DNA fetale nel sangue materno.

Sandro Gabrielli

Clinica Ostetrica e Medicina Prenatale

Policlinico S.Orsola-Malpighi, Bologna

sandro.gabrielli@aosp.bo.it

DNA fetale nel sangue materno. Applicazioni e Prospettive

PATOLOGIA Natera Verinata Sequenom Harmony BGI Lifecodexx

Down syndrome (T21) >99% 99.9% 99.1% >99% 99.9% 97.6%

Edwards syndrome (T18) >99% 97.4% >99% 98% 99.9% 100%

Patau syndrome (T13) >99% 87.5% 91.7% 80% 99.9% 100%

Turner syndrome (mX) 91.7% 95% 94.7% 96.7% No No

Triploidy detection Yes No No No No No

Male >99.9% 99.1% 99.4% 99% No No

Female >99.9% 97.6% 97.9% 99% No No

Sex Chromosome - extra copy

Yes Yes Yes Yes No No

22q 11.2 deletion syndrome / DiGeorge Syndrome

95.7% No 60-86% No No No

1p36 deletion syndrome / Angelman syndrome / Cri-du-chat syndrome / Prader-Willi syndrome

93.8->99% No 60-90% No No No

How early can the test be used?

9 weeks >10 weeks >10 weeks >10 weeks >10 weeks 9+ weeks

SE IL TEST DEL DNA FETALE È POSITIVO…. Praticamente tutti i feti Down sono diagnosticati dal test

ma c’è un 0.1% di falsi positivi

Popolazione

generale

Donna di 38

Anni a 10 settimane

o NT aumentataDonna di 35

Anni a 10 settimane

Donne positive al

Test combinato

Donna di 25 anni

A 10 settimane100

Incidenza di sindrome di Down nella popolazione che ha beneficiato del test

33

40

50

62

71

83

91

VP

P (

%)

1:7001:100 1:2401:20 1:1000

100

Risultato chiaro che non

Lascia dubbi.

Il test è o negativo o positivo

Se è nella «fascia grigia»

è comunque positivo

V va meglio per V va meglio per

le Ovodonazioni

DNA fetale Eseguito a 13 sett

46,XY (Maschio normale)

Eco a 16 settimane: sospetto femmina

La paziente era una ovodonazione che partiva come gemellare.. Molto probabilmente è stato amplificatoIl segnale Y del sacco del feto riassorbito

Eco a 20 settimane : feto femmina

DNA fetale e Demised twin

• In caso di discordanza di sesso e/o di cariotipo, l’errore può

riguardare sia un FP che un FN . Dubbi con Verinata (NCV) ma

miglior risultato con Natera (SNPs) .

• Più probabile che il demised twin sia aneuploide

• Non ci sono studi che indicano per quanto tempo il sacco • Non ci sono studi che indicano per quanto tempo il sacco

riassorbito immetta DNA in circolo ma NON meno di 6-7

settimane .

37 anni, NT=3 mm, Test Combinato 1:300

Trisomia 18Trisomia X

Amnio negativa 46,XX

Test Combinato positivo per T18

NIPT positivo per T21 negativo per T18 (ff=11.5%)NIPT positivo per T21 negativo per T18 (ff=11.5%)

Funicolocentesi : T18 (QF-PCR)

T18 allelic ratio= 1:2 ; T21 allelic ratio=1:1

QF-PCR su placenta:

T18 allelic ratio=1.3:1

T21 allelic ratio= 1.5:1

Biopsia placentare multipla mosaico T21 > T18

?

DNA fetale e mosaicismo

• FALSO POSITIVO – Mosaicismo confinato alla placenta (1-2% dei CVS ma probabilmente

molto di più)

– Mosaicismo materno (raro)

• VERO POSITIVO– Quanto ? Non correlazione fra positività al DNA fetale e clinica – Quanto ? Non correlazione fra positività al DNA fetale e clinica

• FALSO NEGATIVO

– Errore dovuto al fatto che è necessaria una maggior frazione fetale del

4% minimo per poter rilevare al test (meno cellule contribuiscono).

• DISCORDANZA DNA VILLOCENTESI

– CVS eseguito su una zona di placenta non a mosaico

– Mosaico del mesenchima (Tipo II) ??

42 years old, gravida 4 parity 1 abortion 2.

Combined test 1:5

CVS :46 XX

NIPT : positive for T21

Amniocentesis 46 XX with UPD 21 (aborto volontario)

NIPT NON HA AIUTATO

DNA fetale nelle pazienti trapiantate

Patient Information

� 26 y.o. G1P0, 12w5d

Indications for Counseling

� Personal history of congenital renal abnormalities (Unilateral absent kidney with renal reflux in contralateral kidney) and two prior kidney transplants

� Family history of Down syndrome in sibling� Family history of Down syndrome in sibling

� NIPT result: “No Aneuploidy Detected” with presence of two sex chromosomes (XY)

� 20 week ultrasound showed normal anatomy and…It’s a girl!

� the most recent kidney donor was a male

Quando fare il test ?

• La tendenza è quella di fare prima possibile per offrire un CVS entro 90

giorni

– Accettabile nel caso di diagnosi di T21

• Ci sono almeno tre motivi per farlo ragionevolmente più tardi possibile• Ci sono almeno tre motivi per farlo ragionevolmente più tardi possibile

– Vanishing Twin

– FIVET : embrione anche se non impiantato può contribuire ??

