développement d'une méthode de purification non dénaturante non

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Mme Cécile Bienboire-Frosini IRSEA | QUARTIER SALIGNAN, LE CHENE, 84400 APT Développement d’une méthode de purification non dénaturante non dénaturante de la protéine Fel d 1, en vue de l’identification de son possible ligand par GC-MS RAYNAUD Cloé DUT Génie Biologique, option Analyses Biochimiques et Biologiques 2014/2016 Stage du 18 Avril au 25 Juin 2016

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Page 1: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

Mme Cécile Bienboire-Frosini IRSEA | QUARTIER SALIGNAN, LE CHENE, 84400 APT

Développement d’une méthode de

purification non dénaturante non

dénaturante de la protéine Fel d 1, en

vue de l’identification de son possible

ligand par GC-MS

RAYNAUD Cloé

DUT Génie Biologique, option Analyses Biochimiques et Biologiques

2014/2016

Stage du 18 Avril au 25 Juin 2016

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RAYNAUD Cloé

DUT Génie Biologique, option Analyses Biochimiques et Biologiques

2014/2016

Stage du 18 Avril au 25 Juin 2016

_____________________________________________________________________

___________________________________________________________________

Développement d’une méthode de purification

non dénaturante de la protéine Fel d 1, en vue

de l’identification de son possible ligand par

GC-MS _____________________________________________________________________

___________________________________________________________________

Maître de stage : Dr Cécile Bienboire-Frosini

IRSEA

Département des Mécanismes Physiologiques et Comportementaux de l’Adaptation

Quartier Salignan, Le Chêne, 84400 Apt

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Remerciements

Je tiens à remercier toutes les personnes qui ont contribué au succès de mon stage et qui

m’ont aidée lors de la rédaction de ce rapport.

Tout d’abord, je souhaite remercier Messieurs Pageat, De Leyssac et Cozzi pour avoir

accepté ma candidature pour ce stage à l’IRSEA.

Je remercie aussi vivement mon maître de stage Docteur Cécile Bienboire-Frosini, chef

du département Mécanismes Physiologique et Comportementaux de l’Adaptation, pour

son accueil et le partage de son expertise au quotidien. Grâce aussi à sa confiance, j’ai

pu m’accomplir totalement dans les différentes manipulations.

Je souhaite également remercier Camille Chabaud, technicienne de laboratoire du

département Mécanismes Physiologiques et Comportementaux de l’Adaptation, pour

son accueil chaleureux, le temps passé ensemble, sa patience pour m’expliquer certaines

manipulations et tous les conseils donnés durant mon stage.

Enfin je remercie toute l’équipe du département Mécanismes Physiologique et

Comportementaux de l’Adaptation et plus généralement toute l’équipe de l’IRSEA pour

son accueil chaleureux, leur partage de connaissance et les moments passés ensemble.

Page 5: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

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Table des matières

REMERCIEMENTS ............................................................................................................................................ 3

PRESENTATION DE L’ENTREPRISE .................................................................................................. 5

INTRODUCTION ...................................................................................................................................... 7

MATERIEL ET METHODES .................................................................................................................. 9

III.1 PRELEVEMENTS DES ECHANTILLONS DE FEL D 1 ......................................................................................... 9 III.1.1 Anesthésie des animaux ..................................................................................................................... 9 III.1.2 Lavage global du corps (‘Body wash like’ = BWL) ........................................................................... 9 III.1.3 Sacs anaux (SA) ............................................................................................................................... 10

III.2 EXTRACTION DE FEL D 1 DES ECHANTILLONS DE CHAT ............................................................................. 10 III.3 DOSAGE DE FEL D 1 DANS LES ECHANTILLONS PAR LA METHODE ELISA ................................................. 11 III.4 DOSAGE DES PROTEINES TOTALES PAR LA METHODE AU BCA .................................................................. 12 III.5 ÉLECTROPHORESE SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE (PAGE) ...................................................................... 13

III.5.1 Le Western Blot (immunotransfert).................................................................................................. 14 III.5.2 La coloration à l’Imperial Protein Stain ......................................................................................... 15

III.6 DEVELOPPEMENT DE L’IMMUNOPURIFICATION ......................................................................................... 16 III.6.1 Première immunopurification .......................................................................................................... 17 III.6.2 Deuxième immunopurification ......................................................................................................... 18

RESULTATS ............................................................................................................................................ 19

IV.1 DOSAGES .................................................................................................................................................. 19 IV.2 ÉLECTROPHORESES SUR GELS DE POLYACRYLAMIDE ................................................................................ 20 IV.3 LES IMMUNOPURIFICATIONS ..................................................................................................................... 22

DISCUSSION ............................................................................................................................................ 26

CONCLUSION ......................................................................................................................................... 28

LISTE DES ANNEXES ............................................................................................................................ 29

BIBLIOGRAPHIE .............................................................................................................................. 41

Page 6: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

5

Présentation de l’entreprise

L’Institut de Recherche en Sémiochimie et Ethologie Appliquée (IRSEA) est un

laboratoire de recherche et développement spécialisé dans le domaine de la

communication chimique au sein du monde vivant. Cet institut existe depuis 1995 mais

sous le nom Phérosynthèse jusqu’en 2010, où il devient l’IRSEA.

Cette entreprise est un établissement privé dédié à l’étude et à la compréhension des

mécanismes du comportement des animaux et de l’homme, de leurs interactions et

particulièrement de leur communication chimique afin de développer des méthodes

permettant une amélioration de la gestion des comportements, des interactions et du

bien-être.

L’identification de signaux chimiques intervenant dans la vie des animaux permet de

mettre au point de nouveaux outils thérapeutiques et zootechniques, respectueux de

l’homme, de l’animal et de l’environnement.

L’IRSEA utilise donc la sémiochimie afin d’interagir avec le monde du vivant en

utilisant ses codes, plutôt qu’en cherchant à le plier à nos exigences.

L’entreprise a développé différents produits pour divers animaux afin d’améliorer leur

bien-être et leur communication. Le produit phare de l’institut est Feliway® qui est une

reproduction synthétique de la phéromone faciale F3 et aide les chats à faire face aux

changements de leur environnement et aux situations stressantes en limitant le marquage

urinaire. Dans la même gamme, deux autres produits ont été développés pour les chats :

Feliscratch® qui favorise le comportement de griffade du chat et Felifriend® qui améliore

la cohabitation entre chat.

