqu9s s ent dls pcn lble s pour l's xa rn sn des colonies de bac t:e rie s sur a u da ns lesrnm eux (je cultuee gelose a,4.12.2 Entreti:enet conirc,1 eApres lIillii:sa.t~on a i'imme~!on~ I'objectif dolt l1 re nettoye de maVilliera a ne pas 9.\mrer Iraqu:aiite de1"OpUqiUSat a.iil1l ij'e nm ln er le p ro du it u'l:ihse p~~r l'immerstcn,Au rnoi ns unetoi S , par an, Ie microscope doitsu D ir u n I " i I ettoy ag e g e n e r a l ~un control e a umecanisme e t d e l'o ptJ iq uE !' pa r lJ il1 J iee rs enne i:li8!bmte9.4.13 ~rCUeur agaz, i.ncinerateuf a fElUn brCdeut a gaz est uti~:is.epour ereer et rnaiflltenir urne ZQrlS de protection autotllr d'un point enaud.

I' U sert a sterHiser ~es~ U . S et les arises eli metal, en. les por1a_rlt a lneandesc 1'100.~-


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e rs oII es t p re ie r. a.o!e d'utillser l'jr1dnerateur a iii pour la sterilisation des fils et des anses en meta ll apresla m an ip L :I ~ a t 1 c : n i lde s nacterie s pa th o genes_

Gest un i'F1st1rtlmen~ cu apparei' permettent de repartir les milie'uIX. de culture et r eac ,t ifs dans Jestub es , fla ccn s a u boTh es de l Petri (p ar e xemple eprouvette graduee, s erin gue rnanue lle , s erln gueautomatlque, pompe peristaltlqus au d~~idjributeLlrutornatlque d ,e rnllieux).

4.H.2 Utilisa~ionD arns, e cas de r epaJ ii ti on esept ique de m lh eux de culture et de r eac ti fs s ta r iles j toutes lies pa r1 ~esde i~:ln:strUlment au de ~.L.aiPpalfei lencon ta eta ee e Ie prociu:ita ~par1 ir dOivent eire s tE irUes [ vo ir 6 . 2) .La p recis ion de l'ln stru rnent OL i d e l'a ppa re ll dOlt eire adapise a Is "p re cle lc n du volume a repartir.En pa rti o u.iie r, ~a p reelslen de mandes sur Ies vol umes de d ih..lants l lt Jl !i se 5 p01H effeChJer l esdi l u n t i o n s o leoima le s est j,) 2 %.4.14.3 :Entreiien l e t . controh~!C as in snu mants et apparsr ls doiV:rIl i ~~re.mal ntenus en parfalt e t a t, se lon les i:nstructjol1 s d ufacricB!nt _ _ _ _ - ~ _ _ _ _

4.15 AQftateUl mecanlqueUn agita~eur mecalli l lq u e p arm et de meianger de ra:90nhomogen e divers mmeux liq u~des I~parE:x:empieI18s d~lluti!ornsdecimales et ~esechaJlil,tiTIons pour essai liquides} au mettre en suspensionde s cell ules bacterlerm es da ns un Ilq uide.8 'll:1 p r~ .nc[ pees tr om :ie sur un mouvemeot de ro ta tio n e~oe lil'trre edu c on tenu d ie s tu be s , a essal(vort.ex).

H est preferable qlle 'l'appareH saul muni d'l!Jlnsysteme d 'scla~ r ,a .gea .vec fO li ld na ir , d'une Joupe deg rosslssernent min imal : 1,se t dun corn p te u r filum e riq LI m sca.n iqu e ou e. !eetroniq LJ. To ut autresysterne de cQm.ptage automat!se d'efflcadte equival.ente, peut eire utilise (p ar e xemp le corn pte urlaser).


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erso rso 7218i:1996{F)

4.11.,' Oescfi l~~onC'est une [arre ,6fermeturs etanche ou taut a!utreappareiHage approprie perrnettsnte'obtersr etdsrnalrrlenir cI8 condit ions d 'a trnosphere mo.a ifi, ee {p a,r e xe rn pj,e a na ero bicse ) p en da nt tou ts radlu:ree de 1', incu'Daij(m.dt.! mmeu die cultu re . D1autre s s ys temes de perio,rmanoe equivalenre, pa rex:emp\e ohambres anaeroDie.s" peuvent 'etre u~1 Iis e, s.Les in struetic ns du ta brioan t dclvent 'stresu ~v~espeu r ill:insta.1 1a tion et ta maintenance.

4.~7.2 UtUisati.onLa composition de I 'atmosphere obtenue par un melange gazeux tpar ,exemJl~e,d'u ne bo u tem e degaz) au par tout aut!re moyen apprropr~8(par exernple des systemes ga:Z:9ux disponlbles dans Ie.,;commerce) sera pr~ci.sldans la Norms lnt ,emationa le s .pec if~que+

4.17 ..8 Enil:re~[e:net controlsUn i.n dic ate u r d e o o n l l t r B i e de la nahlre (i'e ['atmosphere dofut~tn1ll 'p~acedans cheque en oeintepe li lda lr rr l chaqu l iI tlUsat io r l.Q.uand un systeme cata lly tl, q ue es t empia'ye , II don. etre r e g l e n e r e se:~cm1es wns tr uc ti ons d LIf:abricant

4.18 Autres :materiets

(\. _ -

D 'a :t lJ tr es m a :~enie lset equ ip eme n t sen t d"uUns:i3 :t ion oourante, dont les suwvanis:appareUs def ilt ra t ion , recip l en ts (tubes a essa is , fl ace ns, beutetll es,etc.) en verrscu en matiere plasti.q U9,boltss de Pe,trt"enV5rf au en matiere piastique (les pIus eourants ayant ent.re 9,0 rnma 1100mmde oiarnetre). pipettes en vema 0 1 . 1 en matiere pias~jq'lJe~de 10 mt. 2 ml, 1 mlj etc.,), instrumentspour p reh l! vemen t d'echa'l1~mo:n" 'fils e t a ns es (en nickel/chrome, en p~a~tnelr!ldie au en matierep iasNq ue a us;ag e unlqu e , etc.),: 5 Personnel

Tou t personn el in te rv e n an t d an s IIn laboratoi re de m icrobio~ogh5dolt avol r ~e~u18:orm auionindispe:nlsab~,~ 1&DonJler,salis.atli.on des operations O J lLIiiui son. con fiee .s .l.s personnel c i 1 a r ' Q e de la r , e a J i s s t h " ; ) ' F 1 desessals do~tavoir une bonne connalssence at unepratique sumsante des techniques m.icl 'Olb iiolo'giques et des mi.cromga.n~:smesr,ec:herclles,. Hdoitegaleme n t pouvo ir in ts~pr 'e te r l es notions de precis ion at de fideli.te reClulsas pau r obler:1i r desresu lta ts ecoep teb les , P o u r oela, Hpou rra, pa r exem p h i l " pa rtic l pe r a des e s sais circula i res, L1t[H~edes m a terl a ux de referenoe, au effectuer des essais d 'a. IJ tc'Hhraiuat i;on pou r ~ede n ornbre m e ntd asm icroorga nism es (se na.ierer en pa l1 icu ii ,e r eux tr avaux de 1 21 .~L).

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ISO '721,8:1996{F) ISO

.t.'ensemble du personnel doit recevoir une lnformanon continue et adaptee I S n maliere d .hyg~eneet de securits.

5.2 HY9ien.eDa ns ~e dam aine de ~ihyg~ene person neU e, Ias. precaut ions sulv a n te s doiv en t etre prises po u reviterla contamination .des echantulcns et des mlheux de culture, rnais egalement pourevlter desrisques o'tnteetion du personnel:

- porter des vetements de laboratolre de,cou lsu r c la ir e, propres at en bon stat, reaiises dans Uritissu limitalFlI les risques d ij, n flammabH i te ; cas vetements ne dolvsnt pas , ,etr s pones hors de slocaux d' a ssais at, eventu eUs rnent, des vss t ia l res:- porter des protections pour Jes eheveux et la barbe, si neceseaire:- garder des angles pa.rfaitement prcpres et so~gnes et, de preference, courts;- se Iave rsoign euaernent les main s . a 1" eau ti ede, de !lvree de p referen ce par un robl n et acommence non rnanuelle, et au savcn liquids au en poudre, even tueUement desJn fec tan t,deiivre de preference par un distr:ibuteur maintanu en bon etat de prop:rete, avan t et apres las xame ns m icrob i,olog ique s e t lmm edla te rn en t e pre s ch aq ue pa ssa ge a u> :to~ le tte s; p ou r S9secher ~ es m ato s, uti ilser des serv i ettes en paple r ou e n tlssu ill usa ge uniq u e;~ poendant J es snsemencements , evita r de pari e r, d e , te us se r, e tc.;

~ .p re nd re d es prec8.uti ons partlcu liieres pou r les pe rsonnes p rs 'sentant des ir afecli ens (pana rls )ou des maladies dont les genTles, susoepfbles de contamlner les ecnantHions. risquent detausser las resuttats;~ 11 9 pa s pla ce r d'a llm sn ts destines a!a consom mation personnelie dans les rMrigerateursd'sssals.

('.

6 Prepara.tion du materiel6.1 PreparaUcnLe materiel UtHiS8 en mlcrcblologie dolt ~tre prepare de fa~nna garantir sa proprets st/ou sastermts jusqu'au m om ent de P utiH sa tian.

