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Diagnostic prénatal non invasif : Du Génotypage Rhésus Fœtal au Diagnostic de la Trisomie 21
Dr. A. Levy-MozziconacciUnite Fonctionnelle de Biologie Materno-Fœtale et Centre de Médecine Fœtale, APHM, AMU, [email protected]
Diagnostic Prénatal Invasif : Ex : Amniocentèse, Placentocentèse , sang de cordon
Diagnostic prénatal non invasif
Isolement de l’ADN fœtal dans le sang maternel
LE DIAGNOSTIC PRENATAL
Depuis 1975Risque de perte fœtale : > 1% des grossesses
Depuis 2000Risque de perte fœtale : 0
13
L’enjeu est majeur !!!
GRAAL pour certain…
COUPE DU MONDE… pour d’autres
L’enjeu est majeur !!!
Mais la difficulté d’y arriver… aussi
Quelles doivent être les caractéristiques de ce diagnostic ?
• FIABILITE : 100%• FIABILITE : 100%
• APPLICABLE A TOUTES LES FEMMES
• UTILISABLE EN ROUTINE
• COUT RAISONNABLE
Quels sont les sources non
invasives de matériel fœtal ?
LES CELLULES FŒTALES ?
Prélèvement ENDOCERVICAL
SANG MATERNEL
Paterlini-Brechot et al., Lancet 2003
Sifakis et al., Early Human Development, 2010
ETUDE NIFTY (2002)Taux d’echec : 17%Taux de détection : 74,4%
Quels sont les sources non invasives
de matériel fœtal ?
ADN/ARN FŒTAL EXTRACELLULAIRE DANS LE SANG MATERNEL
Isolement de l’ADN fœtal dans le sang maternel
Centrifugation
Cellules Foetales ADN Fœtal « libre »
Plasma ou SérumCulot cellulaire
Lo et al., 1998
Acides nucléiques libres circulants
• 1948 : présence d’ADN et D’ARN libre plasmatique (Mandel et al.,)
• 1970-80 : augmentation ADN sérique chez des patients
• 1970-80 : augmentation ADN sérique chez des patients porteurs de tumeur solide
• 1994 : découverte de mutation oncogène à partir de l’ADN sérique
• 1998: Mise en évidence de l’ADN Fœtal circulant dans le sang maternel (Lo et al., 1998)
FoetusFoetusFoetusFoetus
Analyse quantitative de l’ADN Fœtal dans le Sang Maternel
TermeADN Fœtal/Plasma maternel
ADN Fœtal/Culot cellulaire
11-28 SA
37-43 SA
3,4 %
6,2 %
0,001%
0,01 %
X 3400
X 620
Lo et al., 1998
ANEC :
Origine placentaire
500 nm
Microparticules
Hahn S et al. Placenta. 2005 Aug. Review.
