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Biologie Cellulaire &
Biologie Moléculaire
L3 UE 5.2 2013-2014
Cours n° 10 : Jeudi 7 novembre 2013
V •Transcription Techniques d’études Principes généraux
Conclusions
Cours 10 BC&BM 2013-2014 255
Technique 8 : Retard sur gel
256 T
P 200
256 Cours 10 BC&BM 2013-2014
Identifie une interaction ADN/protéine mais Ne précise pas le site de fixation :
Technique 9 : Empreinte à la Dnase I
Technique 9 : Empreinte à la Dnase I
257
Empreinte à la Dnase I
1 Purification de promoteur ou de zone régulatrice 2 Marquage radioactif sur un seul des deux brins 3 Interaction promoteur/protéine(s) régulatrice(s) 4 Action de la Dnase I en faible quantité (1 site de clivage/brin) 4 Electrophorèse en gel de polyacrylamide 5 Révélation (autoradiographique, …)
Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 210
Empreinte à la Dnase I (« Fooprinting »)
258
+ -
Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 211
Illustrations : Empreinte à la Dnase I
259
Sp1- Sp1+
-400
-200
-1
Cours 10 BC&BM 2013-2014
C : étalon de taille
B A
P 212
Permet de déterminer les caractéristiques des sites de fixation:
• Nombre
• Taille
• Séquence
Technique 10 : gènes/vecteurs rapporteurs
Cours 10 BC&BM 2013-2014 260
Vecteur rapporteur
1 Purification du promoteur (ou de la zone régulatrice) 2 Préparation de formes modifiées du promoteur (ou de zone régulatrice)
par délétion progressive, délétion partielle ou mutation. 3 Insertion dans le site de clonage du vecteur « rapporteur » 4 Transfection d’un type cellulaire permettant l’expression du promoteur 4 Mesure de l’activité ou de l’expression du gène rapporteur mis sous la
dépendance du promoteur ou de ses différentes formes 5 Détermination de la part respective de chaque séquence dans l’activité du
promoteur dans la cellule choisie
P 213
Gènes et vecteurs rapporteurs
261 Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 214
Décryptage d’une structure plasmidique
262 Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 215
1 2
3 4 5 6
7 9
8
2) Intron et 4) site de clivage et site polyadénylation pour permettre l’expression en cellule eucaryote de la séquence 3) codant pour le gène bactérien rapporteur « chloramphénicol acétyl-transférase »
10
Vecteur de contrôle positif de l’expression du gène rapporteur
263 Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 216
11
Vecteur pour l’étude d’un promoteur
264 Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 217
Technologie de l’ ADN recombinant
Promoteur ou Promoteur modifié
Zone régulatrice de transcription
(enhancer) (silencer)
Vecteur pour l’étude d’une zone régulatrice
265 Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 218
Gènes et vecteurs rapporteurs
266
Promoteur
Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 219
• Mettre un gène rapporteur sous la dépendance d’un promoteur (ou d‘une zone régulatrice)
• gène rapporteur : gène dont le produit ne s’exprime pas dans la cellule concernée rendant son niveau d’expression ainsi aisément quantifiable
• Ex. : CAT, β-galactosidase, luciférase. • Cohérence globale des 3 partenaires.
Promoteur/Cellule choisie/Gène rapporteur
267 Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 220
Terminologie et principes généraux
Cours 10 BC&BM 2013-2014 268
Illustration : Promoteur zone étudiée -1150/-313
sur cet exemple le site d’initiation de la transcription est situé en : -314
La numérotation classique d’une structure génique débute au nucléotide +1 et est symbolisé par :
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14
Etude de la fonctionnalité du promoteur par : 1) Délétion graduelle à partir du 5’ (ex. -1150/-313,-852/-313)
2) Délétion de zone (Promoteur PΔ5 : site CRE, fixation FT: CREB) 3) Mutation C-618A (site AP2)
a
-1150/-313
-852/-313
PΔ5
C-618A
269 Cours 10 BC&BM 2013-2014
Modification d’un promoteur
Promoteur et promoteurs modifiés
P 221
5’
3’
270
%
Analyse par délétion partielle de promoteur : interprétation
0
50
100
150
200
250
300
Τ Δ1 Δ2 Δ3 Δ4 Δ5 Δ6 Δ7 Δ8 Δ9 Δ10 Δ11 Δ12 Δ13 Δ14
Définit le rôle activateur, inhibiteur, neutre ou de positionnement de l’ARN pol II pour chaque zone du promoteur. Interprétation valide dans la cellule utilisée pour cette expérience.
