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50
Biologie Cellulaire & Biologie Moléculaire L3 UE 5.2 2013-2014 Cours n° 10 : Jeudi 7 novembre 2013 V •Transcription Techniques d’études Principes généraux Conclusions Cours 10 BC&BM 2013-2014 255

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Biologie Cellulaire &

Biologie Moléculaire

L3 UE 5.2 2013-2014

Cours n° 10 : Jeudi 7 novembre 2013

V •Transcription Techniques d’études Principes généraux

Conclusions

Cours 10 BC&BM 2013-2014 255

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Technique 8 : Retard sur gel

256 T

P 200

256 Cours 10 BC&BM 2013-2014

Identifie une interaction ADN/protéine mais Ne précise pas le site de fixation :

Technique 9 : Empreinte à la Dnase I

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Technique 9 : Empreinte à la Dnase I

257

Empreinte à la Dnase I

1 Purification de promoteur ou de zone régulatrice 2 Marquage radioactif sur un seul des deux brins 3 Interaction promoteur/protéine(s) régulatrice(s) 4 Action de la Dnase I en faible quantité (1 site de clivage/brin) 4 Electrophorèse en gel de polyacrylamide 5 Révélation (autoradiographique, …)

Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 210

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Empreinte à la Dnase I (« Fooprinting »)

258

+ -

Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 211

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Illustrations : Empreinte à la Dnase I

259

Sp1- Sp1+

-400

-200

-1

Cours 10 BC&BM 2013-2014

C : étalon de taille

B A

P 212

Permet de déterminer les caractéristiques des sites de fixation:

• Nombre

• Taille

• Séquence

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Technique 10 : gènes/vecteurs rapporteurs

Cours 10 BC&BM 2013-2014 260

Vecteur rapporteur

1 Purification du promoteur (ou de la zone régulatrice) 2 Préparation de formes modifiées du promoteur (ou de zone régulatrice)

par délétion progressive, délétion partielle ou mutation. 3 Insertion dans le site de clonage du vecteur « rapporteur » 4 Transfection d’un type cellulaire permettant l’expression du promoteur 4 Mesure de l’activité ou de l’expression du gène rapporteur mis sous la

dépendance du promoteur ou de ses différentes formes 5 Détermination de la part respective de chaque séquence dans l’activité du

promoteur dans la cellule choisie

P 213

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Gènes et vecteurs rapporteurs

261 Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 214

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Décryptage d’une structure plasmidique

262 Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 215

1 2

3 4 5 6

7 9

8

2) Intron et 4) site de clivage et site polyadénylation pour permettre l’expression en cellule eucaryote de la séquence 3) codant pour le gène bactérien rapporteur « chloramphénicol acétyl-transférase »

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10

Vecteur de contrôle positif de l’expression du gène rapporteur

263 Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 216

11

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Vecteur pour l’étude d’un promoteur

264 Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 217

Technologie de l’ ADN recombinant

Promoteur ou Promoteur modifié

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Zone régulatrice de transcription

(enhancer) (silencer)

Vecteur pour l’étude d’une zone régulatrice

265 Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 218

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Gènes et vecteurs rapporteurs

266

Promoteur

Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 219

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• Mettre un gène rapporteur sous la dépendance d’un promoteur (ou d‘une zone régulatrice)

• gène rapporteur : gène dont le produit ne s’exprime pas dans la cellule concernée rendant son niveau d’expression ainsi aisément quantifiable

• Ex. : CAT, β-galactosidase, luciférase. • Cohérence globale des 3 partenaires.

Promoteur/Cellule choisie/Gène rapporteur

267 Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 220

Terminologie et principes généraux

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Cours 10 BC&BM 2013-2014 268

Illustration : Promoteur zone étudiée -1150/-313

sur cet exemple le site d’initiation de la transcription est situé en : -314

La numérotation classique d’une structure génique débute au nucléotide +1 et est symbolisé par :

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1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14

Etude de la fonctionnalité du promoteur par : 1) Délétion graduelle à partir du 5’ (ex. -1150/-313,-852/-313)

2) Délétion de zone (Promoteur PΔ5 : site CRE, fixation FT: CREB) 3) Mutation C-618A (site AP2)

a

-1150/-313

-852/-313

PΔ5

C-618A

269 Cours 10 BC&BM 2013-2014

Modification d’un promoteur

Promoteur et promoteurs modifiés

P 221

5’

3’

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270

%

Analyse par délétion partielle de promoteur : interprétation

0

50

100

150

200

250

300

Τ Δ1 Δ2 Δ3 Δ4 Δ5 Δ6 Δ7 Δ8 Δ9 Δ10 Δ11 Δ12 Δ13 Δ14

Définit le rôle activateur, inhibiteur, neutre ou de positionnement de l’ARN pol II pour chaque zone du promoteur. Interprétation valide dans la cellule utilisée pour cette expérience.

