diagnostic des anomalies de - adrhec plateform · au cours de la grossesse adamts13 diminue...

DIU d’Hémostase – Lyon – 2015

Diagnostic des anomalies de

l’ADAMTS13

Professeur Agnès Veyradier

Service d’Hématologie – Hémostase – Thrombose

Hôpital Lariboisière, Paris

Groupe Hospitalier Saint Louis-Lariboisière-Fernand Widal

Université Paris Diderot – Paris 7

PARIS

DIDEROT

université

PA

RIS

7

Etudes hémorhéologiques des années 1980

Le facteur Willebrand (VWF) est la protéine indispensable

à l’adhésion plaquettaire au sous-endothélium

et à l’agrégation plaquettaires dans la microcirculation sanguine

Endothélium

Matrice

sous-endothéliale

Brèche

vasculaire

Plaquette

VWF

Plaquette fibrinogène

Plaquette

VWF

Agrégation

plaquettaire

Adhésion

plaquettaire

VWF : structure multimérique

Dimère : 500 kDa

Tetramère : 1000 kDa

Multimère > 20 000 kDa

Hexamère : 1500 kDa

VWF : sensibilité conformationnelle aux taux de cisaillement du flux sanguin

Multimère de VWF

globulaire

Multimère de VWF

déplié

Régulation physiologique

de la taille des multimères du VWF

La protéase de clivage du VWF : Historique

1996. Purification partielle à partir du plasma humain

1997. Méthode de dosage fonctionnel dans le plasma

1998. Modèle de pathologie humaine : le PTT

2001. Séquence peptidique (famille ADAMTS) : ADAMTS13

2001. Gène

2001. Lieu de synthèse

Depuis 2001.

. Relations structure / fonction

. Régulation

. Rôle en physiologie et pathologie humaines

ADAMTS13

. Gène : chromosome 9 - 29 exons - ARNm 4,6 kb (clonage 2001)

. Biosynthèse : c de Ito du foie, c endothéliales, plaquettes

. Sécrétion dans le plasma (conc : 1 µg/ml; demi-vie : 1 semaine)

. Normes dans le plasma : 50 – 150 %

. Structure : Métalloprotéase de la famille ADAMTS

(A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin type 1 motifs)

Glycoprotéine monocaténaire de 190 kDa - 1427 ac am

. Fonction : Protéase spécifique de clivage du facteur Willebrand

. Déficit sévère : Purpura Thrombotique Thrombocytopénique (PTT)

La famille ADAMTS

Récepteurs

cellulaires

(CD36 endothélial)

?

Intégrines

(Ca ++) (Zn ++)

RGDS

Chaîne 3 des intégrines

TSP

3

TSP

5

TSP

7

TSP

6

TSP

8

TSP

2

TSP

4 Metalloprotease TSP

1 Spacer

CUB

CUB

Desint. Cys N

C

Structure d’ADAMTS13

Site catalytique

ADAMTS13

Facteur Willebrand (VWF) [monomère = SU mature]

C2 D’ A1 A2 A3 D3 D4 B1 B2 C1 CK

Domaines d’interaction entre ADAMTS13

et son substrat

Tyr842-Met843

VWF73

VWF73 = Substrat minimal pour ADAMTS13 in vitro

Partie N-terminale indispensable au clivage du VWF in vitro

désint TSP

1 Cyst. spacer métallo CUB CUB

EQAPNLV YM VTGNPASDEIKRLPGDIQVVPIG VGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPR EAPDLVLQR

842-843

905 833

Liaison en flux

in vitro

Multimères de VWF clivés

Cellules endothéliales

Multimères de HPM de VWF

Sécrétion des multimères de THPM à partir des corps de Weibel-Palade

Cellules endothéliales

Fonction du couple VWF-ADAMTS13

Sujet Normal

CD 36 ?

Plaquettes

Sujet Normal Patient atteint de PTT

Agrégation spontanée des plaquettes

Libération de thrombi

Fonction du couple VWF-ADAMTS13

CD 36 ?

Variations physiologiques d’ADAMTS13

Conditions ayant en commun une augmentation

physiologique du taux de VWF : diminution d’ADAMTS13

. Âges extrêmes de la vie : nouveau-nés et sujets âgés ADAMTS13 plus basse de 10-20% p/r à la population générale

. Sujets noirs ADAMTS13 plus basse de 10-20% p/r aux sujets blancs

. Au cours de la grossesse ADAMTS13 diminue progressivement à partir de 12 SA

pour atteindre à terme, des taux inférieurs de 15-20% p/r

au taux de base de la patiente

Déficits fonctionnels en ADAMTS13

I- Déficits partiels en ADAMTS13 (Activité entre 10 et 45%)

. Non spécifiques, retrouvés dans de nombreuses pathologies :

sepsis sévère, hépatopathies, HTA maligne, paludisme, MAT

telles que SHU, HELLP syndrome, PTT « non classiques » associés

aux greffes d’organes, aux cancers, au VIH…

. Pertinence clinique ???