500 nm
100 nm
Exosomes
Bonello N.et al 2010
Isolement de l’ADN fœtal dans le sang maternel
Centrifugation
ADN Maternel : 94 à 97%
Cellules Foetales ADN Fœtal « libre »
Plasma ou Sérum
Culot cellulaire
Lo et al., 1998
ADN Maternel : 94 à 97%
ADN Fœtal : 3 à 6 %
Acides nucléiques circulants extracellulaires (ANEC)
PCR quantitative Tps réel ( 2000)
2 Approches
Séquenceur très haut débit (2014)
• Rhésus gènes Rhésus– Alloimmunisation foeto-maternelle
Tps réel ( 2000)
• Sexe gène SRY- Maladie liée à l’X: Hyperplasie des surrénales,
Identification d’un GENE fœtal
non présent chez la mère ♣ Trisomie 21 et autres Aneuploïdies
Quantification de l’ADN fœtal
•
RhD- FREQUENCE EN FRANCE
• Population caucasienne : 15% • Population Afrique subsaharienne : 7%• Population asiatique : 0,3%
• En France : 150 000 RHD- femmes enceintes/an• En France : 150 000 RHD- femmes enceintes/an
• 90 000 femmes RHD- enceintes d’un fetus RHD + :Risque d’immunisation
RhD Pos
RhD Négatif et génotypeRhD Négatif et génotype
Fréquence du Phénotype RhD-Caucasiens : 15% ( délétion RHD >96%)
RHD Neg
Prévention de l’alloPrévention de l’allo--immunisation immunisation RhDRhD foetofoeto--maternellematernelle
�� «« LorsqueLorsque lele génotypagegénotypage fœtalfœtal RhDRhD sursur sangsangmaternelmaternel peutpeut êtreêtre réalisé,réalisé, ilil estest recommandérecommandé dedematernelmaternel peutpeut êtreêtre réalisé,réalisé, ilil estest recommandérecommandé dedel’appliquerl’appliquer afinafin dede limiterlimiter lala prophylaxieprophylaxie RhRh auxauxseulesseules femmesfemmes enceintesenceintes d’enfantd’enfant RhDRhD positifpositif »»(Grade(Grade C)C)
Patiente RhD négatif non immunisée< 12 SA
12-26 SA
Injection d’IgG anti-D cibléeEn casd’évènementscliniquessensibilisants
Injection d’IgG anti-D cibléeEn casd’évènements
GénotypageRhD fœtal
Fœtus RhD négatif
Fœtus RhD positif
ou indéterminé
40%60%
26-28 SA
d’évènementscliniquessensibilisants
Accouchement
Pas deprophylaxie
Ni cibléeNi systématique
Bilan Immuno-Hématologique Mère et Enfant
ou indéterminé
RAI 26-28 SA
Injection systématiqueIgG anti-D : 300 µµµµg IM
Représentation de l’organisation génomique des haplotypes RH D + et RH D -
RHD psy
RhD Pos
Caucasiens : 15% ( délétion RHD >96%)Africains : 3-5% ( 67% sont RHD psy, 18% délétion RHD)
RHD psy
RHD Neg
RhD variant
Quelles doivent être les caractéristiques de ce diagnostic ?
• FIABILITE : 100%• FIABILITE : 100%
• APPLICABLE A TOUTES LES FEMMES
• UTILISABLE EN ROUTINE
• COUT RAISONNABLE
Corrélation génotype/phénotype
Classification Phénotype Protéine Gène
RhD neg Rh D neg Absence Deletion
Anomalie quantitative
Subst. a.aminéTmemb ou Intra Cell
Mutation gène présentRh - ou douteux avec
D faibleTmemb ou Intra Cell
( Anti-D : 0)gène présentRh - ou douteux avec
Du+
D partiel
Anomalie qualitative
Subst. a.aminéSurface GR
( Anti-D possible ) Mutationgène présent
Rh - ou douteux ou Rh D +
avec Du douteux
Recherche D partiel ( EFS)
D ψψψψ Rh D Neg
Absence
(Anti-D +)
Insertion 36pb(intron4-exon5)gène présent *
Risque Risque d’immunisationd’immunisation
HaplotypeHaplotypeDensité en Densité en ag/ celluleag/ cellule
Nucléotide Nucléotide changéchangé
AllèleAllèleTypeType
Pas d’alloPas d’allo--antianti--D D documentédocumenté
CDeCDe533 533 -- 1.1971.197 T GT G en en 809809RHD(V270G)RHD(V270G)11