Act
ivité
Gèn
e R
appo
rteur
Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 222
271
Transcription eucaryote : données de base A) 3 ARN polymérases différentes
Synthèse de précurseurs ARN pol I ARN pol II ARN pol III pré-ARNr pré-ARNm pré-ARNt pré-snARN pré-ARNr 5S pri-miARN
Pas de fixation directe sur les promoteurs mais par l’intermédiaire de
B) Facteurs Généraux de Transcription
TFI TFII TFIII
Les polymérases seules ne confèrent qu’un niveau minimal de transcription Dans le promoteur et dans les zones régulatrices (ZR) les séquences régulatrices nommées : Eléments de réponse (RE) ou Modules (box, …) permettent une expression optimale et régulée du gène.
Ces séquences agissent par fixation de facteurs régulateurs : C) facteurs de transcription (FT), répresseurs,
Ces facteurs régulateurs peuvent agir directement au niveau de l’ARN pol II ou par recrutement de D) co-régulateurs
Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 223
272
Terminologie de la Transcription eucaryote
• Deux modes d’action des Zones régulatrices ZR : • soit activatrices (enhancer)
• soit inhibitrices (silencer)
• Deux types de séquences régulatrices ou éléments de réponse : • les modules ubiquitaires • les modules spécifiques
• Deux principes du fonctionnement des facteurs de transcription
• reconnaissance spécifique d’une séquence ADN • interaction protéine/protéine
Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 224
273
Site reconnaissance
ADN
Site Interaction
protéine/protéine
indirecte Signal (+) ou Signal (-) de transcription
Co-régulateur
directe
Séquence ADN : Module
Elément de réponse Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 225
Exemple : richesse en glutamine (QQQ)
Exemple : structure en doigt de zinc
Principe d’action d’un facteur de transcription
Q Q
Q
274 Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 226 Structure d’un promoteur
275
« C-terminal domaine »: CTD Répétition de sérine et thréonine cibles de phosphorylation
Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 227 TATA box : Positionnement de l’ARN polymérase II
TFIID
TFIID
TBP : TATA box-binding protein TAFs : 13 à 14 TBP-associated factors
TAF1 (ou TAFll250) activités : • Kinases (H2B-S33), • Histone acétyl transférase (H3 et H4), • Ubiquitine ligase (Histone H1). • Reconnaissance histone acétylée (2 bromodomaines, H4 diacétylée) Voir structure et mode d’action pages suivantes [276] et [277] :
TAF 3 reconnaît H3K4me3
TAF1 ou TAFII250 : illustration par sa structure de son rôle central dans le positionnement de l’ARN pol II
Wassarman D A , and Sauer F J Cell Sci 2001;114:2895-2902 ©2001 by The Company of Biologists Ltd
P
Reconnaissance, Modification, Focalisation Une molécule = des partenaires multiples
Identification des réseaux d’interactions moléculaires
276 Cours 10 BC&BM 2013-2014
244
Substrats : Facteurs généraux de transcription TFII et histones
Rôle du TAFII250 dans l’activation de la transcription
Wassarman D A , and Sauer F J Cell Sci 2001;114:2895-2902
©2001 by The Company of Biologists Ltd
: activateur de transcription (FT) A
1) Recrutement de TFIID par un activateur (ex. Sp1) qui interagit avec TAFII110 ou TAFII250
2) Reconnaissance par le TFIID du nucléosome qui « compacte » le promoteur, fixation par l’intermédiaire du double bromodomaine de TAFII250 sur H4 diacétylée.
3) Remodelage chromatinien par acétylation de H3, H4 et H2B et ubiquitination de H1 entrainant la dé-structuration du nucléosome
4) Recrutement des autres facteurs TFII et de l’ARN pol II et acétylation et/ou phosphorylation par TAFII250 de TFIIA, TFIIE, TFIIF pour l’initiation et l’élongation de la transcription.
