Collections et services associés : conservation, cryoconservation, phénotypage des semences…

Jean-Marie Prosperi

Les ambitions du projet ‘ARCAD Infrastructures’

• Rassembler des collections, des outils technologiques et des chercheurs sur un site dédié, dans le cadre d’une démarche pluri-institutionnelle

• Appuyer et conforter la dynamique scientifique locale portant sur l’analyse de l’agro-biodiversité

• Proposer des composantes et des techniques innovantes • Participer à une dynamique nationale en partageant des

infrastructures et des moyens techniques• Offrir des capacités d’accueil de ressources pour des partenaires• Mettre en place des activités de formation et accueillir des

personnels, notamment des pays du sud

S’afficher comme le pôle français pour la gestion et la conservation des Ressources Génétiques végétales

CNRGVRessources génomiques

CRB Espèces modèles Collections issues de

mutagénèse artificielle : ‘Tilling’ ou ‘Mutants

d’insertion’

Plateaux

Organisation des infrastructures nationales pour les Ressources Génétiques végétales

Réseau des CRB Plantes tempérées

INRA, GEVES, partenaires des

réseaux nationaux

Partenaires privés et publics, Europe (ECPGR, …)

Réseau des CRB Plantes tropicalesCIRAD, IRD, INRA

Partenaires privés et publics Sud, International

Ce qui est prévu• Le cœur : un Centre de Ressources Biologiques Végétales

sous assurance qualité (Norme Afnor CRB / NF S 96-900)

• Des outils adossés à la composante semence– Plateau de phénotypage et de caractérisation des semences– Des moyens de conservation long terme et de doubles de sécurité

• Des plateaux partagés à ambition nationale– Cryoconservation des plantes et des semences– DNA Bank + extraction automatique d’ADN à haut débit

• La consolidation du plateau de génotypage, séquençage et de caractérisation moléculaire des ressources génétiques (diversité et polyvalence)

• Un système d’information sur les ressources génétiques intégré avec une ambition nationale

LE CENTRE DE RESSOURCES BIOLOGIQUES VÉGÉTALES (CRBV ARCAD)

• Espèces méditerranéennes et tropicales avec la participation d’équipes outre-mer.

• Plus de 60 000 accessions conservées

• Plus de 15 000 échantillons distribués annuellement

• Conservation de divers organes :graines, plantes entières, racines, tubercules, embryons, explants…

• Forte ouverture au Sud(Méditerranée & Afrique)

Maïs6100

Medicago5500

Vitis7000

Riz 10500(+ 40000)

Arbres forestiers 10300

Sorgho3600

Coton3450

Blé dur3450

Mil4000

Plus les CRB associés à ARCAD :- CRB Plantes Tropicales aux Antilles (Canne à

sucre, Banane, Ignames, Ananas, Arbres tropicaux, Vanille, Plantes vivrières) : 5000

- CRB Café à la Réunion : 750

- CRB Agrumes en Corse : 1200

Autres Espèces (fonio, arachide,cacao…) 3000

Les collections de Ressources Génétiquesconcernées

3 missions principales• Conservation sur le long terme des ressources génétiques (stockage en

chambre froide, congélation, cryoconservation, doubles de sécurité…) ;• Gestion des ressources en contrôlant la qualité (identité, viabilité et état

sanitaire) et en assurant la régénération des lots conservés ;• Diffusion des ressources génétiques en garantissant la traçabilité des

échanges et le suivi des règles nationales et internationales.

2 missions complémentaires• Caractérisation des ressources conservées, définition d’une politique

d’enrichissement et diffusion des données.• Animation de réseaux, aide à la définition des politiques nationales et au

suivi des engagements internationaux, règles de diffusion, communicationet information.

Les missions du Centre de Ressources Biologiques ARCAD

Organisation du CRBV ARCAD

Robotisation & Automatisation Technologies innovantes (RFID)Traçabilité et Haut débit

• Une chambre froide de 600 m3à 4°c et 30% HR => semences d’origines, lots de conservation, lots de distribution, épis et gousses…

• Des congélateurs pour le stockage des lots de référence et des doubles de sécurité à- 25°c

Conservation des semences

Prospections, multiplications régénération et création de matériels

Multiplication au champ ou en serre… Croisements

contrôlés…

Prospections…

Démarche en Assurance - Qualité• Traçabilité et contrôle de l’environnement :

– Code à barre et technologies RFID pour le suivi des lots de semences et des expérimentations

– Enregistrement des conditions de conservation avec archivage

• Fiabilité des mesures : – Suivi métrologique des équipements– Protocoles écrits, documentés et

rassemblés

• Suivi de la norme NF S 96-900

Distribution, qualité sanitaire et suivi juridique

• Diffusion gratuite de matériels pour des programmes de recherche, pour des actions de formation ou pour la sélection et l’amélioration des plantes.

