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Cas d’application de l’outil
Métatranscriptomique pour l’optimisation
des procédés industriels de méthanisation
Sébastien LACROIX1, Grégory MARANDAT1,3, Thierry ARNAUD2, Théodore BOUCHEZ3, Anne-Sophie LEPEUPLE1
1 VEOLIA Recherche et Innovation – Chemin de la Digue, 78600 MAISONS-LAFFITTE - France -
[email protected] 2 VEOLIA - Direction Technique & Performance - 1 rue Battista Pirelli, 94410 SAINT-MAURICE - France -
[email protected] 3IRSTEA – UR HBAN – 1 Rue Pierre-Gilles de Gennes, 92761 ANTONY – France
RECHERCHE & INNOVATION
La Méta quoi ???
RECHERCHE & INNOVATION
Quelques définitions…
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• Méta = Qui vient après
• Métagénomique = Etude du contenu génétique d’un environnement complexe
Image du potentiel métabolique d’une population microbienne complexe
• Métatranscriptomique = Etude de l’ensemble des informations génétiques exprimées au sein d’un environnement complexe
Image de l’ensemble des fonctions métaboliques exprimées par une population microbienne complexe
Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014
Biologie Moléculaire classique vs Méta
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Approche classique (qPCR, RT-qPCR, DGGE): détection d’une espèce, ou groupe d’espèce, ou d’une fonction métabolique précise.
• Détection et quantification uniquement des microorganismes recherchées et connus.
• Implique une connaissance, des microorganismes recherchés, de leur génome ou au moins de gènes cibles.
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Approche « Méta »: Description de l’ensemble de la population microbienne présente au sein de l’échantillon,
• - D’un point de vue taxonomique (Métagénomique)
• - D’un point de vue fonctionnel (Métatranscriptomique)
Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014
Principe de l’approche Méta
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Basées sur l’utilisation de séquenceur d’ADN à haut débit
2 approches différentes:
• Métagénomique: analyse de l’ensemble des génomes présents dans un échantillons.
Fournie une vision quasi exhaustive des populations microbiennes présentes au sein d’un échantillon.
• Métatranscriptomique: analyse de l’ensemble des « transcrits ».
Identification des activités métaboliques exprimées par l’ensemble des microorganismes d’un échantillons.
Thèse CIFRE de Grégory Marandat (IRSTEA d’Antony).
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Acteurs Moléculaires de la cellule
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Dogme centrale de la biologie moléculaire
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Support de l’information génétique
(identification, ensemble des activité métaboliques
potentielles)
Intermédiaire entre information génétique et activité métabolique
Support de l’activité métabolique
(assurent l’ensemble des fonction cellulaires)
Métagénomique Métatranscriptomique
Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014
Workflow pour analyses “Méta”
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Extraction de l’ADN/ARN
Réaction de séquençage
Analyse des séquences (Bioinformatique)
Résultats
Analyses Bioinformatiques: comparaison des séquences obtenues avec séquences présentes dans des bases de données, et analyses statistiques.
Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014
Types de résultats fournis par l’approche Méta
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Métagénomique:
• Proportion des différentes populations microbiennes dans l’échantillon analysé. Ex: % de méthanogènes, d’acétogènes, etc…
• Liste des activités et voies métaboliques potentiellement exprimées dans l’échantillon
Ex: X% de bactéries capables de dégrader la cellulose dans l’échantillon, Y% de capable d’accumuler du Phosphate, etc…
Métatranscriptomique: • Identification les fonctions enzymatiques et voies métaboliques exprimées
• Différence de niveau d’expression entre deux échantillons/conditions
• Identification des microorganismes impliqués dans l’expression des voies métaboliques d’intérêt.
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Exemples de visualisation des résultats
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• Analyse Taxonomique et visualisation
• Analyse Fonctionnelle
KEGG
mapper
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Caractérisation de la flore
microbienne
d’un digesteur UASB
psychrophile
Cas d’application N°1
Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014
Digesteur de type UASB
Volume = 2,3 m3; Hauteur = 5m
Effluent : boues de station d’épuration
Température de fonctionnement 17°C
TSH = 12h, TSB = 20 j
Production moyenne CH4 = 0,21 m3/j
Caractéristiques des effluents entrants et sortants:
Description du digesteur étudié
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Paramètre mesuré Effluent entrant Effluent sortant
TSS (mg.l-1) 456 141
DCO totale (mg.l-1) 845 342
DCO soluble (mg.l-1) 137 65
Sulfates mg.l-1) 84 36
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Caractérisation de la biomasse présente dans le réacteur
Caractérisation d’une biomasse anaérobie fonctionnant à faible
température
Dynamique des population lors d’une période de fonctionnement
stable après phase de démarrage.
Prélèvements d’échantillons à 2 mois d’écart.
Analyse Métagénomique (ADN) et Métatranscriptomique (ARN)
Objectifs
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AnalyseTaxonomique: qui est là?
Population très stable au cours du temps.
Méthanogènes représentent 18% (T1) à 22% (T2) de la population microbienne totale.
90% des bactéries appartiennent à 4 phylum (Beta et Deltaproteobacteria,, Firmicute et Bacteroidetes)
14 Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014
Focus sur les Méthanogènes
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Population Méthanogènes principalement composée de Methanomicrobiales et de Methanosarcinales.
Augmentation des Méthanogènes entre T1 et T2 principalement due à une prolifération des Methanosarcinales.