Les tubes et flacons dolvent etre bouehes a va nt s te rilis atio n p ar W1moy,e,nappropri.e (cotcn carde,b 0uchons meta l liq u ee ou bou chon s plastlq ues t etc.) ,Las pipettes d6 ivent eire bouehees avec du coton carde au tout autre ma:tenau adequa: t.

1 6 ,


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'ISO ISO 721 a:199S(F)S i necessa lr e, 1 '5 mater iel a ste rfilse r p eu t e tre place da ns de s re cip ie nts s pe cia ux, ou ,emb an ed an s un m ate ria l! adapte (papler speclal .a lur runlum, e tc ..). II co nv ls nt q ue lie ma:tirie_1 . passer ara uto cla ve v ld e (e 'e st-a -dire se ns m i~ ie u cu autre so lu tion a qus us e) pe rm etts Ie lib n~ acces de tavapeur, s inon la s~erilli~satio.nne seral t pas rea lh~H~e.6.2 SterUisation6 .2 .1 SteIiUii,sat.i 0n pa l:" oha l e ur secheO haufter dans un four a ste rilise r (fo lJ r P a ste ur) (4.1 0 ) p en da nt a u rn oln s '1 h a une tempera .turecomp ris e e ntre 170 Cet18D C.'6 .2 .2 , S te rU is atilo n p ,a r c ha le ur h um id eChauffer pendant au rnoins 15 min a 121C dans un autoclave (4.5) rnuni, de prefFiirence, d'un

I . -> . dh ;posH if de secha ge sous v ide . D es m dica teurs de tem perafurs peuve nt e tre uW ise s, afin des 'assurer que la tem perature a bien e t e a tte lm s (p ar e xemple p ap ie rs s pe cla ux ),6.3 MateFie~a usage uniqueLe mater iel a usage un ique est accepts a u rn ern e titre q ue la v srre rle reut ili sab le (go iters d e P e tri,p ipetl :Els,flacons, tubes" etc ..) s i le s spe ,c liftcati- ons,sont s im i;~a~res .II est e lors co nseillie tie s 'a ss u re r a up re s 'du fou rriisseu r que iss rna I e rle [6 proposes c c ) n V i , e - n n e n T ~ ; ~ . ~ _ -~- - - - - ._ - -- pour IIuti Ilsanon Em "mi'cr,obilologie' (en particuii:er ,e n ma tie re - cle stMlite)" et t ! u e - : - I e i materiel -rile---- ---connent pes de substan oe sLisceptib:1 e dnM[b,er la croissance des m ic roo rga n ismes,le m ate ria l a usag e un ique doit etre d:eoontamlne a va nt so n e Um in aU on . O utre le s m eth od esciteesen 6 .0" t"indneration peut e ti re u ti lis es. Si l 'molneratsur lalt partie, de 1 ' ,e tabHssemen t, IIpsrmet de rsa liser en une meme operat ion 1 21decontamination et ~lieJiminabon.6.4 (' ie,stian du rnaterl el proprel.e ma te rie l p ro pre doit e tre s to ck s a l'a bri d e ~ ap ou ssisrs da ns de s c on ditio ns a ss ur an t Iern aln fis n d e s a p ro pre te ,6.5 GesUondu materiel,1 sterneAva n t u tmsatio n, te r na t e rl e l doit tn3 stocks dans des con d itionsass u ra nt ~ema i nt j en d eS8s te rilite . L es ma te rie ls a u sa ge u niqu e do lv en t e tre s tocks s se lon les specifications du fabricant,s an s d ete rim ,a tio n d es emba l, ia Q l9 s; ~Sma te rie ls p re pa re s a u ta bo ra tc tre d oiv en t eire s to ck es d an sd es co nte ne urs pro pre s,

", ... -

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ISO 121 e:19:96(F) ISO

Lars de , Ie :sb ri ii sa :t io :n des matetiel:s destine:s a la microtd~k),gTe, un e da b! Umita d'u;li[U sa tion (euune date deffabricatioJ1) do it et re apPo.ses sur eh aque conditlorm ernent. Les mate riels bou e n 8she rmeUq I ! . J ernent petlverH eU e conse rves j usq u 'a . : 3 m 01]6avan t u ti! t sa tio ,n . .Les ma'br~els,c ondlnonnes non herrnetJquement doivsnt ,stre co ns erv es p en da nt un temps plus c- ourt (8 [o urspar exsmp le ).

Apres utUisation (culture de microorganismes au contact avec les rnicroorpantsrnes}, le materiel ets cm co nte nu d oiv en t e tre clecontaminss, avant tout nettoyage au elim ination de celui-e l, quel queso it ie m ie rco rgan isrne en cause . P ar axe mple, les bou chcns de coton des pi p ettes n e dolvsnt e t reren res qU'apres leu r d eCOr:ll8mli nation; ies tubes eontenant des mil ieux iiquides dolvent 'etredeoontamines avan t d 'j tr e ' laves" La decontam~naUon peut.E !tr e efif:)ctuee selon rune de's deuxtech n . i q L :I ess W liv a n te s : -

r s te rllis atio n en c na leor h urn ld e a l 'autoclave (4 ,5 ) p endant all mains, 30 m in ,a au rnoins "l2~~GdE:tout Ie m aterie l quj a e t - e en contact avec des cultures de m leroorpanlsm es (m ilieux deou,1nire incube,s, soil des au liq uides, r e , a c t I T f ~ , contam Ines I rna t e n sis J etc.):r,

- d eco ntam ln atlo n p ar trempag e dans una $o l.ut icm dls,]nfedante pour des mate rie ls de penteta W e e t r es is tant a la corros io n (pipe tte s pa r e xe rn p ~8:).l.es p Ipenes P aste ur ne doivent etre utUisees, q uu n e se ul e tois.Le mate ri, el e n matiere p l a s , t J l q u e p,eul erre d iree tement incil~s:re, 5 1 las ~als-du p a , f s ,cxmsidsrsI'auto,rrsent: -- -- - - -- - .-. -~ --- - - -~---

6.7 Lavaget~e laver le materi el qu'sp re s :88. dsooniaminstion.

Avant lavag e, sspare r Ies joints c i e leur b ouehon, s'i~ y a 11 u,Laver 50igneus,smeht les bouch :on s e t !1 ::9.errerie a l'eau chaude avec una sollu~lQndetergents duco rnm eree . En tabsenee de pl'iQduitdu com ms'ros. un8sol unon de carbon ate de sod~um aO~125 '% (rolm) P8Ut e~JeItn ils ee . p uis u n p as sa .g e, d an s, de l:lacide dnue { pa r e 'X emp ,~e ac ld ech lo rh yd riq ue {HC l) a ve c p = 0 , 1 mo!f~ ).Rineer toutle materiel a ~'eau dlst[U@;sau de quanta equ~va~ente.Pour ia ciH te r le s 'ops rs fie ns d e netto ya ge ,. des mah.iil"ie ls specia lises p e uv ent e tre u u[is ;8 :S {p :8 Texemple apparei ls a debauch er Is s p ip ette s~ iave-va]sseHe, cuves a ultras'o:ns, etc.),

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eiso7 P repar.8iti on at sterU i satmon. des m U h!lu x ,cis CII.II.1uree t de s lreacUfs

-La preparation preclse des mmeux de culture: est une de s 'stapes tondamentales d e I"a n~ dy sem icrohiol,ogiqu et II est neeessai re d'y apports r to ute 1 8 0 . ri g ueu r necessalrs.

L 'e eu u tU ls ee d olt ~ tr, e d e l'e au d~:sl:mse,au de, qua1lire equh'a~ente, c'est-a-dire exernpte desubstanoee suscspf bles d '. I nh iber au d'j nfl u ence r Ie cro iss ance de m lcrco rgan is m es dans ~e Bcon c!~ tio ns de l'e ssai, S ll'e au d is .tilh ee st p re pa re s it partir dtea.u c t11o r'ee, n eutra lls er le ch iorea va nt [a distiU atio n , .l.'sau distill8 dolt etre conseroee dans des recipients en ma.ieria.u. lnerte (parexemple vern::;n e LItre , pol y eth yl:e n e, e tc.) qui dolt etre ex em pt de toutesubstan ce Inh ibl:trlee a van! utBl sane n .

NOTE - Dans certains cas, 1 1 : est nscessalre d'utflser de l'eau fratcherneru prspanae.exempts de C02 dlssous.

Pour e'tre con sid er ee de bonne qua lits "I'le au di,$tme8 dolt av olr une resistiv~t~e 'au m ains300 o o n Oem.NOTE - L'eau c j ,smineral . (5)Se, par pa.ss8ge : su r r es ins ec liiangeus'6 d'lons, est souvent tresch argee en rnlcrocrqantsmes; aus si e st- il oons,eHie de ne pas u tilis er ce precede sans veriifi, erta . paw r ,e te a t'llm icmorga ril ismes de l'eau, ll c on v i ent de 00nsulter le fa b r U cant pour appll qu e r1 .81ne ille LIre methode oe m in ~mlsanon de la co ntam ination micrabienrn9 .. La. s tE iri l ls atlo n par1!i~~rationiul)9 e~.Ej.u_d~i9nrseee t co ntamln .e e_pa rjjn e g ra nd e q ua ntite d e m ic roo -rg an isme sp e ut en core eonte ni r des substances inh ibitricEls pou r la croissance de certainsm icroorgan ism es,

Deux. ty p es de p reparat ions exi sten t:

- soit a partir de mllieux cornplets deshyc!ratas.les flacons ccntenant les eom posants de base deshydrates ou le s m ilie ux comple te deshydratesdoivent etFe conse rvss a I'at:rri de la ~um~ere dans un end ro it S'9C , a la temper,at1u re indiq uee pa r ~ 'efabricarrt.N e pa s utillse r epres 1 8 d ate ! im lte d e e on se rv an on ind lq uee,t.es cornpcsants et rnIi~'l.IX des~,ydrates eiant nyg roscopleuss, i~8:st indispensable de rST8:nnerr ap id er nent a t s oig n.e usement Is s. fiaconsaprss pre~evemsnt U n m ~~ ieudeshydrate qUI oresentedes s Jg ln s diiag,gh.I'tinaticm ou de prise em masse, lndiqusililt ' tine re:pri j: s9 d' h umidii :E:, ne d olt pas eIreutilise.

