caractérisation phytochimique et activité antioxydante de ... · ministère de l’enseignement...
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République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique
Université d’Oran Es-SéniaFaculté des Sciences
Département de Biologie
Mémoire en vue de l’obtention du diplôme de Magistère en BiologieOption: Biochimie végétale appliquée
Thème
Caractérisation phytochimique et activité antioxydante
de quelques cultivars de Phoenix dactylifera L.
Présenté par :
Mr. BENGAG Amine
Soutenu le: 2009, devant la commission du jury :
Année 2008-2009
Mr BELKHODJA Moulay Prof. Université d’Oran Es-Sénia Président
Mr CHERITI Abdelkrim Prof. Centre Univ de Béchar Examinateur
Mr MAROUF Abderrazak Prof. Université d’Oran Es-Sénia Examinateur
Mme OUAFI-HARCHAOUI Saida M.C. USTHB Examinatrice
Mme BENNACEUR Malika M.C. Université d’Oran Es- Sénia Rapporteur
A l’Université d’Oran Es-Senia : pour la qualité de la formation reçue, le
soutien matériel et financier.
A Mme BENNACEUR Malika (Maître de conférences à l’Université
d’Oran, Es-Sénia) : J’ai eu le privilège de bénéficier de votre aide tout au long de ce
travail. Je garderai de vous le souvenir d’un maître disponible, toujours à l’écoute.
Merci pour la confiance que vous m’avez accordé ce qui m’a permis de mener à bien
ce travail. Veillez recevoir en retour mes sentiments de profonde reconnaissance.
A Mr MAROUF Abderrezak (Professeur à l’Université d’Oran, Es-Sénia) :
Votre souci majeur a été l’aboutissement de ce travail qui a nécessité votre concours
sous toutes les formes. Grâce à vous, nous avons appris la rigueur scientifique et
l’amour du travail bien fait. Puisse le Tout Puissant vous aider à réaliser vos projets
les plus chers et vous accorder longue vie. Respectueusement.
A Mr Belkhodja Moulay (Professeur à l’Université d’Oran, Es-Sénia) : Pour
avoir assuré la présidence du jury de ce mémoire.
A Mr CHERITI Abdelkrim (Professeur au Centre Universitaire de
Béchar) : Pour avoir accepté d’examiner ce travail. Pour son soutien et ses précieux
conseils.
A Mme HARCHAOUI Saida (Maître de conférences à l’USTHB) : Pour
avoir accepté d’examiner ce travail.
A tout le personnel du laboratoire: Pour leur disponibilité et le soutien
moral. Pour l’esprit de collaboration et de courtoisie.
Que tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribué directement ou indirectement à laréalisation de ce modeste travail, trouvent ici mes sentiments de profonde gratitude
et de reconnaissance infinie.
Très cordialement.
Au nom de , Le Clément, Le Miséricordieux
« Gloire à Toi ! Nous n’avons de savoir que ce que tu nous as appris. Certes c’est Toi
l’Omniscient, le Sage » : Sourate 2, Verset 32 (Saint Corant).
Prière et bénédictions d’Allah sur le prophète Mohamed,
Paix et Salut sur lui, ainsi que ses compagnons, pour nous avoir apporté une religion
comme l’Islam
A mon père Djelloul: Les mots me manquent pour t’exprimer toute ma
reconnaissance. J’ai toujours trouvé auprès de toi, compréhension et soutien. Tes
prières et tes conseils ne m’ont jamais fait défaut tout au long de mes études. Trouve
à travers ce modeste travail, la récompense de ton affection, de tes sacrifices et de ta
patience.
A ma mère Fatima: Omi, que tes sacrifices, des peines et tes privations
trouvent leur récompense dans l’aboutissement de ce modeste travail qui est aussi le
fruit de ta persévérance, de ton courage et surtout de ta patience. Je voudrais à
travers ce modeste travail, te rendre un hommage mérité et te dire combien je suis
fier de l’éducation que tu m’as donnée. Puisse le Tout Puissant nous accorder de
t’avoir encore longtemps auprès de nous pour que tu puisses bénéficier de l’ombre de
l’arbre que tu as si jalousement protégé et entretenu.
A ma femme, mon fils qui n’est pas encore né et sa famille : Nedjari
Benhadj Ali : A force de courage et de persévérance, j’achève aujourd’hui un travail
qui est aussi le vôtre. Ce travail est le fruit de ton amour, ton soutien moral et tes
encouragements. Que Dieu nous aide à atteindre nos objectifs dans la vie.
A mes frères: Mohamed et Abdelatif : Puisse l’affection, la confiance et la
solidarité qui nous animent rester inébranlables. Fraternellement !
A ma s ur : Hakima, et son marie Mohamed : Vous m’avez beaucoup
soutenu à travers vos conseils, vos encouragements. Trouvez à travers ce modeste
travail, l’expression de ma profonde reconnaissance et le témoignage de mon profond
respect.
iii
Lexique des abréviations et symboles chimiques
AcOHAcOEtADNAlCl3BHACCMCHCl3cmDODPAPDPPHDROE.SFAOFeCl3GPXGSHH2O2HClHCOOHHIVIC50INRAMeOH mlmnNADPHNaOHNaNO2NONOSnmO2-
O2ONOO-
R2
RfSODT °CUVv/v%µgµl
: Acide Acétique: Acétate d’éthyle: Acide Désoxyribonucléique: Chlorure d’aluminium: butylhydroxyanisole: Chromatographie sur Couche Mince: Chloroforme: centimètre: Densité Optique: acide diphénylaminophosphorique: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl: Dérivées réactives de l’oxygène: erreur standard: Food agriculture organisation: Chlorure ferrique: glutathion péroxydase: glutathion: Péroxyde d’hydrogène: Acide chlorhydrique: Acide formique: Virus de l’Immunodéficience Humaine: Concentration inhibitrice à 50%: Institut National de Recherche Agronomique: Méthanol: millilitre: minute: nicotinamide adénosine dinucléotide phosphate (sous sa forme réduite): Hydroxyde de sodium: Nitrate de sodiumOxyde nitrique ou monoxyde d’azote: Synthase de l’oxyde nitrique: nanomètre: Anion supéroxyde: Oxygène moléculaire: Peroxynitrite: Coefficient de corrélation: Facteur de rétention: Superoxide dismutase: température en degré Celsius: Ultra-violets: Volume par volume: pour cent: Microgramme: Microlitre
iv
Liste des figures
Figure 1 : Vue d’ensemble du Ph nix dactylifera L…………………………………… 4
Figure 2 : Vue d’ensemble du Ph nix canariensis L…………………………………… 4
Figure 3 : Vue d’ensemble du Chamaerops humilis L………………………………….. 4
Figure 4 : Les différentes parties aériennes et souterraines du palmier dattier………….. 5
Figure 5 : Distribution du palmier dattier en Algérie…………………………………… 6
Figure 6 : Structure de quelques composés phénoliques………………………………... 17
Figure 7 : Synthèse de différentes classes terpéniques chez les plantes………………… 18
Figure 8 : Déséquilibre de la balance entre antioxydants et pro–oxydants……………... 23
Figure 9 : Mécanismes de détoxification cellulaire……………………………………... 25
Figure 10 : Principaux composés naturels possédant des propriétés antioxydantes……… 26
Figure 11 : Piégeage des radicaux libres (R°) par les flavonoides………………………. 27
Figure 12 : Prélèvement de pennes de palme de palmier dattier (Phoenix dactylifera L.).. 31
Figure 13 : Nettoyage des folioles pennes de palmier dattier (Phoenix dactylifera L…… 32
Figure 14a : Broyage des pennes de palmier dattier (Phoenix dactylifera L.)…………….. 32
Figure 14b : broyeur à billes................................................................................................... 32
Figure 15 : Extracteur sous reflux………………………………………………………... 33
Figure 16 : lyophilisateur Virtis…………………………………………………………... 33
Figure 17 : Extracteur de type Soxhlet…………………………………………………… 34
Figure 18 : Spectrophotomètre UV-Visible (8500 P Double-BEAM spectrophotometer). 39
Figure 19 : Structure chimique du DPPH et sa réaction avec un piégeur de radicaux (A-
H)………………………………………………………………………………. 41
Figure 20a,
20b
: Chromatogramme observée à 365nm sous UV avant la révélation des extraits
aqueux des Arecaceae étudiées……………………………………….. 47
Figure 21a,
21b
: Flavonoides observées à 365nm après révélélation au Neu des extraits
aqueux des trois Arecaceae étudiées…………………………………………. 48
Figure 22 : Flavonoides observés à 365nm sous UV des extraits aqueux des trois
Arecaceae étudiées…………………………………………………………….. 49
Figure 23 : Chromatogramme des aglycones des flavonoides observés à 365nm sous UV
des extraits aqueux des trois Arecaceae étudiées………………………... 51
Figure 24 : Sucres observés après révélation au DPAP des extraits aqueux des trois
Arecaceae étudiées…………………………………………………………….. 52
Figure 25 : Mise en évidence des Tanins par réaction en tube des extraits aqueux des
v
trois Arecaceae étudiées……………………………………………………….. 52
Figure 26 : Courbe d’étalonnage des polyphénols totaux réalisés à l’aide de l’acide
gallique…………………………………………………………………………. 53
Figure 27 : Histogramme représentant la quantité des polyphénols totaux par ordre
décroissant, exprimée en mg/g de poudre lyophilisée des extraits aqueux des
Arecaceae étudiées…………………………………………………………….. 55
Figure 28 : Courbe d’étalonnage des flavonoïdes réalisée à l’aide de la catéchine………. 55
Figure 29 : Histogramme représentant la quantité des flavonoides par ordre décroissant,
exprimée en mg/g de poudre lyophilisée des extraits aqueux des Arecaceae
étudiées…………………………………………………………………………. 57
Figure 30a : Screening de l’activité antioxydante par bioautographie des extraits aqueux
des trois Arecaceae étudiées…………………………………………………... 58
Figure 30b : Screening de l’activité antioxydante par bioautographie des extraits aqueux
des trois Arecaceae étudiées…………………………………………………... 59
Figure 31 : Histogramme représentant les IC50 des extraits aqueux des trois Arecaceae
étudiées…………………………………………………………………………. 61
Liste des tableaux
Tableau 1 : Les principales classes des composés polyphénoliques rencontrés chez les plantes……… 15
Tableau 2 : Structure chimique des alcaloïdes…………………………………………………………. 20
Tableau 3 : Lieux et date de Prélèvement des cultivars de palmiers dattiers…………………………... 30
Tableau 4 : Caractéristiques géographiques et bioclimatiques des sites de prélèvement……………… 31
Tableau 5 : Systèmes d’élution pour la CCM…………………………………………………………. 36
Tableau 6 : Résultats des observations des plaques de CCM avant et après révélation par des
colorations spécifiques pour chaque phytoconstituant……………………………………… 37
Tableau 7 : Caractéristiques des cultivars de palmier dattier d’Adrar…………………………………. 45
Tableau 8 : Tableau récapitulatif de l’analyse qualitative de différents extraits aqueux des trois
Arecaceae étudiées………………………………………………………………………….. 52
Tableau 9 : Analyse quantitative des polyphénols de l’extrait aqueux des cultivars des trois
Arecaceae étudiées………………………………………………………………………….. 54
Tableau 10 : Analyse quantitative des flavonoïdes de l’extrait aqueux des cultivars des trois
Arecaceae étudiées…………………………………………………………………………. 56
Tableau 11 : Dosage des polyphénols et des flavonoïdes des l’extraits obtenus par partage solide
liquide de cultivars de palmiers dattiers……………………………………………………... 57
Tableau 12 : Valeurs des IC50 de l’extrait aqueux des trois Arecaceae étudiées………………………... 60
Tableau 13 : Réactifs chimiques pour la révélation des CCM…………………………………………... 76
TABLE DES MATIERES
vii
Partie bibliographique
Introduction……………………………………………………………………………… 1
Chapitre -I- : Généralités sur les palmiers dattiers
1.Etymologie…………………………………………………………………………….. 42. Position systématique………………...…………………………………........……… 43. La morphologie du palmier dattier……………………………………...……………. 44. Origine et répartition géographique…………………………………………………... 5
4.1. Origine…………………………………...…………………………………......... 5 4.2. Répartition dans le monde……………………………………………………….. 5
4.3. Répartition en Algérie………………………………………………...………... 65. Intérêt et importance des palmiers dattiers…………………………………………… 7
5.1. Ecologique……………………………...………………………………………... 75.2. Economique……………..…………..…………………………………………… 7
5.3. Thérapeutiques et cosmétiques……………………………….………………….. 86. Les marqueurs morphologiques…….…………………………….…………………... 87. Les marqueurs biochimiques et moléculaires…………………….…………………... 10
7.1. Les marqueurs biochimiques……………………………………………….......... 117.1.1. Les isoenzymes…………………………………………………..………… 117.1.2. Les composés flavoniques………………………………..……………..…. 11
7.2. Les marqueurs moléculaires…………………………………………………..…. 12
Chapitre -II- : Les métabolites secondaires
1. Introduction………………………….…………………………………………..……. 142. Familles de métabolites secondaires………………………………………………….. 14
2.1. Polyphénols…………………………………………………………………......... 15 2.1.1. Définition………………..………………………………………………..... 15
2.1.2. Acides phénoliques…..……………………………………………….……. 16 2.1.3. Tannins………………..………………………………………………….... 16
2.1.4. Flavonoïdes………...………………………………………………...….….. 162.2. Terpènes……………………………………………………………………….…. 17
2.2.1. Définition……………………………………..……………………………. 172.2.2. Biosynthèse des terpènoïdes……..…………………………….…………. 18
2.3. Alcaloïdes………………………………………………………………....……... 19 2.3.1. Définition………………………………………………..………….…….... 19
2.3.2. Classification selon la structure chimique………………….……………. 19
Chapitre -III- : Les antioxydants
1. Notion de balance pro/anti-oxydante…………………………………………………. 232. Antioxydants………………………………………………………………………….. 23
2.1. Définition ………………………………………………………………………... 232.2. Neutralisation d'un oxydant……………………………………..……….………. 24
2.2.1. Antioxydants endogènes…………………………………………..………. 242.2.1.1. Système de défense primaire…………………………………..……… 24
2.2.1.2. Système de défense secondaire……………………………..……….. 24
TABLE DES MATIERES
viii
2.2.2. Antioxydants naturels……………………………………………..……...... 252.2.2.1. Vitamine E………………………………………………..………….. 262.2.2.2. Vitamine C………………………………………………..…………… 262.2.2.3. Caroténoïdes………………………………………………..………… 272.2.2.4. Acide alpha-lipoïque………………………………………..………… 272.2.2.5. Flavonoïdes………………………………………………..………….. 272.2.2.6. Tanins ……………………………………………………..………….. 272.2.2.7. Coumarines………………………………………………..………….. 282.2.2.8. Phénols…………………………………………………..……………. 28
Partie pratique
Chapitre -IV-: Matériel et méthodes
1. Matériel végétal et extraction…………………………………………………….…… 30 1.1. Prélèvement du matériel végétal…………………………………………………. 30
1.1.1. Palmiers dattiers……………………………………………………..……... 301.1.2. Autres Arecaceae ……………………………..…………………….…..…. 31
1.2. Séchage et broyage………………………………………………………………. 311.3. Extraction………………………………………………………………………… 32
1.3.1. Extraction sous reflux………………………………………………...…….. 32 1.3.2. Extraction solide-liquide……………………………………………...…….. 342. Analyses phytochimiques…………………………………………………….……….. 34 2.1. Screening phytochimique par CCM……………………………………...……… 34
2.1.1. Principe de la CCM………………………………………...………...…….. 342.1.2. Protocole expérimental………………………………………………..……. 352.1.3. Réactifs de révélation chimique sur CCM………………………………….. 35
2.1.4. Hydrolyse acide……………………………………………..……...….…… 382.1.4.1. Identification des aglycones…………………………..………………. 382.1.4.2. Identification des glucides……………………………..……………… 38
2.1.5. Mise en évidence des tanins……………………..……………………........ 382.2. Dosage des polyphénols totaux…………………………………...……………... 39
2.2.1. Principe…………………………………………………………...…..……. 39 2.2.2. Protocole du dosage…………………………………………..……………. 39
2.3. Dosage des flavonoïdes………………………………………………………….. 403. Activité antioxydante…………………………………………………………….……. 41
3.1. Par bioautographie…………………………………………...…………………... 413.1.1. Principe……………………………………………………………………... 413.1.2. Protocole………………………………………………………………… 42
3.2. Dosage de l’activité anti-radicalaire du radical stable DPPH…………………… 424. Analyse statistique……………………………………………………………………. 43
Chapitre -V-: Résultats et Discussion
1. Résultats……………………………………………………………………….. 451.1. Caractéristiques des cultivars prélevés………………………………………..… 451.2. Screening phytochimique des extraits aqueux………………………………..…. 45
1.2.1. Polyphénols……………………………………………………………..….. 461.2.1.1. Les acides phénoliques libres…………………………………….…… 461.2.1.2. Flavonoïdes…………………………………………………………… 46
TABLE DES MATIERES
ix
1.2.1.3. Hydrolyse acide………………………………………………...…... 511.2.1.3.1. Identification des génines……….………………………….….. .. 51
1.2.1.3.2. Identification des glucides…………….………………….……... 51 1.2.1.4. Mise en évidence des tanins…………………………………………... 52 1.2.2. Autres métabolites secondaires…………………………………………….. 53 1.3. Analyse quantitative………………………………………………………...…... 53 1.3.1. Dosage des polyphénols totaux …………………..………………… 53
1.3.2. Dosage des Flavonoïdes…………………………………………………. 55 1.4. Activité anti-radicalaire contre de DPPH par biotaugraphie…………………….. 57 1.5. Dosage de l’activité antioxydante…………..…………………………….……... 58
1.6. Screning phytochimique des extraits aqueux et méthanolique…………………... 592. Discussion……….…………………………………………………………...... 62
Conclusion et perspectives……………………………...……………………………. 66
Références bibliographiques………………….………………………………………. 69
Annexes………………………………………………………………………………….. 76
Résumé :
Le palmier dattier dans les régions arides du monde est la plante la plus importante
tant sur le plan écologique, économique que social. La richesse en cultivars de palmier dattier
existe dans toutes les palmeraies traditionnelles surtout celles du Sud-Ouest algérien mais chacune
possède une composition qui lui est propre. L'identification de ces cultivars repose sur la description
morphologique du fruit et de la graine mais ces descripteurs posent problème.
