approches moléculaires de la diversité microbienne de deux

Approches moleculaires de la diversite microbienne de

deux environnements extremes : les sources

hydrothermales profondes et les reservoirs petroliers

Erwan Corre

To cite this version:

Erwan Corre. Approches moleculaires de la diversite microbienne de deux environnementsextremes : les sources hydrothermales profondes et les reservoirs petroliers. Biologiemoleculaire. Universite de Bretagne Occidentale, 2000. Francais. <tel-01115381>

HAL Id: tel-01115381

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Submitted on 12 Feb 2015

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Avertissement

Au vu de la législation sur les droits d'auteur, ce travail de thèse demeure lapropriété de son auteur, et toute reproduction de cette oeuvre doit faire l'objetd'une autorisation de l'auteur. (cf Loi n°92-597; 1/07/1992. Journal Officiel,2/07/1992)

THESE

présentée pour l'obtention

du grade de Docteurde l'Université de Bretagne Occidentale

(Mention Microbiologie)

Erwan CORRE

Approches moléculaires de la diversitémicrobienne de deux environnements extrêmes :

les sources hydrothermales profondes et lesréservoirs pétroliers

Soutenue le Mercredi 2 Février 2000 devant le jury composé de :

MM. P. CAUMETTE, Professeur, Université de Pau ExaminateurM. MAGOT, Responsable de Laboratoire, Sanofi, Labège RapporteurP. NORMAND, Directeur de Recherche CNRS, Université Lyon I RapporteurB. PICARD, Professeur, Université de Bretagne Occidentale PrésidentD. PRIEUR, Professeur, Université de Bretagne Occidentale ExaminateurA.L. REYSENBACH, Professeur, Université de Portland, USA Examinatrice

Remerciements

Le travail présenté dans ce mémoire a été réalisé avec le soutien financier de la Communauté Urbaine de Brest

Je remercie tout d'abord Daniel Prieur pour m'avoir accueilli dans son équipe de recherche, d'abords en DEA puis en thèse et

de m'avoir fait confiance tout au long de ces années.

Mes remerciements s'adressent tout particulièrement à Christian Jeanthon pour son soutien, sa patience et sa disponibilité.

Je tiens à lui exprimer ici ma reconnaissance pour toutes les discussions enrichissantes, les conseils avisés et les directives salutaires

qu'il a su m'indiquer tout au long de ce travail. Merci profondément pour le temps consacré à la correction des articles.

Je remercie également Anna-Louise Reysenbach pour m'avoir accueilli dans son laboratoire à Rutgers et de m'avoir permis

de travailler sur les échantillons de Vent Cap. Son expérience en biologie moléculaire, ses conseils en phylogénie m'ont été

grandement utiles. Je la remercie également de m'avoir fait partager durant mon séjour à Rutgers sa passion pour les chevaux et

pour le trafic de fromages et de vins français.

Je remercie également les membres du jury : Pierre Caumette, Philippe Normand, Michel Magot et Bertrand Picard d'avoir

accepté de juger mon travail de thèse.

Je tiens à adresser mes plus profonds remerciements à l'ensemble des étudiants avec qui j'ai eu la joie de travailler : Cédric

Hobel (qui a essuyé les plâtres), la brillante Anne Postec, l'inénarrable mais néanmoins charmante Catherine Charpentier et enfin

le précieux Laurent Toffin avec qui j'ai passé une année de travail formidable. Une grande partie des résultats présentés dans ce

manuscrit sont le fruit de leur acharnement et de leur persévérance.

J'adresse un remerciement tout particulier à Tristan Barbeyron pour m'avoir formé aux techniques moléculaires, pour sa

disponibilité et son savoir intemporel sur tout ce qui à trait la biologie moléculaire, la microbiologie, la radioactivité, Serge Lama et

les 24 heures du Mans. Merci également à Hermie Harmsen pour ses conseils avisés à la paillasse comme à l'e-mail.

Je remercie tout particulièrement Olivier Collin, Stéphan Jouannic et Jean Ranc pour les heures qu'ils ont accepté de passer

à lire et corriger ce manuscrit. Spéciale dédicace à Stéphane et Olivier pour leur travail de pionniers dans la jungle des fautes

d'orthographes et les marais fangeux des accords mal à propos.

Je remercie également tous les membres du laboratoire. En particulier Stéphane et Edmond pour leur amitié, les foulées et la

sueur que nous avons partagé (enfin surtout eux) sur de nombreux kilomètres. Jenny pour m'avoir supporté et pour nous être

épaulé mutuellement dans la dernière (longue, très longue) ligne droite. Marc, Patrick, Olivier, Jean-Louis, Laurent, Viggo, Soizick

et Valérie pour avoir survécu dans les bureaux que nous avons partagés. Enfin je remercie les membres de la Station Biologique de

Roscoff pour leur accueil, leurs compétences et la formidable ambiance qu'ils savent entretenir dans leur laboratoire et dans les

couloirs de la station.

Merci à Odile, Claire, Catherine's, Jeff's, Didier, Vincent et Lolo, à la famille Collin à 2 jambes ou 4 pattes pour leur soutient

moral et véliplanchesque ainsi que pour leur accueil tout au long de mon travail.

Merci à l'ensemble de ma famille, à Juliette de m'avoir aiguillé vers la Station Biologique, à mes parents, "beaux"-parents et

grands-parents de leur soutien.

Merci enfin à Anne d'avoir su supporter au quotidien mes sautes d'humeurs, mes absences et d'avoir finalement, plus qu'aucune

autre personne, contribué à ce que je mène à bien ce travail.

ii

Introduction générale

La microbiologie de l'environnement est une discipline jeune, qui a pour vocation d'étudier les

relations qu'entretiennent les micro-organismes avec leur biotope. Si l'adage populaire n'accorde que

peu d'influence à ce qui est invisible à l'oeil et si la présence de micro-organismes est souvent

associée à une nuisance plutôt qu'à un bienfait, le rôle des micro-organismes est pourtant

prépondérant dans le fonctionnement de nombreux écosystèmes naturels et anthropiques. L'étude

des micro-organismes a longtemps été liée à la capacité des microbiologistes à recréer in vitro des

conditions favorables à la croissance des communautés microbiennes. Or, des écosystèmes

complexes, soumis à des contraintes physico-chimiques extrêmes telles que, de fortes températures,

de fortes pressions ou l'absence d'oxygène, ou à des fluctuations de sources de nutriments ou

d'énergie, sont particulièrement difficiles à simuler au laboratoire. Aussi, dans ces écosystèmes

,comme dans d'autres étudiés déjà depuis fort longtemps tels que le sol où l'eau de mer, un grand

nombre de micro-organismes ont échappé à toute méthode de culture. Le développement des

techniques de biologie moléculaire et l'utilisation de la molécule d'ARN ribosomique comme marqueur

évolutif a permis de s'affranchir des étapes de culture et a permis d'asseoir sur des bases

phylogénétiques les relations taxinomiques s'établissant entre les différents organismes vivants.

Le travail présenté dans ce mémoire a pour objet l'étude de la diversité microbienne de deux

écosystèmes considérés comme extrêmes : les sources hydrothermales profondes et les réservoirs

pétroliers. Les techniques mises en oeuvre sont fondées soit sur l'analyse des ARN ribosomiques

(ARNr) sans étape préalable de culture, par séquençage ou hybridation in situ, soit sur le

positionnement phylogénétique de souches isolées de ces environnements.

Avant de présenter les résultats de ce travail sous la forme d'articles en préparation, soumis ou

publiés, je me propose :

- de présenter une revue des techniques d'écologie microbienne classiques et moléculaires

couramment utilisées pour accéder à la diversité des écosystèmes microbiens, de présenter des

moyens d'accéder à la diversité fonctionnelle de ces écosystèmes et d'insister sur les biais inhérents à

chacune de ces techniques,

- d'effectuer un tour d'horizon des différents habitats microbiens qui ont été étudiés ces dernières

années et de présenter pour chacun de ces habitats les apports des techniques moléculaires dans la

description de la diversité et la découverte de nouveaux groupes phylogénétiques,

et enfin

- de présenter et de discuter les différentes techniques que nous avons mises en oeuvre pour étudier

la diversité microbienne d'un écosystème pétrolier continental et d'un site hydrothermal profond.

iii

Abréviations

A : Adénosine

ADN: Acide désoxyribonucléique

ADNc : ADN cloné

ADNr 16S : ADN codant pour la sous unité 16S de l'ARN

ribosomal

ADNr : ADN codant pout l'ARN ribosomal

AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism

APS : Ammonium Persulfate

ARDRA : Amplified rDNA Restriction Analysis.

ARN : Acide ribonucléique

ARNm : ARN messagé

ARNr 16S : sous unité 16S de l'ARN ribosomal

ARNr : ARN ribosomale

ATP : Adénosine tri-phosphate

BrdU : bromodéoxyuridine.

BSA : Bovine Serum Albumin

BSR: Bactéries sulfato-réductrices

C : Cytosine

C.F.B. : Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides

CDGE : Constant Denaturant Gel electrophoresis

CMF : Cytométrie en flux

comm. pers. : communication personelle

CTAB : Hexadecyltrimethyl ammonium bromide

CTC : 5-cyano-2,3-dotolyl tetrazolium chloride

Da : Dalton

DAPI: Acide diamino-pimélique

DGGE : Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

DH : Deshydrogénases

DMSO : Di methyl sulfoxyde

dNTP : deoxynucléotide triphosphate

dsADN : ADN double brin (double strand)

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

EPR : East Pacific Ride

FAME : Fatty acid Methyl Ester

FISH : Fluorescent In Situ Hybridization

G : Guanidine

GES (tampon) : GIT/EDTA/SDS

GIT : Guanosine isothiocyanate

GNS : Bactéries vertes non sulfureuses

HPLC : High Presure Liquid Chromatography

INT : 2 (p-iodo-pheny)-3-(p-nitropheny)-5-phenyl tetrazolium

chloride

IPTG : isopropylthio-ß-D-galactoside

ISRT : In Situ Reverse Transcription

Knuc : distance phylogénétique

Kpb : Kilo paires de bases

LB (milieu liquide ou gélose) : Luria-Bertani

LFRFA : Low Frequency Restriction Fragment Analysis

LMW RNA: ARN de faible poids moléculaire

LPS : Lipopolysaccharides

LUCA : Last Unversal Common Ancestor

MAR : Middle Atlantic Ride

MPN : Most probable number

NPP : Nombre le plus probable

OTU : Operational Taxonomic Unit

p/v : (masse à volume)

pb : paire de base

PCB : PolyChlorinated Biphenyl

PCR : Polymerase Chain Reaction

PFLA : analyse des profils lipidiques

PGFE : Pulsed-Field Gel Electrophoresis

RAPD : Randomly Amplified Polymorphic DNA

RDP : Ribosomal Database Project

RFLP : Restriction Length Fragment Polymorphism

RPM : Rotation par minute

RT-PCR : Reverse Transcriptase-PCR

S : Svedberg

SDS : Sodium dodecyl sulfate

SET (tampon) : Sucrose/EDTA/Tris

ssADN : ADN simple brin (single strand)

T : Thymine

T-RFLP : Terminal Restriction Length Fragment

Polymorphism

TAE (tampon) : Tris/Amonium/EDTA

TBE (tampon) : Tris/Borate/EDTA

Td : Température de dissociation

TE (tampon) : Tris/EDTA

TEMED : N,N,N',N' Tétraméthyléthylènediamine

TGGE : Temperature Gradient Gel Electrophoresis

Tm : Température de fusion

TNE (tampon) : Tris/NaCl/EDTA

UFC : Unité formant colonie

v/v : volume à volume

X-Gal : 5-bromo-4-chloro-3 indolyl-ß-D-galactopyranoside

iv

Sommaire

Remerciements i

Introduction générale ii

Abréviations iii

Sommaire iv

Partie 1 : Les techniques d'écologie microbienne

I Notions d'écologie microbienne 1

II Les méthodes classiques d'écologie microbienne 3

2.1 Les cultures d'enrichissement et l'isolement 3

2.1.1 L'enrichissement 3

2.1.2 L'isolement et la taxinomie 4

2.2 Quantification et mesure d'activité microbienne 7

2.2.1 Quantification 7

2.2.2 Mesure d'activité microbienne 12

2.3 Une vue restreinte de la diversité 14

III Les acides nucléiques en écologie microbienne 15

3.1 Le développement des techniques moléculaires 15

3.1.1 La phylogénie moléculaire 16

3.1.2 L'ARN ribosomique 16

3.1.3 Le choix de l'ARN 16S 17

3.2 L'analyse phylogénétique 18

3.2.1 Les méthodes de phylogénie 18

3.2.2 L'informatique au service de la phylogénie 23

3.3 Les méthodes moléculaires 27

3.3.1 Le clonage et le séquençage des ARNr 27

3.3.2 Les sondes nucléiques 32

3.3.3 La DGGE 34

3.3.4 Les autres techniques 36

3.4 De la diversité phylogénétique à la diversité physiologique 37

3.5 Les biais des techniques moléculaires 39

3.5.1 Echantillonnage et conservation des échantillons 40

3.5.2 Les techniques de PCR 40

3.5.3 Les techniques d'hybridation 42

3.5.4 Les techniques de DGGE 43

3.5.5 Une solution : l'approche pluridisciplinaire 43

Partie 2 : Les habitats microbiens

I Les origines de la vie 45

1.1 Les premières traces de vie 45

v

1.2 Une origine de la vie controversée 46

II. L'atmosphère 49

III. Les habitats terrestres 49

3.1 Les couches superficielles de la lithosphère 49

3.1.1 Description de l'habitat 49

3.1.2 La rhizosphère 50

3.1.3 L'apport des techniques moléculaires 50

3.2 La biosphère souterraine 52

3.2.1 Description de l'habitat 52

3.2.2 Le concept de biosphère souterraine 53

3.2.3 La communauté microbienne souterraine 54

3.2.4 Des profondeurs aux astres 55

3.3 Les réservoirs pétroliers 56

3.3.1. Formation et production du pétrole 56

3.3.2. Composition physico-chimique du biotope 57

3.3.3. La diversité microbienne des puits de pétrole 58

3.3.4 Activité microbienne liée aux hydrocarbures 62

IV. Habitats aquatiques 63

4.1 L'habitat d'eau douce 64

4.2 L'habitat maritime 65

4.2.1 Les micro-organismes marins isolés 65

4.2.2 L'utilisation des techniques moléculaires 65

4.2.3 Les Fosses océaniques 69

4.3 Les zones sédimentaires marines et lacustres 69

4.3.1 Description du biotope 69

4.3.2 Les techniques moléculaires 70

4.4 Les sources hydrothermales océaniques profondes 72

4.4.1 Nature et structure des émissions hydrothermales profondes 73

4.4.2 Faune associée à l'écosystème hydrothermal 76

4.4.3 Les micro-organismes des sources hydrothermales 78

4.5 Les sites hydrothermaux continentaux et côtiers 89

4.5.1 Description des biotopes 89

4.5.2 Les micro-organismes des sites côtiers et continentaux 91

V La flore microbienne liée à l'Homme, aux animaux et à l'activité humaine 97

5.1 L'Homme comme écosystème microbien 97

5.1.1. La flore de la cavité buccale 97

5.1.2. Les micro-organismes du tractus digestif 98

5.1.3 L'apport des techniques moléculaires en microbiologie humaine 99

5.2 La flore microbienne associée aux autres animaux 100

vi

5.3 Les micro-organismes associés aux activités humaines 103

5.3.1 L'extraction de minerai 103

5.3.2. Les boues de stations d'épuration 104

5.3.3 Les autres milieux 105

VI Conclusion et présentation du projet d'étude 106

Partie 3 : Matériels et méthodes

I Echantillonnage et conservation de l'échantillon 109

1.1 Echantillonnage des puits de pétrole 109

1.2 Echantillonnage des sources hydrothermales profondes 109

1.2.1 Echantillons de cheminée 110

1.2.2 Echantillons de fluides 111

1.3 Echantillonnage des sources chaudes terrestres 111

II Analyse de l'ADNr 16S 111

2.1 Extraction d'ADN 111

2.1.1 Extraction de l'ADN sur filtre ou sur culot de centrifugation 112

2.1.2 Extraction de l'ADN chromosomique par la méthode de Sambrook et al. (1989) 112

2.1.3 Méthode d'extraction au micro-ondes 113

2.1.4 Extraction de l'ADN chromosomique par la méthode de Pitcher et al. (1989) 113

2.1.5 Extraction de l'ADN au "Bead-Beater" 113

2.2 Amplification de l'ADNr 16S 114

2.2.1 Réactions d'amplification classiques 114

2.2.2 Techniques d'optimisation de la réaction 114

2.2.3 Choix des amorces d'amplification 115

2.3 Clonage des produits de PCR 116

2.3.1 Utilisation du kit TOPO TA Cloning 116

2.3.2 Transformation des cellules par électroporation 117

2.4 Analyse des clones par RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism 117

2.5 Séquençage 118

2.5.1 Réactions de séquence 118

2.5.2 Amorces de séquençage 118

2.5.3 Migration des réactions de séquences 119

2.6 Analyse des séquences 120

III Hybridation in situ 120

3.1 Construction des sondes 120

3.2 Mise au point des sondes - Test de spécificité 121

3.2.1 Hybridation sur membrane 121

3.2.2 Hybridation sur culture pure 123

3.3 Hybridation in situ 123

3.3.1 L'enrobage des lames d'observation 123

vii

3.3.2 Fixation des cellules 123

3.3.3 Extraction des cellules de l'échantillon 124

3.3.4 Hybridation in situ 124

IV Observation et quantification des cellules 125

Partie 4 : Articles

Article 1 129

Article 2 154

Article 3 174

Article 4 193

Article 5 202

Article 6 206

Conclusion générale 209

Réferences bibliographiques 214

Annexes

Structure secodaire de l'ADNr 16S de E. coli

Arbre phylogénétique des Bacteria et des Archaea

Les techniques d'écologie microbienne


1

La microbiologie est fondée depuis le 19ème siècle sur l'observation et la culture des micro-

organismes. Or on s'est rendu compte que les techniques de mise en culture donnent une image

faussée, puisque obligatoirement sélective, du rôle et de l'importance des micro-organismes dans la

nature. Aussi, aux techniques classiques de microbiologie (techniques de culture, de comptage,

microscopie électronique, utilisation de marqueurs radioactifs) se sont ajoutées des techniques de

biologie moléculaire (analyses du génome, sondes nucléiques, séquençage) qui permettent

dorénavant d'obtenir une image plus précise des relations des micro-organismes avec leur

environnement. Dans ce chapitre je me propose, après un bref rappel de notions d'écologie

microbienne, de présenter les techniques classiquement utilisées en écologie puis, plus

spécifiquement, les techniques fondées sur l'utilisation des acides nucléiques. Une attention

particulière sera portée aux biais inhérents à ces technologies.

I Notions d'écologie microbienne

Définitions

Un écosystème est un ensemble dynamique au sein duquel interagissent à divers degrés des

facteurs biotiques (individu, population, communauté) et abiotiques (facteurs physico-chimiques) (cf.

figure 1.1) (Begon et al., 1996).

IndividuIndividuIndividuIndividuIndividuIndividu

Individu Ecosystème

Effet des facteurs abiotiques (environnement)

Complexité de l'interaction croissante

PopulationPopulationPopulationPopulationPopulation CommunautéCommunautéCommunauté

Guilde

pH, T°, 02, NaCl, Lumière, H20, Nutriments

Figure1.1. Représentation schématique des relations au sein d'un écosystème

Individu : Unité distincte qui évolue séparément des autres, qui se reproduit dans un groupe et a un rôle (une

niche) défini.

Population : Groupe d'individus qui vivent sur une zone définie.

Guilde : Plusieurs populations distinctes réalisant des tâches similaires ou exploitant les mêmes ressources

environnementales dans un but similaire.

Communauté : Assemblage de populations dans un même espace et sur une même période de temps.

Environnement : Se réfère à tout ce qui entoure un organisme vivant. Correspond aussi bien à des facteurs

physiques, chimiques ou biologiques qu'aux forces qui agissent sur l'organisme.


2

Les interactions entre les composants de l'écosystème

La structure d'une communauté microbienne va donc être soumise à des fluctuations

temporelles et spatiales qui vont correspondre à des phases de colonisation de nouveaux milieux ou

de remplacement d'une communauté par une autre plus adaptée (comme c'est le cas dans le tractus

digestif au cours de la croissance d'un individu). Nous savons qu'un grand nombre de facteurs

peuvent modifier la composition de la communauté microbienne : la disponibilité en sources de

carbone, d'énergie et en accepteurs d'électrons, la température, le pH, l'O2, la teneur en eau ou

encore la lumière. Aussi pour survivre et se développer les micro-organismes ont développé des

adaptations structurales et nutritionnelles qui correspondent à différentes stratégies en fonction des

conditions physico-chimiques auxquelles ils sont exposés (par exemple stratégies r et K, cf. tableau

1.1).Tableau 1.1. Comparaison des stratégies r et K d'après Mac Arthur (1962)

stratégies r stratégies K

Ø Taux de reproduction élevé Ø Taux de reproduction faible

Ø La forte teneur en nutriments permet une croissance importante au

détriment de cellules moins bien adaptées

Ø La faible teneur en nutriments limite la croissance de tous

les organismes.

Ø Très forte population microbienne Ø Population plus réduite

Ø Grosses variations de population lorsque la teneur en nutriments

varie

Ø Communauté pérenne et stable

Ø Ex: "Blooms" cyanobactériens dus à un apport de phosphates, ou

"blooms"" de Pseudomonas dus a un apport de sources carbonées

Ø Ex: Spirillum et Vibrio dans l'eau de mer, bactéries dans les

lac oligotrophiques

D'autres part, aux facteurs extérieurs s'ajoutent de fortes interactions qui peuvent se produire au

sein d'une population (coopération ou compétition) ou entre populations (synergie, symbiose et

antagonisme).

L'habitat naturel

L'étendue de l'habitat microbien est à mettre en rapport avec la taille du micro-organisme1. Même

si les cellules seules n'existent pas ou très peu dans la nature (on parle plutôt de micro-colonies) des

micro-environnements de l'ordre du millimètre peuvent être le siège de très fortes variations physico-

chimiques (c'est le cas notamment dans les particules de sol). De plus les cellules colonisent souvent

les surfaces sous la forme d'un biofilm. Cette structure complexe permet aux micro-organismes

d'accéder plus facilement aux nutriments nécessaires à leur croissance et de les stocker.

L'étude des populations microbiennes dans leur environnement devra donc répondre aux

questions de la composition, de la structure et de la fonction de cette population. Pour répondre à ces

questions les premiers microbiologistes disposaient de méthodes fondées sur leur capacité à recréer

le plus fidèlement possible les conditions de croissance in situ . Par la suite, le développement des

techniques moléculaires a permis de s'affranchir partiellement des étapes de mise en culture.

1 Pour une cellule de 3µm une distance de 3 mm correspond à l'équivalent d'une distance de 2 km pour l'homme.


3

II Les méthodes classiques d'écologie microbienne

2.1 Les cultures d'enrichissement et l'isolement

2.1.1 L'enrichissement

La plupart de nos connaissances sur les micro-organismes proviennent d'études réalisées sur

des cultures pures isolées de l'environnement. Cet isolement est précédé par une phase

d'enrichissement qui va favoriser la croissance d'un type donné de micro-organisme, sélectionné en

fonction des conditions physiques et nutritionnelles du milieu.

On distingue deux grands types de milieux, les milieux électifs où les souches les plus adaptées

aux conditions de culture vont se développer et les milieux sélectifs où on intervient physiquement ou

chimiquement pour favoriser la croissance d'un type donné de micro-organismes2. On favorise dans

tous les cas les micro-organismes ayant les vitesses de croissance des plus élevées dans des

conditions données.

Il existe plusieurs moyens classiques de modifier la sélectivité d'un milieu :

Ø Ajouter un composé utilisé par un organisme comme source nutritive.

Ø Supprimer un composé utilisé uniquement par les organismes que l'on ne souhaite pas isoler

(supprimer toutes les sources d'azote autres que l'azote gazeux (N2) pour isoler les bactéries

fixatrices d'azote).

Ø Ajouter des antibiotiques (pénicilline pour inhiber les bactéries Gram + et certaines bactéries

Gram -, néomycine et streptomycine pour inhiber les bactéries en général, actidone et nystatine

pour inhiber les champignons).

Ø Modifier les propriétés physico-chimiques du milieu (pH, potentiel redox, etc.).

Ø Modifier les conditions d'incubation (température, teneur en eau, pression osmotique, lumière,

etc.).

Un panel de milieux d'enrichissement, présentant l'ensemble des conditions physico-chimiques

rencontrées dans le biotope d'étude, devra être choisi pour permettre la croissance du plus grand

nombre possible de types métaboliques.

Compte tenu de la complexité de certains écosystèmes, il est parfois nécessaire de mettre en

oeuvre des systèmes élaborés de culture afin de pouvoir assurer le développement de certains

organismes.

C'est le cas notamment des milieux à fort gradient (physico-chimiques, nutritionnels, etc.) pour

lesquels les systèmes suivants ont été mis au point :

Ø La colonne de Winogradsky (cf. figure 1.2).

Ø la chambre de culture en flux continu de Huber et al. (1998b) pour isoler Thermocrinis ruber, une

bactérie hyperthermophile pléomorphe formant, une fois fixée, de longs filaments roses dans les

2 Les milieux électifs sont en fait des milieux peu sélectifs.


4

sources chaudes d'Octopus Spring à Yellowstone (USA). Les systèmes de culture en continu

permettent de sélectionner des micro-organismes ayant de fortes affinités avec des substrats en

faibles concentrations. Les micro-organismes n'ayant pas d'affinité suffisante sont lessivés du milieu.

Ø La "Benthic Gradient Chamber" mise au point pour reproduire les gradients sédimentaires et étudier

les phénomènes de compétitions entre bactéries pourpres et vertes (Caumette et al., 1998).

Ø Les chémostats pour maintenir en culture les bactéries formant des enchevêtrements ("mats")

filamenteux de soufre (Taylor et al., 1999).

Ø Les co-cultures pour la croissance de bactéries syntrophes : Syntrophomonas avec des bactéries

sulfato-réductrices (BSR) (Harmsen et al., 1993) ou de Proteobacteria epsilon soufre oxydantes avec

des BSR (Thiovulum sp. pour Wirsen et Jannasch, 1978 ou Arcobacter sp. pour Teske et al., 1996b).

Dans ce cas le développement du micro-organisme est conditionné par la consommation d'un

des produits de son métabolisme par un second micro-organisme.

Couvercle

Algues et cyanobactéries

Bactéries soufréespourpres

Bactéries soufréesvertes

Décompositionanaérobie et sulfato-réduction

Bouesenrichies enmatièresorganiques eten CaSO4

Eau de lacou demarais

Figure 1.2. Principe de fonctionnement d'une colonne de

Winogradsky. La phase supérieure reproduit les

conditions retrouvées dans le milieu liquide (luminosité,

aération) alors que la phase inférieure reproduit les

conditions des premiers centimètres de sédiments

(obscurité, augmentation du potentiel réducteur). Au cours

du temps, l'établissement de la flore microbienne

s'effectue en fonction de leur préférendum au sein des

gradients (d'après Madigan, 1996).

2.1.2 L'isolement et la taxinomie

A partir de l'enrichissement il est possible d'isoler des espèces pures. Pour ce faire on dispose

de trois grands types de techniques : l'isolement sur boite, la dilution successive en milieu liquide ou

dans l'agar. Pour chacune des méthodes plusieurs repiquages successifs des souches isolées seront

nécessaires pour s'assurer de la pureté de l'isolat.

Une fois la souche isolée il convient de la caractériser, c'est à dire de définir les caractères

phénotypiques et génotypiques qui permettront de la comparer avec d'autres micro-organismes

préalablement isolés. On réalise alors une taxinomie. Une partie de ces caractères est regroupée dans

le tableau 1.2.

La taxinomie microbienne a longtemps été considérée comme une discipline ingrate. A l'instar

de la taxinomie des organismes supérieurs elle était essentiellement fondée sur l'utilisation de clés

dichotomiques successives. Or ces clés n'étaient pas d'un emploi simple et étaient de plus sources


5

d'erreurs. Le développement de la taxinomie numérique3 et des approches polyphasiques dans les

années 70 (Colwell, 1970; Sneath et Sokal, 1973; Vandamme et al., 1996) mais surtout l'apparition de

la taxinomie moléculaire (en particulier l'analyse de l'ARN ribosomique ou des gènes codant pour

l'ARNr (ADNr)) ont permis de redonner un véritable élan à cette discipline.

Tableau 1.2. Liste non -exhaustive des caractères phénotypiques et génotypiques déterminés pour une souche isolée.

Morphologie :

Forme de la cellule

Taille de la cellule (diamètre, longueur)

Mobilité

Flagelle

Type de division cellulaire

Différenciation cellulaire

Structures internes et externes (endospores, vésicules

gazeuses, etc.).

Coloration de Gram

Ultrastructure

Composition chimique et analyse molécul aire :

Couleur des suspensions de cellules

Pigments

Composition en base de l’ADN

Séquence de l’ARNr 16S

Réassociation ADN/ADN entre espèces proches

Acides gras totaux.

Physiologie :

Milieu de culture

Optimum et gamme de température

Optimum et gamme de pH

Croissance phototrophique ou lithotrophique

Besoins en vitamines

Sources de carbone nécessaire à la croissance

Sources d’azote nécessaire à la croissance

Relation vis à vis de l’oxygène

Modes de production d’énergie :

- donneurs d’électrons : organiques ou inorganiques

- accepteurs d’électrons : oxygène, nitrate, sulfate, CO2,

oxydes de fer, etc.

Enzymes extracellulaires :

- amylases, lipases, gélatinases, cellulases, xylanases

Autres enzymes :

- oxydase, catalase

Fermentation du glucose

Dénitrification

La notion d'espèce est le concept clé et l'unité de base de la taxinomie. Elle résulte des

premiers travaux de hiérarchisation du monde vivant au 18ème siècle par le naturaliste suédois Carl Von

Linné. Selon la définition devenue classique proposée par Ernst Mayr (1982), une espèce est un

ensemble d'individus féconds entre eux et seulement entre eux, donc isolés des autres groupes

d'êtres vivants. Or le concept de sexualité chez les procaryotes est très différent de celui des

eucaryotes puisque la reproduction est végétative et asexuée. De plus on sait que des phénomènes

de parasexualité existent chez les procaryotes (conjugaison, transformation et transduction) et que

ceux-ci passent la barrière des espèces (cf. revue de Taddei et al., 1996). A la différence des

eucaryotes, les caractères morphologiques des procaryotes considérés seuls n'ont toujours qu'une

faible signification dans la classification des bactéries car la grande majorité des micro-organismes ont

des formes trop simples pour que l'on puisse les utiliser pour la taxinomie. Le développement des

techniques moléculaires a permis de donner une définition très rigoureuse de l'espèce.

Cette définition est fondée sur les propriétés de dénaturation et de renaturation du double brin

de l'ADN génomique bactérien en fonction de la température. Elle permet de définir une espèce

3 Des caractères phénotypiques (tels que ceux présentés dans le tableau 1.2) peuvent servir de base à la comparaison de plusieurs

souches. Il faut s'assurer que les caractères comparés sont informatifs et notamment qu'ils ne correspondent pas à un caractère

dérivé. Il convient dans un premier temps de discrétiser ces caractères (sous forme de 0 et de 1) puis de les présenter sous la forme

d'une matrice. Les similitudes entre organismes vont être exprimées sous forme de dendrogrammes. Des valeurs d'hybridations

ADN-ADN ou ARN-ADN pourront être aussi utilisées comme caractères dans une taxinomie. Toutefois les hybridations ADN-ADN ne

vont être informatives que dans le cas d'espèces proches et ne pourront être utilisées entre des espèces éloignées.


6

procaryotique comme constituée de souches qui présentent des valeurs d'hybridation ADN-ADN

supérieures ou égales à 70% et une valeur ∆Tm4 inférieure ou égale à 5°C (Wayne et al., 1987). Par la

suite la généralisation de l'analyse de l'ADNr a incité les auteurs à corréler les pourcentages d'identité

entre ARNr 16S et les pourcentages de réassociation ADN/ADN (Stackebrandt et Göebel, 1994). Ainsi

les séquences d'ADNr ayant des identités inférieures à 97% correspondent généralement à des

espèces différentes. Amann et al. (1995) abaissent par précaution cette limite à 95%. Selon certains

auteurs les critères d'hybridation ADN-ADN et de similarité d'ADNr 16S ne suffisent pas pour distinguer

des populations écologiquement distinctes. Il faut leur associer des mesures de similarité de gènes

codants pour des protéines du métabolisme (plus impliquées dans les mécanismes écologiques)

(Palys et al., 1997).

Le positionnement taxonomique d'une souche ne saurait toutefois se faire uniquement sur des

critères génétiques et l'utilisation de l'ensemble des caractères phénétiques et génétiques

permettent d'ancrer plus solidement l'organisme au sein d'une famille, d'un genre ou d'une espèce

définie (cf. tableau 1.3).

Tableau 1.3. Résolution taxonomique des techniques d'analyse (d'après Vandamme et al., 1996)

Techniques Niveau résolutif

Famille Genre Espèce Souche

RFLP

PGFE, LFRFA

Ribotypage

Amplifications d'ADN (RAPD, AFLP, ARDRA)

Typage de phages et de bactériocines

Techniques sérologiques (monoclonales, polyclonales)

Zymogrammes

Analyse des profils protéiques

Hybridations ADN-ADN

G+C %

Marqueurs chemotaxiques (quinones, polyamines)

FAME

Constituants des parois

Phénotype (classique, API, Biolog, ...)

Séquençage ARNr

Sondes nucléiques

Séquençage du génome

Abréviations : RFLP : Restriction Length Fragment Polymorphism; PGFE : Pulsed-Field Gel Electrophoresis; LFRFA : Low

Frequency Restriction Fragment Analysis; RAPD : Randomly Amplified Polymorphic DNA; AFLP : Amplified Fragment Length

Polymorphism; ARDRA : Amplified rDNA Restriction Analysis.

2.2 Quantification et mesure d'activité microbienne

L'isolement des souches permet de définir le type métabolique des micro-organismes mais il

peut être intéressant :

Ø de suivre l'évolution du micro-organisme dans le temps au sein de son environnement,

4 Tm , Temperature melting, est la valeur médiane du profil thermique de dénaturation d'un duplex ADN/ADN ou ADN/ARNr, le ∆Tm

étant la différence de Tm entre l'hybride homologue et hétérologue.


7

Ø de définir sur quelle distance s'étend sa niche écologique et sa zone de densité optimum,

Ø de connaître la vitesse à laquelle il dégrade les nutriments qu'il utilise,

Ø de comprendre comment les éléments qu'il métabolise s'insèrent dans les grands cycles

géochimiques et comment ils sont éventuellement incorporés dans le métabolisme d'autres

populations de micro-organismes.

2.2.1 Quantification

Les méthodes pour quantifier les micro-organismes présents dans un échantillon naturel

dérivent de celles utilisées pour quantifier les micro-organismes en culture pure. On distingue trois

grand types de méthodes : les techniques de mise en culture, les techniques de comptage direct et

les techniques d'analyse chimique de composants cellulaires.

2.2.1.1 Les techniques culturales

A l'aide de dilutions successives sur milieu liquide ou solide on détermine la dilution maximale à

laquelle il est possible d'obtenir une croissance de micro-organismes (technique du NPP: Nombre le

Plus Probable sur milieu liquide et de UFC : Unité Formant Colonie sur milieu solide). Ces techniques

sont grandement dépendantes du milieu et des conditions de culture utilisés. Elles ne permettent

d'accéder qu'à un nombre restreint de micro-organismes présents dans l'échantillon (cf. §. 2.3)

Ces techniques peuvent toutefois être utilisées conjointement avec d'autres méthodes pour détecter

des populations au type métabolique défini (par exemple les BSR, les méthanogènes, les autotrophes

soufre réducteur).

2.2.1.2 Les techniques de comptage direct

Cellules de com ptage

L'échantillon sous une forme liquide est disposé dans des cellules de comptage (cellules de

Mallassez et de Petroff-Hausser). Les cellules sont comptées sous le microscope dans un volume bien

déterminé. Cette technique n'est malheureusement applicable que dans des échantillons où les

cellules sont individualisées. Or dans la nature les cellules sont très fréquemment associées de

manière très cohésive ou associées à des surfaces. Pour simplifier le comptage et pour ne compter

que des cellules viables il est parfois possible de faire croître les cellules dans un milieu contenant un

inhibiteur de la synthèse d'ADN comme l'acide nalidixique et de l'extrait de levure avant de les

dénombrer (Kogura et Simidu, 1979). Les cellules viables vont alors former des cellules géantes (la

croissance de paroi n'étant pas stoppée). Toutefois la limite de détection de cette technique est de

l'ordre de 5.106 à 107 cellules par ml, et cette valeur est bien supérieure à la teneur en micro-

organismes que l'on peut retrouver dans l'eau de mer de surface (5.105 cellules/ml) ou de profondeur

(5.104 cellules/ml) par exemple.


8

Comptage par épifluorescence

Pour ce type de comptage on utilise la propriété qu'ont certains chromophores lorsqu'ils sont

excités à une longueur d'onde (λ1), de réémettre l'énergie fournie sous forme lumineuse à une

longueur d'onde supérieure (λ2) (Zimmermann et Meyer-Reil, 1974). La fluorescence réémise a une

durée de vie plus ou moins longue (fading). Selon les colorations c'est le chromophore qui va se fixer

directement sur la cible (DAPI, SYBR Green) alors que dans d'autres cas il sera relié à une molécule

non fluorescente qui jouera le rôle d'agent de spécificité (anticorps, sondes nucléiques). La coloration

va être réalisée directement sur les cellules. Pour des environnements pauvres en micro-organismes il

est souvent nécessaire de concentrer les échantillons par filtration. On utilise couramment un filtre

noirci (Hobbie et al., 1977) sur lequel il est possible de colorer les cellules avec des marqueurs

fluorescents tels que :

Ø le DAPI (diaminodino-phenylindole) colorant l'ADN,

Ø l'acridine orange qui colore l'ADN et l'ARN,

Ø la fluorescéine isothiocianate (FITC fluorescence verte) et la rhodamine (fluorescence

rouge) qui colorent les protéines en réagissant avec les groupes sulfydryles,

Ø le SYPRO qui colore les protéines et qui a été utilisé récemment pour quantifier la biomasse

planctonique (Zubkov et al., 1999),

Ø le Calcofluor qui réagit avec la cellulose, la chitine et les polysaccharides similaires,

Ø le DANSYL chloride et le "8-anilino-1-naphthalene sulfonic acid salts" (Mg-ANS et Na-

ANS) qui réagissent (fluorescent) en entrant en contact avec les lipides microbiens.

Les deux premiers colorants ont une forte propension à se fixer sur des particules non

biologiques et sont souvent inutilisables dans des échantillons naturels. Il est donc nécessaire de

prévoir une extraction spécifique des cellules avant leur coloration. Il est aussi possible d'utiliser des

colorants beaucoup plus spécifiques des acides nucléiques tels que le SYBR Green I et II, le YOYO-1,

le POPO-1 ou le YO-PRO-1 (cf. tableau 1.4) (Noble et Fuhrman, 1998; Weinbauer et al., 1998; Marie et

al., 1999).

Certains colorants vont permettre de distinguer les cellules mortes des cellules vivantes soit en

ne pénétrant que dans les cellules vivantes (on parle de colorants métaboliques), soit en ne pénétrant

que dans les cellules mortes. De plus les colorants métaboliques permettent de détecter le niveau

d'activité des cellules (par exemple mesure du potentiel d'oxydo-réduction, Rodriguez et al., 1992).

Enfin il est aussi possible d'utiliser des anticorps fluorescents à la spécificité plus ou moins large

pour compter certaines populations de micro-organismes (en particulier dans le domaine médical et

dans l'alimentaire pour la détection et le comptage de certains sérotypes de souches pathogènes).


9

Tableau 1.4. Liste non-exhaustive des fluorochromes spécifiques des acides nucléiques et utilisables pour le comptage cellulaire

(d'après le site MolecularProbes http://www.molecularprobes.com).