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Isa

Las recommendations de ta Norma lmernancnale concernee etlou celles du fabrlcant dolventetresulviss,

7 .2 .2 Mas u rage d upHMesurer le pH au ]JH~metre { 4.4 } a t l'a J Lls te r, .s [ necesssjre, de sorts qu'a pres sterilisaiiionetre fro i d is se rn ent a 25 ~G , Ie m iH eu salt au pH dema nds a 0, 2 Un it e pH , sauf j nd~ca.tionsdifif~renite-s.L 'a ju stemen t e st eftectuEl a ve c un s s olu~ iQ lnd'.hydmxyde de s odium (N a:O H ) . a environ 40 gIl (soilapp roxlm a tivem ent 1 m ol/l) au avec une soiutlon d'actde ch ~ orhyd ri.qu(H C i) a environ 36 , 5 g/~(soli app roxlrna tivsm ent 1 m Q ~I1 ).

,I~:~

Reparl: ir l ie m~~ ieudans des r :e c ip~ent sapp roprie s, s alt manuel lernent, solt s .I'a id e d 'un appa re ilautornatique (4.14).Repartir d an s un reoipient de volum e une, deux a trols, to ls le v olume a reparUr POl.lF eviler que 19m lile u n e d eb ord e d u re cip ie nt a u c ou rs d e l~ alJ to c~ a va g;e.

La ~ ste lilisati 0 n des m in e u x de culture at des reactirs p sut etre rea.lisee pa r dITferS.Fllb::steen n iq ues ,et n otamm snt:

- las te r ill sa ti on per is. ehal sur h umid6~- la sterillisation par filtration,

ce pe nda nt ce rta in s m ~H eux a t re9.c ti vs peuvent etre u tilis es san s s te rmsa tlon particuiiere (s ereporter a ia Norms ln temaiio na h :l s pe clfiq ue eVou aw e ln stru etlo ns d u fabrleant).Apres stsriilsa,ticmj le s m ilie ux , d oi.v en t etre contr-olesj notarnrnsnt le ur pH , le ur couls ur, leurste rl I .i t !e t ~eur e ft! cacite b.acteriologiq ue ,

7.3.1 S te riU sa:tio n p ar Ja ehal e u r hum ideE~~edo lt Mre effectuee da ns un a utocla ve (4 .5 ) a uto n om e a u ta lsa nt pa rtie d'un a ppa re illa ge pourpreps re r a t n9pa l1~ rla s m il i e u x, G eneralement, I;iautocia.vage s ' effe ctu e en1 5 mln a . 1 2 1 '''G(2 46 kP a). P our des voiumess.upeneurs al ~itfe, ls bareme de sterillsation dolt ~ tre a dapt !, D a n staus Ie s ca s, Su iv re !eslndicetions donnees dans la No rm e internationa~espec ii iC !uee t!Q u lesi nd lca ti 0n s d u fa .b ric an LA va nt a .lJ to cia va ge , u n n orn bre representat i f de rec~p le nts, da ns cha que pa rtie de I'sutocl av e, dolte tre m un i dun pepie r r eac tlf (c:UsponIble dans le c ommerc e) ~ nd ]q ua nt q ue 1 &temperature desireea a t e attemte.

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J:SO !SO 721 e:1995(F)~. .. _

7.3.2 St:ermsation par 'fUtiationEHe peu t e tre re aH se e SQUS vide ou sous pression ,Les rnernbraneset cartouch es fU trantes dorvent avolr un dtarnetre de p ore de 0 ,22 um . Ellesdo iv en t a volr e l e sterllisees a l's uto ola ve (4 .5 ) avant u tills atio n, P o ur ! 'L dilis aUon de carte uc he s aude m em branes ach etees ,s.terile:1l,se r~ f re r aux ind ii ca .t ions .dufab r ican t,Les d lf fe ren ts EiIEiments de l'appe rell a flltre r, m ontes ou non, doivent e tre stsrj,jises a l 'autociave(4.5) pe nda nt 15 m in a au m o ,ins 1 21 i:lC . 8 i n e ces saJr,e" LI n m ontage as epti q u e peut eire rea~i esous hone ,; 3 flux lam ln alre a pre s a utocla va qo. C erta ln s a ppa re lls m on te s pa uve nt 'stre achetessterHes.7.4 Conservation

C _ " ': " . ':". Chaque condifionnarnent de flacons, de tubes et de bottes de Petri dolt etr'9 ,etlquefe et doltcompor ts r le s in dic a, tia ns sulv an ta s:

= iden tif cation dum iIle u;- cete de p repa ration et/ou date de pe rempti a n.

7.4.1 Mme ux de oultu reet reactifs prepares'en I Iaberatetre __ ' __ .. _ _ _ _, _:r, _ ~. __ .,"_ _ __ _ __ __ __ _ _ J__. - '" .'Les -rriil1eux:tle culturEfrep'artis ,enf1l5es oldi~conse t le s r e a c t l f s ClILtilie sonCpas IJtilises~:_:-" ..e xtemp ora nema nt d olv en t /d tre c on se rv es a t'a b rl d e la lum lsre at de la des sioca tion (e n utilis an t

par exemp led es cap uch 0 n s en ca outch 0 UC. des c ep su Ie s v i ss ee s) .S aU l spe clf ca tl on in diqu e E l dan s la N orm s in tem a tlonale conce m e s , ils dolvent e tre conserves3 m oisau maxim um au reTIi9 e ra te ur (4 .7 ) j 0 U 1 m ols all maxim u'rn e rn re 1 8; "'C et 23 o ! c dans desc on ditio ns e vi'ta nt tou ts modlftc atto n de le ur c crn po slfio n.Ne ja rna is ~U~s6rdes m llleux qU I 59 sent dessecn,s,s.A va nt le ur utilisation, il sst souhaltabie que la tempe ra tu re des m ilie ux d e culture solt mise enequUibr av ec ce lh ; au laboratoire.

7.4,.2 Milieux de culture et rEiaeti fs prats a I'emplo]II es t necessa ir e de se conformer aux jnelcations eu fah r lcan t; date de peremp tio n , temperature atconditions de conser va tio n, cond itio ns d 'u tllis a tio n (pH, etc.) et controls d'e:fficacite.

c . .21


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erso'7.5 F'usior:l des milieux: de culture ge~osesFairefondre I.E!rndieu de culture en le plac;:al1[ dans un b:ain dieau bouillante au par tout autreprooede don nan! des resu l tats ~d.enlUques (p ar axe m pie en auto clave a vapeu r nuente 'D U i 8 ! .U fa u r a.mlcro-ondes). Eviter de le crn6u:Jf'ter trop ~ongtemps en le retirant au baln d'eau de s qu'il est fondu,La om eu a e cu ~ ture dolt ,sire ' m a lntenu en su nu:s,~oncjlJns un b airn d" eE tu til ermostate it47 cc .2 .c (4.9') jusqu1a.u moment de SQn I!lti~isation. U n miU eu de culture ne dolt jamels E l t r eUWiS8 a u :n s tempe ra tllllr'9 supe r.ie urea 50 ' D C . U est p re fe rable de ne pas m.'3ir: loorl l] rn mm'eu lensu r iu:si0 n p lu s de 8 h. Un m H ie u non utillise n e doit j am al s etJli8 so~ia ifi E i de nouveau po ur un u t J I ls a n o n l! . l1 te r leu re, .Dans Ie ees de milieux de cul.bJre partic:ul.ieremen[ :sel1S! ib l :es~cette diutee de surius :i ;on doit elrereduit:e; ene S8ICa pr~oisele dan s la Norme ln temenonale specifi gue.

EH l1 IecessaIr 'e ., jus te avant !'utiT is at1 on , ch auff r le s mH ie ux d e cultu re d an s.l'e au bQui~ ta rlitee u SOU!)courant de vapeur pendant 15 min, avec bcuehons ie ,gerement dev issss ; apres cnauffage lasb au ehonado ] ,ve nt etrs revi sses et re :tro idis ra pide rn ertta rn atempe ra tu r c J : ' u:tiili,saUon.

7.7 Preparation e i I : ' eonservati on des, bones de PetriOcu.il,srle m li1 l ie 'lJ .e cu ~ tu: regelose en surfuslon dan s las b ones, de f'l'elri d e fa gon a oDtef: li r unespa.issem d'au mains.2 mm(par example pour des boites de 'gO m m de di.ametre, ,au mains t2 rn l_ de gelose sont . 1 1 1 o'rmal'~men t n e ce :5 :s a i~ e ). ila ts se r rerroidir et sol[diI~er te mH ie 'U IgelO'see~ posantles bones de Petri sur une :surface ira lche- ,e tha ri:z ;cmta le.- - - - _ - ., - -~ - - ""- - - ~ - - - - - - - -Ut~iis5r~esbolt:es cle Petri alnsl preparees i'mmediaterneli'l~o:u les COnSElNl5f dians,des cand~tionsev1t8111twutemodification de leur eornpesltlon, , a I\oilscurite ,.au r8m~gera .teu r {4.7} pendanttsernalneau maximum. GetteaJuree de co ns.e rv aV lon p eut e t r , e j dans certains cas, plus I l o n g l l l E ! cupiuS OOU rte; '9 ness ra precisee da ns ~anorm e specifiq ue, Etiq ueter :1as b 0 ites com me dcrite:n r .4.