P
277 Cours 10 BC&BM 2013-2014
245
278
Transcription ERCC2 et ERCC3 hélicases : ouverture de la double hélice au niveau du site d’initiation de la transcription
Réparation
Cours 10 BC&BM 2013-2014
s
P 227
Dualité d’action du facteur général de transcription : TFIIH
279 Cours 10 BC&BM 2013-2014
3 2
P 228 Sous-unités ERCC2 et ERCC3 et réparation de l’ADN
Remarque complémentaire : La réparation des lésions situées sur les brins « matrice » des gènes qui s’expriment est
favorisée
: Lésion ADN
ARN pol II
Libération de ERCC2 et 3 après initiation de la trancription
Disponibilité de ERCC2 et 3 pour se fixer sur les lésions ADN
Formation d’un ADN DB avec une brêche (gap) de 20 à nucléotides substrat préférentiel de l’ADN polymérase β
280
cdk8-cyc C
cdk7-cyc H
p53
Cdk7-cycH = CAK Activité qui phosphoryle le MPF : cdk1-cyc B
hélicases
Réparation
Répétition de sérine et thréonine cibles de phosphorylation
Cours 10 BC&BM 2013-2014
s
P 227
TFIIH trois rôles : Transcription Réparation Cycle cellulaire
Régulation de l’ARN pol II par interactions protéine/protéine : (exemple p53)
Régulation l’activité de l’ARN pol II et du du cycle cellulaire par phosphorylation
CAK pour : Cyclin-dependent kinase Activating Kinase
281
Structure d’un promoteur
Cours 10 BC&BM 2013-2014
P QQQ
229
RAR bHLH
RARE
RAR : récepteur de l’acide rétinoïque RARE : Elément de réponse à l’acide rétinoïque
282
Facteur ubiquitaire Reconnaît séquence GGGCGG ou GC box Copies multiples Associée à la matrice nucléaire Rôle dans les origines de réplication virales (Aux1 de SV40) Pontage entre LCR de domaine régulateur et promoteur Zone de reconnaissance de l’ADN : 3 doigts de zinc
Zone interaction protéine/protéine riche Glutamine (QQQ) • interaction avec TAF (TFIID) • interaction avec P300 (HAT) • Interaction avec HDAC (dé-acétylase)
Modifications post-traductionnelles subies (Ac, me, P, Ub) ex. Sp1 phosphorylé par CDK-cycline A ,
Rôle : Positionnement du TFIID et du complexe de pré-initiation de la transcription. Intervient pour des milliers de gènes.
Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 230 Sp1 : Facteur de transcription ubiquitaire à rôles et interactions multiples
283
• •
Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 232
Sites Sp1 contribuent au positionnement de l’ARN pol II pour ce promoteur sans module « TATA » voir [284] .
Sp1 et positionnement de l’ARN pol II
284 Cours 10 BC&BM 2013-2014
TAF1 =TAFII250
P 231
285
Module CAAT ou NF1 ubiquitaire
NF-1/CTF (sous forme de dimère) Domaine de trans-activation riche en proline détermine l’efficacité du promoteur
Rôle : • voir illustration participation de NF1 à
l’activation d’un gène spécifique au cours du développement [286] .
NF-1 « Nuclear Factor 1 » Séquence reconnue TTGGC(N5)GCCAA.