Dans le même esprit, l’IRSEA a créé des produits visant les chiens et les chevaux avec

respectivement Adaptil® qui, grâce à la réplication synthétique de la Dog Appeasing

Pheromone, diminue les comportements de stress et de peur chez le chien et

Equanimity® qui limite l’anxiété des chevaux lors des transports

Page 7: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

6

Page 8: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

7

Introduction

Le chat domestique est l’une des causes les plus fréquentes d’allergies chez l’enfant et

l’adulte provoquant notamment des manifestations respiratoires telles que des rhinites

allergiques ou bien de l’asthme bronchique. Ces allergies sont dues à l’hypersensibilité

des personnes à la protéine Fel d 1 produite par les glandes sébacées, salivaires,

lacrymales et anales et qui se propage sur le pelage du chat [1], [2], [3], [4]. Cette

protéine est l’allergène majeur du chat capable d’induire la production d’IgE spécifiques

chez 85 à 95% des patients sensibilisés [5], [6], [7]. Les principales sources de sécrétion

de Fel d 1 sont : la peau, le pelage et les sacs anaux.

Fel d 1 est une glycoprotéine tétramérique d’environ 35-40 kDa qui appartient à la

famille des sécrétoglobines. Ce tétramère est formée de deux hétérodimères non-

covalents capable de lier des ions calciums, qui peuvent aider à la stabilisation de la

forme tétramérique [8]. Chaque hétérodimère possède deux chaînes polypeptidiques ; la

chaîne 1 constituée de 70 acides aminés et la chaîne 2 qui est, elle, constituée de 90-92

acides aminés et d’un sucre, le N-glycane. Ces dernières sont reliées par 3 ponts

disulfures et ont respectivement un poids moléculaire de 7 et 10 kDa (sans le N-glycane)

[9].

Le polymorphisme structural de cet allergène a été démontré par plusieurs études [10],

[11], [12], [13]. En particulier, une forme dimérique tronquée (14-16 kDa) est

majoritairement présente dans les sacs anaux alors que la forme dimérique intacte (20-

22 kDa) est présente en majorité sur la peau et le pelage [14], ainsi que dans la poussière

de maison [15].

La protéine est amphiphile, ce qui veut dire qu’elle possède une partie hydrophile

associé à une partie hydrophobe. Elle est également globulaire et le dimère a une forme

de boomerang avec une cavité majeure hydrophobe capable de lier un ligand et deux

cavités secondaires [16] (cf. Figure 1). Des études in silico ont proposé que les cavités

de Fel d 1 pouvaient interagir avec des ligands de la famille des stéroïdes [3].

Page 9: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

8

Figure 1 : Représentation in silico de la protéine Fel d 1

(Source : Cécile Bienboire-Frosini, Caractérisation du polymorphisme structural et fonctionnel de

l’allergène majeur du chat, Fel d1, 2009)

Les récentes découvertes laissent supposer que Fel d 1 pourrait être une protéine de

liaison (Pheromone Binding Protein, PBP) [17], en particulier pour une ou des

phéromone(s), et pourrait alors éventuellement avoir une implication dans la

communication chimique. Afin de vérifier cette hypothèse, nous allons chercher à

identifier le ligand endogène porté par Fel d 1 en testant et développant une méthode

d’immunopurification en conditions non dénaturantes, tout en suivant l’intégrité et la

pureté des protéines obtenues par électrophorèse native et dénaturante. Une fois la

protéine native purifiée, le but sera d’extraire son ligand par une extraction

Méthanol/Chloroforme, puis de réaliser son identification par GC-MS1.

Je vous présenterais dans un premier temps les prélèvements réalisés, la caractérisation

biochimiques initiale des prélèvements en termes quantitatifs (ELISA Fel d 1) et

qualitatif (dosage des protéines totales et électrophorèse), et les tests de plusieurs

méthodes d’immunopurification, puis je vous exposerais les résultats des principales

manipulations et je finirais par discuter de ces résultats et des perspectives possibles.

1 Chromatographie Gazeuse – Spectrométrie de Masse

Cavité

secondaire

Cavité

secondaire

Cavité

majeure

Page 10: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

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Matériel et méthodes

III.1 Prélèvements des échantillons de Fel d 1

Pour la réalisation de la manipulation, nous avons prélevé les échantillons de Fel d 1 sur

quatre femelles entières, toutes venant de la population de chat de l’IRSEA.

Les prélèvements ont été réalisé à deux endroits différents :

o Le flanc et la joue du chat = Lavage globale du corps

o Les sacs anaux

III.1.1 Anesthésie des animaux

Avant de réaliser le prélèvement de Fel d 1, il a été nécessaire d’anesthésier les chats.

Pour cela, la vétérinaire a procédé à une injection intramusculaire, au niveau de la cuisse,

de trois molécules anesthésiques mélangées dans une même seringue. Le dosage par

chat des molécules fut le suivant :

o Butophanol (Dolorex®) : 1 mg 0.1 ml

o Médétomidina (Domitor®) : 160µg 0.2 ml

o Kétamine (Kétamine 1000®) : 10 mg 0.1 ml

L’anesthésie a pris effet au bout d’environ 5-10 min. A la fin des prélèvements, la

vétérinaire a injecté une molécule antagoniste à la Métédomidina pour permettre aux

chats de se réveiller plus rapidement, l’Atipamezole (Antisedan®). La vétérinaire a

injecté un volume inférieur de moitié au Domitor®, soit 0.1 ml.

III.1.2 Lavage global du corps (‘Body wash like’ = BWL)

Pour récupérer les molécules de Fel d 1 à la surface du corps du chat, un flanc a été

humidifié avec 10 ml de solution de lavage (solution d’antiprotéases à base de cocktail

antiprotéases fourni par Sigma et dilué dans l’eau ultrapure selon les recommandations

du fabricant). Puis on a frotté et frictionné toute la surface du flanc avec une compresse

stérile que l’on a préalablement humidifié avec 2 ml de solution de lavage. La zone de

la joue peut également être particulièrement frottée, notamment après l’avoir pressée

pour induire le relargage du contenu des glandes sébacées (en effet, la zone de la joue

en est particulièrement riche). La compresse et les poils récupérés suite à la friction ont

ensuite été collectés dans un pot stérile pour échantillon. Le pot fut ensuite identifié avec

le nom du chat, la date du prélèvement, la nature de l’échantillon, la masse du pot vide.

Page 11: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

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III.1.3 Sacs anaux (SA)

Ce type d’échantillon est récupéré après le lavage global du chat et avoir changé de gants

pour éviter toute contamination des échantillons.

Le contenu de chaque sac anal a été récupéré par une pression manuelle bilatérale des

glandes et collecté dans un tube eppendorf LoBind Protein de 5 ml. Le tube a été

identifié avec le nom du chat, la date du prélèvement, la nature de l’échantillon, la masse

du tube vide.