'En genral, pour l'ensernenoernent en surface du mm'9U gelose, seeher les boltss, de prefe:renceavec 18 eouvercl e 8tl~eve et avec la su rfaes de la geiose tourl"lse vers ~8, bas, dans u ns stuvere glee e ,n tre .2:~ ( Ie at 5,0 15C ~ ju sq u'a , d i:sp aritio n d es g o.utt:e ~ie tte s a la . su na .c d iu m iUeu . N 1 3 , pas lasBecher d av an ta .g :e . L e s eo ha ge des. bones oOlltenant Je mi~reu de culture gelose peut eussi e i r e~ e a . ~se sows hottea flux lamina ke penaant30 min a.vec le eouvercle entrouvert au tmne un e nultavee Ie eouverele en place.Des , o O l , i t e s de P e,tri pretes a!'em.plai sent dispo:n1bies,dal1sie commerce. las. c.oJilSlervl5r ' E l l lesutlliser selon les instructiorts du fabricant.

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ISO,,-,"-.

.B EchanUllons pour laberateire6.1 E.chantillonnageII e st im p orten t que Ie la bo ra tel re re90iv un ech antilio n reell em en! rep res enta tit d u pro du it, n onendQmmage au mo,diiiie iors du transportet de I:"entrepos.age.L'echantmonnage n e fa it pa s p artie ' de s. re g'le s generaies d 'exa rnen m ic robio, log~qUoe .Vo i r la No rmaln te rn atio na ls s pe cifiq ue au p ro du it c cn ce rn e, 8 '[ 1 ny a p as d e Norme ln te rn aton ale spedfiquedisp-onible, II est reccmm ande que les parties concem ees ee mettsnt d'accord ace suiet,

Le tra nsport de s ecnant:illons vern ie laboratolrs do it etr,e r eaJise dans d es co nd itio ns v'ita nt toutsm odifjcation dun ornbre de m l eroo r'ga 1 1 ism es p resen ts .. II e st pre terabl,e , de ch aisir les rnoye ns d~transport assurant lee achem lnem ente les plus rapldes ..U na a tte nnon p.a.Ii~ cuH eredolt etre a pportee a u re spe ct des tem pera ture s de con se rv ationsulvantes, adaptees aux types de produits suivants:

- prod u lts s ta bl e s: tempe ra tu re ambia rrte ;,~produ ltsfrats et nfrig e res: entre 0 "C et -+ 4 , o G ;

.- - ":"_-. ~- - - . . . . : . _ . - . . .:~-. -_ . " .. _ - -_" ..~ prodults past.e'UrisM etslmila:ifes:" e n f r e "(I 'QCef + 4 - o b i - - - - ---~=---- .---.-_ .p rodu lts s tab Ia s a lte re~s : ' en tr e 0 QC a t ... 4 c'.

ATfENTlON- Des produits aUmentaires sens~bles (par e.xempl1e viandes en .retat, produitsdel a peche) do ivent eire eo nserves . a un e tem perature cam prise e ntre (I C et ,. 2 ~C.Les' p rodu its s table s a lte re s doivent Eitre transportee da ns un emba ll.a.ge ferm e pour le s proteg errd 'une pe rt e d'etanc:heite a u d 'u n s cla teme nt e ve ntu el.

8.3, Reee ptio n et stoe.kegeLa personnel du ta bc ra to lre d olt verifier l'e ta t des echantHlol1is de s leu r rscep ti on . S 'i eeu x- cl s on tendommages ou s ills s on t e n q uantite insuff.iElaJl!te~~e Ia borato ir s dolt refuser. duns tacon9Emera le , le s e ch an tillon s. D an s de s circon stan ces pa rtr,cul:iere s, le personn el pe ut ies a na ly serrnais le rapport d'essat dolt a lors corn porte r des re se rv es s ur ia v aildile de s resultats,Le s ec.hanmions a dm ls a u la bo ra to lrs d oiv erit e tre refere nce s de maniers a en assurer ls suiviju s qu 'a la re da cti on d LI rapport d ' assai.

(..'- ..:'23

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1807218: Hn36(F)

Les informatJons suivantes doivent etre notess:- la date de receptlo n;~ les caracterisfiques du preievement (date au pnlelVement, con ditio ns d e p re le ve rn eo t, e tc .) :~.Ies ccordonnees dude man deu r;

Le stookage des echantill!orls enattsnte d'axarnen dolt e IrS rea li se dans des eondltionsevltantto uts mod ific atio n d iu n orn ore d e m ic ro org an lsme s presents.Une attention particullere dolt etre apportes au respect d es tempe ra tu re s de conservaton (voir8 ..2 ) et aux de la Js d'exarn en pour les prcduits suiva nts:

- p rodu lts s table s: l ie plus tat possible e t av ant 1 0'3.a te lim ite d e con se rv atio n;i - prod ults fra ls s t rerrigeres: dans Iss 2 4 h apres la re,ceptlon (s i une plus I ,ongue per~Qdedestockag e ne peut ~ tr,e evitee~ conqeler I 'echanti :l lon cies que poss ,i :b le a temperature inf9r ie lJ re' a- 1 8 ,eGet en fairs eta: dan s Ie rapport d 'essai, car, dan s certains produits, la'congelationmod i fie [a compos iti on de la n o re):

- produits pasteurtses ousimilalres: le plus t6t possible stevant la date limite de conservation;-.

- ~ 'p rodui ts s tab les a fte res : le plus t5,t pos~it~I'e9f:~'i~nf41fh.-=-.-.~ ~--~ " = - - . . = ~ . - : - ~ - : . - . ~ ~ . - -- .._ - --- -- ._ - _ - --.------------.--~--.----------.- - - - ~

Pour e vite r ta contam ina tion de l'e nv lrcn nernen t et de J a prise d'sssa l, il est rsccm rna nde detra vaille r d ans des l oceux pa rt fou ii er s OU sous des hottes de securlte. A defaut, Ie s produitsco nn us pou r ecntenlr peu de m lcrccrqam sm es (par exsmple las prodults pastsurises, ias platscu lsin es) doiv en t to uj,otJ rs sU e exam in es en pre ml e i, pu is ceux eonnus P () ur etre p i us f .a rternentcontammes,La protec tion de ! 'envircmnement centre 18.contamination es t p artic ulle rement lmpo rta nte la rs del'echantlllonnage et de la pesee de I.eprise d'sssal des prodults pulveru~en. ts tor tementcontarnines. Ces ope ra tio ns dolv ent eire effectuees SOLIS hotte de seolJr~te.les ,ecilantlmans dolvent e!re rnanlpules defavon a eviter tout risque de contamination. Pour cela,les precautions sulvantes do,ivent etr'e prises: - . .

~ dans Ie cas ou l'on ne trava iH e pas sous hotte de securlle, p re is ve r la p ris e d'essal a proximited un s fla rnme :- pour un produit p lace dans un em baJlage , nettcysr la partie exterieure qui sera ouverts avecde l iethanol a 70 %;flambersi possible; .- tout in strum en t s erv an t is : ouvn r un emba!la:ge {ouvre-boltes, palre de cisea ux, etc.) doit e iresterile; .

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!SO

- tout instrument servant a prelever I 'echanti l lo:n (spatule, pince, pipette, stc.) dolt etre sterile;= reporter solqneusement la reference de l'echarttlllon de laboratoire sur las, n~ciprentsJ i,essachets en matiere plastlque, etc. (voir 8.3) rsntermant I 'echanri l lon pour essai.

B,.5 Conservation et destruction des echantiUons pour laboratoireSauf ca s pa rtlculie rs, con se rve r la s e cna ntilJ on s pour laboratclre jus qu'a ce que tous le s res ultatsalent ' a t e obte nus a u plus lon gtempe s i ne ce se alre, s ole s eon dltionn an t da ns; des re cipie ntss te rlle s (s ach ets e n rn atle re p la stiqu e p ar s xemple ) st en le s rem etta nt a Ia tem perature des toc ka ce . P o ur le s prc du its tra is re frig ere s, if e st re co rn rn an ds d e lie s co np eis r.Decon ta m :lne r lssech antlll ens p C i ' U r labo rato) re aU ens 0 U C CH ,, ; !sid e r a s co m m e d ange re I l J X ave n tetimlnatlon.EHm in er d lre cts rn en t le se cn ar rttllc ns p ou r taboratolrs non alteres.