C’est avec l’objectif de contribuer à l’inventaire des cultivars du Phoenix dactylifera L. par la
recherche des marqueurs biochimiques que nous nous sommes proposés de caractériser les
phytoconstituants des folioles de 20 cultivars de palmier dattier. Un screening phytochimique a été
établi en vue de déterminer la composition en métabolites secondaires de ces cultivars. Les différents
extraits ont été préparés et analysés par la chromatographie sur couche mince qui a permis de mettre
en évidence les substances du métabolisme secondaire tels que les acides phénoliques, les
flavono des et les tanins. Après hydrolyse acide, les aglycones ont été identifiés comme étant la
quercétine et l’isorhamnétine. La partie osidique a été identifiée comme étant le galactose.
Cependant ces métabolites n'ont pas permis d'identifier d'une façon univoque les cultivars testés. Ils
permettent de différencier les deux genres étudiés Phoenix et Chamaerops. Les flavonoïdes et les
polyphénols totaux ont été également dosés. Les résultats montrent aussi une forte activité
antioxydante dans certains extraits aqueux des cultivars de palmier dattier.
Mots clés : Phoenix dactylifera L., Phoenix canariensis L. et Chamaerops humilis L., métabolites
secondaires, chimiotaxonomie, Activité antioxydante,
Summary:
The date palm in the arid areas of the world is the most important plant as well on
the ecological, economic level as social. The wealth of cultivars of date palm exists in all
the traditional palm plantations especially those of Algerian South-west but each one has
a composition which is special for him. The identification of these cultivars rests on the
morphological description of the fruit and of seed but these descriptors pose problem.
It is with the objective to contribute to the inventory of the cultivars of the Phoenix
dactylifera L. by the research of the biochemical markers that we proposed to characterize
the leaflets constituents of 20 cultivars of date palm. A screening was established in order
to determine the composition in secondary metabolites of these cultivars. The various
extracts were prepared and analyzed by thin layer chromatography that permits to identify
the phenolic acids, the flavonoids and tannins. After acid hydrolysis, the aglycones were
identified as being quercetin and the isorhamnétine. The osidic part was identified as
being galactose. However these metabolites did not make it possible to identify in a
univocal way the cultivars tested. They make it possible to differentiate the two studied
kinds Phoenix and Chamaerops. The total flavonoids and polyphenols were also
proportioned. The results show also a strong antioxydant activity in certain aqueous
extracts of the cultivars of date palm.
Key words: Phoenix dactylifera L., Phoenix canariensis L. and Chamaerops humilis L.,
secondary metabolits, chimiotaxonomy, antioxydant activity.
Introduction
INTRODUCTION
1
Le palmier dattier (Ph nix dactylifera L., famille des Arecaceae) est une
monocotylédone pérenne particulièrement adaptée aux zones arides et semi arides. Il
représente pour les populations des oasis sahariennes une espèce indispensable car il
constitue leur ressource de base, non seulement pour son fruit, la datte mais aussi pour
tous les sous produits dérivés des différentes parties du palmier dattier. En outre, il permet
de bonnes conditions de cultures étagées sous les palmiers comme les arbres fruitiers et
les cultures maraîchères.
L’évaluation et l’identification variétale de ces ressources phoenicicoles
constituent l’une des composantes essentielles d’une gestion rationnelle du patrimoine
ph nicicole.
La caractérisation des cultivars requiert la connaissance d’un grand nombre de
données morphologiques. Ces données décrivent essentiellement les caractères végétatifs
et inflorescentiels du fruit et de la graine qui sont le plus couramment utilisés pour la
détermination variétale.
Ainsi sur l’ensemble des régions phoenicicoles algériennes prospectées, près de
1000 cultivars ont été recensés. La richesse de la diversité existe dans toutes les
palmeraies traditionnelles surtout celles du Sud-Ouest algérien mais chacune possède une
composition “ variétale ” qui lui est propre
Cependant un certain nombre de descripteurs morphologiques utilisés pour la
détermination des cultivars de dattiers ne sont pas stables et dépendent de l’âge des arbres,
du stade de développement phénologique ou des conditions environnementales.
La recherche d’autres marqueurs du type biochimique pour l’identification des
cultivars de palmier dattier a conduit à s’intéresser aux métabolites secondaires, en
particulier aux composés phénoliques très utilisés dans la chimiotaxonomie des végétaux.
Dans ce présent travail, notre objectif majeur porte sur la recherche de marqueurs
biochimiques pour la caractérisation des cultivars algériens de palmier dattier.
On peut se poser alors la question : qu’en est-il de l’identité biochimique des
palmiers, en particulier celle des métabolites secondaires ?
Pour répondre à cette question nous nous sommes proposés de faire une étude sur
les métabolites secondaires sur différents cultivars de palmiers dattiers (Ph nix
dactylifera L.) de la région d’Adrar.
Par ailleurs nous avons travaillé sur deux autres palmacées : Phoenix canariensis
L. et Chamerops humilis L. afin de voir si les marqueurs obtenus sont spécifiques à
l’espèce, au genre ou à la famille.
INTRODUCTION
2
Au-delà de cet objectif, le travail contribuera aussi à mettre en évidence l’activité
antioxydante du palmier dattier comparativement à des substances de référence.
Le travail est constitué de plusieurs chapitres :
- un rappel des travaux sur le palmier dattier.
- une analyse bibliographique portant sur les métabolites secondaires et sur
l’activité antioxydante
- une partie expérimentale décrivant le matériel végétal et les techniques utilisées
- les résultats obtenus et discussions.
Chapitre -I- :
Généralités sur lespalmiers dattiers
Chapitre -I- GENERALITES SUR LES PALMIERS
4
1. Etymologie:
Le palmier dattier est une monocotylédone nommée Ph nix dactylifera par Carl
von Linné en 17531. Ph nix dérive de phoinix, un mot grec pour désigner le dattier.
Dactylifera dérive du grec dactulos qui signifie doigt, en relation avec la forme du fruit.
2. Position systématique:
- Le palmier dattier est une angiosperme monocotylédone de la famille des
Arecaceae (Figure 1), Cette famille est représentée par 200 genres et 2700 espèces
réparties en six familles (Uhl et Dransfield, 1987). Le genre Phoenix est classé dans la
sous famille des Coryphoideae subdivisée en trois tribus. Ph nix reste le seul genre de
la tribu Phoeniceae, il comprend plus d'une douzaine d'espèces qui semblent parfaitement
distinctes selon Barrow (1998).
Des hybrides naturels peuvent être formés par les croisements suivants:
P. dactylifera (Palmier dattier) x P. canariensis (Palmier des Canaries).
P. dactylifera (Palmier dattier) x P. reclinata (Palmier nain).
P. dactylifera (Palmier dattier) x P. sylvestris (Palmier à sucre)
Par ailleurs, nous avons travaillé sur deux autres palmacées (Arecaceae) :
- Ph nix canariensis L. appelé vernaculairement faux dattier. C'est un palmier à
valeur ornementale (Figure 2).
- Chamaerops humilis L. palmier nain ou palmier éventail est aussi une plante
d'ornement (Figure 3).
3. La morphologie du palmier dattier:
C'est un grand palmier avec un stipe de 20 à 30 mètres de haut, portant une
couronne de feuilles ou palmes de 4 à 7 mètres de longueur. Chaque palme est pennée et
les pennes à la base sont transformées en épines (Figure 4). L'espèce est dioïque et porte
des inflorescences mâles ou femelles. La fleur femelle comporte trois carpelles
indépendants dont un seul se développe pour donner la datte (le fruit) (Bouguedoura,
1991).
1 Linné Carl von, 1753. Species plantarum, 2 volumes. Impensis Laurentii Savii
Groupe Spadiciflores
Ordre Palmales
Famille Arecaceae
Sous-famille Coryphoïdaea
Tribu Phoeniceae
Genre Ph nix
Espèce dactylifera L
Groupe Spadiciflores
Ordre Palmales
Famille Arecaceae
Sous-famille Coryphoïdaea
Tribu Phoeniceae
Genre Ph nix
Espèce canariensis L
Groupe Spadiciflores
Ordre Palmales
Famille Arecaceae
Sous-famille Coryphoïdaea
Tribu Corypheae
Genre Chamærops
Espèce humilis L.
Figure 3: Vue d’ensemble du Chamaerops humilis L.(Photo prise à Misserghine)
Figure 2: Vue d’ensemble du Ph nix canariensis L.(Photo prise à la faculté d’Oran Es-Sénia)
Figure 1: Vue d’ensemble du Ph nix dactylifera L.(Photo prise à Adrar)
Chapitre -I- GENERALITES SUR LES PALMIERS
5
Figure 4: Les différentes parties aériennes et souterraines
du palmier dattier (Munier, 1973).
4. Origine et répartition géographique :
4.1. Origine :
Le palmier dattier semble avoir été cultivé pour la première fois dans les zones
arides et semi arides chaudes de l’ancien monde situé entre l’Euphrate et le Nil vers 4500
avant J.C (Munier, 1973). Il connut ensuite une extension vers les autres régions du
monde (Wrigley, 1995).
4.2 Répartition dans le monde :
Le palmier dattier est localisé dans les régions, là où les conditions climatiques le
permettent, entre les latitudes 35° Nord et 15° Nord. Sa culture est localisée sur la rive
méditerranéenne de l’Afrique jusqu’au proche- orient, depuis le sud de l’Iran jusqu’à la
côte atlantique de l’Afrique du nord et en Asie
Dès le 18ème siècle, il a été introduit en Amérique, en particulier en Californie. Il
ne vit que dans les déserts chauds et s’étale entre les parallèles Nord 9°18’ (Cameroun) à
39°44’ (Elche en Espagne).
stipe
Chapitre -I- GENERALITES SUR LES PALMIERS
6
Les plantations les plus récentes et à faible échelle se situent en Argentine, Brésil,
Pérou, Australie et au Niger (Jahiel, 1996), Mali, et Sénégal.
4.3. Répartition en Algérie :
Le palmier dattier se rencontre dans plusieurs oasis réparties sur tout le sud du
pays où le climat est chaud et sec. Sa culture s’étend depuis la frontière marocaine (Ouest)
jusqu’à la frontière Tuniso- libyenne (Est), et depuis l’Atlas saharien jusqu’à Reggane à
l’Ouest, Tamanrasset au centre et Djanet à l’Est.
Les principales régions phoenicicoles (Figure 5) sont:
• A l’Est : les Zibans (Biskra), l’Oued Rhir (entre Ouargla et Touggourt), l’Oued
Souf, la cuvette de Ouargla et le M’zab (Ghardaïa). Ces palmeraies sont
constituées principalement de Deglet Nour, cultivar à très haute valeur
commerciale.
• A l’Ouest : la Saoura (Beni Abbes), le Touat (Adrar), le Gourara (Timimoun), le
Tidikelt (Reggane) et El Goléa. Ces palmeraies comportent un verger très
diversifié. Ces cultivars produisent des dattes, de qualité commerciale très faible.
Figure 5: Distribution du palmier dattier en Algérie (Hannachi et al, 1998).
Chapitre -I- GENERALITES SUR LES PALMIERS
7
5. Intérêt et importance des palmiers dattiers :
Le palmier dattier dans les régions arides du monde est la plante la plus importante
tant sur le plan écologique, économique et social (Bounaga, 1991).
5.1. Écologique :
Le palmier dattier est l’arbre providence des régions chaudes et désertiques où il
croît. Il permet aux populations de ces régions de vivre et de se maintenir dans des
conditions très sévères.
En outre, le dattier crée des conditions climatiques favorables (protection vis à vis
des vents violents, atténuation de l’ensoleillement par tamisage, le maintien d’un certain
degré d’humidité) à l’implantation de cultures maraîchères, arboricoles ou fourragères
(Toutain, 1979).
Un champignon du sol, le Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, provoque chez le
dattier une fusariose (le bayoud) qui entraîne sa mort; cette attaque cryptogamique a fait
disparaître les palmiers dattiers de nombreuses oasis. Le phénomène de désertification
s’est ainsi accentué par un déséquilibre profond des écosystèmes de nombreuses
palmeraies.
5.2. Économique :
La datte constitue la base de l’alimentation des populations oasiennes. Elle est
aussi utilisée comme dessert et elle est soit consommée directement, soit transformée en
produits alimentaires (pâtes, confiture, crème, farine, sirop, vinaigre et alcool de datte).
Les noyaux de dattes servent à l’engraissement du cheptel. Les noyaux concassés
sont utilisés comme reconstituant pour les dromadaires amaigris. Cette alimentation est
tonifiante et très riche en glucides. Les graines torréfiées peuvent fournir un succédané de
café.