Methanobacteriales apparaissent comme peu présentent mais particulièrement actives (ARN)
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Analyse fonctionnelle: Quelles sont les activités
exprimées?
3 (T1) et 5 (T2) millions des séquences obtenues correspondent à des activités métaboliques.
Principales voies métaboliques détectées: Méthanogénèse (36%)
Biosynthèse des protéines Repliement des protéines Transfert d’électrons ATP synthase … autres activités de base
Métabolisme de l’azote (0,65%) Métabolisme du soufre (0,55%)
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>50%
Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014
Focus sur le métabolisme du méthane
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37 des 50 enzymes de la méthanogénèse identifiées. Prédominance de la voie hydrogénotrophe sur la voie acétoclaste Détection de 6 enzymes spécifiques de cette voie.
Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014
L’approche Métatranscriptomique a permis de :
Décrire de façon très précise et complète la biomasse d’un digesteur
anaérobie fonctionnant à basse température (17°C)
Mettre en évidence que cette biomasse est proche de celle décrite
classiquement dans une installation mésophile
De définir que, dans ces conditions de fonctionnement, la voie
hydrogénotrophe était prédominante sur la voie acétoclaste.
Conclusions
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o Caractérisation de la biomasse au sein du digesteur
o Evaluation d’une technique de Microaération pour diminuer la
concentration en H2S
Cas d’application N°2: Digesteur de type EGSB traitant
des effluents papetiers
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EGSB de 5m3
Alimentation: effluent papetier
Charge volumique = 5 kg DCO/m3/j
Système d’injection d’air sur la boucle
de recirculation (débit réglable)
Objectif:
Validation de la méthode de
microaération pour contrôler la
production de H2S
Contexte de l’étude
Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014
Conditions expérimentales
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Périodes Début Fin Débit d’air
m3/jour
H2SO4
addition
1. Contrôle #1 18-Oct-2012 5-Nov-2012 0 non
1. Contrôle #2 6-Nov-2012 21-Jan-2013 0 oui
1. Aération #1 22-Jan-2013 29-Jan-2013 1.37 oui
1. Contrôle #3 2-Fev-2013 25-Fev-2013 0 non
1. Aération #2 26-Fev-2013 19-Mar-2013 0.72 non
1. Aération #3 22-Avr-2013 14-Mai-2013 2.04 non
1. Aération #4 15-Mai-2013 23-Mai-2013 3.40 non
Analyses Méta réalisées tout au long du suivi.
Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014
Population globale très stable au
cours du temps: Pas de modification de population induite
ni par microaération, ni par l’ajout de
H2SO4
Analyses taxonomiques: Qui est là?
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Bactéries
Mehanolinea
Methanobacterium Methanosaeta
Population microbienne composée à 70% de Méthanogènes, dont 50% de Methanosaeta Prédominance de la voie acétoclaste Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014
Détection des voies métaboliques du méthane, du soufre et de l’azote
principalement.
Très peu de variations du niveau d’expression de ces différentes voies au
cours du suivi. Pas d’impact significatif de la microaération et de l’ajout de H2SO4
Une différence majeure: variation de l’expression d’une enzyme (1.8.99.1)
induisant la formation de H2S via réduction d’ions sulfites Absence d’expression avant ajout H2SO4
Expression forte après ajout de H2SO4
Inhibition de l’expression après mise en place de la microaération
Analyse fonctionnelle
23 Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014
Analyse fonctionnelle: Métabolisme du Méthane
24 Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014
Description complète et précise de la biomasse au sein du
réacteur.
Corrélation entre:
les analyse Méta: Inhibition de l’enzyme 1.8.99.1 du synthèse du H2S
les données du suivi physico-chimique: Diminution de la concentration en H2S
dans le biogaz
Mise en évidence de la raison métabolique provoquant une
diminution de la production de H2S lors de la mise en place de la
microaération
Conclusions
25 Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014
Conclusions générales
RECHERCHE & INNOVATION
L’approche Méta offre un outil très puissant basé sur une technologie de
pointe (NGS).
Cette approche permet de décrire avec précision un écosystème
microbien aussi complexe que celui d’un digesteur anaérobie (d’un point
de vue taxonomique et fonctionnel).
Présente avant tout un intérêt scientifique: description et compréhension
de ces écosystèmes complexes.
Montre également que l’approche Méta peut déjà être un outil efficace
d’aide à la décision pour l’optimisation d’installations à l’échelle
industrielle.
Conclusions
27 Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014
• A court-termes:
• Explorer, caractériser et comprendre les dynamiques des communautés
microbiennes complexes.
• Identifier des profils taxonomiques et fonctionnels caractéristiques, lors de
régimes perturbés et productifs des bioprocédés.
• A moyen-termes:
• Faire le lien entre le design des procédés, les paramètres opératoires, les
performances mesurées et la biomasse active.
• Fournir un outil d’aide à la décision pour la conduite et le design des procédés.
A long termes:
• Repousser les limites de fonctionnement des installations, même dans des
conditions défavorables (ex : faible température),
• Générer de nouvelles hypothèses fondamentales et potentiellement identifier de
nouveaux biocatalyseurs environnementaux ou nouvelles voies métaboliques,
industriellement utilisables.
Perspectives d’application
28 Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014
Merci de votre attention
TITRE PRÉSENTATION / SOUS TITRE / DATE 29