9.1 Precauti'ons hygh~niquespendant I'examenDes p re ca ution s d olv sn t e tre p rls es p ou r tra ,v a.ilie r ~ ep lu s p .o ss ib l,e d an s d e's conditionsaseptiquea,pa r exernp ls :

' ~ . S i a s s u - r , e w 'qu e la z on e d e ' t ' r a v a i i ' e s t p r o p r e - e t q l l r : , - c i i - ' y a pas d e c o u r a n t ~ d i a ir - ( p o r te s e i ' f ; n i t i - e ~ 'fei'rmees);- -_ -- _-- -- - - ..- - - '_ .'-_ .._ -- - -- - - - - -- - _"_ --- - - - .- -._ -~ d econtarnlner la surface de trava il avec un deslrlfectant approprie, a va nt e t a pre s lie tra va fl;- s 'a ss urs r, a va nt d e c ommen ce r, qUI8 I'on dispose de tout eelqui est necessalre a la realisationdu t rava il;

'. - da ns ie cas de trav ait 'effe ctu 60US hotts a f lux la r runa ire , uti,User des gants stariles ou sedeccm am lner iss m ains avant de commencer le trava il (par exernple avec un m elange depolya leools) e t evile r Ie erolsernent des avant-bras sf des m ains;~ d an s ~ eca s o u l'on n e tra va iH -e pa s sous h otte a flux la rnina lre , ouvrlr le s tube s a a .s sa is e t Is sfl aeons , 8 . proxlrnlte d'u ne Ila mm e en, J es ten ant J e pius in clin e s poa sl tJ ~e;- sffe ctu e r Ie travel! ,Ie pius rapids m e nt posalble sans fa l re de mouvements i i1Utjl.es:- s i la totaH te dun sachet de plpettes jetabjes, de bottes de Petri, etc., n'est pas utilises auCDLIfS dune operation, s'assursr que lie r ecipie nt e st bien te rm e a pre s avolr pn9~eve le nombrsapproprie d'un ites; .- s teri ll ser Jes anses et les fU s a e ns emen ce r, e tc .. .a va nt a t a pre s u filis afion , a la fla mrn e; pourev ite r les p ro jec ti ons de ma ti- ere e tce m lcroorpa nlsme s, utili:s er de preference un inc ine ra teu r a'fii (4. 13 )~ dans tous Jes c as ou eels, es t poss ib le , utiHser dies anses et des fU s steri ies a usageunique:

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- p la ce r le s p lp ette s, spall.ules.etc., uti~isesdans d e s f', eC ip ie n~ s pe oIiiq u s c on te na nt u odes i nfectant approp ri e (p,a:rexernple sa! utlon d'hjyp'oo1n~orite de sod~um po ur lss pipenes) avantde !e s d econ tami n er (0 .'6 );- p l8i.cer las baU es de P etri. m n , i e ! J x d e cU!lt.lm:~:t 'tOlJiiautre ma'lteulelpow : an t c on la n i f desm i, cr oo rg an le rn e s dan s des mo jrp ~ en ts ,s pe ciHq l!le -s av an t la d ec on tam~na tio n p r :o 8dan t is -~aV'age;~placer le materlel a usage unique dans des recipients appropr~esavant d.econtamlnation OLlincinera.thJJ:1,(ekS);- e nle ve r~ mm edia tem el1 lt tous m ilieux ou produits ee nta mln es qU I aura len t pu se re pa ndr9, aum oy en de tam pons de coton au de toutsautre m atIere a ppropri'Be , ~ m p r e g : r 1 l, e s d'ethanol a70 % (VI\!) 0 L J l de tout a~ tre d eSllniectalili" p uis n etlc iy e r e t de sin fe cte r I:asuriaC o:etra.vai lavantde oon~ lnue r .

La rnanlpuletlon de produits suscsptlales dEl eontenlr des bacb9ries patnogslfl'Els (SafmomMJa,UsteriB monocytog'lSlnes, etc.) ou de produH s toxlques dem ande des :preC8lJt!lons particuiieresd .ecr ite s da .ns les olLlv,rages spec ia lis es. U es tr ecommand ie d'lIIiil~ser par e x : e m p . li e :- une hotte a f ~ u x lami n aJ lre p ou r toutes Ie s man ip u la tio ns nece ss ai re s a I "analyse;.~un appa rei i ,elia.spIration mecan 1q ue 0 e PJP e tl:a ge par a sp i ra tio n a ia. h ouch e e st a prosc rl r e) ,

L es a ero so ls s on i u rne c au se , ~mlP o r1 a nte d e oQ ntam~na ;, tio ilil d e lie nv imnn emen t e t d i~ nf.e ctio n. L e? _a~~~~~,!~-pe~vent~ecr~~~ar-~~mple: _, - ~ -~'~~~,__:-,_-" -__= . . - - . _ . - - _ ~ . ; : . ~ ~ ~_ _ . ~ _ ~ .

~ pen d emit~ Icuve rture des bohes de P',tr'l, tubes t ~ Jaeons;

~ l ar s de rcuve rture c'am pouie s oonte na nt de s cultures lyophiTis,siE:S.Best dOlnc necessa i re d "ev ite r a :u tan t qu e pass,]bl e leurtorrnatien,

9.2 Pre pa ratio n de la Btl spension mere at des d llutionsV oir ISO ssszDans Ie cas de preparation diun suspension rnere, Ie tem ps quls 'e coule entre ~8.fin de sap reparanon at Ie moment (:J illI' in ocuiu m entre en contact avec i'e mi Ileu de cu'lture ne dolt pasde pa sse r 4 5 m ]n ,sa uf ~ndica.tiClil"nsp articu l~ ere :s me ntio nn ee s d an s la Nlmme intemationaiespecl fiquEl . .

l26


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9.:3 Oen omb reme nt par I : . l i i 1 l U i satl en d' u n m ill eu sell de9.3.1 'En se menoemefl1 t dans Is.massePnp ,a re r I, em iUeu (en suril!Jsion dans un bain cijeau .i t 47 f o C I . les Dones de P'str i , Ie d ilu8nt et lasdllutlon s ,9 examiner (conforllTu,ment a 9 . .2 ) e n ql!l8.n'l:ites et nembres eorrespondan t au pland' enserneneement S ' "p l E k m e dans 1 ,9,Norms lm ern atlo na ls c on ce rn E:e.R epart~ r da n is lss b on es de Petr ] (~cIntlfiees) f la s v olu rn es a ete rm in e s d es d ilu tic ns a e xam in e r,Verser dans ch aqu ba Tt :Ie volume d e m ifie 1 J present e n 7 .7 . Mei.anger i,mmediiatemlnt 8ts:o~,gne,usementl ie mi l iie u : mondu et . ~'inocu~um, de i I I a g o 1 n , it o bte nir u ne repa rti~l:onhomage I)!de sm icroorganism es dans la m asse du milieu. Laisser rmrcidir et s a s olid ifie r e n po sa nt ~es boltes dePetris.ur l ane surTa.oe w,raidtltE:at horiZ!onta]e Oe temps desond ii tca ij on de is . gelQ se ne d o n pa sdepasser 1 0 m in ), ."D ans 1e cas 0 L J ia presenee, dan s le pmdu iit a exami n er, de microo rgan ism E:S a . co Ia r 'l iesenva .h is sante s9st s uspectee (pa.r e xemple P roita us spp.), c oule r :s ur le s bo,nes soHdUiees UI"I~dluX I me coueha de gelose non rU.ltr~uve au idenli :l !: lu9 a ce,~ledu mi Us !ude cu ~llL1 reutili SN!dansI 'analys.

Depose r l 'i nocu~ iU lmau centre de la bone de Petriici:emtUfiiee, s ,ur le mme u de c ul,w ,re get~)s:elIP r : p 8 1 r E l selon f . 1 ) 1 . L 'e ta !;e r de fa90rl u flif~ )rm ;e e t Ie p~IUSrapi,demlel:1t_pDssible a 1 .8s;uliace du ---milieu a ~'aid8 !,j 'un etaieufs,ted"le en verre au en.matiere piastiqllle jusqu 'a_ ce qu'il ne r:!~ pius~ le _ _liquide- v is it ile -a1 1a. suf faOe eu mineu.-- -- ---- - -- - -- -- -- -l.'e ta leme nt pe ut e ga leme nt e tre reali:se a ' I 'aiae de bmes de v err e,D ans oertal ns cas (indiques d e 1 m S ~.aN o rmein tema tio na ie c on ce rn e e), I'i 1I10CU ium ~ ell,! e t r e deposesur uns membrane puis et.ale su r ce.tl.:emembrane co rnme Gec;ri.tprEicedernment~1 . : :t3 ~ Icu 'b ,a lionSaul spec liica tion cont ra ire , rstou rner sans tende r ~as bones eng rn en eees e t lies p lacsrrapiclement a l'e tu v ,e regle a ta temperature approprie9. 5 i une deshydra la .tio n excess lvess-prodlui , l (p.ar exemp1,s a 55 "C au dans; Ie c as ~ ,'Il.m eforte ai.rc:uia.~:ol1l djair). enveiopper les i : u : l ' i t e , s ,sans ssrrer, da.ns des sacs en m a . t ie r e , phmtiqu:eavant ] ! i l r i l c u b a t i D : r i I DU ut i !~oortow: s,y~t.emes imHaire d 'e ffic ao Ite e qu lv ,a le nte . P e nd an t la dlilme d'ilflloubalijon speciie,e., de s v : , u i a , t l l o : n : s dete mperatu fa d'~no!Uba.tion psuvent. etl!t to.h9'rees, par sxemple lers d:es operations nabitu el les dec ha rg sme nt e t dech a rg lement de s etuves.