Act

ivité

Gèn

e R

appo

rteur

Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 222

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271

Transcription eucaryote : données de base A) 3 ARN polymérases différentes

Synthèse de précurseurs ARN pol I ARN pol II ARN pol III pré-ARNr pré-ARNm pré-ARNt pré-snARN pré-ARNr 5S pri-miARN

Pas de fixation directe sur les promoteurs mais par l’intermédiaire de

B) Facteurs Généraux de Transcription

TFI TFII TFIII

Les polymérases seules ne confèrent qu’un niveau minimal de transcription Dans le promoteur et dans les zones régulatrices (ZR) les séquences régulatrices nommées : Eléments de réponse (RE) ou Modules (box, …) permettent une expression optimale et régulée du gène.

Ces séquences agissent par fixation de facteurs régulateurs : C) facteurs de transcription (FT), répresseurs,

Ces facteurs régulateurs peuvent agir directement au niveau de l’ARN pol II ou par recrutement de D) co-régulateurs

Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 223

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272

Terminologie de la Transcription eucaryote

• Deux modes d’action des Zones régulatrices ZR : • soit activatrices (enhancer)

• soit inhibitrices (silencer)

• Deux types de séquences régulatrices ou éléments de réponse : • les modules ubiquitaires • les modules spécifiques

• Deux principes du fonctionnement des facteurs de transcription

• reconnaissance spécifique d’une séquence ADN • interaction protéine/protéine

Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 224

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273

Site reconnaissance

ADN

Site Interaction

protéine/protéine

indirecte Signal (+) ou Signal (-) de transcription

Co-régulateur

directe

Séquence ADN : Module

Elément de réponse Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 225

Exemple : richesse en glutamine (QQQ)

Exemple : structure en doigt de zinc

Principe d’action d’un facteur de transcription

Q Q

Q

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274 Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 226 Structure d’un promoteur

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275

« C-terminal domaine »: CTD Répétition de sérine et thréonine cibles de phosphorylation

Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 227 TATA box : Positionnement de l’ARN polymérase II

TFIID

TFIID

TBP : TATA box-binding protein TAFs : 13 à 14 TBP-associated factors

TAF1 (ou TAFll250) activités : • Kinases (H2B-S33), • Histone acétyl transférase (H3 et H4), • Ubiquitine ligase (Histone H1). • Reconnaissance histone acétylée (2 bromodomaines, H4 diacétylée) Voir structure et mode d’action pages suivantes [276] et [277] :

TAF 3 reconnaît H3K4me3

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TAF1 ou TAFII250 : illustration par sa structure de son rôle central dans le positionnement de l’ARN pol II

Wassarman D A , and Sauer F J Cell Sci 2001;114:2895-2902 ©2001 by The Company of Biologists Ltd

P

Reconnaissance, Modification, Focalisation Une molécule = des partenaires multiples

Identification des réseaux d’interactions moléculaires

276 Cours 10 BC&BM 2013-2014

244

Substrats : Facteurs généraux de transcription TFII et histones

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Rôle du TAFII250 dans l’activation de la transcription

Wassarman D A , and Sauer F J Cell Sci 2001;114:2895-2902

©2001 by The Company of Biologists Ltd

: activateur de transcription (FT) A

1)  Recrutement de TFIID par un activateur (ex. Sp1) qui interagit avec TAFII110 ou TAFII250

2)  Reconnaissance par le TFIID du nucléosome qui « compacte » le promoteur, fixation par l’intermédiaire du double bromodomaine de TAFII250 sur H4 diacétylée.

