cours de chimie analytique jean-luc vialle [email protected] 2009-2010
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Objectifs
• Maitriser les techniques utilisées dans les domaines: - De l’agroalimentaire (lipides, glucides, protides) - Connexes à la production (environnement, culture, élevage)
• Approfondir quelques techniques majeures et discriminatives
Sommaire
• Panorama des techniques• La Quantification et l’Echantillonnage• La Chromatographie• L’HPLC et La CPG• L’ Absorption Atomique et L’ Absorption
Moléculaire
Déroulement - Contrôle
• 5 Interventions: Cours • 1,5 TD + 0,5 TD Projet• 1 Projet (TP)• 1 contrôle
• Claroline: Chimie Analytique– Documents (cours + Power-Point)– Forum (Questions)
Chapitre N°1
Panorama des techniques analytiques
Sommaire
• IntroductionLes environnements Recherche, R&D, Production
• Contraintes des analysesPersonnel, Matériel, Normatives, Economiques
• Classifications des techniquesPropriétés, Etat, Seuil, Cibles
I°) Introduction• Objectifs: Adéquation entre un‘produit’ et
un cahier des charges et/ou une législation.• Moyens: Quantifications +/-
précises de différents paramètres
• Paramètres: Sensoriels, Physiques, Chimiques µ
biologiques liés à la matrice, à la molécule
• Représentativité: Analyse, Echantillonage, Extraction, Conservation.
• Adaptation de la méthode au résultat attendu
• Ciblage des paramètres en fonction des objectifs et de l’environnement
- Recherche- Recherche et
Développement - Production
11 L’environnement Recherche• Objectifs: Structurale / Evolution• Mots Clefs: Liés au produit
Nature, Origine, Matrice, Etat, Pureté
• Moyens: Techniques Lourdes disponibles en Centre de Recherche ou en externalisation
• Obligations de moyens: Pas / peu de contraintes économiques et temporelle
12 L’environnement R&D
• Objectifs: Quantification 2 phases:a) Centrée sur le produit
+ Niveau de détectionb) Transposition en production :
Contraintes normatives• Moyens plus softs• Techniques globales / discriminatives
13 L’environnement Production
• 3 mots clefs: Simplicité - Durée - Coût• Nouvelles contraintes: Obligations -
Références - Externalisation - Qualification• Techniques mises en œuvre :
Liées à la valeur ajoutée du produit:Faible GlobaleElevée Discriminative
II°) Contraintes des analyses
• Liées au personnel• Liées au matériel• Liées aux méthodes• Liées à l’aspect économique et à l’aspect
délai
21 Personnel compétent• Production : Faibles compétences
Analyses simples (globales) Automatisation
• Laboratoire d’analyse: Niveau de compétence + élevé Analyses discriminatives Automatisation
• Laboratoire de recherche: Niveau de compétence très élevé Interprétation des analyses
22 Contraintes matérielles• Coût d’investissement:
- Routine (Production) : 15.000 Euros- Analyse discriminative: 15.000 Euros par ligne d’analyse
- Analyse structurale: Quelques centaines de milliers d’Euros par technique.
• Coût de fonctionnement et de maintenance
23 Contraintes Normatives et Légales
• Normes ISO, Afnor, Din, Asae…font références et sont
incontournables si obligations légales• Méthodes officielles: AOAC pallient
l’absence de normes• Méthodes interprofessionnelles
Ex: Test de sédimentation de Zélény, saccharimétrique dans l’industrie sucrière, MS chez la pomme de terre.
• Méthodes internes (propres à l’entreprise)
24 Contraintes économiques et temporelles
• Liées à l’aspect légal ou marketting de l’analyse.
• Liées à l’impact sur la production (Immobilisation)
• Internalisation / Externalisation de l’analyse Impact sur le délai et sur le coût
• Liées au volume d’activité de l’entreprise et à la valeur ajoutée de la production
• C < 15 Euros , D < 3 joursMS, pH, Gravimétrie, Brix, tests simples
• 15 < C < 50 Euros, D < 3 joursTitrimétrie, Complexiométrie, AA, Absorption moléculaire
• 100 > C > 50 Euros, D < 3 joursTechniques chromatographiques
internalisées, simples• C > 100 Euros, D > 1 semaine
Analyse thermiques, structurales, analyses chromatographiques externalisées
III°) Classifications des techniques
• Selon les propriétés du soluté (matrice).• Selon le caractère ‘destructif’.• Selon l”état de la matière.• Selon le seuil de détection• Selon le caractère discriminant de l’analyse• Selon la ‘cible’ visée dans la molécule
• Propriétés du soluté (matrice)Chimiques et µbiologiques - Physiques -
Mécaniques - Thermiques - Optiques - Electriques - Magnétiques - Physico chimiques - Energétiques - Fragmentation
• Caractère destructif / non destructifMEB, RX, RMN du solide, Near FTIR
• Etat de la matière: S, L G
• Seuil de détection:– 0,1% (1000 ppm)Titrimétrie - Thermiques - IR - RMN - Gravimétrie
- 1 ppm: AA, AM , Chromatographie…
• Global / Discriminant: Titrimétrie / Séparatives
Classification selon la ‘cible’
• Molécule = atomes et ou de groupes fonctionnels liés entres eux par des électrons.