Le tronc fournit le bois de chauffage et du matériel pour la construction. La sève
qui s’écoule du stipe incisé est utilisée pour la préparation de boisson appelée le vin de
palme ou lagmi qui peut être bu frais ou fermenté.
Les palmes (vertes ou sèches) sont utilisées pour la vannerie (confection des
couffins, chapeaux, éventails et nattes). On les trouve aussi en clôture, sous les toitures.
L’inflorescence est utilisée en balai et la spathe en bois de chauffage.
Le coeur de palmiers fournit le djemmar qui peut être consommé cru.
Chapitre -I- GENERALITES SUR LES PALMIERS
8
La production mondiale est de l’ordre de 5.960.000 tonnes (année 2004) (données
FAO2) dont plus de 4.227.00 Q tonnes produites par les pays arabes soit 71% de la
production mondiale.
En ce qui concerne l’Algérie, le nombre total de palmiers est estimé à plus de 17
millions (année 2006) (données FAO2) sur une superficie de plus de 147 900 hectares. La
production dattière algérienne est de l’ordre de 550.000 tonnes (année 2006) (données
FAO). Dans ce contexte, l’Algérie serait le 6ème producteur mondial de datte et le 5ème
exportateur au niveau du monde arabe.
5.3. Thérapeutiques et cosmétiques :
Choix des cultivars pour leur usage médical ( Guerradi et al., 2005).
- U’chet, Feggouss : fortifiant pour les femmes après accouchement, sucette pour
bébés
- Dalt (Algérie): sucettes pour nouveaux nés
- Azerza et Ghars (Algérie) : utilisées comme compresses pour le rétablissement des
fractures des os.
- Jihl (Maroc): Régulation de l’hyper tension artérielle
- Des masques de beautés à base de dattes (Maroc, Algérie, Tunisie)
- Utilisation de pollen pour le traitement des problèmes de stérilité chez l’homme et
la femme. (Algérie, Maroc et Tunisie)
- Bourar (Maroc) : utilisés dans les régimes alimentaires pour lutter contre l’obésité.
- Les pennes de Timjouhart utilisés contre la toux et les angines.
6. Les marqueurs morphologiques :
Traditionnellement, de nombreux caractères morphologiques sont utilisés pour
décrire les lignées et les cultivars chez les végétaux. L’observation se fait à tous les stades
de croissance de la plante jusqu’à la récolte.
La notion de cultivar chez le palmier dattier repose sur la description
morphologique du fruit et de la graine et de façon moins évidente sur la description de
l'arbre. Les différentes appellations des dattiers ne sont appliquées que pour les palmiers
femelles car ils sont les seuls à produire des fruits.
2 www.FAO.org. (Consulté le: 23/03/2008)
Chapitre -I- GENERALITES SUR LES PALMIERS
9
Dans le cadre de l’évaluation de la variabilité génétique du palmier dattier, des
études morphologiques ont été réalisées par Brac de la Perrière et Benkhalifa (1989).
Une fiche descriptive a été mise en place à l’échelle des pays du maghreb.
En Algérie, Hannachi et al. (1998) et Belgueddj (2002) ont décrit presque 200
cultivars des oasis algériennes en utilisant les caractères du fruit et de la graine et
quelques mesures et appréciations sur l'arbre.
L’application de cette méthode leur a permis de mettre en évidence les caractères
les plus discriminants. Cependant, ces données morphologiques sont assez incertaines sur
le plan taxonomique pour diverses raisons :
- Leurs interactions avec l’environnement (sol, température etc.) font qu’ils sont
peu informatifs d’un point de vue sélection précoce. La précision de ces analyses
phénotypiques peut être augmentée en introduisant d’autres marqueurs.
- Les cultivars sont des palmiers dattiers femelles multipliés végétativement et
identifiés localement dans une même palmeraie d’après l’aspect morphologique
de leur fruit. On leur donne une même appellation vernaculaire en langue arabo-
berbère. C'est ainsi qu'une variabilité intracultivar importante pour certains
cultivars a été détectée. Ces derniers auraient probablement des origines
multiclonales, alors que pour d’autres cultivars, ils sont plus homogènes, ils
proviendraient d’une seule origine clonale (Brac de la Perrière et Benkhalifa,
1989).
- Plusieurs problèmes se sont aussi posés concernant la nomenclature des cultivars.
Un problème de synonymie, lorsque différents noms vernaculaires peuvent
indiquer un même cultivar, et inversement, un problème d’homonymie, quand il
s’agit de différents cultivars dans différentes palmeraies et qui ont le même nom
vernaculaire (Hannachi et al., 1998) .
Cette appellation vernaculaire repose entre autres sur plusieurs critères. Les
exemples qui suivent sont rapportés par Tirrichine (2007) :
• Les caractéristiques du fruit:
- La couleur du fruit à la véraison, exemples: «Tazougueght», à véraison rougeâtre
«Tdelt», sans véraison (couleur verte) «Taoureght», de couleur jaunâtre ;
«Tazerzeit», mélange de couleur.
- La forme du fruit, exemple: «Akerbush» et «Takerbusht» forme ronde et
sphérique «Jakerneneit» forme ovoide ; «Sehaa bedraa» forme allongée.
- Le goût et la consistance du fruit, exemple: «Sokria», goût sucré.
Chapitre -I- GENERALITES SUR LES PALMIERS
10
• La personne qui a mis au point ou introduit le cultivar:
«Ali ou rached» ; «Ouggahmide» ; «Deglet Nour» ; «Babati» ; «Baydir».
• L’origine supposé du cultivar (lieu ou tribu):
«Tamezouart n’Tlet», TIet étant une zone de la palmeraie de Beni Isguen ;
«Tamjouhert», de la tribu Mjaher de Tougourt; «Utekbala», celle qui vient d’el
Kibla (sud-est).
• La précocité :
Exemple: «Tamezouart» cultivar présent dans l’oasis de Ghardaia connu pour sa
précocité, ne pas confondre avec le cultivar «Tamezouart n’Tlet» précédemment
cité. (Tirichine, 2007),
Exemple d’un cas de synonymie: au M’zab, les appellations «Litim» et «Ajoujil»
désignent en fait un même cultivar.
Exemple d’un cas d’homonymie: «Tazerzait» du M’zab et «Tazerzait» du Touat
sont deux cultivars tout à fait différents.
L’évaluation du potentiel ph nicicole des différentes palmeraies à partir des
marqueurs morphologiques a fait donc apparaître des problèmes mettant en cause l’effet
du milieu et la nomenclature des cultivars. De plus, la reconnaissance des cultivars en
dehors de la période de fructification est difficile. Pour ces raisons, d’autres marqueurs
ont été entrepris pour évaluer la diversité génétique du palmier dattier par l’utilisation des
marqueurs biochimiques et moléculaires
7. Les marqueurs biochimiques et moléculaires :
Les marqueurs génétiques de types protéiques et enzymatiques (marqueurs
biochimiques) ou nucléiques (marqueurs moléculaires) dont l’expression est indépendante
de l’environnement peuvent être utilisés pour caractériser les populations de palmier
dattier, évaluer leur diversité génétique et pour marquer aussi la conformité génétique des
individus régénérés.
Un bon marqueur doit être polymorphe transmis de façon codominante, facile à
obtenir et reproductible, mais, pratiquement, aucun marqueur ne possède toutes ces
qualités exigées.
Chapitre -I- GENERALITES SUR LES PALMIERS
11
7.1. Les marqueurs biochimiques:
7.1.1. Les isoenzymes:
Les isoenzymes sont des formes moléculaires multiples d’une enzyme qui
possèdent des activités catalytiques similaires dans un même organisme. Des études
montrent que les iso enzymes peuvent être spécifiques d’un tissu. Elles dépendent de sa
maturité et de son environnement cellulaire (Scandalios, 1974).
Dans le cas du palmier dattier, le contrôle génétique de cinq systèmes
enzymatiques de feuilles adultes a été étudié par Torres et Tisserat (1980) pour
différencier les cultivars.
D’autres auteurs ont travaillé sur les profils estérasiques et péroxydasiques de
plusieurs cultivars marocaines (Baaziz, 1989).
Bennaceur et al. (1991) a travaillé sur 186 individus appartenant à 31 cultivars
provenant de diverses palmeraies algérienns à l’aide de 7 systèmes enzymatiques. Ces
auteurs ont montré que la diversité génétique est grande mais seulement 20 cultivars sont
identifiés à partir de cinq systèmes enzymatiques.
L'utilisation de marqueurs isoenzymatiques polymorphes dans l'analyse de la
diversité génétique des palmeraies marocaines a permis d'estimer la variabilité intra-
population à plus de 90% de la diversité totale du palmier dattier, alors que la variabilité
entre les populations est limitée à 10 %, environ (Bendiab et al., 1998; Bendiab, 1998).
Les isoenzymes n’ont pu être totalement discriminants pour différencier
l’ensemble des génotypes.
7.1.2. Les composés flavoniques
Les flavonoïdes sont des composés phénoliques souvent localisés dans la vacuole
cellulaire, dotés d’une diversité structurale. Ce sont des outils de la chimiotaxonomie de
plusieurs classes de végétaux et ils sont impliqués dans les mécanismes de résistance aux
maladies. Les études dans un but chimiotaxinomique sont très peu nombreuses. De plus si
les composés phénoliques des feuilles (Ouafi, 1987) et des fruits (Maier et al., 1964) du
palmier dattier n’ont fait l’objet que de très rares travaux, l’étude de ceux des racines n’a
été entreprise qu’à partir de 1992 par Ziouti et aI, (1992).
Des études chimiotaxinomiques ayant montré que les aglycones flavoniques (deux
flavones et trois flavonols) obtenus par hydrolyse acide des palmes sont des marqueurs de
l’espèce (Ouafi et al., 1988).
Chapitre -I- GENERALITES SUR LES PALMIERS
12
Les hétérosides flavoniques, marqueurs infra-spécifiques ont permis
l’identification de 9 cultivars de palmier dattier issus d’une collection à I’INRA d’Adrar.
Ces marqueurs ont permis aussi de déceler une variabilité intracultivar chez
Taquerboucht, cultivar résistant à la fusariose du palmier dattier (maladie du Bayoud).
Cette variabilité est liée probablement à deux clones génétiquement proches (Ouafi et al.,
1992).
D’autres travaux ont montré une grande richesse polyphénolique dans le feuillage
du palmier dattier. On y trouve quatre grande familles flavoniques : proanthocyanidines,
flavonols, flavones et les acides phénols (Ouafi et Bounaga, 2008).
Toutefois aucune étude n’a aboutit à la mise en évidence d’un marqueur univoque
qui pourrait être utilisé comme un critère d’identification des cultivars et de sélection des
plantes issues de croisements dirigés.
7.2. Les marqueurs moléculaires:
Plusieurs travaux dont nous citerons certains, ont décrit l’utilisation des marqueurs
RFLP (Corniquel et Mercier, 1994), RADP (Bouchireb et Clark, 1997 ; Sedra et al.,
1998) et les microsatellites (Zehdi et al.,2004).
Seuls les microsatellites ont permis de caractériser certains cultivars tunisiens.
Cependant, ces techniques nécessitent un équipement très lourd et très cher donc
difficilement applicables dans nos laboratoires.
Chapitre -II- :
Les métabolitessecondaires
Chapitre -II- METABOLITES SECONDAIRES
14
1. Introduction :
Les métabolites secondaires végétaux peuvent être définis comme des molécules
indirectement essentielles à la vie des plantes, par opposition aux métabolites primaires
qui alimentent les grandes voies du métabolisme basal. Ces métabolites secondaires
exercent cependant une action déterminante sur l’adaptation des plantes à leur
environnement. Ils participent ainsi, de manière très efficace, à la tolérance des végétaux à
des stress variés (attaques de pathogènes, prédations d’insectes, sécheresse, lumière
UV…).
D’un point de vue appliqué, ces molécules constituent la base des principes actifs
que l’on retrouve chez les plantes médicinales. La grande valeur thérapeutique de certains
de ces métabolites, alliée à leur difficulté de production, à partir de végétaux
(généralement moins de 1 % du poids de matière sèche), explique les difficultés
d’approvisionnement liées à ces molécules et, conséquemment, un prix de marché souvent
exorbitant.
Chez l’Homme, ces éléments traces jouent également un rôle important, en
agissant directement sur la qualité nutritionnelle des fruits et légumes et leurs impacts sur
la santé des consommateurs sont maintenant avérés (effet antioxydant, effet protecteur
contre l’apparition de certains cancers, ou au contraire micro toxiques indésirables).
Par ailleurs, certains métabolites secondaires peuvent être considérés comme des
marqueurs chimiotaxonomiques (Verscheure, 2002). La recherche de ces métabolites
fera l'objet de notre travail.
2. Familles de métabolites secondaires :
Les métabolites secondaires des végétaux, dépassant actuellement 100 000
substances identifiées, appartiennent à trois classes principales (Guignard, 2000):
Ø Composés aromatiques: phénoliques, acide shikimique ou dérivé d’acétate ;
Ø Terpènoïdes et Stéroïdes ;
Ø Composés azotés ou alcaloïdes.
Chapitre -II- METABOLITES SECONDAIRES
15
2.1. Polyphénols :
2..1.1. Définition :
Les polyphénols constituent un des groupe le plus nombreux et largement
distribué des substances du métabolisme secondaire dans les végétaux. Ils sont
présents dans tous les organes de la plante avec plus de 8000 structures
phénoliques connues. Ils résultent biogénétiquement de deux voies synthétiques
principales: la voie des shikimates et la voie des polyacétates. Selon Harborne (1989),
les polyphénols peuvent être divisés en une dizaine de classes chimiques qui
présentent toutes un point commun : la présence dans leur structure d’au moins un cycle
aromatique à 6 carbones, lui-même porteur d’un nombre variable de fonctions
hydroxyles (OH) (Figure 6). Peuvent s'étendre de molécules simples, telles que les
acides phénoliques, aux composés fortement polymérisés, tels que des tanins
(Guignard, 2000 ; Lugasi et al., 2003) (Tableau 1).
Tableau 1 : Principales classes des composés polyphénoliques rencontrés chez les plantes
(Goodwin et Mercer 1983)
Nombre d’atomede carbone
Structure Classe Exemple
6 C6 Phénols simples Catéchol7 C6-C1 Acides phénoliques acide gallique, salicylique
8 C6C2
acétophénones 3-acétyl-6-méthoxybenzaldéhydeTyrosol
9 C6-C3
Acide hydroxycinnamiquePhénylpropènesCoumarinesIsocoumarinesChromones
Caféique, feruliqueEugénol, Myristicineombelliferone,BergenoneEleuthérinolEugenine
10 C6C4 Naphtoquinones Juglone, plumbagine13 C6C1C6 Xanthones Mangiferine14 C6C2C6 Stilbènes
AnthraquinoneResveratrolEmodine
15 C6C3C6 FlavonoidesIsoflavonoides
Quercetine,cyanidineGenisteine
18 (C6C3) Lignanes Podophylotoxine,Pinoresinol
30 (C6C3C6)2 Biflavonoides Amentoflavonen (C6C3) n Ligninesn (C6C3C6) n Tanins condensés
Chapitre -II- METABOLITES SECONDAIRES
16
Les composés phénoliques (acides phénoliques, flavonoïdes simples et proanthocyanidines)
forment le groupes des composés phytochimiques le plus important des plantes (Beta et al.,
2005).