NOTE - H P eute tre lltile dans ce'ria in s cas de p rev lJk des boitss e nsemenoees e In dou'blle,qui se ront conser vess i3 t +2 ac~ pour le s ,oompan!!f , la rs d iu d en cmbreme nt,a .v 9c le s bonesensemencees inou 'b ee s, a fin d ie n ep es c C T 1 I i o : n d r - e des parneule s au produU exa:mine avecdes co lon ies ,

(Ap res mcubanon, ~38 boT tes d o iver rt , s~ p 'ossH:de, eireexaml ness im rnedlatem ent , Si n on, ell e speuvent e tre oonserves8, sauf specification oon tra ire , au maximum 24 n au refrigEira.'l:E'im (4.7).


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ISO 7218: 1996(F) ISO

9.3.4 CQm pta.ge des eoionlesApres, ~aperiocl d'ineubation mentionnee dans la Norme intemanonale spec if ique, p roceoer aucornptape des colontes pour chacue boTte contsnant m ains de 30 0 colonies (ou tout autre nornbreinldique dans la Norme intematio: l1 ,a le specifique).

N OTE - D ans certa ins cas, lea eolorties peuvent eIre difficites a ccm ptsr (par e xe rn ple enpresence de- rn icroorqa nism es e nva hlssa nts), D es cas sont tra lte s dan s le s n orm esspecifiq u e s .9.3.5 EXpression des n~isultats9.3.5.1 Mod e de eatcu I : Cas generalPo u r q L 1 ! U n resu ~tatso~tvalabie r on sstlm e en gene ra l q liil 8 , S t n ecessai f de com ptsr :1es co Ion iassur au moms une bolte c on te nant au m in imum 1 :5 colonies.GaICU~9rIe nombre N de m ic ro org an rsmes p re sents . d an s riechantillo:n pour essai, en tant quemcyenne ponderS6a part ir d ,edeux d ilu tions successlves, a ~Laldede la fo rrn ule ;

ou '-_1""'~~ ';" . . - .. - _ .. - - . _ ... -- - - _ .. _-_._--_._------_. ---,' -----_._. --_ .._-- ...:...--- ----- .-._.----.-:_-.---.__:_-.__::_:~-..:..._:.:.:..:..=. ...::...-----.-

est (a sornm e des colonles eornptaes sur toutes les boltes retenU6S de de ux d H u t i , o n sSUCC8 sslveset d0nt au rnolns un e oomle nt 1 5 colo ni es:v est I,e v olum e de I t i n o c L l I ' u m applique a cheque botte, en miliilitres;e st lie n om bre de s bolte$l 'etenue.s a la p rem ie re d iiuUon ;est le nom bre des bones rstenues a la seconde dilution;

d est Ie taux de dll ution oorrespendanta la p ram i ere dUu tio n re ts n us.Arrol1ld ir h '5sresultats c-;:dc-ulssa deux cn if tr ,es significatrts. Pour cela, si ie dernler ch lffre estinferieur a 5 , le chiffre pre ee da nt n 'e st pa s m odiffe ; sl le demle r ci1 !ffre e st supe rieur au e ga l a 5 , lech iffre p re ce da nt e st a.ugmente d 'u ne unite . Pr,oceder de proche en proche j l l J s q u ' a ee que l'cn alideux ehiffres signiiicatifs. .Retenir cornrne resultat Ie nornbre de mic roorgani.smes pa r miUi1itre (proauits Uquldes) au pargramm.e (autres produits), exprimeper un nornbre cernprls entre 1,0 et 9,9 multipUe par lap u ls s a n c e a p p r o p r ie e de 1 [ ).

\ ' - - -_.

28 , ',


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erso ISO 1 21 8: 1 9~ 96(F}r>.

EXEMPU~:

En arrondissant le resultat te l C lue present ci-dessus, le resultat est 1 9 000 ou 1 ,,9 x 1 04m lcrcorpanernee par gramme de produit,

9.3 ..5.2 Mode de cal eu I : Cas apr,es idenUficatio n

,i~.'.. ~

D an s. 'e ca s Cl'U la ms,thocie utiHsee n lecess ite u ne id en tifica tio n, u n n ombre determine, A~(e ng en era l 5 ) de colon ie s SOl1t replquees sur cnacune des bones, retsnues pour Ie com ptaqe desco I,Qnias. Ap re s id ent it lca tlon , ca lcu 1 , 8 r, p ou r ch acu n 8des boites, len ornb re, a, de m lcro-c rqan ismes Identiiie s , al'aide de I !equat ion S U iv B . l '1 i te , : -.'

a u

best ie nornnre de colonies repon:dant aux c ri ts res c l" ~den ti fi ca tlon ;c le ' -n o m o r e total de colonies dienombrees sur 161bon e.':'

A r ron d ira. un nom bre enner de colonies salon Ies regl a s indiqu ees en 9.3.5 .1 .Cak:u ! s r !e n omb rs N de m ~ cro org a n i smes id en tifie s p re se nts a ans I,iechantiHon p ou r e esa l, em tantque mo,yenne ponderee" a l'a id e de la fo rmu le donnee en 9 .3 .5 ..1 " e n re rn pla cant I.e par L a .EXEMPLE:U n de nom crsm en t dire ct d'un prodult llqulde a .don ne le s re sulta ts sulva rrts:

w a la prem iere dilutionretenu9 (1 0-3): 6 6 et 80 colonies j- a 1 8.d eu xleme d ilu tio n re te nue (10-4): 4 et 7 co lon ies .o nt El l s re p lq u~ees:

- pour 6 6 colonies, 8 colonies dont 6 ont repondu aux c rite res ; d;ou a ::: 5 0;- pow 80 colon ie s, 9 colon ie s de nt '6 , an t r epondu B'UX critsres; d"ou a= : 5 13;- pour 7 colonies, 5 colonies dent 4 ont repondu aux.criteres: o'ou a;:: 6;- pour 4 . colcnies.Ies 4 se sont revehses toutes etre Ie r ntc rompan lsme reche rc he , d'ou a = = 4.

(,L a 50+ 53+ 6+4N- =~--------.-V(nt +Q " ln2 }d 1 (2 + 0 ;1 x 2 ) x 1 0 -3 1 13 ,, ''''' - '1 " '6 4,.; ;0 ,2,2X10-3

-~...

29'


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0 1 7,218:' 99 6(f)


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f, SO 721 ' 8 : 1996 (F) erso

EKEMPlE :P our ~ecas donne en 9.3.2 , ~ enornbre N de rn icrcorpa nlsm es trouvs s e st de 5 ,1 x 1 :0 4pa r rn illllltrepo u r 113 colon ie s reten u as, par su its:

8 ;;:;-I. ~ 3.'+1 '.9 2 1 ,, 9S ., Jfi3 ]' x _, s~2,2 2,,2 - 2,2 I 110-\08;;;;(51,36 +0,87 9,47) x 103

Les llm itss de l'im srvalle de contianes sent done8, = = 4,3 x 104 at ~ ;;;;;,2 x '1 04

Dans oe cas, Iss limi'tes de t'~ntervaHede confiance sent comprises entre ~ 16,7 %et +20,1 ' " ' / o c ; .

{;I .3.6.3 Est; m,ati,on des petits nom bresLes lirn ltas de com lance sontdonnees dans lies tableaux A.1 et A .2 de I'annexa A.

91.4Cenombrement par utilisation d'un milieu Uquide ; Techniq:ue diu nernbrele plus __..- _probab~e(NP~~~ . ~ , , - ~ ~ ~ ~ _ . ' _ ' ~ _ ~ ~ ~ . = - ~ ~ ~ i i ; ~ ." , ~ ~ . ~ ' _ , : , ~ : ~ - : ~ , -~~ . . . . ._ _. _ . ~' - . '. . . - . ~ - ._ _. .: ~ .' . _ - .- _ ~ _ ~ ~ ,_

NOTE - D eux systernes d'ensem enesrnent sent possibles. Les systsm es les plus usites(dits (~symetriques~jJcom prennsnt le rnem e nom brs de tubes pour chaque dilution , lesrapports de. volum e en tre 2; diiutlons etant en general de 1 a 1 0 . C as s ystem es s en t s urtoututilises Iorsqu'il ne s'agit pas umquement de verif ier cu'uns certalne limite n 'e st p asde pa s se e, rn a 1 S 'gal em ant de dete rm l ner h:! nom b re d e rnlcroorqarus m e s p re se nts, H existsaussl des systernes (dits (~cH:ssymetriques) qu i co rnp rsnnent differents n ombre s d e tu be spour diffe r,en te s dilutions . S euls la s s ys temes syrne tn que s a ve c dilutilons d sc lma le s sen tevoq L! ~s dans la presents Norrne in temation ale.

9.4.1 Ensemencement_.. -Salon la precision souhaltee pour I,ss rssultats, e nse rn ence r un nom bre a ppropn e de ficlle s a utubes avec la ITH~me dilution (par exem pts trois, cinq ou dlx flo les au tubes}, En reg ie genE:m~de , Is ste eh niq u as m ises en oeu vre dem andent trois violas 0u tubes par dIIuti on. .

1ntrcduire, a l'a id e d 'une pipette, l'ln oc ulu rn d an s le s flo le s o u tu be s, c orre sp ondants .U tilis er u ne n ou ve lle p ip ette sterile pou r o haqu e d ilu tio n.

9.4,.2 tncubationDisposer les ticles et/ou lss tubes snsemences dans une etuve OU , de preT,erenc9, dans un ba~nd'eau thermostaie (4.9 ) .