• Atome = noyau + électrons• Propriétés physiques , chimiques +/-
spécifiques et des Propriétés physico-chimiques spécifiques Techniques Séparatives
• Possibilité de la casser par apport d’énergie mécanique (chimique) analyse élémentaire , Spectrométrie de masse.
• Possibilité de modification de la molécule par apport d’énergie sous forme thermique ATD, ATG, DSC, Fusion…
• Possibilté d’action sur les molécules et ses atomes constitutifs par apport d’énergie sous forme lumineuseE = h = hc /
En fonction de l’énergie apportée, on agit sur des cibles différentes: SAA, IR, Absorption moléculaire
• µ onde et ondes radio 3 106 nmModification de la matrice
• Infra-Rouge de 2500 à 1000 nmVibration des atomes constitutifs des liaisons
• Visible de 800 à 400 nmExcitation des electrons constitutifs des liaisons
(les plus mobiles). Excitation des electrons atomiques
• UV de 350 à 200 nmExcitation des électrons constitutifs des liaisons (les moins mobiles)
• RX et rayons < 3 nmArrachage des electrons constitutifs
P r o p r ié té s m o lé c u la ir e s e t io n iq u e s+ / - S p é c if iq u e s
R é a ctio n sp é c ifiq u es C o m p le x io m é tr ie
R é ac tiv itéC h im iq ue
p H m é tr ie
A r g en tim é tr ie P e r iod im é tr ie
M a n ga n im é tr ie C h r o m im é tr ie
C é r im é tr ie C h lo m é trieIo d o m é trie
B ro m om é trie
P o te n tio m é tr ie
P rop riétés C h im iq u es
P r o p r ié té s m o lé c u la ir e s e t io n iq u e s+ / - sp é c if iq u e s
A n a lyse é lé m e nta ire
C onstitu tives
G r a v im é tr ie
D e n sim é tr ie
V o lu m é tr ie
T o n o m é tr ie
P hysiquesP , V , m ...
E b ulliosc op ie
C r y o sc o p ie
C alorim étrie
A .T .D
A .T .G
D .S .C
A nalyse T herm ique
T herm iques
R é fr a c to m é tr ie
P o la r im é tr ie
O ptiques
C o n du c tim é tr ie
A m pé r o m é tr ie
V o lta m é tr ie
C o u lom é tr ie
P o la ro g r ap h ie
E lec tr od essp é cifiqu es
E lectriques
P r o p r ié té s P h y s iq u e s
P r o p r ié té s M o lé cu la ire s e t Io n iq u esS é lec tiv e s
C .P C .C .MH P C C M
Surface
H P L CP h a se l iq u id e
C P GP h a se g a z u e se
V olum e
C h r o m a to gr a p h ie
P a p ier G el
Surface
E le c tr o p h o r è sec a p i l la ire
V olum e
E le ctr op h or è se
In tér a c tio n s P h y sico c h im iq u es
P r o p r ié té s E n e r g é tiq u e s d e s m o lé c u le sS p é c if iq u e s
S p ec tro sco p ieIn fr a -r o u ge
S p ec tro sco p ieR a m a n
V ibration des atom es
A b sor p tionm o lé c u la ireU V - V is ib le
F lu or im é tr ie
E xcitation dese- de co valenc e
M olécu le
E m iss iona to m iq u e
F la m m e F la m m eF r o ide
T o r c h e àP la sm a
F o u r
A b sor p tionA to m iq u e
E xcitation dese- atom iques
A tom e
C ib le u tilisée(E c ro issa n te )
P r o p r ié té s d uN o y a u A to m iq u e
R .M .N
M agnétiques
S c in tigr a p h ie
R adioactive s
M icr o sco p ieE lec tro n iq u e
à b a la y a ge
D iffr a c tio n X
P hysiques
P rop riétés d u n oyauet d e l'a tom e
Chapitre N° 2
La quantification
Sommaire
• IntroductionLes calculs d’incertitudes
• Les méthodes ‘Absolues’Methodes directes
Dosages chimiques• Les méthodes comparatives
Etalonnage interne et externeLes ajouts dosés
• Conclusion
I°) Introduction
• Analyse = Quantification• Structurale = Identification• Rappels sur les incertitudes
Incertitudes absolues n xIncertitudes relatives x /x
II°) Les méthodes ‘absolues’
• Mesure de paramètre physiquesExemple Taux de cendres NF V 18-101
• Méthodes basées sur l’application d’une loi simple
Exemple ; L’amidon (3ème directive du JO du 23/11 1980)
• Méthodes basées sur des réactions chimiques
• Acido-basique• Rédox• Complexiométrie - Précipitation
• Conservation du nombre d’équivalents échangés
• Méthodes à point final• Méthode directe: (NF T 60-204)• Méthode en retour (NF V 18-100)
III°) Méthodes comparatives
• Etalonnage externe
• Etalonnage interne
• Méthode des ajouts dosés
31 Etalonnage externe
• Pas de dépendance d’un facteur extérieur
