Cours 1 : Introduction à la biologie cellulaire

1 Introduction 1.1 Découverte de la cellule : la théorie cellulaireLa biologie cellulaire par définition c'est la science qui étudie les loi

fondamentale de la vie, science qui va s'occuper donc des cellules et de leur fonctionnement. Les connaissances que nous avons obtenue en biologie cellulaire sont essentiellement liée au outils que les chercheurs ont eu à leur disposition à un moment donné, on va voir que l'amélioration des connaissances en biologie cellulaire est directement liée au technologie qui ont été mis en place à un moment donnée au cours de l'histoire.

La première notion de cellule a été introduite par un chercheur, et ceux dès le milieu du 17éme siècle, par Hooke (1635-1703) qui a introduit donc cette notion de cellule a parlé pour la première fois de cellule, il s'est posé la question : pourquoi lorsqu'on utilisait des bouchons pour fermer les bouteilles de vin ces bouchons étaient efficaces ? Et il a eu l'idée de faire des tranches extrêmement fines de ses bouchons et, de regarder avec un microscope (l'origine du microscope), la structure qu'avait ces bouchons. Et il a observé que ses bouchons étaient sous forme de nid d'abeille, sous forme d'alvéoles et il a appelé ça des cellules parce que sa ressemblait aux cellules dans lesquelles vivaient les moines a l'époque. On a appelé ça pour la premières fois des cellules ce qui évidement n'en n'était pas directement. Donc première fois, HOOKE en 1665.

Près de deux siècles plus tard, d'une part Schleiden (1804-1881) et d'autre part Schwann (1810-1882) qui au 19ème siècle ont émis le postula que la cellule était l'unité structurale et fonctionnelle de tout les être vivants que ce soit les plantes ou les animaux. Donc ça c'est la première théorie cellulaire décrite par Schleiden et Schwann à savoir que la vie est basé sur une unité qui est la cellule. D'autre part ils ont émis les hypothèses que tous les organismes vivants sont constitués soit d'une seul cellule, c'est le cas pour les unicellulaires, soit de plusieurs cellules pour les êtres pluricellulaires.Alors à l'époque ils n'avaient pas encore d'idée sur la façon dont elle se formait, d'où elles venaient mais néanmoins ils ont émis le postula que toute vie reposait sur cette entité qui était représenté par la cellule.

Il faut attendre ensuite 1855 pour que Virchow (1821-1902) un chercheur allemand introduise le troisième principe de la théorie cellulaire : une cellule ne peut provenir que de la division d'une cellule existant. Donc ça ne peut pas apparaître de rien. Une cellule ne peut provenir que de la division d'une cellule préexistant et que c'est grâce à des phénomènes de divisions cellulaires.

En suite c'est grâce à l'amélioration des techniques et en particulier des techniques des microscopies que l'on a pu obtenir d'avantage de renseignement sur le fonctionnement des cellules, et en particulier grâce au travaille d'un autre physicien qui travaillait dans l'optique, qui était un chercheur allemand, Zeiss (1816-1888), qui a fabriqué de nouvelles lentilles de verre qui ont permis au microscope de considérablement améliorer sa résolution, et c'est donc à la fin du 19ème siècle que ce sont faites les premières descriptions de cellules et de tissus et ceux donc grâce à une très forte amélioration de la qualité des microscopes. Tout l'espace de temps entre 1850 et 1900 va correspondre à une période ou on a beaucoup étudié la structure des cellules et période au cours de laquelle on a eu de très nombreuses informations sur la façon dont était structuré en particulier les tissus des organes.

Non seulement il faut améliorer l'outil c'est à dire les microscopes, et il a fallu aussi améliorer les techniques de colorations, en effet les tissus vivant ne sont pas naturellement coloré, donc très difficilement observable au microscope et en conséquence il faut pouvoir, pour les observer correctement, les colorer. Et c'est là encore au cours du 19ème siècle qui ont était mis en place plusieurs sortes de techniques spécifiques entre autres par des chercheurs (espagnoles cette fois) qui ont l'idée de faire des techniques en particulier imprégnation avec de l'argent et qui ont pu mettre en place des structures comme l'appareil de Golgi : GOLGI(1843-1926) et Cajal(1852-1934) ils ont eu d'ailleurs le prix Nobel en 1906 en particulier pour leur description d'un certain nombre de cellules en particulier des neurones,

Maintenant on passe au 20ème : en 1930 a été mis au point un nouveau microscope qui était un microscope qui fonctionnait différemment des précédents, qui est le microscope à contraste de phase, qui a permis d'avoir de nouvelles informations dans la mesure où pour la première fois un microscope a permis d'observer des cellules vivantes, qui n'était évidemment pas le cas avec les autres microscopes qui nécessitait des préparations en amont des observations. On vas voir avec le microscope à contraste de phase pour la première fois on a un microscope qui permet de voir des phénomènes dynamique puisqu'il permet de voir des cellules qui sont des cellules vivantes.

En 1931 a été construit le premier Microscope Électronique à Transmission (MET) qui a été encore réalisé par les physiciens, les microscopes électroniques qui ont permis pour la première fois de publier en biologie en 1945 et c'est en 1945 que nous avons vue apparaître les premières publications contenant des micrographies en microscopie électronique, qui permet d'augmenter considérablement la résolution du microscope donc d'obtenir des images à agrandissement beaucoup plus important.

En même temps qu'a été construit ce MET microscope électronique, on a continué d'améliorer les techniques d'observation et en particulier en 1941 un chercheur anglais dénommé Coons a réussi à localiser des molécules à l'intérieur des tissus et ceci grâce a des anticorps et la réaction antigène-anticorps, et c'est à partir de ce moment là que sont apparus les techniques d'immuno fluorescences qui sont des techniques très couramment encore utilisé à l'heure actuel.

Enfin en 1988, une grande avancé, où a été mis en évidence les premiers microscopes confocaux, qui est de la microscopie a fluorescence particulière. Comme on utilise un certain nombre de technique en biologie cellulaire, il faut aussi connaître les différentes possibilités de tout ces appareil et de surtout connaître les limites de ces outils pour obtenir des résultats satisfaisants.

1.2 Dimensions biologiques – Ordre de grandeurORDRE DE GRANDEURS DES OBJETS BIOLOGIQUES

Dans l'espèce humaine on peut avoir des cellules qui en particulier certains neurones moteurs qui peuvent avoir des prolongement de type axones qui peuvent aller jusqu'à un mètre ou plusieurs dizaines de centimètre. Les plus grandes cellules qu'on peut trouver dans un organisme humain ce sont des neurones qui peuvent avoir plusieurs dizaines de centimètre de longueur.

Des cellules qui peuvent avoir une longueur d'environ 15 cm c'est le cas de certaines cellules musculaires squelettique, qui sont des cellules multinucléées, qui ont plusieurs noyaux, et qui peuvent aller jusqu'à un peu plus de 10cm.

Des cellules qui ont 0,1mm de diamètre c'est le cas des cellules mono-nucléées comme les ovocytes, plusieurs centaines de micromètres.

Des cellules plus petites de l'ordre de 80µm, c'est la cas de adipocytes qui sont

les cellules qui stockent les lipides dans l'organisme et qui peuvent donc avoir des tailles variables en fonction de la quantité de lipide qu'ils stockent.

La plus grande majorité des cellules qui se trouve dans l'organisme humain ont un diamètre qui s’échelonne entre 10 et 30 µm.

En dessous de 10 µm on retrouve quelques rares cellules, c'est le cas des globules rouges par exemple qui ont un diamètre de 7µm, TOUT les globules rouges humain ont cette dimension ce qui est d'ailleurs un repère, lorsqu'on regarde des types de tissus puisque sa permet d'avoir, par comparaison, des idées de la taille des autres cellules puisqu'on sait qu'un globule rouge a un diamètre de l'ordre de 7µm.