• Suivi et respect des règles nationales et internationales (Traité FAO, CDB, Protocole de Nagoya…)

• Mise en place et utilisation d’accords de transfert de matériels en fonction du statut des échantillons

• Distribution d’un matériel exempt deproblèmes phytosanitaires.

LE PLATEAU DE PHÉNOTYPAGEET DE CARACTÉRISATION DES SEMENCES ET DE LEUR GERMINATION

Pourquoi ? La gestion ex-situ des Ressources Génétiques d’espèces à grainesnécessitent la manipulation et la caractérisation, en routine, de plusieurs millierséchantillons de semences aussi bien lors des phases initiales de régénération deslots que lors de leur conservation.

Utiliser des techniques novatrices pour permettre des gains de productivité, defiabilité et de qualité des données collectées (robotisation, analyse automatiqued’images, spectroscopie proche infrarouge).

Les espèces cibles• Les espèces agricoles et leurs apparentées sauvages conservées dans le

CRBV et/ou en appui aux autres CRB nationaux (ouverture du plateau)• Les espèces sauvages rares et menacées en appui aux Conservatoires

Botaniques nationaux

Très grande diversité de forme, de taille, de poids, de constitution biochimiquedes semences…

Un plateau de phénotypage des semences

Les caractères cibles :• Morphométrie et caractéristiques physiques des épis, des gousses et des

graines (forme, nombre, poids de mille grains…)• Composition biochimique des graines (azote, sucres, huile…)• Taux de germination et énergie germinative (cinétique)

Mise en place d’un laboratoire de caractérisation des semences équipé demachines de laboratoire autonomes de technologies variées afin d’assurermodularité et généricité.

Des équipements classiques acquis sur le programme ARCAD Feder : compteurs,balances, humidimètres, nettoyeurs, batteuses… mais aussi des technologiesnovatrices…

La caractérisation des semences

Compteur de grainsLoupe binoculaire + appareil photo

Humidimètre

Morphométrie et caractéristiques des semences sèches : quelques machines utilisables

Scans de graines de Fonioet de Medicago

Prise d’images par photo ou scanner, puis analyse automatique des images

Obtention des données de morphométrie (longueur, largeur, poids de 1000 graines, typologie des semences…)

Quelques équipements aujourd’hui disponibles sur le marché

Equipements disponibles :• Trieur par densité : débit important mais peu précis (déchets)• Tamisage ou tri manuel : précis mais avec un débit très faible,

difficulté de séparer certains déchets ou graines cassées

Un besoin : disposer d’un trieur de laboratoire permettant de trier depetits lots de semences sur la base de critères de formes et decouleur avec un débit relativement important, une haute précision etfacilement paramétrable.

Discussion avec plusieurs sociétés sur la faisabilité et laconstruction d’un prototype en utilisant les données fourniespar les appareils de morphométrie et d’analyse de semences.

Mise au point d’un trieur optique de semences de laboratoire sur la base de leur forme ou de leur couleur

Plateau d’analyse qualitative des graines par spectroscopie proche infrarouge

Analyseur NIRSFoss system 6500

La spectroscopie proche infrarouge est une technique déjà largementemployée en agriculture ou en industrie pour le contrôle qualité en continu deproduits, le tri de fruits, de lots de graines…

C’est une technique non destructive basée sur la propriété des constituants des semences à restituer différemment l’énergie des ondes reçues.

Les prédictions sont réalisées à partir de courbes de calibrations sur la base des spectres NIRS et de données de référence obtenues en laboratoire. Des courbes sont disponibles pour de nombreuses espèces (blé dur, medicago, maïs…) et pour différents constituants (azote, sucres, huiles, mitadin, qualités technologiques, maladies…)

Courbe de calibration de la teneur en azote de semences de Medicago truncatula

Analyseur NIRSPerkin Elmer

Mise au point d’un banc automatique d’analyse et de suivi de la germination

Objectif : Suivre par analyse d'images prises à desintervalles réguliers la cinétique de la germination et laqualité germinative finale de lots de semences.