• Application au dosage du phosphore soluble dans les terres (NF X 31-161)– Etalonnage– Exploitation des résultats– Avantages et inconvénients
32 Méthode de l’étalonnage interne
• Domaine d’utilisation• Principes• Application à l’analyse des FAME (NF T 60-234)• Avantages et inconvénients• Choix de l’étalon interne
33 Méthode des ajouts dosés
• Analyse de traces
• Application en absorption atomique
• Application en chromatographie
• Avantages et inconvénients
Chapitre N° 3
Introduction à laChromatographie
Sommaire
• Introduction• Aspect thermodynamique• Aspect cinétique• Facteurs liés à la chromatographie
I°) Introduction
• Technique séparative• Dualité Analytique / Préparative
Lié à la valeur ajoutée• Les différents états de la matière
solide – liquide – gaz – critique• Classification des techniques séparatives - Suivant les forces mises en jeu - Suivant l’état de la matière
Un peu d’histoire…• Khrômatos = Couleur Graphikos = Tracé• 1903 Tswett: CaCO3 Colonne ouverte• 1940 Martin et Synge : Théorie de la
partition• 1950 Snyder: Théorie de l’adsorption• 1950 Martin et James CPG• 1960 CCM• 1970 HPLC et phase inverse• 1975 CPG Capillaire• 1985 HPLC en phase supercritique
Glossaire
• Soluté: Espèce à séparer / à doser• Solvant: Solubilise le soluté• Eluant: Phase mobile• Eluat: Phase mobile (+ soluté)• Phase stationnaire:
Phase immobilisée dans le système chromatographique
Schéma d’un chromatographeRéserveEluant
Système de Mobilité
Injecteur
Passeur
Gradient Séparateur
Micro Proesseur
Détecteur
Traitement du signal
Collecteur
Classification des techniques chromatographiques
• Suivant la technologie: Surface / Volume• Suivant la nature des phases:
Phase mobile: Liquide ou Gazeuse(Critique)
Phase stationnaire: Solide ou Liquide
immobilisé
RécapitulatifPhase Mobile
Phase Stationnaire
Technologie Application Principe
GazLiquide
VolumeCPGG/L
Partage
Solide CPGG/S
AdsorptionExclusion
LiquideSurface CCM
L/LPartage
LiquideVolume HPLC
L/LPartage
SolideSurface CP
L/SAdsorptionExclusion
Volume LC, HPLCL/S
AdsorptionExclusion
II°) Aspect ThermodynamiqueThéorie des plateaux
• Un soluté P qui se distribue entre les deux phases stationnaire et mobile = Equilibre K = [P]stat / [P]mob
• K varie avec la force des interactions• Objectif: Multiplication du nombre d’équilibre : n• Ecoulement discontinu ; 1 plateau = 1 équilibre• y = fraction de P (stat) et x = fraction de P (mob) k’
= y/x = cste x + y = qo = 1
0 1 2 3 ….. p … n-2 n-1 n
Evolution du soluté PInjection
n 0 1 2 n - 1 n
Stat. 1 0 0
Mob. 0 0 0
Equilibre
n 0 1 2 n -1 n
Stat. y
Mob. x
Transfert
n 0 1 2 n - 1 n
Mob 0 x 0
Stat y 0 0
Equilibre
n 0 1 2 n -1 n
Mob xy x²
stat y² xy
Transfert
n 0 1 2 n - 1 n
Mob 0 xy x²
Stat y² xy 0
Equilibre
n 0 1 2 n -1 n
Mob xy² 2x²y x3
Stat y3 2xy² x²y
Généralisation• Après n transferts:
Le soluté se disperse suivant une loi du type (x + y)n
• Facteur de capacité: k’ = y / x Grandeur caractéristique d’un soluté dans un système chromatographique donné
• Qnp = f(n,p, q0)
Equation d’une Gaussienne Courbe à maximum
• Après n transferts, la phase mobile a parcourue une distance ln et l’extrémum se situe à une distance lp tel que
lp / ln = 1 / (1+k’)
• Soit en terme de vitesse
vp / vn = 1 / (1+k’)• Soit t = Cste On mesure l Surface
• Soit l = Cste On mesure t Volume
Quelques grandeurs fondamentales
• Temps de rétention: Apparition de l’extrémum Tr = T0 (1+k’)
• Temps de rétention nulle: Soluté non retenuT0
• Rf Rf = lp / l0
• Efficacité : N = Nb de plateaux théoriques
• HEPT: H = L / N
Séparation de plusieurs solutés
• Sélectivité = k’2 / k’1 Traduit la différence d’affinité pour 1 et 2
• Résolution Rs Traduit la séparation entre deux pics chromatogaphiques
III°) Aspect Cinétique
• Ecoulement Continu : Déformation des pics:• Transfert de système chromatographique et
Transposition: Notion de grandeurs réduites (l, h et vitesse réduite)
• Si l, h et la vitesse réduite sont constant, N est constant
Mécanismes de Dispersion
• Knox (HPLC) et Van Dempter (CPG)
• H = A + B / u + C u• A = Anisotropie d’écoulement• B = Diffusion longitudinale• C = Résistance aux transferts de masse• U = vitesse linéaire de la phase mobile• Optimisation