En dessous, on retrouve les noyaux : le noyaux des spermatozoïdes par exemple 2µm la plupart des noyaux atteint un diamètre de 5micron

En dessous on trouve un certain nombre d'organites: on trouve les mitochondries de l'ordre de 1µm (sachant que les mitochondrie ont des tailles variables en fonction de l'activité de la cellule dans lesquelles se trouvent ses mitochondries) leur taille vas jusqu'à 3µm. Taille moyenne est de l'ordre de 1micron.

Ensuite on trouve des structures de type lysosome, et là encore la taille est variable en fonction de l'activité lysosomial dans la cellule. En général, les lysosomes font 0,1µm, et sa peut atteindre quelques microns lorsque l'activité de dégradation dans la cellule est importante.

On retrouve des structures fines dans le cytoplasme et en particulier le ribosome fait une trentaine de nanomètres.

Enfin dans le cytoplasme de la cellule, on retrouves des cellules beaucoup plus fines tel que les macromolécules qui seront de l'ordre du nm de diamètre.

Comme repère, la membrane d'une cellule animale varie de 5 a 10 nm d'épaisseur la plupart du temps, et en particulier chez l'homme, les membranes ont une épaisseur de 7,5 nanomètres.

Ensuite on va se retrouver à l'échelle de l'Ångström et là on a à faire aux atomes.

On peut avec un MET observer toute cette gamme de structure, toute la gamme de structure dont je viens de parler peut être observé avec un microscope électronique.

1.3 Organisation de la cellule eucaryote (animale et végétale)QUELQUES GÉNÉRALITÉS SUR L'ORGANISATION DES CELLULES.

Dans le monde vivant il y a deux types d'organisations des cellules : soit ce qu'on appelle les procaryotes soit ce qu'on appelle les eucaryotes, la principale différence est tant que dans le premier cas l'ADN est libre dans le cytoplasme des cellules, tandis que dans le cas des cellules eucaryotes l'ADN est entouré d'une enveloppe.

Caractéristiques des procaryotes : ils ont une membrane qui peut être entouré par une enveloppe qui est plus ou moins complexe, enveloppe qui peut même elle être recouverte par une paroi. Chez les procaryotes l'ADN est circulaire et non entouré par une membrane. Ce sont des organites simples d'organisation qui ont un métabolisme autonome, c'est à dire qu'ils sont capables de se reproduire et de produire de l’énergie. Dans cette catégorie on retrouve les bactéries Les Cellules de type eucaryote : Le matériel génétique est contenu dans un noyau. Ce noyau est lui même entourer d'une enveloppe. La cellule elle même est limitée par une membrane cytoplasmique, qui joue un rôle de limite par rapport au milieu extérieur La première fonction de la membrane est de délimité un espace qui va contenir le cytoplasme, le noyau et les organites. Cette membrane cytoplasmique a aussi un rôle structurant car elle délimite la forme de la cellule et un rôle dynamique dans la mesure où elle participe aux échanges entre la cellule et l’extérieur. Les

membranes de la cellule jouent des rôles fondamentaux sur les fonctions qu'ont les cellules entre elles ou avec leur environnement. Nous verrons en particulier que ces membranes cytoplasmiques sont susceptibles de faire des invaginations pour permettre des échanges avec l’extérieur. Lorsqu'il s'agira d'invagination avec entrée d'éléments, on parlera d'endocytose et lorsqu'il s'agira de faire sortir des substances on parle alors d’exocytose. Les membrane des cellules permettent des interactions avec le milieu extérieur ou avec d'autres cellule pas le biais de jonctions ou des molécules spécifique que l'on va appelé des récepteurs qui sont capable de ce lier a des molécules du milieu environnant et ainsi de permettre de réagir à ces informations qui viennent de l’extérieur. A l'intérieur de la cellule il existe le matériel génétique. Ce matériel génétique est sous forme d’ADN. Cette ADN est contenue dans une enveloppe et ceci constitue le noyau. Cette enveloppe est constituée d'une double membrane formant une citerne périnucléaire. Cette enveloppe n'est pas complètement étanche car elle doit laisser passer dans un sens et comme dans l'autre un certain nombre de molécules et ces molécules passeront par ce que l'on appelle des pores nucléaires. A travers ces pores nucléaires, il y aura la possibilité d'entrer et de sortir des molécules. Ce matériel génétique, lors de la mitose, se condense sous forma de chromosomes pour permettre la répartition de ce matériel génétique dans les deux cellules filles issu de la cellule mère. En dehors de ces périodes de division cellulaire, le matériel génétique peut être observer sous deux formes : l'hétérochromatine et euchromatine. A l'intérieur du noyau, il existe une région particulière qu'on appel le nucléole. Cette portion de l'ADN est transcrite en ARN selon le modèle classique puis ces ARNs quittent le noyau et pour certains d’entre eux vont être traduit en protéines au cours d'un mécanisme qui s'appelle la traduction. C'est dans le cytoplasme que se fait les mécanismes de traduction qui à partir de ARN donne des protéines. Le cytoplasme (= cytosol) est une substance aqueuse sous forme de gel qui contient tout les organites ainsi que de nombreuses inclusions cytoplasmique. Ces inclusions cytoplasmiques sont à la fois des protéines du cytosquelette ou bien des réserves sous forme de glucide comme par exemple des rosettes de glycogène. A l'intérieur de ce cytoplasme il existe des réseaux de membrane qui vont constituer des compartiments membranaires qui communiquent les uns avec les autres soit directement soit indirectement par le biais de vésicules. Parmi ces compartiments il existe le réticulum. Ce réticulum peut être associer a des ribosomes et donc constituer le réticulum endoplasmique granulaire. C'est lui qui sera à l'origine de la synthèse des protéines membranaires. Ce réticulum peut ne pas être associer a des ribosomes et il va alors porter le nom de réticulum endoplasmique lisse. L'appareil de Golgi intervient dans certain nombre de phénomène, notamment dans la maturation des protéines, l'empaquetage des protéines qui sont destinés à être secréter à l'extérieur de la cellule, ce qui sont à l'origine des grains de sécrétions. Cet appareil de Golgi est aussi à l'origine du système de digestion qui existe à l'intérieur des cellules qui constitue le système lysosomale. C'est à partir de l'appareil de Golgi que va se faire tout ce phénomène. Pour fonctionner la cellule a besoin d'énergie et ceci va être, dans les cellules animales, de la responsabilité des mitochondries tandis que, dans les cellules végétales, ce rôle est dévolu aux chloroplastes. Les mitochondries possèdent un génome propre que l'on appel ADN mitochondrial. Il existe une relation directe entre la cellule elle même, son fonctionnement, sa structure et son environnement .En effet un certain nombre de facteur externe que ce soit la matrice intracellulaire, les molécules qui sont libérées par d'autres cellules, l'interaction entre cellules ou entre cellule et matrice, tout ceci constitue l’environnement. Cet environnement peut influé non seulement sur le fonctionnement de la cellule mais aussi sur leur structure.