Pour chaque type de prélèvement, le contenant a ensuite été pesé avec les échantillons

qu’il contenait puis le poids fut noté sur le pot ou le tube.

Figure 2 : Échantillons récupérés

(Source : Photo personnelle)

III.2 Extraction de Fel d 1 des échantillons de chat

Un volume de solution de lavage a été ajouté dans les tubes/pots contenant les

échantillons selon le protocole suivant :

o 6 ml pour 1 g de poils et de compresse récolté

o 5 ml pour 1g de sécrétion de sac anal.

Par exemple pour les prélèvements du chat Écaille (pour les autres chats cf. annexe 1) :

- VBWL = 24,45 ml pour mBWL = 5,49 g

- VSA = 1.02 ml pour mSA = 0.17 g

Ensuite les échantillons ont été longuement vortexés et incubés toute la nuit à

température ambiante sous une légère agitation.

Le jour suivant, le liquide obtenu des échantillons extraits a été transvasé dans des tubes

en volume égaux. Ils ont ensuite été centrifugés à 3000 g pendant 20 minutes à 4°C pour

retirer les poils et les contaminants, puis ils ont été aliquotés dans des microtubes de 2

ml et de nouveau centrifugés à 21 000g pendant 30 min pour ôter les derniers

Page 12: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

11

contaminants solides. Le surnageant de chaque tube a été ensuite divisé en au moins un

aliquot de 500 µl et plusieurs aliquots de 20 µl qui sont ensuite conservés à -20°C.

III.3 Dosage de Fel d 1 dans les échantillons par la méthode

ELISA

La technique ELISA2 est une technique immuno-enzymatique de détection qui permet

de visualiser une interaction antigène-anticorps grâce à une réaction colorée produite

par l’action sur un substrat d’une enzyme préalablement fixée sur l’anticorps (figure 3).

Le dosage ELISA peut se réaliser de deux manières :

o Compétitif

o Non compétitif (Type Sandwich)

Figure 3 : DAS ELISA ou ELISA Sandwich

(Source : http://www.technobio.fr)

La DAS3 ELISA est un dosage non compétitif, de type sandwich. L’antigène se trouve entre deux

anticorps spécifiques : un de capture et un de détection (dans notre cas, 6F9 et 3E4). Cette méthode

nécessite donc que l’antigène possède deux épitopes différents, permettant la fixation des deux

anticorps distincts.

Le dosage de la concentration en Fel d 1 de nos échantillons s’est réalisé avec un kit

commercial ELISA de Indoor Biotechnologies. Pour notre manipulation nous avons

effectué des dilutions en triplicat pour les échantillons et duplicat pour la gamme étalon

(cf. annexe 2), puis suivi ensuite le protocole du fournisseur (cf. annexe 3).

2 Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay 3 Double Antibody Sandwich

Page 13: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

12

Figure 4 : Plaque ELISA pour le dosage de Fel d 1

(Source : Photo Personnelle)

L’image ci-dessus représente le résultat du dosage de Fel d 1 des sacs anaux des femelles. Les blancs

sont réalisés dans les puis A11/12 et B11/12. Les puits de A1 à B10 contiennent la gamme étalon ; Les

échantillons se trouvent dans les puits de C1 à G12.

III.4 Dosage des protéines totales par la méthode au BCA4

La méthode au BCA est basée sur la conversion du Cu 2+ en Cu1+ dans un environnement

alcalin. Un produit de couleur pourpre est formé par la chélation de deux molécules de

BCA avec l’ion cuivreux Cu1+. Ce complexe soluble dans l’eau présente une forte

absorbance à 562 nm. (Figure 5)

Figure 5 : Schéma de principe du dosage au BCA

(Source : IRSEA)

Cette dernière est directement proportionnelle à la quantité de protéine présente dans la

solution et peut-être estimée par comparaison avec une protéine standard telle que

l’albumine bovine sérique (BSA). La formation d’une couleur pourpre est due à la

structure macromoléculaire des protéines, le nombre de liaisons peptidiques et de la

présence de quatre acides aminés (cystine, cystéine, tryptophane et tyrosine) [12].

Pour notre manipulation, nous avons suivi le protocole du fournisseur du kit présenté en

annexe 4.

4 Acide Bicinchoninic

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Figure 6 : Plaque ELISA pour le dosage des protéines totales

(Source : Photo Personnelle)

L’image ci-dessus représente le résultat du dosage des protéines totales des sacs anaux des

femelles. Les puits A1 et B1 sont les blancs, ceux de C1 à B3 correspondent à la gamme étalon.

Les échantillons sont présents dans les puits C3 à B5.

III.5 Électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE)

L’électrophorèse (figure 7) est une technique de séparation et de caractérisation des

molécules. Elle consiste à soumettre un mélange de molécules à un champ électrique ce

qui entraine une migration des molécules chargées.

Pour nos manipulations, nous avons utilisé le gel de polyacrylamide qui permet de

séparer des macromolécules (protéines, ADN, etc.) en fonction de leurs charges, leurs

tailles et leurs encombrements stériques au sein d’un champ électrique constant et le

système X-Cell SureLock Mini-Cell (Invitrogen).

Il existe plusieurs types de conditions pour une électrophorèse sur gel (native,

dénaturante, réductrice etc.).

Figure 7 : Système d’électrophorèse (Source : Photo personnelle)

Page 15: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

14

En conditions dénaturantes on utilise des traitements qui suppriment les liaisons non-

covalentes des protéines et leur font perdre leur structure tridimensionnelle ou

conformation initiale, tels que des traitements à haute température et au SDS5. Ce dernier

est un détergent et tensioactif ionique fort, chargé négativement qui permet à la protéine

de prendre une forme déroulée et d’être chargée négativement.

Les conditions non dénaturantes ou natives, permettent la séparation des molécules

dans leur état le plus proche possible de leur état natif. Les étapes préalables permettant

l'obtention de la solution contenant les molécules à séparer, doivent éviter les conditions

dénaturantes citées précédemment.

Dans notre cas, les échantillons (50ng de Fel d 1/puit) ont été analysés sur des gels

NuPAGE® Bis-Tris 4-12% (conditions dénaturantes) et Novex® 4-20% Tris-Glycine

(conditions natives) en suivant les protocoles du fournisseur Thermo Fischer (cf.

annexes 5 et 6).