IV°) Facteurs liés à la chromatographie
• La température: Fondamentalk’ est fonction de T Si
T augmente k’ diminue• La composition de la phase mobile (HPLC -
CCM)• Le débit de la phase mobile (u)• Loi de Darcy: Perte de charge dans un
écoulement à travers un tube rempli
Chap N°4 La CPGSommaire
• Introduction• Les phases stationnaires en colonne remplie• Transposition colonne remplie / colonne
capillaire• L’injection• La détection• La dérivatisation
I°) Introduction
• 1ère technique développée dès 1950• Simplicité de mise en œuvre• Rapidité des analyses complexes• Matériel disponible et peu onéreux• Nombreuses applications :• NF T60-234 FAME Carbowax
20 M DB 20 F.I.D NF T60-237BHA et BHT DC 200 CP Sil 5F.I.D
NF T90-120 PcB et Organo-chlorésOV17 DB5 ECD
NF T90-121 Atrazine et SimazineDB5 Thermo ionique
NF T90-125 COV halogénésCarbowax 1500 CPSil 5 ECD
Nombreuses autres applications - Gaz Permanents Porapak
Catharomètre- Solvants résiduels – Composés volatils - Résidus d’incendies – Arômes –
Huiles essentielles….
II°) Les phases stationnaires en colonne remplie
• Colonne remplie = Tube + Support + Phase Liquide Imprégnée (Solide)
• Tube:2 m 1/8ème ‘’ Inox• Support: Diatomées P, W, G Granulométrie
80-100 mesh (175-150µm) Pertes de charge faibles (1-2 bars) Taux d’imprégnation 10 - 30%
Traitements: Tamisage, AW, TMCS
21 Les phases stationnaires
• Les hydrocarbures ramifiésréférence : Polarité nulle
• Les Polysiloxanes et polysiloxanes substitués:R = CH3,
Phényl, Cyanopropyl… Polarité très faible (DB1, 100% de CH3) à très forte (CP Sil 88, 100% de cyanoéthyl)
Référence en capillaire
• Les polyéthylènes glycols (carbowax 20M, FFAP..) équivalence CP Wax, DB 20
• Les Polyesters: Polarités intermédiaires et fortes (DEGS, EGA….)
• Les Adsorbants Tenax, Carbopack, Tamis moléculaires
• Classification selon la polarité • Equivalence entre remplie et capillaire
22 Les indices de Kovat’s
• Série homologue: log10 Tr’ = an + b
• Notion de droite de similitude: - Prédiction de la rétention - Approche d’identification
• Application à la série des n alcanes - Notion d’indice de rétention
23 Classification suivant la polarité
• Constantes de Mac Reynolds – Rohrschneider
– 1 phase de référence : Squalane P = 0– 5 solutés de référence:
Benzène X’ n Butanol Y’ MeCOPr Z’Nitropropane U’ Pyridine S’
Cste de Mac Reynods = Différence d’indice de rétention du soluté entre la phase et la référence
Polarité = Somme des cstes de Mac Reynolds des cinq solutés(Existence de 3+2 autres solutés références)
Exemples
Phase X’ Y’ Z’ U’ V’ Somme
Squalane 0 0 0 0 0 0
SE 30 15 53 44 54 41 217
OV 17 119 158 162 243 202 884
FFAP 340 590 397 602 627 2546
OV 275 666 1001 895 1177 1099 4838
24 Choix raisonné des phases stationnaires
• Classification des solutés en 5 catégoriesLiées à la polarité
• Classification des phases en 4 catégoriesLiées à la polarité
• Associations par catégories: - Apolaire – Apolaire - Polaire – Polaire - Moyennement polaire – Moyennement polaire
III°) TranspositionColonne Remplie / Colonne Capillaire
Remplie Capillaire
Phases Variées Variées (mais +
restreint)Longueur
Perte de charge2 m
1 bar / m10 - 100 m
1 bar / 50 m
Diamètre 1/8 ‘’1/4 ‘’
0.32 et 0.25 mm
0.53 et 0.1 mm
Classification
• Colonnes de Golay:-
COT et WCOT : Wall Coated Open Tubular - SCOT : Support Coated Open Tubular - PLOT : Porous Layer Open Tubular - Micropacked Columns
• Perméabilité k importante : Efficacité importante et vitesses linéaires importantes soit tr faibles
• B = VG/VL 2 à 10 x supérieur / remplie• B= dc / 4ef et tr = t0 (1 + K / B)
• Si B augmente : tr diminue ; possibilité de diminuer la température
B élevé: Analyses rapides : substances lourdes B faible: Substances volatiles
• Epaisseur du film: De l’ordre du micron• Tr augmente en f(Log e) e x 2 = Tr (-15°)• Films minces et films épais