2.1.2. Acides phénoliques :
Les acides phénoliques sont contenus dans un certain nombre de plantes agricoles
et médicinales (Psotove et al., 2003). On citera l’acide chlorogénique, l’acide
caféique, l’acide protocatéchique, l’acide vanillique, l’acide férulique, l’acide sinapique
et l’acide gallique (Hale, 2003).
Ils sont considérés comme substances phytochimiques avec des effets
prébiotique, antioxydant, de chélation et anti-inflammatoire. Leur toxicité est faible
et considéré non toxique. Pharmacologiquement, le mieux caractérisé est l’acide
caféique (Psotove et al., 2003).
2.1.3. Tanins :
Les tanins sont des polyphénols polaires d’origine végétale (Berthod et al., 1999),
existent dans différentes parties de la plante : écorce, bois, feuilles, fruits et racines. Il est
difficile de les séparer dans un extrait végétal, parce que de nombreux isomères
avec une base moléculaire très semblable coexistent (Berthod et al., 1999).
Ils sont divisés en deux groupes, tanins hydrolysables et condensés, ils
peuvent être constitués par la condensation des dérivés flavane qui ont été transportés
aux tissus du bois des plantes. Alternativement, des tanins peuvent être constitués par
polymérisation des unités de quinone (Cowan, 1999).
2.1.4. Flavonoïdes :
Le terme flavonoïde rassemble une large gamme de composés appartenant à la
famille des polyphénols. Les flavonoïdes possèdent un squelette de base à quinze atomes
de carbone constitué de deux cycles en C6 (A et B) reliés par une chaîne en C3 (Ribéreau-
Gayon, 1968). Les flavonoïdes sont une classe de composés ubiquitaires dans les plantes
vasculaires et représentent un des plus grands groupes de produits naturels phénoliques
(Figure 6). Ils interviennent dans la pigmentation des fleurs, la protection des plantes contre
les radiations UV de type B et leur défense contre les herbivores et les attaques
microbiennes (Harborne et al., 2000). Certains flavonoïdes ont parallèlement une activité
antioxydante (Pietta, 2000), anti-inflammatoire, vasculaire, oestrogénique et antitumorale,
Chapitre -II- METABOLITES SECONDAIRES
17
pour ne citer que leurs principales propriétés pharmacologiques (Harborne et Williams,
2000).
Ces composés se divisent en différents types : flavones, isoflavones, flavonols,
flavanones, flavanes, chalcones, anthocyanidines, catechines, ptérocarpanes, aurones.
2.2. Terpènes :
2.2.1. Définition :
Les terpènes sont des hydrocarbures formés par assemblage de deux ou plusieurs
unités isopréniques. Ce sont des polymères de l’isoprène de formule brute (C5H8) n. Ce
sont des polymères de l’isoprène de formule brute (C5H8) n. Selon le nombre d’unités
associées, on distingue : les mono-(C10), les sesqui-(C15), les di-(C20), les tri-(C30), les
tétra-(C40) terpènes et poly terpènes.
Figure 6: Structure de quelques composés phénoliques (Guignard, 2000).
Chapitre -II- METABOLITES SECONDAIRES
18
La famille des terpénoïdes comprend (Hopkins et Evrard, 2003):
Ø des hormones (gibbérellines, acide abcissique),
Ø des pigments caroténoïdes (carotène et xanthophylle),
Ø des stérols (par exemple : ergostérol, sitostérol, cholestérol)
Ø des dérivés de stérol (par exemple des hétérosides digitaliques),
Ø le latex (qui est à la base du caoutchouc naturel).
Ø une grande partie des huiles essentielles qui confèrent aux plantes leur
parfum ou leur goût.
2.2.2. La biosynthèse des terpènoïdes :
La biosynthèse des terpènoïdes implique l’addition de l’unité isoprène avec
son isomère pour former le géranyl diphosphate (GPP, C10), condensé avec une
autre unité IPP (Isopentenyl di phosphate) forment le diphosphate de farnésyl (FPP,
C15) à l’origine des sesquiterpènes etc. (figure 7).
Les précurseurs parentaux compte tenu de la modification structurale par
l'oxydation, la réduction, l'isomérisation, l'hydratation, la conjugaison et/ou d'autres
transformations donnent une variété de terpènoïdes (Dubey et al., 2003)
Figure 7: Synthèse de différentes classes terpéniques chez les plantes (Dubey et al., 2003)
Chapitre -II- METABOLITES SECONDAIRES
19
2.3. Alcaloïdes :
2.3.1. Définition :
Les alcaloïdes forment une grande famille de molécules chimiquement
hétérogènes. Leurs caractéristiques communes sont :
Ø leur solubilité dans l’eau ;
Ø la présence d’au moins un atome d’azote qui accepte souvent un proton, ce qui
leur confère un caractère légèrement basique en solution (d’où leur nom
d’alcaloïdes).
A faible dose, ils sont toxiques et possèdent une remarquable activité physiologique
qui a conduit à l’emploi de certains d’entre eux en thérapeutique : morphine, quinine,
atropine, cocaïne, etc. (Hopkins et Evrard, 2003).
2.3.2. Classification selon la structure chimique:
Dans le premier cas, on classe les alcaloïdes en fonction de la nature de l’amine
primaire (mescaline), secondaire (éphédrine), tertiaire (hordéine) ou ammonium
quaternaire (muscarine).
Dans le deuxième cas, les alcaloïdes sont classés selon la grandeur et la complexité
croissante de l’hétérocycle azoté (Guignard, 2000).
L’énumération suivante peut en donner un aperçu (les formules développées
sont données dans le tableau 2).
Chapitre -II- METABOLITES SECONDAIRES
20
Tableau 2: Structure chimique des alcaloïdes (Buchanan et al., 2000)
Alcaloïdes Dérivés
N
CH3
Pyrrolidine
N
CH3
CH2 CO OCH3
Hygrine
N PyridineN
CH3
Nicotine
N
H Pipéridine
N
H
CH2 CH2 OCH3
Coniine
N
H3C
Tropane
N
H3C
COOCH3
O C
OC6H5
Cocaïne
N
N
H Imidazole
N
N
H
CH2 CH2 NH2
Histamine
N
CH3
COOCH3
OCOC6H5Cocaïne
C
CH3
O
H2C
H3C
N
CO
C6H5
CH3
CH3
Stovaïne
Chapitre -II- METABOLITES SECONDAIRES
21
Suite du tableau 2 :
N
N N
N
H Purine
N
N N
NH3C
CH3
CH3O
O
Caféïne
N
H Indole
NN
H
H3COOC
OH Yohimbine
N
Isoquinoléine
NH3CO
H3CO
H3CO
OCH3
Papavérine
Chapitre -III- :
Les antioxydants
Chapitre -III- ACTIVITE ANTIOXYDANTE
23
1. Notion de balance pro/anti-oxydante :
Dans la plupart de notre tissu sain, les défenses anti-oxydantes sont capables de
faire face aux besoins et de détruire les radicaux produits en excès. On dit que la balance
pro/anti-oxydante est en équilibre. Mais dans certaines situations, en raison d’une
surproduction radicalaire (tabac, alcool, pollution) et/ou d’une diminution des capacités
anti-oxydantes (insuffisance d’apports en micronutriments anti-oxydants, inactivation
d’enzymes), un déséquilibre s’instaure entre la production des radicaux libres et les
systèmes de défense. On se trouve face à une altération de l’état redox cellulaire, appelée
stress oxydatif (Figure 8)3.
Figure 8: Déséquilibre de la balance entre antioxydants et oxydants3
2. Antioxydants :
2.1. Définition :
Il peut être défini comme toute substance qui est capable, concentration
relativement faible, d’entrer en compétition avec d’autres substrats oxydables et ainsi
retarder ou empêcher l’oxydation de ces substrats (Meister, 1983).
3 www.Probiox.com-Untitled (Consulté le 12 /10/ 2008)
Oxydant
Antioxydants
Chapitre -III- ACTIVITE ANTIOXYDANTE
24
2.2. Neutralisation d'un oxydant :
2.2.1. Les antioxydants endogènes :
Les défenses antioxydantes de l’organisme (Figure 9) peuvent se diviser en :
- Système de défense primaire ;
- Système de défense secondaire.
2.2.1.1. Système de défense primaire :
Les systèmes de défense primaire sont composés d’enzymes et de substances
antioxydantes:
Ø la superoxyde dismutase (SOD) : diminue la durée de vie de l’anion
superoxyde O2-
Ø La catalase : transforme le peroxyde d’hydrogène (H2O2) en simple molécule
d’eau
Ø Le glutathion péroxydase (GPx) : détruit le péroxyde d’hydrogène et les
péroxydes lipidiques
Ø Les molécules piégeurs : le glutathion (GSH), l’acide urique, les protéines à
groupement thiols, ubiquinone, etc.
2.2.1.2. Système de défense secondaire :
Les système de défense secondaire sont composés d’enzymes protéolytiques,
des phospholipases, des ADN endonucléase et ligase (Pincemail et al., 1998).
Chapitre -III- ACTIVITE ANTIOXYDANTE
25
Figure 9: Mécanismes de détoxification cellulaire (Buchanan et al. , 2000 )
2.2.2. Antioxydants naturels :
Plusieurs substances peuvent agir en tant qu'antioxydants in vivo. Elles incluent
le bêta carotène, l'albumine, l'acide urique, les oestrogènes, les polyamines, les
flavonoïdes, l'acide ascorbique, les composés phénoliques, la vitamine E (Figure 10) etc.
Elles peuvent stabiliser les membranes en diminuant leur perméabilité et elles ont
également une capacité de lier les acides gras libres (Svoboda et Hampson, 1999).
Chapitre -III- ACTIVITE ANTIOXYDANTE
26
Figure 10: Principaux composés naturels possédant
des propriétés antioxydantes (Shahidi, 1997)
2.2.2.1. Vitamine E :
La vitamine E est un antioxydant important qui protège les cellules contre
les dommages associés aux radicaux libres et par conséquent, prolonge la vie
cellulaire tout en ralentissant le processus de vieillissement (Maydani, 2000). Il a
été déterminé que la vitamine E naturelle, semble être deux fois plus biodisponible que la
vitamine E synthétique (Burton et al., 1998). La vitamine E est rencontrée surtout
dans les huiles végétales, les noix et les germes de diverses graines (Vansant, 2004).
2.2.2.2. La vitamine C ou acide ascorbique :
La vitamine C est un puissant réducteur. Il joue un rôle important dans la
régénération de la vitamine E. Il est présent dans les légumes, le chou, le poivron, les
agrumes (Ekoumou, 2003).
Chapitre -III- ACTIVITE ANTIOXYDANTE
27
2.2.2.3. Caroténoïdes :
Les exemples de caroténoïdes incluent l’alpha carotène, bêta carotène,
lycopène, phytofluène, phytoène, lutèine, néoxanthine, violaxanthine, anthéraxanthine,
alpha cryptoxanthine et bêta cryptoxanthine. Leur structure polyène leur permet
d’absorber la lumière et de neutraliser l’oxygène singulet. Cette chaîne polyène, par
mécanisme d’addition, permet l’incorporation des espèces réactives ou radicaux
libres et de ce fait ralentir leur propagation. Les caroténoïdes sont impliqués dans
la prévention de nombreux types de cancer: cancer de la prostate, cancer du poumon
(Hale, 2003).
2.2.2.4. Acide alpha-lipoïque :
L’acide alpha-lipoïque fut isolé il y a cinquante ans et identifié comme vitamine.
Depuis, il a été reclassé comme antioxydant et peut piéger les radicaux libres aux
niveaux intracellulaire et extracellulaire. Du fait, qu’il soit aussi bien liposoluble
qu’hydrosoluble, il peut accéder à toutes les parties de nos cellules (Packer et al.,
1995).
2.2.2.5. Flavonoïdes :
Plusieurs flavonoïdes ont montré des activités antioxydantes (Figure 11), anti-
inflammatoires, inhibitrices d’enzymes et prévention des maladies cardiovasculaires
(Wang et Mazza, 2002).
2.2.2.6. Tanins :
Les tanins sont des donneurs de protons aux radicaux libres lipidiques produits au
cours de la péroxydation. Des radicaux taniques plus stables sont alors formés, ce qui a
Figure 11: Piégeage des radicaux libres (R°) par les flavonoides
(Jovanovic et al. , 1994)
Chapitre -III- ACTIVITE ANTIOXYDANTE
28
pour conséquence de stopper la réaction en chaîne de l’auto oxydation des lipides (Cavin,
1999).
2.2.2.7. Coumarines :
Les coumarines de différents types se trouvent dans de nombreuses espèces
végétales et possèdent des propriétés très diverses. Ils sont capables de prévenir la
péroxydation des lipides membranaires et de capter les radicaux hydroxyles, supéroxydes
et péroxyles. Les conditions structurales requises pour l’activité antipéroxydante des
coumarines sont similaires à celles signalées pour les flavonoides (Igor Passi, 2002).
2.2.2.8. Phénols :
Parmi les dérivés phénoliques, le resvératrol est le composé qui est le plus étudié. En
effet, ce stilbène, isolé du raisin possède de fortes propriétés antioxydantes (Igor Passi,
2002).
Chapitre -IV-:
Matériel et méthodes
Chapitre -IV- MATERIEL ET METHODES
30
1. Matériel végétal et extraction
1.1. Prélèvement du matériel végétal
1.1.1. Palmiers dattiers :
Le prélèvement des pennes de palmier dattier a été effectué sur une vingtaine de
cultivars de palmier dattier dans la wilaya d'Adrar en janvier 2008 (Tableau 3) (Figure
12), dont les caractéristiques géographiques et bioclimatiques d’Adrar sont résumées dans
le tableau 4.
Tableau 3: Lieux et date de prélèvement des cultivars de palmier dattier.
cultivars Lieux de récolte Date de récolte
Baouadhim Benyellou / Bouda 16.01.2008
Timjuhert I.N.R.A d’Adrar 15.01.2008
Bamakhlouf I.N.R.A d’Adrar 15.01.2008
Warglia I.N.R.A d’Adrar 15.01.2008
Tinakour Benyellou / Bouda 16.01.2008
Adoukli Benyellou / Bouda 16.01.2008
Aghamou Zt.Manssour / Bouda 13.01.2008
Aghamou (Bayoud) Benyellou / Bouda 16.01.2008
Tgaza Konta / Regan 14.01.2008
Baouarif Benyellou / Bouda 16.01.2008
Timliha Zt.Manssour / Bouda 13.01.2008
Ghars I.N.R.A d’Adrar 15.01.2008
Tinasser Zt.Manssour / Bouda 13.01.2008
Deglet nour I.N.R.A d’Adrar 15.01.2008
Takarbuchet I.N.R.A d’Adrar 15.01.2008
Aghares I.N.R.A d’Adrar 15.01.2008
Deglet mahmoud Benyellou / Bouda 16.01.2008
Deglet bouda Benyellou / Bouda 16.01.2008
Aharthan Zt.Manssour / Bouda 13.01.2008
Doukar (pied mâle) I.N.R.A d’Adrar 15.01.2008
Chapitre -IV- MATERIEL ET METHODES
31
Tableau 4 : Caractéristiques géographiques et bioclimatiques des sites de prélèvement.
Stations Etage
bioclimatique
Altitude
(m)
Latitude
nord
Longitude
ouest
Pluviométrie
(mm/an)
Adrar Aride 263 27°53’ 0°17’ 13
Misserghin Semi-aride 78 35°36’ 1°15’ 300
Oran Semi-aride 90 35°37’ 0°37’ 300
Figure 12: Prélèvement de pennes de palme de palmier dattier (Phoenix dactylifera L.)