Colorants des acides nucléiques Ex/Em£ Propriétés et usages

4',6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 358/461 Semi-perméable

Sélectif des bases AT

Etude du cycle cellulaire, détection des mycoplasmes

Colorant cellulaire et chromosomique

7-Aminoactinomycin D (7-AAD) 546/647 Peu permanent

Sélectif des bases GC

CMF (cytométrie en flux)

Acridine orange 500/526 (ADN)

460/650 (ARN)

Perméable

Mesures du taux ADN/ARN

Marquage des lysozomes, CMF

Bromure d'éthidium 518/605 Imperméable

Intercalant du dsADN (double brin)

Coloration des cellules mortes

Colorant chromosomique

Electrophorèses, CMF

Excitable par un laser Argon

Hoechst 33342 350/461 Perméable

Sélectif des bases AT

Coloration des cellules vivantes

Etude du cycle cellulaire


POPO-1 434/456 Imperméable

Forte affinité avec l'ADN



Pré-colorant d'électrophorèse

SYBR Green I 494/521 Forte sensibilité à l'ADN et aux oligonucléotides

Colorant post électrophorèse

Colorant cellulaire

SYBR Green II 492/513 Forte sensibilité à l'ARN et aux ssADN (simple brin)

Colorant post électrophorèse

Colorant cellulaire

YO-PRO-1 491/509 Imperméable


Electrophorèses

Excitable par un laser Argon

YOYO-1 491/509 Imperméable

Forte sensibilité à l'ADN


Coloration chromosomique

Pré-colorant d'électrophorèse£Longueur d'onde d'excitation et d'émission (nm/nm)

Des tentatives d'automatisation des comptages ont été entreprises pour faciliter certaines

études comparatives. L'analyse d'image assistée par ordinateur permet de reconnaître différents

paramètres morphométriques (longueur, largeur, surface, périmètre), de quantifier les cellules et de

déterminer le volume cellulaire (Van Wambeke, 1995). Mise au point sur des cultures pures, cette

technologie n'est encore pas applicable pour le comptage d'échantillons environnementaux; en effet

la diversité des morphotypes, la taille des cellules (moins importante que pour les cultures pures), le

bruit de fond important lié aux particules (sédiments, sol, matière organique) rendent l'analyse très

fastidieuse et très aléatoire. L'amélioration des technologies d'acquisition d'image (microscopie


10

confocale, caméra CCD), l'accélération de l'acquisition et du traitement des données (cartes

d'acquisition et microprocesseur) devraient permettre dans les années à venir de généraliser l'analyse

d'image associée à l'épifluorescence. Récemment Blackburn et al., (1998) proposaient d'utiliser des

algorithmes de calcul fondés sur les réseaux neuronaux pour faciliter la quantification et l'analyse de

l'activité bactérienne d'échantillons de bactérioplancton prélevés en mer Baltique.

La cytométrie en flux (CMF)

Cette technique apparue dans les années 1980 pour détecter des anomalies dans les cellules

animales et analyser le cycle cellulaire est dorénavant couramment utilisée pour quantifier les micro-

organismes en particulier dans les environnements liquides comme l'eau de mer (Joux et Lebaron,

1995; Monfort et al., 1995). Différents signaux optiques permettent de mesurer différents paramètres

cellulaires (cf. tableau 1.5) :

Tableau 1.5. Paramètres mesurés en CMF en fonction des signaux optiques analysés

Signaux optiques Paramètre mesuré

Diffusion à petit angle Taille cellulaire

Diffusion à grand angle Réfringence cellulaire

Fluorescence Contenu en ADN, flux ioniques, potentiel

transmembranaire

La taille des cellules, le contenu en ADN, l'emploi de colorants particuliers ou plus récemment

l'utilisation de sondes nucléaires ou d'anticorps spécifiques permettent de distinguer et de séparer les

différentes populations contenues dans l'échantillon. Utilisée pour le comptage direct des cellules,

cette technique très puissante et très rapide (une fois mise au point) est applicable pour suivre le

métabolisme cellulaire (potentiel membranaire, activité respiratoire, activité enzymatique par exemple)

et effectuer un tri cellulaire (et donc un isolement puisque la technique n'est pas destructive). La CMF

atteint toutefois ses limites pour des échantillons où la répartition des cellules n'est pas homogène, où

on retrouve des morphotypes non réguliers tels que des filaments ou des structures en chaînettes, où

de nombreuses particules (que l'on peut confondre avec des cellules) sont présentes et où les

cellules sont associées fortement aux particules (particules de sols ou de cheminée).

2.2.1.3 Les mesures de constituants cellulaires

Ces techniques ont pour objectif la quantification d'un constituant cellulaire et permettent

d'extrapoler la biomasse microbienne en fonction de la biomasse de ce constituant (Servais, 1995). Si

certaines de ces techniques sont très précises en terme de mesure (par exemple mesure de l'ATP),

elles sont par contre extrêmement dépendantes de la qualité de l'extrapolation.

La mesure de l'ATP

L'adénosine-triphosphate peut être utilisée comme marqueur de biomasse active en écologie

microbienne et peut être détectée avec une très forte sensibilité à l'aide de techniques enzymatiques


11

de bioluminescence (Holm-Hansen et Booth, 1966; Hodson et al., 1976). Cette technique est

toutefois sujette à des sources d'erreur liées : au stress de la cellule lors du prélèvement et du

traitement de l'échantillon, à la méthode d'extraction (rendement plus ou moins grand selon les

solvants utilisés), à la destruction de l'ATP lors de l'extraction, à l'inactivation des réactifs de dosages

par l'échantillon (notamment dans le cas des sédiments) ou à la présence d'ATP sous une forme libre

dans l'échantillon (par exemple liée aux argiles). De plus le taux d'ATP n'est pas directement corrélé

aux cellules vivantes et l'extrapolation "biomasse d'ATP à biomasse cellulaire" est très dépendante de

l'état physiologique des cellules (Poulicek et Danckers, 1995).

Mesure de l'Azote et du Carbone cellulaires

Par spectrométrie de masse il est possible de définir la quantité de N et C présents dans

l'échantillon et d'extrapoler cette quantité à celle contenue dans les cellules. Cette technique est très

approximative et nécessite de travailler sur des échantillons très propres.

Mesure des constituants de la paroi microbienne

Les acides muramiques contenus dans la paroi bactérienne peuvent être extraits d'échantillons

environnementaux et analysés par HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) (Moriarty, 1977). La

quantité d'acide muramique dans la cellule est fonction du type de paroi (Gram négative ou Gram

positive : 12 µg.mg -1 en moyenne chez les Gram- et 44 µg.mg-1 chez les Gram+). Cette technique n'est

pas applicable si on ne connaît pas la proportion de Gram- et de Gram+ dans l'échantillon. Il faut de plus

tenir compte du fait que les spores contiennent 4 fois plus d'acide muramique que les cellules

végétatives.

Lipopolysaccharides (LPS)

Les LPS protéobactériens agissant comme endotoxines peuvent être détectés à de très faibles

doses (10-20 pg/mL) en analysant leur effet sur les amaebocytes de Limule (Limulus polyphemus)

(Watson et al., 1977). Ce test est utilisé en pharmacologie ou en microbiologie clinique pour détecter

les micro-organismes présents dans les fluides cérébro-spinaux, le sérum ou l'eau potable. Toutefois

la sensibilité de la méthode la rend très dépendante des contaminants et sa spécificité la limite aux

milieux colonisés par des entérobactéries.

2.2.1.4 L'analyse lipidique et les autres marqueurs moléculaires

La technique FAME (Fatty Acid Methyl Ester) est fondée sur l'analyse des profils d'acides gras

obtenus par chromatographie en phase gazeuse. Chaque profil est spécifique d'une souche et peut-

être comparé avec d'autres profils contenus dans une banque de données (Drucker et Owen, 1971;

Moss et al., 1974; Guezennec, 1995; Böttiger, 1996). En plus de l'établissement de profils lipidiques,

il est possible de rechercher un ou des lipides marqueurs spécifiques dont la présence sera

caractéristique d'un groupe de micro-organismes (par exemple étude des micro-organismes colonisant


12

différents coupons en milieu hydrothermal, Guezennec et al., 1998). Les rapports entre certains

marqueurs spécifiques pourront donner une indication sur l'état physiologique de la communauté.

Cette technique peut donc être utilisée sur des souches isolées ou sur des environnements peu

diversifiés afin de suivre l'évolution d'une souche particulière. Par exemple la recherche des Nocardia

dans les boues actives (Cha et al., 1999) ou l'étude de souches isolées d'environnements naturels

(des sols (Ka et al., 1994) ou des sédiments pollués (Wagner-Döbler et al., 1998)). L’analyse des

profils lipidiques est toutefois limitée par un manque de banques de données uniformisées, par un

nombre relativement faible de micro-organismes type étudiés et par l’influence de l’état physiologique

cellulaire sur les profils observables.

En dehors des lipides, d'autres marqueurs moléculaires peuvent être utilisés pour accéder à la

diversité microbienne d'un échantillon (cf. tableau 1.6).

Tableau 1.6. Principaux marqueurs bactériens (d'après Guezennec, 1995)

Biomarqueurs Micro-organismes Remarques ou Exemples de molécules

Phospholipides (Acides Gras)

Acides ß Hydroxylés (LPS)

Toutes cellules

Bactéries Gram -

Mesure de la biomasse viable

ß OH C14:0

Acides Gras Toutes cellules

Sulfato-réductrices

Thio-oxydantes

C16:1ω7, C16:0

iC17: 1ω7c, 10MEC16:0

OH monoinsaturés, 10-11MeOC18:0

Plasmalogènes Bactéries anaérobies essentiellement

Quinones Bactéries aérobies

Bactéries anaérobies

Anaérobies facultatives

Ubiquinones

Ménaquinones

Ubiquinones et Ménaquinones

Ethers de Glycérol Archaea

Acide Muramique Bacteria

Acide diaminopimélique Bactéries Gram - et quelques Gram +

Acides aminés (D) Bacteria D-alanine, D-glutamine

Hopanes Quelques Bacteria

Phytopigments Phototrophes

2.2.2 Mesure d'activité microbienne

2.2.2.1 Incorporation des radio-isotopes

Ils permettent de suivre la dégradation, la production ou la transformation d'un composé, d'en

estimer la vitesse ou la localisation. Pour ce faire on va suivre l'incorporation d'isotopes radioactifs 14C,3H, 35S. L'incorporation du 14CO2 permettra de suivre les mécanismes de photosynthèse, ou la

production de 14CH4 permettra de suivre les mécanismes de méthanogenèse. La sulfato-réduction

pourra être suivie par mesure de la conversion de 35SO42- en H2

35S, alors que la méthylotrophie ou la

méthanogenèse acétoclastique pourra être suivie en mesurant la conversion du méthanol ou de

l'acétate marqué au 14C en 14CH4 (Zehnder et al., 1979). Les mécanismes de chimioorganotrophie

pourront être suivis par mesure de l'incorporation de sucres et d'acides aminés marqués au 14C. La

synthèse de l'ARN ou de l'ADN peut être suivie par mesure de l'incorporation de la 3H-adénine (Karl,

1979, 1981). L'activité des cellules bactériennes peut être suivie en mesurant l'incorporation de la 3H-


13

thymidine dans l'ADN chez la majeure partie des hétérotrophes (Fuhrman et Azam, 1980, 1982;

Pollard, 1998), du 35SO42- (Monheimer, 1972) ou de la 3H-leucine (Kirchman et al., 1985) dans les

protéines pour l'ensemble du monde bactérien. Enfin les bactéries nitrifiantes ou dénitrifiantes sont

analysées par mesure de l'isotope 15N (Goering et Dungale, 1966). Ces mesures peuvent être

effectuées dans la nature ou sur cultures isolées. On parle alors de microautoradiographie.

2.2.2.2 Mesure des ratios isotopiques

Dans la nature chaque élément chimique existe sous la forme de plusieurs isotopes de stabilité

variable. Les ratios entre ces isotopes sont fixes (par exemple le ratio 12C/13C=19/1), or les mécanismes

de transformation cellulaire vont favoriser l'incorporation d'un isotope (en général le plus léger) et les

composants synthétisés vont donc avoir un ratio isotopique différent du ratio naturel. De plus les

mécanismes métaboliques vont incorporer différemment chaque isotope et pour une molécule

donnée un ratio isotopique pourra être attribué à chaque métabolisme.

2.2.2.3 Mesures d'activités spécifiques

L'emploi d'analogues structuraux fluorescents permet de détecter des activités enzymatiques

extra-cellulaires spécifiques comme celles des lipases, des phosphatases, des aminopeptidases.

L'incorporation de bromodéoxyuridine (BrdU), un analogue de la thymine chez les bactéries actives

(synthétisant de l'ADN) peut être suivie par méthode immunochimique. L'ADN ainsi marqué peut être

extrait et étudié (Urbach et al., 1999)

L'emploi du CTC (5-cyano-2,3-dotolyl tetrazolium chloride) ou de l'INT (2 (p-iodo-phenyl)-3-(p-

nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride) permet de suivre l'activité respiratoire par l'apparition

(CTCàCTC-formazan) ou la disparition (INT à INT-formazan) d'un cristal fluorescent.

L'emploi du système Biolog directement à partir d'échantillon environnemental a été proposé

par Garland (1997) puis par Smalla et al. (1998) en conjonction avec une étude en TGGE. Le

métabolisme du carbone dans l'échantillon peut être ainsi appréhendé mais sans identifier les micro-

organismes qui en sont responsables.

2.2.2.4 Les microélectrodes

Si l'utilisation des microélectrodes était une chose commune en neurophysiologie et en biologie

animale, ce n'est que très récemment (ces 15 dernières années) que sous l'impulsion de Jørgensen et

de Revsbech elles ont été utilisées en écologie microbienne (de Wit , 1995; Amann et Kuhl, 1998;

Cooper, 1999). On dispose actuellement de microélectrodes qui permettent de mesurer O2, pH, S2-,

NO2, CO2, NO3-, NH4

+ et potentiels redox. D'un diamètre de 2 à 100 µm, voire 2 à 3 µm pour les

électrodes à O2, elles ont une très forte résolution spatiale qui permet de suivre des microvariations

dans des environnements où de nombreuses populations microbiennes se succèdent comme par

exemple: les sédiments ou les biofilms (Santegoeds et al., 1998 a, b; Okabe et al., 1999).


14

2.3 Une vue restreinte de la diversité

L'ensemble des techniques préalablement décrites pour analyser la diversité microbiologique

d'un échantillon présente l'inconvénient de ne donner qu'une vue restreinte ou une approximation

grossière de la diversité naturelle. Les techniques qui permettent d'accéder individuellement à chaque

organisme sont notamment entachées d'erreurs inhérentes aux méthodes culturales. Celles ci sont

connues depuis fort longtemps et ont été décrites sous le terme de "la grande anomalie du comptage

sur boite" (Staley et Konopka, 1985).

Selon les auteurs entre 0,001% et 15% des bactéries présentes dans un échantillon sont

cultivables à l'aide des techniques classiques (cf. tableau 1.7)

Tableau 1.7. Cultivabilité déterminée comme le pourcentage des bactéries cultivables par rapport aux cellules totales déterminées par

comptage direct. (D'après Amann et al., 1995)

Habitat Cultivabilité (%)a

Eau de mer 0,001-0,1

Eau douce 0,25

Lac mésotrophique 0,1-1

Eaux d'estuaires non polluées 0,1-3

Boues actives 1-15

Sédiments 0,25

Sol 0,3a Bactéries cultivables mesurées en tant qu'unités formant des colonies (UFC)

Ce décalage est à attribuer à différentes causes (Amann et al., 1995; Joux et Lebaron, 1995;

Ward et al., 1997):

Ø Le milieu de culture choisi ne peut être universel et l'ensemble des conditions de

l'environnement ne peuvent être reproduites sur un seul et même milieu de culture en

particulier pour les environnements à forts gradients physico-chimiques.

Ø Certaines cellules hors de leur environnement peuvent entrer dans un état viable mais non-

cultivable (cf. tableau 1.8 pour des études réalisées sur le milieu aquatique). Cet état cellulaire

correspond à une adaptation aux conditions de stress, notamment nutritionnel. Il

s'accompagne de modifications physiologiques et structurales dont le rétablissement n'est

pas simplement possible sur milieu synthétique. Cet état peut être maintenu de plusieurs jours

à plusieurs années.

Ø Des populations inférieures numériquement peuvent supplanter des populations majoritaires

moins adaptées au milieu de culture.

Ø Des populations enrichies en liquide peuvent ne pas se développer sur milieu solide.

Ø La quantité d'inoculum choisie pour l'enrichissement influence le type de cellules enrichies.

Ø Des micro-organismes différents ayant des conditions de croissance similaires seront

difficilement distinguables.


15

Ø Certaines cellules sont impossibles à obtenir en culture pure comme c'est le cas des micro-

organismes symbiotes et syntrophes.

Tableau 1.8. Pourcentages de bactéries actives par rapport au nombre total de bactéries (comptées en épifluorescence), cité

dans Servais (1995)

Méthodes Environnements Pourcentages

Autoradiographies3H acides aminés Marin (Kiel Bay)

Marin (Chesapeake Bay)

41%

45 à 76 %; 17 à 82 %3H glucose Marin (Kiel Bay) 2,3 à 56,2 %3H acétate Marin (Chesapeake Bay) 49 à 59 %; 6 à 51 %3H thymidine Marin (Chesapeake Bay)

Marin (S. California Bight)

Marin (Côte du Danemark)

15 à 94 %

28 à 50 %

20 à 80 %

Réduction d'INT Marin (mer Baltique)

Marin (Chesapeake Bay)

Eau potable (France)

Lac Léman

8 à 97%

61 %; 25 à 94 %

10 à 20 %

0,6 à 26 %

Acide nalidixique Marin (Chesapeake Bay)

Marin (Porto Rico)

7 à 15 %

0,5 à 6 %

Des techniques permettant d'accéder individuellement aux micro-organismes présents dans un

échantillon en s'affranchissant des techniques culturales ont été proposées à la fin des années 1980.

Ces techniques sont fondées essentiellement sur l'analyse, non plus de la cellule, mais des acides

nucléiques qu'elle contient sous la forme d'ADN génomique ou d'ARN ribosomaux. Dans le chapitre

suivant je me propose de décrire ces techniques après avoir présenté les molécules analysées (les

ARN ribosomaux) et les principes de phylogénie. Les apports des techniques moléculaires dans

l'analyse de différents habitats microbiens seront abordés dans la seconde partie de mon introduction.

III Les acides nucléiques en écologie microbienne

3.1 Le développement des techniques moléculaires

L'émergence des technologies moléculaires en écologie microbienne est liée au

développement de la phylogénie moléculaire à la fin des années soixante (Zuckerland et Pauling,

1965) ainsi qu'au choix de l'ARN ribosomique comme marqueur évolutif à la fin des années soixante-

dix (Woese et Fox, 1977). Les premiers travaux d'écologie microbienne moléculaire provinrent de

l'équipe de Pace qui utilisa les résultats de Woese pour accéder à la diversité d'échantillons

environnementaux (Olsen et al., 1986; Pace et al., 1986a et b).

Un grand nombre de publications se sont proposées de décrire sous forme de revue les

techniques moléculaires employées en écologie microbienne. Parmi les plus anciennes on peut citer,

en plus des deux publications précédentes : Turner et al., 1989; Olson, 1991; Pickup, 1991; Atlas et


16

al., 1992; Liesack et Stackebrandt, 1992; Olson et Tsai, 1992; Ward et al., 1992. Si nombre de ces

revues décrivent avec enthousiasme les apports de ces techniques certains auteurs s'interrogent déjà

sur les nouvelles limitations qu'elles impliquent.

3.1.1 La phylogénie moléculaire

Le concept de phylogénie moléculaire est né des travaux de Zuckerland et Pauling (1965) qui

les premiers considérèrent les molécules comme des marqueurs de l'histoire évolutive et

développèrent le concept d'horloge moléculaire. Cette notion est liée à la théorie neutraliste de

l'évolution (Kimura, 1968). Les mutations s'accumulent au cours du temps dans le génome et chez

des organismes différents. Le taux d'accumulation est dicté par l'intensité de la pression de sélection

et il est du même ordre de grandeur dans des domaines homologues du génome (région soumise à la

même pression de sélection). Ainsi les gènes à mutations rapides vont pouvoir refléter des

événements évolutifs récents alors que les gènes très conservés seront les témoins d'un passé très

éloigné. Sans pour autant remettre en cause la validité de la phylogénie moléculaire, la théorie

neutraliste de l'évolution est fortement contestée (Goodman, 1981) voire niée (Li, 1993). La

différence de taux d'évolution est alors attribuée soit aux différences de temps de génération soit aux

différences d'activité du métabolisme (Li, 1993).

Près de dix ans après les travaux de Zuckerland et Pauling, Woese et ses collaborateurs (Fox et

al., 1977; Woese et Fox, 1977) appliquent cette théorie à l'étude de la phylogénie bactérienne en

utilisant l'ARN ribosomique comme marqueur de l'évolution. Les premières études portent sur

l'analyse de fragments de séquences et définissent des signatures spécifiques qui scindent le monde

du vivant en trois grands domaines. La dichotomie du monde vivant en terme de Procaryote et

Eucaryote était abandonnée au profit d'une division tripartite constituée d'Eucarya, de Bacteria et

d'Archaea. Les études menées par la suite sur des séquences entières confirmèrent ces résultats

(Woese, 1987; Woese et al., 1990).

3.1.2 L'ARN ribosomique

Les ARN ribosomiques (ARNr) sont formés de sous unités pouvant se grouper en polysomes.

Ces éléments sont caractérisés par leur constante de sédimentation exprimée en Svedberg (S). Chez

les organismes procaryotes, il existe des ribosomes 70S (de poids moléculaire 2,5.106 Da (1 Dalton= 1

g/mol)) formés de 2 sous-unités. La petite unité 30S de poids moléculaire 0,93.106 Da est composée

de 21 protéines et d'ARNr 16S (1541 nucléotides chez E. coli; 0,56.106 Da) (Moore, 1998). Lorsque

des régions sur sa séquence sont complémentaires (appariement AU et GC), le brin d'ARN se replie

sur lui même pour former une structure en "épingle à cheveux". Dans le ribosome les molécules

d'ARNr, repliées en une structure secondaire, peuvent être représentées à partir d'études

comparatives des séquences primaires (Gutell et al., 1994; Noller, 1984; Noller et Woese, 1981;

Woese et al., 1975). Une modification de la séquence primaire de l'ARNr va influencer directement sa


17

structure secondaire. Pour maintenir la fonctionnalité de la molécule, la structure secondaire de l'ARNr

doit être conservée dans l'ensemble du monde vivant par le biais de mutations compensatoires

(Hancock et al., 1988; Wheeler et Honeycutt, 1988; Otsuka et al., 1999).

3.1.3 Le choix de l'ARN 16S

Le choix de Woese et de ses collaborateurs s'est porté sur la petite sous-unité de l'ARNr (16S

chez les Procaryotes et 18S chez les Eucaryotes) pour plusieurs raisons (Pace et al., 1985; Ludwig et

Schleifer, 1994; Ludwig et al., 1998) :

Ø Sa présence est universelle et il y accomplit le même rôle chez tous les organismes.

Ø Sa séquence est une alternance de domaines dont les vitesses d'évolution varient, permettant

de comparer des espèces très proches sur des domaines hypervariables et des espèces très

éloignées sur des domaines très conservés.

Ø Il a évolué lentement.

Ø Il n'est pas le résultat de transferts latéraux5.

Ø Il est relativement facile à isoler en raison de son abondance dans les cellules

Ø Sa séquence est facilement obtenue par des méthodes standard d'extraction et de

séquençage. Les techniques d'extraction (Dorsch et Stackebrandt, 1992) et de séquençage ont

été simplifiées et optimisées au fil des ans par l'introduction du séquençage des ADNr (Böttger,

1989) plutôt que des ARNr (Lane et al., 1985c), et l'utilisation du "cycle-sequencing" à l'aide

d'amorces fluorescentes (Hiraishi, 1992; Ruano et al., 1993)

Ø Il est préféré au 5S et au 23S en raison de sa taille moyenne et de sa structure secondaire moins

marquée. Sa séquence est suffisamment longue pour réaliser des comparaisons statistiquement

cohérentes (cf. § 3.2.2.2 calcul de la déviation standard).

L'ADN codant pour l'ARNr (ADNr) est organisé en opéron. Au sein d'une souche, cet opéron

peut être en copies multiples (de 1 à 14 selon les souches) et ces copies sont généralement

identiques ou très proches en raison des fortes pressions évolutives gouvernant le maintien de la

structure secondaire de l'ARNr (Hillis et al., 1991). Il a toutefois été observé au sein d'un même

organisme d'importantes variations entre les différentes copies de l'ADNr 16S (Clayton et al., 1995).

D'autre part des séquences d'ADNr 16S correspondant à des souches phénotypiquement très

distinctes pouvaient s'avérer quasiment identiques (Fox et al., 1992). Récemment Ueda et al. (1999)

attribuent ces différences entre copies d'un même opéron à deux mécanismes : d'une part une

mauvaise incorporation durant la réplication de l'ADN et d'autre part des transferts horizontaux.

Le choix de l'ARNr 16S est parfois contesté (cf. Partie 2 §1.2), il serait donc préférable d'établir

les phylogénies sur plusieurs gènes afin de ne conserver que l'arbre consensus à toutes ces

phylogénies. Des tentatives ont été entreprises (Gupta, 1998a; Huang, 1996). Mais le travail est

actuellement très laborieux. Gageons que les améliorations des techniques de séquençage :

5 Une étude récente de complémentation de E. coli (dont l'ensemble des opérons rrn (7) avaient été inactivés) par des ARNr d'une

autre espèce semble indiquer que la possibilité de transferts horizontaux de l'ARNr n'est pas à exclure (Asai et al., 1999a et b).


18

augmentation du nombre d'échantillons traités simultanément, accélération des migrations dans des

microcapillaires, utilisation de puces de séquençage ou de séquençage par spectrométrie de masse,

permettront d'ici quelques années d'accéder à l'ensemble du génome des micro-organismes comme

nous accédons actuellement à l'ARNr 16S.

3.2 L'analyse phylogénétique

Une étude de diversité microbienne est fondée sur l'identification des micro-organismes

présents dans un échantillon et donc sur la comparaison de ces micro-organismes avec d'autres

préalablement isolés. Selon que l'on dispose uniquement de séquences (ADNr ou gènes du

métabolismes clonés) ou de souches isolées, les comparaisons porteront uniquement sur ces

séquences ou sur l'ensemble de l'ADN génomique et sur des caractères phénotypiques. Dans tous

les cas il convient de définir des homologies entre les organismes à comparer puis de réaliser une

phylogénie à partir des caractères homologues.

On définit par homologues des caractères dérivant d'un même caractère ancestral. Ces caractères

sont orthologues s'ils ont conservé la même fonction et paralogues si la fonction est différente.

Les caractères analysés lors d'une phylogénie moléculaire sont des séquences d'acides aminés

ou des séquences d'acides nucléiques. Ce sont des caractères discontinus qui peuvent donc être

étudiés comme des caractères discrets (absence ou présence). L'extrémité des branches d'arbres

phylogénétiques correspond aux taxons. Ces taxons constitueront des OTU (Unité Taxinomique

Opérationnelle) sur la base de caractères phénétiques (Sokal et Sneath, 1963). C'est cette unité que

choisit Moyer et al. (1994) pour définir la structure et la diversité de la communauté d'un tapis microbien

hydrothermal sur un site du Pacifique. D'autres auteurs leur préfèrent la définition de phylotype (ou

type phylogénétique) qui s'applique plus à une analyse fondée sur des caractères moléculaire

(Haddad et al., 1994; Poltz and Cavanaugh, 1995).

3.2.1 Les méthodes de phylogénie

Il n'existe pas de techniques qui permettent de réaliser l'arbre phylogénétique vrai. On ne

dispose que de moyens statistiques pour construire l'arbre "le moins faux possible".

Trois méthodes permettent de construire les arbres : l'analyse des distances (Fitch et

Margoliash, 1967), l'analyse de la parcimonie (Fitch, 1971), l'analyse du maximum de vraisemblance

(Felsenstein, 1981).

La première est une méthode phénétique c'est à dire fondée non pas sur un critère

généalogique mais sur un critère de similarité : on utilise alors des distances et il n'y a pas de tentative

pour établir des relations d'ancestralité entre des séquences différentes. Les deux autres méthodes

sont des méthodes cladistiques reposant sur des caractères discrets; on cherche par ces méthodes à

établir des relations généalogiques entre les individus étudiés. On détermine alors le nucléotide le

plus probable pour une position donnée sur la séquence ancestrale. La méthode de parcimonie est


19

fondée sur un nombre minimal de mutations pour établir les relations entre les espèces et la méthode

du maximum de vraisemblance est une méthode statistique.

On considère qu'une phylogénie est solide lorsque les arbres obtenus par les trois méthodes

sont concordants.

Toutefois différentes sources d'erreurs doivent être prises en compte :

Ø Dans les zones hypervariables, l'alignement de certains nucléotides est hasardeux car la

présence d'une même base sur deux séquences différentes n'est pas liée obligatoirement à une

homologie mais à une homoplasie (cf. définition §3.2.1.1).

Ø Les différences entre deux séquences sont censées représenter un événement dans une

lignée, or un même site peut avoir changé plusieurs fois dans une lignée ou avoir changé une fois

dans deux lignées différentes.

Ø Des "gaps" doivent parfois être introduits dans des séquences qui correspondent soit à des

insertions soit à des délétions. Ces modifications peuvent correspondre à un ou plusieurs

événements.

3.2.1.1 L'alignement

L'alignement est l'étape cruciale de l'analyse phylogénétique. Il consiste à mettre en regard des

nucléotides à des positions homologues. Au sein de zones très conservées, les zones homologues

sont facilement détectables mais lorsque des événements d'insertion et de délétion (fréquents dans

l'ARNr 16S) surviennent, il convient de les répercuter sur les alignements.

Au sein de zones hypervariables, des nucléotides peuvent s'avérer identiques alors que ceux-ci

ne sont pas homologues6 mais ont subi des phénomènes de réversion, de parallélisme ou de

convergence. Il convient alors, si ces séquences sont impliquées dans une structure secondaire, de

vérifier la présence de mutation compensatoire assurant le maintien de cette structure. Des banques

de structures secondaires d'ARNr ainsi que des logiciels de détermination de structures secondaires

d'ARN sont disponibles à cet effet sur le Web (Neefs et al., 1993; Van de Peer et al., 1997, 1999).

Une fois l'alignement obtenu il faut choisir quelles positions sur la séquence seront informatives

pour l'étude. Ce choix va être dicté par la proximité des séquences prises en compte durant l'étude. Il

n'est par exemple pas informatif de choisir des portions de séquences hypervariables sur un ensemble

de souches correspondant à plusieurs genres voire plusieurs familles. Toutefois ces zones

hypervariables pourront n'être que faiblement variables voire partiellement conservées si l'étude est

restreinte aux individus d'un même genre (les zones deviennent homologues). Il va donc falloir créer

des masques qui spécifieront pour les programmes de phylogénie les zones à analyser.

6 Homoplasie : similarité qui ne dérive pas d'un caractère ancestral.

Il existe trois sortes de phénomènes qui conduisent à une homoplasie: réversion : changement dans une séquence annulé par un

second changement (A → C → A), parallélisme : changements parallèles dans deux séquences. convergence : des bases différentes

dans deux séquences ancestrales peuvent être semblables dans des séquences contemporaines.


20

3.2.1.2 L'analyse des distances

Ce sont des méthodes rapides fondées sur le nombre de nucléotides différents entre deux

séquences. Les méthodes différeront en fonction de la façon dont les nucléotides seront pondérés,

dont les changements de bases (transition, transversion)7 seront traités, et des algorithmes utilisés

pour construire les arbres.

Ê Le nombre de différences observées entre deux séquences est toujours inférieur au véritable

nombre de différences en raison de phénomènes de mutation réverses et de mutations

multiples. Cette différence véritable ou distance évolutive peut être estimée par une loi de

Poisson. Si P est la proportion calculée de nucléotides différents entre deux séquences, alors

le taux de substitution selon Jukes et Cantor (1969) :

Knuc = −3

4Ln 1 −

4

3P

Cette méthode sous-entend que toutes les positions sur une molécule changent à la même

vitesse, que les transitions et les transversions7 ont la même probabilité et que chaque site

évolue de manière indépendante. Ce qui n'est pas nécessairement le cas.

Ë Selon Kimura (1980) le poids des transversions7 (proportion Q) est double par rapport à celui des

transitions (proportion P). Alors le taux de substitution

Knuc = −1

2Ln 1 − 2P − Q( ) 1− 2Q( )

1

2

Ì Van de Peer et al. (1994) proposent quant à eux de tenir compte des "gaps" qui peuvent être

introduits au cours de l'alignement. Pour P : proportion calculée de nucléotides différents entre

deux séquences, G : nombre de "gaps" dans une séquence par rapport à une autre, T : nombre

total de nucléotides pris en compte dans l'analyse. Une série de "gaps" adjacents, quel que soit

le nombre de "gap", est traitée comme un "gap". Alors

Knuc = −3

4Ln 1−

4

3P

1 −

G

T

+

G

T

Les valeurs Knuc sont alors soumises à des algorithmes produisant des arbres dont la longueur

des branches est minimisée en fonction de la proximité des séquences. Les méthodes principalement

utilisées sont celles :

Ø de UPGMA. Méthode agglomérative rapide mais peu précise. On groupe les deux espèces

les plus proches puis on construit une nouvelle matrice avec ce doublet, etc. (Sneath et Sokal, 1973).

Développée à l'origine pour réaliser de la taxinomie numérique, cette méthode a tendance à raccourcir

les branches des arbres lorsque l'on réalise une phylogénie (distances égales des branches de

chaque cotés du noeud).

Ø de Fitch et Margoliash (1967) fondée sur le principe d'additivité (la distance entre deux

taxons est égale à la somme des longueurs de branche les reliant). C'est une méthode précise mais

7 Transition : passage d'une purine à une purine (A ↔ G) ou d'une pyrimidine à une pyrimidine (T ↔ C)

Transversion : passage d'une purine à une pyrimidine et inversement.


21

qui nécessite un temps de calcul élevé. Elle permet de corriger l'effet "d'écrasement" obtenu par la

méthode UPGMA en acceptant des longueurs de branches inégales de chaque coté d'un noeud.

Ø de Neighbor-joining (Saitou et Nei, 1987) la plus couramment utilisée car elle permet

d'atténuer la méthode d'additivité en tenant compte des phénomènes d'homoplasie. Cette méthode

est rapide et précise.

Dans une analyse de séquence il faut aussi tenir compte du nombre de nucléotides analysés.

Plus celui ci sera important plus l'erreur ou la déviation standard sera faible. Cette déviation standard

dépend du nombre de résidus (N), de la proportion de nucléotides différents (P), de la proportion de

nucléotides semblables (Q=1-P).

Alors ∆ =3

4.

P.QL

Q −1

4

.

Par exemple pour 50% de différence sur 1000 nucléotides ∆=0,05 soit ±10% et pour 100 nuc.

∆=0,15 soit ± 30%.

On considère que les méthodes de distance sont faciles et rapides à réaliser. Elles conviennent

à une comparaison de séquences proches, ayant un haut score de similarité. Toutefois ces méthodes

perdent de l'information (les séquences sont réduites à des distances) et ne conviennent pas à la

comparaison de séquences éloignées.

3.2.1.3 Le maximum de parcimonie

Cette méthode est fondée sur le principe de l'économie : l'arbre le plus parcimonieux sera celui

présentant le moins de mutations pour passer d'une séquence à une autre. Le noeud qui relie deux

séquences est une séquence commune ou ancestrale (Fitch, 1971).

A partir de l'alignement total, un nombre réduit de sites informatifs est utilisé pour construire des

arbres. On élimine les sites qui ne varient pas (et parfois les sites qui diffèrent par transition dans le cas

d'une parcimonie de transversion). En effet on ne considère comme informatifs que les sites qui

favorisent une topologie d'arbre parmi toutes celles possibles. Les différentes topologies d'arbres

sont testées et l'arbre le plus parcimonieux est conservé. Pour des comparaisons s'appliquant à plus

de 8 séquences les techniques de choix d'arbres par des recherches exhaustives peuvent être

difficiles et très longues, aussi on utilise une technique dite heuristique (plus rapide mais moins

précise, par exemple le "branch swaping") afin de définir l'arbre le plus parcimonieux. Cette méthode

suppose que l'horloge évolutive est constante or ce n'est pas toujours le cas et les résultats obtenus

peuvent parfois être erronés. De plus il est fréquent de générer des arbres aussi parcimonieux les uns

que les autres et le choix de l'arbre consensus est alors difficile.

3.2.1.4 Le maximum de vraisemblance

C'est une méthode statistique où les changements évolutifs dans la séquence nucléique

suivent des modèles probabilistes. On recherche l'arbre possédant la plus forte probabilité pour qu'un


22

ensemble de données soit le résultat de l'évolution décrite par cet arbre. Les éventualités de

mutations sont calculées pour chaque site en suivant le modèle de Kimura dans le programme DNAML

développé par Felsenstein (1973, 1981). D'une manière similaire à la parcimonie la vraisemblance

assigne une séquence ancestrale à chaque noeud, mais elle ne suppose pas que l'évolution ait été

parcimonieuse. Pour chaque site et à chaque noeud tous les nucléotides possibles sont testés en

calculant dans tous les cas la probabilité pour que la séquence observée soit produite avec une

longueur de branche donnée. La première version du programme DNAML ne permettait pas de traiter

beaucoup de séquences à la fois, aussi Olsen a amélioré la technique en rendant possible le

traitement de plusieurs séquences (FastDNAML) (Olsen et al., 1994a).

Pour mémoire on peut citer une quatrième méthode de phylogénie qui tient compte de taux

d'évolution variables au sein des différentes branches d'un arbre. Il s'agit de la méthode des invariants

développée par Lake (1987).

3.2.1.5 Estimation de la robustesse des arbres

Ø Des méthodes différentes de phylogénie peuvent donner des arbres de topologies

différentes, aussi ne sont conservés, pour la construction de l'arbre final, que les branchements

retrouvés dans chacune des trois méthodes (Huelsenbeck et Hillis, 1993; Kim, 1993).

Ø Mais il existe aussi des méthodes statistiques qui permettent de vérifier la stabilité

(robustesse) des arbres : le "jackknife" et le "bootstrap". Cette dernière méthode est la plus

couramment utilisée. Elle consiste en la construction d'une nouvelle matrice de même taille que la

matrice initiale en réalisant des tirages avec remise des différentes colonnes de la première matrice

(Felsenstein, 1985). Aussi certaines colonnes de l'alignement pourront être utilisées plusieurs fois

alors que d'autres ne seront pas du tout utilisées pour construire la nouvelle matrice. Un arbre

phylogénétique est construit et cette opération est reproduite 50, 100 ou 1000 fois. Un arbre

consensus est calculé, portant sur chaque noeud de branches le pourcentage d'arbres où ce noeud

est retrouvé. Plus le pourcentage est élevé plus le noeud est considéré comme robuste. Dans la

pratique un noeud est considéré comme robuste lorsque le pourcentage est supérieur ou égal à 90%.

Les noeuds ayant un pourcentage inférieur à 50% ne sont pas pris en considération.

Ø Les séquences incluses dans une analyse peuvent influer sur la topologie d'un arbre. On

valide donc une topologie en incluant de nouvelles séquences et en supprimant d'anciennes.

Ø Enfin il est possible de vérifier la topologie en comparant les associations entre les séquences

sur la base de signatures spécifiques comme des nucléotides spécifiques à une position donnée ou la

présence (ou l'absence) de structures secondaires (par exemple des boucles, la longueur de structure

en épingle) à une position donnée.

Il reste toutefois difficile de définir "à coup sûr" si l'on est parvenu à réaliser une bonne

phylogénie et il est souvent nécessaire de vérifier la congruence de la phylogénie obtenue avec des

phylogénies obtenues au cours d'autres études ou à l'aide d'autres caractères.

Packages généraux

- PHYLIP- PAUP*- MEGA- VOSTORG- Fitch programs- Phylo_win- Zharkikh Unix programs- ARB- DAMBE

Construction, dessin, manipulationd'arbres

- PHYLIP- PAUP*- TreeTool- TreeView- Fitch programs- NJplot- DendroMaker- Tree Draw Deck- Phylodendron- ARB- unrooted- DAMBE- MacClade- ClaDOS- PDAP- TreeTool

Calcul des distances

- PHYLIP - PAUP*- RAPDistance - MULTICOMP- MARKOV - RSVP- Microsat - DIPLOMO- OSA - DISPAN- RESTSITE - NTSYSpc- PUZZLE - Hadtree, Prepare andTrees- Wisconsin Sequence Analysis Package (GCG)- AMP - DISTREE- GCUA - DERANGE2- calcdist - POPGENE- TFPGA - REAP- MVSP - SOTA- RSTCALC - Genetix- BIOSYS-2 - RAPD-PCR package- DISTANCE - Darwin- sendbs - K2WuLi- GeneStrut - Arlequin- DAMBE - DnaSP- PAML - puzzleboot - MATRIX

Arbre consensus et comparaison d'arbres

- COMPONENT- TREEMAP- NTSYSpc- PHYLIP- PAUP*- REDCON- TAXEQ2- TreeCons

Manipulation et soumission des séquences

- PARBOOT- Random Cladistics- Tree Gardener- GDE- MUST- DNA Stacks- SeqPup- Tonex- ARB

Maximum de vraisemblance etméthodes associées

- PHYLIP- PAUP*- fastDNAml- MOLPHY- PAML- Spectrum- SplitsTree- PLATO- SPOT- PUZZLE- Hadtree, Prepare and Trees- SeqPup- Phylo_win- PASSML- ARB- Darwin- BAMBE- DAMBE- Modeltest- TreeCons- VeryfastDNAml

Maximum de Parcimonie

- PAUP*- Hennig86- MEGA- Tree Gardener- RA- Pee-Wee and Noname- PHYLIP- PHYSYS- TurboTree- Freqpars- Fitch programs- CAFCA- Phylo_win- sog- gmaes- LVB- GeneTree- TAAR- ARB- DAMBE

Méthodes des matrices de distance

- PHYLIP - PAUP*- MEGA - MacT- ODEN - Fitch programs- SINCAIDEN - ABLE- TREECON - DISPAN- RESTSITE- NTSYSpc- METREE- TreePack- TreeTree- GDA- Hadtree, Prepare and Trees- Wisconsin Sequence Analysis Package (GCG)- SeqPup- PHYLTEST- Lintre- WET- Phylo_win- njbafd- gmaes- GTREE, ADDTREE, and EXTREE- DENDRON- Molecular Analyst Fingerprinting

Bootstrap et autres tests de validation

- PHYLIP- PAUP*- Zharkikh bootstrapping programs- PARBOOT- ABLE- Random Cladistics- AutoDecay- TreeRot- RASA- DNA Stacks- OSA- DISPAN- TreeTree- PHYLTEST- Lintre- sog- njbafd- PICA95- TAXEQ2- BIOSYS-2- RAPD-PCR package- TreeCons- BAMBE- DAMBE- puzzleboot

Tableau 1.9. Logiciels dédiés aux différentes méthodes de phylogénie


23

L'essor de l'écologie moléculaire bactérienne est indubitablement associé à l'essor des outils

d'analyse phylogénétique et des banques de données. La généralisation de l'outil informatique dans

les laboratoires a permis de démocratiser l'emploi de programmes de phylogénie longtemps confinés

dans des équipes disposant de centres de calculs surpuissants. Je me propose dans le chapitre

suivant de présenter différents logiciels et sites internet dédiés aux analyses de diversité.