. Mécanismes : consommation par excès de substrat, diminution de

synthèse/sécrétion, inhibition catalytique par IL6, dégradation

protéolytique par enzymes protéolytiques (thrombine, élastases

leucocytaires…)

II- Déficit sévère en ADAMTS13 (Activité <10%)

. Pathognomonique du PTT

. Marqueur diagnostique sensible et spécifique

. Marqueur pronostique probable

. Mécanismes : auto-anticorps ou mutations génétiques

PTT : définition

. Anémie hémolytique mécanique (schizocytes)

. Thrombopénie de consommation

. +/- ischémie multiviscérale (cerveau, rein…)

rein surrénale

colon pancréas

foie coeur

Thrombi de la microcirculation dans différents organes

d’un patient atteint de PTT

PTT : historique, épidémiologie

. Historique

. Adulte : Syndrome de Moschcowitz (1924)

. Enfant : Syndrome d’Upshaw-Schulman (1960)

. Prévalence

4 à 10 cas / million d’habitants / an - (maladie rare)

. Age de révélation (1ère poussée)

Enfance (naissance -> adolescence) : <10% des cas

Adulte : 30-40 ans, sex ratio 2F/1H : >90% des cas

. Evolution par poussées (entrecoupées de rémission)

. sporadiques

. récurrentes (parfois familiales)

. Formes cliniques

. Idiopathiques (~50% des cas)

. Secondaires : infections, grossesse, MAI, médicaments… (~50% des cas)

Les grandes étapes de la

compréhension physiopathologique

du PTT de 1982 à 2001

Structure multimérique du VWF plasmatique

dans le PTT

-

+

multimères

de THPM

- dimère

PTT Normal

Moake et al, Blood 1982

Histopathologie du PTT

Microangiopathie thrombotique

souffrance

endothéliale

Asada et al, Thromb Res 1985

Micro-

vaisseaux

Thrombi de

plaquettes + VWF

Purification d’une protéase spécifique de clivage du VWF : VWF-CP

L’activité plasmatique de la VWF-CP est effondrée (<5%) chez les

patients atteints de PTT Furlan et al, Blood 1997

Physiopathologie du PTT (1)

Le déficit fonctionnel sévère de la VWF-CP dans le PTT est :

. soit acquis par le biais d’auto-anticorps spécifiques

. soit probablement constitutionnel (cas familiaux)

Furlan et al, NEJM 1998

Tsai et al, NEJM 1998

Furlan et al, Blood 1996

Le clonage du gène de la protéase spécifique de clivage du

facteur Willebrand a permis :

. de l’identifier comme le 13ème membre de la famille ADAMTS

(A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin

type 1 repeats) : ADAMTS13

. de montrer qu’il existe bien des cas héréditaires de PTT

par le biais de mutations récessives du gène d’ADAMTS13 :

maladie orpheline = Syndrome d’Upshaw-Schulman

Levy et al, Nature 2001

Physiopathologie du PTT (2)

Physiopathologie du

purpura thrombotique thrombocytopénique

Formation spontanée de thrombi plaquettaires

dans la microcirculation sanguine

Déficit fonctionnel sévère <10% en ADAMTS13

Accumulation de très grands multimères du VWF très adhésifs

en circulation dans le plasma

Acquis (auto-anticorps anti-ADAMTS13)

Héréditaire (mutations du gène d’ADAMTS13)

Anémie hémolytique mécanique

Thrombopénie de consommation

Ischémie

multiviscérale

Facteurs favorisants

Le PTT lié à un déficit sévère

héréditaire en ADAMTS13

Syndrome d’Upshaw-Schulman


Epidémiologie

. Maladie orpheline :

moins de 10% de tous les cas de PTT

prévalence <0,5 pour 1 million

. Une centaine de patients décrits dans la littérature

. Répartition mondiale ubiquitaire :

Amérique du Nord (USA, Canada)

Europe (UK, France, Allemagne, Autriche, Suisse, Italie, Portugal,

Yougoslavie, Suède)

Asie (Japon, Chine, Iran, Koweit, Turquie)

Australie

Afrique (Maghreb)

Peu de mutations d’ADAMTS13 communes entre les différents pays

. Age de révélation

. à la naissance +++ (ictère, hémolyse, thrombopénie)

. dans la petite enfance ++

. à l’âge adulte : mutation R1060W, grossesse

. Sévérité des poussées

. bicytopénie hématologique …..

… ischémie multiviscérale parfois irréversible

(insuffisance rénale terminale, séquelles d’AVC, d’IDM…)

. Fréquence des poussées :

. périodes de rémission de durée variable (mois, années)

. ou maladie chronique (rémission < 1 mois)


Phénotype clinique variable

. Activité plasmatique ou sérique d’ADAMTS13 < 10%

. Antigène d’ADAMTS13 le plus souvent indétectable < 65 ng/ml

. Autoanticorps anti-ADAMTS13 négatifs

. Titre d’IgG anti-ADAMTS13 < 15 UI/dl

. Activité inhibitrice circulante anti-ADAMTS13 indétectable


Phénotype biologique invariable

. Une centaine de mutations d’ADAMTS13

. Transmission autosomique récessive (maladie orpheline) :

. Les patients sont double hétérozygotes ou homozygotes

. Parmi les homozygotes (~15 mutations) : consanguinité

. Répartition sur toute la longueur du gène

. Mutations faux-sens : 70% / Mutations de terminaison : 30%

. Pas de délétion totale du gène (létale ?)