Pour la révélation des bandes de nos échantillons nous avons utilisé deux méthodes : le

Western blot pour la protéine Fel d 1 (50 ng/puits) et la coloration à l’Imperial Protein

Stain pour les protéines totales (1-2,5 µg/puit)

III.5.1 Le Western Blot (immunotransfert)

Après l’électrophorèse, les bandes de protéines séparées ont été transférées vers une

membrane de nitrocellulose. Les protéines adhèrent à la membrane de la même manière

qu'elles ont été séparées en raison des interactions entre les charges. Les protéines de cet

immunotransfert ont ensuite été liées par liaison à un anticorps spécifique (anticorps

primaire) pour permettre leur identification. L’anticorps primaire est un anticorps

monoclonal de souris de type IgG et est lui-même révélé par un anticorps secondaire

anti-IgG de souris couplée à une enzyme qui transformera un substrat en produit coloré,

permettant la visualisation des bandes protéiques spécifiques.

Ce transfert se fait grâce au module XCell II Blot Module Invitrogen. Les éponges, la

membrane et les papiers filtres ont été imbibé dans du tampon de transfert contenant 35

ml de NuPAGE® Transfert Buffer (20X), 70 ml de méthanol et 595 ml d’eau ultra pure

pour les gels Bis-Tris et 28 ml de Novex® Tris-Glycine Transfert Buffer (25X), 140 ml

de méthanol et 532 ml d’eau ultra pure pour les gels Tris-Glycine. Ensuite nous avons

suivi la mise en place présentée figure 8 puis rempli la chambre d’électrophorèse d’eau

ultrapure et le boîtier contenant la membrane, de tampon de transfert.

5 Sodium Dodecyl Sulphate

Page 16: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

15

Figure 8 : Ordre des différents composants pour le Western Blot

(Source : Thermo Fischer)

Les conditions du Western Blot sont les suivantes :

Conditions Dénaturantes Conditions Natives

Tampon NuPAGE® Transfer Buffer

(20X)

Novex® Tris Glycine

(25X)

Volt (V) 30 25

Ampère (mA) 300 300

Temps 1h 2h30

Après le transfert, la révélation se fait à l’aide du kit de coloration WesternBreeze

Chromogenic Immunodetection (Invitrogen). Nous avons suivi le protocole du

fournisseur (cf. annexe 7) légèrement modifié en utilisant comme solution de saturation

du BSA 1%, PBS6-Tween 0,05% à la place de la « Blocking solution » fourni par le kit

et comme anticorps primaire, l’anticorps 6F9 dilué au 1/1000e [17]. Nous avons aussi

ajouté 7 ml de Substrat Chromogenic au lieu des 5 ml préconisés pour mieux immerger

la membrane.

III.5.2 La coloration à l’Imperial Protein Stain

L’Imperial Protein Stain (Thermo Fischer) est un réactif coloré à base de Bleu de

Coomassie mais ayant une meilleure sensibilité (jusqu’à 3 ng), permettant la coloration

spécifique des protéines sur gels de polyacrylamide.

Avant de réaliser la coloration, nous avons lavé le gel plusieurs fois dans de l’eau ultra

pure (entre 100 et 200 ml), puis exécuté la coloration en ajoutant 20 ml du réactif.

Cependant les temps de coloration et de décoloration varient en fonction de la sensibilité

recherché.

6 Phosphate Buffer Saline

Page 17: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

16

Sensibilité en ng Temps de coloration Temps de lavage

≤ 3 2 heures Sur la nuit

3-6 1 heure 1-2 heures

6-12 5-10 minutes 3 x 5 minutes

Dans notre cas, nous recherchions une sensibilité inférieure à 3 ng afin de détecter toutes

les possibles bandes protéiques autres que Fel d 1 et d’évaluer correctement le degré de

contamination des échantillons. C’est pourquoi nous avons effectué une coloration sur

2 heures et une décoloration sur la nuit. Toutefois, selon l’intensité des bandes sur le gel

après la décoloration, il était possible de réitérer une coloration de 2 heures suivie par

une décoloration d’1 heure.

III.6 Développement de l’immunopurification

Cette étape est basée sur le principe de la chromatographie d’affinité, la séparation des

molécules va se faire selon leur capacité à se lier à un ligand spécifique fixé sur une

résine (figure 9). Dans notre cas, les colonnes utilisées contiennent des billes d’agarose

couplées à la protéine A que l’on utilise ensuite pour fixer un anticorps spécifique de

Fel d 1, 6F9, dans un premier temps, puis Fel d 1.

Figure 9 : Schéma de principe d'une

chromatographie d'affinité

(Source : http://planet-vie.ens.fr/content/la-

chromatographie)

Page 18: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

17

III.6.1 Première immunopurification

Nous avons réalisé cette immunopurification en utilisant comme tampon de liaison celui

du kit Gentle Ag/Ab Binding & Elution de ThermoScientific qui est à un pH de 8,0.

Cette manipulation s’est déroulée en plusieurs étapes.

Dans un premier temps, on a préparé la colonne NAb Protein A Spin (ThermoScientific)

avec des Ac7 6F9 en ajoutant 2 ml de la solution d’anticorps, préalablement diluée dans

du tampon de liaison (Protein A Binding Buffer, ThermoScientific), dans la colonne

après avoir l’avoir équilibré, avec le même tampon de liaison, et centrifugé 1 min à 1000

g. On a incubé avec retournement pendant 10 minutes, puis centrifugé à nouveau 1 min

à 1000g. Une fois la centrifugation terminée, nous avons récupéré le liquide sorti et lavé

la colonne.

Dans un second temps, on a réalisé l’interaction Ag8 Fel d 1 – Ac 6F9. Pour cela, on a

lavé et équilibré la colonne avec un autre tampon de liaison (Gentle Ag/Ab Binding

Buffer, ThermoScientific), puis ajouté à la colonne l’échantillon à purifier, auparavant

dilué dans du tampon de liaison, de façon à déposer 20 µg de Fel d 1. On a incubé

pendant 1h sous agitation basculante, lavé la colonne et procédé à l’élution douce en

ajoutant cinq fois 2 ml de Gentle Ag/Ab Elution Buffer (ThermoScientific) et en

centrifugeant 1 min à 1000g à chaque fois.

Cette étape nous a permis de récupérer au total 5 fractions de 2 ml de notre échantillon

ainsi que le liquide récupéré après le couplage Ag/Ac et les lavages.

Étant donné la forte concentration ionique du tampon d’élution, nous avons ensuite

réalisé le dessalage des échantillons afin de pouvoir effectuer par la suite une

électrophorèse en conditions dénaturantes pour analyser les fractions obtenues. Pour

cette étape, nous avons utilisé des colonnes de dessalages Zeba Spin Desalting 7 K

MWCO (ThermoScientific) de 10 ml que nous avons équilibré trois fois avec de l’eau

ultrapure. Après cela, nous avons pu réaliser le dessalage des échantillons en ajoutant 2

ml de ces derniers et en centrifugeant trois fois 1 min à 1000g. Il est nécessaire de

récupérer le liquide après chaque centrifugation et pour chaque fraction.