2. Techniques utilisées en biologie cellulaire

Pour comprendre la cellule il est nécessaire de pouvoir observer les cellules et éventuellement modifier leurs comportements, donc agir sur elles. Ceci nécessite un certain nombre de techniques. Techniques qui vont en d'autre constituer a isoler des

cellules, les cultiver donc à faire des études in vitro et évidemment faire agir un certain nombre de substance pour voir quelles sont les réponses à ces différentes substances. Les cellules d'un organisme pluricellulaire sont assemblées les unes avec les autres sous forme de tissus, ces tissus constituant des organes. A l'intérieur de ces tissus et ces organes les cellules communiquent les unes avec les autres. Comme c'est le cas dans de très nombreux champs disciplinaire, les avancés des connaissances sont directement lier a la mise en œuvre de méthode. C'est grâce à ces très nombreux perfectionnements des techniques que l'on a pu avoir un certain nombre de réponses aux différentes questions que posait le fonctionnement des cellules. Parmi les techniques que l'on utilise en biologie cellulaire il y a deux grades familles de technique des technique dite «  technique morphologique »  , qui vont permettre de faire des observations des cellules , des tissus , voir des parties d'organes . Ça va être sous forme d'observation et tout le reste des techniques qui vont être dans la famille des techniques dites « non morphologique ».

1.4 Techniques morphologiques

Ces techniques morphologiques vont permettre d'observer des cellules ou des tissus et évidemment c'est de les observer dans des conditions qui sont très proche du vivant. Puisque en dehors du microscope a contraste de phase qui permet d'observer des cellules vivantes les autres types de microscopes ne permettent pas d'observer les cellules vivantes. Il faut donc trouver un moyen pour que ce que l'on observe soit le plus proche de la réalité et ceci aille passer par des étapes de préparations avant l’observation.

2.1.1. Microscopie optique ou microscopie photonique

Tous les microscopes ont évidemment une limite. Cette limite est le pouvoir de résolution. Ce pouvoir de résolution est défini comme étant la plus petite distance observable entre deux points sans qu'ils soient confondu. Ce pouvoir de résolution est donné par la formule suivante :

N représente l'indice de réfraction du milieu, c'est à dire le milieu que se trouve entre la préparation que l'on va observer et une partie du microscope qui est l’objectif. Pour l'air, ce facteur N est égale à 1, pour l'huile a immersion elle est de 1,5. Si on remplace l'air par de l'huile on va donc diminuer le pouvoir de résolution et donc obtenir des images plus fines. C’est la longueur d'onde du faisceau émis et qui va traverser la préparation et alpha est la moitié de l'angle du cône de lumière.

La biologie cellulaire est née a la fin du 19éme siècle avec l'annoncé de la théorie cellulaire et c'est surtout grâce a l'observation en microscopie optique ou photonique que vous avez eu les premières descriptions de ces cellules. Très rapidement il y a eu la nécessité d'améliorer et de développer des techniques qui sont des techniques à la fois de préparation des objets que l'on va observer mais du microscope lui même .

Le microscope Photonique (= optique) : Il faut une source lumineuse, dans le cas de la microscopie optique il s'agit une ampoule qui va émettre des photons. Ces photons vont passer à travers un certain nombre de lentilles qui sont d'une part le condenseur, ensuite le faisceau lumineux va traverser une lame de verre qui va supporter la préparation que l'on cherche à observer et ensuite ce faisceau va continuer son trajet a travers d'une part un objectif qui est modulable dans la plupart des microscopes et ensuite un oculaire qui va nous permettre l’observation. Dans le microscope optique, toutes ces structures : oculaire, objectif, condenseur sont

D = 0,61 / N sin alpha

représenter par des lentilles de verre et en général les microscopes qui sont vendu aujourd'hui la source lumineuse provient de la base de l’appareil. Ce sont essentiellement des lentilles de verre qui permet de concentrer le faisceau et de le diriger a travers la préparation et ensuite a travers l'objectif et l’oculaire. Avec le microscope optique on peut avoir des grossissements d'image de 400 à 1000 fois en fonction du microscope et des objectifs qui sont installé sur ce microscope. Pour que le faisceau puisse traverser la préparation il faut que la préparation soit suffisamment fine. Les tissus vivants sont la plupart du temps très peu contrasté et en conséquence si l'on mettait la lame avec une coupe de tissus biologique dans le microscope on ne verrait pas grand chose d'où la nécessité de passer par des systèmes de contraste ou de coloration. Pour obtenir une réparation très fine il existe plusieurs possibilités soit on utilise directement un frottis sanguin. Il suffit donc de mettre une goutte de sang sur une lame de verre et étaler cette préparation grâce à une lamelle et là on aura qu'une seul couche de cellule qui permettra au faisceau lumineux de la traverser. On peut aussi utiliser des suspensions cellulaire, c'est a dire qu'a partir des tissus isolés des cellules et on peut si la concentration en cellules n'est pas trop importante la encore déposer une goutte de ce liquide qui contient les cellules, les étaler et là encore nous aurons qu'une seule couche de cellules sur la préparation. Les choses se compliquent lorsque l'on cherche a observé des cellules dans un organe, par exemple les coupes de tissus. Alors la il existe plusieurs possibilités : soit on passe par des fixations de type chimique en utilisant des substances comme des fixateurs aldéhydique ou des fixateurs de type osmium ( tétroxyde d'osmium ) qui permettent de fixer les tissus dans l'état qu'ils sont et on espère le plus proche du vivant . On peut aussi fixer les tissus par le froid c'est ce que l'on appel la cryofixation qui permet de stabiliser les structures, la encore dans un état le plus proche dans le vivant. Cette cryofixation se fait tout simplement en plongeant les morceaux de tissus ( biopsie de tissus ) dans de l'azote liquide et ensuite ces tissus congelés seront découper en tranche grâce a un cryostat qui permet de faire des coupes a partir de tissus congelés . On peut aussi faire de la fixation par des substances chimique. On trempe les biopsie dans des fixateurs chimiques et ensuite on le lave pour éliminer tout les excédants de fixateur et ensuite on va déshydrater le matériel cela consiste a enlever l'eau et le remplacer soit par de la paraffine pour le microscope optique soit par des résines qui vont ensuite permettre de faire des coupes avec ce que l'on appel des microtomes. Il faut au début remplacer l'eau par un solvant puis ce solvant sera remplacer par des substances, soit de la paraffine (microscopie optique) soit des résines plastique pour la microscopie électronique. Ensuite on va faire durcir ces résines ou cette paraffine ; soit en chauffant pour les résines pour qu'ils deviennent dur qui permettra ensuite de faire des coupes, soit l'inverse pour la paraffine qui est liquide pour lui permettre de pénétrer dans les tissus puis on va refroidir et ensuite on aura un objet solide qui permettra d'être coupé par un microtome. C'est ce que l'on appelle les techniques d'inclusion ( = enrobage ) qui ce font donc soit par la paraffine qui est d'abord liquide a 50/60 °C et puis après on va le refroidir à température ambiante et la paraffine n'est que d'autre de la bougie , a température ambiante c'est relativement solide . A partir de cette inclusion en paraffine on va faire des coupes qui sont des coupes de l'ordre de quelques µm (5 µ). Ces coupes de µm vont être ensuite déposé sur une lame de verre et ces lames de verres seront ensuite colorées pour permettre de faire des observations de ces tissus. Il existe un grand nombre de colorations qui utilise des colorants spécifiques de telle ou telle structure à l'intérieur de la cellule. Ensuite il suffit de mettre cette lame dans un microscope optique pour faire des confirmations et des photos.

2.1.2. Microscopie électronique

En ce qui concerne la microscopie électronique, le procédé est du même ordre, sauf que les outils vont légèrement changer et surtout les substances vont changer, à la place de la paraffine on fait des inclusions avec des résines plastiques qui vont

durcir on va ensuite pouvoir faire des coupes à l’aide de microtomes perfectionnés qui sont appelées des ultra microtomes et qui permettent de faire des coupes très fines puisque l’épaisseur est inférieure à 0,1 micromètre. Ces coupes ultrafines vont être déposées non plus sur des lames de verre mais sur des grilles qui sont en général en cuivre mais peuvent être d’autres métaux. Ce sont ces grilles qui seront introduites dans le microscope électronique. Là encore les tissus biologiques ne sont que très peu contrastés, très peu colorés, et donc pour la ME il faut passer par une étape de contraste (on ne parle pas de coloration car on va être en noir et blanc) et on va utiliser des agents qui sont des métaux lourds en particulier du citrate de plomb ou de l’acétate d’uranyle constitué en parti d’uranium. On va contraster ces grilles qui sont recouvertes de ces coupes de tissu et ensuite on introduira ces grilles à l’intérieur du ME.