CTF : « CCAAT Binding Transcription Factor »
NF-1
NF1/ CTF
Pro Pro Pro
+
Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 233 NF-1/CTF : Facteur de transcription ubiquitaire
Cours 10 BC&BM 2013-2014 286
NF1/CTF : Illustration de la mise en place au cours du développement de l’expression hépatique du gène de l’albumine
Structure chromatinienne fermée
Embryogenèse
Expression de facteurs de transcription Fixation sur la zone « enhancer »
Développement Fixation de NF1
Ciblage de CRC sur le promoteur
246
287
bHLH
Module bHLH
•
• •
• •
• •
•
• •
Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 234
Exemple de membre de la famille bHLH (basic Helix-Loop-Helix) :
C-myc :
• Fixe séquence consensus CAGGTG (Enhancer Box ou E-box)
• Recrute (HATs)
• Contrôle la réplication : (exemple contrôle de l’expression de E2F [227]
Myc mRNA possède un IRES (internal ribosome entry site)
bHLH : Facteur de transcription ubiquitaire
288
• très peu exprimé en G0 • Induit par les Facteurs de croissance (ou par le sérum de veau fœtal en culture cellulaire) entrainant une signalisation au niveau de l’élément de réponse au sérum (SRE) présent dans le promoteur du gène c-fos et qui fixe le facteur de transcription SRF (« serum response factor »). • Réponse précoce au passage G0/G1 induction de : c-fos, c-jun, cdk2, cdk4, cyc D, cyc E • Dimérisable avec c-jun pour formé le facteur de transcription AP1 : « Activator protein 1 » • ARNm et protéine instables : disparition rapide après élimination des facteurs de croissance. • Induit l’expression de gènes de prolifération : (illustration hors cours [289]). • Réponse au : stress, UV et H2O2. • Oncogène par sur-expression (expression constitutive dans certaines tumeurs)
• c-jun interaction avec TFIID (illustration [291]) Complexe AP-1 « Leucine zipper »
c-fos c-fos c-fos c-jun
TGACTC
L L L L L L
L L L L L L
L L L L L L
L L L L L L
AP-1
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 235
C-fos : Modifications post-traductionnelles (phosphorylation)
c-fos : facteur de transcription induit par les facteurs de croissance
Liu et al. Nature Reviews Immunology 7, 202–212 (March 2007) | doi:10.1038/nri2035
Signal extracellulaire
Voies de Signalisation :
Cascades de Kinases
Phosphorylation de facteurs de transcription
Activation gène c-fos
AP1 : « activator protein 1 » TCF : « ternary complex factor » favorise la fixation de SRF sur SRE SRF : « serum response factor » ATF2 : « activating transcription factor 2 »
Sérum de veau fœtal Facteur de croissance
Gènes de prolifération 289
Cours 10 BC&BM 2013-2014
247
Document hors cours, pour illustration du document 288
290 Papai et al. Curr Opin Genet Dev. 2011
Cours 10 BC&BM 2013-2014
Structure 3D TFIID Zones d’interaction
P 236
Localisation des sites d’interaction de facteurs de transcription avec le TFIID
Function and Regulation of CREB Family Transcription Factors in the Nervous System Bonnie E Lonze, David D Ginty Neuron, Volume 35, Issue 4, 605-623
Facteur de transcription CREB : • « cAMP-response element-binding protein », • protéine ubiquitaire se fixant au module CRE • CREB activé par phosphorylation • Recrute des co-activateurs transcriptionnels comme :
CBP à activité Histone Acétyl-Transférase 3• Recrutement Co-activateur
4• Acétylation : Histones
Favorise l’expression génique
291 Cours 10 BC&BM 2013-2014
Notion de Co-activateurs CBP: Ex. réponse à l’AMPc par le couple CREB/CRE
101
1• Activation de CREB 2• Fixation sur CRE CRE
http://www.jbc.org/content/275/44/34433.full.pdf+html
Ca++ AMPc
CBP
Cours 10 BC&BM 2013-2014 292
A l’opposé des facteurs de transcription ubiquitaires : les facteurs de transcription spécifiques
• Récepteurs nucléaires des hormones
- Exemple : Récepteur à l’acide rétinoïque
293
Facteurs de transcription spécifiques Récepteur nucléaire des hormones : ex. Récepteur de l’ acide
rétinoïque
RXR RAR RXR
RAR
P P P P P P
Sans acide rétinoïque Avec acide rétinoïque :