• Films Minces: 0,15 < e < 0,5 µmAvantages: Meilleures performances Réduction du temps d’analyse Possibilité d’analyse de composés ‘lourds’ Inconvénients:Charges + faibles : restreint la possibilité d’analyse de traces - Interactions avec la surface
• Films Epais: e > 1 µmAvantages: Analyses de traces Analyses de volatils
Inconvénients Pb de Bleeding (e > 5µm)• Diamètre: Wide Bore = Remplie
Narrow bore: Analyses courtes : Couplage GC / MS
IV°) L’injection
• Colonne remplie: Injecteur à Septum Volume injecté: 0,5 à 1 µl Gaz : 100 µl à 500 µl Head-Space (Statique et dynamique)
• Colonne capillaires: Charges + faiblesUtilisation de diviseurs - Split / Splitless - On column - Injecteur de verre
V°) La détection
• 2 classes de détecteurs: I : Réponse proportionnelle à la concentrationCatharomètre, E.C.D
II : Réponse proportionnelle au débit massique: F.I.D , N.P.D
• Sélectivité : Universels / Spécifiques• Quantité minimale détectable : variable de (1-
10 ng) TCD à 0,1 pg ECD(30-100 pg) FID
• Catharomètre: Pont de Wheastone (I)Universel Gaz permanents
• F.I.D: Combustion (II)Universel (sauf incombustibles) Notion de Make-up
• E.C.D Capture d’électrons (I)Spécifique: Dérivés Halogénés
• N.P.D Thermoionique (II)Spécifique: Dérivés N et P
VI°) La dérivatisation
• Objectifs: Volatilisation des espècesAmélioration des analyses
(trainées de pic)Amélioraion des résolutions
• Méthodes:Estérification :
Diazométhane, BF3/CH3OHSilylation : TMCS / HMDS
obtention d’éthers, d’esters silylés volatils: Pb H2O
Chapitre N°5La chromatographie Liquide
L’adsorptionLe Partage
Sommaire• La chromatographie d’adsorption
Théorie de SnyderFacteurs liés à la phase stationnaire, la phase mobile et le soluté
• Le Greffage• La chromatographie en phase inverse• La chaîne chromatographique
I°) Introduction• Le dosage de l’aflatoxine B1 dans les aliments pour
animaux (NF V 18-200)
Extraction Liquide / solide au CHCl3Purification Colonne ouverte de gel de silice (50-200
µm) conditionnée dans CHCl3 – Lavage à l’étherDésorption avec CHCl3 / CH3OH (97/ 3)Chromatographie Monodimensionnelle sur silice: Phase mobile: CHCl3 / Acétone (90/10) Ether / méthanol/ eau (96/3/1)
Lecture visuelle / Fluorodensitométrique
II°) La chromatographie d’Adsorption
• Supports solides polaires: Silice Caractère acide
Alumine Caractère basique
Utilisables en CCM, HPLC, colonne ouverte
Principe: Formation de liaisons H entre le support et le soluté. (interactions)
• Phases mobiles : peu polaires
• Applications analytiques: – Fonctionnalités Différentes– Isomères– Solutés peu et moyennement polaire
• Applications en extraction (purification)Fixation des espèces plus polaires
• Ordre d’élution: suivant l’ordre de polarité• Faible coût – Pb de la phase mobile
21 Mécanismes d’adsorption
• Adsorption / désorption en surface• Equation de Snyder• log k’ = log Va + B*(E° - As °) + log (Wa/Vm)• k’ = facteur de capacité
– Phase stationnaire: Va, Wa et Vm , B*– Phase mobile: B* , °– Soluté: As et E°
Facteurs liés à la phase stationnaire
• Va, Wa et Vm Liés à la taille des particules et au remplissage
Peu d’actionsInfluence la transposition Surface / volume
• B* Etat d’activité de l’adsorbant (0<B*<1)Séchage des plaques et conservation au dessicateur
Facteurs liés à la phase mobile• ° et B*• B* liée à la teneur en eau de la phase mobile
Solvant isohydriqueutilisation d’acide et de base pour réduire l’activité
• °: Force éluante Série éluotropique si ° Augmente, alors Rf augmente
(k’ diminue)
Développement isocratique et en gradient de concentration.Utilisation de mélanges binaires et ternaires
Facteurs liés au soluté
• As et E°• As: surface spécifique : Pas d’action si ce n’est
une dérivatisationChangement de la nature du soluté et des interactions
• E°: même remarque
III°) Le greffage• Adsorption
Contraintes Activité du supportIsohydrie de la phase mobile
Limites2 types de phase : Silice (alumine)échelle de polarité limitée
problèmes de traînées de pics• 1970 Le greffage
II°) Le Greffage• Modification du support siliceux par greffage
chimique d’espèces liquides: Si-OHSi-O-Si-R R =
Alkyl (C18, C8, C3, C2)PhénylAmino alkylNitro alkylDiols , Cyano….