Pour préparer ces échantillons biologiques, il existe plusieurs type de ME :Le ME à transmission ou le ME à balayage. Les préparations st différentes dans la mesure où la MEB va permettre d’observer la surface des échantillons et il va falloir recouvrir cette surface, qui naturellement ne serait pas visible dans ce type de microscope, avec des métaux lourds capables d’arrêter les électrons, c’est ce qu’on appelle la métallisation soit avec de l’or soit avec du platine qu’on pulvérise à la surface de l’échantillon que l’on veut observer.On utilise pour la ME, un microscope qui est très différent du précédent pas dans son principe mais dans sa constitution. Le ME va ns permettre d’observer des structures intracellulaires (de toute petite dimension) avec le même principe que la MO mais c’est l’appareil en lui-même qui ne va plus être constitué de lentilles de verre mais par des lentilles de type électromagnétiques. Il va permettre d’observer des structures beaucoup plus fines que le MO, à une échelle beaucoup plus petite, la fixation et la préparation des tissus au préalable doivent être bien meilleure que dans la MO. C’est pour ça qu’on utilise des mélanges de fixateur, en général : mélange d’aldéhyde, formaldéhyde d’une part et du glutaraldéhyde qui sont les 2 fixateurs aldéhydiques les plus utilisés, permettant de fixer rapidement et de façon stable les structures dans les cellules pour leur permettre d’être observées et pour que les observations soient le plus proche de celles qu’elles avaient avant d’être fixées. On utilise aussi de la résine plastique ou araldite, de type époxyde, ensuite on fait des coupes fines de l’ordre de 50 nanomètres d’épaisseur qui sont obtenus grâce à des couteaux en métal dans la MO, alors que dans la ME on utilise des diamants qui permettent de faire des coupes beaucoup plus fines. Contrairement dans la MO où les faisceaux étaient constitués de photons, dans le ME ils sont constitués d’électrons. Il y a donc dans la partie supérieur du ME, une source qui est la cathode (en général un filament de tungstène que l’on va chauffer à plusieurs 100aine voir milliers de degrés, et en le chauffant il va émettre des électrons qui vont être récupérés et mis sous forme d’un faisceau. Donc dans la partie supérieur : il y a une cathode où le filament est chauffé à environ 2700 C° qui émet des électrons qui seront attirés par le pôle + constitué par l’anode, (il y a une différence de potentielle entre cathode et anode pour permettre d’attirer ces électrons). Quand on chauffe un filament les électrons vont être émis dans toutes les directions il va falloir assembler ces électrons pour former un faisceau, ceci est du d’une part et en 1er lieu à l’anode qui va attirer tous ces électrons, il existe donc une tension dans un ME qui suivant les ME est de l’ordre de 40 000 à 100 000 Volts. Ces électrons vont être rassemblés , ils vont ensuite passer à travers un certain nombre de lentilles qui sont des lentilles électromagnétiques, d’une part le condenseur, ce faisceau va ensuite passer à travers la préparation qui est la petite grille en cuivre,et ensuite ce faisceau va passer à travers d’autres lentilles électromagnétiques qui sont constituées par l’objectif le projectif et ces électrons qui ne sont pas visibles à l’œil nu qui viendront frapper à la base du ME, à l’écran qui est recouvert de substances fluorescentes et lorsque les électrons vont venir frapper cet écran , les molécules fluo de l’écran vont être excitées et émettront des photons qui là seront visibles. On

observera une image sur l’écran fluo, ce qui explique que les photos que l’on voit en ME sont d’une part en noir et blanc mais quand on regarde dans le microscope c’est jaune/vert, ce qui est du à la longueur d’onde d’émission des mol qui recouvrent l’écran, il est possible de prendre des photos grâce à un système de plaque photographique qui est en dessous de l’appareil. Grâce à ce type d’appareil on augmente le part de résolution puisque celui d’un ME est de l’ordre de quelques nanomètres et on peut descendre jusqu’à 2 nanomètres, on obtient un facteur 100 par rapport à la microscopie optique.Il y a un certain nombre de lentilles, grâces auxquelles on peut avoir différents grandissements. Avec un ME, on peut avoir des grandissements qui st de l’ordre de 30 000 voire 50 000 fois l’objet de départ et même avec de très bons microscopes et des très bonnes préparations on peut avoir des grandissement s qui vont jusqu’à 100 000 fois si donc la prépa est excellente.Le ME est constitué d’une colonne dans laquelle il y a les différents éléments situés juste avant. A l’intérieur de cette colonne règne un vide très poussé, on est obligé de faire le vide car la moindre mol de gaz présente dans la colonne risquerai de dévier le faisceau d’électrons et on ne pourra alors faire aucune observation, pour éviter qu’il y ait ces déviations des faisceaux d’électrons par des mol de gaz ont fait un vide très poussé ce qui rend l’appareil beaucoup plus complexe qu’un simple MO, ça explique aussi qu’on ne peut pas voir de cellules vivantes avec un MET.Le MEB : il ne permet non plus d’observer des coupes mais des surfaces des objets ,on ne réalise donc pas des coupes de tissus mais on va observer la forme des tissus ou des cellules. Pour pouvoir faire ces observations il faut métalliser les objets de manière à ce que le faisceau d’électron vienne frapper les métaux lourds (or, platine) et ainsi permettre par des différences de contraste des images. On a tjrs un filament qui va être chauffé et émet des électrons qui seront attirés par l’anode dont la tension dans un MEB est plus faible que celle d’un MET, ce faisceau est ensuite dirigé vers un condenseur il va passer à travers des bobines qui sont mobiles et qui vont permettre de faire un balayage de la surface et d’obtenir les images caractéristiques que l’on trouve en MEB. Il permet de voir des structures très fines comme des glomérules rénaux, mais aussi de voir des structures beaucoup plus volumineuses comme un insecte. Utilisation du MEB pour observer une vaste gamme de dimensions ça va de petites particules jusqu’aux insectes.En 1930, sont apparus les microscopes à contraste de phase. Ils sont très importants car ils permettaient pour la 1ere fois d’observer des cellules vivantes. Dans ce cas on ne fait aucune fixation, aucune coupe, aucune coloration, on peut directement en mettant une boite contenant des cellules en culture observer les cellules avec ce type de microscope. Evidemment comme on ne fait aucune coloration, les contrastes seront beaucoup moins forts qu’avec la microscopie photonique classique. Le principe est simple : les différentes structures qui sont dans une cellule ne vont pas dévier toutes les ondes de la même manière , on va envoyer à travers une cellule des ondes lumineuses qui vont traverser la préparation, quand les ondes vont venir frapper les structures présentes des la cellule, ces ondes seront déviées soit de la même manière (toutes les ondes sont des la mm phase et des ce cas il y aura une augmentation de la brillance et de l’intensité lumineuse) à l’inverse lorsque les ondes vont être déviées par les structures présentes à l’intérieur des cellules , les ondes ne sortiront pas dans la même phase et il y aura diminution de la brillance ) Ainsi en fonction de la cellule, de sa structure et de ce qu’elle contiendra, on va pouvoir observer des zones plus ou moins brillantes . (On peut observer des cellules végétales). Ceci a permis d’observer un certain nombre de choses en particulier les phénomènes dynamiques : les déplacements de cellules, des mécanismes de mitose (de division cellulaire), ou déplacement de cert1 organites à l’intérieur même de la cellule.