NCoR : co-répresseur RARE : élément de réponse à l’acide rétinoïque RXRE : élement de réponse à l’acide 9 cis-rétinoïque
HDAC RIP
RIP : co-activateur formé des sous-unités RIP 140 et RIP160
HAT
ARN pol II
NCoR
TFIID
Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 237
Cas particulier : Récepteurs pré-positionnés sur leurs modules respectifs
294
H
Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 238
295
Intégration de signaux et informations multiples :
Etat de l’ADN (p53) Libération de calcium (CaRE) Cycle cellulaire (cdk-cyc, E2R/Rb) Contact avec la matrice extra-cellulaire (intégrines) Contact avec les cellules adjacentes (jonctions cellulaires) Messages hormonaux (acide rétinoïque, …) Facteurs de croissance (c-fos) Présence de métaux lourds (MRE) Développement (répresseur) Spécificité cellulaire Statut métabolique cellulaire Médiateurs : AMPc et autres …
Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 239 Complexe d’initiation de la Transcription
Document suivant [296] : Complexe d’initiation de la Transcription et autres acteurs abordés lors ce cours
H
Cours 10 BC&BM 2013-2014
238
SIRT 1
CRE
CREB
Kinases
me P
Phosphatases
siARN 296 Cours 10 BC&BM 2013-2014
bis
297
Niveaux concernés :
Chromatinien (modifications covalentes, remodelage)
Transcriptionnel (facteurs de transcription)
Post-transcriptionnel (miARN)
Post-traductionnel (phosphorylation, localisation cellulaire)
Cours 10 BC&BM 2013-2014
P 240
Cours 10 BC&BM 2013-2014 298
gène 1 gène 2 gène 3 gène 4
• 10 000 gènes s’expriment à niveaux variables parmi les 22 000 du génome humain • Chaque cellule à son panorama d’expression spécifique • Chaque promoteur a son complexe d’initiation spécifique • Cinq niveaux de régulations se superposent pour un gène donné
(Chromatine, Transcription, Post-Trans, Traduction, Post-Tradu) • Chaque « protéine intégrative » a son réseau d’interactions moléculaires propre • Coordination entre : transcription, réparation, réplication, signalisation, métabolisme énergétique • Ces caractéristiques et interactions s’inscrivent dans un contexte cellulaire dynamique
Panorama dynamique d’expression cellulaire ou tissulaire
gène n gène n+1 gène n+2 gène n+3
Liste des Outils mis à disposition : Liste d’ouvrages Cours n° 1 Cours n° 2 Cours n° 3 Cours n° 4 Cours n° 5 Cours n° 6 Cours n° 7 Cours n° 8 Cours n° 9 Cours n° 10 11• Plan et objectifs corrigés 2013 12• Cours de Biologie Cellulaire et Biologie Moléculaire 2013-2014 (chapitres I, II, III) 13• Cours de Biologie Cellulaire et Biologie Moléculaire 2013-2014 (chapitres IV, V) 14• Glossaire 15• Cours condensé en 70 diapositives et 16• Sous forme de fichier « synoptique » 17• Techniques 18• Documents à restituer 19• Documents à annoter 20• Sujets d’examen
299 Cours 10 BC&BM 2013-2014
FIN …
Cours 10 BC&BM 2013-2014 300
Merci pour votre attention ! En vous souhaitant de tirer le meilleur profit de cet
enseignement
[email protected] 02 47 36 62 06
301
L’activité dépend du contexte cellulaire
Cours 10 BC&BM 2013-2014 http://louisville.edu/medschool/pulmonary/research-activities/igor-zelko-ph-d-assistant-professor.html
242 Document hors Cours
2013
302
Vers les pathologies
Cours 10 BC&BM 2013-2014
241 Document hors Cours
2013
ARN régulateur de transcription des ARNr
Cours 10 BC&BM 2013-2014
303
243
NoRC
SIRT1 : Activée par baisse de glucose
ARNr
NoRC : CRC SNF2h : ATPase TIP5 : ciblage H4K16ac TTF-I :
MOF : Acétylase H4K16 et TIP5K633
Document hors Cours
2013
Molécule intégrative : Organisation de CBP/p300 et interactions avec les facteurs de transcription et les facteurs généraux de transcription.
Vo N , and Goodman R H J. Biol. Chem. 2001;276:13505-13508
©2001 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology 304 Cours 10 BC&BM 2013-2014
Document hors Cours
2013
zinc fingers (Zn), CREB-binding domain (KIX), bromodomain (Bromo), HAT domain, and glutamine-rich domain (Q). TBP, TATA-binding protein