3.2.2 L'informatique au service de la phylogénie

Les ordinateurs le plus souvent utilisés pour réaliser des calculs de phylogénie sont des stations

de travail fonctionnant sous environnement UNIX. En complément à ces machines il est désormais

possible à tout utilisateur disposant d'un ordinateur personnel de type PC ou Macintosh de faire

fonctionner sous le système d’exploitation Linux8 (http://www.linux.org) des logiciels réservés

jusqu'alors à une station de travail UNIX.

D'autre part un grand nombre de programmes de phylogénie ont été développés pour

fonctionner sur Macintosh ou sur PC sous les environnements Mac Os, DOS ou Windows.

3.2.2.1 Les programmes de phylogénie

Un grand nombre de logiciels sont disponibles pour réaliser des phylogénies à partir

d'alignements d'acides nucléiques ou d'acides aminés (cf. tableau 1.9). Je m'appliquerai ici à réaliser

une liste non exhaustive des logiciels disponibles sur Macintosh et sur Station SUN. Une liste plus

complète est disponible sur le site de l'institut Pasteur (http://www.pasteur.fr/outils.html).

Les logiciels d'alignements

La première étape d'une étude phylogénétique est celle de l'alignement. Ce travail peut être

effectué "à la main" ou à l'aide d'algorithmes regroupés dans des programmes [Clustal V ou clustal W

(GDE), Fast align sequence, aligner v1.0 ou v2.0 (ARB), pileup (GCG)]. Les résultats obtenus par ces

algorithmes ne sont malheureusement pas suffisamment fiables. Ils nécessitent toujours une

vérification de la part de l'utilisateur notamment dans le cas de l'ADNr afin de tenir compte des

structures secondaires de la molécule.

Sous environnement de type UNIX l'un des logiciels les plus ergonomiques est GDE (Genetic

Data Environment par Steven Smith). Il nécessite cependant une mémoire vive et vidéo importante

pour être utilisé sans trop de désagréments. Ce logiciel peut être utilisé seul ou dans le package ARB

(voir plus loin).

8 LINUX est un environnement gratuit de type UNIX qui a été développé à l'origine par Linus Torvalds puis qui a été amélioré par des

programmeurs du monde entier. C'est un environnement ouvert dont les sources sont disponibles gratuitement dans le cadre du projet

GNU General Public License (http://www.linux.org/info/gnu.html).


24

Seaview développé par Manolo Gouy (Galtier et al., 1996) est un logiciel d'alignement multiple

très convivial. Il traite aussi bien les séquences d'acides nucléiques que les séquences d'acides

aminés (http://pbil.univ-lyon1.fr/software/seaview.html). Développé récemment, il intègre les

principales formes d'acquisitions de fichiers et un alignement manuel ou automatique sur la base des

algorithmes Clustal et de Dot Plot. Ce programme est destiné à fonctionner en aval du logiciel

d'analyse de séquences Phylo_Win (Galtier et al., 1996).

Le package ARB (voir plus loin) propose à lui seul 4 logiciels d'alignement : GDE2.2., ALE,

ARB4 et ABRNT. Certains de ces logiciels (ARB4 et ABRNT) permettent de réaliser l’alignement en

tenant compte de la structure secondaire propre à l’ADNr 16S.

Pour finir sur UNIX, TkDCSE est la version pour X-Window de DCSE (Dedicated Comparative

sequence editor)(http://indigo2.uia.ac.be/~peter/dcse).

Sur Macintosh il est aussi possible de réaliser des alignements de séquences grâce au logiciel

Seqpup . Il n'existe pas de mise à jour récente du logiciel.

Les Packages

PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 3.57c est historiquement l'un des premiers

ensembles de logiciels développés pour l'analyse phylogénétique des séquences. Mis au point en

1986 par Joseph Felsenstein et ses collaborateurs de l'université de Washington, ce package a

évolué avec la mise au point de nouvelles techniques de phylogénie (Felsenstein, 1989). Toutefois

son interface uniquement en mode texte n'est pas conviviale et on lui préférera des programmes

comme ARB (voir plus loin) ayant intégré l'ensemble des méthodes de calcul de Phylip au sein d'une

interface beaucoup plus ergonomique.

GCG (Genetic Computer Group) (http://www.gcg.com) est un ensemble de logiciels très

complet mais aussi très coûteux. L'ensemble des programmes peut tourner en mode texte, mais il est

aussi possible de les faire fonctionner sous une interface graphique (SeqLab) à partir d'un Terminal X,

d'une station de travail ou à partir de n'importe quel ordinateur grâce à une "interface www" nommée

SeqWeb. L'intérêt de ce package réside dans la mise à jour régulière des logiciels et des banques de

données fournies avec ce programme. Toutefois cette dernière possibilité a été rendue caduque par

la disponibilité des banques sur le réseau.

Phylo_Win est un logiciel d'analyse phylogénétique de séquences (http://pbil.univ-

lyon1.fr/software/phylowin.html) (Galtier et al., 1996). Il accepte des alignements au format MASE

produits par Seaview. Il permet de réaliser des analyses par les méthodes du "Neighbor-joining", du

maximum de parcimonie et du maximum de vraisemblance en permettant de réaliser des

réechantillonages sur chacune de ces méthodes. Un grand nombre de facteurs de distance sont

disponibles (Jukes et Cantor, Kimura, Tajima et Nei, HKY, Galtier et Gouy (Galtier et Gouy, 1995),

LogDet pour les séquences nucléiques, la correction de Poisson pour les séquences protéiques). La

gestion des masques est très facilement effectuée à la souris et les arbres construits sont aisément

exploitables par d'autres logiciels.


25

ARB est un package développé par Olivier Strunk et Wolfgang Ludwig au sein de l'université

technique de Munich (TUM) et qui est avant tout destiné à l’analyse de l’ARN ribosomique 16S. Il

fonctionne sous environnement UNIX mais une version a été récemment développée pour LINUX. Il

intègre un grand nombre de programmes déjà existants tant en alignement (GDE) qu’en phylogénie

(Phylip). ARB possède sa propre base de données de séquences. Il s'agit d’ADNr 16S préalablement

alignés par les membres de la TUM. Cette base de données contient de plus toutes les informations

disponibles sous le format GenBank (dépositaire de la séquence, publication de référence, groupe

phylogénétique de la séquence, etc.). Elle n’est malheureusement pas mise à jour suffisamment

régulièrement (dernière mise à jour en mars 1997). Il est donc préalablement nécessaire lors de la

construction d’arbres de vérifier le dépôt de nouvelles séquences au près du RDP ou auprès de

GenBank. Il est possible grâce à ce logiciel de réaliser des arbres à l’aide des trois méthodes

phénétique et cladistiques. L’arbre consensus peut être par la suite édité à l’aide du logiciel Xfig fourni

avec le package puis importé sur Macintosh ou PC sous un format poscript (type PS ou EPS).

Mais l’un des atouts majeurs de ce logiciel est le programme très ergonomique de construction

de sondes nucléiques. En choisissant dans la banque de données d’ARB les séquences cibles, il est

possible de construire puis de vérifier la validité des sondes. L’orientation "procaryotes-ADNr 16S" fait

d'ARB un outil idéal pour les microbiologistes.

3.2.2.3 Les outils d’analyse en ligne et les bases de données

Les outils d'analyse en ligne et les banques de données se sont considérablement développés

ces 5 dernières années avec la généralisation de l'accès à Internet9 au sein des laboratoires.

Dans un premier temps cantonnées à un échange de données uniquement en mode texte via

le courrier électronique (e-mail) ou ftp (file transfer protocol), les analyses sont désormais possibles via

des sites http (hypertext transfert protocol) avec une interface beaucoup plus ergonomique basée sur

le html (hypertext markup language). L'information étant disponible à tous il devient alors possible de

centraliser la source d'information, de mettre à jour plus facilement les banques, de stocker les

données sur une seule machine (The Integration of Microbial Databases (site web), 1995; Burks,

1999; FitzGerald et Blacke, 1998; Nierlich, 1996).

En France le site de l'institut Pasteur (http://www.pasteur.fr) fournit une liste des logiciels

disponibles pour la comparaison et l'alignement de séquences, les analyses phylogénétiques, la

recherche de gènes et de régions codantes, la recherche et l'extraction de motifs, les HMM (Hidden

Markov Model), les analyses de structures secondaires et tertiaires des acides nucléiques et des

acides aminés (par exemple pour l'ARNr la Mfold home page (Zuker et Jacobson, 1998)). Le

9 Internet est né il y a un peu plus de 20 ans de la volonté du département de la défense américaine de mettre en réseau l'ensemble de

ses services de recherche militaire afin de répondre le plus rapidement possible à d'éventuelles attaques nucléaires, ce premier réseau

s'appelait ARPAnet. Un protocole de communication est alors développé afin de permettre la communication entre les ordinateurs

(quelle que soit leur marque) : le protocole IP (Internet Protocol). Dix ans plus tard le développement des réseaux internes (Ethernet

local area network, ou LAN) et la pression du marché (de la part des université américaines notamment) permettent l'accès de

n'importe quel utilisateur équipé d'un ordinateur et d'un modem à ce réseau devenu un réseau de réseaux ou World Wide Web.


26

BioCatalog de l'EBI (European Bioinformatics Institute) référence quant à lui la plus grande partie des

logiciels pour la biologie (UNIX, Macintosh, PC) (http://www.ebi.ac.uk/biocat).

Dans le cadre d'une analyse de séquence d'ARN ribosomique deux sites sont indiqués :

Ø Le site du NCBI (National Center for Biotechnology Information) va permettre d'accéder à

l'ensemble des séquences publiques déposées dans GenBank (Benson et al., 1999) et dans l'EMBL

(Stoesser et al., 1999). En décembre 1999 plus de 4,9.106 séquences et 3,8.109 bases étaient

disponibles dans cette banque de données (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Il est possible via ce site de

récupérer des séquences (Entrez), de soumettre de nouvelles séquences (BankIt et Seqin) ou de

comparer des séquences avec celles présentes dans GenBank (BLAST Basic Local Alignment Search

Tool, Altshul et al., 1997; Tatusova et Madden, 1999). Ce site permet de plus d'avoir accès au projet

PubMed gérant la banque de données développée par la NLM (National Library of Medecine)

regroupant les 9.106 références bibiographiques MEDLINE et PreMEDLINE.

Ø Le site du RDP ou Ribosomal Database Project (http://www.cme.msu.edu/RDP/html/

index.html) (Maidak et al., 1999) est une base de données et un ensemble de logiciels d'analyse en

ligne essentiellement destinés à l'analyse de l'ADNr 16 et 18S. Cette banque, gérée par le CME

(Center for Microbial Ecology) est régulièrement mise à jour à partir des séquences soumises à

GenBank mais aussi par des séquences (très souvent des clones environnementaux) soumises

directement par les utilisateurs. En plus de la banque de séquences d'ARNr, le RDP met à la

disposition des scientifiques un ensemble de programmes permettant :

Ø de comparer une ou plusieurs séquences avec celles de la banque de données,

Ø de réaliser un premier alignement sommaire,

Ø de placer des séquences dans un arbre phylogénétique rudimentaire,

Ø de vérifier la nature chimérique des séquences analysées,

Ø de vérifier la validité d'une sonde

Ø d'accéder aux banques de données de séquences d'ADNr 16S et 23S10.

Il existe aussi des banques de données concernant les micro-organismes cultivés. Ces banques

sont disponibles sur le site de l'ATCC (http://www.atcc.org) et de DSMZ (http://www.dsmz.de/). Le site

du Bergey's Manual Trust (http://www.cme.msu.edu/bergeys) donne aussi accès à la liste des

souches disponibles, aux espèces, genres, familles reconnus ou incertains, ainsi qu'à un arbre

phylogénétique type regroupant les souches isolées et les séquences provenant d'ARNr clonés à

partir d'échantillons environnementaux. Un projet de normalisation de cette liste sous la forme d'une

base de données plus aboutie est en cours sous le nom du PDP Phenotypic Database Project.

10 En complément du site du RDP deux banques inventorient les structures secondaires des petites sous-unités de l'ARNr (Van de

Peer et al., 1999) et des grandes sous-unités de l'ARNr (de Rijk et al., 1999)

Echantillon

Acides nucléiques extraitsADN ARNr

PCR

Clones contenant ADNr

Séquences d’ADNr

Banques de données

Environnement

ADNramplifiés c ADNr

Séquençage

Analyse comparative

Enrichissementcellulaire

Sondes nucléiques

Hybridation in-situ

Hybridation sur cellule totale

Dot Blot quantitatifs

Southern

Dot Blot /colonies

ADN

SEQUENCAGEHYBRIDATION

+ +

Figure 1.3. Utilisation des techniques moléculairesd’analyse de l’ADNr 16S pour l’étude de ladiversité microbienne.

Dessin d’après Amann et al., 1995


27

Après m'être intéressé au choix des acides nucléiques comme marqueurs de la diversité

microbienne et à l'analyse des séquences d'acides nucléiques, je me propose de décrire les

différentes méthodes moléculaires couramment utilisées en écologie microbienne.

3.3 Les méthodes moléculaires

Les techniques moléculaires peuvent en principe s'appliquer à tous les gènes pour peu que

ceux-ci répondent aux principes d'universalité et d'évolution que nous avons évoqués

précédemment. Toutefois nous nous attacherons dans cette partie à décrire les principales

techniques mettant en jeu l'ARNr 16S. Les hybridations ADN/ADN et la mesure du G+C% d'un ADN

génomique sont elles aussi des méthodes moléculaires, mais elles s'appliqueront plus à la

caractérisation d'une souche isolée qu'à l'étude directe d'un environnement (à l'exception de

l'approche présentée dans le §3.3.4.1).

3.3.1 Le clonage et le séquençage des ARNr

Cette technique est l'une des premières à avoir été employée pour s'affranchir de toute étape

de culture. Les différentes étapes de cette technique sont regroupées dans la partie droite de la figure

1.3. Elles consistent : à extraire l'ADN ou l'ARN total de l'échantillon environnemental, à amplifier

spécifiquement les gènes codant pour l'ARN ribosomique, puis à cloner le produit d'amplification et

enfin, à séquencer et à analyser les clones de la banque.

3.3.1.1 Historique de la méthodologie

Le résultat des premières études portant sur l'analyse de l'ARN ribosomique est reporté dans la

seconde partie de ce manuscrit. Ces études consistaient à analyser la communauté microbienne

d'échantillons naturels par séquençage des ARNr 5S directement extraits de l'échantillon. Elle

portaient sur l'analyse : de la communauté symbiotique de vers hydrothermaux considérés comme

chémo-autotrophiques (Stahl et al., 1984), de bactéries colonisant une source chaude terrestre (Stahl

et al., 1985) et des micro-organismes colonisant les bassins de biolixiviation du cuivre (Lane et al.,

1985b). Le manque de pouvoir résolutif de l'ARNr 5S (seulement 120 pb) incita les chercheurs à

analyser les ARNr 16S.

La première stratégie a été d'extraire l'ADN génomique total et de le cloner dans une banque

phagique. Les phages contenant des fragments d'ARNr ont été par la suite criblés à l'aide d'une sonde

spécifique et les clones ont été séquencés. Il a été possible à l'aide de cette technique d'analyser une

communauté picoplanctonique marine (Schmidt et al., 1991). Cette technique a été reprise par Stein

et al. (1996) pour accéder à des gènes du métabolisme à partir du même type de banque phagique.

Afin de réduire l'étape de criblage Giovannoni et al. (1990b), proposèrent à l'aide d'amorces

spécifiques d'amplifier les gènes codant pour l'ARNr 16S (ADNr 16S) puis de cloner le produit

d'amplification. Afin d'accéder à la population réellement active de l'échantillon Weller et Ward (1989)


28

proposèrent de travailler sur les ADNc transcrits à l'aide d'une réverse transcriptase à partir du pool

d'ARNr 16S. Amann et al. (1992a) modifièrent cette technique en ajoutant une étape de PCR après

l'utilisation de la reverse transcriptase afin de travailler directement sur des ADNr (cf. figure 1.3).

L'approche proposée par Giovannoni et al. (1990b) est actuellement la plus utilisée. Les

modifications qui y ont été apportées s'attachent à réduire les biais inhérents à cette méthodologie en

optimisant les techniques d'extraction d'ADN, d'amplification (jeu d'amorces, cycle, etc..) et d'analyse

de la banque (RFLP, séquençage total).

Nous reviendrons en détail dans la troisième partie de ce manuscrit sur les différentes étapes de

cette méthode et le chapitre 3.4 s'attachera à décrire les biais qui peuvent entacher une étude de

diversité.

3.3.1.2 L'échantillonnage et l'extraction d'ADN

Il faut considérer que l'étude reflétera la diversité de l'échantillon avant de refléter, par

extrapolation, celle de l'environnement tout entier. Aussi l'échantillon devra représenter le plus

fidèlement possible l'environnement étudié.

Un grand nombre de dispositifs d'échantillonnage sont disponibles selon que l'on travaille sur

des échantillons solides ou liquides, profonds ou de surface. L'accessibilité du site d'échantillonnage

est la première donnée du problème. Les sources hydrothermales profondes ne sont par exemple

accessibles qu'à un nombre réduit de submersibles scientifiques. Pour les échantillons des sols, il est

possible d'effectuer des prélèvements par carottage à partir de la surface ou d'utiliser des puits pour

accéder à des échantillons profonds (Pedersen, 1996). Pour des échantillons liquides il est possible

de réaliser des prélèvements ponctuels (seringue titane, bouteille NIO, bouteille Niskin) ou de travailler

sur de grands volumes pour accéder à une diversité plus importante, notamment aux souches rares. Il

est alors nécessaire de concentrer par filtration les échantillons (Bej et al., 1991; Giovannoni et al.,

1990a; Sommerville et al., 1989).

Le mode de conservation de l'échantillon pourra lui aussi influer sur la diversité observée. Il

faudra conserver les cellules intactes, c'est à dire les fixer si on souhaite réaliser des hybridations in situ

ou les maintenir dans des conditions proches de celles où elles se développent (pH, potentiel redox).

Afin de limiter la dégradation des acides nucléiques durant le stockage, il faudra limiter l'action des

DNAses ou des RNAses qui sont libérées dans le milieu dès que les cellules sont altérées. Pour ce

faire il faudra conserver les cellules au froid, dans l'éthanol ou dans des tampons bloquant les DNAses

et les RNAses (comme le Guanidide Iso Thiocyanate). La solution idéale reste de pouvoir extraire l'ADN

des échantillons dès que ceux ci sont collectés afin de réduire au minimum le temps de stockage de

l'échantillon.

La méthode d'extraction des acides nucléiques devra lyser de manière efficace l'ensemble des

parois microbiennes, sachant que la paroi des Gram + est plus résistante que celle des Gram- et que les

Archaea ne possèdent pas de peptidoglycane et sont donc insensibles à l'action du lysozyme. De

plus, des composants présents dans l'échantillon peuvent réduire l'efficacité de l'extraction (matière

organique, métaux, etc.) en se fixant sur l'ADN libéré des cellules. Il est souvent nécessaire de


29

combiner des méthodes de lyse physique (pilon et mortier, cycles de congélation-décongélation,

etc.), de lyse chimique (détergents, phénol, etc.) et de lyse enzymatique (lysozyme, protéinase K,

etc.) afin d'extraire le plus efficacement possible l'ADN contenu dans l'échantillon.

Une technique particulière de purification des ADN bactériens a été proposée par Neimark et al.

(1998) dans le cadre de l'étude de l'agent (non cultivable) du poumon gris (GLA: Grey Lung Agent).

Après extraction des ADN, ceux-ci sont séparés par électrophorèse en champ pulsé. Il est ainsi

possible de travailler sur des chromosomes entiers.

Deux autres techniques ont été proposées dans le cas d'études de milieux peu complexes pour

isoler spécifiquement les micro-organismes sans utiliser de méthodes culturales. Ces techniques

reposent sur la micromanipulation des micro-organismes ou sur leur extraction du milieu d'étude. Dans

le cadre de l'étude des bactéries symbiotes du poisson chirurgien (famille des Acanthuridae), Angert

et al. (1993) ont isolé le symbiote par micromanipulation. La taille de la bactérie (80 x 600 nm) a permis

d'utiliser cette technique habituellement appliquée aux Eucarya. Hubert et al. (1995) ont utilisé quant à

eux les pinces optiques pour isoler une Archaea hyperthermophile préalablement détectée par

extraction et séquençage des ADNr 16S à partir d'échantillons de la source chaude d'Obsidian Pool

(Barns et al., 1994). Le micro-organisme était minoritaire dans les cultures d'enrichissement et

échappait à toutes les tentatives d'isolement (Hubert et al., 1995). La technique d'isolement utilisée

est fondée sur la détection du morphotype à l'aide de sondes nucléotidiques spécifiques, puis sur la

recherche du morphotype dans des cultures d'enrichissement. Les cellules sont alors prélevées dans

le milieux à l'aide d'un LASER (Ashkin et Dziedzic, 1987)11. La seconde méthode, employée pour

étudier les symbiotes des vers hydrothermaux, consistait à isoler les cellules bactériennes des cellules

hôtes sur un gradient de Ficoll après centrifugation (Lane et al., 1985a).

3.3.1.3 L'amplification et le clonage

Chaque étape de la PCR devra être prise en compte afin d'optimiser les conditions

d'amplification (voir pour revue Arnheim et Erlich, 1992; Steffan et Atlas, 1991).

L'utilisation de l'ADNr 16S permet de concevoir des amorces de PCR aux extrémités 5' et 3' de la

molécule avec des spécificités plus ou moins importantes (Brunk et al., 1996; Marchesi et al., 1998).

On utilise généralement plusieurs jeux d'amorces universelles afin de réaliser des banques de

séquences de Bacteria, d'Archaea et parfois d'Eucarya (Hugenholtz et al., 1998a par exemple). Dans

certaines études il a été possible d'amplifier spécifiquement des séquences d'ADNr 16S

correspondant à un type métabolique défini (les BSR, Devereux et Mundfrom, 1994; Devereux et al.,

1996). En jouant sur les conditions de PCR (enzyme, nombre de cycles, température, etc.) il est

possible par la suite de modifier la spécificité de la réaction et de diminuer les risques de création de

11 L'utilisation des pinces optiques touche de nombreux domaines de la biologie. Ces pinces sont utilisées pour travailler notamment

sur les chromosomes (séparation des chromosomes lors de la division cellulaire), les mitochondries ou les microfilaments. Il est

également possible d'utiliser le LASER à la fois comme pince (maintien de la cellule) et comme ciseaux (découpage précis de la

cellule) (Berns, 1998). Récemment Arai et al. (1999) sont parvenus à l'aide de pinces optiques à faire des noeuds dans des filaments

d'actine et d'ADN et ont prouvé que l'ADN était plus solide que l'actine.


30

chimères (voir §3.4.2.2). Les biais inhérents à la PCR rendent difficile une approche quantitative même

si de nombreuses techniques ont été proposées (Ferré et al., 1994 pour revue; Lee et al., 1996; Poltz

et Cavanaugh, 1997). Le développement des techniques de PCR quantitative en temps réel permet

désormais de suivre l'évolution des produits d'amplification à l'aide d'amorces marquées12 (Patel et al.,

1998; Pahl et al., 1999).

Le clonage des produits de PCR est l'étape préalable au tri. Dans la mesure où les fragments

amplifiés sont de petite taille (1,5 Kpb pour l'ADNr 16S) il est possible de les cloner dans des vecteurs

plasmidiques (généralement dérivés du plasmide pBluescript). Il est par contre nécessaire de réaliser

des banques phagiques lorsque l'on souhaite cloner l'ensemble de l'ADN génomique d'un échantillon

pour accéder à des gènes du métabolisme.

Le clonage peut être réalisé directement sur produits de PCR en utilisant le principe du TA-

cloning (Mead et al., 1991) ou après digestion du produit de PCR et d'un vecteur afin de réaliser des

clonages en bouts francs et ou en bouts cohésifs. L'avantage de la dernière méthode est de connaître

l'orientation du fragment inséré, mais le traitement du produit de PCR par des enzymes peut entraîner

une digestion partielle de ce dernier. Il n'est alors pas possible d'accéder à la séquence du gène dans

son intégrité.

3.3.1.5 Le criblage et le séquençage

Une fois les fragments clonés il est nécessaire de vérifier la nature de l'insert et sa taille. Il est

alors possible d'hybrider directement les colonies à l'aide de sondes spécifiques des ARN

ribosomiques ou plus simplement extraire le plasmide ou de réamplifier directement sur colonies

l'insert à l'aide d'amorces spécifiques du plasmide flanquant le site de clonage (T3, T7, M13, reverse,

universelle par exemple).

Afin de réduire le coût de séquençage de l'étude il peut être intéressant de réaliser un premier

tri parmi les clones de la banque. Des classes, ou OTU (Moyer et al., 1994), ou phylotypes (Ward et al.,

1998) peuvent être définis par comparaison des profils de restriction des inserts coupés à l'aide

d'enzymes tétramériques (RFLP, AFLP, ARDRA). Le choix des enzymes de restriction va conditionner

la qualité du tri (Moyer et al., 1996). Il est possible de coupler la RFLP à un marquage fluorescent. On

observe la migration des fragments de restriction marqués sur un gel de séquençage: T-RFLP (Liu et

al., 1997; Pukall et al., 1998; Chin et al., 1999; Marsh, 1999). On peut aussi analyser les profils

obtenus après séquençage des différents clones sur une seule base (Ward et al., 1990b). Suzuki et

al. (1998) analysent quant à eux le polymorphisme de taille de fragments d'ADNr 16S amplifiés.

Récemment la diminution des coûts ainsi que la simplification des techniques de séquençage a

permis de généraliser l'analyse de la totalité de la banque par séquençage. On séquence alors les

12 Les entreprises BioRad et Perkin Elmer proposent par exemple des systèmes de PCR quantitative clé en main (iCycler et Gene

Amp, TaqMan respectivement).


31

clones à l'aide d'une seule amorce dans un sens (par exemple l'amorce 515F (nos études) ou l'amorce

533F (Hugenholtz et al., 1998a).

L'utilisation de séquenceurs automatiques ou le recours à des entreprises réalisant le

séquençage "à façon" a permis de grandement faciliter l'étape de séquençage dans une analyse de

diversité. L'utilisation de jeu d'amorces marquées réparties sur l'ensemble de l'ADNr 16S tous les 200

à 400 pb (cf. figure 1.4) permet de couvrir l'ensemble de la molécule en lecture double ou triple

(Edwards et al., 1989).

Figure 1.4. Exemple de jeu d'amorces permettant de couvrir l'ensemble du gène de l'ADNr 16S

L'analyse de la séquence est réalisée à l'aide des techniques de phylogénie classique

(méthodes de distance, de maximum de vraisemblance et de maximum de parcimonie) en comparant la

séquence du clone avec les séquences des micro-organismes déposées dans les banques de

données (Maidak et al., 1999).

3.3.2 Les sondes nucléiques

A la différence des techniques d'analyse par extraction et séquençage de l'ADNr 16S,

l'utilisation des sondes nucléiques permet d'accéder individuellement à chaque cellule. Cette

technique implique la formation d'un duplex entre une sonde nucléique et un ARNr cible. Comme

l'indique la figure 1.3, les sondes peuvent être utilisées aussi bien sur de l'ADN fixé sur membrane (Dot

ou Slot Blot après Southern), directement sur les colonies de clones (Grunstein et Hogness, 1975),

sur des cultures d'enrichissement ou sur souche pure (Whole-cell hybridation) ou sur des échantillons

naturels (hybridation in situ). Pour marquer la sonde on utilise soit des radioéléments (ATP-35S ou ATP-32P) (Giovannoni et al., 1988) soit des enzymes (Amann et al., 1992b) soit des marqueurs fluorescents

(fluorescéine, rhodamine, CY3, etc.); on parle alors de FISH (Fluorescent In-Situ Hybridization) (Delong

et al., 1989; Amann et al., 1990 a et b; Stahl et Amann, 1991). On retiendra deux publications

décrivant en détail les principes et les procédures d'hybridation sur membranes et cellules (Stahl et

Amann, 1991; Johansson, 1996).

3.3.2.1 La construction des sondes nucléiques

La succession de domaines, de conservés à très variables, sur la molécule d'ADNr 16S permet

de disposer de sondes au spectre plus ou moins large (de l'espèce au domaine cf. tableau 1.10). La

spécificité de la sonde s'accroît à mesure qu'elle s'hybride dans un domaine de plus en plus variable.


32

Tableau 1.10. Exemple de différentes sondes ayant des niveaux de spécificité différents.

Nom de la sonde Spécificité Référence

S-*-Univ-1390-a-A-18 universelle Zheng et al., 1996

S-D-Bact-0338-a-A-18 domaine : Bacteria Amann et al., 1990a

S-D-Arch-0915-a-A-20 domaine : Archaea Amann et al., 1990b

S-K-Cren-0499-a-A-18 royaume : Crenarchaeota Burgraff et al., 1994

S-Sc-aProt-0019-a-A-17 sous classe : Proteobacteria α Manz et al., 1992.

S-G-Dsbb-0660-a-A-20 genre : Desulfobulbus Deveureux et al., 1992

S-S-Thip-0829-a-A-21 espèces : Thioplaca araucae, T. chileae Teske et al., 1995

Une grande partie des sondes ont été dessinées pour être spécifiques de l'ARNr 16S et un

grand nombre de publications décrivent la construction de ces sondes13, par exemple : sondes

générales (Amann et al., 1990b), sondes pour méthanogènes (Raskin et al., 1994a), sondes pour les

différentes sous-classes des Proteobacteria (Manz et al., 1992) ou pour les Proteobacteria δ sulfato-

réductrices (Devereux et al., 1992). Des auteurs ont ciblé d'une manière similaire l'ARNr 23S (Ludwig

et al., 1994; Trebesius et al., 1994) ou les gènes codant pour des activités métaboliques spécifiques

(Ogram et Sayler, 1988). Une technique alternative de construction de sondes a été proposée par

Fani et al. (1993). Ces derniers ont utilisé comme sondes des fragments spécifiques produits par

RAPD. Ces fragments pouvaient alors cibler l'ensemble du génome. Une technique de construction

de sondes par hybridation soustractive a été proposée par Mau et Timmis (1998) pour obtenir des

sondes très spécifiques (d'un clone par exemple) en limitant ainsi le nombre de séquences identiques

à analyser.

L'accessibilité de la sonde à l'ARN est le second facteur qui va influer sur la qualité de la sonde.

La forte structure secondaire de la molécule d'ARNr (Gutell et al., 1994) impose des contraintes

structurales d'hybridation qui peuvent réduire considérablement l'intensité du signal (Fuchs et al.,

1998).

L'un des paramètres importants de l'hybridation est la température de fusion (Tm). Cette dernière

définit pour un oligonucléotide la température d'équilibre à laquelle la moitié du duplex sonde-cible est

dissociée. La Tm est dépendante de la concentration en oligonucléotides mais est indépendante du

temps (situation d'équilibre). La Td ou température de dissociation est la température pour laquelle

50% du duplex reste intact pour une durée de lavage définie dans des conditions de non-équilibre

(donc Td peut être différent de Tm). La Td est la variable expérimentale de référence, elle définit la

température de lavage de posthybridation pour laquelle 100% des hybridations non spécifiques sont

dissociées (cf. tableau 1.11).

Une fois la sonde construite il est nécessaire de la valider en vérifiant sa spécificité dans un

premier temps sur Dot blot contre des ARN ou des ADN de souches s'hybridant ou non avec la sonde

13 Une banque de séquence de sondes (OPD: Oligonucleotide Probe Database) a été créée et est disponible sur le réseau

(http://www.cme.msu.edu/opd/). Elle n'a malheureusement pas été remise à jour récemment (Alm et al., 1996).


33

puis en testant la sonde sur culture pure ou mélange de culture pure (voir par exemple Harmsen et al.,

1997b).

Tableau 1.11. Caractéristiques de la température de dissociation (Td)

La Td est déterminée par : La Td est dépendante de :

Ø le nombre de liaisons hydrogène entre bases

complémentaires,

Ø le degré de "stacking" (échange d'électrons) des

bases adjacentes sur une même chaîne,

Ø les interactions entre les phosphates (chargés

négativement) les cations en solution.

Ø la structure du duplex,

Ø la séquence de la chaîne,

Ø la longueur de la chaîne,

Ø le nombre, le type et la position des mésappariements,

Ø la présence de bases désappariées en fin de chaîne,

Ø des conditions de lavage et d'hybridation.

3.3.2.2 L'utilisation des sondes en dot blot

Les sondes marquées peuvent être utilisées en dot blot pour qualifier voire quantifier un type

de micro-organismes (s'hybridant avec la sonde) par rapport à une population totale dont l'ADN serait

fixé sur membrane. La présence ou l'absence du micro-organisme sera liée à l'hybridation ou non de la

sonde. L'intensité de l'hybridation par rapport à une sonde plus générale (par exemple une sonde

universelle ou domaine spécifique) pourra refléter la quantité de micro-organismes présents dans

l'échantillon. Cette intensité est toutefois fortement liée au nombre de ribosomes dans la cellule

(variant de 103 à 105 selon les organismes et l'état cellulaire) et à la qualité d'extraction d'ADN.

3.3.2.3 Les sondes en hybridation in situ

A la différence des hybridations sur colonies ou sur membrane, les hybridations sur cellules

entières permettent d'accéder directement à l'ARNr sans endommager la structure pariétale de la

cellule et donc d'accéder en plus du caractère phylogénétique ou métabolique lié à la sonde à un

caractère morphologique. Olsen et al., (1986) proposent les premiers d'utiliser les sondes marquées

pour identifier et compter les cellules dans des échantillons environnementaux. Le premier essai est

réalisé à l'aide de sondes radioactives (Giovannoni et al., 1988). L'hybridation consiste en une

première phase de perméabilisation de la cellule et de fixation des acides nucléiques à l'aide de

paraformaldehyde le plus souvent. Puis les cellules sont fixées sur une lame enduite de gélatine. Elles

sont incubées sur lame en présence de la sonde marquée dans des conditions de stringence qui sont

définies par la température d'hybridation ou la quantité de formamide présente dans le tampon. Après

lavage, les cellules peuvent être observées sous microscope à épifluorescence. Il est possible de

combiner l'hybridation de plusieurs sondes (ayant des spécificités différentes) au sein d'un même

échantillon par l'utilisation de différents fluorochromes (Amann et Kuhl, 1998). Il est aussi possible

d'utiliser plusieurs sondes ayant la même spécificité mais des sites d'hybridation différents afin de

détecter des micro-organismes en très faible quantité (Lee et Kemp, 1994).

Des comparaisons des différentes méthodes de quantification des cellules ont été entreprises

par Karner et Furhman (1997). Les techniques les mieux corrélées sont les sondes nucléiques et les


34

techniques d'autoradiographie. Ces deux techniques détectent toutefois moins de cellules que le

comptage par DAPI.

Une technique de transcription reverse in situ (ISRT) a été développée afin de pouvoir détecter

plus facilement les bactéries actives d'un échantillon (Chen et al., 1997). Les hybridations, sur des

ADNc, à l'aide de sondes spécifiques des ARNr ou de certains ARNm, permettent d'obtenir des

signaux plus puissants (sur les bactéries actives) que par simple FISH.

3.3.3 La DGGE

3.3.3.1 Principe

Le principe de la DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) est fondé sur la séparation

d'un double brin d'ADN sous l'action de la chaleur ou d'un dénaturant (Fischer et Lerman, 1979). La

température à laquelle le duplex est détruit est conditionnée par deux facteurs :

Ø Le nombre de liaisons hydrogène entre les bases complémentaires. Ainsi une liaison GC (3

liaisons hydrogène) est détruite à une température plus élevée qu'une liaison AT (2 liaisons

hydrogène)

Ø L'attraction entre des bases voisines sur un même brin ou "stacking".

La molécule d'ADN aura donc une Tm (ou température de fusion) qui variera selon les domaines

et qui sera fonction de sa séquence nucléique. Deux molécules d'ADN proches, différant d'un seul

nucléotide dans une zone à faible température de fusion, auront deux températures de fusion

différentes. Lors d'une migration électrophorétique dans un gradient croissant de dénaturant

(habituellement formamide ou urée), la mobilité de la molécule d'ADN décroît alors que les zones à

faible température de fusion se dissocient. La structure de l'ADN, alors en simple brin, stoppe la

migration de la molécule. Pour éviter la dénaturation totale du double brin, une structure à très haute

température en fusion (très riche en GC) est associée lors de l'amplification. Une PCR est alors réalisée

à l'aide d'une amorce portant en 5' une succession de 40 GC : le GC clamp.

La mise au point de la technique réside essentiellement (Michaelides et al., 1995; Cotton, 1997) :

Ø dans le choix des amorces. Elles permettent d'amplifier de 100 à 400 pb dans une zone à faible

point de fusion. Le "GC clamp" doit être proche de l'extrémité amplifiée ayant le plus fort point de

fusion. Il est donc nécessaire de connaître avant l'amplification les zones qui auront une

température de fusion plus ou moins élevée. Dans le cas de l'ADNr 16S ces zones peuvent être

connues en raison de la forte stabilité de la structure secondaire de la molécule.

Ø dans la préparation du gel (nature et établissement du gradient, tension et durée

d'électrophorèse).

Dans les deux cas des outils informatiques permettent d'assister le scientifique pour déterminer

le type de gradient à réaliser dans le gel et la durée de migration estimée de l'échantillon.

En résumé les avantages et les désavantages de la méthode peuvent être présentés dans le

tableau 1.12.


35

Tableau 1.12. Avantages et désavantages de la technique de DGGE

AVANTAGES DESAVANTAGES

1. Méthode très sensible

2. En routine, la mise en oeuvre est simple et ne requiert

pas l'emploi de radio éléments.

3. Les fragments de PCR après migration peuvent être

récupérés et séquencés.

1. La phase de mise au point peut être longue

2. Il est préférable d'acheter un appareillage spécifique

3. Le séquençage des fragments est limité à 400 pb.

Problématique pour réaliser des phylogénies par la suite

4. Les gènes ou régions très riches en GC sont

difficilement analysables par DGGE.14

3.3.3.2 La DGGE en écologie microbienne

Initialement développée dans le domaine médical pour détecter des mutations impliquées dans

des maladies génétiques, cette technique a été utilisée pour distinguer les différentes populations de

micro-organismes dans des échantillons naturels après amplification de leur ADNr 16S (Muyzer et al.,

1993; Muyzer, 1999).

Cette technique permet :

Ø la comparaison d'échantillons différents : évolution d'une communauté dans le temps (Santegoeds

et al., 1998b), action de différents nutriments et de l'inoculum dans des cultures en "batch" (Jackson

et al., 1998a) ou action des facteurs environnementaux dans un milieu défini (Santegoeds et al., 1996;

Ward et al. 1997),

Ø une identification des souches présentes dans un échantillon par comparaison du profil de migration

avec des profils obtenus sur des cultures pures, par séquençage des bandes après excision (Ferris et

al., 1996a) ou par hybridation sur le gel d'électrophorèse à l'aide de sondes spécifiques (Muyzer et al.,

1995).

3.3.3.3 Les variantes de la DGGE

Il existe différentes variantes de la DGGE selon le type de gradient utilisé (TGGE ou CDGE).

D'autres techniques (SSCP, HMA) sont elles aussi fondées sur les migrations de structures

secondaires d'ADNr différents.

Ø TGGE : Temperature Gradient Gel Electrophoresis. Le gradient dénaturant chimique est remplacé

par un gradient de température qui augmente au cours de la migration. (Zoetendal et al., 1998; Eichner

et al., 1999)

Ø CDGE : Constant Denaturant Gel Electrophoresis. La concentration d'agent dénaturant est

constante dans le gel et équivalente à la température de la plus base zone de fusion. Cette technique

utilisée lorsque l'on ne connaît pas la localisation des zones de mutations requiert l'utilisation de

plusieurs gels reproduisant chacun différentes conditions de dénaturation.

Ø La technique de SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) est fondée sur la différence de

structure secondaire et donc de migration au sein d'un gel non dénaturant entre deux fragments

14 Wu et al. (1999) ont proposé une méthode combinant la CDGE et la DGGE pour l'analyse des régions très riche en GC.


36

d'ADN simples brins ayant des séquences différentes (Lee et al., 1996; Schwieger et Tebbe, 1998).