En dehors de ces microscopes soit photoniques soit électroniques, il existe des microscopes à fluorescence.

Ces microscopes sont particuliers car ils vont permettre d’observer des molécules fluorescentes, ces molécules fluorescentes sont particulières puisqu’elles ont un certain nombre de propriétés : absorber de la lumière à une certaine longueur d’onde et de réémettre de la lumière à une longueur d’onde qui est en général différente. Ils sont plus volumineux que les autres dans la mesure où au lieu d’avoir une simple ampoule pour émettre de la lumière, ils ont un système de lampe à UV. La lampe à UV émet une lumière avec une longueur d’onde d’excitation lambda 1, qui va traverser la préparation et donc les mol fluo qui s’y trouvent, des mol fluo vont réémettre une lumière qui sera une longueur d’onde supérieure lambda 2, et quand on met un filtre d’arrêt pour empêcher la longueur d’onde Lambda 1 de passer on observe que les mol ont été éclairées par cette longueur d’onde qui est lambda 2. On va ainsi avoir une image caractéristique de cellules qui ont été marquées avec un fluorochrome qui émet dans une lumière verte et qui permet entre autre de voir les différents éléments du cytosquelette. Plusieurs filtres : excitation, filtre d’arrêt qui ne va laisser passer que la longueur d’onde émise par la mol fluo qui a été excitée. Il existe de nombreuses mol capables de fluorescer, les plus couramment utilisées : la fluorescéine qui fluoresce en vert, les mol de fluorescéine absorbent la lumière dans le bleu et restituent une lumière dans le jaune/vert suivant le type de fluorescéine. Il existe d’autres mol comme la rhodamine qui elle restitue la lumière rouge. Ce type de micro est surtout utilisé pour observer la présence de mol à l’intérieur des cellules, avec ces microscopes on ne peut observer l’aspect général des cellules mais on va pouvoir aller rechercher à l’intérieur de ces cellules ou des tissus des molécules particulières.Il existe un cas particulier de fluorescence qui a permis d’apporter dans la fin des années 1900, beaucoup d’infos sur les cellules = le micro confocale. On remplace la lampe UV par un rayon laser qui va émettre une lumière à une longueur d’onde qui est toujours d’excitation, elle va venir exciter les mol fluo présentes dans la préparation et ces mol fluo vont réémettre une lumière avec une longueur d’onde différente. L’intérêt d’un tel microscope est qu’il va permettre d’observer des échantillons beaucoup plus épais qu’avec ceux à fluorescence classique et il va pouvoir faire des coupes optiques , c'est à dire qu’on va pouvoir agir sur le microscope de manière à ce que le rayon laser aille que dans la partie superficielle de l’échantillon pour faire une acquisition de l’image ensuite on va pousser ce rayon laser un peu plus profondément pour avoir une région plus profonde de la préparation et tt ceci en jouant uniquement avec la profondeur de l’entrée du rayon laser de sorte qu’au fur et à mesure on va pouvoir faire des coupes optiques à l’intérieur de notre préparation et ensuite grâce à un système d’informatique on peut faire des reconstitutions d’images en 3D , et ce microscope a permis de répondre à certaines questions en particulier de localiser beaucoup plus finement les mol car avec l’autre type de micro on pouvait éventuellement dire que tel marquage était à tel endroit mais comme on avait qu’une vue en surface il était difficile de dire si par ex la mol recherchée était juste sur la membrane ou si elle était dans le cytoplasme ou mm dans le noyau , avec cette reconstitution d’image en 3 D en dehors du fait que les images sont beaucoup plus fines, on arrive à savoir si ce que l’on observe est en surface ( marqueur membranaire) ou au contraire à l’intérieur même de la cellule. C’est le balayage du faisceau laser, et ensuite le traitement numérique de ces images qui va ns permettre d’obtenir ces fameuses coupes optiques.Il existe d’autres techniques qu’utilisent la fluorescence (on s’éloigne de celles morphologiques) qui permettent d’utiliser la fluorescence pour étudier les interactions entre des mol et en particulier leur dynamique. C’est ce qu’on appelle la technique de type FLIP ou FRAP, elle consiste à irradier les cellules, ou régions de la cellule, de façon continue et de regarde la perte de la fluorescence, lorsque l’on irradie une mol fluo elle va réémettre dans une autre longueur d’onde et au bout d’un certain temps ces mol fluo vont s’éteindre, on irradie donc une région particulière de la cellule, la fluorescence va s’éteindre et on regarde comment revient la fluorescence.Il existe aussi la technique de FRET qui permet d’étudier les interactions entre les

protéines : on prend une pro recouverte d’une mol fluo, une autre mol marquée par une autre mol fluo on irradie la 1ere mol, cette mol va émettre un rayonnement lumineux dans une autre longueur d’onde, cette deuxième longueur d’onde va exciter la 2eme mol fluo qui va elle émettre dans une 3eme couleur et si les mol sont suffisamment proches l’unes de l’autre il va y avoir émission de cette 2eme couleur, ça permet de voir et d’observer dans les cellules si les mol sont suffisamment proches, si elles interagissent les unes avec les autres car il va y avoir un transfert d’énergie d’une mol fluo à une autre mol de fluo.

Pour localiser les structures de façon précise dans les cellules, on utilise soit des colorants spéciaux qui colorient des structures particulières soit utilisé des anticorps qui vont reconnaître des antigènes, les AC étant spécifiques de l’AG, en choisissant un AC adapté à l’AG recherché…

Alors, on peut observer évidemment avec les microscopes que nous avons vu jusqu'à présent un certain nombre de structures dans la cellule. Maintenant on peut avoir des besoins de localiser préci-sément une molécule ou une structure à l'intérieur de ces cellules. Pour localiser de façon spécifique cette structure et l'identifier par rapport a une autre structure , on peut utiliser plusieurs autres tech-niques et en particulier ce que l'on appelle des techniques d'immunohistochimie, des techniques d'immunofluorescence, dont on fait appel en microscopie à fluorescence ou encore l'autoradiogra-phie .

La 1ère technique c'est l'histoenzymologie, comme son nom l'indique, il permet de détecter une ac-tivité enzymatique à l'interieur d'une cellule . On va voir que l'immunohistochimie va permettre de détecter la présence de protéine grâce à des interactions entre un antigène et un anticorps, et nous verrons une 3è technique qui fait aussi appel à la microscopie c'est l'hybridation in situ qui permet de localiser des acides nucléiques . Il y a 3 grandes familles, l'histoenzymologie, qui permet de loca-liser des enzymes, des protéines à activités enzymatiques, l'immunohistochimie qui permet de loca-liser n'importe quel type de structure pourvu qu'on aie l'anticorps capable de la reconnaître, et mettre en évidence des acides nucléiques grace a l'hybridation in situ .

L'histoenzymologie permet de mettre en évidence des enzymes . Le principe est simple , l'enzyme est une protéine . Lorsqu'on lui donne un substrat, il va transformer ce substrat en un produit. Évi-demment, on va vouloir visualiser ce produit, il faut que le substrat, une fois transformé, soit lui-même visible. Et grâce à ce type de technique, on a pu mettre en évidence des enzymes comme le peroxydase par exemple, dans les cellules, ce sont des enzymes que l'on a mis en évidence soit au microscope optique soit au microscope électronique, en leur donnant un substrat, qui était ce que l'on appel la diaminobenzidine (dab) qui est un substrat qui est quasiment incolore normalement et ici çà peut réagir avec la peroxydase, se transforme en un précipité rouge brun ou marron, et ceci en présence d'eau oxygénée. Autrement dit, dans un tissu, si vous avez l'enzyme, la peroxydase et que vous mettez la (dad) et de l'eau oxygéné, la réaction enzymatique va se faire, et il va y avoir appari-tion d'une coloration brune .