1.1.2. Autres Arecaceae:
Les folioles de deux autres Arecaceae ont été prélevées dans la wilaya d'Oran en
Décembre 2007. Il s'agit de Ph nix canariensis L. (prélevé à l'université d’Oran – Es
Senia) et de Chamaerops humilis L. (prélevé à Misserghine), dont les caractéristiques
géographiques et bioclimatiques sont résumées dans le tableau 5.
1.2. Séchage et broyage :
Les folioles sont nettoyées avec de l’alcool afin d’éliminer toute trace de
cochenille (Figure 13) et séchées à l’étuve à 45°C pendant 48 heures. Le matériel séché
est coupé finement (Figure 14a) et broyé à l'aide d'un broyeur à billes (Figure 14b).
Chapitre -IV- MATERIEL ET METHODES
32
La poudre végétale de chaque échantillon est conservée dans des flacons à
l'obscurité jusqu'à utilisation.
Figure 13: Nettoyage des folioles de Phoenix dactylifera L., Phoenix canariensis L.
et Chamaerops humilis L.
1.3. Extraction:
1.3.1. Extraction sous reflux :
Pour chaque échantillon, on introduit 100 ml d’eau distillée (solvant d'extraction) et
10 g de poudre végétale dans un ballon de 500 ml. L'ensemble est porté à ébullition douce
sous reflux pendant 30 mn par extraction (Figure 15). Chaque échantillon a subi trois
Figure 14a: Broyage des pennes de
dattier (Phoenix dactylifera L.)
Figure 14b: Broyeur à billes
Chapitre -IV- MATERIEL ET METHODES
33
extractions successives ce qui permet d'extraire le maximum de composés chimiques les
plus polaires.
Les trois extraits obtenus sont filtrés à l’aide du filtre de papier plissé, réunis,
répartis dans des ballons rodés avant d’être congelés et lyophilisés à l’aide d’un
lyophilisateur (Virtis) (Figure 16) afin de pouvoir garder les extraits à l’état sec et
empêcher une altération des métabolites de la plante.
Figure 15: Extracteur sous reflux
Figure 16 : Lyophilisateur Virtis
Statif
Réfrigérant
Chauffe ballon
Ballon d’extraction
Vanne du vide
Ballon rodé
Echantilloncongelé
Chapitre -IV- MATERIEL ET METHODES
34
1.3.2. Extraction solide-liquide :
Cette méthode consiste à extraire les constituants d’un solide par simple contact
avec différents solvants organiques de polarités croissantes à l’aide d’un extracteur du
type Soxhlet (Figure17).
Dix grammes de poudre végétale sont déposés dans la cartouche du Soxhlet. Le
ballon est rempli dans un premier temps de 150 ml d'hexane, solvant apolaire qui élimine
les lipides. Dans un deuxième temps, on ajoute 150 ml de méthanol, solvant très polaire
pour récupérer les métabolites polaires
Les extraits hexanique et méthanolique obtenus sont concentrés séparément à l'aide
évaporateur rotatif.
2.Analyses phytochimiques :
L’identification des phytoconstituants des extraits végétaux se fait par
chromatographie sur couche mince (CCM), technique simple et rapide qui permet de
mettre en évidence les différentes familles de métabolites secondaires recherchées.
2.1. Screening phytochimique par CCM :
2.1.1. Principe de la CCM :
La chromatographie sur couche mince (CCM) met en jeu des phénomènes physico-
chimiques, basés sur le pouvoir d’adsorption. Elle correspond à une phase mobile (éluant),
Figure 17: Extracteur de type Soxhlet
Chapitre -IV- MATERIEL ET METHODES
35
formée par un/ou un mélange de solvants et une phase stationnaire étalée sur une couche de
verre ou d’aluminium et sur laquelle est déposée une goutte de la substance à analyser.
La vitesse de progression de chacun des constituants du mélange entraîné par le
solvant (par capillarité le long de la plaque) n’est pas la même. Par conséquent, il se forme
des spots révélés au moyen de l’UV ou de réactifs colorés.
Chaque composé est défini par son Rf (facteur de rétention), qui correspond à sa
migration relative par rapport au solvant : Rf = D1/ D2
D1 : Distance parcourue par le soluté
D2 : Distance parcourue par le front de solvant
2.1.2. Protocole expérimental :
Chaque échantillon est déposé sous forme de tiret à l'aide d'une pipette Pasteur sur
une plaque couverte de gel de silice 60F254 (Merck), l’intervalle entre les dépôts est de
1cm, à partir d’une distance de 1,5 cm du bord inférieur de la plaque. Chaque dépôt est
séché à l’aide d’un sèche cheveux.
La plaque est ensuite immergée dans un système de migration approprié. La
migration est arrêtée quand le front du solvant atteint 0,5 cm du bord supérieur de la
plaque. Celle-ci est alors retirée et séchée au sèche-cheveux, examinée sous UV à 254 et
365 nm puis révélée par un révélateur spécifique. Les systèmes d’élution utilisés sont
représentés dans le tableau 5.
L’identification des acides phénoliques a été réalisée en utilisant des témoins tels
que: acide caféique - acide sinapique - acide férulique - acide cinnamique.
2.1.3. Réactifs de révélation chimique sur CCM:
L’utilisation de réactifs chimiques en solution, vaporisés sur les CCM, permettent
de compléter les observations faites visuellement sous les lampes UV à 254 nm
(Quenching (extinction de la fluorescence)) et 365 nm (fluorescence propre). En effet, un
choix adapté de réactifs permet non seulement de mettre en évidence des constituants ou
classes de constituants présents dans un extrait (criblage général), mais offre en plus une
méthode simple et rapide pour localiser un composé particulier dans un mélange (extrait,
fraction enrichie, etc.) (Tableau 6).
Les différents réactifs chimiques pour CCM utilisés dans ce travail sont présentés
en annexes.
Chapitre -IV- MATERIEL ET METHODES
36
Tableau 5 : Systèmes d’élution pour la CCM (Wagner et Bladt, 1996).
Phytoconstituants Système d’élution
Acides phénoliques libres AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100 : 11 : 11 : 26).
Séparation sous UV (365 nm )
Coumarines AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100 : 11 : 11 : 26)
Dérivés anthracéniques,
anthrones et anthranolsAcOEt- MeOH- H2O (100 :13.5 :10)
Flavonoïdes AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100 :11:11:26)
Glycosides cardiotoniques AcOEt- MeOH- H2O (100 :13.5 :10)
Quinones AcOEt-MeOH-H2O (100 :17 :13)
Lignanes CHCl3-MeOH-H2O (70 : 30 : 4)
Saponines CHCl3-MeOH-H2O (64 :40 :8)
Sesquiterpènes lactones AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100 :11:11:26)
Triterpènes AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100 :11:11:26)
Chapitre -IV- MATERIEL ET METHODES
37
Tableau 6: Résultats des observations des plaques de CCM avant et après révélation par des colorations spécifiques pour chaque
phytoconstituant d'après Wagner et Bladt (1996).
Avant révélation Après révélationPhytoconstituants Révélateurs
Quenching à 254 nm Fluorescence à 365 nm Couleurs au visible Fluorescence à 365 nm
Acides phénoliques
libres*Folin-Ciocalteu et NH4 + Bleue Bleu-noir Variable selon les composés
Anthrones et anthranols KOH + Jaune ou rouge-brunâtre - Jaune
Coumarines
(gel de silice)KOH +
Bleue intense ou bleue- verdâtre (coumarines
simples), jaune, brune, bleue ou bleue-verdâtre
(furano- et pyranocoumarines)
- Intensification de la fluorescence
Coumarines (gel de
cellulose)- Coloration en UV = hydroxycoumarines - -
Dérivés anthracéniques KOH + Jaune ou rouge-brunâtre Rouge Rouge
Flavonoïdes Neu + + - Rouge, orange, jaune, jaune-orange, jaune- verdâtre, violette
Glycosides
cardiotoniquesSbCl3 + - Vert, violet, brun Blanche, orange, jaune, jaune- verdâtre, verte, bleue, brune
LignanesVanilline-Ac
Phosphorique+ - Bleu-rougeâtre Violette, violette-rougeâtre, bleue-violette
Lignanes Vanilline-H2SO4 + - Violet-rougeâtre Rouge
Lignanes SbCl3 + - - Jaune, bleue
Quinones libres KOH + - Rouge -
Saponines Komarowsky + - Brune-grisâtre -
Sesquiterpènes lactones Zimmermann + - Brun-grisâtre -
Triterpènes Anisaldéhyde + - Violet, bleu-violette -
- : absence ; + : présence.*Fry, 1988
Chapitre -IV- MATERIEL ET METHODES
38
2.1.4. Hydrolyse acide :
L’hydrolyse acide est réalisée sur quelques mg de poudre végétal de palmier dattier, à
l’aide de HCl (2N)-MeOH (1 :1) dans des tubes en verre scellés. Ils sont mis dans une
étuve à 100°C pendant 1h. Après refroidissement, la génine est ensuite séparée de la
fraction osidique par une extraction liquide-liquide contre du dichlorométhane (CH2Cl2).
La phase organique résultante est ensuite évaporée à sec puis reprise par quelques
millilitres de méthanol. Les génines libérées, entraînées par le dichlorométhane, sont
ensuite identifiées par CCM. La phase aqueuse contenant les composés polaires, en
l’occurrence, les monosaccharides, neutralisée par évaporations successives (3 fois) en
présence de méthanol, servira à l’analyse des sucres.
2.1.4.1. Identification des aglycones :
Les génines obtenues sont identifiées par CCM (sur silice 60 F254)
comparativement à des témoins de référence dans les solvants : toluène-AcOEt-HCOOH
(50 :40 :10) et révélées par le réactif de NEU (2-aminoéthyl-diphénylborate) suivi d’un
chauffage. Les témoins d’aglycones utilisés sont: la quercétine, l’isorhamnétine, flavone,
flavanol, Kampférol.
2.1.4.2. Identification des glucides :
L’identification des sucres obtenus par l’hydrolyse est réalisée par CCM
comparative sur silice normale dans le système de solvant CHCl3-MeOH-H2O (64 :40 :8)
puis révélé par pulvérisation d’une solution de DPAP (acide
diphénylaminophosphorique) suivi d’un chauffage. La CCM est réalisée en présence de
neuf monosaccharides témoins : mélibiose, acide glucuronique, glucose, galactose,
rhamnose, xylose, arabinose, fucose, acide galacturonique.
2.1.5. Mise en évidence des tanins :
Dans un tube à essai, 5 ml d’extrait aqueux à 2 % est ajouté à 1 ml de solution
aqueuse de FeCl3 à 1 %. L’ajout de FeCl3 1 % permet de détecter la présence ou non de
tanins. La couleur vire au bleu noir en présence de tanins galliques et au brun verdâtre en
présence de tanins catéchiques (Rizk, 1982).
Chapitre -IV- MATERIEL ET METHODES
39
2.2. Dosage des polyphénols totaux :
Le dosage des polyphénols totaux se fait selon la méthode de Folin-Ciocalteu.
2.2.1. Principe:
Le réactif est constitué par un mélange d’acide phosphotungstique et d’acide
phosphomolybdique. Il est réduit lors de l’oxydation des phénols en un mélange d’oxydes
bleus de tungstène et de molybdène (Ribéreau-Gayon, 1968). La coloration produite,
dont l’absorption maximum est à 765 nm est proportionnelle à la quantité de polyphénols
présents dans les extraits végétaux.
2.2.2. Protocole du dosage :
Dans des tubes à hémolyse, on met 100 l d'extrait aqueux (dissous dans du
méthanol à une concentration de 2 mg/ml) et 500 l de Folin-Ciocalteu dilué au 1/10
dans eau distillée) sont mélangés. Après agitation, le mélange est laissé 5 mn à l'obscurité
et à température ambiante. On ajoute 1500 l de carbonate de sodium Na2CO3 (à 2%
dans eau distillée), on agite et on laisse une heure à température ambiante et à l'obscurité.
La couleur jaune du réactif vire au bleu. La lecture de l'absorbance se fait au
spectrophotomètre UV-Visible (Figure 18) (8500 P Double-BEAM spectrophotometer) à
765 nm en utilisant des cuves en plastiques jetables (LP ITALIANA SPA, Italy, volume
2ml).
Figure 18: Spectrophotomètre UV-Visible
(8500 P Double-BEAM spectrophotometer)
Chapitre -IV- MATERIEL ET METHODES
40
La quantification des polyphénols a été faite au moyen d'une courbe d'étalonnage
établie à l'aide de différentes concentrations (4,70- 9,40- 14- 19 et 24 µg /ml d'acide
gallique (Fluka) (solution mère à 1mg/ml). Cette courbe est réalisée dans les mêmes
conditions opératoires que les extraits.
Le blanc est aussi préparé dans les mêmes conditions en remplaçant la quantité de
l’extrait méthanolique par le méthanol.
Chaque mesure est effectuée en trois répétitions en employant des cuves en
plastiques jetables (volume 2ml). La valeur finale de chaque dosage correspond à la
moyenne des trois répétitions.
La courbe de tendance obtenue (déterminée à l’aide de Excel 2003)
La quantité des polyphénols totaux est exprimée en mg d’équivalents d’acide
gallique par gramme d’extrait lyophilisé.
2.3. Dosage des flavonoïdes :
L’analyse quantitative des flavonoïdes est réalisée par le dosage
spectrophotométrique selon la méthode décrite par Kim et al ., (2003).
Dans les tubes à hémolyse, on mélange 500 µl d'extrait aqueux (dissout dans du
méthanol à une concentration de 2 mg/ml) à 1500 µl d'eau distillée. A ce mélange, on
ajoute 150 µl d'une solution de NaNO2 à 5% (dissout dans eau distillée). Après 5mn de
réaction, on rajoute 150 µl d'une solution de AlCl3 à 10% (dissout dans eau distillée) et
à la onzième minute, on ajoute 500 µl de NaOH 1M. L'ensemble de ce mélange est
agité au vortex.
La lecture de la densité optique à 510 nm permet de déterminer la concentration des
flavonoïdes en se référant à une courbe d’étalonnage faite à partir d’une série de
solutions étalons de catéchine (Fluka) ayant les concentrations suivantes 5µg/ml,
10µg/ml, 15µg/ml et 20µg/ml.
Le blanc est préparé en remplaçant la quantité de l’extrait méthanolique par du
méthanol seul et dans les mêmes conditions.
Les densités optiques sont lues au spectrophotomètre UV-Visible (8500 P Double-
BEAM spectrophotometer) à 510 nm en utilisant des cuves en plastiques jetables (LP
ITALIANA SPA, Italy, volume 2ml).
Les résultats sont exprimés en mg d'équivalents de catéchine par gramme d'extrait
lyophilisé.
Chapitre -IV- MATERIEL ET METHODES
41
3. Activité antioxydante ;
Le test de l'activité antioxydante peut être effectué par bioautographie sur plaque
CCM (test qualitatif) ou par dosage spectrophotométrique (test quantitatif).
3.1. Bioautographie :
La mise en évidence de l'activité antioxydante par bioautographique peut se faire
par réduction de radical libre DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl).
3.1.1. Principe:
Le DPPH (2 ,2 -diphenyl-1-picrylhydrazil) figure est un radical stable, soluble
dans du méthanol ou éthanol qui présente une absorption caractéristique à 517 nm qui lui
confère une coloration violette. Cette couleur disparaît lorsque le DPPH est réduit en
diphénylpicrylhydrazine par un capteur de radicaux libres (Figure 19).