Plus facile à mettre en oeuvre que la DGGE, la SSCP nécessite l'utilisation d'ADN témoin pour identifier

les micro-organismes auxquels correspondent les bandes (Widjojoatmodjo et al., 1994). Elle peut

aussi être utilisée pour distinguer des espèces entre elles (Borin et al., 1997).

Ø La technique HMA (Heteroduplex Mobility Assay) consiste elle aussi à faire migrer des fragments

d'ADNr 16S dénaturés puis renaturés de différentes espèces. Au cours de la renaturation des

hétéroduplex se forment dont la mobilité est fonction des structures secondaires recréées dans les

régions non-appariées. La migration a lieu sur gel de polyacrylamide mais elle permet surtout de

distinguer des populations peu complexes (Espejo et al., 1998)15.

3.3.4 Les autres techniques

3.3.4.1 Les renaturations d'ADN totaux

La technique proposée par Torsvik et al. (1990a) repose sur la mesure de la vitesse de

renaturation d'un mélange d'ADN préalablement dénaturé. Plus l'échantillon est constitué d'une

population complexe plus il mettra de temps à se renaturer. Il ne s'agit pas d'une identification des

micro-organismes impliqués dans la diversité de la population mais de la mesure d'un indice de

diversité.

3.3.4.2 L'analyse des fragments de restriction.

Des endonucléases de restriction sont utilisées pour générer des fragments de différentes

tailles sur de l'ADN génomique ou sur de l'ADNr 16S amplifié. La comparaison des profils de restriction

sur gel de polyacrylamide permet d'accéder simplement et d'une manière peu onéreuse à la diversité

de l'échantillon (Moyer et al., 1994; Martinez-Murcia et al., 1995). Moyer et al. (1996), sur la base d'une

simulation réalisée à l'aide de différentes enzymes tétramériques et des séquences disponibles sur le

RDP, a proposé une liste d'enzymes particulièrement résolutives pour des RFLP sur ADNr 16S. S'il est

possible de comparer les communautés entre elles par cette technique, il n'est pas possible

d'identifier les éléments de ces communautés. Une étape de séquençage est alors indispensable.

3.4 De la diversité phylogénétique à la diversité physiologique

Si les techniques d'écologie microbienne moléculaire fondées sur l'étude de l'ADNr 16S

permettent d'accéder et de quantifier la diversité phylogénétique associée à un milieu, ces techniques

ne permettent malheureusement pas d'accéder à la diversité métabolique. En effet à l'exception de

quelques grands groupes phylogénétiques correspondant à une type métabolique donné, tels que

les Archaea méthanogènes ou les cyanobactéries, le rôle fonctionnel d'un micro-organisme détecté

15 Les mêmes auteurs proposent de corréler les profils de migration aux pourcentages de similitudes sur l'ADNr 16S entre souches.


37

"moléculairement" reste dans bien des cas non défini. De plus l'isolement et la caractérisation des

micro-organismes ne nous informent que sur leur capacité métabolique dans des conditions définies.

Aussi pour accéder aux diverses contributions métaboliques au sein de l'environnement différentes

approches ont été proposées, elles consistent soit à étudier les gènes du métabolisme, soit à étudier

les ARNm.

Comme nous l'évoquerons dans la partie suivante (les habitats microbiens), à l'instar des études

réalisées sur les gènes codants pour l'ARNr 16S, des stratégies fondées sur l'emploi de sondes

nucléiques et sur l'amplification des gènes du métabolisme à l'aide d'amorces spécifiques ont déjà été

employées. Bien que le degré de conservation des gènes codants pour des fonctions métaboliques

soit moins important que celui des gènes d'ARNr, un certains nombre de gènes sont suffisamment

conservés pour pouvoir déterminer des sondes ou des amorces spécifiques. Ainsi il est possible

d'amplifier la bisulfite réductase, l'APS réductase ou l'hydrogénase impliquées dans des mécanismes

de sulfato-réduction, la méthane monooxygénase soluble (sMMO) ou particulaire (pMMO ou pmoA)

impliquées dans les phénomènes de méthanotrophie, l'ammoniaque monooxygénase (amoA)

impliquée dans la nitrification, les gènes de fixation de l'azote atmosphérique (opéron nif), la sous-

unité alpha de la méthyle coenzyme-M réductase (mer) impliquée dans la méthanogénèse ainsi que

des gènes impliqués dans des résistances aux métaux (cf. chapitre 2 §3.1.3 et §5.3.2). L'utilisation de

sondes pour des hybridations in situ est rendue aléatoire par le fait qu'à la différence des ARNr, les

gènes codant pour des fonctions métaboliques sont présents en bien moins grande quantité. Pour

circonvenir cette limitation une technique d'amplification in situ a été mise au point (Hodson et al.,

1995). Cette technique permettrait d'amplifier des gènes, des ARNm et des ARNr, mais elle n'a jusqu'à

présent été utilisée que pour étudier des cellules isolées ou des communautés peu complexes

(Tolker-Nielsen et al., 1997; Holmstrøm et al., 1999; Tani et al., 1998). L'approche la plus utilisée

consiste à amplifier directement les gènes à partir d'un pool d'ADN génomique directement extrait de

l'échantillon, puis d'une manière analogue à l'ADNr 16S, à réaliser des phylogénies en comparant les

séquences des gènes clonés avec celles de micro-organismes isolés. Les biais inhérents aux

techniques d'extraction de l'ADN, d'amplification et d'analyse phylogénétique (cf. §3.5) peuvent

malgré tout entacher cette analyse. De plus l'amplification d'un gène n'implique pas obligatoirement

que celui-ci soit transcrit. Il est donc préférable d'utiliser des techniques de PCR compétitive pour

quantifier la présence du gène dans une population (Lee et al., 1996b; Kowalchuk et al., 1999). L'une

des solutions les plus élégantes consiste donc à analyser les ARNm dont la présence dans le

cytoplasme procaryotique est directement corrélée à l'expression du gène par le micro-organisme.

Cette technique fondée sur l'extraction des ARNm suivie d'une RT-PCR à permis d'étudier

l'expression des gènes de résistance au mercure dans des échantillons d'eau (Nazaret et al., 1994),

les gènes de la manganèse péroxydase dans le sol (Bogan et al., 1996), de la naphtalène

dioxygénase dans des eaux souterraines (Wilson et al., 1999), de la fixation de l'azote chez la

communauté symbiotique du termite Neotermes kokunensis (Noda et al., 1999). La quantification de

l'expression des ARNm peut être effectuée par PCR compétitive (Tsai et Wiltbank, 1996). La

technique de "Differential Display" employée couramment dans l'étude des ARNm d'Eucarya est aussi


38

applicable à partir d'ARNm procaryotique (Fleming et al., 1998), il n'est alors pas nécessaire de

connaître la séquence des ARNm dont on souhaite suivre l'induction. Une dernière technique

consiste à rechercher une fonction métabolique dans un environnement par clonage d'une banque

d'ADN génomique dans Esherichia coli, puis par criblage de la banque en suivant l'expression des

gènes clonés. Il a été possible à l'aide cette technique, à partir de différents échantillons de sol, de

détecter la présence de gènes codants pour l'utilisation du 4-hydroxybutyrate (Henne et al., 1999).

Cette technique est toutefois très laborieuse puisqu'il a fallu cribler 930000 souches d'E. coli pour

détecter 36 clones positifs dont seuls 5 possédaient un plasmide recombinant. Une étude similaire,

passant toutefois par une étape préalable clonage dans une banque de phage, a été entreprise pour

rechercher des chitinases à partir d'échantillons d'eau de mer (Cottrell et al., 1999)

L'analyse d'un gène codant pour une fonction du métabolisme ne nous renseigne pas sur la

position phylogénétique du micro-organisme qui exprime ce gène. Seules les études de

communautés très simples telles que les associations symbiotiques n'impliquant généralement qu'un

hôte et un symbiote permettent d'attribuer à un micro-organisme défini, à la fois une position

phylogénétique et une fonction métabolique. Ainsi, il a été possible d'attribuer les gènes d'une

nouvelle famille de bisulfite réductase dissimilatoire aux épibiotes de l'annélide polychète Alvinella

pompejana (Cottrell et Cary, 1999) et les gènes codants pour une flagelline au symbiote de Riftia

pachyptila (Millikan et al., 1999). Une autre méthode consiste à cloner des grands fragments d'ADN

génomique à partir d'une extraction directe d'ADN et à rechercher dans les banques des fragments

portant les gènes codant pour l'ADNr 16S (Stein et al., 1996). Il est alors possible d'étudier les gènes

adjacents disposés sur le même "contig". Comme dans le cas précédent il n'est pas garanti que les

gènes détectés soient exprimés, de plus l'effort d'échantillonnage à fournir pour détecter les gènes

d'ADNr 16S peut parfois être démesuré. Cette technique employée dans l'étude d'une communauté

simple à permis de caractériser l'ADNr 16S et les gènes de l'ADN polymérase de l'Archaea

Crenarchaeum symbiosum associée à l'éponge Axinella mexicana (Preston et al., 1996; Schleper et

al., 1997b).

Les imposants projets de séquençage génomique humain et procaryotique ont favorisé le

développement des nanotechnologies. Nombre de ces développements ne sont encore qu'à l'état

de pré-projet mais la demande en systèmes d'analyse rapides et bon marché de la part des industriels

les imposeront probablement très rapidement au sein des laboratoires. L'effort de recherche semble

s'être porté sur différentes technologies de puces à ADN fondées sur la détection du signal par

fluorescence (Marschall et Hodgson, 1998; Schena et al., 1998; Gerhold et al., 1999) ou par

spectrométrie de masse (Tang et al., 1999) ainsi que sur la miniaturisation des dispositifs de migration

d'ADN utilisant des systèmes électrophorètiques en microcapillaires de silicone (Chou et al., 1999) ou

des "crochets" animés de mouvements browniens (Bader et al., 1999). L'écologie microbienne n'a

pour l'instant que très peu bénéficié du développement de ces techniques, seule une étude décrit la

mise au point (Guschin et al., 1997b) puis l'emploi (Guschin et al., 1997a) de puces à ADN pour

détecter différentes communautés de bactéries nitrifiantes. Les programmes de séquençage

génomique ont quant à eux fourni de nombreuses informations sur l'organisation génomique, sur la


39

fonctionnalité génétique et sur les mécanismes évolutifs impliqués dans les micro-organismes

séquencés (Olsen et Woese, 1996; Karp et al., 1998, 1999; Ge et Taylor, 1999). Ils permettent

désormais de comparer les micro-organismes non sur la base de caractères phénotypiques ou

phylogénétiques mais sur l'ensemble des informations contenues dans leur génome (Koonin et

Galperin, 1997; Rastan et Beeley, 1997).

3.5 Les biais des techniques moléculaires

A l'instar des techniques culturales, les techniques moléculaires sont elles aussi soumises à de

nombreux biais qui peuvent lourdement entacher l'analyse de la diversité microbienne d'un

échantillon. Ces biais peuvent intervenir à différents stades de l'analyse : lors de l'échantillonnage, de

la conservation de l'échantillon, de la lyse cellulaire, de l'amplification de l'ADNr 16S, de l'analyse des

séquences. Dans le cadre des études par hybridation in situ la construction et la spécificité de la

sonde, l'état cellulaire et la perméabilité des membranes ainsi que la sensibilité des méthodes

d'analyse peuvent influencer les résultats de l'analyse. Trois publications récentes font le point sur les

principaux bais de ces techniques. La première (Amann et al., 1995) s'attache plus particulièrement à

décrire les biais des techniques d'hybridation in situ et propose des techniques pour améliorer la

sensibilité de la méthode. La seconde (Wintzingerode et al., 1997) fait un inventaire très complet des

biais majeurs rencontrés dans les études par amplification et séquençage. La troisième (Head et al.,

1998) fait le point sur dix années d'études moléculaires ainsi que sur les biais de l'ensemble de ces

techniques.

3.5.1 Echantillonnage et conservation des échantillons

En dehors de très rares milieux où la diversité microbienne est très restreinte (par exemple

symbiose réduite à un micro-organisme) l'échantillon prélevé dans le milieu devra rendre compte le

plus fidèlement possible de l'ensemble des espèces présentes dans l'environnement. Il est donc

nécessaire de connaître les conditions physico-chimiques de chaque échantillon.

Dans la mesure où il n'est pas possible de traiter (lyse, extraction) l'échantillon dès son

prélèvement, il est nécessaire de le conserver dans les conditions qui permettront de conserver

l'intégrité des acides nucléiques. Une étude a comparé les effets de différentes techniques de

conservation sur la composition de banques de clones d'ADNr 16S (Rochelle et al., 1994). Il a été

observé que les échantillons congelés rapidement et maintenus sous atmosphère anaérobie (non-

oxydante) présentent une diversité bien plus importante que les échantillons conservés en aérobiose

ou congelés plus tardivement. La congélation tardive des échantillons est source selon les auteurs

d'enrichissement de certains phylotypes.


40

3.5.2 Les techniques de PCR

3.5.2.1 La lyse cellulaire et l'extraction des acides nucléiques

La lyse cellulaire est une étape cruciale de l'analyse de la diversité. Elle devra détruire les parois

et membranes des micro-organismes en endommageant le moins possible les acides nucléiques.

L'efficacité de la technique de lyse cellulaire sur un échantillon environnemental est d'autant plus

difficile à déterminer que l'on ne connaît pas le type et la quantité de cellules à lyser. On sait toutefois

que les techniques de lyse bactérienne doivent être modifiées pour lyser des Archaea, que les

bactéries Gram + sont plus difficiles à lyser que les Gram -, que les spores et les petites cellules

résistent mieux à la lyse.Tableau 1.13. Les techniques de lyse cellulaire

Techniques physiques Techniques chimiques

congélation- décongélation

Azote liquide

pilon et mortier

bead beating

Presse de French

sonication - micro-onde

chauffage à 100°C

Résine d'échange d'ions (Chelex)

solvants

détergents (SDS)

enzymes

lysozyme

protéinase K

N-acetylmuramidase

Lysostaphin

Achromopeptidase

Les techniques de lyse les plus efficaces sont celles qui combinent à la fois les traitements

physiques et chimiques (cf. tableau 1.13). Toutefois elles peuvent conduire à une forte fragmentation

de l'ADN et favoriser la production d'amplifiats chimériques. Aussi est-il parfois nécessaire de simplifier

la technique d'extraction afin d'avoir un ADN de meilleure qualité. On est alors confronté à la présence

de contaminants tels que les acides humiques (pour des échantillons de sols) ou les métaux lourds qui

peuvent inhiber l'action de certaines ADNpolymérases.

La solution idéale consisterait à utiliser plusieurs techniques de lyse et à rassembler le résultat

des différentes extractions pour réaliser l'amplification.

3.5.2.2 L'amplification par PCR

L'amplification est l'une des sources majeures de biais dans l'étude de la diversité. Ces biais sont

introduits pour différentes raisons :

Ø inhibition de la PCR en raison de la présence de contaminants chimiques ou organiques (Wilson,

1997)

Ø l'état physiologique de la cellule va influer sur la qualité de l'amplification : les ADN des cellules à l'état

quiescent ou létal vont être plus difficilement amplifiables (Silva et Batt, 1995)


41

Ø amplification préférentielle de certaines molécules : celle-ci est liée au nombre de copies de l'opéron

rrn16 (de 1 à 14) (Farrelly et al., 1995), au choix des amorces (Reysenbach et al., 1992; Brunk et Eis,

1998), à l'échantillon (Suzuki et Giovannoni, 1996), à la composition en GC de la séquence (Dutton et

al., 1993), aux proportions initiales de séquences dans l'échantillon (Suzuki et Giovannoni, 1996), aux

séquences adjacentes de la zone à amplifier (Hansen et al., 1998)

Ø formation de molécules chimériques : lors de l'appariement les simples brins d'ADN vont s'associer

entre eux plutôt qu'avec les amorces, en particulier lorsque l'ADN a été fragmenté (Pääbo et al., 1990;

Liesack et al., 1991; Kopczynski et al., 1994; Wang et Wang, 1996)

Ø formation de mutant de délétion : la structure secondaire de l'ADNr 16S va persister lors de la

dénaturation et la polymérase va "sauter" certaines structures résistantes

Ø mauvaise incorporation de la polymérase : selon les enzymes utilisées et les conditions

d'amplification le taux d'erreur variera d'une toutes les 300 bases à une toutes les 5000 bases.

Ø variation des séquences des différentes copies dans l'opéron rrn au sein d'une même souche (voir

§ 3.1.3 et Ninet et al., 1996; Reischl et al., 1998).

Ø présence de séquences de contaminants de la réaction : les tampons de réaction, l'eau ou les tubes

peuvent être source de contaminants qui passent alors pour faire partie de la population indigène de

l'échantillon (Tanner et al., 1998). L'une des solutions est d'exposer le mélange d'amplification aux

U.V. (Goldenberger et Altwegg, 1995)

3.5.2.3 Le clonage et l'analyse des séquences

Il semblerait que la technique de clonage influence la composition de la banque de clones. En

particulier pour les clonages en bouts cohésifs où il est nécessaire d'utiliser des enzymes de restriction

qui peuvent couper le fragment d'ADNr 16S (Rainey et al., 1994b). L'orientation du fragment cloné

peut elle aussi générer des différences de profils lors de l'analyse par RFLP de la banque en cas de

clonage par TA-cloning. Pitule et Pace (1999) ont proposé un vecteur spécialement construit pour le

clonage de l'ADNr 16S dans une orientation donnée.

Le criblage de la banque doit être effectué en tenant compte des espèces minoritaires. Ainsi,

dans un échantillon contenant 108 cellules.g-1 et une population présente à 102 ou 104 individus.g-1, il

sera nécessaire de cribler 104 à 106 clones pour statistiquement détecter cette population17.

La détection des chimères est une étape essentielle lors de l'analyse des séquences. Si

différents auteurs ont proposé des techniques pour réduire le nombre de chimères lors de l'étape de

PCR (voir § 3.4.2.2 et Wintzingerode et al., 1997), les outils pour détecter ces séquences sont assez

réduits. Il s'agira d'utiliser le programme CHIMERA sur le site du RDP (Robinson-Cox et al., 1995) ou de

comparer la topologie d'arbres phylogénétiques en n'utilisant que certaines parties de l'alignement

(par exemple de la partie 5' à la base 500, de 500 à 1000 et de 1000 à la partie 3'). Ces séquences

16 Ce nombre de copies peut être variable au sein d'une même espèce. Prüß et al. (1999) détectent des séquences signatures

spécifiques d'une part de souches psychrotolérantes et d'autre part de souches mésophiles sur différentes copies de l'ADNr 16S de

Bacillus cereus dont le nombre varie de 6 à 10 selon les souches.17 Lors de l'amplification, les ratios cellulaires ne sont pas maintenus, ce nombre de clones à analyser est donc théorique.


42

seront d'autant plus difficiles à détecter qu'elles sont formées entre espèces proches ou entre copies

d'un même opéron (Wang et Wang, 1997).

3.5.3 Les techniques d'hybridation

Les principaux biais des techniques d'hybridation sont liés d'une part à la perméation des

cellules, et d'autre part à l'état cellulaire et à la construction des sondes.

Ø Pour la fixation des cellules et leur perméation l'utilisation d'aldéhyde comme le

paraformaldéhyde (agent de pontage) va être plus efficace sur les bactéries Gram - alors qu'un

dénaturant comme l'éthanol fixera mieux les Gram +. Pour les Gram + il est parfois nécessaire d'utiliser

du lysozyme pour faciliter la pénétration de la sonde.

Ø Des cellules actives dans l'échantillon, donc riches en ribosomes, seront plus facilement

détectées que des cellules en dormance. En effet le taux de croissance est corrélé dans la plupart des

cas avec le nombre de ribosomes par cellule. Le nombre de ribosomes n'est toutefois pas un facteur

limitant de la croissance et de la synthèse protéique chez les bactéries oligotrophes à la différence des

hétérotrophes (Fegatella et al., 1998).

Ø La construction de la sonde devra tenir compte de la spécificité de la séquence. Ainsi pour un

nucléotide de 18 bases, il y a 0,25-18 chance pour détecter une séquence non recherchée. Mais dans

la pratique des hybridations non spécifiques peuvent se produire avec quelques mésappariements

dans la sonde. Il est donc nécessaire de vérifier la validité de la sonde en la confrontant avec les

banques de séquences et par hybridation sur membrane ou sur culture pure.

Ø En jouant sur les conditions d'hybridation, Td ou pourcentage de formamide on modifie la

spécificité de la sonde. Zheng et al. (1996) ont quantifié avec plus de précision des organismes des

trois domaines (Eucarya, Bacteria et Archaea) en diminuant la Td pour différentes sondes universelles.

Ø Le type de marquage de la sonde influera sur la qualité de détection, aussi des nouveaux

marqueurs et des nouvelles techniques de détection ont été développés (Glöckner et al., 1996;

Schönhuber et al., 1997, 1999)

Ø La sonde devra "accéder" à son site d'hybridation sur la molécule d'ARNr 16S. La forte

structure secondaire de l'ARNr ainsi que les interactions avec des protéines peuvent rendre certains

sites inaccessibles. L'utilisation de formamide permet alors de réduire les liaisons hydrogène et

d'accroître l'accessibilité du site. Et en utilisant une sonde dans les régions déjà connues pour donner

des hybridations efficaces il est possible de limiter ce biais (Frischer et al., 1996). Récemment l'équipe

de Amann a établi sur la base de l'ARNr 16S d'E. coli une carte d'accessibilité de la molécule en

comparant par cytométrie en flux l'hybridation de l'ensemble des sondes couvrant les 1500

nucléotides de la séquence avec la valeur de la sonde EUB 338 donnée pour 100% d'hybridation

(Fuchs et al., 1998).


43

3.5.4 Les techniques de DGGE

Les biais de la technique DGGE sont semblables à ceux rencontrés dans les techniques

d'amplification et de séquençage. Dans la mesure où il est nécessaire d'effectuer une amplification de

fragments d'ADNr 16S, l'ensemble des biais d'échantillonnage, d'extraction et d'amplification sont

présents. Seules les bandes de fortes intensités, correspondant aux populations majoritaires ou

majoritairement amplifiées pourront être détectées.

3.5.5 Une solution : l'approche pluridisciplinaire

L'engouement "excessif" du début des années 1990 vis à vis des techniques moléculaires

(Olsen et Woese, 1993; Olsen et al., 1994b; Woese, 1994 a et b) a désormais fait place à une vision

plus pondérée des différentes méthodologies d'étude de la diversité microbienne (Palleroni, 1997;

Amann et Kühl, 1998; Head et al., 1998). Si les biais des techniques culturales sont depuis longtemps

pris en compte, les résultats obtenus par des techniques d'analyse des ARNr peuvent parfois être

surprenants. D'une part :

Ø La grande majorité des séquences obtenues ne sont pas similaires à celles de souches cultivées.

Ø Un grand nombre de séquences bactériennes et archaéennes correspondent à de nouveaux

phylums.

Ø Les séquences de souches isolées de sites d'où provient une collection de clones d'ADNr 16S

sont rarement identiques à celles des clones.

Ø Des séquences de clones obtenus de sites très éloignés peuvent être très similaires.

Ø Des organismes très peu ou pas cultivés peuvent présenter une très grande variabilité

phylogénétique et être ubiquitairement présents dans la nature.

D'autre part :

Ø Les données "de base" d'écologie ne peuvent être obtenues par ces techniques; notamment en

raison des problèmes méthodologiques il est difficile de quantifier les taxons présents dans le milieu.

Ø La qualité des amplifications est dépendante de conditions physiologiques et génomiques

cellulaires que l'on ne peut prévoir.

Ø Il est difficile de définir les propriétés physiologiques, métaboliques et le rôle écologique des

organismes détectés à partir de leur position phylogénétique d'autant plus si ceux-ci forment de

nouveaux phylums.

Ø Les amorces dites "universelles" n'ont été construites qu'en utilisant une très faible fraction des

organismes connus.

Ø La présence d'un grand nombre de séquences similaires est difficile à interpréter : s'agit-il de

microhétérogénéités au sein de l'opéron rrn ou de souches très proches?

Ø La détection et la quantification des cellules par hybridation in situ est actuellement soumise à de

nombreux biais notamment lors de la détection du signal et de la perméation cellulaire.


44

Ø Par amplification (séquençage et DGGE) ou par hybridation il est encore très difficile de détecter les

espèces minoritaires.

Ø Le traitement des banques de clones devrait être soumis à plus de rigueur statistique.

Ø Le pouvoir résolutif de l'ADNr 16S au niveau de l'espèce (qui est l'unité de base en écologie) est

limité. Des valeurs de 95% d'identité peuvent distinguer des espèces différentes, contre 70% de

similitude en hybridation ADN/ADN.

Si les techniques moléculaires ont permis de considérablement accroître le champ des

connaissances en écologie microbienne (cf. partie suivante), il est désormais indéniable que seul

l'emploi combiné de techniques culturales et non-culturales permettra de lier les informations

concernant la diversité et la fonction des communautés microbiennes dans leur environnement. Au

même titre que la taxinomie bactérienne a su intégrer aux techniques classiques d'identification et de

taxinomie numérique les techniques moléculaires et la phylogénie moléculaire, l'écologie microbienne

devra elle aussi intégrer l'ensemble des techniques mises à sa disposition. Cette approche

polyphasique peut s'envisager par l'utilisation conjointe des sondes moléculaires et des

microélectrodes (Schramm et al., 1996), des sondes moléculaires et des mesures d'incorporation

spécifiques (Lee et al., 1999; Ouverney et Fuhrman, 1999), le clonage de grands fragments d'ADN

génomique (Stein et al., 1996), l'utilisation des microscopes confocaux (Manz et al., 1995, 1999;

Harmsen et al., 1996b; Rocheleau et al., 1999) et des pinces optiques (Huber et al., 1995). La

biomasse procaryotique, cette "majorité invisible" telle que la décrivent Whitman et al. (1998), ne

devrait nous être accessible qu'au terme de ces efforts.

Les habitats microbiens


45

La Terre est un écosystème extraordinairement complexe où l'on peut distinguer trois habitats

majeurs : l'atmosphère, le sol et l'eau. Aux habitats naturels se sont adjoints de nouvelles niches

écologiques liées à la présence et aux activités humaines. L'étude de tous ces habitats a longtemps

été limitée aux grandes formes de vie et nombre de textes d'écologie articulaient leur réflexion

uniquement autour de ce qui était visible à l'œil nu. L'utilisation de techniques culturales en

microbiologie, relayé ces dernières années par l'emploi de techniques moléculaires, nous a permis

d'observer à quel point la diversité et le rôle des procaryotes pouvait être prépondérant dans l'équilibre

de la biosphère. Je me propose dans cette seconde partie introductive, après une description

sommaire des différents écosystèmes et des micro-organismes qui y ont été isolés, de présenter une

revue des apports des techniques moléculaires dans l'étude de la diversité de ces milieux. Les

écosystèmes pétroliers et hydrothermaux seront plus particulièrement approfondis. Un arbre

phylogénétique présenté en annexe permettra au lecteur de repérer les différents groupes

phylogénétiques cités dans cette seconde partie.

I Les origines de la vie

1.1 Les premières traces de vie

Aller à la recherche des premières formes de vie sur terre c'est tenter de répondre à ces trois

questions : qu'est ce que la vie? Quand cela a-t-il commencé? Et à quoi ressemblait la Terre à cette

époque?

La première question peut revêtir des aspects tant métaphysiques que physiologiques.

Norman Pace (Pace, 1991; et site web de l'équipe de Norman Pace http://pacelab.berkeley.edu)

répond qu'une forme est considérée comme vivante lorsqu'elle est autoréplicative et réalise une

chimie organique sous une forme libre.

Pour répondre à la seconde et à la troisième question nous disposons d'enregistrements

astronomiques (formation des systèmes solaires et des planètes), d'enregistrements géologiques

(fossiles, mesure d'isotopes, étude des roches, etc.) et d'enregistrements biologiques (la phylogénie

moléculaire).

On considère que la Terre est apparue il y a 4,6 milliards d'années, mais il faut attendre encore

800 millions d'années avant que l'eau liquide apparaisse sur la terre créant ainsi des conditions

compatibles avec la vie telle que nous l'imaginons. Les premières traces fossiles de micro-organismes

datent de 3,6 milliards d'années1. Ce sont des tapis microbiens fossilisés connus sous le nom de

stromatolites. On en retrouve encore en activité en Australie en Amérique et en Afrique dans des

lagunes côtières où dans des sources chaudes. A la différence des stromatolites actuels colonisés par

des cyanobactéries (aérobies) les premiers stromatolites devaient être constitués de phototrophes

1 Il existerait une trace plus ancienne de vie dans des roches prélevées au Groenland. Prélevées dans des sédiments vieux de 3,8 à 3,9

milliards d'années, des roches Isua présentent des rapport isotopiques 13C/12C laissant supposer une origine biologique.


46

anaérobies, l'oxygène sous une forme libre étant apparu il y a 2 à 2,5 milliards d'années. Cette période

correspond à une augmentation de la diversité morphologique des fossiles microbiens laissant

supposer un accroissement de la diversité phylogénétique.

Lorsque la vie est apparue, la Terre présentait des conditions qui nous sembleraient

particulièrement inhospitalières. C'était un environnement très réducteur où les gaz principaux étaient

le méthane, le dioxyde de carbone et l'azote. On retrouvait des traces de sulfures sous la forme H2S et

FeS. Lors du premier milliard d'années la température était alors très élevée (supérieure à 100°C). Ce

n'est que lorsque la Terre a commencé à se refroidir (4 milliards d'années) que la vie a pu se

développer (cf. figure 2.1).

400

300

200

100

°C

4,5 4 3,5 Temps en milliards d’années

“océan magmatique”

Condensation de l’eau

Synthèses abiotiques

Synthèses biotiques

Figure 2.1. Représentation schématique de l'évolution de la température à la surface de la Terre depuis sa formation.

On considère que les premières synthèses de macromolécules comme les acides nucléiques

et les protéines se sont déroulées de manière abiotique sur des surfaces de roches ayant le rôle de

catalyseur. La pyrite (FeS2) a probablement joué un rôle majeur dans ces synthèses où le rayonnement

U.V. était la source principale d'énergie (très importante à l'époque du fait de la quasi absence

d'atmosphère) (Wächtershäuser, 1988).

1.2 Une origine de la vie controversée

L'ensemble de la communauté scientifique semble s'accorder sur le type métabolique des

premiers organismes vivant sur Terre. Il s'agirait d'organismes anaérobies chimiolithotrophes tirant leur

énergie de la réduction du soufre (Pace, 1991; Stetter et al., 1996) ou plus probablement du fer (FeS

ou FeCO3) (Slobodkin and Wiegel, 1997, Vargas et al., 1998), la source de carbone provenant de

molécules organiques abiotiques2 ou du CO2 atmosphérique. La température à laquelle la vie est

apparue est quant à elle sujette à discussion.

Les similitudes observées entre les sources hydrothermales et les conditions retrouvées sur

Terre il y a 4 milliards d'années : milieu très réducteur et anoxique, forte teneur en soufre, en méthane

et métaux lourds, températures élevées, ont conduit les scientifiques, au début des années 70, à

2 La voie d'assimilation du carbone par autotrophie étant un mécanisme complexe il est peu probable qu'il ait précédé l'hétérotrophie.


47

considérer ces écosystèmes comme des lieux possibles d'émergence de la vie sur Terre (Corliss et al.,

1981; Baross et Hoffman, 1985)

A la même époque Woese propose une division tripartite du monde vivant en créant le

domaine des Archaebactéries (Woese, 1987) (devenant par la suite Archaea, Woese et al., 1990) qui

ne regroupait alors que des micro-organismes aux préférendums vitaux extrêmes (très forte

température, très forte salinité, production de méthane, réduction du soufre). Les branches basses de

l'arbre du vivant étaient courtes (donc ayant peu évolué) et essentiellement occupées par des micro-

organismes thermophiles (Bacteria: Aquificales, Thermotogales; Archaea: Crenarchaeota soufre-

dépendantes, Thermococcales et méthanogènes thermophiles) (Stetter et al., 1996). L'émergence

d'un concept de biosphère microbienne souterraine thermophile quelques années plus tard (Gold,

1992) abonda dans le sens d'une origine de la vie thermophile. Or cette proposition va à l'encontre de

la théorie d'un monde à ARN.

On considère que l'apparition de l'ARN a précédé celle de l'ADN (les ribonucléides avant les

desoxyribonucléides). L'ARN jouait un rôle de stockage d'information et un rôle enzymatique. Il

possède encore des capacités catalytiques qui lui permettent d'associer les acides aminés pour former

les protéines (ribosyme). De plus s'il a été prouvé que l'ADN (pour peu qu'il soit super-enroulé) pouvait

résister à de très fortes températures (Forterre, 1996; Forterre et al., 1996), l'ARN quant à lui, est très

rapidement dénaturé à mesure que la température augmente. Il est donc peu probable que les

premiers organismes (à ARN) aient pu supporter les très fortes températures que supportent les

hyperthermophiles actuels3.

De plus les phylogénies réalisées sur les ARNr ont été récemment remises en cause4.

Ø La généralisation des séquençages génomiques permet d'accéder à de nombreuses séquences

protéiques pouvant, au même titre que l'ARNr, servir de base à des phylogénies. Or si la majeure

partie des arbres obtenus sont en accord avec une division tripartite du monde vivant (33 protéines

sur 40), la monophylie de ces domaines est mise en cause dans 17 phylogénies sur 40 (Williams et

Embley, 1996). Ce résultat soulève le problème de la représentation d'un arbre universel reflétant

soit la majorité des arbres obtenus à partir de toutes les molécules, soit le résultat d'une

phylogénie sur un ou plusieurs gènes clés (Doolittle, 1996; Doolittle et al., 1996).

Ø Des phylogénies récentes placent Aquifex (la bactérie branchant le plus profondément sur l'arbre à

ARNr) non plus à la base des Bacteria mais à proximité de Bacillus ou au sein des Archaea (Klenk,

1998; Pennisi, 1998).

3 L'instabilité de l'ARN est en partie liée à la présence de cytidine , qui représente le moins stable des 3 acides nucléiques. Il a donc été

proposé que cet acide aminé pouvait être absent des premiers matériaux génétique (Levy et Miller, 1998), des liaisons A:U, G:U

pouvant être suffisamment fortes pour maintenir la structure secondaire de la molécule. Il a de plus été démontré que l'activité d'un

ribozyme était accrue lorsque celui ci était dépourvu de cytidine (Rogers et Joyce, 1999). Cet ARN primaire, stabilisé, dépourvu de

cytidine pourrait être alors en accord avec une origine de la vie dans des conditions thermophiles.4 La division du monde vivant en trois domaines telle que l'avait proposé Woese, a même été remise en cause récemment par Ernst

Mayr (1998). Cet article a conduit à un échange très vif entre les deux protagonistes par journal interposé (Woese, 1998b). Pour sa part

Gupta (1998 a, b et c) s'interroge sur les similitudes entre les Archaea et les Firmicutes et propose une nouvelle classification du

monde vivant.


48

Ø Il semblerait que la position d'un micro-organisme sur un arbre soit très fortement liée à la vitesse à

laquelle la molécule ayant servi à construire l'arbre a évolué. Cette fréquence mutationnelle varie au

sein de la molécule et entre les organismes induisant des phénomènes d'attraction des branches

longues5. Ces phénomènes perturbent particulièrement les analyses d'organismes "branchant

profondément" sur les arbres phylogénétiques et qui sont sensés être les plus proches de l'état

ancestral (Philippe et Laurent, 1998).

Ø On a observé que les ARNr d'hyperthermophiles étaient riches en bases G et C. Or ces dernières

forment des structures stables qui pourraient ralentir les mutations, raccourcir les branches et donc

rapprocher les branches courtes (Galtier et Gouy, 1998; Galtier et al., 1999).

Ø Enfin la détection de séquences de Crenarchaeota et d'Euryarchaeota (très probablement non

thermophiles) au sein de nombreux environnements (sols, sédiments, eaux douce et eau de mer,

symbiose avec des animaux, voir Olsen, 1994; Schleper, 1999) vient faire vaciller le dogme

d'Archaea exclusivement cantonnées dans des environnements extrêmes.

L'ensemble de ces informations présente la thermophilie comme un caractère dérivé, une adaptation à

de nouvelles niches écologiques et remet en cause une origine thermophile de la vie sur terre.

La nature de la première forme de vie sur terre est elle aussi discutée. Les phylogénies

réalisées sur les ARNr ont permis de présenter un arbre de la vie non raciné, mais des études ont été

entreprises afin d'enraciner cet arbre, à partir de travaux effectués sur les protéines codant pour les

facteurs d'élongation, les ATPases et les ADN et ARN polymérases. Ces travaux présentent la racine

de l'arbre entre la branche des Bacteria et celle des Eucarya-Archaea. Différents noms ont été

proposés pour nommer l'organisme qui serait à la base de l'arbre : progénote, cenancestor, LUCA

(Last Universal Common Ancestor). Les deux premiers termes ont le désavantage de donner une idée

primitive de la biologie de cette entité6. Or il est tout à fait probable que cet organisme ait eu un

métabolisme assez complexe, qui ait évolué en se simplifiant au cours des générations et de la

conquête de nouveaux milieux. De plus, raisonner en terme de dernier organisme commun ne doit

pas faire oublier qu'à l'origine les échanges génétiques et les fréquences de mutations devaient être

très élevés, favorisant l'apparition de gènes paralogues et xénologues (Woese, 1998a).

Le séquençage du génome de nombreux micro-organismes devrait fournir de nouveaux

matériaux pour établir des relations phylogénétiques plus solides et avancer de nouvelles hypothèses

sur la nature des premiers organismes ayant colonisé le globe.

Des trois compartiments de la biosphère, l'atmosphère constitue l'environnement le moins

propice au développement d'une vie endémique. Il semble toutefois que les micro-organismes soient

parvenus à coloniser ce milieu.

5 Les positions sur deux séquences ayant des fréquences de mutation très élevées peuvent s'avérer similaires par convergence sans

que cette similitude reflète un caractère d'ancestralité (Felsentein, 1978).6 Les termes employés pour la dénomination des domaines peuvent conduire à de faux raisonnements. Ainsi les Archaea ne sont pas

essentiellement confinés dans des environnements extrêmes (proches des conditions ancestrales) et les "pro"caryotes possèdent des

mécanismes aussi évolués que ceux des eucaryotes.


49

II. L'atmosphère

La présence de micro-organismes dans l'air a été mise en évidence par les expériences de

Pasteur en 1864, mettant ainsi fin au concept de génération spontanée. Au sein de cet habitat

inhospitalier les micro-organismes ne sont qu'en transit. En haute altitude, l'absence de nutriments,

d'eau et les fortes irradiations (rayonnements U.V.) ne permettent pas le développement des micro-

organismes7. Les organismes sont donc sous la forme de spores. Au fur et à mesure que l'on s'élève

dans l'atmosphère la concentration en micro-organismes diminue.

A l'échelle humaine les micro-organismes présents dans l'air ambiant, sous forme d'aérosols,

sont responsables d'un grand nombre d'infections humaines, en particulier dans des environnements

anthropiques clos, chauffés et humides comme ceux des hôpitaux. Ces infections peuvent aussi

toucher d'autres organismes supérieurs tels que les plantes et les animaux domestiques. La teneur de

l'air en micro-organismes, qu'ils soient sous une forme viable, viable mais non cultivable ou mort, est

fonction de facteurs climatologiques (humidité, pluie, température) comme de facteurs liés à

l'ensoleillement (saison, cycle nycthéméral) (Lighthart, 1997). Les techniques de culture classiques

(Heidelberg et al., 1997; Shaffer et Lighthart, 1997; Reponen et al., 1998), comme les techniques de

biologie moléculaire (Alvarez et al., 1995; Palmer et al., 1995; Pillai et al., 1996; Bartlett et al., 1997;

Stärk et al., 1998) ont été mises à profit à de nombreuses reprises pour détecter les micro-organismes

en suspension dans l'air. Il n'a s'agit toutefois que de détecter des micro-organismes généralement

impliqués dans des infections humaines, et aucune étude ne s'est encore intéressée à la diversité

totale des micro-organismes "aériens". Ce type d'étude est beaucoup plus commun au sein des

habitats terrestres.

III. Les habitats terrestres

On distingue trois compartiments majeurs parmi les habitats terrestres : la couche superficielle

du sol qui s'étend de la surface à quelques mètres de profondeur, la biosphère souterraine qui s'étend

sur toute la lithosphère, et le cas particulier des réservoirs pétroliers. Chacune de ces niches abrite une

communauté particulière de micro-organismes.

3.1 Les couches superficielles de la lithosphère

3.1.1 Description de l'habitat

Le sol abrite de fortes quantités de micro-organismes qui interviennent activement dans

différents cycles géochimiques (C, N, S et métaux). La diversité microbienne y est fonction du type de

sols étudiés (par exemple : elle est plus abondante dans la rhizosphère que dans des sols nus) mais

7 Certains chercheurs auraient proposé l'hypothèse que des micro-organismes pourraient se développer dans les nuages, là où la

teneur en eau est plus élevée. Source : site du Microbe Zoo, Digital Learning Center for Microbial Ecology

(http://commtechlab.msu.edu/sites/dlc-me). De plus des bactéries actives ont été détectées dans des gouttes d'eau de nuage à 3000 m

d'altitude (Psenner et Sattler, 1998).