7 Anticorps 8 Antigènes

Page 19: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

18

III.6.2 Deuxième immunopurification

Pour cette autre immunopurification, le protocole est le même que précédemment mais

cette fois ci nous avons utilisé comme tampon de liaison du TBS9 pH 7,2 - 7,4 et incubé

une nuit à température ambiante l’Ag Fel d 1 avec l’Ac 6F9 immobilisé sur les billes

d’agarose de la même colonne d’immunopurification utilisée ci-dessus. Pour des raisons

pratiques, des colonnes de dessalage Zeba Spin Desalting 7K MWCO

(ThermoScientific) de 5 ml ont été utilisés dans ce cas.

Pour vérifier la réussite des immunopurifications, nous avons réalisé des électrophorèses

en conditions dénaturantes, puis des révélations par coloration à l’Imperial Protein Stain.

Lors des électrophorèses, nous avons déposé pour chaque gel, 15 µl du marqueur de

taille SeeBlue Plus Pre-Stained (Thermo Fisher) dans les puits 1 et 8. Ensuite nous avons

déposé dans le puit 2 du gel 1, l’échantillon « brut » donc sans immunopurification, du

lavage global du chat Elvira, puis dans les puits 3 à 7, les fractions F1 à F5 récupérées

après l’immunopurification.

Sur le gel 2, nous avons déposé le marqueur de taille et l’échantillon « brut » dans le

même ordre et sous les mêmes volumes. A la place des fractions F1 à F5, nous avons

déposé dans les puits 3 à 7, l’éluat du couplage Ag Fd1 – Ac 6F9, appelé C1, puis les

éluats des quatre lavages réalisés après l’ajout de l’échantillon (L1 à L4) (cf. annexe 8)

Les échantillons ont été déposé sous un volume de 32 µl en suivant les proportions

suivantes :

Échantillon (µl) 24 / 18,2

Tampon LDS Running Buffer (4X) (µl) 8 / 8

Eau ultra-pure (µl) 0 / 5,8

Volume total (µl) 32 / 32

(En bleu, sont représentés les volumes pour l’échantillon de BWL brut)

9 Tris Buffer Saline

Page 20: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

19

Résultats

IV.1 Dosages

Les résultats des dosages (cf. figure 10), nous indique que la protéine Fel d 1 est présente

en plus grande concentration dans les sacs anaux (AS) que dans les lavages globaux

(BWL), ce qui correspond à ce qui était attendu.

Ces résultats nous montrent aussi que dans les sacs anaux, il y a une plus grande quantité

de protéines autres que Fel d 1 que dans les lavages globaux.

Figure 10 : Résultats des dosages de Fel d 1 et des protéines totales

(Source : Photo Personnelle)

Suite à ces résultats, nous nous sommes intéressés au ratio entre Fel d 1 et les protéines

totales. Nous avons pu observer un ratio similaire pour les sacs anaux des chats Elvira

et Edelweiss. Toutefois, cette similarité n’était pas le cas avec le chat Ecaille.

Cette disparité de ratio se retrouve aussi au niveau des lavages globaux. En effet, on peut

observer un très grand ratio Fel d 1/Protéines totales pour le chat Elvira mais un ratio

faible pour le chat Perle.

Pour tous les chats, la quantité de Fel d 1 par rapport à celle de protéines totales est plus

importante dans les lavages globaux (hormis Perle pour laquelle la donnée est

manquante pour le ratio dans les sacs anaux)

Chats AS Ecart-type BWL Ecart-type AS Ecart-type BWL Ecart-type

Elvira 19,1 ± 3,1 12,5 ± 0,1 1099,7 ± 18,0 137,5 ± 11,3

Edelweiss 20,8 ± 3,2 3,2 / 1453,3 ± 42,9 131,9 /

Ecaille 12,7 ± 1,0 8,2 ± 0,2 1629,8 ± 20,6 163 ± 4,4

Perle / / 0,5 ± 0,04 2260,3 / 77,5 ± 3,4

Chats AS BWL

Elvira 1,7 9,1

Edelweiss 1,4 2,4

Ecaille 0,8 5

Perle / 0,6

Ration Fd1/Protéines

Totales

Dosages

Fel d1 Protéines totales

Concentration (µg/ml) Concentration (µg/ml)

/< au seuil de détection du kit, calculé en prenant en compte le facteur de

dilution

Page 21: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

20

IV.2 Électrophorèses sur gels de polyacrylamide

Les résultats présentés correspondent à l’électrophorèse réalisée en conditions

dénaturantes pour permettre une meilleure visualisation des bandes protéiques.

La figure 11 présente la caractérisation protéique des échantillons dans les lavages

globaux (puits 2 à 5) et les sacs anaux (puits 7 à 10) après une électrophorèse en

conditions dénaturantes et une coloration à l’Impérial Protein Stain (Thermo Fischer).

Les puits 1 et 6 contenaient le marqueur de taille SeeBlue Plus PreStained (Thermo

Fischer).

Figure 11 : Gel d’électrophorèse des échantillons

de sacs anaux et lavages globaux des 4 femelles entières

(Source : Photo Personnelle)

Cette caractérisation nous a permis d’observer des bandes à différents poids moléculaire.

Dans les puits 2 et 4, on peut constater la présence d’une bande diffuse autour de 20 kDa

ce qui correspond à la taille attendue de la forme dimérique intacte de Fel d 1.

Dans les puits 3 on distingue la présence d’une bande autour de 28 kDa ce qui concorde

avec la taille de la forme tétramérique tronquée de Fel d 1.

On retrouve cette bande dans les puits 7, 8, 9 et 10 mais on remarque aussi la présence

d’une bande légèrement inférieure à 14 kDa ce qui coïncide avec la forme dimérique

tronquée de Fel d 1. Cette bande est aussi présente dans le puit 5 ainsi qu’une bande

légèrement inférieure à 28 kDa. Cette dernière correspond à une autre forme

tétramérique tronquée de Fel d 1.

kDa

198

62

49

38

28

18

14

6

3

Page 22: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

21

Figure 12 : Électrophorèse des échantillons de sacs anaux

et de lavages globaux des 4 femelles entières

(Source : Photo Personnelle)

La figure 12 présente la caractérisation protéique des échantillons dans les lavages

globaux (puits 2 à 5) et les sacs anaux (puits 7 à 10) après une électrophorèse en

conditions natives et un WesternBlot. Les puits 1 et 6 contiennent un échantillon de Fel

d 1 purifié (20 kDa) (ThermoFischer).