Peut causer une Peut causer une immunisation immunisation antianti--DD
cDEcDE446 446 -- 950950C G en C G en 5252
G A en G A en 809809RHD (L18V, RHD (L18V, V270G)V270G)
22
Des alloDes allo--anti D anti D peuvent être observépeuvent être observé
cDecDe1.872 1.872 -- 1.9191.919
C G en 602C G en 602
T G en 667T G en 667
G A en 819G A en 819
RHD (T201R, RHD (T201R, F223V)F223V)
44
G A en 819G A en 819
??cDEcDE218 218 -- 386386C A en 446C A en 446RHD (A149D)RHD (A149D)55
AlloAllo--antianti--D à titre D à titre élévé documenté élévé documenté avec l’haplotype avec l’haplotype cDecDe
cDe ou cDe ou CDeCDe
183183G T en 885G T en 885
RHD (M295)RHD (M295)1111
Pas d’alloPas d’allo--antianti--D D documentédocumenté
CDeCDe66 66 C T en 340C T en 340RHD RHD (R114W)(R114W)
1717
Rhesusbase www.uni-ulm.de
sensibilitésensibilité 99,65%99,65%
spécificitéspécificité 96,04%96,04%
VPPVPP 98,42%98,42%
VPVP 19941994
FPFP 3232
VNVN 777777VPNVPN 99,11%99,11%
exactitudeexactitude 98,61%98,61%
VNVN 777777
FNFN 77
2% de cas où le génotypage Rhesus foetal sur sangmaterneln’a pas pu être conclu
(n= 2810)
CREATION D’UNE PLATEFORME PACA DE DPNI
2009-2014 : Diffusion des analyses de DPNI dans toute la région PACA ( financement ARS) :
Création d’un réseau de soin PACA autour d’un seul laboratoire REFERENT (APHM)
20
-750 prescripteurs PACA-Toutes les maternités publiques et privées- Les PMI- 350 Laboratoires privés
Acides nucléiques circulants extracellulaires (ANEC)
PCR quantitative Tps réel ( 2000)
2 approches
Séquenceur très haut débit (2014)
• Rhésus gènes Rhésus– Alloimmunisation foeto-maternelle
Tps réel ( 2000)
• Sexe gène SRY- Maladie liée à l’X: Hyperplasie des surrénales,
Identification d’un GENE fœtal
non présent chez la mère ♣ Trisomie 21 et autres Aneuploïdies
Quantification de l’ADN fœtal
•
Publications 2012Populations à haut risque
Etude N N aneuploidies
Sens. Spéc.
Sparks 167 T21 : 36T18 : 8
T21 : 100%T18 : 100%
T21 : 100%T18 : 100%
Aschoor 397 T21: 50T18 : 50
T21 : 100%T18 : 98%
T21 : 100%T18 : 100%
Bianchi 532 T21 : 89T18 : 36T13 : 14XO : 16
T21 : 100 %T18 : 97,2 %T13 : 78,6%XO : 93,8%
T21 : 100%T18 : 100%T13 :100 %XO :99,8 %
Norton 3228 T21 : 81T18 : 38
T21 : 100%T18 : 97,4%
T21 : 99,97%T18 : 99,93%
Conclusions sur l’évolution du dépistage de la trisomie 21
Période Type de dépistage Sensibilité Faux +
Années 70 Age maternel 30% 5%Années 70 Age maternel 30% 5%
Années 80 Age + MS 2è T 70% 5%
Années 90 Age + CN 80% 5%
Années 2000 Age + CN + MS 1er T 85-90% 3-5%
Années 2010 DPNI > 99% <1%
Trisomie 21: avis favorable du comitéd'éthique sur le nouveau test de diagnosticLEXPRESS.fr, publié le 25/04/2013
Le Comité d'éthique a indiqué que le nouveau test dedépistage de la trisomie 21 "correspond à unedépistage de la trisomie 21 "correspond à uneamélioration technique du dépistage" actuel, par sa"plus grande facilité" et avec "moins d'effet
secondaires".
MST1
ACTUEL AVENIR
MST1
>1/250>1/250
Prélèvement invasifFISH, Caryotype foetal
5% des grossesses
>1/250
Recherche T21 sur ADN fœtal/ Sg maternel
Si positif
1% des grossesses
Insertion dans le dépistage actuel ?
Test combiné
Option 1 Option 2
DPNI
Option 3
DPNI à 10 SA
DPNI
Confirmation par Test invasif
Confirmation par Test invasif
Echo 12 SATest combiné si échec DPNI
Test invasif pour confirmation ousigne d’appel écho