. Mécanismes : déficit quantitatif ou qualitatif d’ADAMTS13


Génotype

Métalloprotéase Desint. TSP

1 Cys Spacer TSP

2

TSP

3

TSP

4

TSP

5 TSP

6

TSP

7

TSP

8 CUB1

I79M

V88M*

A95P

H96D

R102C

S119F

R193W*

T196I

S203P

L232Q

H234Q

D235H

A250V*

S263C

R268P

C311Y

C322G

T323R

F324L

R328G

C347S

P353L

C365X*

W390C*

W390X

R398H

E444G

Q448E

Q449X*

P457L

P475S

R507Q

C508Y*

R528G

Splice :

In15 :

1787 -26G>A

Frameshift :

1783-1784 TT del

A900V

S903L

C908Y*

C908S

R910X

C951G

W1016X

C1024G

A1033T

R1034X

R1060W*

R1095W

R1096X

R1123C* Q44X*

R7W

Splice :

In3 : G>A

In4 : 414+1 G>A

In6 : 686+1>A 686+1T>G

Frameshift :

Ex7 : 718-724 del G+C

Splice :

In8 : 987

+ 11C>T

or +69C>T

Int/ex8 :

8 bp del

Ex 9 : G>A

Splice :

In10 :

1244 -2T>G

1245 -32C>G

Splice :

In 13 :

+2T >A

1584 +5G>A

1584 +106C>G

1584 +236T>C

Ex12 :

G>A

A596V

P618A

R625H

A631V

P671L

I673F

P671L

T673F*

R692C

C695W

A732V

Frameshift:

Ex19 :

2279G>A

2279delG

2376del26

C758R

Q802X

Frameshift:

Ex20 :

2549delAT

H960D

C977W

Splice :

In22 :

2861 +55C>T

R1206X

C1213G*

C1213Y

I1217T

R1219W*

C1239V*

W1245X*

K1256F

K1256S

R1336W

D1362V

Frameshift:

Ex27 :

3769insT

CUB2

Splice :

In28 :

4077 +32T>C

Frameshift :

4143insA

Mutations d’ADAMTS13 dans le syndrome d’Upshaw-Schulman

E812X

Mutations de novo

Mutations françaises

Mutations exprimées dans des recombinants*

Le PTT lié à un déficit sévère acquis

en ADAMTS13

(Syndrome de Moschcovitz)

PTT par déficit sévère acquis en ADAMTS13

. 90% de tous les PTT lié à déficit sévère en ADAMTS13

. Prévalence : 4 à 10 cas par million d’habitants / an

. Age : adultes +++ (âge de la 1ère poussée : 30-40 ans)

. Sex ratio : 2F / 1H

. Contexte : idiopathique / contexte clinique associé

. Mécanismes

. autoimmunité (IgG anti-ADAMTS13) : 90% des cas

. autres (défaut de synthèse/sécrétion, dégradation, inhibition …) : 10% des cas

Phénotype clinique variable

. Age de révélation de la maladie : adulte >>>>> enfant (rares cas chez grands

enfants et adolescents)

. Caractère idiopathique = contexte clinique associé (maladies auto-immunes

LED SAPL…)

. Degré de l’atteinte ischémique (thrombopénie -> ischémie multiviscérale)

. Fréquence des poussées (récurrentes sporadiques -> chroniques)

. Exigences thérapeutiques (plasmathérapie +/- immunosuppresseurs)

Phénotype biologique variable

IgG anti-ADAMTS13 : détectables dans ~70% des cas

PTT par déficit sévère acquis en ADAMTS13

Auto-anticorps anti-ADAMTS13

dans le PTT acquis (1)

. Dans 75% des PTT acquis : IgG combinant une

activité inhibitrice et une complexation à l’antigène

. Rarement : IgM et/ou IgA

. Polyclonaux et toujours dirigés contre le domaine

Cys-rich d’ADAMTS13

. Associés d’emblée ou précèdent l’apparition

d’autres auto-Ac (FAN)

Auto-anticorps anti-ADAMTS13

dans le PTT acquis (2)

. Induisent le déficit sévère acquis de l’activité d’ADAMTS13

retrouvé en poussée de PTT

. Le plus souvent, disparaissent en rémission clinique,

parallèlement à une normalisation de l’activité d’ADAMTS13

. Parfois, persistent en rémission clinique :

- à un titre élevé, parallèlement à une ADAMTS13 indétectable

- à un titre moindre, parallèlement à une ADAMTS13 détectable

ADAMTS13 dans les MAT

Expérience 1999-2014

du CNR-MAT (Centre National de Référence des MicroAngiopathies Thrombotiques)