Sur ce WesternBlot on peut constater la présence d’une bande de 20 kDa dans les puits

2 et 4 qui correspond à la forme dimérique intacte de Fel d 1. Dans le puit 3 on remarque

une bande diffuse proche de 28 kDa qui coïncide avec le tétramère tronquée de Fel d 1.

Dans les puits 7 à 10 on aperçoit une bande inférieure à 20 kDa qui peut coïncider avec

la taille du dimère tronquée (14 kDa). On observe dans les puits 7,8 et 10, une bande

supérieure à 20 kDa et à la même hauteur que celle du puit 3 qui correspond à la forme

tétramérique tronquée de Fel d 1.

Figure 13 : WesternBlot des échantillons de sacs anaux et

de lavages globaux des 4 femelles entières

(Source : Photo Personnelle)

kDa

62

49

38

28

18

14

Page 23: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

22

La figure 13 présente la révélation par WesternBlot de l’électrophorèse en conditions

dénaturantes des échantillons. La contenance des puits et l’ordre est identique à la figure

11.

Ici on peut constater la présence d’une bande diffuse autour de 20 kDa pour les puits 2

à 5 donc la présence de la forme dimérique intacte de Fel d 1 dans les lavages globaux.

On aperçoit aussi une bande diffuse autour de 38 kDa dans les puits 2 à 4, qui coïncide

avec la forme tétramérique intacte de la protéine.

Dans les puits 7 à 10, on voit apparaître une bande autour de 28 kDa qui correspond à

la forme tétramérique tronquée de Fel d 1, ainsi qu’une autre bande autour de 14 kDa

qui concorde avec la forme dimérique tronquée de la glycoprotéine.

Dans le puit 10 on discerne une bande autour de 38 kDa. Cette taille est celle de la forme

tétramérique intacte de la protéine d’intérêt.

IV.3 Les immunopurifications

Les résultats des électrophorèses après immunopurification sont présentés figures 14 et

15.

Sur la figure 14 on peut voir la présence d’une bande dans le puit 2 (BWL brut Elvira)

autour de 20 kDa. Cette taille, qui est identique à celles retrouvées lors de

l’électrophorèse en conditions dénaturantes, correspond à celle de la protéine Fel d 1

présente sous sa forme dimérique intacte sur la peau et le pelage [10]. On remarque aussi

l’absence totale de cette bande dans les puits 3 à 7 qui correspondent aux 5 fractions

récupérées.

Figure 14 : Gel 1 d’électrophorèse des fractions

récupérés en condition dénaturante après l’immunopurification de l’échantillon du lavage

global du chat Elvira

kDa

198

62

49

38

28

18

14

6

3

Page 24: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

23

(Source : Photo Personnelle)

Sur le gel présenté à la figure 15, la bande autour de 20 kDa apparaît cette fois dans le

puit 2 mais aussi dans le puit 3. La protéine Fel d 1 est donc présente dans le couplage

Ag/Ac (C1). Par conséquent, cela indique qu’il y a un problème de fixation soit Ac

6F9/Ag Fd1, soit Protéine A/Ac 6F9.

Figure 15 : Gel 2 d’électrophorèse du couplage Ac/Ag et des lavages en conditions dénaturantes

(Source : Photo Personnelle)

Par la suite, nous avons mesuré la DO10 à 280 nm de l’éluat récupérer après le couplage

Protéine A/ Ac 6F9. La concentration en protéine étant nulle dans l’échantillon, on peut

affirmer que le couplage Protéine A/Ac 6F9 s’est bien réalisé.

Tout au long des immunopurifications, nous avons réalisé des dosages

spectrophotométriques à 280 nm de chaque échantillon récupéré à chaque étape des

immunopurifications afin d’évaluer la présence de protéines (Ac, Fel d 1 ou

contaminants) dans ceux-ci :

10 Densité Optique

kDa

198

62

49

38

28

18

14

6

3

Page 25: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

24

Tableau 1 : DO et concentration des différents volumes récupéré lors des immunopurifications

(Source : Tableau personnel)

Les résultats (Tableau 1) nous permettent de voir que la concentration protéique la plus

significative se trouve à chaque fois au niveau de l’étape de couplage Ag/Ac (C1) et

aussi au premier lavage (L1) lors de l’immunopurification.

Afin de déterminer la nature des protéines retrouvées dans les échantillons à chaque

étape de l’immunopurification, la réalisation de WesternBlot pour les deux

immunopurifications a été nécessaire pour confirmer l’absence/présence de Fel d 1 dans

les différentes fractions de couplage, lavage et éluat.

Echantillon N° Sample DO 280 nm Concentration

(µg/ml)

C1 24/05 1 0,356 0,485

L1 24/05 2 0,093 0,179

L2 24/05 3 0,042 0,083

L3 24/05 4 0,043 0,067

L4 24/05 5 0,093 0,081

F1 24/05 6 0,034 0,077

F2 24/05 7 0,044 0,091

F3 24/05 8 0,034 0,075

F4 24/05 9 0,043 0,089

F5 24/05 10 0,034 0,069

C1 08/06 11 0,16 0,202

L1 08/06 12 0,056 0,076

L2 08/06 13 0,026 0,043

L3 08/06 14 0,022 0,011

F1 08/06 15 0,034 0,041

F2 08/06 16 0,084 0,082

F3 05/06 17 0,028 0

F4 08/06 18 0,031 0,037

F5 08/06 19 0,032 0,053

F'6 08/06 20 0,021 0,022

F'7 08/06 21 0,032 0,044

F'8 08/06 22 0,045 0,051

Page 26: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

25

Figure 16 : WesternBlot de la 1ère immuno- Figure 17 : WesternBlot de la 2nd

-purification immunopurification

(Source : Photo Personnelle) (Source : Photo Personnelle)

Pour le Western Blot de la 1ère immunopurification présenté figure 16, le puit 1 contient

le marqueur de taille. Du puit 2 à 5, il y a l’échantillon récupéré après le couplage Ag/Ac

et les trois lavages. Du puit 6 à 10, il y a les 5 fractions d’élution.