• Notion de chromatographie de partage• Echelle de polarité inversée / Adsorption• End-Capping
Soluté Polaire Moyennement
PolaireMoyennement
PolaireNon
Polaire
Eluant Moyennement
PolaireTrès
Faiblement
Polaire
Fortement
PolaireMoyennement
Polaire
ExemplesCH2Cl2 / Hexane80/20
CH2Cl2 / Hexane
5/95
CH30H / H20
40 / 60
CH30H / H20
90 / 10
HPLCPartage Phase
NormaleNH2, CN,
Partage Phase
NormaleNH2, CN,
PartagePhase Inverse
C18, Phényl
PartagePhase Inverse
C18, Phényl
IV°) La Phase Inverse
• Application : Dosage de 6 PAH (µ polluants) en phase aqueuse NFT 90-115 : Fluoranthène, Benzofluoranthène b et k; Benzopyrène a; (10
ppb) Benzopérylène, Indénopyrène (50 ppb)• Extraction au cyclohexane - Concentration à 1ml sous vide• Purification sur colonne d’alumine • Concentration à sec et reprise dans 1ml de solvant:• Phase stationnaire: RP 18, Lichrosorb C18 L = 250 mm Diam: ¼ ‘’• Phase mobile: CH3-CN / H2O (85/15 ; 90/10) Débit: 1ml mn-1
• Injection 20 µl• Fluorimétrie: Excitation 360 nm Emission > 420 nm
La phase stationnaire
• Apolaire Lipophile = Hydrophobe• Nature du greffon: CH3-(CH2)n-CH2-
si n augmente: La rétention augmente• Nombre de greffon: Plus le taux de greffage
est élevé, plus la rétention est importante• Généralisation à la surface hydrocarbonée• Pratique: Entre 8 et 15 % de Carbone
La phase mobile• Base:H20 + CH3OH ou H20 + CH3CN
Attention à la perte de charge (Darcy)• Utilisation éventuelle de modificateurs:
THF, Acétone, CHCl3… Attention à la détection
• Influence de la teneur en eau : La rétention augmente avec la teneur en eau
• Elution en mode isocratique : Composition de la phase mobile constante
• Elution en mode gradient de concentration
Le soluté
• Rétention Inverse à la polaritéPlus le soluté est polaire, plus la rétention est faible.
• Liée à l’hydrophobie: Cste de partage dans le système octanol / eau P
• Rekker:log P = Somme fi + CM (somme kj)fi = Incréments CM = Cste = 0,268 kj
= effets de proximité log k’ = a log P + b
IV°) La chaîne chromatographique
L’Injection
• Couramment : 20 µl (1 à 50 µl)• Injection en boucle Etalonnage
externe• Vanne d’injection Six Voies• Automatisation Passeurs automatiques
La détection - Généralités
• Notion de dérive (1 heure) bruit à long terme (10 mn)bruit à court terme (1 mn)
• Sensibilité:Pente de la courbe: Réponse = f (Concentration initiale)
• Concentration minimale détectable: n fois le bruit à court terme
• Détection directe et différentielle
Les différents Détecteurs
Détecteurs Simples
Ultra violetFluorimétrieRéfractométrieDiffusion de lumière
ElectrochimiqueConductimétrique
Détecteurs semi Informatifs
UV multi lambdaFluorimètre programmable
Multi électrodes
Détecteurs intelligents
Spectométrie de MasseFT IRBarrette de diodesRMN
Dérivatisation pré et post colonneDérivatisation Pré Colonne
SimplicitéModification des conditions chromatographiquesEx: Acides aminés (OPA)
Réactions reproductiblesPossibilité de réactions secondaires
Dérivatisation Post Colonne
SélectifMulti détectionExemple:Vitamine C
Matériel plus sophistiquéModification du pic chromatographique
VI°) Les autres techniques HPLC
Technique Phase stationnaire
Phase mobile Solutés
Paire d’ions C8, C18 CH3CN, CH3OH, H2O
Espèces ionisables
Echange d’ions
Résines échangeuses
Tampons aqueux
Ions minéraux cations et
anions
Exclusion Polymères poreux
THF, Tampons aqueux
Polymères hydrophiles et organiques
Chirale Chirale cyclodextrines,
Pirkle
Aqueuses et organiques
Enantiomères
Chapitre N°6
L’absorption Moléculaire UV-VisibleEt
L’absorption atomique
L’absorption moléculaireSommaire
IntroductionDétermination de l’indice Phénol NF T 90-109
Détermination de As3+ NF T 20-054
Détermination du Fer total et du Fe2+ NF T 90-017
Détermination du Phosphore soluble NF X 31-161
Le spectrophotomètre d’absorption moléculaire
Introduction
• Absorption Atomique: Concerne les électrons atomiques (absorption et émission)
• Absorption et Émission Moléculaire: Concerne les électrons des liaisons moléculaires, les électrons délocalisables ().