ADAMTS13 en France : historique 1999-2012

2000 2002 2005 2006 2011 2012

U143 Inserm/

Hématologie A. Béclère

(D. Meyer)

Méthode originale de mesure

d’ADAMTS13 activité

(ELISA VWF full-length)

et application aux MAT

Thèse de Sciences A. Veyradier

1999

Réseau clinico-biologique d’étude des MAT

Cliniciens: réanimateurs,

hématologues, néphrologues, internistes

Biologistes:

ADAMTS13 : Hémato A. Béclère/U143 Inserm

Complément: Immunologie HEGP

Thèse d’exercice médecine P. Coppo

U143 Inserm/

Hématologie A. Béclère

(D. Meyer/A.Veyradier)

Nouvelles méthodes

d’investigation

d’ADAMTS13

FRETS-VWF73

IgG anti-A13

Séquençage gène A13

PNMR 1: 3ème vague de labellisation

Centre National de Référence

des MicroAngiopathies Thrombotiques (CNR-MAT)

Coordonnateur : P. Coppo

50 Équipes cliniques (sites CNR + CC)

Labos référents:

ADAMTS13 : A. Veyradier

Complément : V. Frémeaux-Bacchi

Expertise HAS

Renouvellement CNR-MAT

(PNMR2)

U770 Inserm

(C. Denis)

Souris KO ADAMTS13

Laboratoire de génétique,

CHU Nantes

(P. Boisseau, S. Bezieau)

Génotypage d’ADAMTS13

2010

Laboratoire ADAMTS13 du CNR-MAT : historique

De la recherche clinique au diagnostic médical

Tests phénotypiques pour les patients

Inserm U143

Inserm U143

Hémato bio

Hôp. A. Béclère

1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014

Hématol bio

Hôp. A. Béclère

Hémato bio

Hôp.

Lariboisière

Inserm U770

Tests génotypiques pour les patients

1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014

Inserm U143/U770 Génétique

Hôp. Hôtel-Dieu - CHU de Nantes

Réseau clinico-biologique des MAT Centre National de Référence des MAT (PNMR)

Lille

Nantes

Strasbourg

Bordeaux

Toulouse

Montpellier Marseille

Tours

Caen Rouen

Clermont-

Ferrand

Lyon

Rennes

Reims

Dijon

Amiens

Limoges

Angers

La Réunion

Paris

CNR-MAT Assistance Publique-Hôpitaux

de Paris

Saint Antoine

Saint Louis

Pitié Salpêtrière

Tenon…

Antoine Béclère

HEGP

19

Centres

de

Compétences

CNR-MAT : maillage territorial

Laboratoire ADAMTS13 du CNR-MAT

Service d’Hématologie biologique

S. Thouzeau-Benghezal, S. Savigny,

S. Capdenat, Dr A. Stepanian, Pr A. Veyradier

Etude phénotypique

(ADAMTS13 activité

FRETS-VWF73 et full-length VWF

IgG anti-ADAMTS13 titrage et inhibiteur)

Service de génétique moléculaire

Dr P. Boisseau, Pr S. Bezieau

Etude génétique d’ADAMTS13

Inserm U770,

Le Kremlin Bicêtre

P. Legendre

Dr C. Denis, Dr P. Lenting,

Recherche fondamentale

Modèle murin ADAMTS13 KO

2000 2002 2001 2003 2005 2004 2006 2008 2007 2009 2011 2010

Nombre de tests ADAMTS13

phénotypiques

1000

2000

3000

Soins courants

Recherche clinique

Labellisation

CNR-MAT

PNMR1

Laboratoire ADAMTS13 du CNR-MAT : activité

. Total sur 14 ans : environ 15 000 tests phénotypiques

-> recrutement national

-> 1 à 3 séries d’ADAMTS13 activité / semaine

-> compte rendus spécialisés experts

-> avis spécialisé (tel, email) dans 30% des cas

2012 2013

Filière MARIH

PNMR2

adultes

enfants

PTT héréditaires PTT acquis

Cohorte du CNR-MAT de

PTT lié à un déficit sévère d’ADAMTS13

(~850 patients)

Age de révélation :

. adulte (93%)

. pédiatrique (7%)

Etiologie (tous âges):

. Acquise (94%)

. Héréditaire (6%)

Etiologie (enfants):

. Acquise (44%)


Etiologie (adultes):

. Acquise (98%)


mais ……

Cohorte du CNR-MAT de

PTT lié à un déficit sévère d’ADAMTS13

révélé en contexte obstétrical

(42 patientes)

PTT acquis

(80%)

PTT héréditaires

(20%)

Moatti-Cohen et al, Blood 2012

Exploration biologique

d’ADAMTS13

I- Etapes pré-analytiques

II- Méthodes biologiques

. Activité d’ADAMTS13

. Antigène d’ADAMTS13

. Auto-anticorps anti-ADAMTS13

. Gène d’ADAMTS13

I- Etapes pré-analytiques

. Etude phénotypique (activité, antigène, recherche d’auto-Ac)

- Plasma citraté ou serum

- Si absence de ttt extemporané : congélation à -20°C ou -80°C

- Si ttt sur un site extérieur, envoi dans la carboglace

- Limites :

communes à toutes les techniques

. EDTA : inactivation d’ADAMTS13 in vitro

. Hémolyse : inactivation d’ADAMTS13 in vitro

propres aux méthodes VWF full-length

. Taux de VWF:Ag > 300 UI/dl

propres aux méthodes fluorimétriques

. Autofluorescence de certains plasma/serum ?