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e isepncedentes, (c :'est-a . ..dire c e r n e s dent les ooncenwatia:ns en ec:hantililonsent E i g a l ' 9 s a 10 eta. 100fo ls oell e de ~a pr'em'rere d~iutlolll chols le ; .voir Iesexem p!es 4 et 5 ), sa u r lo rs qu e d es tubes FlH:lSltlisn e sam trouves q u '8, u niive au de ta p rem tete dUutlcn prepares a pa rtl r d e, ~'ech,8.ntilIon, Dans cede mi e r cas, II est necessai re de , re1l:enir ies trQis premle re s dHuHon s pDUIi ~e ealcul du NP p. meme'si eetts serle renierme d eux d~iI!Jtio:ns ns revelsnt aueun tube pooitif.

9.4 . : 3 , . 2 .1 1 V e r l t i er, selen ~e nom ore d i e c h a ; n J i i H o n s exa rn in E lS par lot dans ~e tab! saw B .1 " s i lessequences de nom bre de tubes positlfs, oarrespondarlltaux diiuuhons sel,ectiann,ees seien 9 .4 .3 .1sont aeceptsbles du point de we staimiq us. Cetile acceptabi[ite depend ala m~sdu ncrnbred'e o h8 .n ~mon s exam in es a t d e la de~s~ on d 'aeeep te r OU d e re fu se r 1 '8 s res u . t t & J . ~ sdes Gategori es : 2 et3 (voir tableau B.2),Ai .ns i, par e~x.' 'm]e . iorsqueseu\ement ~es resulmts de 1 2.eactegorie 1 se nt a ee ep te s, la sequ enoe2:21 inS PElLEtetrie re-telll ue qu e s ill( ) 'edhan~mo:ns du lo t cO'nsidere on t ' e ' f s examitnes. IF '8J centre,1 0 rs qu e ~es: results ts moins p robablss ds la categolr~e 2 sent ega~em ent eeceptes, la seq uen ce 221s era :re te nu e aus si dans le ca s at:! s eulem an t deux, tro isou cin q echanUUo ns olilll e r e exam lines. 5 ila sequen 00:221 est ~eresultst 0'un ssai uniqu 9, elle ne sera acceptable en aucune man ]S're.

9.4.3.2.2 Pour chaqu s eque nce J u,g ee accE:pt8b~seion 9.4.3.2 a.1, le coeff~ciant.NPP es t obtenuau mo,yen du tableau 6.1 , . .:..:....:..:...;.,.---..:.-~.,..........-:; -=-~- --=~----::'~.-'l"'"i -- _ - I. ~. -....... _----- . . . . . . . ,-___:_ .:. . : . . - .. ._,. -. __ .- ._ .. ._ - -

9.4,.4 Exp resston des. resl:.llrtats;

A . Ipartir du co effic i'snt N IP !P (o oi'r 9 .4 .3 .2 ) lu dans ie tab leau B.', d'ete rm~ner le nombre de:m icroor ganl sm sa Ie pi us p robabls dans u til volume de refElfenCe dan rH~(:Ie l"echantHion a I ! a . i o e de'I ' equ at~on sUiva.nte:

a u

F es t ~ '~nver$edu t8l.JXde dl.~ut~onorrespondant a . la cHiutiolr1.eVfltue~~ede ~'echant:iHolilc~n:siderseooimme d il'r .mon de, base umlisee dans !~etableau B.1 {generm.ement r;;; , (I,100, ete.);

v~ est le vo lu m e de r e f e r e n c e ebo !s i p o W 1 re:xpr~me r ~ a c once ntr.a:ticm en m ic roor g an ls rnes :Vo es t la iC li~ut iC! tne base.

\._-


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lS0 tS0721 8;1 '996(F)

Dans le cas au la dHutlon retenue Ie moins eisvelE! correspond aux tubes prepares. a partir d'unmilieu double concentration (ensemencernent de '10 mi), dlviser prealablement te ,coefficient NPPpar 10."S[ le NPP est tnf,sri'em a 0,3 mlcroorpanlsrne par mmHitre (prodl..lits llquldes) au par gramme (autresproduits) at si le mode operatoirs epproprie pour LIn faible nombre de miereorpantsmes a e t eutilis,e J Ie r es ulta t o ott e tr s exprlrne de la ia 90 n s ulv an te : mains de 1 rnlcrocrpanlsme dans 1 iml(produlta H quide s) a u da ns 1 9 de produit (a utre s produits ),EXEMPlEDans le cas d'un produit sollde, Ie coefflclent NPP est 24; le premier tube retenu correspond al'e ns ern en ce rn en t de 1 m l. de la s us pe ns ion mere (F = = 1 0 }, G s est, par gramme

"

.

9.4.5 Ummtes de ccnflanceL es llrn tte s d e c cn fla nc e SOl1t donnees dans lia ta .ble N PP {ta b~ ea u 1 3.1 ).II est bien cormu que des variations lmportantes dans les resu~ta.t8psuvent Mrs- observses avec tate ch n iq IIe du N PP .. De ce i . a . r t , lss res uIta ts obtanu s sel on la p n9s8nte m etnode do [vent etre u:tH ises, avee pru d ence.

9.5 .:-Methode de recherche _-_._:_..,--=- -----_.----=---~ ..---Un e method e de reohe rene est u ne methode q u r vise a d etermner la p rasence au rabsen ce demicroc rgan ism e s deiinis dans IIne quantite donn e e de prod uit,9.5.1 PrjncipeSaui indicatloncontralte dans la Norrne Intmattanale concernee, une quantlte p de prcdult aanalyser est melanges (produits Hqutdes) au homogen,eis,e9 (autres prodults) avec (9 x p) ml au gd 'un bou iUon elecbii 01.1 selecti t, Apres tncubation , de pre ferem ce eans un bain thermostate (4.9)]un e an 58 de la cultu re obten us est etelee S J r la surface d 'un rnl l ieu g e l os e sa l ectlf de lagon aobtenlr des colonies isa~ees. Une partie des. colonies (en 'g eneral c ir tq ) obtenues apres incubationest ensulte i.dentif'ie'ei. - _.. ..- . -Dans certains cas, ll est souhaltable de fake preesder l'ennchlssement dans Ie boullton e~8ctifousEile ctif p ar u n p re em ic his semen t d an s u n b ou ill'o n nutritlf de r na oie re a r,evlvlfier ; 1 9 8 micro-orga~n ismes stresses. De meme, Happaralt parlols utile d'utlliser en parallsle deux au plusleursbe u iHons 61ec tlfs ou se le c tir s ai.n s~que deux au plusleurs m meux geioses sede ctifs.9.5.2 Inte~pt'et:atio n du resu'ltatS i Ie m lc roo rgan lsme recherche a. e t a rn is e n evidence, le ra su ita t e st donne s cu s ir afo rme :

' (present dans le s p ml (proeuits H qu ide s) o u le s p g (aunes produltsjanatyses.. . . . .. , .-

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IS O 7.2 1,9: 1 996 ( F} ISQ

Si le m lcroorganlsm e rschercbe n'a pas e t e m is e n e vid en ce , Ie resultat es t donne sous la form e:absent dans Iss p ml (prcduits ~iqllides)ou I;esp g (autres prccuits) analyses,

On ne peut en aucun cas gieneraliser a d'autres cuamltes pius impartantes de prodult.9..6 T9 ch niques de base i f ! , identifi cation9 .6 .1 P re pa r.a U on d 'u ne culture pure9.6.1.1 G e n e r .a m e sLa preparation d'une culture pure commence par la selection c'une cclonle sur". OU da ns, un m ilieuge i.ose ensemenc a pa rtir dune dilution de j'ech an tillon pour a ssa i ous pa rtir d'un e culture .La. c olonie choisl e est ensuite enserne n cee sur un m [ I i eu de cu itu re g e l , Q s non seleciif. Ap re sin cu ba tio n, ch ols lr u na oo lo rue b ie n i:s oh e .R ep ete r t'o pe ra tio n s i b es oln est,U tilise r les te ch niques d'isoleme nt oe crites en 9 ..6.1.2. Des me th ode.s d iffe re nte s peu vent s 'a vs re rne csa sa lre s da ns des ca s pa rticulle rs, P our 1E:8 mlcro erg an ls rn es anae robie a, Ie mode ope ra to lrdecrit en 9.6..1.2 pe ut so uvent i tre s U l V I , en v ,emant a lalsser ies culturesen presence d'airpendantu ne d u l r e e a ussl brev e q u possible .

.. .~ _ . -...~ - - - - P - r ~ i e v e rn e p~tTteq u~antlfi ra 1 a - s - u r t a c s (j'u n a c o l o ~ n i e -b i e n - t o o l ~ ;a I~~icj ,~d ai, ex1;~ tte -d '~ ~ ~ ~ ;~~ _ - - -_ ::- - ._ -s te rtle . P r oc eder ens uite a l'is ole rn en t, s olt d ire ete rn en t a ve c le s oellu l.9Spre sente s s ur ta ns e(9.6.1.2.1) , solt ap res a volr pre pa re un e s us pe ns ion de ce escsllules (9.6.1.2.2) .9.6.1.2.1 Method,e directe.: ExempteAvec ILextremite de l'anse, ensem sncer par sm es serreas une portion d'env iron Uri tiers de las urfa ce d u m ilie u g~ !o se. S te rH i se r e t r ~fr old ir r rans . Pu is , a p artir d e is : de rn le re e xtremtte d e Iazone ensernencee, ,effectuer des stries, m ains serrees que dans Ie prem ier cas, sur la rnoltie de Issu rfa ce n on e nco re e ns emsn ce e. Repeier I'ope ration sur Ie de rnie r tie rs de la surfa ce e n re,alisa.lntd a s str.i es p Ius e c a r l t e e . s (vol r fig u re 1 ).