50

elle s'étend dans toutes les niches où la vie est thermodynamiquement possible. La proportion de

micro-organismes s’accroît à mesure que l'on s'éloigne de la surface du sol. A 10 cm de profondeur on

estime retrouver 75 à 95% de la population totale microbienne du sol. Les micro-organismes

procaryotes y côtoient des Eucarya. Par gramme de sol on retrouve 107 à 108 procaryotes, 105

champignons, 5.104 algues et 3.104 protozoaires (Madigan, 1996; Withman et al., 1998).

3.1.2 La rhizosphère

Au sein de la rhizosphère la diversité et la richesse microbienne sont très importantes. Les

populations peuvent atteindre jusqu'à 109 individus par gramme de sol. Cette richesse est à attribuer

aux relations qui s'établissent entre les plantes et les micro-organismes (Bally et al., 1999).

Ø La plante excrète des sucres, des acides aminés et des vitamines qui permettent la croissance des

micro-organismes alors que ces derniers produisent des hormones favorisant la croissance de la

plante (auxine, indole, acide acétique ou des molécules "gibbereline-like").

Ø Certains micro-organismes de la rhizosphère permettent de lutter contre les pathogènes (bactéries

et champignons) de la plante.

Ø Les polysaccharides bactériens favorisent quant à eux l'agrégation du sol autour des racines (Amellal

et al., 1998).

Ø Enfin d'importants phénomènes symbiotiques sont observables, notamment chez les

légumineuses où, au sein de bactériocystes, des Rhizobium permettent la fixation de l'azote

atmosphérique par le végétal (Ferrera-Cerrato, 1980).

Les méthodes de culture classiques ont permis d'isoler essentiellement des micro-organismes

associés aux genres Bacillus, Arthrobacter et Actinomycetes. Or les milieux de culture utilisés ne

peuvent que difficilement recréer l'ensemble des interactions que les micro-organismes entretiennent

avec le sol et les plantes. De plus les micro-organismes retrouvés en culture diffèrent de ceux

observés in situ. Ces derniers semblent avoir une paroi plus complexe et une taille plus petite (ce qui

les protégerait contre les contraintes hydriques et alimentaires).

3.1.3 L'apport des techniques moléculaires

Compte tenu de l'importance des micro-organismes tant au niveau des cycles géochimiques

que de l'augmentation des rendements de cultures, de la production d'antibiotiques, et des

mécanismes d'infection (par exemple Clostridium tetani ou Bacillus anthrax), de nombreuses études

utilisant les techniques moléculaires ont été entreprises (Liesack et al., 1997; van Elsas et al., 1998;

O'Donnel et Görres, 1999). Ces dernières ont révélé une diversité microbienne bien plus abondante

que celle obtenue par les méthodes de cultures classiques et dont les représentants se répartissent

dans toutes les branches (mésophiles) de l'arbre des bactéries (Torsvik et al., 1990a; Borneman et al.,

1996).


51

La première étape à franchir dans le cadre de telles études, est l'extraction d'ADN à partir

d'échantillons riches en matière humique et en substances susceptibles de fixer l'ADN telles que les

argiles (Vettori et al., 1996). Un grand nombre d'articles décrivent et comparent l'efficacité de

différentes méthodes d'extraction à partir de tels échantillons (Holben et al., 1988; Steffan et al., 1988;

Pillai et al., 1991; Tsai et Olson, 1992 a et b; Moran et al., 1993; Ogram et al., 1995; Felske et al., 1996;

Zhou et al., 1996; Jackson et al., 1997; Porteous et al., 1997; Abu Al-Soud et Rådström, 1998; Kuske

et al., 1998). Les plus efficaces de ces techniques sont décrites dans la troisième partie de ce

manuscrit.

Une fois résolus les problèmes liés à l'extraction de l'ADN, la communauté microbienne au sein

de différents types de sols a été analysée soit par séquençage direct des ADNr 16S, soit par

hybridation à l'aide d'amorce domaine-spécifique. Le tableau 2.1 présente une liste non-exhaustive

des différentes études réalisées sur les sols; chacune de ces études à contribué à la découverte de

nouvelles séquences de micro-organismes proches de micro-organismes déjà isolés mais le plus

souvent correspondant à de nouveaux phylums.Tableau 2.1. Etudes de la diversité microbienne des sols par des approches moléculaires

Sols cultivés Autres types de sols

Ø mise en évidence d'une nouvelle lignée de Crenarchaeota (Bintrin et al.,

1997; Buckley et al., 1998),

Ø recherche des bactéries actives dans le sol (Christensen et al., 1999),

Ø étude sur des sols isolés de l’archipel Hawaiien (Nüsslein et Tiedje,

1998),

Ø approche de la diversité bactérienne très complète (séquençage,

hybridation, DGGE) et quantification des espèces actives par RT-PCR

(Felske et al., 1998a; Felske and. Akkermans, 1998a),

Ø communauté des Archaea (Großkopf et al., 1998a et b) et des bactéries

oxydant le méthane (Henckel et al., 1999) se développant sur les racines

de riz,

Ø une des premières études mettant en évidence la présence de

nouvelles lignées de Planctomycetales (Liesack et Stackebrandt, 1992)

suivit des travaux de Stackebrandt et al. (1993),

Ø communauté bactérienne des pâtures (Borneman et al., 1996; Lloyd-

Jones et Lau, 1998; McCaig et al., 1999)

Ø étude des méthanotrophes et des méthylotrophes dans des sols

anoxiques ou "fluchés" en CH4 (Øvreås et al., 1998), après culture

d'enrichissement (Jensen et al., 1998),

Ø approche générale (Picard et al., 1992; Ueda et al., 1995; Lee et al.,

1996b),

Ø approche de la diversité par analyse du G+C% et la réassociation de

l'ADN génomique et par les méthodes de cultures classiques (Torsvik et

al., 1990 a et b).

Ø communautés rhizobiales (Khbaya et al., 1998;

Lafay et Burdon, 1998),

Ø sols traités par des herbicides (elFantroussi et al.,

1999),

Ø sols pollués par des hydrocarbures par la

méthode d'hybridation génomique reverse (Shen et

al., 1998),

Ø sols forestiers (Borneman et Triplett, 1997;

Jurgens et al., 1997; Widmer et al., 1999),

Ø tourbières (Hales et al., 1996; Lloyd et al., 1998),

Ø sols gelés, permafrosts (Shi et al. 1997), ou sols

de toundra (Zhou et al., 1997),

Ø sols arides (Kuske et al., 1997; Dunbar et al.,

1999),

Ø sols hypersalés : Mer Morte (Arahal et al., 1996),

marais salants et marécages (Martínez-Murcia et

al., 1995; Nübel et al., 1999)

Ø fumier et compost (Blanc et al., 1997; Kowalchuk

et al., 1999).

Ø sols pollués par le plomb et bactéries résistantes

associées (Konopka et Zakharova, 1999; Konopka et

al., 1999)

D'autre part des recherches de plasmides susceptibles, par transfert horizontal, d'être vecteurs

de résistance aux antibiotiques ont été réalisées en utilisant des techniques d'extraction directes sur

différents échantillons de sols (Götz et al., 1996). Des techniques similaires ont été utilisées pour

détecter des entérovirus dans des sols amendés par des boues actives (Straub et al., 1995).

D'autres techniques s'attachent à amplifier ou hybrider spécifiquement certains types de micro-

organismes à l'aide d'amorces et de sondes espèces- ou sous espèces- spécifiques, ou à rechercher

des métabolismes ou des gènes impliqués dans des mécanismes de résistance (cf. tableau 2.2).


52

Tableau 2.2. Etudes de micro-organismes ou de métabolismes spécifiques

Recherche d'une espèce spécifique Recherche d'un métabolisme ou d'une résistance

Ø une espèce de Mycobacterium (Briglia et al., 1996),

Ø un Bacillus incultivable (Felske et al., 1998b; Felske, 1999) et

une souche associée aux Verucomicrobiales (Felske et

Akkermans, 1998b) détectés en grande quantité par une étude de

diversité générale,

Ø des Acidobacterium (Barns et al., 1999),

Ø des Pseudomonas par une approche traditionnelle de culture et

d'amplification (Johnsen et al., 1999),

Ø des Leptothrix et des Sphaerotilus impliqués dans les processus

d'oxydation du fer et du manganèse (Siering et Ghiorse, 1997),

Ø des Sphingomonas hybridés à l'aide d'une sonde spécifique et

quantifiés par cytométrie en flux (Thomas et al., 1997).,

Ø des Proteobacteria β oxydant l'ammoniaque genres

Nitrosomonas et Nitrospira dans des sols cultivés (Stephen et

al., 1996, 1998) ou par DGGE dans des sables dunaires

(Kowalchuk et al., 1997) ou dans des sols cultivés (Bruns et al.,

1999),

Ø des bactéries sulfato-réductrices dans le sol (Telang et al.,

1994; Devereux et al., 1996) ou au niveau de la rhizosphère

d'une plante colonisant les marais salants (Hines et al., 1999).

On notera en particulier les études réalisées pour étudier les

bactéries magnétotactiques dont la présence dans les sédiments

fossiles est le témoin des variations du champ

électromagnétique terrestre (Spring et al., 1992, 1998; Thornhill

et al., 1995).

Ø la méthane monooxygénase (gènes mmo) et la méthanol

deshydrogénase (gènes mxaF) des micro-organismes

méthanotrophes (McDonald et al., 1995; Henckel et al., 1999),

Ø le gène mcr des méthanogènes dans des échantillons de

tourbières (Nercessian et al, 1999),

Ø la nitrogénase réductase (gène nifH) (Widmer et al., 1999),

Ø sous unité α du gène codant pour la coenzyme M réductase

(Hales et al., 1996),

Ø l'ammoniaque monooxygénase (gène amoA) (Rotthauwe et al.,

1997),

Ø la résistance au mercure (gène mer) (Bruce et al., 1992),

Ø la résistance au cadmium au cobalt et au zinc (Diels et

Mergeay, 1990),

Ø dégradation des PCB (polychlorinated biphenyl) (Walia et al.,

1990).

Si les micro-organismes colonisant les couches superficielles du sol ont fait l'objet de

nombreuses études et ont même conduit à la création d'une discipline à part entière (la microbiologie

des sols), les couches stratigraphiques plus profondes sont moins bien connues et les micro-

organismes qui s'y développent ne sont étudiés que depuis récemment.

3.2 La biosphère souterraine

3.2.1 Description de l'habitat

L'habitat souterrain est défini comme celui compris au dessous de 8 mètres pour les habitats

terrestres et en dessous de 10 cm pour les sédiments marins. En terme de volume c'est le plus gros

habitat colonisable sur le globe. Il est constitué de roches magmatiques (basaltes, granites) et de

roches sédimentaires (les argiles par exemple). La température et la pression y croissent à mesure que

la profondeur augmente. On considère que la limite inférieure de colonisation de la lithosphère ne

s'étend pas en dessous de 4 km où la température atteint 125°C et avoisine la température limite de la

vie procaryotique (Whitman et al., 1998).


53

3.2.2 Le concept de biosphère souterraine

La notion de biosphère souterraine est née au début des années 90, en particulier grâce aux

réflexions d'un astronome, Thomas Gold, qui le premier supposa qu'il pouvait exister dans la croûte

terrestre (ou dans l'équivalent extra-terrestre) des conditions physico-chimiques pouvant permettre la

vie de micro-organismes tout à fait indépendamment de la surface (Gold, 1992). On considérait

jusqu'alors que les micro-organismes souterrains étaient essentiellement des chimioorganotrophes se

développant très lentement en métabolisant les restes de matière organique qui s'infiltraient dans les

couches stratigraphiques profondes (Arrage et al., 1993; Paul et al., 1995). Les études réalisées par la

suite par des microbiologistes dans les environnements tels que les sources hydrothermales (Deming

et Baross, 1993), les sédiments profonds (Parkes et al., 1994; Wellsbury et al., 1997) ou les puits de

pétrole (Bernard et al., 1992, L'Haridon et al., 1995), ainsi que les travaux de Yayanos et al. (1981;

Yayanos, 1995) sur les souches barophiles des fosses océaniques, permirent de confirmer en partie

les hypothèses de Gold. D'une part les souches thermophiles isolées en profondeur avaient une

pression optimale de croissance supérieure à la pression à laquelle elles avaient été récoltées (ce qui

laissait supposer une origine plus profonde), d'autre part on retrouvait dans des environnements très

éloignés géographiquement, mais tous proches de la lithosphère (réservoirs pétroliers et sources

hydrothermales), les mêmes espèces de procaryotes, enfin les prélèvements effectués dans des

sédiments marins profonds indiquaient la présence de micro-organismes jusqu'à 750 mètres de

profondeur à des teneurs encore élevées (1,8.106 bactéries/g). Par ailleurs l'étude d'aquifères

basaltiques profonds par des méthodes moléculaires et des méthodes de cultures classiques a

indiqué la présence de micro-organismes chimiolithotrophes anaérobies (BSR, méthanogènes,

homoacétogènes) (Kotelnikova et Pedersen, 1997; Kotelnikova et al., 1998, Motamedi et Pedersen,

1998) ou thermophiles (Szewzyk et al., 1994; Boone et al., 1995) dont le métabolisme (source de

carbone et d'énergie) pourrait entièrement dériver de composés libérés par la lithosphère (Stevens et

McKinley, 1995). Ainsi H2 ne dériverait pas de la décomposition anoxique de la matière organique mais

de la réaction de l'eau sur les basaltes et pourrait ainsi servir de donneur d'électrons dans des réactions

où interviendraient en tant qu'accepteurs le CO2 ou le SO42- présents sous une forme inorganique

dans les couches profondes (cf. réactions ci dessous).

Production de H2 inorganique : 2FeO (basaltes) + H2O Õ H2 + Fe2O3

Méthanogenèse : 4H2 + CO2 Õ CH4 + 2H2O

Acétogenèse : 4H2 + 2HCO3- + H+ Õ CH3COO- + 4H2O

Réduction des sulfates : 4H2 + SO42- + H+ Õ HS- + 4H2O

Cette hypothèse a été réfutée récemment par Anderson et al. (1998) car selon eux la

production de H2 au pH in situ (pH≈8) ne peut être suffisante pour pouvoir soutenir la croissance

chimiolithotrophique de toute la biomasse souterraine. Ils attribuent la croissance des micro-

organismes à la matière organique emprisonnée dans les sédiments, ou apportée par l'eau des

aquifères. Ils n'excluent toutefois pas la possibilité que cette croissance soit liée aux gaz réduits


54

provenant de couches stratigraphiques inférieures et percolant au travers de la lithosphère, comme

l'avait proposé Thomas Gold.

3.2.3 La communauté microbienne souterraine

Les micro-organismes se développant dans cette biosphère ne sont étudiés que depuis une

quinzaine d'années. L'intérêt pour l'étude de la biosphère souterraine s'est accru dès lors que

l'homme a dû trouver de nouveaux espaces pour enterrer des déchets. Il s'agissait particulièrement de

se défaire des déchets ultimes radioactifs des centrales nucléaires. Cet enfouissement était réalisé

dans des zones granitiques ou argileuses où les déchets pouvaient entrer en contact avec de l'eau

d'aquifère. Ces eaux chargées en micro-organismes pouvaient accélérer la corrosion des contenants à

déchets et favoriser la dispersion des radionucléides (Pedersen, 1996a; Santo Domingo et al., 1998a;

White et al., 1998). D'autre part l'étude de la flore souterraine permettait de suivre la dégradation de

polluants tels que les hydrocarbures ou les solvants chlorés (Dojka et al., 1998; Klier et al. 1999). De

plus, on suppose que les micro-organismes interagissent avec les roches dans des processus de

formation de minéraux (formation de silicates, de carbonates ou initiation de sites de nucléation des

minéraux) comme dans des processus de dégradation (lixiviation) (Torsvik, 1997; Douglas et

Beveridge, 1998; Fisk et al, 1998). L'intérêt pour ces micro-organismes s'est traduit par la mise en

place de sections spécialisées dans l'étude de micro-organismes au sein des programmes de forages

océaniques (Ocean Drilling P roject) et par la constitution (par le Departement o f Energy des Etats-

Unis) d'une collection de souches isolées spécifiquement d'environnements souterrains (Stim, 1994;

Reeves et al., 1996; Balkwill et al., 1997). Cette collection ayant été réalisée à partir de techniques de

cultures traditionnelles, mettant en jeu des milieux de culture classiques pour hétérotrophes aérobies,

les souches isolées ne pouvaient que partiellement rendre compte de l'entière diversité du milieu.

Les études réalisées notamment par Pedersen sur des forages d'aquifères profonds ont

quant à elles mis en évidence des séquences très diverses pouvant correspondre aussi bien à des

souches aérobies qu'anaérobies. Elles se répartissent dans 11 branches du domaine bactérien et 5

nouvelles branches (Ekendahl et Pedersen., 1994; Pedersen et al., 1996 a, b, 1997). D'autre part,

des représentants des Proteobacteria α, β, γ , δ et ε, des Firmicutes à haut et bas G+C%, des

Cytophagales (ex-C.F.B) ont été retrouvés à de nombreuses reprises dans différents gisements

(Boivin-Jahns et al., 1996; Barns et Nierzwicki-Bauer, 1997; Chandler et al. 1997, 1998; Fry et al.,

1997; Stroes-Gascoyne et al., 1997). Récemment Crozier et al. (1999) ont étudié les indices de

biodiversité à partir des différentes séquences collectées sur le site Oklo par l'équipe de Pedersen. 5

sites ont été comparés et les résultats semblent indiquer que, dans aucune des études, l'ensemble de

la population n'a pu être détecté (par clonage et séquençage). Les similitudes de population entre

sites de prélèvement sont discutées en fonction de leur caractéristiques physiques.


55

Une étude a permis de comparer l'effet d'une pollution par des carburants sur la flore

microbienne dans un aquifère à l'aide de sondes spécifiques (domaine, classe, phylum, etc.) et de

réitérer cette expérience au laboratoire en fermenteur alimenté en nitrates (Shi et al., 1999)8.

La majeure partie des études réalisées dans de tels environnements a porté sur l'analyse de la

diversité à l'aide du gène de l'ADNr 16S, mais quelques études ont porté sur l'analyse de la naphtalène

dioxygénase (gène nahAc) (Herrick et al., 1993; Wilson et al., 1999).

L'utilisation des techniques moléculaires a permis d'accroître considérablement nos

connaissances sur la flore souterraine mais, comme dans tous les milieux où ces techniques ont été

utilisées, un gros effort reste à réaliser pour améliorer les techniques d'échantillonnage (asepsie,

pression), en particulier pour les sites profonds, ainsi que les techniques de culture (prise en compte

des gaz disponibles sur le lieu d'échantillonnage, techniques d'enrichissement in situ).

3.2.4 Des profondeurs aux astres

Le concept de biosphère souterraine intéresse particulièrement les exobiologistes. Les

observations de chimie microbienne à base de H2S, CO2, Fe3+ (Vargas et al., 1998), de minéraux

réducteurs, et en quasi absence d'eau liquide, permettent d'extrapoler cette chimie prébiotique à

d'autres planètes du système solaire (ou à leurs satellites) où ces composés sont présents en grande

quantité (Brack, 1999; Brack et Raulin, 1999).

Il y a 20 ans alors que les premières sources hydrothermales étaient découvertes, la sonde

Voyager mettait en évidence une activité volcanique sur deux satellites de Jupiter, Io et Gaymède. A la

surface d'Europe (un autre satellite de Jupiter) il a été observé des plaques (de nature inconnue) qui

se déplaceraient sur un fluide (liquide ou gazeux). Il y a de fortes présomptions pour que ces plaques

soient des glaces d'eau qui se déplacent sur un océan d'eau liquide. Les mouvements des plaques

sont à attribuer à des phénomènes de courants liés à une marée due à la force gravitationnelle de

Jupiter ou à la présence d'un noyau chaud au centre du satellite. Si ce noyau existe il est probable que

des phénomènes d'hydrothermalisme soient observables sur Europe. Aujourd'hui un programme

spatial a été initié afin de prélever des échantillons sur ce satellite et rechercher des traces de vie à

proximité de sites hydrothermaux (Delaney, 1998).

La découverte (McKay et al., 1996) (contestée par Mc Coy, 1997) de formes associées à des

micro-organismes dans la météorite martienne ALH84001, (bien que ces formes n'atteignent que 380

nm de long !?) a permis de relancer, en plus de nouveaux crédits pour la NASA, le concept d'une vie

extraterrestre martienne (Carr, 1996; Farmer, 1996; McKay, 1997). Cette découverte ravive de plus

l'idée qu'un fort bombardement météorique aurait pu initier la chimie prébiotique terrestre, c'est le

concept de panspermie (Brack et Pillinger, 1998) ou au contraire supprimer toute forme de vie et

induire la division tripartite du monde vivant (Gogarten-Boekels et al., 1995).

8 Une étude sur un environnement similaire a été réalisée par Bekins et al. (1999) en utilisant une approche culturale : NPP (MPN) et

enrichissement de métabolismes spécifiques (méthanogènes, flore aérobie, flore fermentative, etc.). Rooney-Varga et al. (1999) ont

analysé par amplification et séquençage la flore anaérobie associée à la dégradation des benzènes dans un aquifère contaminé.

1-Sédimentation de la matière organique 2-Recouvrement de la matière organique par des couches sableuses (jaune) et imperméables (vert)

3-Phénomènes géologiques de mouvements du terrain (tectonique)

4-Phénomènes géologiques de transformation de la matière organique sous l’effet de la pression et de la température (métamorphisme)

5 et 6 Migration de l’huile (vert clair) du gaz (rouge) et de l’eau (bleu cyan) dans la roche réservoir (jaune) jusqu’à atteindre la roche couverture (vert)

1 2 3

4 5 6

Figure 2.2. Mécanismes de formation du pétrole

images d’après le site Total (http://www.total.com)

http://www.total.com


56

3.3 Les réservoirs pétroliers

3.3.1. Formation et production du pétrole

3.3.1.1 La formation du pétrole

Le pétrole résulte de la transformation de la matière organique en hydrocarbures. Les débris

végétaux ou animaux sont théoriquement dégradés par les micro-organismes, mais certains

échappent à cette dégradation. Ils se déposent au fond des mers fermées, des lagunes, des lacs, des

deltas ou d'autres milieux aquatiques pauvres en oxygène. Protégés de l'action des bactéries, les

matières organiques se mélangent à des sédiments (sable, argile, sel...) et s'accumulent au fond des

océans où ils sont recouverts par la suite d'autres sédiments plus jeunes. Par leur propre masse, ces

couches sédimentaires s'enfoncent naturellement. Les mouvements tectoniques qui agitent la

lithosphère les cassent, et les entraînent plus profondément dans l'écorce terrestre.

Lors de cet enfouissement, pression et température s'accroissent jusqu'au point où ces débris

se transforment en hydrocarbures et sont expulsés de leur matrice originelle. L'azote et l'oxygène sont

éliminés pour ne laisser que des molécules formées de carbone et d'hydrogène qui constituent les

hydrocarbures liquides et gazeux qui se retrouvent au sein d'une roche, appelée roche mère. Moins

denses que l'eau, les hydrocarbures vont migrer vers la surface profitant de microcavités et de fissures

du sol. Si rien ne les arrête, ils s'échappent et suintent à la surface ou bien se solidifient en bitume en

perdant leurs constituants volatils. Mais si au cours de leur migration, les hydrocarbures rencontrent

une couche imperméable qu'on nomme la couverture, ils seront bloqués par cette barrière rocheuse

étanche. Piégés dans les interstices microscopiques et les fissures d'une roche dite roche réservoir,

ils vont constituer le réservoir de pétrole (cf. figure 2.2).

3.3.1.2 L'exploitation et la production du pétrole

Les premières traces d'utilisation du pétrole par d'homme datent de la haute antiquité, en

Mésopotamie. Ramassé en surface, le pétrole servait alors dans des préparations médicinales, comme

combustible d'éclairage ou pour étancher les bateaux (calfatage). Il faut attendre 1859 pour qu'en

Pennsylvanie le "colonel" Drake initie les premiers forages pétroliers qui étaient alors de quelques

mètres de profondeur (cf. figures 2.3 et 2.4).

Figure 2.3. Premier

puits commercial

d'Edwin Drake,

Titusville,

Pennsylvanie, 1859

Figure 2.4. Deux ans

plus tard exploitation à

Run Creeks,

Pennsylvanie

Images site du D.O.E. agence "fossile energy" : http://www.fe.doe.gov/

Actuellement les forages peuvent atteindre des profondeurs de plusieurs milliers de mètres.

La première phase d'une exploitation passe par l'exploration du site. A l'aide de techniques sismiques,

gravimétriques ou magnétométriques, des géologues et des géophysiciens définissent les propriétés


57

physiques du sous sol et confirment la présence d'hydrocarbures. La mise en évidence directe

s'opère par forage.

La production consistera à récupérer les hydrocarbures. Ils remontent à la surface sous l'effet

naturel de la pression dans le gisement. Cinq à 20% du pétrole est ainsi extrait. Afin d'accroître le taux

de production des gisements, des techniques de récupération secondaire sont mises en place. L'une

d'entre elle consiste à injecter de l'eau ou du gaz au fond des puits afin d'y exercer une pression. La

récupération peut alors atteindre 35%. Pour récupérer le maximum des 65% restants, des techniques

d'extraction tertiaires ont été mises au point. Elles consistent en des procédés complexes qui

améliorent le drainage du pétrole : injection de vapeur, injection d'eau additionnée de produits

chimiques, injection de gaz miscible, combustion in situ. (Sources : TOTAL http://www.total.com et

ELF http://www.elf.fr).

Lorsque l'extraction du pétrole devient moins rentable, les grosses sociétés pétrolières (ELF,

TOTAL, EXXON) cèdent leur place à de petites sociétés qui se chargent de tarir la nappe en injectant

plus d'eau lors de l'extraction.

3.3.2. Composition physico-chimique du biotope

Les micro-organismes que l'on peut s'attendre à trouver dans la nappe de pétrole se trouvent

en réalité dans la phase aqueuse piégée avec l'huile et les gaz sous la roche couverture.

Dans cette eau, appelée de production, les conditions physico-chimiques sont variables selon

les puits analysés, mais elles sont généralement anoxiques et légèrement acides du fait de la

dissolution du CO2 ou de l'H2S (pH entre 3 et 7). La température du puits est fonction de sa profondeur

: à raison d'une augmentation de la température de 3°C tous les 100 m, la température de certains puits

peut atteindre 130 à 150°C (généralement de 60 à 130°C, Beeder et al., 1994). Selon la profondeur

du puits la pression au sein de la nappe va varier entre 150 et 400 bars. En outre la salinité des puits

peut être très élevée. Celle-ci dépend de la salinité de la roche mère au sein de laquelle la nappe va

être emprisonnée et peut varier entre 0 et 300 g.l-1 de sels totaux (NaCl, MgCl2, KCl essentiellement)

(pour revue Magot et al., 1999; Ravot, 1996).

L'analyse des accepteurs et donneurs d'électrons potentiels dans la nappe de pétrole souffre

d'un cruel manque de données. En effet les industriels ne collectent pas de façon routinière les

données concernant par exemple le phosphore ou les nitrates. On estime toutefois que le potentiel

redox des eaux de production est relativement bas et que des accepteurs comme l'oxygène, les

nitrates et le fer ferrique sont généralement absents. Par contre la présence de sulfates et de

carbonates laisse supposer que les métabolismes que l'on peut espérer rencontrer sont la sulfato-

réduction, la méthanogenèse, l'acétogenèse et les fermentations. Les donneurs d'électrons sont

quant à eux l'H2 d'origine biotique et abiotique ainsi que des molécules organiques. Les acides

organiques comme l'acétate, le formate, le propionate et le butyrate sont souvent détectés dans les

puits de pétrole, mais on détecte aussi des acides plus complexes. Si la dégradation aérobie de

nombreuses molécules organiques présentes dans le pétrole a souvent été démontrée (n-alcanes et


58

alkylbenzènes), ce n'est que très récemment que des preuves d'une potentielle dégradation

anaérobie de ces composés ont été apportées (Ruetter et al., 1994; Connan et al., 1996; Heider et al.,

1999; Zengler et al., 1999). De plus des composés comme les résines et les asphaltènes, structures

riches en soufre, azote et oxygène, présentes en grandes quantités dans les huiles, pourraient servir

de sources de carbone et d'énergie à des micro-organismes anaérobies (Magot, communication

personnelle). Enfin la production anaérobie de l'hydrogène lors de la réaction de l'eau avec du basalte

pourrait servir de donneur à des hydrogénotrophes tels que les micro-organismes méthanogènes, les

sulfatoréducteurs et homoacétogènes (Stevens et McKinley, 1995) (voir §3.2.2).

3.3.3. La diversité microbienne des puits de pétrole

Même si la présence des micro-organismes dans les puits de pétrole a été établie depuis

longtemps, c'est seulement depuis une dizaine d'années que les industries pétrolières ont pris en

compte le rôle de ces micro-organismes dans la formation des huiles et les problèmes liés à la

dégradation des systèmes d'extraction. La première étude de la flore microbienne associée aux puits

de pétrole a mis en évidence des bactéries sulfato-réductrices (Bastin, 1926), et dès cette époque

l'auteur s'est interrogé sur la nature endémique des souches étudiées. La microflore des gisements

pétroliers est relativement peu diversifiée (Ravot, 1996). On retrouve principalement des micro-

organismes anaérobies qui appartiennent aux deux règnes des Procaryotes : Archaea et Bacteria. On

a cependant mis en évidence la présence d’organismes aérobies dont l'origine semble être exogène.

3.3.3.1 La colonisation exogène des gisements de pétrole

L'étude de la flore des nappes de pétrole pose le délicat problème de l'origine des micro-

organismes présents dans l'échantillon étudié. En effet, le mécanisme d'extraction du pétrole,

notamment les techniques d'extraction secondaires et tertiaires, sont des sources non négligeables

de contamination de la nappe de pétrole.

¬ L'eau injectée dans la nappe peut avoir diverses origines :

Ø eau d'un réseau interne à l'entreprise de forage : injectée, récupérée, traitée et réinjectée,

Ø eau de rivière ou de mer dans le cas d'exploitation "offshore",

Ø eau de nappe phréatique adjacente à la nappe de pétrole,

Ø eau de consommation courante lorsque qu'aucune nappe souterraine n'est proche du puits ou

lorsque ce puits est trop éloigné du site de production pour être alimenté par un réseau d'eau

interne.

La contamination peut aussi provenir du matériel utilisé. Les têtes de forage et les canalisations

peuvent perturber la composition initiale de la nappe. La nature de ces dernières favorise

particulièrement le développement de bactéries sulfato-réductrices (BSR) qui en se multipliant en

biofilm autour des canalisations provoquent une dégradation accélérée des installations connue sous

le terme de "pitting".


59

® Enfin, les micro-organismes présents dans les différentes couches stratigraphiques qui surmontent

la nappe peuvent eux aussi contaminer l'eau de production. Dans les couches superficielles on

retrouve des micro-organismes chimio-organotrophes se développant sur la matière organique

présente en grande quantité dans le sol. Il s'agit de souches aérobies ou anaérobies qui interviennent

dans les cycle de l'azote, du soufre et des métaux. Dans les couches plus profondes on retrouve une

flore plus spécifique (voir § 3.2.).

Des études menées sur différents gisements ont indiqué que certains puits de pétrole étaient

stériles. Ces gisements pouvaient être classés en trois catégories différentes :

Ø Les puits dont la température dépassait 82°C, ce qui semble correspondre à la température pour

laquelle aucune biodégradation des huiles n'a été observée (Philipi, 1977). Il faut toutefois noter

qu'il a été possible d'isoler des micro-organismes thermophiles et hyperthermophiles ayant des

optima de croissance supérieurs à 85°C dans les puits de pétrole terrestres et marins (Stetter et al.,

1993; Jeanthon et al., 1995; L'Haridon et al., 1995; Ravot et al., 1995b). La température élevée

des puits n'est donc pas un critère d'absence de micro-organismes. On estime toutefois que les

gisements dont la température dépasse les 130 à 150°C (température fréquemment observée

dans des puits profonds) sont stériles. Les processus indispensables à la "machinerie cellulaire" ne

peuvent se dérouler convenablement à de telles températures.

Ø Les puits dont la température est supérieure à 50°C mais dont la salinité était supérieure à celle de

l'eau de mer (Bernard et al., 1992). Cette dernière donnée corrobore l'incapacité actuelle des

microbiologistes à isoler des souches à la fois halophiles et thermophiles.

Ø Enfin des gisements dont les caractéristiques physico-chimiques les rendraient favorables au

développement de micro-organismes, mais dont le parcours géologique a porté ces gisements à

des températures plus élevées que la température actuelle ce qui a eu pour effet de "stériliser" la

nappe de pétrole (Bernard et al., 1992).

3.3.3.2 Les micro-organismes des gisements pétroliers

Les techniques moléculaires n'ont été que très peu utilisées dans les réservoirs pétroliers

comparativement à d'autres environnements. La majeure partie des études a été initiée par Gerrit

Voordouw. Elles consistent en une étude par hybridation génomique inverse sur des cultures

d'enrichissement et par séquençage des ADNr 16S (Voordouw et al., 1991, 1992, 1996; Leu et al.,

1998). Les travaux de Voordouw et de Leu ont permis de détecter, en plus des BSR, la présence de

micro-organismes aérobies ou anaérobies facultatifs semblables à ceux trouvés dans les eaux de

surface (genres Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas). Mais il a été également possible de détecter

(amplification de l'ADNr 16S) des micro-organismes associés aux genres microaérophiles :

Oceanospirillum, Thiomicrospira et Campylobacter. Une souche nommée CVO associée aux

Campylobacter a d'ailleurs été isolée par Voordouw et al. (1996) à partir de cultures d'enrichissement

sur milieu pour Thiomicrospira denitrificans. Les Campylobacter et les Thiomicrospira pourraient trouver

une niche de développement au sein de la nappe de pétrole dans des cavités micro-aérées de la


60

roche mère et pourraient intervenir dans la réoxydation des sulfures (après réduction des sulfates par

les BSR) en utilisant les nitrates ou les nitrites comme accepteurs d'électrons (Voordouw et al., 1996).

Si ces micro-organismes peuvent être anaérobies facultatifs, leur caractère indigène peut être

contestable : aussi considère-t-on plus sûrement comme indigènes des micro-organismes anaérobies.

Parmi ceux-ci les micro-organismes sulfato-réducteurs, fermentaires ou homoacétogènes sont les plus

fréquemment retrouvés dans les études de diversité par une approche classique de culture.

Les micro-organismes sulfato-réducteurs

Les micro-organismes sulfato-réducteurs représentent la grande majorité des micro-

organismes endogènes aux gisements de pétrole. Ces organismes anaérobies stricts (du domaine

des Bacteria comme des Archaea) ont la particularité d'utiliser les ions sulfate SO42- comme accepteurs

d'électrons dans des oxydations génératrices d'ATP. Les ions SO42- sont réduits en plusieurs étapes

métaboliques en soufre élémentaire (ions sulfure S2- en général) qui, lorsqu'il est libéré réagit avec les

molécules d'H2O pour donner du sulfure d'hydrogène H2S en conditions acides, d'où la présence de

ce gaz en très grandes quantités dans les réservoirs.

Il a été prouvé également que ces bactéries ont la propriété de réguler leur environnement,

c'est-à-dire le biofilm, par une diminution ou une augmentation de la consommation d'ions H+. On

distingue parmi ces micro-organismes les mésophiles, impliqués dans la précipitation de sulfures de fer

ou pitting (fer provenant des systèmes d'extraction) et les thermophiles impliqués dans les

phénomènes d'acidification du réservoir.

Le tableau 2.3 énumère les souches et genres sulfato-réducteurs couramment isolés dans les

gisements pétroliers (d'après Magot et al. 1999).

Tableau 2.3. Micro-organismes sulfato-réducteurs isolés de réservoirs pétroliers.

Bacteria Archaea

Sulfato réducteur mésophile Sulfato réducteur thermophile Sulfato réducteur hyperthermophile

Genre Desulfovibrio Genre Desulfotomaculum Genre Archaeoglobus

Desulfotomaculum halophilum Desulfacinum infernum

Desulfomicrobium aspheronum Thermodesulforabdus novegicus

Genre Desulfobacter Thermodesulfobacterium mobile

Les méthanogènes

Ces micro-organismes appartiennent exclusivement au domaine des Archaea . Ce sont des

anaérobies stricts qui tirent leur énergie de la réduction du CO2 en oxydant H2 tout en produisant du

méthane (CH4). La méthanogenèse n'a été que récemment décrite au sein des gisements pétroliers.

Elle est souvent associée à des puits riches en sels. Jusqu'à présent seules des souches mésophiles

ou thermophiles modérées ont été isolées de gisements pétroliers; aucune souche hyperthermophile

n'a pu être isolée de gisements en raison de la teneur en sel trop élevée de ces derniers. Certaines

souches méthanogènes sont capables de se développer sur d'autres composés en C1 plus réduits

que le CO2, ce sont des méthanogènes méthyloclastiques. Elles se développent sur méthylamine

(CH3NH2), méthanol (CH3OH), diméthyl sulfures ((CH3)2S) (Madigan, 1996; Thauer, 1998). L'acétate


61

(CH3COO-) présent à de très fortes concentrations dans certains puits pourrait lui aussi servir de

substrat à certaines méthanogènes acétoclastiques soit directement, soit en syntrophie avec d'autres

organismes acétoclastiques ou acétogènes.

Parmi les souches méthanogènes isolées d'environnements pétroliers on retrouve des micro-

organismes appartenant à l'ordre des Methanobacteriales, des Methanoccoccales, des

Methanomicrobiales, des Methanosarcinales.

Les micro-organismes fermentaires

Les micro-organismes fermentaires sont des Archaea ou des Bacteria mésophiles,

thermophiles ou hyperthermophiles hétérotrophes, c'est-à-dire qu'ils utilisent de la matière organique,

comme les sucres ou les peptides, en tant que substrat énergétique en l'absence d'accepteur

d'électron externe.

Les bactéries mésophiles sont le plus souvent des halophiles modérées anaérobies et

appartiennent au genre Haloanaerobium. Certaines de ces souches présentent un intérêt pour les

industriels car en produisant des acides, des solvants et des gaz à partir des sucres elles pourraient

participer à une augmentation du rendement d'extraction du pétrole (MEOR : microbial enhancement

oil recovery). Magot et al. (1999) rapportent l'isolement de deux bactéries halophiles modérées

appartenant aux genres Spirochaeta et Dethiosulfovibrio. Les techniques fondées sur l'étude des

ADNr 16S par amplification sur des enrichissements ont quant à elles permis de détecter la présence

de micro-organismes potentiellement anaérobies stricts ou facultatifs associés aux genres Clostridium,

Eubacterium et Synergistes (Voordouw et al., 1996).

Les bactéries thermophiles appartiennent généralement à l'ordre des Thermotogales

pour lequel on retrouve dans les gisements, les genres Thermotoga, Geotoga et Petrotoga. Au sein

de cet ordre le genre Thermotoga regroupe les seuls micro-organismes du domaine des Bacteria

considérés comme hyperthermophiles. Il constitue une des branches phylogénétiques les plus

ancestrales de ce domaine. Thermotoga, isolée et identifiée dans les gisements pétroliers, pourrait

jouer un rôle dans les phénomènes de corrosion, en réduisant le thiosulfate en sulfures (Jeanthon et

al., 1995; Ravot et al., 1995a). En effet la réduction du soufre interviendrait en tant que mécanisme de

détoxication en oxydant H2 produit lors de la fermentation. D'autres familles ont également été

identifiées dans des puits pétroliers comme les Thermoanaerobiaceae capables de réduire le

thiosulfate en soufre (Thermoanaerobacterium) ou en sulfures (Thermoanaerobacter) (Grassia et al.,

1996) et la souche Anaerobaculum thermoterrenum (Rees et al. 1997) capable de réduire le soufre et

le thiosulfate.

Des Archaea fermentaires ont, elles aussi, été identifiées au sein des gisements de pétrole

(Stetter et al., 1993; L'Haridon et al., 1995). Elle appartiennent au genre Thermococcus et

Pyrococcus. Leur caractère endémique a été discuté par Stetter (1993) mais leur capacité à réduire le

soufre et le fer à température élevée en fait des candidats potentiels pour des phénomènes de

biocorrosion (Magot et al. 1994; Grassia et al. 1996; Magot, 1996).


62

Les bactérie s homoacétogènes et les bactéries réductrices des métaux

Les bactéries homoacétogènes se caractérisent par une production exclusive d'acétate à partir

de CO2 et de H2. En dehors des composés gazeux habituels H2 et CO2, elles peuvent réduire le CO2 à

partir d'autres composés en C1 ou de sucres. A ce jour, peu de bactéries homoacétogènes ont été

mises en évidence en milieu pétrolier (Acetobacterium romashkowii par Davydova-Charakhch'yan et

al., 1992).

Magot et al. (1999) rapportent dans leur revue l'isolement au sein de gisements pétroliers de

micro-organismes bactériens capables de réduire le fer (Shewanella putrefaciens) ou le fer et le

manganèse (Deferribacter thermophilus, Green et al., 1997). Le manque de données concernant le

cycle de ces composés au sein du gisement ne nous permet pas de déterminer le rôle de ces micro-

organismes au sein de la nappe. Il semble toutefois que les processus de réduction du Fe (III) soient

très largement répartis dans le monde procaryotique en particulier au sein des genres thermophiles.