. Hyperbilirubinémie

. Etude génétique

- Sang total EDTA ou citraté conservés à +4°C pdt 72 h ou -20°C

- Consentement éclairé du patient

Exploration biologique d’ADAMTS13

Principe

Dégradation d’un substrat exogène (VWF full-length ou courts peptides de VWF)

par l’ADAMTS13 du plasma testé.

Les produits de dégradation du VWF clivé par ADAMTS13 sont mesurés par des

techniques :

- électrophorétiques (multimères ou fragments)

- immunologiques (CBA, VWF:Ag, Chr-VWF73)

- d’agrégation plaquettaire (VWF:RCo)

- fluorimétriques (FRETS-VWF73)

- de spectrométrie de masse (SELDI-TOF)

Normes : 50 – 150 %

Objectif

Détection des déficits fonctionnels sévères: activité d’ADAMTS13 <10%

II- Méthodes biologiques : Activité d’ADAMTS13 (1)


Indications pour le diagnostic médical

. Devant une suspicion de MAT en phase aiguë, confirmation ou infirmation

du diagnostic de PTT (paramètre sensible et spécifique)

- dans 95% des cas : non urgent ! Délai préconisé < 10 jours.

- dans 5% des cas : urgent car nécessité d’ajustement thérapeutique rapide

. confirmation diagnostique de PTT pour indication traitement

immuno-modulateur si intolérance à la plasmathérapie ou flare-up

. diagnostic d’exclusion de PTT pour indication d’eculizumab

. Suivi biologique en rémission des patients ayant un(des) ATCD de poussées

de PTT (paramètre ayant une valeur pronostique quant au risque de

rechute)

II- Méthodes biologiques : Activité d’ADAMTS13 (2)


Méthodes électrophorétiques (VWF full-length)

Multimères du VWF (SDS-agarose)

Mesure de l’activité d’ADAMTS13

Furlan et al, NEJM 1998

Dilutions

plasmatiques 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 Tp 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640

Sujet normal Activité d’ADAMTS13 100%

Patient PTT Activité d’ADAMTS13 <10%

Méthodes électrophorétiques (VWF full-length)

Fragments de dégradation du VWF (SDS-PAGE)


Tsai HM, NEJM 1998

Sujet normal Activité d’ADAMTS13 100%

Patient PTT Activité d’ADAMTS13 <10%

300 kDa -

250 kDa -

SU - VWF

clivage par

ADAMTS13

Méthodes immunologiques (VWF full-length)

ELISA VWF:Ag


Obert et al, Thromb Haemost 1999

Sujet normal

Patient PTT

Plasma

+ BaCl2

rvWF WT

(substrat) +

Protéolyse

Mesure du VWF:Ag résiduel par ELISA

Acm

anti-vWF

C-term

Acm

anti-vWF

N-term

ou

Méthode Fluorimétrique (VWF-73)

FRETS-VWF73


Kokame et al, Br J Haematol 2005

Avantages et inconvénients des méthodes

selon le substrat VWF utilisé


Méthodes Avantages Inconvénients

Méthodes

VWF full-length

Méthodes

VWF-73

Home-made

Longues (plusieurs jours)

Interférence du VWF:Ag

endogène du patient

Non adaptables en kit commercial

Méthodes de référence,

évaluées

Sensibles à ~toutes les

mutations d’ADAMTS13

Méthodes de référence,

évaluées

Rapides (1 journée)

Pas d’interférence du VWF:Ag

endogène du patient

Adaptables en kit commercial

Interférence selon mode de

révélation (autofluorescence spontanée)

Non sensible à certaines

mutations d’ADAMTS13

Corrélation des différentes méthodes


Méthodes « home made » de référence entre elles (littérature 2006-2010)

(full-length vs full-length et full-length vs VWF-73)

Littérature -> bonne corrélation inter-méthodes pour le diagnostic des déficits sévères

mais discordances pour les déficits partiels et les valeurs normales

Méthodes «home made» versus kits commerciaux récents

. Etude multicentrique nationale en 2011 pilotée par le CNR-MAT

(12 labos des Centres de Compétences du CNR-MAT, ~10 échantillons)