Les précipités bruns que vous voyez par sa présence indique la présence de l'enzyme de la peroxy-dase grâce au substrat qui a été transformé en un produit qui est maintenant visible. Une subtilité, le précipité que l'on obtient, le produit que l'on obtient soit dense au électrons et on peut tout à fait adapter cette technique avec la microscopie électronique. On peut l'adapter pour la microscopie électronique en utilisant un substrat dans le produit obtenu après la transformation enzymatique sera donc …

C'est grâce à ce type de technique que l'on a mis en évidence l'activité des paroxydases dans cer-taines cellules, que l'on a mis en évidence l'activité de certaines enzymes comme le phosphatase dans des structure qui ont la charge de la dégradation dans les cellules çàd les lysosomes . Les phos-phatases acides présent dans les lysosomes ont été mis en évidence par ce type de réaction.

Autre type de technique, qui fait appel à un autre principe, c'est l'immunohistochimie et l'immuno-fluorescence. De quoi s'agit-il? Pour localiser un certain nombre de macromolécules dans les cel-lules, les glycoprotéines, les protéines ou encore toutes autres AG on va utiliser un anticorps qui va reconnaître de façon spécifique cette macromolécule. Il y a de grandes spécificités entre un antigène et un anticorps, et si on met un anticorps sur une préparation, il va aller spécifiquement sur son anti-gène. On va donc utiliser différents type d'anticorps, soit des AC polyclonaux ou bien des AC mo-noclonaux .

Cette technique permet de visualisant l'anticorps. En visualisant les AC car avant de le mettre sur la préparation, on a préalablement associer à l'anticorps, soit une molécule fluorescente, soit une molé-cule qui est visible en microscopie soit optique , soit électronique.

Sur le schéma, on a l'antigène, et l'anticorps qu'on a accouplé à un fluorochrome. Une fois que l'an-ticorps s'est fixé à son antigène . Évidemment on fait des rinçages pour ce debarasser des AC qui on pas fixé et voici l'observation que l'on peut faire: la ou on voit du vert, celà signifie que l'anticorps dirigé spécifiquement sur son antigène spécifier et çà veut dire que l'antigène était bien présent à cet endroit-là. On peut également couplé non pas une molécule fluorescente sur l'anticorps, mais on peut très bien lui couplé une molécule qui est une enzyme . Là encore, comme précédemment, on pourra donner, une fois que l'anticorps sera fixé à son antigène, il suffira d'ajouter un substrat inco-lore, l'enzyme qui s'est fixé à l'anticorps va transformer ce substrat en un produit qui est visible, et à l'endroit où on verra le produit coloré, çà signifiera que l'anticorps est bien présent et qu'il s'est fixé à son antigène, et donc que cet antigène était présent bien présent à cet endroit la .

On peut coupler de la fluorescence , des enzymes, et aussi des billes d'or essentiellement, on peut les visualiser en microscopie électronique. On peut aussi voir des petites billes noirs qui peuvent avoir plusieurs diametre. Et mettre en evidence des choses differentes en accouplant ces billes avec des anticorps , tel taille de bille or avec cette AC et mettre d'autre billes d'or de taille encore diffé-rentes . çà permet de visualiser en microscopie électronique .

Cette technique fait appel à de l'immunohistochimie classique . On a un anticorps qui reconnaît un antigène. Parfois l'antigène n'est pas suffisamment représenté dans notre cellule et on n'observe pas forcement de signal. C'est pas que l'antigène n'est pas présent mais tout simplement parce qu'il n'est pas présent en quantité suffisant pour pouvoir être visualiser. On utilise ce qu'on appelle des tech-niques d'immunohistochimie indirecte, qui consiste tout simplement à utiliser un 1er anticorps qui est ici dirigé contre l'antigène que l'on recherche, ce 1er anticorps n'est pas marqué il n'a pas de mo-lecule de fluorochrome ni d'enzyme, mais on va ajouter dans un 2è temps un 2è anticorps qui est évidemment va se fixé sur le 1er anticorps. On voit que sur un même anticorps plusieurs anticorps secondaires vont venir se fixer, et ensuite accroître considérablement le sillage . Autre type de tech-nique qui est couramment utiliser en biologie cellulaire est l'autoradiographie . Cette technique consiste a détecter et visualiser des molécules radioactives qui on était préalablement introduite dans les cellules ou dans les tissus . On procède de la manière suivante : soit injecter la molécule ra-dioactive que l'on appel un processeur radioactif , soit injecter un … , soit infuser un morceau de tissu ou des cellules en culture avec ce processeur radioactif . Ce processeur radioactif va entrer dans la constitution des macromolécules biologique et si c'est un acide aminé radioactif il va être in-corporer dans la fabrication de protéines , si c'est un sucre il va être incorporé dans un macromolé-cule glucidique etc … La protéine en question ou le sucre complexe va devenir radioactif et on va pouvoir grâce a cette technique d'autoradiographie mettre en évidence l'endroit ou ce trouve cette

molécule radioactive . Pour cela on va procéder en général a une technique d'histologie classique qui évidemment qui fait suite au phénomène d'incorporation de l'élément radioactif ensuite on va tremper cette coupe dans une émulsion photographique qui est la même chose qui recouvrait les pellicules photographique , bien sur ici c'est sous forma liquide . On va tremper la lame qui contient la coupe du tissu qui elle même contient l'élément radioactif dans cette émulsion photographique . On va donc obtenir la lame de verre avec la coupe du tissu qui est recouvert par cette émulsion pho-tographique . On va infuser cela pendant un certain nombres de jours voir de semaines a l'abri de la lumière , ça dépend de l'isotope qui est utilisé . Ensuite on va faire un traitement , qui est un traite-ment classique de révélation utiliser en photographie et a l'endroit ou il y avait l'élément radioactif et bien les grains d'argent qui constitue l'émulsion photographique vont être réduit . Il va y a voir un phénomène de réduction des grains d'argent de l'émulsion photographique et a l'endroit ou il y aura ces grains d'argent qui vont apparaître comme des petits point noirs et bien ça sera la marque de la présence de notre molécule radioactive . Cette autoradiographie va permettre de mettre en évidence des molécules et nous verrons ultérieurement l'utilisation de suivre et bien les travers de synthèse de certaines molécules grâce a cette technique d'autoradiographie . Ça permet de faire des études dyna-mique et de suivie de synthèse de molécules . Ceci grâce a l'observation dans un microscope clas-sique de ces grains d'argent qui apparaissent en noir sur la photo . Autre technique couramment uti-liser en biologie cellulaire est l'hybridation in situ . L'hybridation in situ va permettre de détecter et visualiser des chaines d'acide nucléiques . C'est une technique spécifique de la mise en évidence d'acide nucléique dans une cellule ou un tissu . Cette technique ce base sur le principe d'affinité que peuvent avoir des chaines d'acide nucléique entre elles lors qu'une réaction d'hybridation . Le prin-cipe sera hybrider 2 acides nucléiques , un présent dans la structure des cellule in situ et grâce a l'utilisation d'une autre chaine d'acides nucléiques que l'on appèlera une sonde . Le principe est un peu le même que l'on avait dans la relation AC/AG . Dans un cas on a un AC qui aller venir recon-naître un AG présent dans la cellule , la dans l'hybridation in situ on remplace l'AG par une sé-quence d'acide nucléique dans la cellule in situ et les AC on les remplace par une sonde qui est elle même une chaine d'acide nucléique . Il suffira que la sonde utiliser soit visualisable soit par une en-zyme, soit par une molécule fluorescence et on verra donc la ou il y aura hybridation visualiser la chaine d'acide nucléique rechercher grâce au microscope à fluorescence. On peut rechercher dans la cellule toutes formes d'acide nucléique que ce soit de l'ADN ou que ce soit de l'ARN . On peut mettre en évidence soit de l'ADN génomique soit si il y a eu infection par un virus des molécules d'acide nucléique viral, ARN viral ou des ADN bactériens ou soit de l’ADN mitochondriale, . C'est de plus en plus le cas actuellement on peut aussi utilisé des hexonucléiotides de synthèse , c'est a dire que l'on fait fabriquer . Il suffit de donner la séquence d'un oligonucléotide . En général c'est les plus petite taille qui compose l'ADN , qui est spécifique de la région rechercher et on le commande . On demande qu'elle soit marquée par un fluorochrome ou une enzyme et on peut ainsi cette tech-nique d'hybridation . On peut aussi utiliser un ADN bicaténaire mais il faut qu’il soit alors séparée de son brun complémentaire. On utilise d’autres types de marquages comme avec la sonde froide qui sera marquée par de la biotine-avidine ou de la digoxigénine ou par un fluorochrome, une sonde radioactive passera par une étape plus longue car on va faire un étape d’autoradiographie en recou-vrant notre coupe de tissu avec une émulsion radiographique puis on attend plusieurs semaines, voir mois selon la coupe observée et on observe ce que l’on a à droite du poly page 20 une coupe de cer-veau de souris congelé coupé par un cryostat et sur lequel on a pu montré l’expression d’une pro-téine qui est la Calbiding s’exprimant dans certaines zones particulières du cerveau. Peu importe ce qui est important c’est de retenir que cette technique permet de montrer les séquences d’acides nu-cléiques codant cette protéine. Cette technique permet de mettre en évidence aussi bien des ARN que des ARN messager ou même des morceaux d'ADN viraux . Cette technique d'hybridation in situ permet d'abord de visualiser cette séquence d'acide nucléique et bien peut être couplé a d'autres techniques et en particulier a des techniques d'himmunohistochimie . Ceci peut avoir un intérêt pour par exemple dans un tissu localiser a l'endroit ou est exprimé un ARN messager et de localiser en parallèle sur la même coupe ou sur une coupe voisine la protéine grâce a des immunohistochimie . On peut donc mettre en évidence a la fois l'ARN messager qui sera traduite pour donner la protéine