Aussi de nombreux genres initialement décrits comme fermentatifs pourraient sous certaines

conditions respirer en anaérobiose le fer ferrique (Slobodkin et Wiegel, 1997; Vargas et al., 1998;

Slobodkin et al., 1999).

3.3.4 Activité microbienne liée aux hydrocarbures

Les techniques d'exploration et de production d'hydrocarbures bénéficient de nouvelles

informations fournies par les études microbiologiques : les propriétés physiologiques des bactéries

identifiées pourraient renseigner sur la température du milieu. Ces études peuvent aussi être un

indice pour montrer la correspondance entre deux gisements, apparemment distincts, si la flore

microbienne est similaire dans les deux puits. Un suivi régulier de la flore peut permettre de s'assurer

de l'effet de certains biocides que les producteurs injectent dans les puits lors de l'extraction des

huiles pour se défaire des BSR, ou dans les tanks pour limiter le développement des souches oxydant

les hydrocarbures en présence d'O2.

La détection de certaines bactéries peut également annoncer un risque majeur pendant la

phase de production : la biocorrosion. Les BSR constituent le groupe majeur impliqué dans ce

phénomène. La corrosion provoque des dégâts considérables sur le matériel, en particulier sur les

pipelines.

Mais la dégradation des hydrocarbures par des micro-organismes peut être aussi mise à profit

dans le cas de catastrophes écologiques majeures telles que l'échouage de pétrolier ou la rupture de

canalisations (Button et al., 1992). La décomposition des hydrocarbures est alors assurée par des

bactéries aérobies, des algues ou des champignons (Swanell et al., 1996). Les hydrocarbures

aliphatiques n'étant pas fermentables, leur dégradation se produit en présence d'O2 sous l'action de

bactéries telles que des Pseudomonas, des Corynebacterium ou des Mycobactéries. Pour accélérer

le développement de ces micro-organismes il est parfois nécessaire d'apporter des nutriments (azote

et phosphore) sous forme de "spray" en surface de la zone à nettoyer. Les micro-organismes peuvent

aussi produire des surfactants qui peuvent accélérer la dispersion des hydrocarbures dans le cas de


63

pollution par des nappes de pétrole (Desai et Banat, 1997). Il est possible de suivre le développement

et la présence de ces souches en amplifiant ou en hybridant spécifiquement les gènes impliqués dans

le métabolisme de dégradation des hydrocarbures (Guo et al., 1997): xylE : cathécol 2,3-dioxygénase,

tod : toluène dioxgénase, alkB : alcane hydroxylase, tmo : toluène monooxygénase, nahAcd :

composant de la naphtalène dioxygénase.

McNaughton et al. (1999) ont suivi, par mesure des profils lipidiques (PFLA) et DGGE (sur

ADNr 16S), l'évolution des populations eucaryotiques et procaryotiques lors d'une pollution simulée

aux hydrocarbures en eau de mer. Les deux techniques permettent de suivre la disparition des

eucaryotes au profit de bactéries Gram - (Proteobacteria α et Cytophagales).

Il est à noter que certains micro-organismes eucaryotes produisent des hydrocarbures en C30 jusqu'à

C36. Cette "production microbienne" de pétrole est réalisée par l'algue verte Botryococcus braunii

(Dennis et Kolattukudy, 1991; Madigan, 1996).

Si les premières études moléculaires des communautés microbiennes des sols s'attachaient

surtout à décrire la formidable diversité procaryotique qui s'y développe, l'effort s'est désormais porté

sur l'analyse de l'activité et la taille des différentes populations. L'ensemble de ces informations devrait

permettre de mieux définir l'action de l'Homme dans cet environnement et notamment d'améliorer les

pratiques agriculturales et les processus de dégradation des déchets.

IV. Habitats aquatiques

Au même titre que les habitats terrestres, on distingue trois habitats aquatiques physiquement

et chimiquement différents : l'eau douce (rivière, lac), l'eau de mer et les estuaires qui constituent la

frontière physique entre l'eau douce et l'eau de mer. Au sein de chaque habitat, de fortes variations

physiques et chimiques vont avoir lieu entre la surface de l'eau, la colonne d'eau et le fond. Ces

variations vont influer fortement sur la disponibilité en nutriments et donc sur la composition de la

communauté microbienne. D'autre part l'analyse de cette communauté est confrontée au délicat

problème de la nature endémique des souches isolées ou détectées. Au même titre que les études

réalisées dans des environnements terrestres, les premières analyses effectuées sur des échantillons

d'eau douce et d'eau de mer ont essentiellement permis d'isoler la flore aérobie, hétérotrophe,

correspondant majoritairement à des bactéries Gram - (Bertrand et Larsen, 1988). Ces bactéries étaient

en tout point semblables à celles obtenues à partir d'environnements terrestres et cette diversité

apparemment limitée comparativement à la multitude de formes observées en comptage direct laissait

présager d'un biais énorme dans les méthodes d'échantillonnage et de culture employées.

L'utilisation des méthodes moléculaires ainsi que l'introduction de techniques plus fines d'observation

(microscopie, cytométrie en flux) ont permis de révéler à quel point les milieux aquatiques pouvaient

être plus riches et diversifiés que ce que les premières études culturales pouvaient laisser présager.


64

4.1 L'habitat d'eau douce

Au même titre que l'eau de mer, la composition microbiologique de l'eau douce des lacs et des

rivières sera fonction de la disponibilité du milieu en oxygène et en matière organique. Dans les rivières

et dans les lacs en hiver où on peut observer de très forts courants de fond, toute la masse d'eau va

être brassée, oxygénée et alimentée en matière organique. Par contre au cours de l'été les couches

d'eau superficielles chauffées par le soleil et donc moins denses vont se disposer au dessus des eaux

plus froides et plus denses créant ainsi une stratification au sein de laquelle les micro-organismes

aérobies vont coloniser préférentiellement les couches supérieures en consommant activement la

matière organique. Les couches inférieures appauvries en oxygène vont être colonisées par les micro-

organismes micro-aérophiles ou anaérobies.

Au sein des rivières (même avec un fort courant) un apport massif de matière organique (rejet

d'industrie, boues d'épuration) peut entraîner des conditions ponctuelles d'anaérobiose qui peuvent

alors profondément perturber la composition de la communauté microbienne indigène.

Différentes méthodologies moléculaires ont été mises à profit afin d'étudier la population totale

microbienne :

Øpar extraction des ARN à bas poids moléculaire (LMW RNA), électrophorèse et séquençage des

bandes majoritaires à partir d'échantillons d'eau d'un lac eutrophe (Höfle et al., 1999). La

comparaison des profils LMW RNA permet de suivre l'évolution des populations au cours de l'année.

Ø Par amplification et séquençage de l'ADNr 16S d'échantillons d'eau d'un lac de montagne (Hiorns et

al., 1997),

Ø par amplification et DGGE sur des échantillons de différentes profondeurs d'un lac méromictique

(Øvreås et al., 1997) et d'un fjord (Teske et al., 1996a),

Ø par utilisation de sondes domaines- et phylum- spécifiques sur des échantillons de lac de montagne

(Alfreider et al., 1996; Pernthaler et al, 1998; Tonolla et al., 1998), d'eau de Fjord (Ramsing et al.,

1996), d'eau de rivière (Kenzaka et al., 1998),

Il a été aussi possible de détecter des micro-organismes spécifiques tels que des bactéries

sulfureuses pourpres associées aux Chromatiaceae dans la chémocline d'un lac suisse (Tonolla et al.,

1999), et des bactéries ammonium oxydantes (Proteobacteria β) participant activement au cycle de

l'azote dans les sédiments lacustres ou dans les eaux de surface. La présence de ces Proteobacteria

était connue depuis longtemps mais elles étaient difficilement détectables par les techniques de

culture classiques (Voytek et Ward, 1995; Hastings et al., 1998; Speksnijder et al., 1998).

Une étude très complète a été réalisée par Priscu et al. (1998) afin d'analyser la diversité

biologique au sein de lacs gelés en Antarctique. Au sein de cet environnement la température ne

dépasse pas 0°C en été. Il est toutefois possible d'y observer une activité microbienne. Durant l'été,

des poches d'eau liquide se créent à l'intérieur de la glace et des sédiments parviennent à atteindre

ces poches d'eau. Ces "oasis" permettent alors la croissance de bactéries photoautotrophes

(cyanobactéries) et hétérotrophes ainsi que de certaines algues (Priscu et al., 1998; Psenner et

Sattler, 1999).


65

4.2 L'habitat maritime

4.2.1 Les micro-organismes marins isolés

Les écosystèmes marins peuvent être considérés comme des environnements stressants en

raison de la salinité (3,5% soit 0,6M NaCl), de la pression (1 atm tous les 10 mètres; on considère que

90% des océans correspondent à des profondeurs supérieures à 1000 mètres), de la température

(90% des océans sont à une température inférieure à 5°C).

On distingue communément dans cet habitat deux zones principales : les océans et le littoral.

Les océans sont pauvres en matière organique (oligotrophe) et étaient donc considérés jusqu'il y a

peu comme pauvres en producteurs primaires, sauf lorsque certains courants permettent à des

nutriments de profondeur de passer en surface comme au large du Pérou et de la Californie. Les côtes

océaniques quant à elles sont des régions riches en matières organiques (eutrophe), donc riches en

producteurs primaires et riches en poissons et en coquillages. Les premières études réalisées à l'aide

de techniques de culture classiques confirmèrent ces hypothèses. Les bactéries isolées en haute mer

(Oceanospirillum, Vibrio, Photobacterium et Alteromonas) correspondaient à des micro-organismes

hétérotrophes présents en très faibles quantités (102 à 105 organismes/l). L'amélioration des

techniques de microscopie a permis au début des années 80 de mettre en évidence au milieu des

océans une diversité microbienne jusque là insoupçonnée. Dans un premier temps des équipes

américaines ont mis en évidence une abondante colonisation des eaux de haute mer par des

Cyanobactéries associées au genre Synechococcus. Par la suite les techniques de cytométrie en flux

permirent d'isoler le plus petit et le plus abondant des micro-organismes photosynthétiques connus :

Prochlorococcus. Ces deux micro-organismes cohabitent dans les océans en colonisant des zones

concomitantes. Alors que les Synechococcus colonisent les eaux de surface bien éclairées et sont

présents dans tous les océans aussi bien oligotrophes qu'eutrophes, les Prochlorococcus colonisent

des zones plus oligotrophes et sont retrouvés à des profondeurs plus importantes (pour revue

Madigan, 1996; Blanchot et al., 1998; Partensky et al, 1999).

4.2.2 L'utilisation des techniques moléculaires

4.2.2.1 Le bactérioplancton océanique et côtier

Les techniques moléculaires basées sur l'identification directe des gènes codants pour l'ARNr

16S furent appliquées très rapidement aux échantillons d'eau de haute mer. L'une des premières

études a consisté à comparer plusieurs échantillons d'eau de mer par hybridation de l'ADN génomique

total extrait (Lee et Fuhrrman, 1990). Chaque échantillon servait successivement de sonde et de cible.

Il était alors possible de déterminer des similitudes entre les échantillons mais la diversité de ces

derniers était encore inaccessible. Après la mise au point d'une technique d'échantillonnage

permettant de filtrer de très grandes quantités d'eau de mer (Giovanonni et al., 1990a), les travaux de

l'équipe de Giovanonni et de DeLong (Giovanonni et al., 1990b; Britschgi et Giovannini, 1991;

Schmidt et al., 1991) permirent de confirmer la présence d'une part (pour la moitié de la banque) de


66

séquences associées aux Cyanobactéries (Synechococcus et Prochlorococcus, ces derniers

n'étaient alors pas décrits) et d'autre part de séquences associées aux Proteobacteria communément

isolées (Alteromonas , Vibrio, Pseudomonas pour les Proteobacteria γ et Caulobacter pour les

Proteobacteria α), ou ne correspondant à aucun genre connu (clade SAR11). Par la suite des travaux

réalisés sur de nouveaux sites permirent de confirmer l'ubiquité des séquences précédemment

décrites comme le clade SAR11 mais aussi la présence de séquences associées aux Firmicutes à haut

G+C%, aux Flavobactéries (Fuhrman et al., 1993), aux bactéries vertes non-sulfureuses (Giovannoni et

al., 1996). Récemment une étude plus approfondie des séquences proches des Actinobacteria a

confirmé l'existence d'un clade de séquences marines provenant d'échantillons côtiers et hauturiers

sur les océans Pacifique et Atlantique (Rappé et al., 1999). Des études similaires ont été réalisées à

partir des séquences proches des Proteobacteria α associées au clade SAR11 (Fields et al., 1997), de

la sous-classe 3 des Proteobacteria α9 (Gonzalez et Moran, 1997) et des bactéries sulfureuses vertes

associées au clade SAR 406 (Gordon et Giovannoni, 1996). Des études menées par une équipe

espagnole en Méditerranée permirent dans un premier temps de suivre les variations de la diversité

microbienne de différents échantillons (formes libres et attachées, variations de profondeur, variations

temporales) ceci par une étude uniquement fondée sur l'analyse des profils RFLP (Acinas et al, 1997)

puis par séquençage des profils majeurs associés aux formes libres et attachées (Acinas et al, 1999).

L'approche suivie par Giuliano et al. (1999) sur des échantillons de surface et profonds de

Méditerranée consiste en une première étape d'isolement par dilutions successives suivie d'une

analyse des séquences d'ARNr 16S présentes dans la dernière dilution. Cette technique conduit à

l'identification de séquences proches des Proteobacteria γ et α et des Cytophagales mais elle ne

permet l'analyse que des micro-organismes majoritaires de l'échantillon.

Des études similaires ont été réalisées sur les micro-organismes associés aux neiges marines

révélant là encore une grande diversité de séquences se répartissant au sein de nombreux groupes

bactériens mais apparemment différents de ceux trouvés sous une forme libre dans la colonne d'eau

environnante (DeLong et al., 1993). On a retrouvé des séquences associées aux Proteobacteria (α, γ ,

δ, ε), aux Cytophagales , aux Planctomycetales, aux Verucomicrobiales (DeLong et al., 1993; Rath et

al., 1998). Une comparaison de la diversité bactérienne existant sous une forme libre ou sous une

forme associée avec des particules a été réalisée par extraction de l'ADN et séquençage de l'ARNr 16S

le long de la rivière Columbia (Crump et al., 1999). Les auteurs ont comparé des prélèvements dans la

rivière, dans l'estuaire et sur la côte et ont observé une plus grande diversité phylogénétique au

niveau de l'estuaire.

Une des premières études réalisées sur des sites côtiers a été effectuée dans deux lagunes

françaises en baie d'Arcachon et dans une zone saumâtre près de Palavas (Benlloch et al., 1995).

Cette étude complète (comptage, mesure du métabolisme et séquençage) mettait en évidence une

diversité bactérienne plus importante dans l'échantillon eutrophe (Méditerranée) et une grande

diversité de micro-organismes majoritairement associés aux Cytophagales et aux Proteobacteria α. Les

9 Il a été possible d'isoler des représentants de ce clade préalablement détectés par séquençage.


67

analyses phylogéniques de cette étude souffrent toutefois de la faible longueur d'ADNr 16S

séquencé (210 pb). L'étude effectuée sur des échantillons provenant de la côte Est des Etats-Unis

révèle encore une fois la prédominance des séquences associées aux Proteobacteria α et γ (75% de

la banque bactérienne de séquences) (Rappé et al., 1997). Par contre les eaux côtières se distinguent

des eaux du large par la présence de séquences associées aux Proteobacteria β (notamment

associées au méthylotrophes), l'absence de cyanobactéries et l'abondance de séquences plastidiales

(expliquée par l'absence de filtration de l'échantillon et l'abondante biomasse d'eucaryotes dans les

environnements côtiers). On note aussi la présence de Cytophagales, d'Actinobacteria et de

Planctomyces comme dans les études précédentes.

L'emploi de la DGGE a permis de comparer la composition du bactérioplancton sur deux

estuaires de la côte Californienne (Murray et al., 1996). Il a été ainsi possible de relier la variation de

types métaboliques détectés par des techniques classiques d'incorporation de radioisotopes à des

variations de phylotypes.

L'étude réalisée par Suzuki et al. (1997) est particulièrement intéressante car elle compare les

résultats d'une analyse directe des gènes codants pour l'ARNr 16S par séquençage et RFLP à ceux

obtenus après culture d'enrichissement sur milieu solide pour hétérotrophes marins. Si les

Proteobacteria α et γ sont bien les phylums les plus représentés dans les deux banques de

séquences, seules 4 séquences d'isolats (sur 127) sont retrouvées dans la banque

environnementale. De plus la diversité des séquences est plus grande dans la banque de clones

environnementaux que dans la banque d'isolats. Cette étude nous permet d'observer à la fois le biais

engendré par les techniques de culture classiques (la plupart des micro-organismes ne sont pas

présents sous une forme cultivable) comme celui engendré par les techniques d'amplification

(l'ensemble des micro-organismes présents dans l'échantillon n'a pas été détecté, soit il n'a pas été

amplifié, soit l'effort d'échantillonnage était trop important pour le détecter).

Enfin on peut citer l'étude réalisée sur un mésocosme constitué d'eau de mer

méditerranéenne rendue eutrophe par addition d'azote et de phosphore (Pukall et al., 1999). Les

auteurs comparent les résultats obtenus par extraction directe de l'ADN et séquençage des ADNr 16S

à ceux obtenus par isolement après dilutions successives. Parmi les 739 clones analysés (96 clones

séquencés - le reste est discriminé par dot-blot) et les 128 souches isolées, les séquences associées

à Alteromonas macleodii prédominent largement dans les deux banques. Les auteurs s'interrogent

alors sur la très forte micro-variabilité de séquence qu'ils n'attribuent pas uniquement à un grand

nombre d'opérons rrn dans cette souche mais à un possible mécanisme adaptatif.

Les études moléculaires des communautés bactériennes de l'eau mer ont confirmé que les

techniques culturales n'avaient permis d'accéder qu'à une très faible part de la diversité. Si on retrouve

toujours les même grands groupes bactériens (Proteobacteria α et γ , Cytophagales) de nouveaux

phyllums sont apparus à proximité ou au sein de ces groupes. On peut considérer toutefois que l'un

des apports majeurs de l'approche moléculaire dans l'étude des communautés microbiennes marines

a été la découverte, en grande quantité et de manière ubiquitaire, de deux grands groupes d'Archaea


68

rattachés aux Euryarchaeota et aux Crenarchaeota visiblement non associées à des conditions

physico-chimiques extrêmes.

4.2.2.1 L'archaeoplancton océanique et côtier

En 1992, à quelques mois d'intervalle, Fuhrman et al. (1992) et DeLong (1992) détectent dans

des eaux prélevées à 100 et 500 m de profondeur dans l'océan Pacifique (Fuhrman) et dans les eaux

côtières d'Amérique du Nord (DeLong) des séquences de micro-organismes branchant profondément

à la base des Crenarchaeota (Marine Group I - DeLong, 1992; Fuhrman et al., 1992; Fuhrman et al.,

1993) et des séquences associées aux Euryarchaeota mais formant là encore un clade bien distinct

(Marine Group II - DeLong, 1992; Fuhrman et al., 1993). Leur abondance semble indiquer qu'elles

interviennent activement dans les cycles chimiques océaniques et ne correspondraient donc pas à

des micro-organismes au métabolisme thermophile ou halophile comme le sont leur plus proches

"voisins" isolés. De plus le G+C% de leur ADNr (I : 0,51, II : 0,55-0,57) est inférieur à celui observé pour

des souches thermophiles (entre 0,60 et 0,69). DeLong propose alors que ces Archaea pourraient

correspondre soit à des méthanogènes soit à des Archaea mésophiles, aérobies10. Par la suite

l'analyse d'échantillons provenant d'eau de surface de l'Antarctique (DeLong et al., 1994) a confirmé

l'abondance des Archaea dans le picoplancton marin (jusque 34% de la biomasse procaryotique).

Ensuite des séquences associées au groupe I furent détectées dans l'estomac d'une Holoturie (Mc

Inerney et al., 1995), parmi les symbiotes d'une éponge (Preston et al., 1996) et parmi d'autres

échantillons de bactérioplancton (Stein et al., 1996; McInerney, 1997). Des séquences associées au

groupe II ont été détectées dans l'estomac de poissons (van der Maarel et al., 1998). L'approche

utilisée par Stein est particulièrement séduisante quoique fastidieuse. Elle consiste à cloner non pas

un produit d'amplification mais des fragments génomiques extraits de l'environnement. On dispose

donc à la fois de l'information phylogénétique en recherchant dans la banque de fosmides les gènes

codants pour l'ARNr 16S11 et d'informations sur le métabolisme en analysant les autres gènes

contenus dans la banque. Il faut toutefois garder à l'esprit que les gènes clonés ne sont pas forcément

exprimés. Enfin l'étude réalisée par l'équipe de DeLong à l'aide de sondes nucléiques spécifiques des

groupes I et II semble indiquer une zonation dans la colonisation de la colonne d'eau. Le groupe I serait

dominant en profondeur alors que le groupe II proliférerait en surface (Massana et al., 1997).

La détection de nouvelles Crenarchaeota dans des échantillons de sol (Bintrim et al., 1997),

d'un champ de soja (Ueda et al., 1995), de sources chaudes terrestres (Barns et al., 1994) et marines

(Takai et Sako, 1999) et de sédiments lacustres (MacGregor et al., 1997), ainsi que les séquences

d'Archaea associées au groupe II détectées avec d'autres Euryarchaeota (proches des

10 Une étude réalisée sur les éthers lipidiques présents dans la colonne d'eau associe ces derniers à des Archaea mais leur nature les

distingue clairement des méthanogènes (Hoefs et al., 1997 dans Vetriani et al, 1998). Les Crenarchaeota non thermophiles restent la

source principale de tétraéthers lipidiques dans les échantillons de plancton marin (DeLong et al., 1998). Des Archaea méthanogènes

ont toutefois été détectées dans des échantillons d'eau de mer, associées à des particules ou dans l'estomac de poissons (van der

Maarel et al., 1999)11 Un "screening" plus complet de banque fosmidique a permis par la suite de détecter des séquences de clones associées aux

Panctonomycetales (Vergin et al., 1998).


69

Methanosarcinales et des Halophiles) dans des sédiments de marais salants (Munson et al., 1997) et

sur des racines de riz (Großkopf et al., 1998b) nous amène à considérer ces "nouveaux" micro-

organismes comme les Archaea les plus représentées à la surface du globe (Olsen, 1994; Schleper,

1999)12.

4.2.3 Les fosses océaniques

Les fosses océaniques constituent des environnements particulièrement atypiques. En plus

de supporter des températures basses (2°C) les micro-organismes (bien souvent psychrophiles) se

développant dans de tels environnements (jusqu'à 10000 mètres de profondeur) doivent supporter

de très fortes pressions. On retrouve donc jusqu'à 4000 mètres de profondeur des micro-organismes

barotolérants, entre 5000 et 6000 mètres de profondeur des micro-organismes barophiles et des

barophiles stricts à des profondeurs avoisinants les 10000 mètres, nécessitant pour certains 700 bars

de pression minimale pour se développer (Yayanos et al., 1981; Nogi et Kato, 1999).

Très peu d'études à ce jour ont mis à profit les méthodes moléculaires pour analyser les

échantillons provenant de fosses océaniques. Seuls les travaux de Kato et al. (1997) et de

Yanagibayashi et al. (1999) associant les extractions directes et les techniques de culture en pression

et sans pression suivies d'extraction font référence. Récemment Li et al. (1999) ont comparé après

extraction de l'ADN total et séquençage la composition de sédiments abyssaux prélevés à différentes

profondeurs (entre 1159 m et 6482 m de profondeur). Ils n'ont pas observé de différences majeures

entre les échantillons dominés, pour la plupart, par des séquences proches de Pseudomonas, du

symbiote de Solemya velum ou des Proteobacteria ε.

4.3 Les zones sédimentaires marines et lacustres

4.3.1 Description du biotope

Interfaces entre le milieux terrestre et le milieu aquatique, entre des zones aérobies et

anaérobies, les sédiments sont le siège d'importants processus biogéochimiques impliquant les

principaux cycles de matière (N, C, S, O). La disponibilité de ces différents constituants dans la couche

de sédiments ainsi que les échanges de matières réalisés avec l'eau vont entraîner une forte zonation

des micro-organismes présents dans les sédiments en fonction de leur type métabolique et de leur

préférendum (cf. figure 2.5).

12 Des études similaires à celles effectuées sur les Procaryotes ont été entreprises sur les picoeucaryotes océaniques. En effet la taille

de ces organismes ainsi que la difficulté à les obtenir en culture ou à maintenir les cultures pures ont favorisé l'emploi de

méthodologies moléculaires pour accéder à la diversité eucaryotique de certains échantillons (Lim, 1996; Guillou, 1999). L'une des

techniques consiste à analyser les ADNr 16S plastidiaux contenus dans les banques de séquences (Rappé et al., 1998). Les ADNr

plastidiaux constituent dans cette étude près de 47% de la banque bactérienne.


70

En dehors des sédiments abyssaux qui sont aérés sur plusieurs mètres, les sédiments

présentent une couche oxygénée très fine et donc une succession de types respiratoires microbiens

très rapide. On a donc affaire à des micro-organismes réalisant des respirations aérobies sur les toutes

premières couches de sédiments puis plus profondément des bactéries fermentaires ou des bactéries

réalisant des respirations anaérobies en utilisant les nitrates (bactéries dénitrifiantes), les sulfates

(bactéries sulfato-réductrices) ou les carbonates (bactéries méthanogènes). De la même façon un

gradient s'établit entre les bactéries aérobies, anaérobies facultatives, microaérophiles et anaérobies

strictes. La disponibilité de la matière organique va conditionner quant à elle la présence de micro-

organismes hétérotrophes et chimio-autotrophes alors que le rayonnement lumineux à la surface du

sédiment va favoriser la présence de photoautotrophes.

Les techniques de culture classiques

ont conduit à l'isolement de nombreux genres

bactériens associés aux différents types

métaboliques décrits précédemment. Parmi

les plus spectaculaires on peut citer

Thiomargarita namibiensis, une bactérie sulfo-

oxydante accumulant les nitrates dans une

grande vésicule qui permet à cet organisme

d'atteindre 750 µm de diamètre (Schlulz et al.,

1999). C'est à ce jour le plus gros Procaryote

connu. Dans ces zones où l'oxygène et l'H2S

coexistent sous forme de gradient (stables ou

versatiles en raison des courants, de la marée,

des pluies qui remettent les sédiments en

suspension) on peut observer des micro-organismes accumulant le soufre sous forme de granules

internes Thioplaca ou Beggiatoa (Jørgensen et Gallardo, 1999; Teske et al., 1999) ou sous forme de

très longs filaments externes créant de véritables réseaux "mycéliens" dans les gradients d'O2 et d'H2S

(Taylor et Wirsen, 1997; Taylor et al., 1999).

4.3.2 Les techniques moléculaires

L'application des techniques moléculaires a contribué à accroître le nombre d'espèces

détectées dans cet environnement. Comme pour les études de sols, le problème principal a été

l'extraction d'ADN des échantillons de sédiments. Dès 1992 Rochelle et al. proposent des techniques

d'extraction couplées à des amplifications à partir d'échantillons de différentes profondeurs. Par la

suite, les travaux d'extraction d'ADN à partir d'échantillons de sols (cités § 3.1.3) servirent de

référence.

AIR

EA

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O2

NO3-

SO42-

HCO3-

Respiration aérobie

Fermentation

Respiration nitrate

Respiration sulfate

Methanogénèse

Bactéries aérobies

Bactéries fermentatives

Bactéries dénitrifiantes

Bactéries sulfato-réductrices

Bactéries méthanogènes

O2

H2O

NO3-

N2

SO42-

H2S

HCO3-

CH4

Bactéries sulfo-oxydantes+

H2S

S

Figure 2.5. Représentation schématique des populations

bactériennes dans les couches de sédiments (d'après Marty et al.,

1988).


71

Compte tenu du rôle des bactéries sulfato-réductrices dans les mécanismes de production

d'H2S dans les sédiments, ces dernières ont été couramment étudiées: soit après extraction de l'ADN

total de l'échantillon et amplification à l'aide d'amorce spécifique des BSR affiliées aux Proteobacteria δ

(Devereux et Mundfrom, 1994), soit après extraction et détection à l'aide de sondes spécifiques de

ces mêmes BSR (Trimmer et al., 1997). Une étude récente réalisée sur des échantillons de sédiments

lacustres côtiers et profonds s'est attachée à étudier les BSR après isolement, séquençage de l'ADNr

16S et empreinte génomique ("genomic fingerprints") (Sass et al., 1998). Les auteurs ont ainsi

observé que même si leur souches correspondaient majoritairement (70%) au même genre

(Desulfovibrio) et présentaient de très fortes similarités d'ADNr 16S, leur contenu génomique, et donc

leur capacité physiologique, étaient très variables. Ce résultat permettrait d'attribuer l'hypervariabilité

de séquences de phénotypes proches à des souches ayant des rôles métaboliques distincts.

Des études s'intéressant à la diversité globale de l'échantillon ont été aussi réalisées :

Ø sur des échantillons de sédiments côtiers près de Seattle (Etats-Unis) où malgré le peu de clones

analysés (22 essentiellement bactériens) les auteurs observent une grande diversité

phylogénétique dans leur échantillon (Gray et Herwig, 1996). L'étude réalisée par Wise et al. (1997)

sur des échantillons prélevés dans une baie en Caroline (Etats-Unis) avec peu de clones (35 clones

bactériens) démontre encore cette très grande diversité.

Ø sur des échantillons marins provenant de sédiments sableux et boueux (Mer de Wadden en

Allemagne) hybridés à l'aide d'un grand nombre de sondes sur différentes profondeurs (Llobet-

Brossa et al., 1998)13. Un des points marquants de cette étude est la détection de séquences

associées aux Proteobacteria ε proches du genre Arcobacter.

Ø sur des sédiments coquilliers continentaux où Vetriani et al. (1998) détectent pour la première fois

dans ce biotope des séquences associées aux Archaea pélagiques proches du groupe I et d'autres

proches du groupe II. Puis sur des sédiments profonds où ces séquences sont de nouveau

détectées (Vetriani et al., 1999)

Ø des séquences similaires sont détectées (Crenarchaeota groupe II et méthanogènes) dans des

sédiments d'un lac du Michigan (Etats-Unis) (MacGregor et al., 1997; Schleper et al., 1997a). Les

séquences crearchaéennes semblent être plus abondantes dans la zone oxique du sédiment où

elles n'interviennent toutefois que pour 10% de l'ensemble des ARN archaéens.

Ø sur des sédiments lacustres d'origine postglaciaire sur lesquels une étude complète a été entreprise

(comptage total, comptage de bactéries viables, culture, extraction et séquençage) (Miskin et al.,

1998). Les 14 clones bactériens se répartissent parmi les Firmicutes à haut et bas G+C% et parmi les

Proteobacteria β et δ, et 9 clones archaéens sont quant à eux associés aux méthanogènes.

Ø enfin sur des sédiments lacustres datés de plus de 9000 ans où des séquences associées aux

bactéries pourpres sulfureuses sont détectées (à l'aide d'amorces genre-spécifique : Chromatium) et

analysées par DGGE et séquençage (Coolen et Overmann, 1998).

13 Cette étude a été suivie d'une analyse plus poussée concernant les Proteobacteria γ soufre oxydantes du genre Thiomicrospira, par

comptage, culture, amplification et DGGE (Brinkhoff et al., 1998).


72

D'une manière similaire aux études menées à partir d'échantillons de sols, la diversité

microbienne associée au sédiments marins ou lacustres s'avère être très importante. La part que

prennent chacun des groupes phylogénétiques détectés dans les processus géochimiques reste

malgré tout encore à définir. Si extraordinaire que semble être la découverte de nouveaux phylums

archaéens ou bactériens, il ne semble pas que ceux-ci interviennent de manière prépondérante dans

les communautés. Les études sont donc à poursuivre en s'attachant a définir les rôles que chaque

micro-organisme détecté peut tenir dans le biotope étudié.

4.4 Les sources hydrothermales océaniques profondes

Les mouvements de la croûte terrestre (ou tectonique des plaques) ont généré à la surface du

globe des zones d'anfractuosités où de l'eau (de mer ou douce) entre parfois en contact avec le

magma profond (cf. figure 2.6).

Figure 2.6. Représentation des zones d'accrétion et de subduction.

De droite à gauche : création de la lithosphère au niveau de la dorsale médio océanique. La surface du bassin océanique s'accroît alors

que sur la gauche la plaque plus ancienne glisse sous une marge passive continentale. Cette subduction est accompagnée de la

création d'une faille profonde et l'accroissement de température sur cette zone de friction crée un arc volcanique (par exemple les îles

japonaises) et une nouvelle zone d'accrétion dans le bassin arrière arc (d'après Press, F. et Siever, R. (1978) Earth (second edition).

W.H. Freeman, San Francisco).

Ces zones sont le siège de phénomènes hydrothermaux. Chargée en métaux, l'eau émerge

soit au niveau de sites océaniques profonds, de sites marins côtiers ou de sites terrestres. Ces deux

derniers sont connus depuis fort longtemps car ils sont le siège de phénomènes spectaculaires

comme les geysers (Parc de Yellowstone (USA), site de Geysir (Islande) pour les plus connus mais

aussi Russie, Nouvelle Zélande, Japon, Chili et Açores), les solfatares (Solfatara (Italie), Açores) ou les

émergences côtières (Vulcano (Italie), Ile de Santorin (Grèce), Iles Kouriles (Russie), Afrique). Si la

présence des sites hydrothermaux profonds était connue (ou supposée) déjà depuis plusieurs


73

années, il faut attendre la fin des années 70 pour que les premières plongées profondes mettent à

jour la formidable vie associée à ces sites.

4.4.1 Nature et structure des émissions hydrothermales profondes

4.4.1.1 Localisation des sources

La carte (figure 2.7) présente une liste non exhaustive des sites hydrothermaux étudiés

jusqu'à présent, où une faune associée a été observée (d'après Chevaldonné, 1996).

On retrouve des sites hydrothermaux profonds dans des zones à forte activité tectonique :

- Soit à proximité des zones d'accrétion, le long des dorsales médio-océaniques.

(Middle Atlantic Ride (MAR), East Pacific Ride (EPR), légende ____).

- Soit à proximité de zones de subduction, au niveau des bassins arrière arc (Bassin

de Lau, Bassin Nord Fidjien, légende tt).

Figure 2.7. Emplacements des sites hydrothermaux marins sur le globe

4.4.1.2 Composition du fluide hydrothermal

Les sources étudiées jusqu'à présent sont situées entre 700 et 4000 mètres de profondeur.

Dans ces zones où la croûte océanique a été fragilisée, l'eau de mer froide et dense s'infiltre. Elle est

alors portée à très haute température, très forte pression et peut atteindre le stade de fluide

supercritique. Sous cet état sa fluidité augmente ainsi que son pouvoir solvant. Elle remonte donc en

surface, et en percolant dans la lithosphère des échanges chimiques importants sont réalisés avec la

roche crustale. Les sulfates réagissent avec le fer contenu dans la roche pour produire du sulfure

d'hydrogène (H2S) ou des oxydes de fer, le magnésium réagit avec les hydroxydes et la silice. Le fluide

hydrothermal se charge en gaz dissous (H2S, CH4, CO, CO2, H2) et en métaux (Si, Mn, Fe, Zn). Ce fluide

est anoxique, acide, de salinité variable et ne contient pas de magnésium, de sulfates, de nitrates et de

phosphates. Sa composition contraste donc très fortement avec celle de l'eau de mer.


74

La température, le débit et la composition du fluide hydrothermal sont variables selon le site

étudié et même selon les points d'émission sur un même site. Ces données vont conditionner la forme

sous laquelle le fluide va être émis et les types de faunes associées.

4.4.1.3 Edification des cheminées hydrothermales

(d'après Erauso, 1994; Chevaldonné, 1996)

Les fumeurs noirs

Si le fluide en remontant dans la lithosphère ne subit pas de dilution avec l'eau de mer, il est

émis en surface à de très fortes températures (jusqu'à 400°C) et à un débit important (0,7-2,4 m.s-1)

(Converse et al. 1984). Il entre alors en contact avec l'eau de mer et forme une matrice poreuse de

sulfates (barytine ou anhydrite). La paroi de l'édifice croît alors verticalement et des grains de sulfure de

cuivre, de zinc et de fer se déposent sur la croûte externe (cf.

figure 2.8). Par la suite, la forte température du fluide induit le

dépôt d'une couche interne de sulfures de cuivre et de fer en

formant un conduit. La perméabilité de l'édifice diminue alors que

de nouveaux sulfures se déposent à la place de l'anhydrite. Les

minéraux s'arrangent de manière concentrique, stabilisant la

structure de la cheminée et créant un gradient de température

horizontal dans l'édifice. La communauté microbienne associée à

ce type de cheminée est essentiellement de type thermophile ou

hyperthermophile. On observe très peu d'Eucarya à proximité de

la zone d'émission de ces cheminées. La colonisation par des

bivalves ou des gastéropodes et les vers est plus éloignée de la

cheminée.

Les fumeurs blancs ou diffuseurs

Lorsque le fluide sort à des températures moins

élevées (<280°C), des cheminées riches en zinc peuvent alors

se former. Elles sont qualifiées de diffuseur car le conduit

central de la cheminée est absent ou très étroit et le fluide

diffuse à très faible vitesse (0,5 m.s-1) au travers d'un réseau de

petits canaux dans la cheminée. La cheminée va alors croître

dans toutes les directions car les dépôts de minéraux vont se

faire très lentement (cf. figure 2.9)

Ces diffuseurs peuvent être surmontés d'une structure en nid d'abeille au sein de laquelle des

échanges importants entre l'eau de mer et le fluide ont lieu. Ces structures très poreuses sont idéales

pour étudier les zonations de peuplement qui s'établissent en fonction des gradients de nutriments et

Figure 2.8. Fumeur noir sur le site du

Bassin Nord Fidjien

Figure 2.9. Diffuseur sur le site du Snake Pit

(MAR)


75

de température. On y retrouve aussi bien des micro-organismes mésophiles que thermophiles. Ces

structures sont toutefois très difficiles à échantillonner car elles sont très fragiles.

Les autres structures

En fonction de la composition du fluide et de sa célérité, d'autres types d'édifices vont être

rencontrés. Certaines cheminées sont dépourvues de sulfures et sont essentiellement constituées

d'anhydrite ("La Dame Blanche" dans le bassin nord Fidjien). Pour d'autres, le fluide a traversé une

couche de sédiments au cours de sa remontée. Le conduit de la cheminée est alors constitué de

dépôts argileux. Enfin des structures horizontales sont parfois observées. Elles se constituent

progressivement lorsque le fluide émis le long d'une surface verticale rencontre un obstacle qui initie

le dépôt des minéraux. Le fluide retenu sous ces constructions s'en échappe par les bords ou en

percolant au travers de la structure. Il se crée alors un gradient de température dans l'épaisseur de la

structure qui favorise la colonisation par une grande diversité de micro-organismes (Delaney , 1998).

4.4.1.4 Autres types d'émission

L'émission des fluides hydrothermaux peut ne pas conduire à la formation d'édifices, c'est le

cas par exemple dans le bassin de Guaymas ou au fond du lac Tanganyika. En plus des structures

classiques en cheminée, le fluide percole au travers de sédiments d'origine planctonique très riches

en matière organique et en sulfates. Ses sédiments sont le siège d'une forte activité sulfato-réductrice

se produisant à différentes profondeurs (donc à différentes températures) dans les sédiments ( pour

revue Elsgaard, 1995). Ces biotopes abritent une communauté bactérienne très riche qui se nourrit de

la matière organique présente en grandes quantités dans ces bassins.

Des suintements froids, ou à faible température, observés à proximité des marges passives

(Golfe de Californie, Golfe du Mexique), sont colonisés par une faune similaire à celle des sites

hydrothermaux profonds. La communauté microbienne est quant à elle essentiellement mésophile.

Récemment Hinrichs et al. (1999) ont analysé, par amplification et séquençage de l'ADNr 16S, la

communauté microbienne se développant dans les sédiments à proximité des suintements de

méthane émanant des réserves de méthane solidifié ("methane hydrates"). En plus de la flore

anaérobie de sulfato-réducteurs et de Gram +, les auteurs détectent des séquences associées aux

méthanogènes mésophiles (Methanomicrobiales et Methanosarcinales). L'analyse du contenu

lipidique de leur échantillon et le suivi du 13C leur permet de supposer que parmi les séquences

proches des méthanogènes certaines souches utiliseraient le méthane solidifié comme source de

carbone. La présence dans ces échantillons de sulfato-réducteurs laisserait supposer que ces

nouvelles souches réaliseraient une oxydation anaérobie du méthane en utilisant les sulfates comme

accepteurs d'électrons (Hinrichs et al., 1999; Summons, 1999).


76

4.4.2 Faune associée à l'écosystème hydrothermal

L'une des caractéristiques les plus remarquables des sources hydrothermales est la faune que

l'on peut y observer. Jusqu'en février 1977 (date des premières plongées réalisées par John Corliss et

John Edmond) les fonds sous-marins étaient considérés comme des espaces désertiques. Ces oasis

de vie que représentent ces nouveaux biotopes ont alors considérablement bouleversé la biologie,

remettant en question le dogme d'une vie impossible sans lumière (Corliss et Ballard, 1977; Corliss et

al., 1979).