-> nécessité d’évaluer les kits commerciaux ADAMTS13 act. pour aider les

Laboratoires des Centres de Compétences du CNR-MAT à choisir le meilleur kit si

volonté de développer la technique sur site pour les urgences

. Publication récente : Mackie et al, Thromb Haemost janvier 2013

Evaluation des Kits American Diagnostica (Fret-VWF86) et Technoclone (Chr-VWF73)

versus méthode home made frets-VWF73 : 159 échantillons

-> assez bonne corrélation inter-méthodes pour le diagnostic des déficits sévères mais

discordances pour les déficits partiels et les valeurs normales

Evaluations menées par le laboratoire ADAMTS13

du CNR-MAT en 2013-2014

EVALUATION DE 2 KITS COMMERCIAUX

. Projet initial

Evaluation en parallèle du kit Genprobe® et du kit Technoclone ® …

mais rupture de stock du kit Technoclone ® pendant 6 mois

. Finalement

. Evaluation du kit Genprobe ® début 2013

. Evaluation du kit Technoclone ® fin 2013-début 2014

. NB : auto-financement des réactifs (pas de conflit d’intérêt)

PARTICIPATION AU STANDARD INTERNATIONAL

. (NIBSC, United Kingdom) sous l’égide du SSC VWF/ADAMTS13 de l’ISTH

. Très bons résultats

Evaluation du kit Genprobe ®

pour la mesure de l’activité d’ADAMTS13 (1)

Principe de la méthode

Dégradation d’un substrat FRETS-VWF73 par l’ADAMTS13 du plasma testé.

Révélation par fluorimétrie.

Calibrants et CQ du kit (bas : 16-26% / haut : 47-57%)

CQ internes (PTT < 10%, pool 50%, pool 100%)

Echantillons testés : n = 209

. 13 PTT héréditaires (USS)

. 38 PTT acquis en poussée

. 31 PTT acquis en rémission

. 97 MAT diverses (SHU, sepsis, cancers, MAI et autres…)

. 30 sujets sains

Thouzeau S, Capdenat S, Stepanian A, Coppo P, Veyradier A.

Thrombosis Haemostasis 2013

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100 120

ADAMTS13 activity

(In-house FRETS-VWF73)

ADAMTS13 activity

(ATS-13 ® Activity Assay)

[Number] of tested samples

Total = 209

[51] [86] [72]

Limite de sensibilité : 10%


Seuil de relevance

clinique : 10%

Evaluation du kit Genprobe

ADAMTS13 (2)

51 échantillons <10% :

3 discordants (sur-estimés)

86 échantillons entre 11 et 49% :

65 discordants

dont 17 sous-estimés (<10% !)

et 48 sur-estimés


presque tous surestimés

Evaluation du kit Genprobe®


Conclusion

. Limites techniques :

Seuil de détection (15%) trop élevé et > seuil de relevance clinique

Calibrants non optimaux

. Bonne sensibilité pour détecter les taux d’ADAMTS13 < 10%

. Défaut de spécificité

-> sur-diagnostic de déficit sévère (!) dans 17 cas/65 (~1 cas / 4)

. Surestimation quasi-systématique des valeurs détectables

-> problème de suivi des patients en rémission +++

(sous-diagnostic d’un début de rechute biologique qui pourrait justifier une

Injection préventive de rituximab ?)

Evaluation du kit Technoclone ®


Joly B, Stepanian A, Hajage D, Thouzeau S, Capdenat S, Coppo P, Veyradier A.

Thrombosis Research, 2014

Principe de la méthode

Dégradation d’un substrat FRETS-VWF73 par l’ADAMTS13 du plasma testé.

Révélation par colorimétrie.

Calibrants (n=6) et CQ du kit (n=2)

CQ internes (PTT < 10%, pool 50%, pool 100%)

Echantillons testés : n = 247

. 19 PTT héréditaires (USS)

. 75 PTT acquis en poussée

. 52 PTT acquis en rémission

. 71 MAT diverses (SHU, sepsis, cancers, MAI et autres…)

. 30 sujets sains

ADAMTS13 activity (%)

(Technozym® ADAMTS13 activity ELISA)

ADAMTS13 activity (%)

(In-house FRETS-VWF73)

[94] [15] [53] [85]

[Number] of tested samples

Total = 247

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Evaluation du kit Technoclone

ADAMTS13 (2)

Seuil de relevance

clinique : 10%

94 échantillons <10% :

11 discordants (sur-estimés)


4 sous-estimés (<10% !)

Autres plutôt sous-estimés


Globalement sous-estimés



-40

-20

0

20

40

60

0 25 50 75 100

FR

ET

S-V

WF

73 -

Chr-

VW

F73

(FRETS-VWF73 + Chr-VWF73)/2

Mean

6.6

+1.96 SD

41.7

-1.96 SD

-28.5

Evaluation du kit Technoclone

ADAMTS13 (3) Graphe de Bland et Altman

149 échantillons dont l’activité d’ADAMTS13 est > 10%

Le test Chr-VWF73

(Technoclone) :

. a tendance à sous-

estimer l’act. A13

. mesure des valeurs

très dispersées de

manière aléatoire

Evaluation du kit Technoclone®


Conclusion

. Seuil de détection (3%) bien adapté au seuil de relevance clinique (10%)

. Pistes d’amélioration techniques : ajouter un calibrant (~80%) et des CQ

. Pour la détection d’une activité d’ADAMTS13 < 10%

- assez bonne concordance avec la méthode de référence FRETS-VWF73

- mais ~12% de résultats faux négatifs

Attention à ne pas « manquer » le diagnostic biologique de PTT

. Pour la mesure précise d’une activité d’ADAMTS13 >10% (entre 11 et 100%)

- tendance à la sous-estimation systématique des valeurs détectables

- grande variabilité des mesures, de manière aléatoire

Attention à ne pas surestimer le risque de rechute et par conséquent, l’indication

d’une injection préventive de rituximab lors du suivi des patients PTT en rémission

clinique

.