Sur cette image, on peut constater la présence d’une bande autour de 20 kDa dans les

puits 2 à 5 avec une intensité qui diminue au fur et à mesure. Il y a donc la protéine Fel

d 1 dans le couplage et les lavages. On peut aussi voir une bande très intense autour de

200 kDa dans le puit 2 et qui s’éteint au fur et à mesure des puits pour ensuite disparaître

dans les puits 3 à 5. Cette bande correspond surement à l’anticorps 6F9. Toujours dans

le puit 2, on remarque une bande autour de 40 kDa qui correspond à la forme

tétramérique intacte de la protéine.

Pour le Western Blot de la 2ème immunopurifcation (figure 17), les puits 1 à 4

contiennent le couplage Ag/Ac et les lavages. Les puits 7 à 10 contiennent les 5

fractions. Le marqueur de taille est au puit 6.

Sur ce Blot, on peut toujours voir la bande à 20 kDa et celle à 40 kDa dans le couplage

et les lavages. L’antigène de Fel d 1 ne s’est donc toujours pas lié à l’anticorps sur la

colonne. On remarque cependant, l’absence de la bande autour de 190 kDa et donc

probablement de l’anticorps 6F9.

kDa

198

62

49

38

28

18

14

Page 27: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

26

Discussion

La fonction biologique de Fel d 1 et son éventuel rôle dans la communication chimique

des chats n’étant pas encore identifier, ce sujet avait donc pour but de développer une

méthode d’immunopurification non dénaturante afin d’obtenir la protéine pure avec sa

conformation intacte et ainsi permettre l’extraction spécifique et l’identification de son

hypothétique ligand. Ce travail préalable est nécessaire au développement de stratégies

de limitation de la production ou de l’allergénicité de cette molécule.

Les résultats des différents dosages nous confirment la présence de Fel d 1 dans les

échantillons en plus ou moins grandes quantités selon le type d’échantillons. Il a donc

été nécessaire de réaliser des électrophorèses, dans des conditions différentes, pour

déterminer la forme de la protéine présente dans les échantillons. Pour cela nous avons

donc réalisé des électrophorèses en conditions dénaturantes (haute température et SDS)

pour mieux déterminer les différentes formes de Fel d 1, puis, voulant développer une

méthode d’immunopurification non dénaturante, des électrophorèses en conditions

natives, c’est-à-dire sans facteurs dénaturants.

Les résultats nous indiquent qu’il y a, dans les échantillons, différentes formes de la

protéine d’intérêt et que ces formes ne sont pas identiques selon si la protéine se trouve

dans les sacs anaux (tétramères et dimères tronqués) ou bien dans les lavages globaux

(tétramères et dimères intacts) comme l’indiquent les figures 11 et 13. Cependant on

retrouve aussi des formes tronquées dans les lavages globaux ce qui montre bien que les

formes de Fel d 1 ne sont pas établies à chaque échantillon.

La troncation de Fel d 1 dans les sacs anaux est probablement due à la présence de

différentes protéases [14] dans le contenu des sacs anaux qui provoqueraient une

dégradation protéolytique.

Après cette validation de la présence de Fel d 1 dans les échantillons et la caractérisation

de leurs degrés de contamination, la partie sur le développement d’une méthode

d’immunopurification a débuté. Nous avons dans un premier temps réalisé une

immunopurification en suivant le protocole et les tampons du kit ThermoScientific

utilisé, dont le Gentle Ag/Ab Binding Buffer à pH 8,0. Les résultats des électrophorèses,

présentés figures 14 et 15, nous ont démontré l’absence total de Fel d 1 dans les fractions

récupérées après l’élution et une présence de la protéine dans le couplage Ag/Ac. Cette

absence significative de Fel d 1 dans les fractions peut venir de deux problèmes :

- Un mauvais couplage Protéine A/ Ac 6F9

- Un mauvais couplage Ac 6F9/ Ag Fel d 1

Pour vérifier la première hypothèse, nous avons mesuré la DO de l’éluat récupérer après

le couplage Protéine A/Ac. Cette mesure nous a indiqué une concentration nulle, donc

une absence de protéine A dans l’éluat, ce qui signifie un bon couplage.

Page 28: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

27

La première hypothèse étant réfutée, nous avons donc réalisé une seconde

immunopurification mais cette fois-ci en changeant le temps d’incubation (une nuit au

lieu d’une heure) lors de l’ajout de la solution d’antigène (contenant l’échantillon) ainsi

que le tampon de liaison pour vérifier le couplage Ac/Ag.

Nous avons fait le choix d’utiliser du tampon TBS car son pH est équivalent (7,2-7,6) à

celui du tampon de liaison de l’ELISA dans lequel l’Ac 6F9 fonctionne bien.

L’incubation a été prolongée sur la nuit pour s’assurer d’atteindre l’équilibre de la

liaison Ag/Ac. Le résultat de cette deuxième immunopurification nous a présenté encore

une fois une absence totale de Fel d 1 dans les fractions et sa présence dans le couplage.

Le dosage spectrophotométrique de chaque fraction récupérée de chaque

immunopurification nous a démontré la présence de protéines dans les couplages Ag/Ac

et dans le premier lavage pour la première immunopurification. Pour connaître la nature

exacte de ces protéines (protéine A, Ac 6F9 ou protéine Fel d 1) nous avons donc réalisé

un Western Blot pour chaque immunopurification. Les résultats (figures 16 et 17) nous

ont clairement indiqué la présence de Fel d 1 dans l’échantillon C1 et les lavages, ainsi

que la présence d’anticorps dans le couplage et les lavages de la première

immunopurification.

Cela confirme donc bien la perte de l’antigène lors de l’étape de fixation Ag/Ac et des

lavages pour chaque immunopurification.

Ayant testé plusieurs conditions d’incubation (dont celles connues pour assurer la liaison

Ac 6F9/Ag Fel d 1 en ELISA), nous faisons l’hypothèse que cette perte est probablement

due au type de support solide utilisé. En effet, les billes d’agarose étant poreuses avec

des trous, la surface d’échange est très grande et la quantité d’Ac 6F9 appliquée n’a pas

permis de la recouvrir suffisamment. En conséquence, à cause du volume de fluide élevé

et de la surface insuffisante de fixation disponible, il est possible que l’antigène de Fel

d 1 n’ait peut-être pas pu rentrer en contact avec les anticorps et ainsi se fixer au support

solide, entraînant alors son élimination immédiatement après l’étape de fixation Ag/Ac

et lors des lavages.

Au vu des résultats obtenus, nous pouvons avoir comme perspective de poursuivre le

développement de cette méthode en changeant le type de de support solide de

l’immunopurification. Notamment, l’utilisation de billes magnétiques semble plus

judicieuse car les volumes de travail et les surfaces d’échanges sont plus petites et

favorise la probabilité de l’interaction Ag/Ac. Il suffit donc ensuite de retenir les billes

grâce à un aimant, de procéder au lavage en séparant les billes de la phase liquide dans

laquelle se trouve le matériel non retenu et ensuite éluer en remettant en suspension les

billes pour relâcher la protéine Fel d 1.