• Mêmes concepts: Dualité Onde / Énergie E = h = h c /
• Spectre de la lumièreDomaine UV: 200-350 nm
Domaine Visible: 350 – 800 nm
• Complémentarité Absorption / CouleurTriangle des couleurs
• Utilisation des propriétés d’absorptions pour une quantification
• Nombreuses applications : Cations , Anions, Molécules Organiques
• Sélectivité plus ou moins importante
• Loi de Beer-Lambert: log10 I0/It = .l.Ce : Coefficient d’extinction molaire
. Quantification par étalonnage externe
Détermination de l’indice phénolEaux NF T 90-109
• PrincipeDistillation des phénols en milieu acide
(H3PO4) en présence de CuSO4(action bactérienne) (Entraînement à la vapeur)Enregistrement du spectre UV à 254 et 270 nm ( # 6000 et 1500) cuve quartz 1cmComparaison à un étalonnage externe
• Applications: 0,025 – 0,5 mg/l
Dosage de l’arsenicCorps gras NF T 20-054
• PrincipeRéduction de l’arsenic sous forme d’arsine AsH3
par Zn en milieu HCl Absorption de l’arsine par le diéthyldithiocarbamate d’argent: Ag(DDTC) AsH3 + 6 Ag(DDTC)…. 6 Ag + 3H(DDTC) + As(DDTC)3
• Formation d’Argent colloïdal dispersé: Rouge – Violet• Mesure de la DO à 540 nm cuve 1cm• Comparaison à un étalonnage externe• Application: masses de 1 à 20 µg d’Arsenic
Dosage du ferEaux NF T 90-017
• Fet = Fe dissous + Fe suspension• Formation d’un complexe coloré entre Fe2+ et l’ortho
phénanthroline (1-10) Rouge –Orangé (510nm)• Fer total: Oxydation par le peroxodisulfate
Fe3+ Réduction par le chlorydrate d’hydroxylamine pH # 4,5
Fe2+ Complexation (15mn à l’obscurité)• Fer dissous: Réduction du Fe3+ dissous
Complexation• Fe2+ dissous Complexation directe• Applications 10 µg/l – 10mg/l
Le phosphore solubleSols NF X 31-161
• Principe: Méthode de Joret-HébertExtraction du phosphore soluble (sous toutes ses formes) par l’oxalate d’ammonium (pH = 7)
• Complexation du phosphore sous forme de complexe phosphomolybdique réduit avec le réactif sulfomolybdique (heptamolybdate d’ammonium, Acide ascorbique, thiosulfate de sodium, formol)
• Développement chaud (100°C, 5mn) d’une coloration violette
• Mesure de la DO à 825 nm• Domaine d’application: 1 – 10 mg/l de P
sols: Expression du résultat en P2O5
Le spectrophotomètre
• Source• Monochromateur• Fentes (Slit)• Cuve• Photomultiplicateur• Amplificateur• Calculateur
Sources et rayonnement incident
• Lampes à décharge (lumière blanche)• Multi longueurs d’onde
- Deutérium (Domaine UV)- Vapeur de mercure (Domaine visible)
• Simple et double faisceaux• Sélecteur: Monochromateur• Fente (Slit): Permet de réguler l’énergie du
rayon incident
Cuves
• Cuves:- Plastique (jetables)Attention aux solvants organiques- Verre (domaine du visible)- Quartz (domaine UV)
• A remplissage et à circulation (Cinétique – Passeurs automatiques)
• Trajets optiques: 0,1 à 5 cmfonction de la concentration et du coefficient d’extinction molaire
• Zéro optique: Sur Blanc (0 d’absorbance)
Rayonnement transmis
• Photomultiplicateur : Comptage des photons transmis: Travail en Absorbance (A) ou en Transmitance (T)
• Amplificateur• Calculateur: Io, It, A (T), log10(A), C• Restitution du spectre, des concentrations…• Gamme de linéarité de Beer-Lambert
(Étalonnage externe)
L’absorption atomique
Sommaire• Introduction• Principe de l’absorption et de l’émission• Schéma général d’un spectromètre d’AA• Les différentes parties du spectromètre• La quantification• Applications• Analyse de traces
Introduction
• Analyse de cations minéraux• Actuellement: Environ 60 éléments du tableau de
Mendeleiev• Nombreuses applications: Métallurgie, Géologie,
Environnement, Agriculture, Agro alimentaire…• Impératif: Mise en solution de l’échantillon
Eaux NF T90-112 FlammeEaux NF T90-119 Four Eaux NF T90-131 Flamme Froide Sols NF X31-151 Flamme
Principe• Atome = Noyau + électrons• Électrons: Gravitent autour du noyau (Champs
électrostatique): Notion d’orbitales: Niveaux d’énergie quantifiés
• État fondamental + Énergie électromagnétique:État excité (Passage de l’e- d’un niveau fondamental à un niveau supérieur) : Instable : Retour à l’état fondamental