Recommandations du CNR-MAT

pour la mesure de l’activité d’ADAMTS13

à des fins de diagnostic médical

Idéalement, la mesure de l’activité d’ADAMTS13 (technique et interprétation)

effectuée dans le cadre de la documentation biologique d’une suspicion de MAT :

. relève d’une activité biologique experte supraGH dédiée aux maladies rares (plateforme

biologique du CNR-MAT) . repose en 1ère intention sur la technique FRETS-VWF73 . doit être contrôlée par une 2ème méthode utilisant un substrat VWF full-length

. systématiquement pour les patients pédiatriques

. en cas de discordance avec la présentation clinique ou de pb analytique

(autofluorescence par ex.) pour les patients adultes

Le kit commercial Technoclone est le plus performant en 2014. Les utilisateurs

doivent cependant en connaitre les limites et ne pas hésiter à avoir recours au labo

ADAMTS13 du CNR-MAT en cas de doute ou de problème technique et/ou

d’interprétation.

II- Méthodes biologiques : Antigène d’ADAMTS13


. Principe

ELISA utilisant des Anticorps polyclononaux ou monoclonaux

anti-ADAMTS13

Méthodes home made et kits commerciaux

. Normes : 700 – 1400 ng/ml

. Indication pour le diagnostic médical

Caractérisation des déficits fonctionnels sévères héréditaires

en ADAMTS13 (syndrome d’Upshaw-Schulman) :

Distinction déficit quantitatif / déficit qualitatif

II- Méthodes biologiques :

Auto-anticorps anti-ADAMTS13 (1)


. Titrage des IgG anti-ADAMTS13

. Principe

ELISA utilisant de l’ADAMTS13 recombinante sauvage et une révélation par des Anticorps anti-IgG

humaines. Méthodes home made et kits commerciaux.

. Seuil de positivité: ~15 UI/ml

. Sensibilité : le titre d’IgG anti-ADAMTS13 est positif dans ~75% des PTT acquis auto-immun en

phase aiguë

. Spécificité : le titre d’IgG anti-ADAMTS13 peut être discrètement positif chez un très faible

pourcentage de sujets sains ayant une activité d’ADAMTS13 normale


Test de 1ère intention pour la recherche d’auto-Ac anti-ADAMTS13.

Si et seulement si l’activité d’ADAMTS13 est inférieure à 10%, le tirage des IgG anti-ADAMTS13 est

indiqué afin d’objectiver une cause auto-immune au déficit sévère en ADAMTS13 (PTT acquis auto-

immun).


Auto-anticorps anti-ADAMTS13 (2)


. Recherche d’une activité inhibitrice circulante anti-ADAMTS13

. Principe

Mesure de l’activité ADAMTS13 résiduelle de mélanges, à différents ratios, de plasma testé + plasma

témoin. Méthodes home made.

. Seuil de positivité: variable selon les méthodes

. Sensibilité : une AIC anti-ADAMTS13 est retrouvée dans ~60% des PTT acquis auto-immun en phase

aiguë

. Spécificité : une AIC anti-ADAMTS13 n’est jamais détectée si l’activité d’ADAMTS13 est >10%


Test de 2ème intention pour la recherche d’auto-Ac anti-ADAMTS13.

Si et seulement si l’activité d’ADAMTS13 est inférieure à 10%, la recherche d’une AIC anti-ADAMTS13

est indiquée et permet :

. si les IgG anti-ADAMTS13 sont positives, d’objectiver leur éventuel caractère

inhibiteur (~80% des cas)

. si les IgG anti-ADAMTS13 sont négatives, une IAC anti-ADAMTS13 est rarement mise

en évidence et pourrait alors être liée à la présence d’IgA/IgM anti-ADAMTS13


Analyse génétique d’ADAMTS13


Principe Séquençage des 29 exons et des jonctions exon/intron du gène d’ADAMTS13

Indication pour le diagnostic médical Confirmation du diagnostic de PTT héréditaire (Syndrome d’Upshaw-Schulman)

devant une histoire clinique et un phénotype biologique évocateurs :

- poussées de PTT récurrentes depuis l’enfance ou déclenchées par la grossesse

- activité d’ADAMTS13 (méthode full-length et méthode VWF-73) < 10%

de manière constante (en poussée de PTT en en rémission)

avec IgG anti-ADAMTS13 négatives

Sensibilité : des mutations bi-alléliques du gène d’ADAMTS13 sont retrouvées

dans ~99% des USS

Spécificité : les mutations bi-alléliques du gène d’ADAMTS13 ont une spécificité

de 100% dans le diagnostic de l’USS

Arbre décisionnel simplifié pour l’investigation d’ADAMTS13

à visée diagnostique dans le PTT : recommandation CNR-MAT

ADAMTS13 activité non effondrée

effondrée

IgG / inhibiteur anti-ADAMTS13

positif négatif

ADAMTS13 activité

non effondrée effondrée

(+ auto-Ac anti-ADAMTS13 nég.)