La réaction peut être résumée sous la forme de l’équation:
DPPH + (AH)nà DPPH-H + (A)n,
Où (AH)n représente un composé capable de céder un hydrogène au radical DPPH
(violet) pour le transformer en molécule DPPH-H.
Forme libre du DPPH
Forme réduite du DPPH
N N.
O2N
NO 2
O2N
A-H
NHN
O2N
NO 2
O2N
+ A.
Figure 19: Structure chimique du DPPH et sa réaction avec un piégeur de radicaux
(A-H) (Roberto Lo Scalzo, 2008).
Chapitre -IV- MATERIEL ET METHODES
42
3.1.2. Protocole:
Les extraits aqueux lyophilisés sont à 2mg /ml dissous dans le méthanol. Ils sont
déposés à la même concentration de 20 ug/ml sur deux plaques Silicagel 60 F254 sur
feuille d’aluminium (Merck). Ces plaques sont développées dans le système d’élution
approprié : Chloroforme-acide acétique-acide formique-eau distillée (100 :11 : 11 :26).
Après développement et séchage, les plaques sont pulvérisées à l’aide d’une solution de
DPPH à 0.2 % dans le méthanol. Les plaques sont examinées après 30 mn à l’oeil nu. Les
activités antiradicalaires apparaissent sous forme de spots de couleur jaune-blanc sur fond
violet (Cavin, 1999).
3.2. Dosage de l’activité anti-radicalaire du radical stable DPPH :
Cette technique ne concerne que les extraits ayant montré une activité antioxydante
par bioautographie.
Dans des tubes secs, on introduit 50µl de la solution à tester et 1950 µl de la
solution méthanolique de DPPH à 6.10-5 M. Après agitation par un vortex, les tubes sont
placés à l’obscurité à la température ambiante pendant 30 min. Pour chaque
concentration, le test est répété 3 fois. La lecture est effectuée par la mesure de
l’absorbance à 517 nm en utilisant des cuves en plastiques jetables (LP ITALIANA SPA,
Italy, volume 2ml) par un spectrophotomètre UV-Visible (8500 P Double-BEAM
spectrophotometer).
Pour réaliser cette mesure, on utilise trois témoins positifs, un témoin négatif et un
blanc de la réaction qui ne contient pas d’extrait méthanolique mais du méthanol pur.
Le contrôle positif est représenté par trois antioxydants de référence:
Butylhydroxyanisole (BHA), Acide ascorbique et Quercétine
Le contrôle négatif est composé de 1950µl de la solution méthanolique au DPPH
(6.10 -5M) et de 50µl de MeOH.
L’activité d’un antioxydant peut être caractérisée par une grandeur appelée la IC50
(Concentration inhibitrice à 50%) : concentration de l’antioxydant qui permet l’inhibition
de 50% du signal de référence.
La IC50 permet de comparer l’activité de différentes composées antioxydants. Plus
la IC50 est petite, plus l’antioxydant a une activité plus importante.
Pour déterminer la IC50, nous avons calculé dans un premier temps le %
d’inhibition pour différentes concentrations. Ensuite, l’équation du tracé qui correspond
Chapitre -IV- MATERIEL ET METHODES
43
le mieux aux points expérimentaux est déterminée. C’est à partir de cette équation que la
IC50 est calculée.
4. Analyse statistique:
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± erreur standard (Means ±
standard errors (S.E.M)) calculée sur la moyenne de trois expériences pour chaque cas (le
calcul est réalisé à l’aide du logiciel Microsoft Excel 2003).
Les donnés expérimentales sont présentées sous forme d’histogrammes pour les
quantités des flavonoïdes et des polyphénols totaux et pour les IC50 et sous forme de
courbes pour les étalons de l'acide gallique et la catéchine).
Le coefficient de corrélation R2 entre les DO et les concentrations des étalons est
calculé à l’aide du logiciel Microsoft Excel 2003.
Chapitre -V-:
Résultats&
Discussion
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
45
1. Résultats :
1.1. Caractéristiques des cultivars prélevés:
Une enquête sur le terrain a permis de donner quelques indications sur les
cultivars prélevés dans la wilaya d’Adrar. Ces caractéristiques sont axées sur la
résistance ou sensibilité au bayoud (fusariose du palmier dattier), sur la période de
maturation des dattes et la fréquence des cultivars dans la wilaya d’Adrar (Tableau 7).
Tableau 7 : Caractéristiques des cultivars de palmier dattier d’Adrar.
1.2. Screening phytochimique des extraits aqueux:
La mise en évidence des différents métabolites secondaires des extraits aqueux des
cultivars de P. dactylifera L. et des extraits aqueux de P. canariensis L. et de
Chamaerops humilis L. a permis d’obtenir les résultats suivants :
Cultivars
Dattes
moles (M)
ou dures (D)
Résistance (R)
Tolérante (T)
Sensible (S)
Précocité (P)
ou Tardif (T)
Endémique
ou introduite
à la région
Fréquente (F)
ou Rare (R)
Baouadhim M S T Juillet E R
Timjuhert M T T Juillet I R
Bamakhlouf M S P juin E R
Warglia M S P juin I R
Tinakour D S T octobre E R
Adoukli M S T Juillet E R
Aghamou D S T septembre E F
Tgaza M S P juin E F
Baouarif M T T juillet E R
Timliha M S T juillet E F
Ghars M S T juillet I R
Tinasser D T T août E F
Deglet nour M S T septembre I R
Takarbuchet M R T octobre E F
Aghares D R T septembre E R
Doukar
(pied mâle)
Aucune
sélection/ Echelonné / /
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
46
1.2.1. Polyphénols :
1.2.1.1. Les acides phénoliques :
Après pulvérisation des chromatogrammes avec le réactif de Folin-Ciocalteu, une
tache bleue- noire apparaît immédiatement. Le Rf (0,56) de cette tache ne correspond pas
aux Rf des témoins utilisés, acide caféique, acide cinnamique, acide férulique, acide
sinapique. Il s'agit probablement d'un autre acide phénolique (Tableau 8).
1.2.1.2. Flavonoïdes:
- Extraits aqueux:
Après CCM et observation sous UV à 365 nm (Figure 20a, 20b) et révélation par
le réactif de Neu (Figure 21a, 21b)., les différents extraits testés présentent des
constituants de fluorescences diverses, ce qui indique la présence de plusieurs types de
flavonoides
Les substances colorées en jaune sont probablement des flavonoïdes à base de
rutine. Les constituants qui donnent une couleur jaune orange sont des flavonols et ceux
présentant une fluorescence jaune verte, des flavonols à base de Kaemphérol. La
fluorescence orange est due à des flavones à base de lutéoline et ses glycosides (Wagner
et Bladt, 1996). L’intensité de coloration des produits séparés est proportionnelle à leur
concentration.
Les résultats de la séparation des flavonoïdes sont regroupés dans le tableau 8.
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
47
Figure 20a: Chromatogramme observée à 365nm sous UV avant la révélation
des extraits aqueux des trois Arecaceae étudiées.Système de migration utilisé: AcoEt-HcooH-AcOH-H2O (100 :11 :11 :26).
Bm : Baouadhim; Tj : Timjuhert; Bk : Bamakhlouf; Wg : Warglia; Tn : Tinakour; Ad : Adoukli; Ag : Aghamou ;
Agb : Aghamou(Bayoud); Tg : Tgaza; Br : Baouarif; Pc : Phoenix canariensis L.; Ch : Chamaerops humilis L.
Figure 20b: Chromatogramme observée à 365nm sous UV avant la révélation
des extraits aqueux des trois Arecaceae étudiées.Système utilisé: AcoEt-HcooH-AcOH-H2O (100 :11 :11 :26)
Th : Timliha; Gh : Ghars; Tc : Tinaceur; Dn : Deglet nour; Tk : Takarbuchet; Dk : Doukara; As :Aghares ;
Dm: Deglet mahmoud; Db: Deglet bouda; Ah : Aharthan; Pc: Phoenix canariensis L.; Ch: Chamaerops humilis L.
Bm Tj Bk Wg Tn Ad Ag Agb Tg Br Pc Ch
Th Gh Tc Dn Tk Dk As Dm Db Ah Pc Ch
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
48
Figure 21b: Flavonoides observées à 365nm après révélélation au Neu
des extraits aqueux des trois Arecaceae étudiées.Système utilisé AcOEt-HcooH-AcOH-H2O (100 :11 :11 :26)
Th : Timliha; Gh : Ghars; Tc : Tinaceur; Dn : Deglet nour; Tk : Takarbuchet; Dk : Doukara; As :Aghares ;
Dm: Deglet mahmoud; Db: Deglet bouda; Ah: Aharthan; Pc: Phoenix canariensis L.; Ch: Chamaerops humilis L.
Figure 21a: Flavonoides observées à 365nm après révélélation au Neu
des extraits aqueux des trois Arecaceae étudiées.Système utilisé AcOEt-HcooH-AcOH-H2O (100 :11 :11 :26)
Bm: Baouadhim; Tj: Timjuhert; Bk: Bamakhlouf; Wg: Warglia; Tn: Tinakour; Ad: Adoukli; Ag: Aghamou ;
Agb : Aghamou(Bayoud); Tg : Tgaza; Br : Baouarif; Pc : Phoenix canariensis L.; Ch : Chamaerops humilis L.
Bm Tj Bk Wg Tn Ad Ag Agb Tg Br Pc Ch
Th Gh Tc Dn Tk Dk As Dm Db Ah Pc Ch
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
49
- Extraits méthanoliques : Résultats du partage solide-liquide sur les extraits de palmier
dattier.
La comparaison des chromatogrammes des flavonoides sur les extraits aqueux et
des extraits méthanolique et hexanique (Figure 22) montre que:
- les extraits hexaniques ne possèdent pas de flavonoides. En effet, l’hexane solvant
apolaire élimine les lipides.
-les extraits méthanoliques semblent contenir une concentration plus élevée en
flavonoides , une plus forte fluorescence est obtenue pour certaines substances.
-le cultivar Aghamou sain et bayoudé montrent des différences qualitatives. L’extrait
méthanolique du cultivar Aghamou bayoudé ne possède pas la fluorescence jaune
orangée.
- le cultivar Deglet nour (sensible au bayoud) semble posséder plus de substances
fluorescentes jaunes que le cultivar Takerboucht (résistant au bayoud).
L'ensemble des ces remarques sont à prendre avec précaution car l'observation n'a
été faite que sur un individu par cultivar.
Figure 22: Flavonoides observés à 365nm sous UV des extraits aqueux
des Arecaceae étudiées.Système utilisé AcOEt-HcooH-AcOH-H2O (100 :11 :11 :26) et révélés par le Neu
Ag : Aghamou ; Agb : Aghamou bayoudé; Tk : Takarbouchet; Dn : Deglet nour.
Ag Ag Agb Agb Ag Ag Agb Agb Tk Tk Dn DnMeOH Hexane MeOH Hexane MeOH Hexane MeOH Hexane
Extrait aqueux
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
50
Tableau 8: Tableau récapitulatif de l’analyse qualitative des extraits aqueux des Arecaceae étudiées.
Q : Quenching ; FB : Fluorescence Bleu ; FJV : Fluorescence Jaune Vert ; FJO : Fluorescence Jaune Orange ; ( ) : Rf
Fluorescence
Avant révélation Après révélationcultivars
Nombre de
constituant
trouvés A 254 nm A 365 nm A 365 nm
Nature probable
des phytoconstituants
Baouadhim 6 Q (0.35) ; Q (0.45) ; Q (0.73)FB (0.56)
FJO (0.35); FJO(0.45); FJV(0.50); FJO(0.73); FJV(0.91) ;
FB (0.56)
Flavonoides-
acides phénoliques
Timjuhert / / / / /
Bamakhlouf / / / / /
Adoukli / / / / /
Aghamou / / / / /
Aghamou (Bayoud) / / / / /
Tgaza / / / / /
Aharthan / / / / /
Timliha / / / / /
Ghars / / / / /
Tinakour / / / / /
Deglet nour / / / / /
Takarbuchet / / / / /
Aghares / / / / /
Deglet mahmoud / / / / /
Deglet bouda / / / / /
Tinaceur 7 /FB (0.62)
FB (0.56)
FJO(0.35); FJO(0.45); FJV(0.50); FB (0.62) ; FJO(0.73); FJV(0.91) ;
FB (0.56)/
Baouarif 7 /FB (0.97)
FB (0.56)
FJO (0.35); FJO(0.45); FJV(0.50); FJO(0.73); FJV(0.91); FB (0.97) ;
FB (0.56)/
Warglia 7 /FB (0.97)
FB (0.56)
FJO(0.35); FJO(0.45); FJV(0.50); FJO(0.73); FJV(0.91); FB (0.97) ;
FB (0.56)/
Doukar (pied mâle) / / / / /
Phoenix canariensis 7 /FB (0.97)
FB (0.56)
FJO(0.35); FJO(0.45); FJV(0.50); FJO(0.73); FJV(0.91); FB (0.97) ;
FB (0.56)/
Chamaerops humilis 6 Q (0.73)FB (0.62)
FB (0.56)
FB(0.05); FJV(0.21); FJV(0.41); FB(0.62); FJO(0.73) ;
FB (0.56)/
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
51
1.2.1.3. Hydrolyse acide :
1.2.1.3.1. Identification des génines :
Après observation des trois hydrolysats, sous UV à 254 nm et à 365 nm avant et
après révélation, on constate que (Figure 23) :
Ø Les hydrolysats de Bamakhlouf, Chamaerops humilis et Phoenix canariensis
présentent une bande de même RF (0.52) correspondant à la quercétine.
Ø L’extrait Bamakhlouf présente une bande de plus de même RF (0.613) que
l’isorhamnétine.
Figure 23: Chromatogramme des aglycones des flavonoides observés à 365nm sous UV
des extraits aqueux des trois Arecaceae étudiées.Système utilisé Toluène-AcOEt-HCOOH (50 :40 :10) et révélés par Neu
Pc : Phoenix canariensis L., Ch : Chamaerops humilis L.; Bk : Bamakhlouf; Irh : Isorhamnétine;
Kam : Kaempférol; Qrc : Quercétine ; Flal : Flavanol; Flan : Flavone.
1.2.1.3.2. Identification des glucides :
Cette hydrolyse acide a permis de détecter une tache ayant le même Rf
(0.375) que le monosaccharide galactose dans les trois extraits (Bamakhlouf,
Chamaerops humilis L. et Phoenix canariensis L.) (Figure 24).
Pc Ch Bk Irh Kam Qrc Flal Flan
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
52
Figure 24: Sucres observés après révélation au DPAP des extraits aqueux
des trois Arecaceae étudiées.Système utilisé CHCl3- MeOH- H2O (64 :40 :8)
Bk: Bamakhlouf; Ch: Chamaerops humilis L.; Pc: Phoenix canariensis L.; Gal: Galactose; Glu: Glucose; A.glu: Acide
glucuronique; Mel: Melibiose; Rha: Rhamnose; Xyl: Xylose; Ara: Arabinose; Fuc: Fucose; Ac.gal: Acide galacturonique.
1.2.1.4. Mise en évidence des tanins :
Le résultat a été positif sur l’ensemble des extraits aqueux, car la réaction au
chlorure ferrique donne un précipité bleu–noir (Figure 25) caractéristique des tanins.
Cependant l’intensité de la coloration est variable, elle est claire chez Chamoerops
humilis L.
+ FeCl3
Figure 25: Mise en évidence des tanins par réaction en tube
des extraits aqueux des Arecaceae étudiées.