et la protéine . Très rapidement lorsque l'on a mis en évidence et développer toutes ces techniques de microscopie est apparu nécessaire encore de pouvoir quantifier un certain nombres de phéno-mènes que l'on visualisait . Lorsque l'on a décrit de façon qualitative un phénomène , c'est a dire de dire telle protéine, antigène présent dans telle partie de la cellule et a tel endroit il peut être néces-saire aussi de dire que dans telle partie du tissu il y a plus de protéines qu'il y en a dans d'autres ré-gions de ce tissu . Et donc est apparu nécessaire d'avoir des informations ou des données quantita-tives sur le phénomène observer . C'est pour ça que c'est apparu la microscope quantitative . Elle fait appel tout simplement a l'utilisation de caméra . C'était au départ des caméras et par des logi-ciels qui nécessitaient d’être couplé a des systèmes de traitement d'image , maintenant il existe des caméras numérique blanc/noir ou couleurs qui permettent de numériser directement . Donc de rendre sous forme informatique des informations de type image . Grâce a des logiciels dédier d'ana-lyse d'image on peut faire de la quantification et c'est ainsi que l'on peut faire des mesures par exemple de volume de cellules , volume de noyaux , on peut mettre en évidence , calculer avant et après un traitements par exemple l'apparition ou la disparition d'un certains nombres de structures comme des capillaires dans un tissu , on peut faire des mesures de surface membranaire après la en-core d'action d'un médicament ou d'un produit qui est censé agir sur la surface etc , etc … Cette mi-croscopie quantitative est extrêmement importante car elle permet non seulement après un examen qualitatif d'avoir des observations qui sont des observations quantitatif sur l'effet d'un produit et bien autres choses . C'est donc un microscope de bonne qualité couplé a un système de informatique par l'intermédiaire d'une vidéo . En dehors de toutes ces techniques de microscopie il existe évidem-ment en biologie cellulaire un grand nombre de techniques qui ne sont pas morphologique . Qui vont donc pas permettre d'observer dans la cellule ou dans le tissu des molécules ou des macromo-lécules et que l'on appel sous le nom générique de «  non-morphologique » . Elles sont en nombre extrêmement importantes . Ça va de la culture cellulaire , ce qui permet dans des chambres de culture de faire pousser des lignés de cellules et donc de pouvoir faire un certains nombres de test sur ce culture de cellules . Ça passe aussi par des techniques biochimiques qui consistent a purifié des molécules a partir de cellules ou a partir de tissu pour pouvoir faire l'étude de ces macromolé-cules par le fractionnement sub cellulaire. Les techniques non morphologique permettent d'isoler de façon spécifique différentes fractions a l'intérieur des cellules , comme par exemple quelqu'un qui veut travailler spécifiquement sur les mitochondries et bien il y a ce que l'on appel le fractionne-ment sus cellulaire qui va lui permettre d'isoler de façon spécifique les mitochondries d'une cellule pour pouvoir travailler uniquement sur les mitochondries ou au contraire uniquement sur le noyau etc … . Grâce donc a cette technique de fractionnement sus cellulaire qui permet de différencier les différentes structures dans une cellule . Nous allons voir que parmi les techniques utiliser en biolo-gie cellulaire il existe des techniques comme la cytométrie en flux qui va permettre de faire de la quantification … et surtout quand elle est associée a un trieur , de trier des cellules . C'est une tech-nique qui fait appel la encore a une molécule fluorescente . On va pas visualiser la fluorescence mais on va l'utiliser pour faire du comptage voir trier les cellules . Ces molécules fluorescente sont accrocher a des AC . Ces AC vont reconnaître de façon spécifique des AG qui sont essentiellement mais pas uniquement a la surface de la cellule . C'est pour des molécules a la surface de la cellule mais c'est applicable aussi pour des molécules qui sont a l'intérieur de la cellule . Ceci fonctionne de la façon suivante, de manière tubulaire : les cellules qui sont dans le prélèvement passe pas un sys-tème de tuyaux, de tubulures ou de capillaires et aboutir a une chambre d'observation . Il va y avoir dans cette chambre d'observation un système de détection constituer d'une pipette extrêmement fine qui va faire passer les cellules a partir du mélange une par une . Ces cellules qui serons ou non mar-quée va passer devant un rayon laser qui va être capable de voir si la molécule et fluorescente ou non . Si elle l'est , elle va la comptabilisée et si elle la voit pas elle va la laisser partir sans la comp-tabilisé . De plus, elle va permettre a partir d'un échantillon de cellules marquées et d'autres non marquées et bien de déterminer dans quelques fractions de secondes , cela dépend du volume du nombre de cellules , ça peut prendre quelques minutes pour que tous les cellules passent a l'intérieur de ce système mais ça permet dans des temps extrêmement bref que comptabilisé dans un mélange de plusieurs milliers voir plusieurs millions de cellules pour calculer et déterminer le nombre de cel-