3)  Remodelage chromatinien par acétylation de H3, H4 et H2B et ubiquitination de H1 entrainant la dé-structuration du nucléosome

4)  Recrutement des autres facteurs TFII et de l’ARN pol II et acétylation et/ou phosphorylation par TAFII250 de TFIIA, TFIIE, TFIIF pour l’initiation et l’élongation de la transcription.

P

277 Cours 10 BC&BM 2013-2014

245

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278

Transcription ERCC2 et ERCC3 hélicases : ouverture de la double hélice au niveau du site d’initiation de la transcription

Réparation

Cours 10 BC&BM 2013-2014

s

P 227

Dualité d’action du facteur général de transcription : TFIIH

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279 Cours 10 BC&BM 2013-2014

3 2

P 228 Sous-unités ERCC2 et ERCC3 et réparation de l’ADN

Remarque complémentaire : La réparation des lésions situées sur les brins « matrice » des gènes qui s’expriment est

favorisée

: Lésion ADN

ARN pol II

Libération de ERCC2 et 3 après initiation de la trancription

Disponibilité de ERCC2 et 3 pour se fixer sur les lésions ADN

Formation d’un ADN DB avec une brêche (gap) de 20 à nucléotides substrat préférentiel de l’ADN polymérase β

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280

cdk8-cyc C

cdk7-cyc H

p53

Cdk7-cycH = CAK Activité qui phosphoryle le MPF : cdk1-cyc B

hélicases

Réparation

Répétition de sérine et thréonine cibles de phosphorylation

Cours 10 BC&BM 2013-2014

s

P 227

TFIIH trois rôles : Transcription Réparation Cycle cellulaire

Régulation de l’ARN pol II par interactions protéine/protéine : (exemple p53)

Régulation l’activité de l’ARN pol II et du du cycle cellulaire par phosphorylation

CAK pour : Cyclin-dependent kinase Activating Kinase

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281

Structure d’un promoteur

Cours 10 BC&BM 2013-2014

P QQQ

229

RAR bHLH

RARE

RAR : récepteur de l’acide rétinoïque RARE : Elément de réponse à l’acide rétinoïque

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282

Facteur ubiquitaire Reconnaît séquence GGGCGG ou GC box Copies multiples Associée à la matrice nucléaire Rôle dans les origines de réplication virales (Aux1 de SV40) Pontage entre LCR de domaine régulateur et promoteur Zone de reconnaissance de l’ADN : 3 doigts de zinc

Zone interaction protéine/protéine riche Glutamine (QQQ) • interaction avec TAF (TFIID) • interaction avec P300 (HAT) • Interaction avec HDAC (dé-acétylase)

Modifications post-traductionnelles subies (Ac, me, P, Ub) ex. Sp1 phosphorylé par CDK-cycline A ,

Rôle : Positionnement du TFIID et du complexe de pré-initiation de la transcription. Intervient pour des milliers de gènes.

Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 230 Sp1 : Facteur de transcription ubiquitaire à rôles et interactions multiples

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283

• •

Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 232

Sites Sp1 contribuent au positionnement de l’ARN pol II pour ce promoteur sans module « TATA » voir [284] .

Sp1 et positionnement de l’ARN pol II

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284 Cours 10 BC&BM 2013-2014

TAF1 =TAFII250

P 231

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285

Module CAAT ou NF1 ubiquitaire

NF-1/CTF (sous forme de dimère) Domaine de trans-activation riche en proline détermine l’efficacité du promoteur

Rôle : • voir illustration participation de NF1 à

l’activation d’un gène spécifique au cours du développement [286] .

NF-1 « Nuclear Factor 1 » Séquence reconnue TTGGC(N5)GCCAA.