I ,. .. :. .. . _ "

Ftgure 1 - Exem pte d"iso lem ent: M 6 th ode direete3 6


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I,SO

9.6.1.2.2 Mlithede dudl IuantMettre las cellules en suspension dans iml a 2 ml du diluant cholai, en frottant l'ansee ns emen ce ,e c on tre 1a p aro l d u tub a a la su rf ace a u liqulde, puis le mel,anger soigneusement.S te rH ise r e t refroldirl'anse. Reprendre avec l'anse un peu de la suspension m icrob,enne atproceder comrne en 9.6.1.2.1.'9.6..1.3 IncubationSauf lndlcatlon contrelre, retourner Ies bcites de Petri alnel ensemencees et tes placer a l'eiuvependant ~admes et a la temperature prevues,9.6.1,.4 Selection ,!Apres incubation, cholslr one colonie bien Jsolee sur ~abolts, solt pour un lsolement u'lterleur, solts n vue des essel is a r e . a : H s e r .~Iconvient, sl possible, d'effectusr les essals finals a partir des cellules d'uneseuiecclonle. Si unecolon ie ne com ports pa s s uffi,s amme nt de ce llu ie s, il con vie nt, to ut d'abord, d e p ro ee ds r a unec u ltu re s co nd-aire dans un rn iH eu Uquide au su r la p e nte d'un m U ieu g elo se ~ap re s qual, la cu Ituras econda ire p eu t e tre u :tH is ee p ou r !~Sessals a reallser,

-----'-_;__--=----"-'-.:....-...~ .... ~.::_:-_._-.-- _ =Oe tte c olo ra tio n d es cellu le s bacterlennes permet a la To15de connaltre la rn orph olopie de sb ac te rls s e t le ur c la ss lfic ation e n d eu x groupes en fcncticn de leur capaelte ou nan a rste nlr lacolora tion viole tte du cristal v io le t dan s le s con dition s ope ra tcire s. G etta div ision decoulep rln cip alems nt d e d iffe re nce s d an s Is s tru ctu re des oarols oslluiaires des deux groupes et elle setrouve correlee avec d'autres differences irnpcrtantesentre les deux gmupes. II y a plusieursieons de r e al ise r un e colora tion de G ram . rn a . t S toutes suivent Ies seq uences dorm ees cl-ap r e s .9.6.2.1 S'olutionsDes solutions du commerce peuvsnt e tre utillseee. D ans C~ cas, sulvre les recommendations outabricant, ._ . __ _ ._ ._

9.6.2.1.1 SoIutlon de cris1a~vi oiet9.6.2.1 .1.1 Compositi 0nCrista! violet.Ethanol (a 95 %)Oxa la te d'amrn on lurn (C2H aN204)Eau dist il iee

2,Og20ml0,8 9SOmi

c -37


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iso 7218; 1996( F) lSO9,6.2.1.1.2 PreparatkmD iss ou dre le cris ta l v io le t d an s ~'ethano~,e t l'o xa ta te d 'ammon ium dans ~ '8,aud ls tlllee , Me langer l asde ux solutIon s a t la lsse r re pose r le m ela ng e 2 4 h a va nt utilisa tion .

9.6,,2.1.2 Solution d'iode9 .6 .2 .1 .2 .1 C ,om pe s itionlode.Icdure de potassium (K I)Eau drs tiHee

1,0 '92 ,0 9100ml

9.'6.2;1.2.2 Pr,eparationD lssouoreltodure de potassium dans" 0 m l d'ea u distiH l; alouter " ,iode pa r fr ac tions. Ap readi sso lu tio n compl ete r a 1 00 m l dans U I: lenola j augee.

I,-.

9.6.2.1.3 Solu!ion de safranine9.6.2.1.3.' Composition -

, - , r O,2S 9I _ _= . : . ._ = - _ _ . _ . . . . : _ _ . . -10 ml

100 ml

-:- :-:-.. _ .- -~: -::" ----,,_ ' _ -"" - ,, _ --- Safranine 0. E than- d'l '{a' 95% r ~ " - - - ,_ ' - - - , " " " , _

,Eau c i i s . ti H e e_ .. ' - _ - _ ._ . --_ ..._.::_-----_._-- ..

9 .6. 2 ,. 1 .3 ,. 2 Prepara ti onD lssoudre la sa fra nln e da ns I'ethanol: puis rn ela ngera ve c l's au d~s tille e" ,

"_

9.6.:2.:2 Techni.que de col,orationA pre s a voir f~ xe la film baete rlen , p rovsnant d une cultu re de 1 8 h a 241:1 ,s ur lin e lame dem lcrcscope , a u' lorsqoe Ie bculh or: e st trouble , re ccuv rlr !s fU m a ve c la solution de e rtsta l v iole t( 9.6 . 2 .1 . 1 ). Le ls aer aglr 1 m in" 'R 'i ncer doucemsnt la la rn e in ciln ee a ve c de I'e au p en da nt q ue lq ue s se ccn de s.R ecouv rir la lame avec Ie s olu tio n d 'jo de (9 .'6 .2 .1 .2 ).. L ale se raotr 1 min,Rineer oouee rnent la la me ln clin ae a ve c de l'e au psn da rrt que lque s se con de s,Falr~ couler dcucem snt stan contlnu un film d'ethano~ (a 9'5 %) sur la lam e incline-a pendant 30 sau plus jusqu'a ce ssation de [ 'emission de c ou ls ur v io le tts .Rinc '9r doucament la lame in clin e s a ve c de l'e a u pou r e lim in e r ~ '8 .lo ooL { ,\._-

3S


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ISO tSO 7218 ~199S{F}

Recouvrir ia lame avec la solunon de safranine (9.6.2.1".3) pendant' 0 s.Rinc~r doucernent la lame mcllnee avec de l'eau ..secher la lam e ..

9.6..2.3 IntfrpretarlionExaminer la lame au microscope a l 'immersion (4.t2). Lss cellules bacterlennee qui apparaisserttde ceuleur bleu au vlolet sont dtes e Gram posltlf (Gram +); celles qui sont ds ceulsur rose fanosa rouqssont dltes a Gram ne'gatif (Gram -).O n pe ut oote nlr, pour une culture p ure d e c erta in s g,enres bacteriens, a la fo ls des csllules Gram +et G rarn - dans un rnerne cham p de m icroscope.

.:1

NOTE - Des ce~~ulestorternent gr'Dupees, peuvent donner une reponse non ca.ra.cteristique.

9,.6 .3 Rech ereh e de :1a cats IE l s eLa m ise en 'ev idence de cette enzym e, qui decom pose Ie peroxyde d'hydrogene (H ~P 2 ) en eau atoxygene j peut sU e realislee a partir de cLl~ttJreen bcuulon, de culture sur rntllsu 9'61088 au a partird'un e seu Ie co Ion ie su r m llieu 9 8 1 0 1 8 , 8 .-.D an s tou s Ies ca s.s auf indicati,on con trah e dans ~ ~ _ . N S 2 _ [ r T le J n te rn a tio na l, co r : J c e r . t : l e e , . Ie rnl ll e ll de_ _ . __uitu r_9" -r Je ::dp it.Ras ren f'e rmen:ie sa'ng', os-au fsi ce, iu i~ cr~ a te chauff~ (mmeu a u s a n l g - cult). -~ -.:...._- -.------ _---_o, ....._-_--=-.. __....:..... . .. .. _ ~. ..-. ..,

NOTES1 cena inss haeM rles lactlques pcssed e n t u n is pse udc-catalaee n o ne renfe urna .n t pa s degroupement hemelorsqu'elles sent cultiv9'es, en absence de glucose au en presence d'unsfa ib l con ce ntra tio n e n g lucos e (0 ,1 %).2 Dans Ie cas de bactsries anaeronles, attendre30 s a l 'air avant d'ajoutar ~peroxydad'hydro g e I d e.

9.6.3.1 ipartlr d'une culture 'en bouillonAjouter a 1 mt de Is.culture 0,5 ml dune solution de peroxyde d!hydro-gene a 10 volumes[3 % . (m lm) l. Observer I 'appari ti o. [l (catalase posnive ) au l 'absence (catalase negative) d ie buttesd 'o xy ge ne ..

Reco'UVrt f Ie culture avec 1 ml a 2 ml d 'une so lu ti on de pe roxyde d 'h y clm [ ;H !ne a 10 vo lumes.Observer immedi ,atem.ent, puis apres 5 min, s'il y a au non formation de bu~!es d'axygene,


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I~SO

P lace r sepanam ent deux: gouttes d'u ne so~utlOlilr de pe ro xy cJ ,e d",nrydrogene a 10 vol ume s su r Urnslame d e m icro sco pe .P re ~e ve r u ns e olcrtie av ec u ne b ag ue tl:& l U i vane O'U en pla.st~que sterHe {a I 'exdusion de illm ~ta~ :1 qus) at la m e iange r doucemen t dans un e des , d eux gou tte s. Obse rver immed i'atern ent, puispe nda nt que lque s m inute s (1 m in au m in im um ), slil y B. au non mrmatioll de buH~s ($taX:YQene. 8'[1y a dOl!lte, re co uv rlr c ha cu lrI d es g outte s a ve c tme 1 , 8 m el Ie Ge m~ol liOSioopeet oomparer 'I'apparitrondes bun es scus les de ux ~am e n es,la s observat ions pe uv~ nt se ta l re macrf"OsoopiquementoItJ ii~'a]d6

doc technique

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