Séquençage du gène

d’ADAMTS13

PTT

en

poussée

PTT

en

rémission

Diagnostic PTT acquis PTT héréditaire

…..

pas de mutation mutations

?

Cas clinique N°1

Un nouveau-né (fille) présentant un ictère développe à J2 de vie,

une thrombopénie à 20 giga/L associé à une anémie à 10 g/dL

avec 3% de schizocytes. Il existe une protéinurie modérée sans

insuffisance rénale. Il n’y a aucun contexte clinique particulier.

Les parents sont cousins germains et il y a dans la fratrie de 4

enfants, un frère décédé à quelques jours de vie dans un tableau de

défaillance multiviscérale inexpliqué (il y 10 ans) et 2 sœurs bien

portantes.

Vous suspectez une MAT.

Cas clinique N°1

1. Quels examens biologiques complémentaires

demandez-vous ?

Réticulocytes :

Coombs érythrocytaire : négatif

LDH :

Biliribine non conjuguée :

Haptoglobine : effondrée

ADAMTS13 activité : effondrée <10%

Fractions de la voie alterne du complément : C3, C4, CH50 : normaux

Cas clinique N°1

2. Quel diagnostic suspectez-vous ? Pourquoi ?

. PTT héréditaire (syndrome d’Upshaw-Schulman)

. Tableau clinique évocateur : ictère néonatal + anémie hémolytique mécanique

+ thrombopénie profonde sans contexte clinique particulier

. Consanguinité parentale

. Probable atteinte d’un frère ainé décédé (ischémie systémique)

. Forme acquise de PTT rarissime voire inexistante à cet âge

3. Quels examens biologiques complémentaires

demandez-vous ? Selon quel protocole ?

Cas clinique N°1

. Contrôle de l’effondrement de l’activité d’ADAMTS13 sur un 2ème

prélèvement (Attention : préciser au clinicien de prélever avant

l’initiation d’une plasmathérapie)

. Titrage des IgG anti-ADAMTS13 : négatives

. Eventuellement : dosage de l’Antigène d’ADAMTS13

. Séquençage du gène d’ADAMTS13 : mutations bi-alléliques du

gène d’ADAMTS13

. Enquête familiale : phénotypique et génotypique

Cas clinique N°2

Une femme de 38 ans arrive aux urgences d’un centre hospitalier

pour asthénie, dyspnée, pétéchies diffuses et céphalées.

La NFS plaquettes retrouve une anémie à 8 g/dL avec 3% de

schizocytes et une thrombopénie à 15 giga/L. La fonction rénale est

normale. L’examen neurologique retrouve une discrète confusion

mentale. Les beta-hCG sont négatives.

La patiente n’a pas d’ATCD médical particulier et elle ne prend pas

de traitement. On retrouve la notion d’un lupus chez sa sœur.

2. Quel diagnostic suspectez-vous ? Quels examens biologiques complémentaires demandez-vous ?

. PTT acquis auto-immun idiopathique

. Bilan d’hémolyse : réticulocytes, coombs érythrocytaire, LDH, bilirubine C/NC,

Haptoglobine

. Mesure de l’activité d’ADAMTS13 : <10%

. Titrage des IgG anti-ADAMTS13 : 100 UI/ml

Cas clinique N°2

3. La patiente est traitée par plasmathérapie (EP) pendant

10 jours et entre en rémission clinique.

Le contrôle de l’activité d’ADAMTS13 à 6 mois en rémission

montre une activité toujours effondrée <10%.

Qu’en pensez-vous ?

Quelle attitude préconisez-vous ?

. Risque de rechute important dans les 2 premières années

. Surveillance biologique systématique tous les 3 mois (en dehors de tout

événement clinique intercurrent)

. Si l’activité d’ADAMTS13 reste <10% à 1 an, discuter avec les cliniciens du

CNR-MAT l’indication d’un traitement préventif des rechutes par Rituximab

Cas clinique N°2

A. Veyradier, M. Wolf, A. Stepanian, P. Coppo.

ADAMTS13, la protéase spécifique de clivage du facteur Willebrand.

EMC (Elsevier Masson SAS, Paris), Biologie Médicale, 90-20-0003-A, 2011

A.Veyradier, P. Coppo.

ADAMTS13, von Willebrand factor specific cleaving protease.

Med Sci (Paris) 2011 Dec; 27(12): 1097-1105.

Bibliographie

diagnostic des anomalies de - adrhec plateform · au cours de la grossesse adamts13 diminue...

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