CTF : « CCAAT Binding Transcription Factor »

NF-1

NF1/ CTF

Pro Pro Pro

+

Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 233 NF-1/CTF : Facteur de transcription ubiquitaire

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Cours 10 BC&BM 2013-2014 286

NF1/CTF : Illustration de la mise en place au cours du développement de l’expression hépatique du gène de l’albumine

Structure chromatinienne fermée

Embryogenèse

Expression de facteurs de transcription Fixation sur la zone « enhancer »

Développement Fixation de NF1

Ciblage de CRC sur le promoteur

246

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287

bHLH

Module bHLH

• •

• •

• •

• •

Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 234

Exemple de membre de la famille bHLH (basic Helix-Loop-Helix) :

C-myc :

• Fixe séquence consensus CAGGTG (Enhancer Box ou E-box)

• Recrute (HATs)

• Contrôle la réplication : (exemple contrôle de l’expression de E2F [227]

Myc mRNA possède un IRES (internal ribosome entry site)

bHLH : Facteur de transcription ubiquitaire

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288

• très peu exprimé en G0 • Induit par les Facteurs de croissance (ou par le sérum de veau fœtal en culture cellulaire) entrainant une signalisation au niveau de l’élément de réponse au sérum (SRE) présent dans le promoteur du gène c-fos et qui fixe le facteur de transcription SRF (« serum response factor »). • Réponse précoce au passage G0/G1 induction de : c-fos, c-jun, cdk2, cdk4, cyc D, cyc E • Dimérisable avec c-jun pour formé le facteur de transcription AP1 : « Activator protein 1 » • ARNm et protéine instables : disparition rapide après élimination des facteurs de croissance. • Induit l’expression de gènes de prolifération : (illustration hors cours [289]). • Réponse au : stress, UV et H2O2. • Oncogène par sur-expression (expression constitutive dans certaines tumeurs)

• c-jun interaction avec TFIID (illustration [291]) Complexe AP-1 « Leucine zipper »

c-fos c-fos c-fos c-jun

TGACTC

L L L L L L

L L L L L L

L L L L L L

L L L L L L

AP-1

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 235

C-fos : Modifications post-traductionnelles (phosphorylation)

c-fos : facteur de transcription induit par les facteurs de croissance

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Liu et al. Nature Reviews Immunology 7, 202–212 (March 2007) | doi:10.1038/nri2035

Signal extracellulaire

Voies de Signalisation :

Cascades de Kinases

Phosphorylation de facteurs de transcription

Activation gène c-fos

AP1 : « activator protein 1 » TCF : « ternary complex factor » favorise la fixation de SRF sur SRE SRF : « serum response factor » ATF2 : « activating transcription factor 2 »

Sérum de veau fœtal Facteur de croissance

Gènes de prolifération 289

Cours 10 BC&BM 2013-2014

247

Document hors cours, pour illustration du document 288

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290 Papai et al. Curr Opin Genet Dev. 2011

Cours 10 BC&BM 2013-2014

Structure 3D TFIID Zones d’interaction

P 236

Localisation des sites d’interaction de facteurs de transcription avec le TFIID

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Function and Regulation of CREB Family Transcription Factors in the Nervous System Bonnie E Lonze, David D Ginty Neuron, Volume 35, Issue 4, 605-623

Facteur de transcription CREB : • « cAMP-response element-binding protein », • protéine ubiquitaire se fixant au module CRE • CREB activé par phosphorylation • Recrute des co-activateurs transcriptionnels comme :

CBP à activité Histone Acétyl-Transférase 3• Recrutement Co-activateur

4• Acétylation : Histones

Favorise l’expression génique

291 Cours 10 BC&BM 2013-2014

Notion de Co-activateurs CBP: Ex. réponse à l’AMPc par le couple CREB/CRE

101

1• Activation de CREB 2• Fixation sur CRE CRE

http://www.jbc.org/content/275/44/34433.full.pdf+html

Ca++ AMPc

CBP

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Cours 10 BC&BM 2013-2014 292

A l’opposé des facteurs de transcription ubiquitaires : les facteurs de transcription spécifiques

• Récepteurs nucléaires des hormones

- Exemple : Récepteur à l’acide rétinoïque

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293

Facteurs de transcription spécifiques Récepteur nucléaire des hormones : ex. Récepteur de l’ acide

rétinoïque

RXR RAR RXR

RAR

P P P P P P

Sans acide rétinoïque Avec acide rétinoïque :

NCoR : co-répresseur RARE : élément de réponse à l’acide rétinoïque RXRE : élement de réponse à l’acide 9 cis-rétinoïque

HDAC RIP

RIP : co-activateur formé des sous-unités RIP 140 et RIP160

HAT

ARN pol II

NCoR

TFIID

Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 237

Cas particulier : Récepteurs pré-positionnés sur leurs modules respectifs

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294

H

Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 238

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295

Intégration de signaux et informations multiples :