- Competizione cellulare

COMPETIZIONE CELLULARE

• All’interno di un tessuto in crescita due popolazioni cellulari con differenti proprietà

metaboliche SI CONFRONTANO con crescita della popolazione più forte a scapito di

quella più debole

• INFLUISCE SUL CONTRIBUTO DELLE DUE LINEE CELLULARI ALLA COMPOSIZIONE DEL

TESSUTO

• Il potenziale proliferativo di una cellula con anomalia cromosomica, la sua • Il potenziale proliferativo di una cellula con anomalia cromosomica, la sua

sopravvivenza, il suo destino, il suo contributo allo sviluppo finale di quel tessuto

dipendono dalle INTERAZIONE CON LE CELLULE VICINE

• MEDIATI DALLA p53

1. APOPTOSI

2. INIBIZIONE CICLO DI DIVISIONE CELLULARE (G0)

Johnston (2009) Science 324:1679-1682Bondar e Medzhitov (2010) Cell Stem Cell 2;6(4):309- 322 Thomson e Compton (2010) J Cell Biol 188,3: 369-381 Baker (2011) Curr Biol 11;21(1):R11-5

COMPETIZIONE CELLULARECOMPETIZIONE CELLULARE

APOPTOSIAPOPTOSICOMPETIZIONE CELLULARECOMPETIZIONE CELLULARE

APOPTOSIAPOPTOSI

NORMALENORMALE

PATOLOGICAPATOLOGICA

Thompson e Compton (2010) J Cell Biol 188,3:369-381Mantel e coll. (2011) Blood 109,10:4518-4527Thompson e Compton (2010) J Cell Biol 188,3:369-381Mantel e coll. (2011) Blood 109,10:4518-4527

COMPETIZIONE CELLULARECOMPETIZIONE CELLULARE

INIBIZIONE CICLO CELLULAREINIBIZIONE CICLO CELLULARECOMPETIZIONE CELLULARECOMPETIZIONE CELLULARE

INIBIZIONE CICLO CELLULAREINIBIZIONE CICLO CELLULARE

NORMALENORMALE

PATOLOGICAPATOLOGICA

Thompson e Compton (2010) J Cell Biol 188,3:369-381Mantel e coll. (2011) Blood 109,10:4518-4527Thompson e Compton (2010) J Cell Biol 188,3:369-381Mantel e coll. (2011) Blood 109,10:4518-4527

E’ possibile una terapia prenatale della Sindrome di Down ???

• Studi preliminari su modelli animali

– Pentilenetetrazolo (PTZ),

– Memantina - Demenza

– Fluoxetina (PROZAC) – Antidepressivo

• Ci sono circa 250 geni sul Chr 21 ma solo alcuni sono responsabili della S. di Down. Studi di

inattivazione del cromosoma 21 in eccesso. inattivazione del cromosoma 21 in eccesso.

• utilizzando lo specifico gene a RNA denominato XIST (da X-inactivation gene), espresso

nell'embrione solo dal cromosoma X destinato a essere silenziato. Tale gene induce

modificazione del cromosoma a mutarsi nel corpo di Barr, evitando che vi sia un'espressione

duplicata di geni situati sui due cromosomi X.

• Tramite un enzima, XIST è stato introdotto in una coltura di staminali pluripotenti derivate da

pazienti Down e si è ottenuto il silenziamento dei geni contenuti nella copia

soprannumeraria del cromosoma 21; si è riscontrato un effetto notevole sulla funzionalità

delle cellule

Brevetto B13788R

Brevetto B13788R

Conclusioni

• Numero inaspettato di falsi positivi da mosaicismo

• Il segnale del feto riassorbito può costituire un problema

prima ignorato

• Spostare il test in avanti ??

• Conferma che il test va eseguito solo in popolazioni a rischio• Conferma che il test va eseguito solo in popolazioni a rischio

• Conferma della validità del test combinato

• Nuovo campo : CHD mediante dosaggio di mRNA e miRNA

Grazie per l’attenzione

Dati su piccole popolazioni incoraggiano l’uso del MPS per la diagnosi di:

a.Microdelezioni;

b.Duplicazioni;

c.Traslocazioni (non solo T21);

d.Mosaicismo T21;

con risultati uguali ai microarray e al cariotipo (CVS)

Am J Hum Genet. 2013 Feb 7;92(2):167-76

Results – Concordant with Karyotype

Duplications and Deletions Detected by Deep MPS

Sample Affected Chromosome

Gain/Loss Size (Mb) Chromosome Region

1 6 Gain 38 6q12-6q16.3

7 Gain 0.3 7q22.1

2 7 Loss 0.3 7q36.1

3 8 Loss 6 8p23.2-8p23.2

4 15 Loss 17 15q11.2-15q14

5 17 Gain 19 17q23.3-17q25.3

10 Loss 2 10q26.3

6 3 Gain 40 3q25.32-3q29

X Loss 9 Xp22.3-Xp22.31

Deep MPS can provide greater resolution and can detect fetal subchromosomal

abnormalities at a resolution of 100kb across the genome