• Restitution calorifique: Absorption atomique• Restitution lumineuse: Émission atomique
• E = f (h, c et longueur d’onde)• Notion de transitions spectrales• Spectres de raies spécifiques à chaque élément• Possibilité de dosage spécifique par éléments
(Interférences)• Équation de Boltzman: Ne = Cste x N0e-(E/kT)
• Emission: Ne élevé• Absorption: N0 élevé• Loi # Beer-LambertA = I0/It
• Log10 A = K.l.C K = Coef. d’absorption monochromatique
Schéma général d’un spectromètre d’Absorption Atomique (Emission)
• Une source de photons: Source d’émission• Une source d’atomes: Source d’atomisation• Un monochromateur: Sélecteur de radiations• Un détecteur: Photomultiplicateur +
amplificateur
Source de photons
• Tube à décharge à cathode creuse– Cathode : Élément à doser (sel)– Anode: Lame de Zirconium– Tube ‘rempli’ de gaz inerte (Ne, Ar) – Décharge : Tension 500 - 800 volts – Intensité = qqes mA (suivant élément)
• Obtention du spectre d’émission de l’élément à doser
• Lampes mono élément et multi éléments
Générateurs d’atomes
• Fonction de la nature des éléments à doser• Flamme: Cas général• Atomisation thermique: Détection
plus basse• Flamme froide et générateurs d’hydrures:
spécifique à certains éléments (Hg,As..)• Torche à plasma
Atomisation en flamme
• Objectif: Transformer des espèces de la forme ionique à la forme atomique
• Analyse d’échantillons liquides exempts de particules solides.
• Capillaire: Transfert de l’échantillon vers la chambre de nébulisation
• Nébuliseur: Formation d’un brouillard dans le comburant: Fines gouttelettes
• Brûleur: Transformation des espèces à l’état atomique
Principales Flammes
Combustible
Hydrogène
Comburant
Argon
Température
1000 K
PropaneButane
Air
Oxygène
2200 K
3200 K
AcétylèneAir
OxygèneProtoxyde
d’azote
2500 K3400 K3200 K
Autres Générateurs d’atomes
• Atomisation électrothermique: Four - Séchage (# 100°C)
- Décomposition thermique (100 à1800°C)- Atomisation (1800-2600°C)- Nettoyage Four (2800°C)
• Générateur de mercure HgCl2 + SnCl2….Hg° + SnCl4
• Générateurs d’hydrures As, Sb…Formations d’hydrures (AsH3) + Flamme froide (1000°C)
Sélecteur de radiations et PM
• Monochromateur: Sélection d’une longueur d’onde
• Bande passante: 0,05 à 0,1 nm si spectre complexe sinon 0,5 à 2 nm
• Photomultiplicateur: Permet de compter les photons transmis
• Amplificateur + calculateur
La quantification
• Étalonnage externe (ajouts dosés)• Flamme: Mesure en continu à flux
constant…..Permet de minimiser les fluctuations de la flamme
• Pb des interférences (chimiques, spectrales…)• Utilisation de modificateurs LaCl3, HNO3..• Réalisation de dilutions• Sensibilités: Flamme # ppm
Four # ppb
Exemples d’Applications
• Sols, Sédiments NF X 31-151- Calcination à 450°C -
Solubilisation (HF,HCLO4) - Evaporation et mise à sec - Reprise eau régal(HCl/HNO3)
• Dosage par absorption atomique (Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Zn)
Eaux : Dosage du Hg par SAA sans flamme NF T 90-113
• Minéralisation de l’échantillon par KMnO4 et K2S2O8 à 95°C
• Réduction par SnCl2 Obtention de Hg°• Entraînement sous argon• Mesure à 253,7 nm Cuve à fenêtre• Limite de dosage 0,5 µg/l
Eaux: Dosage de dix éléments métalliques (directe et indirecte)
• NF T90-112 (Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ag, Cd et Pb)
• Flammes air / acétylène - Oxydantes Fe, Ni, Cu, Mn - Réductrices Cr - Normales Co, Zn, Ar, Cd et Pb
• Ex du plomb: 283,3 nm et/ou 217 nm• Dosage direct
Elément Longueur d’onde Détection (ppm)
Cr 357,9 0,1-10
Mn 279,5 0,05 - 4
Fe 248,3 0,1 - 10
Co 240,7 0,1 - 10
Ni 232 0,1 - 10
Cu 324,7 0,05 - 6
Zn 213,8 0,05 - 2
Ag 328,1 0,05 - 4
Cd 228,8 0,05 - 2
Pb 217 0,2 - 10
Dosage indirect
• Complexation(APDC) et extraction du complexe par la MIBC
• Dosage dans le phase organique
Cr 1-200 ppbMn 1-200 ppbFe 1-200 ppbCo 1-200 ppbNi 1-200 ppbCu 1 -200ppbZn 0,5 - 50ppbAg 0,5 - 25ppbCd 0,5 - 50ppbPb 1- 200 ppb