Page 29: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

28

Conclusion

Cette étude nous a permis de caractériser des échantillons biologiques contenant Fel d 1

qualitativement et quantitativement. Nous avons pu valider le fait que la protéine est

présente sous différentes formes selon les types d’échantillon étudiés (lavages globaux

ou sacs anaux) et déterminer son ratio par rapport aux protéines totales.

Ce projet nous a aussi permis d’éliminer une méthode d’immunopurification qui n’a pas

donné les résultats escomptés. En effet, lors des différentes immunopurifications, nous

avons perdu la protéine d’intérêt lors des couplages et des lavages, avant même d’avoir

passé le tampon d’élution. Après divers changement (tampon d’élution et temps

d’incubation) et vérification, nous avons conclu que le problème venait certainement du

type de support solide utilisé.

Comme dit précédemment, la suite des recherches concernant le développement d’une

méthode d’immunopurification va d’abord nécessiter d’un changement de support

solide en utilisant des billes magnétiques plutôt qu’un gel contenant des billes d’agarose.

Si cette technique ne permet toujours pas de récupérer la protéine Fel d 1, il faudra peut-

être alors changer de protéine de liaison et utiliser plutôt la protéine G qui a une

meilleure affinité pour les anticorps 6F9 qui sont des anticorps de souris. On peut

également envisager de changer éventuellement d’Ac anti-Fel d 1, bien que l’Ac 6F9

soit connu pour avoir une très forte affinité avec Fel d 1 [17].

A titre personnel, ce stage fût une très bonne expérience du travail de technicienne de

laboratoire en recherche. Cela m’a permis de voir quel était le travail attendu en

recherche, les avantages et inconvénients du métier. Cette expérience m’a ainsi permis

de confirmer mon envie de travailler dans la recherche pour participer aux découvertes

et développement de produits pouvant améliorer la vie des patients humains ou des

animaux.

Page 30: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

29

Liste des annexes

Annexe 1 : Résultats des prélèvements et de la remise en solution p. 30

Annexe 2 : Plan de plaque ELISA Fel d 1 p. 31

Annexe 3 : Protocole ELISA pour le dosage de Fel d 1 (Indoor Biotechnologies) p.32-

33

Annexe 4 : Protocole de dosage des protéines totales au BCA (ThermoFischer) p.34-

36

Annexe 5 : Protocole d’électrophorèse NuPAGE Bis-Tris 4-12% (ThermoFischer)

p.37

Annexe 6 : Protocole d’électrophorèse Novex 4-20% Tris-Glycine (ThermoFischer)

p. 38

Annexe 7 : Protocole de révélation des Westerns Blots (ThermoFischer) p. 39

Annexe 8 : Plan des gels des immunopurifications p.40

Page 31: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

30

Annexe 1 : Résultats des prélèvements et de la remise en solution

Femelles

Nom du

chat

Masse

BWL

(g)

Volume de solution de

lavage (ml)

Masse

SA (g)

Volume de solution de

lavage (ml)

Perle 4,82 24,1 0,4 2,4

Edelweiss 6,13 30,65 0,14 0,84

Elvira 5,42 27,1 0,18 1,08

Ecaille 5,49 24,45 0,17 1,02

Page 32: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

31

Annexe 2 : Plan de plaques ELISA Fel d 1

(Source : Photo Personnelle)

Page 33: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

32

Annexe 3 : Protocole ELISA pour le dosage de Fel d 1(Indoor

Biotechnologies)

Page 34: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

33

Page 35: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

34

Annexe 4 : Protocole de dosage des protéines totales au BCA

(Thermo Fisher)

Page 36: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

35

Page 37: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

36

Page 38: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

37

Annexe 5 : Protocole d’électrophorèse NuPAGE Bis-Tris 4-12%

(Thermo Fisher)

Page 39: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

38

Annexe 6 : Protocole d’électrophorèse Novex 4-20% Tris-Glycine

(Thermo Fischer)

Page 40: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

39

Annexe 7 : Protocole de révélation des Westerns Blots (Thermo

Fischer)

Page 41: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

40

Annexe 8 : Plan des gels des immunopurifications

Plan des Gels :

1 2 3 4 5 6 7 8

Gel 1 :

1 : 15 µl MT 6 : 32 µl F4

2 : 32 µl BWL Elvira 7 : 32 µl F5

3: 32 µl F1 8: 15 µl MT

4: 32 µl F2 9: /

5: 32 µl F3 10: /

Gel 2:

1: 15µl MT 6 : 32 µl L3

2 : 32 µl BWL Elvira 7 : 32 µl L4

3 : 32 µl C1 8 : 15 µl MT

4 : 32 µl L1 9 : /

5 : 32 µl L2 10 : /

Page 42: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

41

Bibliographie

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l’allergène majeur du chat, Fel d 1, Thèse, 2009

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Sitographie

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vie.ens.fr/content/la-chromatographie, (consulté le 20 Mai 2016)

Page 44: Développement d'une méthode de purification non dénaturante non

43

Résumé

L’IRSEA a pour but depuis 1995 de trouver et créer des solutions pour améliorer la

cohabitation entre espèces et le bien-être animal en utilisant des sémiochimiques tels

que les phéromones.

La protéine Fel d 1, allergène majeur du chat, est responsable de la deuxième allergie

respiratoire la plus répandue après les acariens. Si la structure de la protéine Fel d 1 est

connue [9], ses propriétés et ses fonctions ne le sont pas encore totalement.

L’objectif de ce stage était de développer une méthode de purification non dénaturante

afin d’identifier le possible ligand de cette protéine. Pour cela nous avons testé différents

protocoles d’immunopurification avec la protéine A et les anticorps monoclonaux

de souris 6F9 avant d’envisager son extraction et son identification par GC-MS11.

Summary

Since 1995 the IRSEA has aimed at finding and creating solutions to improve

cohabitation between species and animal welfare using semiochemicals such as

pheromones.

The protein Fel d 1, the major cat allergen is responsible for the second most common

respiratory allergy after mites. If Fel d 1’s structure is known [9], its properties and

functions are not yet fully.

The objective of this internship was to develop a gentle purification method in order to

identify this protein’s possible ligand. To do so, we have tested differents

immunopurification protocols with protein A and 6F9 mouse monoclonal antibody

before performing its extraction and identification by GC-MS.

11 Chromatographie Gazeuse – Spectrométrie de Masse