Mesure du taux de germination et de l’élongation de la radicule,

sur une population de lignées recombinantes de

Medicago truncatula *

* Données obtenues sur le banc de germination de la Station Nationale d’Essais sur les Semences (Angers)

Vue générale 3D du prototype

Un système de vision équipé de plusieurs caméras couleur et d’éclairages LED.

Plusieurs acquisitions sont réalisées pour reconstruire l’image de la table de germination.

Construction d’un prototype

LE PLATEAU DE CRYOCONSERVATION

La cryoconservation des ressources biologiques végétales

Pourquoi ? La cryoconservation (dans l’azote liquide à -196°C) est la seuletechnique qui permet d’assurer une conservation à très long terme (supérieure àun siècle), sûre et pour un coût réduit. Destinée, avant tout, aux espèces àmultiplication végétative et à semences non orthodoxes, cette technologie peutêtre aussi employée pour les graines.

Espèces ciblesEspèces propagées par graines, mais dont les graines sont sensibles à la déshydratation (non-orthodoxes) : café, agrumes, fruits tropicaux

Espèces propagées végétativement par boutures, greffons ou tubercules…

Espèces à semences orthodoxes pour assurerune conservation sur le très long terme

• 25 ans de recherche en cryobiologie végétale à Montpellier• Nombreuses collaborations entre les 3 instituts pour le développement de

procédés de cryoconservation : vigne, canne à sucre, palmiers, igname…• Première cryobanque mondiale des semences non-orthodoxes (Coffea)• Participation à des projets et réseaux européens (Crymcept et Cryoplanet)• Un réseau constitué de laboratoires français : le réseau CryoVeg

Le plateau de cryoconservation des ressources biologiques végétales : des atouts

IRD

INRA CIRAD

CRB Antilles-Guyane

CRBRéunion

CRB Vigne

CRB Citrus

CRB MalusPyrus

CRB Café

CRBBrassica

• Des infrastructures dédiées dansle bâtiment à construire permettant la mis en place d’une cryo-banque nationale

• Des équipements spécialisésacquis à l’aide du financementArcad Feder

Le plateau de cryoconservation des ressources biologiques végétales : des moyens

CC1Stockage des Cryo-banques

25 m2

CC7- 12 m2Conditionnement

bourgeons/ grainesnon-orthodoxes

CC4 – 12 m2Repiquage

CC2- 12 m2Lavage &autoclave

CC3- 12 m2Préparation des

milieux

CC512 m2Culture in vitro

CRBV

ADN

Culture In Vitro Prétraitement et congélation

Stockage dans l’azote liquide

1. Mise en place de cryobanques pour des espèces méditerranéennes et tropicales (Vigne, Café, Agrumes, Ignames…)

2. Coordination du réseau CryoVeg et l’accueil de la cryo-banque nationale : doubles de sécurité et sécurisation des collections de semences

3. Des collaborations accrues avec le secteur privé et les réseaux internationaux

Depuis 2008, conservation de la ‘black-box’ de la cryobanque internationale Musaen collaboration avec Bioversity international

Depuis 1993, création et gestion d’une cryobanquede variétés élites de palmier à huile à la demandede la société PlamElit.

Depuis 2012, développement d’un procédéde cryothérapie des cépages de vigne encollaboration avec l’Institut Français de la Vigne et du Vin

Le plateau de cryoconservation des ressources biologiques végétales : les objectifs

Les personnes ressources

• Plateau de conservation des graines et mise en place du CRBV ARCAD : Najate Maghnaoui (CIRAD), Jean-Marie Prosperi et Anne Zanetto (INRA), Bouchaïd Khadari (CBN).

• Plateau de caractérisation des semences : Pierre Bonnet (CIRAD), Jean-Marie Prosperi et Pierre Roumet (INRA)

• Plateau de Cryo-conservation : Stéphane Dussert (IRD), Philippe Chatelet (INRA)

Et l’ensemble des personnels permanents et non permanents recrutés sur le projet qui permettent le développement des outils et la mise en place de ces différents plateaux.