Bk Ch Pc Gal Glu Ac.glu Mel Rha Xyl Ara Fuc Ac.gal
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
53
y = 82,222x - 0,0294R2 = 0,9994
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03
concentration de l'acide gallique (mg/mL)
Abso
rban
ce à
765
nm
1.2.2. Autres métabolites secondaires:
Les réactions de mise évidence par CCM des quinones, des anthraquinones, des
coumarines, des lignanes, des dérivés anthracéniques, des sesquiterpènes lactones, des
saponines et des glycosides cardiotoniques dans les différents aqueux des Arecaceae
étudiées ont été négatives. En effet, aucune coloration ou fluorescence n’est apparue
après pulvérisation des révélateurs spécifiques correspondants aux métabolites
recherchés. Deux éventualités, soit ils sont absents, soit leurs faibles teneurs ne
permettent pas de les détecter avec les techniques utilisées.
1.3. Analyse quantitative :
1.3.1. Dosage des polyphénols totaux :
Les teneurs des polyphénols totaux des différents extraits ont été obtenues à partir
d’une courbe d’étalonnage établie avec des concentrations croissantes en acide gallique
(Figure 26). Elles sont exprimées en mg d’équivalents d’acide gallique par gramme de
l’extrait lyophilisé.
Figure 26: Courbe d’étalonnage des polyphénols totaux réalisée à l’aide
de l’acide gallique.
Les résultats sont regroupés dans le tableau 9. Il montre que les cultivars Ghars,
Deglet bouda, Aharthan, Adoukli, Baouarif, Aghamou et Aghares, ainsi que le pied
mâle ou Doukar (pied mâle) sont les plus riches en polyphénols totaux (>100mg/g).
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
54
Les autres cultivars Bamakhlouf Takarbuchet, Baouadhim, Warglia, Timjuhert,
Timliha, Tgaza, Tinakour, Tinasser, Deglet mahmoud, Deglet nour, Aghamou (Bayoudé)
ont des valeurs inférieures à 100 mg/ml de même que Phoenix canariensis L. Par contre
Chamaerops humilis L. est beaucoup moins riche en polyphénols. Ces résultats sont
représentés par la figure 27.
Tableau 9: Analyse quantitative des polyphénols de l’extrait aqueux des Arecaceae
étudiées.
Extraits aqueuxPolyphénols
(mg/g ± E.S)
Ghars 170,79 ± 2,393
Deglet bouda 143,121± 2,609
Aharthan 142,908 ± 10,329
Adoukli 135,162 ± 1,888
Baouarif 123,412 ± 4,491
Aghamou 120,007 ± 2,037
Aghares 104,682 ± 4,023
Takarbuchet 98,553 ± 3,498
Bamakhlouf 95,530 ± 4,413
Baouadhim 87,953 ± 1,852
Warglia 82,377 ± 4,413
Timliha 79,738 ± 4,187
Timjuhert 79,738 ± 3,003
Tgaza 79,440 ± 1,424
Tinakour 73,778 ± 3,622
Tinaceur 71,820 ± 2,801
Deglet mahmoud 68,968 ± 1,715
Deglet nour 57,943 ± 3,139
Cultivars des palmiers
dattiers
Aghamou bayoudée 47,897 ± 1,407
pied mâle Doukar 122,220 ± 3,945
Phoenix canariensis L. 98,766 ± 0,460Autres Arecaceae
Chamaerops humilis L. 25,209 ± 0,460
E.S : erreur standard.
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
55
y = 0,0454x - 0,11R2 = 0,9999
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 5 10 15 20 25
Concentration de la catéchine (ug/mL)
Abs
orba
nce
à 51
0 nm
-
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Extraits aqueux
Qua
ntité
s de
s po
lyph
énol
sto
taux
(mg/
g)
GharsDeglet boudaAharthanAdoukliBaouarifDoukaraAghamouAgharesPhoenix canariensisTakarbuchetBamakhloufBaouadhimWargliaTimlihaTimjuhertTgazaTinakourTinnaceurDeglet mahmoudDeglet nourAghamou bayoudéeChamaerops humilis
Figure 27: Histogramme représentant la quantité des polyphénols totaux par ordre décroissant,
exprimée en mg/g de poudre lyophilisée des extraits aqueux des trois Arecaceae étudiées.
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 3 répétitions pour chaque concentration.
1.3.2. Dosage des Flavonoïdes:
Les teneurs en flavonoïdes des différents extraits végétaux ont été obtenues à
partir d’une courbe d’étalonnage établie avec des concentrations précises de catéchine
(Figure 28).
Figure 28: Courbe d’étalonnage des flavonoïdes réalisée à l’aide de la catéchine
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
56
Le tableau 10 montre que les cultivars Ghars, Aharthan, Deglet bouda, Adoukli,
Aghamou ont les teneurs les plus importantes en flavonoides, supérieures à 50 mg/g de
poudre lyophilisée. Les autres cultivars de palmier dattier de même que Phoenix
canariensis L. ont des teneurs inférieures à cette valeur. Chamaerops humilis L. a une
teneur plus faible, 17 mg/g de poudre lyophilisée. Ces résultats sont représentés par la
figure 29.
Tableau 10: Analyse quantitative des flavonoïdes des extraits aqueux des Arecaceae
étudiées. E.S : erreur standard
Extraits aqueuxFlavonoïdes
(mg/g ± E.S)
Ghars 69,075 ± 2,688
Aharthan 66,197 ± 3,397
Adoukli 59,413 ± 1,552
Deglet bouda 57,151 ± 2,166
Aghamou 52,423 ± 1,632
Bamakhlouf 48,311 ± 0,356
Baouarif 48,106 ± 2,136
Takarbuchet 45,022 ± 0,000
Aghares 43,789 ± 1,233
Warglia 40,910 ± 1,983
Aghamou bayoudée 38,238 ± 2,224
Tinakour 36,593 ± 0,942
Tinaceur 35,565 ± 0,356
Timliha 29,809 ± 1,552
Baouadhim 28,576 ± 1,884
Tgaza 27,959 ± 1,983
Timjuhert 27,753 ± 1,233
Deglet mahmoud 26,520 ± 1,068
Cultivars des palmiers
dattiers
Deglet nour 24,258 ± 0,712
pied mâle Doukar 53,656 ± 1,850
Phoenix canariensis L. 44,200 ± 0,942Autres Arecaceae
Chamaerops humilis L. 17,269 ± 0,617
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
57
-
10
20
30
40
50
60
70
80
Extraits aqueux
Qua
ntité
s de
s fla
vono
ides
(mg/
g)
GharsAharthanAdoukliDeglet boudaDoukaraAghamouBamakhloufBaouarifTakarbuchetPhoenix canariensisAgharesWargliaAghamou bayoudéeTinakourTinnaceurTimlihaBaouadhimTgazaTimjuhertDeglet mahmoudDeglet nourChamaerops humilis
Figure 29: Histogramme représentant la quantité des flavonoides par ordre décroissant,
exprimée en mg/g de poudre lyophilisée des extraits aqueux des trois Arecaceae étudiées.
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 3 répétitions pour chaque concentration
1.3.3. Dosage du partage solide-liquide:
Les résultats du dosage des teneurs en polyphénols et en flavonoides sur les
différents extraits de palmier dattier obtenus à partir du partage solide-liquide sont notés
dans le tableau 11.
Tableau 11: Dosage des polyphénols et des flavonoïdes des l’extraits obtenus par partage
solide liquide de cultivars de palmiers dattiers.
O
Cultivars Extraits
Polyphénols(mg d'acide
gallique/g d'extrait
lyophilisé)
flavonoïdes
(mg de catéchine / g
d'extrait lyophilisé)
H2O essai 1 123.758 ±2.454 53.506 ±4.878H2O essai 2 120.877 ±2,345 53.908 ±2,512Aghamou
MeOH 143.217 ±2,798 63.161 ±1,844H2O essai 1 44.156 ±2,068 31.782 ±1.844H2O essai 2 43.704 ±2,345 31.379 ±2.090Aghamou
bayoudé MeOH 66.721 ±5.902 34.598 ±1.844Takarbuchet MeOH 109.787 ±2.063 57.529 ±2.512Deglet nour MeOH 66.279 ±5.472 27.356 ±1.844
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
58
On note que la teneur en polyphénols et en flavonoides est plus élevée dans les
extraits méthanoliques que dans les extraits aqueux donc une meilleure solubilisation de
ces constituants dans le méthanol.
Parallèlement, le cultivar Aghamou bayoudé montre une plus faible teneur de ces
deux constituants que le cultivar sain.
Le cultivar Takerbucht (résistant au bayoud) a une plus forte teneur en polyphénols
et en flavonoides que le cultivar sensible Deglet nour.
1.4. Activité anti-radicalaire contre de DPPH par bioautographie :
Les chromatogrammes des différents extraits de palmiers dattiers révélés par une
solution de DPPH, présentent de nombreux constituants qui apparaissent sous forme de
spots de couleur jaune blanc sur fond violet (figure 30a, 30b.), et nous indique la rapidité
de décoloration d'une solution à 0,2 mg, de DPPH, en moins de 30 secondes.
Figure 30a: Screening de l’activité antioxydante par bioautographie
des extraits aqueux des Arecaceae étudiées.Système utilisé: AcOEt-HcooH-AcOH-H2O (100 :11 :11 :26)
Bm : Baouadhim; Tj : Timjuhert; Bk : Bamakhlouf; Wg : Warglia; Tn : Tinakour; Ad : Adoukli; Ag : Aghamou ;
Agb : Aghamou(Bayoud); Tg : Tgaza; Br : Baouarif; Pc : Phoenix canariensis L.
Bm Tj Bk Wg Tn Ad Ag Agb Tg Br Pc
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
59
1.5. Dosage de l’activité antioxydante :
Le radical (DPPH) est utilisé pour déterminer la capacité antioxydante. En
présence d'un antioxydant le (DPPH) est réduit en DPPH-H et son absorbance
spectrophotométrique diminue.
Les examens réalisés à partir de différents extraits caractérisant l’activité
antioxydante des palmiers dattiers ont montré leur haute capacité antiradicalaire.
L'activité antioxydante est exprimée en pourcentage d'inhibition (P.I%) du radical
(DPPH) après 30 minutes d'incubation, en utilisant la formule suivante :
Abs (témoin) – Abs (antioxydant)
P.I % = x 100 (Wang et Mazza, 2002)
Abs (témoin)
Soit :
Abs : Absorbance à la longueur d’onde de 517 nm
La valeur de IC50, déterminée pour chaque extrait est définie comme étant la
concentration de substrat qui cause la perte de 50 % de l’activité de DPPH (Tableau 12).
Figure 30b: Screening de l’activité antioxydante par bioautographie
des extraits aqueux des Arecaceae étudiées.Système utilisé : AcOEt-HcooH-AcOH-H2O (100 :11 :11 :26)
Th : Timliha; Gh : Ghars; Tc : Tinaceur; Dn : Deglet nour; Tk : Takarbuchet; Dk : Doukara; As :Aghares ;
Dm : Deglet mahmoud; Db : Deglet bouda; Ah : Aharthan; Ch : Chamaerops humilis L.
Th Gh Tc Dn Tk Dk As Dm Db Ah Ch
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
60
Tableau 12: Valeurs des IC50 de l’extrait aqueux des Arecaceae étudiées.
E.S : erreur standard
Extraits aqueuxIC50 ± E.S
µg/ml
Ghars 13,155 ± 0,279
Adoukli 16,394 ± 0,071
Aghamou 18,395 ± 0,352
Baouarif 18,739 ± 0,233
Bamakhlouf 23,130 ± 0,750
Aharthan 24,093 ± 0,078
Aghamou bayoudée 24,229 ± 0,151
Deglet bouda 26,610 ± 0,456
Warglia 27,590 ± 0,711
Timliha 28,880 ± 0,386
Timjuhert 29,482 ± 0,560
Baouadhim 31,259 ± 0,553
Tinakour 31,303 ± 0,488
Tgaza 31,970 ± 0,570
Tinnaceur 32,070 ± 0,167
Takerboucht 32,923 ± 0,664
Aghares 35,967 ± 0,405
Deglet nour 67,806 ± 1,203
Cultivars des palmiers
dattiers
Deglet mahmoud 75,460 ± 1,072
pied mâle Doukar 27,126 ± 0,174
Phoenix canariensis L. 45,904 ± 0,638Autres Arecaceae
Chamaerops humilis L. 394,556 ± 3,426
Quercétine 13,525 ± 0,129
Acide ascorbique 14,379 ± 0,058Témoins
BHA 17,907 ± 0,139
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
61
-50
100150200250300350400450
Extraits aqueux
IC50
(ug/
mL)
GharsQercétineAc, AscorbiqueAdoukliBHAAghamouBaouarifBamakhloufAharthanAghamou bayoudéeDeglet boudaDoukaraWargliaTimlihaTimjuhertBaouadhimTinakourTgazaTinaceurTakarbuchetAgharesPhoenix canariensisDeglet nourDeglet mahmoudChamaerops humilis
Les valeurs IC50 de chaque extrait aqueux étudiés sont déterminées graphiquement
à partir des droites représentant les pourcentages d’inhibition en fonction des
concentrations croissantes représentant la moyenne de trois tests séparés. (Figure 31).
Les valeurs d’IC50 des extraits aqueux ont été comparées aux IC50 des substances
de références qui sont la quercétine (13,52 µg/ml), l’acide ascorbique (14,37 µg/ml) et
BHA (17,90 µg/ml) (Tableau 12).
Le cultivar Ghars présente une IC50 de 13,155 µg/ml, cette valeur est inférieur aux
valeurs des trois substances de référence.
Le cultivar Adoukli a une valeur d’IC50 inférieure à la substance de référence : le
BHA. Ces deux cultivars présentent donc une très forte activité antioxydante.
Phoenix canariensis L. semble posséder une activité antioxydante supérieure aux
cultivars Deglet nour et Deglet mahmoud.
Par contre Chamaerops humilis L. possède une très faible activité antioxydante
comme en témoigne le chromatogramme (Figures: 30a, 30b).
Figure 31: Histogramme représentant les IC50 des extraits aqueux
des trois Arecaceae étudiées. Chaque valeur représente la moyenne ± ES
de 3 répétitions pour chaque concentration
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
62
2. Discussion :
Nous avons effectué des études phytochimiques en vue de mettre en évidence les
constituants du métabolisme secondaire des différents extraits aqueux des cultivars
de P. dactylifera L. et des extraits aqueux de P. canariensis L. et de Chamearops humilis
L. ainsi que l’activité antioxydante de ces mêmes extraits.
Un screening phytochimique a été réalisé par CCM et par spectrophotométrique
pour caractériser les cultivars de palmier dattier.
Les résultats de la chromatographie sur couche mince confirment la richesse des
extraits de feuilles de palmiers dattiers en substances polyphénoliques comme les
flavonoïdes et les acides phénoliques déjà identifiés par d’autres auteurs dans des études
précédentes (Ouafi et Bounaga, 2008).
Les chromatogrammes révèlent la présence de 6 bandes communes à tous les
cultivars de P. dactylidera L. et à l'espèce P. canariensis L.
Les bandes en question seraient probablement des flavonoïdes si l’on se réfère à
leur comportement (observation sous UV à 254 et 365 nm) avant et après révélation au
réactif du Neu : avant révélation, quenching à 254 nm et fluorescence à 365 nm ; après
révélation, intensification de la fluorescence à 365 nm. Les fluorescences observées sont
variables : jaune-orange, jaune-verte, bleue (Wagner et Bladt, 1996).