lules marquées . Le cytométrie en flux peut être associé a un trieur de cellules . C'est a dire que lorsque le détecteur va détecter la présence de la molécule fluorescente il va être capable de dirigé vers un tube la cellule marquée ou au contraire la cellule qui ne sera pas marquée sera dirigée vers un autre tube et ainsi grâce a ce type de technique on peut séparer deux types de populations de cel-lules mais bien entendu il faut qu'il y ai des marqueurs spécifique . (On utilise un AC dirigé contre un type de marqueur comme c'est le cas pour les cellules qui sont CD4 positives comparait a des cellules qui sont CD4 négatives . Si on utilise un AC anti CD4 on va pouvoir séparer d'un coté toutes les cellules qui sont CD4 positives et ceux qui sont CD4 négatives .) Voilà petite liste des techniques qui vont être utilisé pour des très nombreuses applications , en particulier des applica-tions médical , on peut typé des leucémies qui ne portent pas toutes les mêmes antigènes grâce a cette technique . C'est a dire telle type de leucémie a tel groupe ou a tel autre . On utilise la cytomé-trie en flux en routine dans tous les laboratoires de biochimie . On peut grâce a cette technique faire des numérations de sous population , par exemple a partir de prélèvement sanguin on extrait les lymphocytes . Il existe plusieurs type de lymphocytes et bien en fonction de leurs AG, on va pou-voir déterminer et séparer les différentes sous populations lymphocytaires . On peut étudier les cycles cellulaires en utilisant des marqueurs . On peut aussi faire un certains nombres de recherches plus fondamentales sur les métabolismes cellulaires. La ploïdie des tumeurs est très utilisée pour la recherche du développement cellulaire. Autre technique couramment utiliser en biologie cellulaire est la chromatographie . cette technique consiste a séparer des molécules a l'intérieur d'un mélange . On va faire couler sur une colonne ( = colonne de chromatographie ) un mélange de différentes mo-lécules . En général ces colonne contiennent des éléments, un solvant qui vont permettre la sépara-tion entre 2 phase , une phase dite fixe et une autre dite mobile . Il existe plusieurs types de chroma-tographie en biologie cellulaire ., en particulier la chromatographie en gel . Cela consiste et bien tout simplement que la colonne de la chromatographie contient des petites billes qui sont poreux et qui vont donc formé un gel . Le mélange de 2 protéines que l'on va déposer en haut de la colonne vont descendre dans cette colonne mais suivant le type de chromatographie elles vont pas a la même vitesse . En effet certaines protéines de grandes taille vont mettre plus de temps a descendre que les molécules de petites taille . Si on part d'une colonne qui contient un mélange de 2 molécules noire et d'orange . Les molécules noire étant plus volumineuses que les molécules orange . Les molécules orange vont descendre plus rapidement . Bien sur en ajoute en haut un solvant qui entraine les molé-cules . Les molécules orange étant plus petites vont descendre plus rapidement . Il existe des chro-matographies ou c'est l'inverse ou les petites restent plus longue temps car elles vont se perdre dans le gel . Mais il faut savoir que le principe est de séparé les éléments en fonction d'un certains nombres de paramètres en particulier de leur taille . La en locurence ce sont les oranges qui vont descendre les premières . On va les recueillir dans un tube puis on va passer a un autre tube qui va retenir la fraction contenant les protéines qui sont ici noires . Grâce a ce système on a put purifier un mélange qui contenait 2 types de molécules , des molécules A et des molécules B . Il existe ce sys-tème avec un gel munit de lignes qui sont poreuses a travers les quelles les molécules vont des-cendre . Il existe aussi ceux que l'on appel des chromatographies d'affinité qui consiste la a accro-cher sur le grille des AC spécifique d'un AG particulier . On met au dessus de la colonne un mé-lange contenant évidemment des molécules qui continent cette AG . Cette AG va être reconnu par les AC qui sont fixer sur le grille et donc cette molécule va resté coincer dans la colonne . Toutes les autres molécules vont passer , car il y a pas de raison qu'elles reste sur la colonne . Par contre les molécules qui on était accrochées par les AC vont y resté . On ce débarrasse de toutes les autres mo-lécules et ensuite il suffit de faire passer un liquide qui va décrocher l'AC et son AG et on peut récu-pérer dans un 2éme temps la molécule qui est recherchée et sur la quelle on avait fixée un AC sur ces protéines. Ceci se fait dans des tubes. (Il existe dans le commerce des … qui sont préalablement fixer a tel ou tel type d'AC . Il suffit de les mettre dans des colonnes de type chromatographie d'affi-nité pour permettre d'isoler de façon spécifique la molécule rechercher. Autre technique couram-ment utilisé est l'électrophorèse sur gel. (Attention, à partir d’ici, le cours change mais il ne rajoute pas grand-chose de différent) Il permet d’estimer le poids moléculaire des protéines. Nous avons différentes types de protéines qui sont les protéines A, B et C qui sont issus de broyat de tissus par

exemple. On va dénaturer ces protéines en les chauffant et en utilisant du SDS pour dodécyl sulfate de sodium. Le SDS est un détergent qui va se mettre sur la surface des protéines, les recouvrir de charges négatives. Par ailleurs, on va mettre des agents réducteurs qui vont couper les ponts disul-fures qui sont des ponts qui s’établissent entre deux cystéines. On a un mélange de protéine recou-vert de charges négative et on va déposer ces protéines dans un gel. On soumet ce gel qui est un gel d’acrylamide, substance chimique où les protéines vont pouvoir migrer. Elles migrent car on sou-met le gel à un courant continue, les protéines étant chargés négativement, elles seront attirés vers le pole positif. Les protéines migrent vers le pole plus en fonction de leur taille. Les protéines volumi-neuses auront du mal à migrer, à passer à travers les mailles du gel et auront tendance à rester en haut. A l’inverse, les petites protéines seront en bas du gel. Cela permet de séparer les protéines se-lon leur poids moléculaire. Ceci est un Western Blot ou électrophorèse en français. Pour identifier les protéines, on va tout simplement tranférer les protéines sur un filtre qui est un filtre de nitrocel-lulose. Là encore par un système électrique, nos protéines chargés négativement seront attirer par ce filtre et ces protéines seront incubés avec des anticorps et on obtient le résultat page 24 du poly. Vous le voyez à droite, on a un filtre avec différentes bandes qui correspondent aux protéines avec des poids moléculaires différents. Si on veut estimer le poids des protéines, il faut faire migrer un mélange de protéines témoins à poids moléculaires connues dans un circuit parallèle. Il existe de nombreuses autres techniques comme la radioactivité pour suivre la synthèse d’une molécule dans le temps. Moins utilisé car la contrainte d’utiliser des molécules radioactives est importante donc il faut beaucoup de sécurité et d’autre part, le coût pour se débarasser des déchets radioactifs est beau-coup plus cher que l’achat de la molécule radioactive. C’est pour cela que l’on utilise les sondes froides dans l’hybridation in situ. On peut utiliser la culture cellulaire. Evidemment, on peut alors faire un fractionnement cellulaire pour isoler les différentes parties contenues dans une cellule. On peut faire des choses qui touchent à la biologie cellulaire : extraire de l’ADN ou ARN, les purifier, faire des déterminations de séquences, on peut introduire des plasmides dans des cellules pour faire exprimer des nouvelles choses dans les cellules qui est la transflexion. Ceci sont des expériences utilisés couramment dans les laboratoires. Les autres techniques couramment utilisé sont la bio-in-formatique , en effet l'informatique est devenu un outil indispensable non seulement pour piloté les instruments que l'on utilise mais aussi pour permettre le stockage des donnés . Il est évident qu'on vois l'importance de stocker les donnés sous forme de banque ce qui permet de faire des comparai-sons de séquence de molécule, des imageries.. Lorsque l'on pose des questions en biologie cellulaire on fait appel a des techniques qui sont très nombreux , complémentaire les unes avec les autres . Maintenant pour étudier un phénomène biologique et en particulier au niveau cellulaire il faut passé par de différentes techniques , comparait les résultats des différentes techniques et ne pas ce conten-té d'une seule technique comme autre fois avec seulement la microscopie car chaque technique ap-porte un élément de réponse à une question, la multiplication d’utilisation de ces techniques apporte une réponse beaucoup plus précise sur la question.