Les premiers prélèvements réalisés sur des sites hydrothermaux entre les Iles Galápagos et

l'Equateur permirent de collecter les premiers spécimens de Calyptogena magnifica et de

Bathymodiolus thermophilus, deux mollusques se développant à proximité des fumeurs noirs. Par la

suite, de nombreux autres organismes ont été isolés de cet écosystème. Parmi ceux-ci les

vestimentifères : Riftia pachyptila et Tevnia jerichonana, les polychètes appartenant aux genres

Alvinella (pompejana et caudata) et Paralvinella. Les crevettes Rimicaris exoculata sont quant à elles

uniquement présentes sur les sites de la dorsale médio-Atlantique.

Cette faune est caractérisée par (d'après Laubier 1989; Tunnicliffe, 1991, 1992 cités dans

Cornec, 1995):

¬ Une dépendance vis à vis du système hydrothermal.

Une biomasse très importante répartie sur des surfaces limitées de l'ordre de 10 kg.m-2 (contre

quelques grammes par m2 dans les zones intra-plaques).

® Un fort taux d'endémisme : 97% de la faune observée sur ces sites est taxonomiquement distincte

de celle observée à des profondeurs équivalentes.

Un nombre important d'espèces nouvelles de grande taille appartenant à des taxons nouveaux (du

genre jusqu'à l'embranchement).

Mais l'une des caractéristiques les plus importantes de cette faune est son développement

inféodé aux symbiotes dont elle tire son énergie (voir plus loin) (Wirsen et al. 1993)

Les Riftia, les Alvinella et les

Rimicaris sont probablement les

organismes les plus surprenants de ce

biotope.

Les premiers (cf. figure 2.10)

sont de long vers pouvant atteindre 2

mètres de long pour 4-5 cm de diamètre.

Ils se développent en véritables

buissons pouvant atteindre une densité

de 100 à 200 individus au m2. Ces vers

dépourvus de système digestif tirent leur

énergie des producteurs primaires qu'ils

abritent dans leur trophosome, des

Figure 2.10. Colonie de Riftia pachyptila (photo site University of

Washington)


77

bactéries sulfo-oxydantes endosymbiotiques. Ces bactéries sont alimentées en H2S par

l'hémoglobine des Riftia qui possède la capacité de fixer aussi bien l'O2, le CO2 que l'H2S. Une fois

l'échange réalisé au niveau du trophosome l'hémoglobine transporte l'H+ à l'extérieur du ver.

L'hémoglobine de Riftia assure l'alimentation des symbiotes et la protection du vers vis à vis de l'H2S

hautement toxique en le transportant sous une forme stable (pour revue récente voir Zal, 1999).

Les seconds (cf. figure 2.11) sont des Alvinellidés

vivant dans des tubes construits en surface des

cheminées, mais ils peuvent aussi se déplacer librement

sur le site hydrothermal pour se nourrir de bactéries.

L'une des caractéristiques majeures de ces vers est la

présence d'une importante communauté épibiotique de

bactéries filamenteuses (voir plus loin) (pour revue

Desbruyères et al., 1998; et pour analyse moléculaire

Haddad et al., 1995; Cary et al. 1997). Si la majeure partie

de la faune se développant dans les sites hydrothermaux

se trouve dans des zones "froides" (20-30°C), les

Alvinellidés sont quant à eux fréquemment rencontrés à

proximité d'émissions à très haute température. A de

nombreuses reprises il a été observé des vers traversant le panache de fluide à la sortie d'un fumeur

où la température dépassait les 100°C (Chevaldonné et al., 1992). La température à l'intérieur des

tubes dans lesquels ces vers se réfugient correspond à un très fort gradient thermique de 60°C (entre

22°C à la sortie du tube et 81°C au fond du tube) (Cary et al., 1998).

La troisième communauté (cf. figure

2.12) très fréquemment rencontrée sur les

sites hydrothermaux de la MAR est

constituée par les crevettes du genre

Rimicaris. Rimicaris exoculata constitue une

biomasse très importante sur ces sites de 25

à 50000 individus.m -2 (Segonzac et al.,

1993; Van Dover, 1994). Elles ingèrent des

petites particules de soufre recouvertes de

bactéries et sont elles-mêmes recouvertes

de bactéries filamenteuses sur leur carapace

et autour de leur orifice buccal (Polz et

Cavanaugh, 1995).

Ces crevettes considérées auparavant

Figure 2.11. A. pompejana. Photo C. Cary. Taille 6 cm.

On observe à la surface du vers les filaments bactériens

qui dominent la communauté épibiotique.

Figure 2.12. Des essaims de Rimicaris exoculata broutant à la surface

d'une cheminée. On observe la tache blanche à la surface de la crevette

correspondant à l'oeil. Photo E. Gaten.


78

comme aveugles possèdent à la surface de leur céphalo-thorax un oeil fonctionnel dont le caractère

ancestral a été discuté (Gaten, 1998; Gaten et al. 1998a et b; Hering et al., 1999).

4.4.3 Les micro-organismes des sources hydrothermales

La découverte des sources hydrothermales, où la vie en l'absence de lumière s'était

développée, a incité de nombreux scientifiques à rechercher l'activité microbienne source de la

production primaire chimiolithotrophique. C'est en 1979 que Jannasch et Wirsen (entre autres) ont mis

en évidence cette présence pour la première fois en indiquant le rôle prépondérant dans cet

écosystème des bactéries sulfo-oxydantes sous une forme libre, associées symbiotiquement à la

macrofaune ou dans des consortiums microbiens (Jannasch et Wirsen, 1979). Par la suite, de

nombreuses études (comptages, techniques de culture, mesure de l'activité du métabolisme) ont

permis de mettre à jour une flore microbienne aux métabolismes et aux préférendums très diversifiés.

Si ces dernières années l'accent a été mis préférentiellement sur l'étude des micro-organismes

thermophiles, peu de choses sont en fait connues des micro-organismes mésophiles (Baross et

Deming, 1995). L'emploi récent des techniques moléculaires devrait nous permettre d'appréhender

l'écosystème hydrothermal dans sa globalité.

4.4.3.1 Habitats et types métaboliques microbiens

On considère actuellement que les communautés microbiennes s'établissent au sein des

écosystèmes hydrothermaux océaniques dans les habitats suivants (Karl, 1995) (cf. figure 2.13) :

¬ Les micro-organismes vivant sous une forme libre dans le fluide hydrothermal. Ces micro-

organismes se développeraient dans une biosphère souterraine sous-jacente aux cheminées et

seraient transportés par le fluide. Ce concept de biosphère souterraine (cf. § 3.2.2) expliquerait

l'ubiquité de certains micro-organismes dans des zones où la croûte terrestre profonde entrerait en

contact avec des milieux plus superficiels. C'est le cas par exemple des Thermoccoccales, des

Méthanogènes des Archaeoglobales retrouvées sur la quasi totalité des sites hydrothermaux

profonds et côtiers et au sein des réservoirs pétroliers (Prieur et al., 1995).

Les micro-organismes se développant à la surface des cheminées ou des roches proches des

émissions et qui seraient alimentés en nutriments par le fluide. On distingue les micro-organismes

se développant dans les cheminées (essentiellement thermophiles) des micro-organismes se

développant sous forme de tapis à proximité des cheminées (essentiellement mésophiles). La

présence de tapis bactériens très abondants est l'une des caractéristiques majeures de certains

sites hydrothermaux (Jannasch et Wirsen, 1981; Prieur, 1992). Ces enchevêtrements constituent

des zones frontières à la fois en contact avec des zones aérobies (l'eau de mer) et anaérobies (le

fluide). Le type de cheminée, sa porosité principalement, va influer sur la profondeur de

colonisation des micro-organismes. Afin d'étudier la communauté capable de se développer à la

surface des cheminées, différentes expériences ont été menées. Elles consistaient soit à prélever

directement le tapis microbien afin de réaliser des cultures d'enrichissement et des isolements, soit


79

à mettre à proximité du fluide des coupons de différentes matières (Téflon, acier, porcelaine,

métaux, plastiques) durant des durées d'expositions variables (Prieur et Ferra, résultats non

publiés dans Prieur, 1992; Guezennec et al., 1998)

® Les micro-organismes se développant en ecto- ou endo-symbiose avec les macro-organismes

colonisant les cheminées : vers polychètes, vestimentifères, mollusques. L'étude des symbiotes

associés aux mollusques des sources hydrothermales constitue la plus ancienne référence à

l'utilisation des techniques moléculaires pour accéder à la diversité microbienne d'un échantillon

(Stahl et al., 1984).

Les micro-organismes retrouvés dans les panaches ("plume") de fluides hydrothermaux. Ces

derniers correspondent à de l'eau de mer enrichie par les minéraux communément retrouvés dans

le fluide. Ces panaches peuvent atteindre des tailles considérables (700m d'épaisseur pour 20 km

de diamètre) (Winn et al., 1995).

° Enfin les micro-organismes se développant dans les sédiments où le fluide peut percoler comme

c'est le cas dans le bassin de Guaymas.

Oxydation/précipitation par mélange avec l'eau de mer froide environnante

FeS + O2

Mn + O2

Fe(O)OH

MnO2

Communauté Thermophiles/Mésophiles

Sous forme libre

SO réduit en S2-

4

2-Lessivage de Ca2+, Mn2+, Mg2+,Fe2+ et Cu2+

BASALTE

350°C

350°C

Eau de mer chaufféeenrichie en minéraux

350°C

Zone de mélange des eauxTempérature moyenne

20 à 40°C

Fort débitTempérature élevée

1-3 km

Percolation de l'eau de mer froide

Communauté MésophilesSous forme libre/

Sous forme de mats

Macr aune

Communauté bactériennemésophile symbionte

Communauté bactériennedans les panaches

100°C

200°C

300°C

400°C

50 à 100°C

Figure 2.13. Schéma de fonctionnement d'une source hydrothermale océanique

(d'après Jannasch et Mottl, 1985).

Si les bactéries sulfo-oxydantes et méthanotrophes semblent constituer le premier maillon de

la chaîne alimentaire de l'écosystème hydrothermal, la chimiolithoautotrophie ne constitue pas le seul

type métabolique et énergétique rencontré au sein des sources hydrothermales. De nombreux

auteurs ont proposé une liste des métabolismes bactériens observés ou potentiellement observables

à proximité des émissions de fluide (cf. tableau 2.4 d'après Prieur et al., 1987; Jannasch, 1995; Karl,

1995).


80

Tableau 2.4. Métabolismes microbiens observés d'isolats de sources hydrothermales profondes

Donneur Accepteur Source Température Type Processus

d'électron d'électron de carbone de réaction respiratoire métabolique

S2- O2 CO2 méso, hyper Aérobie Oxydation de sulfures

S° O2 CO2 méso, hyper Aérobie Oxydation du soufre

S2O32- O2 CO2 méso, hyper Aérobie Oxydation du thiosulfate

Fe2+ O2 CO2 méso Aérobie Oxydation du fer

Mn2+ O2 [CH2O] méso Aérobie Oxydation du manganèse

NH4+, NO2- O2 CO2 méso Aérobie Nitrification

CH4, CO O2 CH4, CO2, CO méso Aérobie Oxydation du méthane

et des composés en C1

[CH2O] O2 [CH2O] méso, hyper Aérobie Hétérotrophie aérobie

H2 O2 CO2 méso, hyper Aérobie Oxydation de l'hydrogène

H2 NO3- CO2 méso, hyper Anaérobie Dénitrification

H2 S° CO2 hyper Anaérobie Sulfo-réduction

H2 SO42- CO2 méso, hyper Anaérobie Sulfato-réduction

H2 CO2 CO2 méso, hyper Anaérobie Méthanogénèse

S2-, S°, S2O32- NO3

- CO2 méso Anaérobie Dénitrification, Sulfo-oxydation

[CH2O] S° [CH2O] hyper Anaérobie Hétérotrophie soufre réducteur

[CH2O] SO42- [CH2O] méso, hyper Anaérobie Hétérotrophie sulfatoréductrice

[CH2O] NO3- [CH2O] méso Anaérobie Dénitrification

[CH2O] [CH2O] [CH2O] méso, hyper Anaérobie Fermentation

méso : mésophile; hyper : hyperthermophile

4.4.3.2 Abondance des micro-organismes

Les comptages réalisés sur des échantillons provenant de différents sites donnent des

résultats très variables en fonction de la technique de comptage utilisée et du type d'échantillon

analysé (cf. tableau 2.5).

Tableau 2.5. Densité microbienne sur les sites hydrothermaux

Echantillon Température Densité Références (°C) $ (Cellules.ml-1); £ (Cellules.g-1);

& (Cellules.cm-2)

Fluide à basse température <50 5-10 106 $ Jannasch et Wirsen, 1979

<50 <2 106 $ Karl, 1987; Straube et al., 1990

<50 108-109 $ Corliss et al., 1979

Fluide à haute température 304 5 105 $ Baross et al., 1984

174-357 <3 105 $ Straube et al., 1990

Cheminée 65-80 2 105-5 107 £ Harmsen et al., 1997a

104-1010 £ Chevaldonné et Godfroy, 1997

Flange 20-100 et+ 106->108 Baross et Deming, 1995

Colonisation sur coupon 2 104-5 105 & (3 jours) Prieur et Ferra (com. perso.)

3 105-5 107 & (10 jours) " "

Colonisation sur Vent Cap 20 -80 4 108-2 109 $ (2-5 jours) Ce manuscrit (Article 3)

Sédiments 80-104 2 107-2 108 £ Hoaki et al., 1995

Tubes A. pompejana face externe 2-3 106 & Chevaldonné, 1989

Tubes A. pompejana face interne 0,4-2 106 & " "

Endobiote (R. pachyptila) 3 109 £ trophosome (humide)14 Cavanaugh et al., 1981

Ectobiote (R. exoculata) 8,5 106 (cellules/individu) Poltz et Cavanaugh, 1995

14 Le trophosome correspond à 40-60% du poids total du ver, ce qui fait des vers des animaux chimioautotrophes (Felbeck et

Childress, 1988)


81

Les trois méthodes principales de numération sont les comptages sur boites, la méthode par

dilution (NPP) et la microscopie. Les résultats obtenus par les deux premières méthodes sont

entachés des erreurs inhérentes à toute technique culturale. Les méthodes microscopiques sont

quant à elles entachées de l'erreur "humaine". Il est en effet difficile de distinguer au microscope

certaines cellules des granules de soufre qui présentent parfois une très forte autofluorescence. Je

reviendrai dans la troisième partie sur les techniques mises au point pour limiter les erreurs de

comptage en microscopie.

4.4.3.3 Les micro-organismes isolés de tapis microbiens et d'échantillons d'eau de

mer

Les micro-organismes mésophiles

Les premières observations réalisées sur les tapis microbiens du bassin de Guaymas ont

indiqué la présence de bactéries soufre-oxydantes se présentant sous la forme de longs filaments et

associées aux genres Beggiatoa et Thiothrix (Jannasch et Wirsen, 1981; Jannasch et al., 1989). Ces

micro-organismes autotrophes oxydent l'H2S en utilisant les nitrates accumulés dans une large

vacuole. Ces enchevêtrements peuvent atteindre des épaisseurs de 10 ou 20 cm et sont aussi

observables à proximité des suintements froids (Ahmad et al., 1999; Nealson, 1999). Une souche

sulfo-oxydante, autotrophe associée au genre Arcobacter a été retrouvée dans les sédiments chauds

du bassin de Guaymas. Cette souche préalablement observée dans des sédiments côtiers produit

d'importants filaments de soufre (de 0,5 à 5 µm de diamètre pour 20 à 500 µm de long) qui pourraient

servir de facteur d'initiation pour la colonisation des Alvinella (Taylor et Wirsen, 1997; Taylor et al.,

1999).

La plupart des isolats obtenus à partir d'échantillons de fluides ou de surfaces exposées aux

fluides correspondent à des bactéries soufre-oxydantes autotrophes ou mixotrophes associées aux

genres Thiomicrospira, Thiobacillus (Durand et al., 1993; Jannasch et al., 1985; Ruby et al., 1981). Des

études récentes effectuées sur un isolat de Thiomicrospira prélevé sur la dorsale médio-Atlantique,

indiquent que ce dernier correspondrait à une Thiomicrospira crunogena préalablement isolée dans le

Pacifique (Wirsen et al., 1998). Cette espèce semble donc présenter une répartition ubiquitaire. Mais

un grand nombre d'autres bactéries soufre-oxydantes hétérotrophes ou mixotrophes ont été isolées

de milieux hydrothermaux. Elles sont associées aux genres Pseudomonas, Acinetobacter et Vibrio

(Durand et al., 1994). Des bactéries sulfato-réductrices associées au genre Desulfovibrio ont été

isolées à partir d'échantillons provenant de la Ride Est-Pacifique (Elsgaard et al., 1991). Jannasch dans

sa revue (1995) rapporte l'isolement de bactéries oxydant le méthane du genre Methylococus et de

bactéries oxydant l'hydrogène du type des Hydrogenomonas. Des bactéries mangano-oxydantes et

des bactéries résistantes à de fortes concentrations en métaux lourds ont été isolées de coupons

colonisés et d'échantillons de moules et d'Alvinellidés (Ehrlich et al., 1983; Durand et al., 1990;

Jeanthon et Prieur, 1990). Elles sont associées aux genres Pseudomonas, Aeromonas et Vibrio. La

recherche de bactéries productrices d'exopolysaccharides à partir de divers échantillons


82

hydrothermaux a conduit à l'isolement de souches apparentées aux Vibrio et aux Alteromonas

(Vincent, 1993; Raguenes et al., 1997 a et b). Enfin des bactéries nitrifiantes, hétérotrophes, aérobies

ont été isolées à partir d'échantillons de cheminées actives sur le site 13°N, EPR et dans le bassin de

Guaymas (Mevel et al., 1996). Ces bactéries correspondent majoritairement à des Pseudomonas et

des Alcaligenes . Récemment une souche aérobie anoxygénique photosynthétique a été isolée à

2000m de profondeur dans un panache hydrothermal (Yurkov et Beatty, 1998). Cette présence

atypique (à de telles profondeurs) mais significative (près de 10% des enrichissements) n'est pas

expliquée par les auteurs.

Les micro-organismes mésophiles associés à la macrofaune

La majeure partie de la faune observée au niveau des sites hydrothermaux présente de fortes

associations avec des micro-organismes sulfo-oxydants15. Ces symbioses correspondent à des

associations hôtes-bactéries très spécifiques qui ont été étudiées dans le cas des vestimentifères

Riftia pachyptila, des mollusques bivalves Bathymodiolus thermophilus et Calyptogena magnifica, des

gastéropodes Alviniconcha hessleri et Neomphalus fretterae, des polychètes annélidés Alvinella

pompejana et A. caudata, des crustacés Rimicaris exoculata et R. chacei (Prieur, 1992; Nealson et

Fisher, 1995). L'ensemble de ces études souffre de l'impossibilité d'isoler les symbiotes de leur hôte.

Seules des techniques de mesure d'incorporation d'isotopes stables de carbone et d'azote, des

recherches d'enzymes impliquées dans le cycle de Calvin et des observations des tissus par

microscopie électronique à balayage et à transmission avaient permis, avant l'emploi des techniques

de séquençage et de marquage moléculaire, d'établir les relations trophiques s'établissant entre l'hôte

et les bactéries (Prieur, 1992). Si les relations nutritionnelles entre les ectobiotes d'A. pompejana et de

R. exoculata ne sont pas encore complètement établies16 (Poltz et Cavanaugh, 1995; Cary et al.,

1997; Desbruyères et al., 1998), celles entre les endobiotes et les mollusques ou les vestimentifères

des sources hydrothermales ont été plus étudiées et l'emploi des techniques moléculaires a permis

d'accroître considérablement le champ des connaissances sur les mécanismes relationnels hôtes-

symbiotes (Nealson, 1999; cf. § 4.4.3.4).

Les micro-organisme s thermophiles

Définition de la thermophilie

La température est l'un des facteurs qui conditionnent la vie sur terre17. On peut alors diviser le

monde vivant en trois groupes principaux, en fonction des températures optimales de croissance : les

psychrophiles se développant à de faibles températures, les mésophiles se développant à des

températures moyennes et les thermophiles se développant à des températures élevées.

15 Il a été aussi observé des symbioses avec des micro-organismes méthanotrophes chez Bathymodiolus (Cavanaugh et al., 1992;

Distel et al., 1995; Nealson et Fisher, 1995).16 Une étude a été menée par Poltz et al. (1998) afin d'établir (par assimilation de carbone marqué, techniques moléculaires de

marquage, etc.) les relations que R. exoculata entretenait avec ses ectobiotes.17 La température influe sur la structure des molécules (notamment des protéines et de l'ADN) et sur la disponibilité de l'eau par

exemple.


83

Les Archaea et les Bacteria thermophiles peuvent être divisées en trois sous-groupes (cf. figure 2.14):

Thermophiles modéres

Thermophiles extrêmes

Hyperthermophiles

Vit

esse

de

crois

sanc

e

Température (°C)

Frontière de la thermophilie (50 à 60°C)

Figure 2.14. Répartition des micro-organismes thermophiles (d'après Brock,

1986)

Ø les thermophiles modérés, dont

la température maximale de croissance

(Tmax) ne dépasse pas 70°C,

Ø les thermophiles extrêmes ,

capables de se développer au delà de

85°C,

Ø les hyperthermophiles, dont la

température optimale de croissance

(Topt) est supérieure à 90°C.

La notion de frontière de thermophilie, d'organismes mésophiles et thermophiles modérés ne

fait pas l'unanimité. On peut toutefois définir pour chaque organisme trois points cardinaux : la

température minimale, Tmin, à partir de laquelle la croissance est possible; le taux de croissance

augmente ensuite presque linéairement jusqu'à la Topt, puis généralement chute brutalement dans les

5 à 10°C qui suivent jusqu'à Tmax18.

Isolement des micro-organismes thermophiles

Les fortes températures relevées au sein des sites hydrothermaux profonds ont conduit à

rechercher des micro-organismes thermophiles et hyperthermophiles. Le tableau 2.6 présente les

principaux genres thermophiles isolés au sein des sources hydrothermales profondes.Tableau 2.6. Micro-organismes thermophiles isolés de sources hydrothermales profondes (d'après la revue de Stetter, 1996).

Domaine Genres Optimum Métabolisme Références

(°C) énergétique

BACTERIA Thermus 60-70 Hétérotrophe, aérobie Marteinsson et al., 1995

Bacillus 60-80 Hétérotrophe, aérobie Marteinsson et al., 1996

Thermotoga 80 Fermentaire, anaérobie Marteinsson et al., 1997

Thermosipho 70 Fermentaire, anaérobie Antoine et al., 1997

Desulfurobacterium 70 Autotrophe, anaérobie L'Haridon et al., 1998a et b

ARCHAEA

Euryarchaeota Thermococcus 80-90 Fermentaire, anaérobie Kobayashi et al., 1994

Pyrococcus 95-100 Fermentaire, anaérobie Erauso et al., 1993

"Palaeococcus" Fermentaire, anaérobie Takai et al., 1998 (resul. non pub.)

Archeaoglobus 83 Mixotrophe, anaérobie Burggraf et al., 1990

Methanococcus 85 Methanogène, anaérobie Jones et al., 1983;*

Methanopyrus 98 Methanogène, anaérobie Kurr et al., 1991

Crenarchaeota Staphylothermus 92 Hétérotrophe, anaérobie Fiala et al., 1986

Pyrodictium 97 Hétérotrophe, anaérobie Pley et al., 1991

Pyrolobus Autotrophe, aérobie Blöchl et al., 1997

Desulfurococcus 85-90 Fermentaire, anaérobie Jannasch et al., 1988

* Jeanthon et al., 1998, 1999 a et b

18 D'une manière analogue aux courbes d'efficacité enzymatique, les courbes de croissance des micro-organismes en fonction de la

température sont les résultantes de la combinaison de la loi d'Arrhenius jusqu'à la Topt et de la dénaturation du micro-organisme jusqu'à

la Tmax.


84

La plupart de ces micro-organismes sont des anaérobies stricts (hétérotrophes fermentaires,

méthanogènes ou sulfato-réducteurs) appartenant au domaine des Archaea . Mais il a été possible

d'isoler certaines Bacteria thermophiles (§ tableau 2.6). Il s'agit généralement de souches appartenant

à des genres déjà décrits au niveau des sources côtières ou terrestres. Ce phénomène pourrait être

expliqué soit par l'ubiquité de ces souches au sein des différents points chauds du globe, soit par un

biais lié aux techniques de cultures toutes issues d'études des environnements côtiers et ne tenant

pas compte de l'un des principaux paramètres: la pression (Prieur, 1997).

Les applications industrielles des souches thermophiles

Ces dix dernières années les études portant sur les Archaea et les Bacteria ont amené les

chercheurs à s'intéresser aux propriétés de ces micro-organismes pouvant se développer dans des

conditions extrêmes de pH, de température et de salinité. Leur capacité à produire des enzymes très

stables a très rapidement été étudiée par les industriels. Toutefois si certains de ces organismes

étaient déjà employés depuis longtemps (Archaea méthanogènes) d'autres, bien qu'offrant des

perspectives fort intéressantes, entraient en concurrence avec des bactéries déjà sur le marché et

beaucoup plus simples à produire en grande quantité. D'autre part les conditions optimales de

croissance (température, pression, anaérobiose) rendent complexe la mise en culture de telles

souches(Cowan, 1992).

Les Archaea thermophiles ont surtout été pressenties par les industriels pour les

caractéristiques de leurs enzymes. Les avantages apportés par l'utilisation d'enzymes thermophiles et

thermostables par rapport aux enzymes classiques sont :

Ø un gain de temps (pas de refroidissement) Ø une diminution des coûts de refroidissement

Ø l'amélioration de la stérilité Ø la possibilité d'extraction de composés volatils

Ø la réduction de la viscosité

La thermostabilité d'une protéine implique le plus souvent une meilleure résistance aux agents

dénaturants et à la protéolyse. Il faut garder à l'esprit que des enzymes thermostables ne réagiront pas

plus rapidement que des enzymes classiques. La vitesse de réaction d'une enzyme ayant son

optimum de température à 90°C ne sera pas 32 fois supérieure à celle de l'enzyme ayant une Topt de

37°C (la loi d'Arrhenius prévoit en effet un doublement de la vitesse de réaction pour une

augmentation de 10°C). Ceci est dû à des relations structure-fonction qui accroissent certes la stabilité

mais réduisent la flexibilité de l'enzyme aux faibles températures (Cowan, 1992). On peut augmenter la

vitesse d'une réaction en utilisant une enzyme thermostable, lorsqu'à des températures élevées le

substrat est plus susceptible d'être catalysé. C'est le cas des mécanismes de dégradation des

polymères protéiques et glucidiques.

Le tableau 2.7 donne un aperçu des applications actuelles des enzymes extraites des micro-

organismes extrêmophiles.


85

Tableau 2.7. Applications biotechnologiques des extrêmophiles

Organismes extrêmophiles Enzymes / Composé organique Applications Produits

Thermophiles 50 - 110°C Amylases Glucose,Fructose , Edulcorants

Xylanases Blanchiment du papier

Protéases Acides aminés produits de la kératine, détergents,

agro-alimentaire : cuisson, brasserie.

ADN-polymérases, Intéines Biologie moléculaire

Psychrophiles 0 - 20°C Protéases neutres Production laitière et fromagère

Protéases, Amylases, Lipases Additifs de dégradation dans les détergents

Acides gras polyinsaturés Industrie pharmaceutique

Déshydrogénases Biocapteurs

Acidophiles pH < 2 Oxydation des sulfures Désulfuration des minerais et du charbon

Alcaliphiles pH > 9 Cellulases, Protéases Additifs de dégradation dans les détergents

Amylases, Lipases

Cyclodextrines Stabilisation de substances volatiles

Antibiotiques Industrie pharmaceutique

Halophiles 3 - 20% sel Carotène Colorants alimentaires

Glycérol et additifs solubles Industrie pharmaceutique

Membranes Surfactants pour l'industrie pharmaceutique

Barophiles Amylase, Protéases Agro-alimentaire, Industrie pétrolière

(d'après Querellou et al., 1999; site programme européen (voir note bas de page n°19))

L'un des domaines d'application courant de telles enzymes est celui de la biologie moléculaire.

La PCR a ouvert le champ à l'utilisation de nombreuses enzymes thermostables. Dans un premier

temps la Taq polymérase extraite de la Bacteria Thermus aquaticus a remplacé le fragment de Klenow

qui exigeait des manipulations longues et était thermosensible, puis de nouvelles polymérases plus

fidèles ont été extraites d'organismes hyperthermophiles (voir pour revue récente Quérellou, 1999).

D'autres domaines d'applications de la biologie moléculaire peuvent être envisagés:

Applications ind ustrielles (König, 1989; Cowan, 1992; Querellou et al., 1999) : 75% des enzymes

utilisées dans le monde le sont dans les industries des détergents, de l'amidon et du lait. Si des

enzymes thermostables pouvaient logiquement intervenir dans de telles industries, il faudrait toutefois

que cette substitution aux enzymes classiques soit commercialement intéressante. Il faut rappeler

notamment que :

Ê Certains procédés industriels ne sont pas compatibles avec des températures élevées (ex :

industrie fromagère).

Ë Certains procédés fonctionnent de préférence à faible température (ex : détergents).

Ì Des enzymes suffisamment thermostables sont déjà utilisées (ex : saccharification de l'amidon).

Í Parfois il n'y a pas d'intérêt à augmenter la température de réaction (ex : certaines réactions de

chimie fine sur les acides aminés ou les pénicillines).

Î L'augmentation de productivité à haute température peut ne pas couvrir l'augmentation des

coûts de chauffage.

Par conséquent l'utilisation d'une enzyme thermostable doit être dictée par les règles suivantes :

À L'enzyme doit être disponible dans des quantités équivalentes à une enzyme classique.


86

Á Son prix par unité d'activité doit être plus faible.

Â Ses performances doivent être significativement supérieures à l'enzyme classique.

Ã Son utilisation ne doit pas entraîner de modifications majeures de l'équipement existant.

Il s'avère donc difficile de remplacer par des enzymes extraites d'Archaea thermophiles les

enzymes déjà présentes sur le marché. L'emploi d'enzymes thermostables devra donc plutôt

s'orienter vers de nouvelles niches d'utilisation (cf. tableau 2.8).Tableau 2.8. Domaines d'applications des enzymes issues de micro-organismes thermophiles

Enzymes Applications

A.D.N. ligases recherche d'enzymes plus thermostables, plus processives et plus fidèles que la Taq polymérase

classique.

Alcool-déshydrogénases des alcools secondaires DH thermostables pourraient avoir de nombreuses applications en

chimie pour la production de molécules chirales. Leur résistance aux produits de réaction (alcool,

aldéhydes et cétones) rendent les DH de Sulfolobus solfataricus et de Hyperthermus butylicus

intéressantes.

Estérases permettant des réactions en milieu non liquide.

Enzymologie en phase gazeuse à l'aide de l'alcool DH de S. Solfataricus. Cette technique permettrait de minimiser l'emploi de

solvant.

Biolixiviation jusqu'à présent des Bacteria mésophiles étaient utilisées à très grande échelle (500 tonnes par an)

pour le traitement du minerai d'uranium. L'emploi d'Archaea sulfo- et métalo-oxydantes

thermophiles se limitait à la récupération de métaux précieux. Les Archaea acidophiles

Sulfolobus, Acidianus et Metallosphaera pourraient être d'un usage intéressant dans le cas de bio-

lixiviation thermodépendante. Le problème réside dans la sensibilité parfois trop forte aux métaux

de ces bactéries dans les réacteurs.

Actuellement le marché des enzymes et des autres composés issus de micro-organismes

extrêmophiles correspondrait à 17 milliards de dollars. Les programmes européens du type

"Extrêmophiles, usines cellulaires"19 ainsi que le séquençage de génomes totaux de micro-

organismes hyperthermophiles20 témoignent de l'intérêt grandissant des industriels pour ces

souches. Toutefois une exploitation à grande échelle de ces enzymes tarde encore à venir.

4.4.3.4 L'apport des techniques moléculaires

Les environnements hydrothermaux ont constitué l'un des premiers champs d'essai des

techniques moléculaires pour accéder à la diversité microbienne en s'affranchissant de toute étape de

culture (Stahl et al., 1984; Lane et al., 1985a). Les premiers échantillons analysés provenaient des

symbiotes de R. pachyptila, de C. magnifica et de Soleyama velum. Ces études confirment par analyse

des ARNr 5S l'affiliation de ces symbiotes avec les bactéries soufre-oxydantes correspondant aux

Proteobacteria γ (appelées alors bactéries pourpres). L'engouement suscité par l'emploi de telles

méthodes a conduit à l'analyse d'échantillons (coupons colonisés) provenant de sites hydrothermaux

terrestres (Octopus Spring dans le Parc de Yellowstone, Stahl et al., 1985) et à la publication de

nombreuses revues dans les années qui ont suivi (Pace et al., 1985, 1986 a et b; Olsen et al., 1986;

Turner et al., 1989). Par la suite les limites de détermination des souches liées à la petite taille du 5S

19 Extremophiles as cell factories http://www.tu-harburg.de/tv/ecf/ecf0_1.htm.20 Sur 17 génomes microbiens séquencés , 5 correspondent à des micro-organismes hyperthermophiles.


87

entraînèrent les scientifiques vers l'analyse des gènes codants pour l'ARNr 16S (1500 nucléotides

contre 120 pour le 5S). Après la mise au point d'une technique rapide et efficace de séquençage

(Lane et al., 1985b), les premières études de diversité microbienne fondées sur l'analyse des gènes

codants pour l'ARNr 16S ne sont appliquées qu'en 1990 en milieu hydrothermal continental (Ward et

al., 1990 a et b) et en 1994 et 1995 par Moyer et al. en milieu profond.

Jeanthon (1999) propose une revue très complète sur l'emploi des techniques moléculaires

en milieu hydrothermal profond. Ces dernières ont permis d'étudier à la fois les bactéries associées à la

macro-faune comme celles présentes sous une forme libre;

ce sont :

Ê les travaux de Poltz et Cavanaugh sur les ectobiotes de R. exoculata (Poltz et Cavanaugh, 1995),

Ë les travaux de l'équipe de Cary sur les symbiotes d'A. pompejana (Haddad et al., 1995; Cary et al.,

1997),

Ì les travaux de Distel sur les symbiotes de Riftia par étude du gène de l'ADNr 16S (Distel et al.,

1988, 1994),

Í les travaux de l'équipe de Vrijenhoek sur la co-évolution des symbiotes et de leur hôte chez

Calyptogena (Peek et al., 1998)et chez Riftia (Feldman et al., 1997),

Î les travaux de Moyer sur des tapis microbiens d'un site hydrothermal du Pacifique (Moyer et al.,

1994, 1995, 1998)

Ï les travaux de Harmsen sur la quantification à l'aide de sondes nucléiques des micro-organismes

de cheminées hydrothermales d'un site Atlantique (Harmsen et al., 1997 a et b)

Ð les travaux de Riley sur les communautés méthanogènes des cheminées (Riley, 1997, 1999)

Ñ les travaux de Takai sur des sources côtières et profondes au large du Japon (Takai et Horikoshi,

1999; Takai et Sako, 1999),

Des travaux Ê et Ë on retiendra la prédominance dans les banques d'ADNr 16S de phylotypes

bactériens associés aux Proteobacteria ε parmi les épibiotes de R. exoculata et A. pompejana. Ces

épibiotes correspondent dans les deux cas à de longs filaments situés sur l'épiderme dorsal des

annélides et sur des excroissances buccales des crustacés. Cette prédominance a été confirmée par

des expériences d'hybridation in situ ou de Dot-blot sur des échantillons d'animaux21. De plus il

semblerait que l'association bactérie-hôte ne soit pas exclusive. En effet il a été détecté dans

l'environnement proche des animaux (tubes externes des annélides, surfaces des roches) des

phylotypes similaires à ceux observés à la surface des animaux (jusque 60% des bactéries détectées à

la surfaces des roches dans le cas du symbiote de R. exoculata). Les épibiotes de R. exoculata

pourraient de plus correspondre à des bactéries pléomorphes comme l'indiquent les expériences

d'hybridation menées sur 3 morphotypes différents à l'aide d'une sonde spécifique du symbiote.

Les travaux Ì et Í confirmèrent les premières études portant sur l'ADNr 5S, sur le

positionnement phylogénétique des symbiotes de Riftia. Par contre il a été possible de définir deux

21 La présence de séquences associées à d'autres Proteobacteria ε a été aussi détectée dans le trophosome de vestimentifères

proches de suintements froids (Naganuma et al., 1997)


88

modes d'acquisition probables du symbiote pour les mollusques et les vestimentifères. Alors que les

symbiotes de Riftia n'ont jamais été détectés dans les oeufs ou les tissus juvéniles des vers et que le

même symbiote est retrouvé sur des individus d'origines géographiques distinctes ou des individus

de genre proche (Ridgea piscesae) (laissant supposer un mode d'acquisition horizontal du symbiote),

les symbiotes thioautotrophes de Calyptogena étaient quant à eux retrouvés dans les oocytes du

mollusque (mode d'acquisition vertical). La forme libre du symbiote de Riftia n'a jamais été détectée

dans l'environnement proche des vers, mais le gène codant pour une flagelline a été détecté dans

l'endosymbiote (Millikan et al., 1999). La forme libre du symbiote pourrait donc être mobile.

Les travaux Î effectués sur des échantillons de tapis microbien confirment eux aussi la

prédominance dans les banques d'ADNr 16S de phylotypes bactériens associés aux Proteobacteria ε

(différents des précédents). Ces phylotypes ne correspondent à aucun micro-organisme isolé de

source hydrothermale. La séquence bactérienne la plus proche est celle de Thiomicrospira

denitrificans22 une bactérie sulfo-oxydante chimiolithoautotrophe pouvant dénitrifier et isolée de

sédiments marins côtiers. Ces micro-organismes pourraient revêtir un rôle dans le cycle du soufre au

sein des écosystèmes hydrothermaux. Le second phylotype le plus abondant correspond à une

Proteobacteria γ proche de Xanthomonas sp. récemment isolée d'eau douce, oxydant l'ion Fe2+

(Emmerson et Moyer, 1997). En ce qui concerne les séquences archaéennes, Moyer (1998) détecte

2 groupes principaux de séquences répartis parmi les Archaea marines du groupe I (Crenarchaeota) et

les Archaea marines du groupe II (Euryarchaeota). Ces dernières ont été aussi détectées dans les

échantillons provenant de la dorsale médio-Atlantique (Reysenbach et al., 1999, résultats non

publiés).

Sur des échantillons de cheminée provenant du même site, Harmsen (Ï) détecte une forte

proportion (40%) de bactéries hybridant à la fois avec la sonde bactérienne et avec la sonde ciblant les

Aquificales. Ces micro-organismes s'avéreront correspondre aux Desulfobacteriaceae isolées des

mêmes échantillons (L'Haridon et al., 1998). Malgré l'isolement de Thermus, de Bacillus et de

Thermotoga de ces échantillons, seul ce dernier genre a pu être détecté par hybridation in situ . Ces

études confirment de plus que la colonisation microbienne est plus abondante à l'extérieur qu'à

l'intérieur des cheminées (avec de plus en plus de Bacteria par rapport aux Archaea à mesure que l'on

se rapproche du centre de la cheminée).

L'un des problèmes majeurs lors des études moléculaires d'échantillons hydrothermaux est rencontré

durant l'extraction d'ADN 23.

Riley (Ð) a probablement solutionné ce problème en extrayant directement l'ADN à bord du

bateau à l'aide d'un Ribolyser (Hybaid). Il lui a ainsi été possible d'obtenir de l'ADN génomique

amplifiable à l'aide d'amorces ribosomales. Il n'a toutefois pas pu détecter de méthanogènes comme il

l'aurait désiré.

22 Le genre Thiomicrospira est mal attribué car il ne s'agit pas ici d'une Proteobacteria γ comme les autres Thiomicrospira isolées

d'environnements hydrothermaux (Muyzer et al., 1995)23 Ce problème a été reporté d'ailleurs sur des échantillons hydrothermaux par Reysenbach et al., 1998.


89

Takai (Ñ) est quant à lui parvenu à extraire de l'ADN procaryotique d'échantillons de fumeurs

profonds. Une exploitation rapide des échantillons ainsi qu'une technique efficace de broyage et de

filtration des échantillons lui a permis de disposer de suffisamment d'ADN pour réaliser des

amplifications et des clonages. Il a observé une très forte diversité de séquences archaéennes se

répartissant parmi des phylums déjà détectés dans les sources profondes (Archaeoglobales,

Methanoccoccales) mais aussi parmi de nombreux nouveaux phylums dont certains sont associés aux

Euryarchaeota, aux Crenarchaeota et aux Korarchaeota. De manière très surprenante aucune

Thermoccoccales n'a été détectée durant ces études.

Les conditions extrêmes de température, de pression ainsi que les forts gradients physico-

chimiques observés dans des écosystèmes hydrothermaux profonds font de ces sites des candidats

idéaux pour les études moléculaires de la diversité. Jusqu'à présent les résultats obtenus laissent

augurer une diversité très abondante qui ne dément pas le qualificatif "d'oasis" qui avait été attribué

aux sources il y a 20 ans.

4.5 Les sites hydrothermaux continentaux et côtiers

4.5.1 Description des biotopes

4.5.1.1 Les sites terrestres

D'une manière analogue aux systèmes profonds, les systèmes continentaux et côtiers sont

liés à la rencontre d'eau d'infiltration avec le magma profond. Le parcours de cette eau dans la croûte

terrestre va conditionner sa composition chimique et sa forme d'émergence (fumerolles, geysers,

mares de boues acides ou basiques).