Etat de l’ADN (p53) Libération de calcium (CaRE) Cycle cellulaire (cdk-cyc, E2R/Rb) Contact avec la matrice extra-cellulaire (intégrines) Contact avec les cellules adjacentes (jonctions cellulaires) Messages hormonaux (acide rétinoïque, …) Facteurs de croissance (c-fos) Présence de métaux lourds (MRE) Développement (répresseur) Spécificité cellulaire Statut métabolique cellulaire Médiateurs : AMPc et autres …

Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 239 Complexe d’initiation de la Transcription

Document suivant [296] : Complexe d’initiation de la Transcription et autres acteurs abordés lors ce cours

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H

Cours 10 BC&BM 2013-2014

238

SIRT 1

CRE

CREB

Kinases

me P

Phosphatases

siARN 296 Cours 10 BC&BM 2013-2014

bis

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297

Niveaux concernés :

Chromatinien (modifications covalentes, remodelage)

Transcriptionnel (facteurs de transcription)

Post-transcriptionnel (miARN)

Post-traductionnel (phosphorylation, localisation cellulaire)

Cours 10 BC&BM 2013-2014

P 240

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Cours 10 BC&BM 2013-2014 298

gène 1 gène 2 gène 3 gène 4

• 10 000 gènes s’expriment à niveaux variables parmi les 22 000 du génome humain • Chaque cellule à son panorama d’expression spécifique • Chaque promoteur a son complexe d’initiation spécifique • Cinq niveaux de régulations se superposent pour un gène donné

(Chromatine, Transcription, Post-Trans, Traduction, Post-Tradu) • Chaque « protéine intégrative » a son réseau d’interactions moléculaires propre • Coordination entre : transcription, réparation, réplication, signalisation, métabolisme énergétique • Ces caractéristiques et interactions s’inscrivent dans un contexte cellulaire dynamique

Panorama dynamique d’expression cellulaire ou tissulaire

gène n gène n+1 gène n+2 gène n+3

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Liste des Outils mis à disposition : Liste d’ouvrages Cours n° 1 Cours n° 2 Cours n° 3 Cours n° 4 Cours n° 5 Cours n° 6 Cours n° 7 Cours n° 8 Cours n° 9 Cours n° 10 11• Plan et objectifs corrigés 2013 12• Cours de Biologie Cellulaire et Biologie Moléculaire 2013-2014 (chapitres I, II, III) 13• Cours de Biologie Cellulaire et Biologie Moléculaire 2013-2014 (chapitres IV, V) 14• Glossaire 15• Cours condensé en 70 diapositives et 16• Sous forme de fichier « synoptique » 17• Techniques 18• Documents à restituer 19• Documents à annoter 20• Sujets d’examen

299 Cours 10 BC&BM 2013-2014

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FIN …

Cours 10 BC&BM 2013-2014 300

Merci pour votre attention ! En vous souhaitant de tirer le meilleur profit de cet

enseignement

[email protected] 02 47 36 62 06

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301

L’activité dépend du contexte cellulaire

Cours 10 BC&BM 2013-2014 http://louisville.edu/medschool/pulmonary/research-activities/igor-zelko-ph-d-assistant-professor.html

242 Document hors Cours

2013

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302

Vers les pathologies

Cours 10 BC&BM 2013-2014

241 Document hors Cours

2013

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ARN régulateur de transcription des ARNr

Cours 10 BC&BM 2013-2014

303

243

NoRC

SIRT1 : Activée par baisse de glucose

ARNr

NoRC : CRC SNF2h : ATPase TIP5 : ciblage H4K16ac TTF-I :

MOF : Acétylase H4K16 et TIP5K633

Document hors Cours

2013

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Molécule intégrative : Organisation de CBP/p300 et interactions avec les facteurs de transcription et les facteurs généraux de transcription.

Vo N , and Goodman R H J. Biol. Chem. 2001;276:13505-13508

©2001 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology 304 Cours 10 BC&BM 2013-2014

Document hors Cours

2013

zinc fingers (Zn), CREB-binding domain (KIX), bromodomain (Bromo), HAT domain, and glutamine-rich domain (Q). TBP, TATA-binding protein