Par recoupement de ces résultats avec ceux de l’hydrolyse acide effectuée sur ces
extraits ainsi que les témoins authentiques utilisés, la nature probable de ces constituants
serait :
- Fluorescence jaune-orange : quercétine ou ses dérivés glycosidiques
- Fluorescence jaune-verte : isorhamnétine ou ses dérivés glycosidiques
- Fluorescence bleue : acides phénoliques
Les résultats obtenus par hydrolyse acide corroborent ceux obtenus par Ouafi et
al., 1988. Ces auteurs révèlent la présence d' aglycones flavoniques (deux flavones et
trois flavonols). L’hydrolyse acide a permis aussi de révéler le monosaccharide
galactose.
Les chromatogrammes révèlent également d’autres bandes particulières à certains
cultivars, notamment :
-une bande de fluorescence bleue avant et après révélation, de Rf 0,62, propre à la
variété Tinnaceur et à coté des autres bandes déjà observées chez les autres cultivars,
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
63
-une bande de fluorescence bleue avant et après révélation, de Rf 0,97, propre aux
variétés Baouarif, Warglia et Phoenix canariensis L. et en plus des autres bandes déjà
observées chez les autres cultivars.
- Chamaerops humilis présente un profil très différent des autres variétés. Six
bandes peuvent être distinguées : 3 de fluorescence bleue (Rf = 0,05- 0,56 et 0,62) ; 2 de
fluorescence jaune-verte (Rf = 0,21 et 0,41) et 1 de fluorescence jaune-orange de faible
intensité (Rf = 0,73). Cette dernière est probablement un dérivé de la quercétine si l’on se
réfère au chromatogramme de l’hydrolysat acide.
Ouafi et Bounaga, 2008 ont montré que l’équipement phénolique des feuilles de
palmier dattier est d’une grande diversité puisque les différentes familles phénoliques
sont représentées. Les flavono des, principaux polyphénols des feuilles sont
essentiellement des combinaisons avec des sucres : hétérosides de la quercétine, de
l’isorhamnétine comme flavonols. De la lutéoline, tricine et chrysoeriol comme flavone,
Quand au niveau des racines, on note l’absence des flavono des. Les dérivés hydroxy
cinnamiques (DHCS) ont été signalés dans les feuilles en tant que composés mineurs (3 à
6 % de la composition phénolique), alors qu’au niveau des racines, ils représentent la
quasi-totalité de l’extrait phénolique.
La composition phénolique soluble de la racine du palmier-dattier est dominée par
la présence de l’acide3- caféoyl shikimique (acide dactyliférique) et ses isomères (Ziouti
et al., 1996). Ces substances sont classiquement considérées comme caractéristiques de la
datte (Maier et al., 1964) , les acides p- coumariques, hydroxybenzoiques, férulique et
sinapique constituent l’essentiel des phénols liés aux différents constituants des parois
cellulaires.
Par ailleurs, les résultats obtenus ont montré que les teneurs en polyphénols et en
flavonoïdes sont plus élevées au sein du cultivar résistant Takerbucht que dans le cultivar
sensible Deglet nour. Cela semble confirmer le rôle attribué aux polyphénols dans la
défense des plantes contre les stress abiotiques. Il est à noter que d'autres cultivars
possèdent des teneurs plus élevées que Takerbucht et pourtant ce sont des cultivars
sensibles tel que le cultivar Ghars.
De plus, ce rôle de défense lié aux polyphénols n'a pas été observé dans la
comparaison des teneurs de ce constituant au sein d'un même cultivar Aghamou sain et
malade.
Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION
64
Les résultats et interprétations précédents sont à prendre avec précaution car le
travail n'a été fait que sur un individu par cultivar. Les seuls éléments de réponse
concernant la phytochimie des trois palmacées (P.dactylifera L., P.canariensis L. et
Chamaerops humilis L.) sont les différences obtenues au sein de ces deux genres..
Le test antioxydant effectué sur plaque CCM par révélation avec une solution de
DPPH présente une traînée où de nombreuses tâches actives montrent l'activité anti-
radicalaire des extraits aqueux de P. dactylifera L. et P.canariensis L. Cette activité peut
être expliquée par la présence des polyphénols dont l'activité antioxydante a été prouvée.
Par contre, Chamaerops humilis L. ne présente qu'une tache à intensité très faible ,donc
une faible activité antioxyante et conséquence d'une faible teneur en polyphénols.
Le dosage de l’activité antioxydante par DPPH montre que certains cultivars de
palmier dattier ont une activité antioxydante équivalente à celle des témoins utilisés tels
que Ghars et Adoukli. Cette forte activité dénote que l’extrait aqueux renferme des
substances réagissantes avec le radical du DPPH, ce qui a été montré dans les tests
phytochimiques effectués sur ces extraits.
L’activité antioxydante a été aussi trouvé dans les dattes de palmier dattier
(Mansouri et al., 2005 ; Allaith. 2008 ; Biglari et al., 2009).
D’après la bibliographie et les enquêtes sur le terrain, le palmier dattier est utilisé
comme plante médicinale (Bellakhdar,1997).En effet, il est utilisé contre les pathologies
oesophago-gastro-intestinaux, du système broncho-pulmonaire, de la sphère bucco-
dentaire, contre les affections oculaires, comme fortifiants, analeptiques et stimulants.
P. canariensis L. est aussi utilisé comme plante médicinale, contre les
pathologies de la peau (Bellakhdar, 1997).
De même que Chamaerops humilis L., il est utilisé contre les pathologies
oesophago-gastro-intestinaux, et il est astringent : ressert les tissus, modère les secrétions,
assèche les écoulements et facilite la cicatrisation. (De Lanessan, 1885)
Nous pensons que l'activité antioxydante résulte de la présence des polyphénols
et des flavonoides qui ont des propriétés médicinales. En effet, plusieurs études ont
rapporté que l’activité antioxydante des plantes qui ont des propriétés thérapeutiques est
due à la présence de substances naturelles principalement des polyphénols (Pokorny et
al., 2001).
Conclusion&
Perspectives
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
66
L'objectif de ce travail est la recherche des marqueurs d'identification à partir de
métabolites secondaires. Notre travail se veut une contribution à l'étude phytochimique
des différents groupes biochimiques du métabolisme secondaire des extraits aqueux de
cultivars de Phoenix dactylifera et des extraits de Phoenix canariensis et de Chamaerops
humilis.
Ø Les résultats montrent l’extrême similitude du profil phytochimique des cultivars,
à l'exception de certains cultivars Baouarif, Warglia, Tinaceur et Phoenix
canariensis L.
Ø Sur le plan quantitatif, on note des différences notables en ce qui concerne la
teneur en polyphénols totaux et en flavonoïdes entre les différents cultivars.
Ø Il est difficile d’établir une corrélation entre le profil phytochimique des cultivars
étudiés et leur statut de résistant ou sensible à la lumière des résultats obtenus.
Ø Cette approche chimiotaxonomique n'a pas permis de trouver des marqueurs
biochimiques qui correspondent d'une façon univoque pour chaque cultivar
Ø L’activité antioxydante des différents extraits est variable et révèle que certains
cultivars sont aussi actifs que les témoins authentiques utilisés. Tel est le cas de
Ghars qui présente l’IC50 la plus faible (et donc l’activité est la plus forte) et
Baouarif dont l’activité est sensiblement similaire à celle du BHA. Ghars est par
ailleurs le cultivar qui renferme également les teneurs en polyphénols totaux et en
flavonoïdes les plus élevées.
Ø Les résultats de ces travaux sont insuffisants et ne nous permettent pas de valider
l'utilisation des deux espèces de Phoenix '(dactylifera et canariensis) en médecine
traditionnelle, bien que tous les extraits aqueux de ces deux espèces ont donné une
activité antioxydante. Il est nécessaire de tester d'autres activités biologiques pour
confirmer les propriétés médicinales de ces deux espèces.
Ce travail n'est pas un aboutissement mais il est à poursuivre en prenant quelques
précautions :
Ø travailler sur plusieurs individus par cultivar.
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
67
Ø prendre des palmiers du même âge, bien que ce facteur est très difficile à prendre
en considération dans des palmeraies.
Ø séparer les pennes d’une palme malade montrant une hémiplégie (pennes vertes et
pennes brunâtres).
Ø caractériser d'autres métabolites secondaires.
Ø poursuivre d'une part l’investigation avec des extraits de polarité différente et
d'autre part mettre l’accent sur les particularités phytochimiques de certains
cultivars.
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Annexes
ANNEXES
76
MODE D’UTILISATION DES REACTIFS CHIMIQUES POUR LAREVELATION DES CCM
Tableau 13: Réactifs chimiques pour la révélation des CCM (Wagner et Bladt, 1996).
Réactifs subst. révélées Mode d’utilisation
Folin
-Cio
calte
u *
Acidesphénoliques
libres
Pulvériser. Attendre 1-2 min et noter les taches. Mettre laplaque dans une cuve contenant un bécher rempli d’unesolution d’ammoniaque concentré jusqu'à ce que le fondjaune se décolore. Noter toute tache apparaissant.Résultats : Taches bleues-noires. Celles forméesimmédiatement possèdent des groupements - ou O-dihydrobenzène ; celles formées après fumigation del’ammoniaque, n’en possèdent pas. Les taches sont stables àl’obscurité.
Dra
gend
orff
Alcaloïdes,composés azotéshétérocycliques
Solution acide d’iodobismuthate de potassium :A : 10 mL d’AcOH glacial + 40 mL d’eau distillée + 0,85 gde nitrate de bismuth basique (chauffer et filtrer sinécessaire) ; B : 20 mL d’eau distillée + 8 g d’iodure depotassium. Mélanger 5 mL de A et 5mL de B avec 20 mLd’AcOH glacial et 100 mL d’eau distillée. Pulvérisation etchauffage (éventuellement) jusqu'à apparition d’une couleurbrun ou orange-brunâtre (visible).
KO
H Anthrones etanthranols
KOH 5-10 % dans l’EtOH. Après pulvérisation et chauffageles anthrones et anthranols apparaissent fluorescents enjaunes sous UV 365 nm.
KO
H
CoumarinesKOH 5-10 % dans l’EtOH, chauffer jusqu'à apparition descouleurs (intensification de la fluorescence).
KO
H Dérivésanthracéniques
KOH 5-10 % dans l’EtOH. Après pulvérisation et chauffageles dérivés anthracéniques apparaissent rouges en visible etfluorescents en rouge sous UV 365 nm.
Neu Flavonoïdes
Mélange (5 : 4 v/v) de 2-aminoéthyldiphényl borinate (2 %m/v dans MéOH) et de PEG 4000 (5 % m/v dans EtOH). Leréactif de Neu met en évidence les flavonoïdes (flavonols,flavones) : les composés ortho-hydroxylés sur le noyau Bapparaissent jaunes-orangés à orangés et lesmonohydroxylés jaunes-verts à jaunes.
SbC
l 3 Glycosidescardiotoniques
Pulvérisation par le chlorure d’antimoine 20 % dans CHCl3ou EtOH. En lumière visible, les glycosides cardiotoniquesapparaissent verts, violets ou bruns ; en UV-365, lesfluorescences sont variables.
ANNEXES
77
Tableau (Suite) :
Réactifs subst. révélées Mode d’utilisation
Van
illin
e A
c-Ph
osph
oriq
ue
Lignanes
A : 1 g de vanilline dans 100 mL Ac phosphorique à 50 %,B : 2 parties Ac phosphorique à 24 % + 8 parties d’Acvanillique à 2 % dans l’EtOH. La plaque est pulvérisée parA ou B. Après chauffage, en lumière visible les lignanesapparaissent en bleus-rougeâtres ; en UV-365, lesfluorescences apparaissent en violettes, violettes-rougeâtres, bleues-violettes.
Van
illin
eH
2SO
4
Lignanes
A : vanilline à 1 % dans l’EtOH, B : H2SO4 à 10 % dansl’EtOH. La plaque est pulvérisée par A ou B. Aprèschauffage, en lumière visible les lignanes apparaissent enViolets-rougeâtres ; en UV-365, la fluorescence apparaisseen rouges.
SbC
l 3
LignanesPulvérisation par le chlorure d’antimoine 20 % dans CHCl3ou EtOH. Après chauffage, en UV-365, les fluorescencesapparaissent jaunes, bleues.
KO
H
Quinones libres KOH 5-10 % dans l’EtOH. Pulvérisation et chaufferjusqu'à l’apparition d’une couleur rougeâtre (visible).
Kom
arow
sky
Saponines
Mélange (5 : 1 v/v) de -hydroxybenzaldéhyde (2 % m/vdans MeOH) et H2SO4 50 % dans l’EtOH. Pulvérisation etchauffage avec le pistolet thermique jusqu'à apparitiond’une couleur brune-grisâtre (visible).
Zim
mer
man
n
Sesquiterpèneslactones
A : 10 g de dinitrobenzène + 90 mL de toluène, B : 6 g deNaOH + 25 mL H2O + 45 mL MéOH. La plaque estd’abord pulvérisée avec A puis par B. Les sesquiterpènesapparaissent colorées en violettes-grisâtres après unchauffage par le pistolet thermique (visible).
Ani
sald
éhyd
e
Triterpènes
Un volume de 0,5 mL d’anisaldéhyde est mélangé dontl’ordre, à 10 mL AcOH glacial, 85 mL MéOH et 5 mLH2SO4. Pulvérisation et chauffage avec le pistoletthermique jusqu'à apparition d’une couleur Violet ou bleu-violette (visible).
* (Fry, 1988)
ANNEXES
78
EXPRESSION DES RESULTATS DES DOSAGES
1. Expression des résultats des polyphénols totaux :
Exemple de Phoenix canariensis présentant une DO de 0.74.
D’après la courbe d’étalonnage on a l’équation suivante :
y = 82.222 x – 0.0294 x = (y + 0.0294) / 82.222 avec y = DO x = (0.74 +0.0294)/ 82.222 = 0.0094 mg/ml
On multiplie cette valeur par 21 qui correspond au facteur de dilution de notre
échantillon ( = 100 µL (volume déposé de l’échantillon) / 2100 µL (volume réactionnel)
= 1/21).
Donc x’= x × 21 = 0.0094 × 21 = 0.1974 mg/ml
La solution mère de Phoenix canariensis est à 2 mg/ml
On a 0.1974 mg/ml 2 10-3 g/mL
x’’ 1g
x’’= 0.1974. 103 / 2
x’ = 98.7 mg
Donc Phoenix canariensis contient 98.7 mg de polyphénols totaux par g de poudre
lyophilisée.
2. Expression des résultats des flavonoïdes:
Exemple de Chamaerops humilis qui présente une DO de 0.17.
D’après la courbe d’étalonnage on a l’équation suivante :
y = 0.0454x – 0.11 x = (y + 0.11) / 0.0454 avec y = DO
x = (0.17 + 0.11) / 0.0454
x = 6.167 µg/ml
On multiplie cette valeur par 5.6 qui correspond au facteur de dilution de notre
échantillon ( = 500 µL (volume déposé de l’échantillon) / 2800 µL (volume réactionnel)
= 1/5.6)
Donc x’= x × 5.6 = 6.167 × 5.6 = 34.54 µg/ml
ANNEXES
79
La solution mère de Chamaerops humilis est à 2 mg/ml
On a 34.54 µg/ml 2 10-3 g/ml
x’’ 1g
x'' = 34,54 10-6 g/ml / 2.10-3
x''= 34,54 10-3 / 2 = 17,27 10 -3 g / ml = 17,27 mg /ml
Donc Chamaerops humilis contient 17.27 mg de flavonoïdes par g de poudrelyophilisée.