S'il s'infiltre une faible quantité d'eau, celle ci va s'échapper sous la forme de fumerolles comme c'est le

cas à Pozzuoli en Italie. Mais souvent ces émissions sont associées à une activité hydrothermale plus

diversifiée. Ainsi, aux fumerolles placées en haut des collines sont souvent associés des geysers et

des sources chaudes situées quant à elles dans la partie basse du bassin.

Les fumerolles et les geysers

(cf. figure 2.15) correspondent à

l'émission d'un fluide très minéralisé

qui a traversé profondément la croûte

terrestre et qui ressort violemment à

100°C dans le cas des geysers ou qui

recircule sur de longues distances

dans la lithosphère pour ressortir sous

formes de vapeurs (fumerolles).

Il existe deux formes de sources chaudes , en fonction du type de

Photos ParkVision.

Figure 2.15. Old Faithfull Geyser (à droite) et

fumerolles (en haut) au parc de Yellowstone (USA).


90

minéraux dont se sera chargé le fluide en traversant la lithosphère. S'il est chargé en acide sulfurique le

pH sera de 1 à 2,5. S'il est par contre chargé en carbonate ou en bicarbonate il sera de l'ordre de 6,3 à

10,2.

Dans les sources acides (cf. figure 2.16), on relève

une forte concentration en soufre et en fer mais une très

faible minéralisation (l'eau n'a pas pénétré profondément

dans le sol). Les gaz volcaniques qui s'échappent de la

source sont chargés en H2, CO2, H2, H2S, CO et NH3. En

arrivant au contact de l'air les sulfures sont oxydés en S°.

Cette oxydation est poursuivie par les bactéries soufre-

oxydantes qui produisent alors de l'acide sulfurique

H2SO4. Il peut se former de manière concomitante des

mares de boues acides. Elles seront très acides en

surface (pH 0,5 à 4) et anoxiques et plus basiques en profondeur. Elles ne constituent pas par contre

un biotope stable car les eaux de pluie modifient très régulièrement leur pH.

Les sources alcalines correspondent à des eaux

ayant circulé en profondeur dans la croûte terrestre (cf.

figure 2.17). Très chargées en minéraux qui vont se

solidifier au contact de l'air, elles constituent un biotope

très stable car les eaux de profondeur les alimentent

régulièrement et tamponnent les effets liés aux eaux de

pluie. Ces écosystèmes sont caractérisés par la

présence d'amas bactériens très stratifiés. Les sources

du parc de Yellowstone ont fait l'objet d'études très

poussées et de suivis réguliers dont des synthèses ont

été proposées récemment par D. Ward et al. (1998) et

par Reysenbach (en préparation).

4.5.1.2 Les sites côtiers

On observe des sites hydrothermaux à faible profondeur

sur les côtes de l'île Vulcano en Italie et à proximité des côtes

Islandaises (cf. figure 2.18). Comme dans les sites profonds on peut

retrouver des petites cheminées émettant un fluide chargé en H2S

mais on peut aussi observer le fluide qui percole parmi les

sédiments ou le sable. Les températures sont alors proches de

100°C mais ne peuvent atteindre de très fortes valeurs du fait de la

faible pression hydrostatique.Figure 2.18. Emissions côtières sur le site de Vulcano.

Source site web de la municipalité de Vulcano.

Il existe aussi un hydrothermalisme lacustre. Certains lacs situés sur les failles actives sont le

Figure 2.16. Bassin de boues acides dans le Upper

Geyser Bassin. Photos ParkVision. Yellowstone (USA)

Figure 2.17. Fountain Paint Pot Photo Park Vision.

Yellowstone (USA)


91

siège de phénomènes d'hydrothermalisme. Le fluide hydrothermal peut percoler aux travers de

sédiments à faible température ou sortir à des températures plus élevées en édifiant de petites

cheminées.

4.5.2 Les micro-organismes des sites côtiers et continentaux

Les sites hydrothermaux côtiers et terrestres ont fait l'objet de nombreuses études. En effet

leur facilité d'accès (par rapport aux sites océaniques profonds)24 permet de réaliser des suivis et des

collectes d'échantillons d'une manière beaucoup plus simple donc beaucoup plus fréquente. Ceci

explique en partie la grande diversité de souches isolées aussi bien de milieux marins que terrestres.

De plus les isolements réalisés en surface ou proches de la surface permettent d'accéder à une

communauté aérobie ou micro-aérophile sûrement moins abondante dans les gisements profonds. Il

ne semble pas qu'il y ait des genres particulièrement inféodés aux milieux terrestres et d'autres aux

milieux marins. En effet, de nombreuses souches ont été retrouvées de manière ubiquitaire dans des

sources côtières après avoir été décrites dans des sources continentales. Seules certaines

sulfothermophiles acidophiles n'ont pu être isolées de milieu marin.

4.5.2.1 Les souches mésophiles marines et continentales

Les souches mésophiles observées dans les écosystèmes marins côtiers sont les mêmes que

celles observées en milieux profonds. On retrouve notamment des bactéries sulfo-oxydantes

associées aux genres Beggiatoa et Thioplaca (Hoaki et al., 1994, 1995) et de nombreuses

hétérotrophes (Gugliandolo et Maugeri, 1998). Dans certains sédiments on retrouve la communauté

microbienne associée aux sédiments froids (BSR, méthanogènes, dénitrifiantes, voir § 4.3.1).

En milieu terrestre le facteur de dilution observé en milieu marin n'a pas cours. Les

écosystèmes sont beaucoup plus stables et sont aussi beaucoup moins étendus. Les écosystèmes

terrestres chauds ne vont donc être colonisés que par de pures thermophiles (modérées à

hyperthermophiles).

4.5.2.2 Les souches thermophiles marines et continentales.

Les écosystèmes terrestres tels que ceux observés au Parc de Yellowstone aux USA

constituent les premiers milieux d'étude des micro-organismes thermophiles. En 1964 Thomas Brock

se rend pour la première fois au Parc de Yellowstone afin d'isoler des représentants du genre Thiotrix.

Les relevés de température qu'il réalise l'incitent à rechercher des micro-organismes capables de se

développer aux températures observées in situ. En 1965 il observe et tente de cultiver de longs

filaments roses, particulièrement abondants à la sortie du fluide et dans un bassin qui deviendra par la

suite un bassin de référence pour les études microbiologiques : l'Octopus Spring25 (Brock, 1995). Si la

24 Les sites côtiers ne nécessitent pas de submersibles et sont souvent accessibles par de simples plongeurs.25 Cette source fait la couverture de la 8éme édition de "Biology of Microorganisms" de T. Brock.


92

position phylogénétique de ces filaments a été définie en 1994 (Reysenbach et al., 1994) ces

derniers vont rester incultivables jusqu'aux travaux de l'équipe de Stetter (Huber et al., 1998b) qui va

mettre au point une chambre de culture recréant les conditions de croissance in situ , notamment en

recréant les surfaces permettant la fixation des filaments exposés à un flux chaud de nutriments, et va

utiliser des pinces optiques pour isoler spécifiquement les micro-organismes qui seront remis en

culture par la suite.

Mais l'une des découvertes majeures réalisée à Yellowstone est l'isolement en 1966 de

Thermus aquaticus qui deviendra en 1980 la source de l'enzyme clé de la biologie moléculaire la Taq

polymérase (Brock et Freeze, 1969 puis Saiki et al., 1985, 1989).

Le tableau 2.9 présente l'ensemble des bactéries thermophiles isolées de sites terrestres et côtiers.

Tableau 2.9. Bacteria isolées de sites hydrothermaux terrestres et côtiers

Domaine Genres Optimum Origine Type Références

BACTERIA (°C) Respiratoire

Acidothermus sp. 55 t aérobie Mohagheghi et al., 1986

Aquifex sp. 85 m microaérobie Huber et al. , 1992

Alicyclobacillus (=Bacillus) 60-80 t/m aérobie (Darland et Brock 1971) Wisotzkey et al., 1992.

Calderobacterium 75 t aérobie Kryukov et al. , 1983

Chloroflexus 50 t aérobie Pierson et Castenholz,1974

Fervidobacterium 70 t anaérobie Patel et al., 1985

Hydrogenobacter 70-75 t aérobie Kawasumi et al. , 1984

Miothermus 60-70 t aérobie Chung et al. , 1997

Moorella 60 t ananérobie Slobodkin et al., 1997a

Rhodothermus 65 m aérobie Alfredsson et al. , 1988

Synechococcus 65 t aérobie

Thermoanaerobacter ium 60 t anaérobie Schink et Zeikus, 1983

Thermoanaerobacter 65 t anaérobie Zeikus et al. , 1979

Thermobrachium 55 t anaérobie Engle et al., 1996

Thermocrinis 80 t aérobie Huber et al. , 1998b

Thermodesulfobacterium 70 t anaérobie Zeikus et al., 1983

Thermodesulfovibrio 60 t anaérobie Henry et al., 1994

Thermoleophilum 60 t aérobie Zarilla et Perry, 1986

Thermomicrobium 73 t aérobie Jackson et al., 1973

Thermonema 60 t aérobie Hudson et al., 1989

Thermosipho 75 m anaérobie Huber et al., 1989b

Thermosyntropha 60 t anaérobie Svetlitshnyi et al., 1996

Thermoterrabacterium 65 t anaérobie Slobodkin et al. , 1997b

Thermothrix 72 t anaérobie Caldwell et al. , 1976

Thermotoga 80 m anaérobie Huber et al. , 1986

Thermus 60-70 t aérobie Brock et Freeze, 1969

t: terrestre; m: marine cotière, Acido: acidophile

D'une manière analogue le tableau 2.10 présente l'ensemble des souches d'Archaea

thermophiles isolées d'environnements hydrothermaux terrestres et côtiers.


93

Tableau 2.10. Archaea isolées de sites hydrothermaux terrestres et côtiers.

Domaine Genres Optimum Origine Type Références

ARCHAEA (°C) Respiratoire

Euryarchaeota

Thermococcales Thermococcus 80-90 t,m anaérobie Zillig et al. , 1983b

Pyrococcus 95-100 m anaérobie Fiala et Stetter , 1986.

"Aphrodite" m anaérobie Arab,1999 (result. non pub.)

Archaeoglobales Archeaoglobus 83 t,m anaérobie Stetter, 1988

Ferroglobus 85 m anaérobie Hafenbradl et al. , 1996

Méthanococcales Methanococcus 65 m anaérobie Huber et al. , 1982

Méthanobactériales Methanobacterium 55-65 t anaérobie Winter et al. , 1984

Methanothermus 83-88 t anaérobie Stetter et al. , 1981

Thermoplasmales Thermoplasma 59 t,m Acido, aérobie Darland et al. , 1970

Picrophilus 60 t Acido, aérobie Scleper et al. , 1995

Crenarchaeota

Thermoprotéales Thermoproteus 88-90 t anaérobie Zillig et al. , 1981

Thermofilum 80-88 t anaérobie Zillig et al. , 1983a.

Pyrobaculum 100 t, m anaérobie Huber et al. , 1987

Thermocladium 75 t anaérobie Itoh et al. , 1998

Désulfurococcales Desulfurococcus 85-90 t anaérobie Zillig et al. , 1982

Staphylothermus 92 m anaérobie Fiala et al. , 1986

Stetteria 93 m anaérobie Jochimsen et al., 1998

Sulfolobales Sulfolobus 65-87 t Acido, aérobie Zillig et al. , 1980

Sulfurisphaera 85 t Acido, aérobie Kurosawa et al., 1998

Stygiolobus 80 t Acido, aérobie Segerer et al. , 1991

Mettalosphaera 75 t Acido, aérobie Huber et al. , 1989a

Sulfurococcus 70-75 t Acido, aérobie Karavaiko et al. , 1994

Desulfurolobus 81 t Acido, aérobie = Acidianus sp.

Acidianus 70-90 t, m Acido, aérobie Segerer et al. , 1985

Pyrodictiales Pyrodictium 80 m anaérobie Stetter et al. , 1983

Hyperthermus 95-106 m anaérobie Zillig et al. , 1990

non-classés Aeropyrum 90-95 m aérobie Sako et al. , 1996

Caldococcus t Aoshima et al. , 1996

Igneococcus t Burggraf et al. , 1997

Sulfophobococcus 90 t anaérobie Hensel et al. , 1997

Thermodiscus 93 m Burggraf et al. , 1997

Thermosphaera 85 t anaérobie Huber et al. , 1998a

t: terrestre; m: marine côtière, Acido: acidophile

Au sein de nombreux écosystèmes terrestres, notamment les sources chaudes à pH neutre,

on retrouve comme producteurs primaires des thermophiles modérés bactériens réalisant la

photosynthèse. Ces bactéries appartiennent aux cyanobactéries du genre Synechococcus ou

Mastigocladus et des bactéries vertes non sulfureuses (GNS) du genre Chloroflexus.

4.5.2.3 L'apport des techniques moléculaires

Sur les sites hy drothermaux côtiers

D'une manière analogue aux sites profonds, très peu d'études ont été réalisées afin de

déterminer la diversité microbienne des sites côtiers par des méthodes moléculaires. Les sources

étudiées jusqu'à présent sont des sources situées à proximité des côtes japonaises ou près des îles

grecques. Yamamoto et al. (1998) ont étudié la diversité microbienne d'enchevrêtrements bactériens

soufrés par séquençage de l'ADNr 16S cloné et par hybridation in situ. Ils observent :


94

- qu'il n'est pas possible d'amplifier de l'ADN archaéen,

- que les banques de 16S diffèrent selon qu'elles sont construites à partir du lysat brut ou de l'ADN

purifié du lysat (diversité plus abondante dans le dernier cas),

- que ces séquences bactériennes sont majoritairement (40 à 68 %) associées aux Aquificales. Les

autres séquences correspondent à des Firmicutes et à des Proteobacteria (α, β et γ ).

Cette étude a été complétée récemment par une analyse des profils quinoliques indiquant que

lorsque la température du tapis bactérien augmente sa diversité décroît (Hiraishi et al., 1999).

Les travaux de Takai et Sako (1999) ont porté sur des sources terrestres et côtières en

réalisant des banques de séquences archaéennes et universelles. Dans le cas des sources marines

(fluide chaud : 128°C), l'ensemble des séquences isolées des banques universelles correspond à des

Bacteria se répartissant parmi des Pseudomonas, des bactéries fixatrices d'azote (Bartonella,

Rhizobium, Agrobacterium)26 et des hyperthermophiles (Aquifex). Les séquences archaéennes se

répartissent parmi les Euryarchaeota hyperthermophiles (Thermococcales) et les Crenarchaeota

proches de représentants isolés (Pyrolobus, Pyrodictium, Stetteria) ou proches du groupe I de

Crenarchaeota marines. Mais l'un des plus intéressants résultats est la détection en milieu marin de

séquences associées aux Korarchaeota détectées jusqu'à présent uniquement dans des sources

terrestres (voir plus loin). Les séquences provenant d'échantillons de sédiments hydrothermaux sont

réparties essentiellement autour des Archaea marines du groupe I, de Proteobacteria et des

Firmicutes à bas G+C%.

Enfin Dando et al. (1998) décrivent la composition microbienne de sédiments chauds sur le

site de la baie de Palaeochori sur l'arc volcanique grec. Ils ont réalisé des enrichissements

d'hyperthermophiles coccoïdes anaérobies correspondant à de nouveaux genres : Stetteria

(Jochimsen et al., 1997) et "Aphrodite" (Arab, 1999 result. non pub.) et de bactéries aérobies proches

des genres Bacillus, Achromatium et Thioplaca. Des amplifications ont été réalisées à l'aide d'amorces

spécifiques des Archaea et des Crenarchaeota conduisant à l'identification de séquences associées

aux genres Staphylothermus, Desulfurococcus, Thermodiscus, Thermosphaera, Stetteria et

Sulfofobococcus ainsi qu'à des séquences correspondant à de nouvelles lignées archaéennes.

Sur les sites continentaux

Une abondante littérature décrit l'utilisation des techniques moléculaires afin d'identifier la flore

microbienne associée aux sources hydrothermales et notamment aux sources du parc de

Yellowstone. Ces techniques ont permis non seulement d'étudier la composition de la communauté

microbienne mais de suivre l'évolution de cette communauté dans le temps et dans l'espace. Ward et

al. (1992, 1997, 1998) ont proposé un historique des travaux réalisés dans leur laboratoire, qui ont

26 Il attribue ces deux premiers types de micro-organismes à des contaminants non représentatifs de la communauté hydrothermale

comme l'avait suggéré Tanner et al. (1998).


95

porté essentiellement sur l'étude des tapis bactériens. Ces travaux ont été complétés par ceux de

l'équipe de Pace qui a travaillé sur des échantillons de sédiments prélevés dans un autre bassin.

Figure 2.19. Octopus Spring Figure 2.20. Obsidian Pool

Photos : N. Pace http://crab2.berkeley.edu/~pacelab/

La première étude a porté sur l'analyse de l'ARNr 5S (Stahl et al., 1985) sur le bassin d'Octopus

Spring (cf. figure 2.19). Les auteurs décrivent alors 3 phylotypes dominants : un premier associé aux

Crenarchaeota soufre-dépendantes et deux autres associés aux Bacteria proches du genre Thermus.

Cette étude a été suivie dans le laboratoire de Ward d'une analyse des ADNr 16S d'un tapis

cyanobactérien (Ward et al., 1990 a et b; Weller et al., 1992) en utilisant différentes techniques de

clonage moléculaire. Ces travaux ont conduit à la description de nouvelles séquences associées aux

cyanobactéries et aux GNS. Conjointement aux travaux de séquençage, des essais d'isolement furent

entrepris afin d'identifier les bactéries associées aux séquences de clones (Nold et al., 1996) ainsi que

des essais d'incorporation de 14CO2 pour étudier les mécanismes photosynthétiques en fonction du

cycle nycthéméral (Nold et Ward, 1996). La mise au point de sondes spécifiques des cyanobactéries

et des GNS cultivées et non cultivées (Ruff-Roberts et al., 1994) permet de mettre en évidence les

biais liés aux méthodes culturales (l'espèce cultivée n'est pas l'espèce la plus abondante dans le milieu

et elle est sélectionnée dans différents échantillons). Puis, par des techniques de dilutions

successives de l'inoculum avant l'enrichissement, il a été possible d'isoler pour la première fois un

micro-organisme correspondant à une séquence d'ADNr 16S préalablement clonée (Ferris et al.,

1996b). La technique de DGGE a été utilisée afin d'identifier la communauté microbienne colonisant

différents gradients de température au sein du tapis microbien (Ferris et al., 1996a). Il a ainsi été

possible d'observer une grande diversité de séquences toutes associées au cyanobactéries ou aux

GNS. Cette diversité pourrait correspondre à une adaptation de l'espèce en fonction des températures

du biotope. La DGGE a par ailleurs été utilisée afin de détecter les modifications dans la communauté

microbienne : (I) lors d'un enrichissement (Santegoeds et al., 199627; Ward et al., 199728), (II) lors des

changements de saisons29 (Ferris et Ward, 1997), (III) lors d'une modification du milieu30 (Ferris et al.,

1997).

27 Il est par ailleurs observé que de nouvelles séquences sont détectées après enrichissement alors que celles-ci n'avaient pas été

détectées ni par isolement ni par clonage direct.28 L'accent est mis cette fois ci sur le choix de la température d'isolement. A forte température, des souches de Thermus sont

préférentiellement isolées alors qu'elles ne représentent qu'une très faible proportion de la communauté microbienne présente dans

l'échantillon dans cette gamme de température.29 Il n'y a pas à proprement parler de succession de populations mais une adaptation des souches à différentes gammes de

températures. Certains phylotypes semblent accroître puis restreindre, au cours de l'année, leur gamme de température.


96

L'ensemble des résultats obtenus sur le site d'Octopus Spring a été synthétisé récemment

permettant aux auteurs d'apporter un regard critique sur leur approche polyphasique de la diversité

(Ward et al., 1998).

Au sein de l'équipe de Pace, Reysenbach et al. (1994) s'attachent à une description

phylogénétique de la communauté bactérienne associée aux filaments roses du bassin d'Octopus

Spring. Ils observent 3 phylotypes majeurs se répartissant au sein des Thermotogales (1) et au sein

des Aquificales (2). Barns et al. (1994) vont travailler sur la source Jim's Black Pool (appelée maintenant

Obsidian Pool, cf. figure 2.20). Après amplification des ADNr 16S archaéens ils observent une grande

diversité de séquences associées à la fois à des Crenarchaeota soufre-dépendantes et à des

Euryarchaeota. Un nouveau groupe de séquences enraciné très profondément à la base de l'arbre

archaéen est aussi détecté (Barns et al., 1996a). Il sera décrit plus tard comme un nouveau domaine :

les Korarchaeota (Barns et al., 1996b). Il n'a pas été possible jusqu'à présent d'isoler des

représentants de ce domaine. Brunk et Eis (1998) sont toutefois parvenus à maintenir un

enrichissement en activité dans un chemostat et à étudier les mécanismes d'amplification spécifique

des séquences d'ADNr 16S korarchaéennes en fonction du type d'amorces utilisées. Les travaux de

Barns ne portant que sur des amplification archaéennes, Hugenholtz et al. (1998a) présentent par la

suite les amplifications réalisées à l'aide d'amorces bactériennes et universelles. D'une manière

surprenante les banques universelles ne contiennent pas de séquences archaéennes (alors que

Barns en avait détecté précédemment) mais elles contiennent par contre une grande diversité de

séquences bactériennes. Ces dernières se répartissent, pour 70% d'entre elles, dans 14 des 24

divisions bactériennes couramment reconnues : parmi celles ci on retrouve des groupes thermophiles

dont la présence s'explique dans un tel environnement (Aquificales, Thermotogales, Thermus) mais

aussi des séquences correspondant à des divisions plus mésophiles (Proteobacteria , Firmicutes haut

G+C%, Cytophagales , etc.). Les 30% de séquences bactériennes restantes forment 12 nouvelles

divisons dans l'arbre bactérien au sein desquelles aucun représentant n'a été jusqu'à présent isolé.

Hugenholtz et al. (1998b) proposent donc une nouvelle version de l'arbre bactérien se répartissant en

36 divisions dont seulement 23 présentent des représentants isolés.

A la lumière de l'ensemble des résultats obtenus sur les sites hydrothermaux terrestres de

Yellowstone, il est évident que les études menées par des techniques culturales et non-culturales ont

considérablement accru nos connaissances de cet écosystème. Il est, dans bien des cas, possible de

répondre aux questions de la composition, de la structure, et de la fonction des différentes

populations de micro-organismes se développant dans cet environnement simple et stable. Si de

nombreuses questions restent encore en suspens concernant le type métabolique de certaines

séquences uniquement détectées par clonage et les relations que l'on peut établir entre les distances

phylogénétiques et les distances géographiques, Ward et al., (1998) nous démontrent la puissance

de l'approche polyphasique et pluridisciplinaire en écologie microbienne.

30 Cette approche a consisté à retirer les premiers centimètres de cellules à la surface d'un mat. Cette étude est complémentée par

l'utilisation de microélectrodes à O2 et par des mesures d'assimilation du 14CO2. Il est alors possible de suivre les successions de

populations lors de la colonisation du mat ainsi que leur métabolisme.


97

V La flore microbienne liée à l'Homme, aux animaux et à

l'activité humaine

5.1 L'Homme comme écosystème microbien

L'homme constitue un environnement favorable à la croissance microbienne31. C'est un

"milieu" constant physiquement (pH, température, pression osmotique) et riche en nutriments (matière

organique, facteurs de croissance). Les micro-organismes colonisent donc de nombreux

compartiments (la peau, les cavités buccale et vaginale, le tractus digestif, les voies respiratoires) à

l'exception du sang, des organes et des voies urinaires32. Mais c'est aussi un "milieu" hétérogène où

des compartiments de composition chimique particulière ont sélectionné certains organismes ayant

développé des mécanismes de résistance aux systèmes de défense de leur hôte (les

lactopéroxydases et les lysozymes de la salive, l'acide lactique des sécrétions cutanées, la bile et

l'acidité du tractus digestif). L'étude de la flore microbienne est importante car on peut ainsi détecter

des modifications lors d'infections, en déduire la source de contamination et mieux saisir (voir induire)

les mécanismes immunitaires de défense.

5.1.1. La flore de la cavité buccale

(d'après Marsh et Bradshaw, 1995; Madigan, 1996)

C'est un environnement complexe et hétérogène, il est constitué de surfaces lisses et

crevassées baignées dans la salive (qui contient des nutriments mais aussi des anti-bactériens). Les

dents sont constituées de structures minérales comme l'émail (cristaux de phosphate de calcium

formant une matrice enrichie en fluor qui limite les processus de dégradation) et de structures

"vivantes" comme la dentine et la pulpe.

Certains micro-organismes forment des plaques qui se développent comme des films à la

surface de la dent. Cette colonisation correspond à une succession de populations de micro-

organismes. Dans un premier temps les glycoprotéines de la salive créent un film fin de matière

organique à la surface des dents sur lequel des Streptoccocus (S. sanguii, S. sorbinus et S. miltis)

forment des microcolonies. Par la suite des bactéries filamenteuses (Fusobacterium et Spirochètes)

contribuent à l'épaississement de la plaque. Si aucun brossage n'intervient, des germes anaérobies

peuvent s'installer, principalement des Actinomycètes.

Si la plaque dentaire n'est pas détruite régulièrement, l'acide lactique produit par les bactéries

conduit généralement à la formation de caries par décalcification de l'émail. Deux micro-organismes

sont impliqués dans la formation des caries. S. mutans produit à partir des sucres contenus dans

31 Chez l'homme ont dénombre 1014 cellules bactériennes pour 1013 cellules purement humaines. 10% du poids de l'homme serait

d'origine bactérienne et 1/3 des fèces sont constituées de bactéries.32 Ceux-ci ne sont colonisés qu'en cas d'infection.


98

l'alimentation d'importants réseaux de polysaccharides (dextran) qui favorisent la fixation de S.

sorbinus qui lui utilise les sucres pour produire de l'acide lactique.

Enfin certains micro-organismes (Bacteroides gingivalis) peuvent former une plaque à la base

de la dent. Ils produisent une protéase qui peut conduire à une inflammation, puis une nécrose des

tissus de la gencive et à un déchaussement des dents.

5.1.2. Les micro-organismes du tractus digestif

Le tractus digestif est constitué de trois parties principales : l'estomac, le petit intestin

(duodénum, jéjunum, iléon) et le gros intestin (ou colon) (cf. figure 2.21).

Oesophage

Pricipales bactéries détectées

Organe

Estomac

Duodénum

Jéjunum

Iléon

Colon

Pet

it in

test

inG

os in

test

in

Lactobacilles

Enterococcus

Bacteroides

BifidobacteriumEubacteriumPeptonococcus

PeptonostreptococcusClostriumLactobacilles

Anus

Lactobacilles

Enterococcus faecalis

Enterobactéries

Ruminococcus

Figure 2.21. Micro-organismes du tractus digestif (d'après Madigan, 1996)

L'estomac est un milieu particulièrement agressif. Les sucs gastriques à un pH proche de 2

sont constitués d'HCl et de nombreuses enzymes digestives qui constituent une barrière efficace

contre les germes pathogènes (l'estomac est lui même protégé des sucs par une épaisse couche de

mucus). L'estomac est toutefois colonisé par de nombreux micro-organismes Gram + tels que des

Lactobacillus et des Streptococcus. Cette colonisation fluctue avec l'âge, l'alimentation et l'état de

santé de l'individu. L'un des germes pathogènes le plus fréquemment étudié est Helicobacter pylori.

Cette Proteobacteria ε micro-aérophile utilise l'urée contenue dans la salive et les sucs gastriques, la

convertit en ammoniaque et carbonate33 (base fortes) et contrecarre les effets de l'acidité stomacale. H.

pylori pénètre alors dans le mucus et produit des cytotoxines qui détruisent les cellules mucosales.

Sans mucus l'acidité naturelle de l'estomac et les pepsines contribuent à la formation des ulcères.

33 CO(NH2)2 + H+ +2H2O --uréase--> HCO3

- + 2(NH4)


99

Dans le petit intestin le pH et la densité microbienne vont s'accroître au fur et à mesure que l'on

s'éloigne de l'estomac. On peut atteindre des densités de 105-107 bactéries.g-1.

Dans le gros intestin la colonisation microbienne est très importante. Elle atteint 107 cellules.g-1

pour les micro-organismes aérobies jusqu'à 1010-1011 cellules.g-1 pour les anaérobies. Le tractus

digestif d'un nouveau né est stérile. Par la suite des micro-organismes pionniers colonisent cet

environnement, le modifient et permettent la mise en place d'une seconde flore qui prend la place des

pionniers.34 A la naissance cette flore est essentiellement constituée de Bifidobacterium puis la

modification du régime alimentaire entraîne l'apparition d'une nouvelle flore intestinale incluant un

grand nombre de genres fermentatifs comme Clostridium, Bacteroides, Enteroccocus et les coliformes

mais aussi des Archaea méthanogènes, des bactéries sulfato-réductrices et acétogènes (Pochart et

al., 1992; Bernalier et al., 1996; Morvan et al., 1996)

5.1.3 L'apport des techniques moléculaires en microbiologie humaine

La flore microbienne associée à l'homme a été intensivement étudiée par des techniques de

culture et jusqu'à présent très peu de travaux ont abordé l'étude de la diversité par une approche

moléculaire. On estime toutefois que pour cet environnement entre 20 et 40% des micro-organismes

ont échappé aux méthodes culturales (Suau et al., 1999). Les techniques moléculaires ont par contre

été mises à profit pour détecter spécifiquement certains germes commensaux ou le plus souvent

pathogènes. En microbiologie clinique la recherche de germe spécifiques prime souvent sur

l'écologie et de nombreuses techniques de détection par PCR à l'aide d'amorces spécifiques du

genre, de l'espèce, de la sous-espèce ou d'un biovariant ont été décrites pour étudier la flore

pathogène comme la flore indigène (Schmidt et Relman, 1994; Dzik, 1995; Whelen et Persing, 1996).

Certaines techniques ont toutefois été développées afin d'extraire l'ADN procaryotique de

tissus particuliers comme la plaque dentaire (Parrish et Greenberg, 1995) ou les gencives (Smith et al.,

1989 a et b).

Sur la flore de la cavité buccale, jusqu'à présent, une seule étude a été réalisée pour étudier la

diversité microbienne d'un abcès dentaire par amplification de l'ADNr 16S bactérien et séquençage

(Dymock et al., 1996). Ce travail a été approfondi par une étude plus précise de trois phylotypes

(préalablement détectés) dans des tissus de patients sains et malades par amplification à l'aide

d'amorces de PCR spécifiques (Harper-Owen et al., 1999). Au sein du même laboratoire une étude

similaire a porté sur l'amplification spécifique d'ADNr 16S codant pour le genre Eubacterium suivi d'un

séquençage (Spratt et al., 1999). Une tentative de quantification bactérienne par PCR compétitive de

la flore buccale a récemment été entreprise (Rupf et al., 1999). Mais la majeure partie des études

entreprises sur la flore buccale consiste à détecter par PCR des germes connus à l'aide d'amorces

34 Chez la souris Flavobacterium, Lactobacillus et entérococci sont les micro-organismes pionniers. Flavobacterium disparaît au bout

de 8 jours et Lactobacillus au bout de 18; Bacteroides (anaérobies stricts) apparaît par la suite et domine la communauté.


100

spécifiques définies sur l'ADNr 16S. Pour exemple : Helicobacter pylori (Nguyen et al., 1993; Wahlfors

et al., 1995), Treponena sp. (Willis et al., 1999), Spirochètes incultivables (Choi et al., 1994), Eikenella

corrodens et Actinobacillus actinomycetemcomitans (Furcht et al., 1996). Des sondes

oligonucléotidiques ont été utilisées pour détecter des Bacteroides forsythus sur des extraits d'ADN

buccaux (Moncla et al., 1991).

La diversité de la flore intestinale a été étudiée par culture et extraction de l'ADN total suivi de

l'amplification et du séquençage des gènes d'ADNr 16S bactériens par Wilson et Blitchington (1996).

Cette étude révèle à la fois la différence obtenue entre les deux méthodes (certaines séquences sont

abondantes dans la banque d'ADNr 16S mais sont absentes dans les cultures et inversement) et le

biais produit par la PCR (la diversité phylogénétique est bien plus importante après 9 cycles de PCR

qu'après 35 cycles). La majorité des séquences détectées sont associées à des genres ou des

espèces communément enrichies dans la flore intestinale (Bacteroides, Clostridium). Une étude plus

récente menée par Suau et al. (1999) obtient des résultats similaires. Quatre-vingt quinze pour cent de

la banque de clone sont associés à trois groupes phylogéniques (Bacteroides, Clostridium coccoides,

C. leptum), mais seuls 24% de la banque sont clairement associés à des espèces isolées. Wang et al.

(1996) quantifient quant à eux les principaux germes anaérobies retrouvés dans les flores intestinales

animales par des techniques de dilutions successives suivies de PCR à l'aide d'amorces spécifiques

de certaines espèces. Des approches fondées sur l'emploi d'un grand nombre de sondes

nucléotidiques (domaine spécifique et orientées vers la flore anaérobie) (Franks et al., 1998) et sur

l'emploi de la TGGE (Zoetendal et al., 1998) ont aussi été utilisées. Enfin d'une manière similaire à la

flore buccale, beaucoup de publications décrivent la détection par PCR d'espèces ou de genres

spécifiques à l'aide d'amorces ou de sondes dessinées sur l'ADNr 16S (cf. revue de Whelen et

Persing, 1996). Des articles récents ont mis à profit la puissance de la détection PCR pour analyser des

septicémies anciennes dans des tissus conservés dans le formol :

Ø infection de 1979, individus susceptibles d'avoir été infectés par des "armes biologiques"

(Bacillus anthracis; Jackson et al., 1998b),

Ø infection de 1997, dans des tissus d'animaux ayant été tués par le charbon (Patra et al.,

1998),

Ø infection datant des 16eme et 18eme siècles, dans des restes de pulpe dentaire sur des

squelettes d'individus probablement morts de la peste (Yersinia pestis; Drancourt et al., 1998),

Ø infection datant de 1918, dans des tissus de foie d'individus ayant été tués lors de l'épidémie

de grippe espagnole (Reid et al, 1918).

Des études similaires à celles réalisées sur la flore buccale et intestinale ont été effectuées sur

la flore pathogène pouvant infecter le liquide cérébro-spinal (Greisen et al., 1994) et sur les micro-

organismes impliqués dans les infections chroniques de la prostate (Tanner et al., 1999).

5.2 La flore microbienne associée aux autres animaux

Les micro-organismes entretiennent des relations avec un grand nombre d'Eucarya :

protozoaires, animaux comme végétaux. La microbiologie classique a permis de résoudre nombre des


101

relations qui peuvent être de nature commensale, mutualiste ou parasitaire. Mais certaines relations

mettent en jeu des mécanismes de symbiose très stricts que des techniques d'étude uniquement

culturales ne peuvent résoudre. Les techniques moléculaires ont donc permis d'accéder à la diversité

des micro-organismes impliqués dans ces relations, je me propose dans ce chapitre d'en décrire

certaines.

Mollusques, Eponges et Holoturies :

Les travaux sur la communauté symbiotique des mollusques hydrothermaux ont été décrits

précédemment (cf. § 4.4.3). On peut toutefois citer des travaux similaires effectués sur des

mollusques prélevés dans des environnements tropicaux côtiers (Distel et al., 1991; Durand et al.,

1996; Gros et al., 1996; Krueger et Cavanaugh, 1997).

Les travaux de Preston et al. (1996) sur les Eponges et ceux de Mc Innerney et al. (1995) sur

les Holoturies ont été décrits plus haut (cf. § 4.2.2.1). Les travaux de Preston ont été poursuivis par la

construction d'une banque fosmidique d'ADN génomique permettant d'accéder à des gènes

fonctionnels comme le gène de l'ADN polymérase (Schleper et al., 1997b) mais aussi aux micro-

hétérogénéités au sein de l'opéron ADNr (Schleper et al., 1998).

Insectes :

De nombreux insectes présentent de fortes relations symbiotiques avec les micro-organismes.

Ces derniers sont très souvent retrouvés dans le tractus digestif de ces animaux (Cazemier et al.,

1997). Les micro-organismes contenus dans l'estomac des termites ont été très étudiés. En effet

cette communauté conditionne chez cet Arthropode la digestion des composés à base de cellulose

et, à une échelle réduite, peut être comparée au fonctionnement du rumen chez un grand nombre de

ruminants. Jusqu'à présent très peu d'isolats ont pu être obtenus; les informations dont on dispose

proviennent d'études réalisées à l'aide de microélectrodes (Brune, 1998) ou d'amplifications des

gènes d'ADNr 16S à partir d'extrait d'estomac :

Ø du termite Reticulitermes speratus par analyse de l'ADNr 16S (Ohkuma et Kudo, 1996); de l'ADNr

16S, du gène mcr et du gène NifH (Kudo et al., 1998),

Ø du termite Cryptotermes domesticus (Ohkuma et Kudo, 1998),

Ø du termite Reticulitermes speratus par T-RFLP (Liu et al., 1997)

Ø du termite Reticulitermes speratus par analyse de l'ADNr 16S et hybridation in situ de la

communauté archaéenne (Shinzato et al., 1999),

Ø des symbioses entre les méthanogènes et R. speratus (Ohkuma et al., 1995) et chez d'autres

termites (Ohkuma et al., 1999),

Ø des termites Nasutitermes lujae (spirochètes incultivables, Paster et al., 1996), et de

Mastodermes darwiniensis (spirochètes incultivables, Brechtold et König, 1996), (flore totale par

hybridation in situ, Bertchold et al., 1999)

Ø et des protozoaires de l'estomac de R. speratus par analyse de l'ADNr 18S (Ohkuma et al., 1998)

et des facteurs d'élongation (Moriya et al., 1998).

Des études similaires ont été réalisées sur les micro-organismes intestinaux de Criquets (Santo

Domingo et al., 1998b). Il a même été possible d'étudier les bactéries associées à des insectes


102

emprisonnés dans l'ambre depuis 25 à 40 millions d'années. Après la mise au point d'une technique

efficace d'extraction d'ADN à partir d'échantillons anciens (Cano et Poinard, 1993), il a été possible de

détecter par amplification et séquençage des Bacillus dans des échantillons d'insectes (Proplebeia

dominicana) (Cano et al., 1994) puis de remettre en culture des spores de Bacillus provenant des

mêmes échantillons (Cano et Borucki, 1995)35 ainsi que des Staphylococcus (Lambert et al., 1998).

Récemment des isolements caractérisés par séquençage et FAME suivis d'une analyse moléculaire de

la communauté totale d'échantillons d'ambre par T-RFLP a été entreprise (Greenblatt et al., 1999). Les

résultats obtenus par ces deux méthodes sont cohérents mais il apparaît que les méthodes

moléculaires peuvent être biaisées en raison de la forte dégradation des ADN dans de très vieux

échantillons et par la présence d'inhibiteurs de la PCR.

Chordés:

Les micro-organismes du rumen ont été aussi intensivement étudiés que ceux des intestins

humains, dans un premier temps par des techniques culturales puis par l'emploi de sondes nucléiques

(Krause et Rusell, 1996a; Stahl et al., 1988). Dans un environnement stabilisé on peut observer des

micro-organismes dégradant la cellulose (Bacteroides, Ruminococcus), les protéines (Veillonella),

l'amidon (Selenomonas), et des producteurs de méthane (Methanobacterium). L'utilisation de sondes

plus spécifiques a permis de suivre l'évolution de certaines espèces en fonction du régime alimentaire

(Forster et al., 1996; Krause et Rusell, 1996b; Schofield et al., 1997). Récemment Tajima et al. (1999)

ont étudié le rumen de vaches en amplifiant spécifiquement l'ADNr 16S bactérien à partir

d'échantillons liquides et solides. Ils n'observent pas de différences avec les résultats obtenus par les

méthodes de mise en culture : les Firmicutes à haut G+C% et les Cytophagales dominent dans les

banques. Des techniques fondées sur l'analyse du G+C% de l'ADN total extrait de tractus digestifs de

poulets a permis de suivre l'évolution de la flore intestinale entre le petit intestin et le cæcum (Apajalahti

et al., 1998). Il n'est toutefois pas possible dans cette étude de définir précisément les genres des

bactéries présentes dans l'échantillon.

Angert et al. (1993) ont isolé par micromanipulation et séquençage le symbiote incultivable du

poisson chirurgien. Epulopiscium fishelsoni était alors la plus grande bactérie connue (80 x 600 nm).

Enfin la communauté intestinale du poisson (Platichthys flesus) a été étudiée après amplification et

séquençage. Il a été possible d'y détecter des séquences associées aux Archaea marines du groupe II

(van der Maarel et al., 1998), et des séquences associées aux methanogènes (van der Maarel et al.,

1999).

Autres:

Les symbiotes d'Acanthamoeba spp. ont été étudiés aussi par amplification de l'ADNr 16S et

séquençage (Fritshe et al., 1999). Ces organismes retrouvés de manière ubiquitaire dans le sol et l'eau

se nourrissent de micro-organismes et sont des facteurs de dissémination de germes pathogènes

notamment en milieu hospitalier.

35 Des études sur la flore intestinale de Mammouth ont été aussi réalisées mais elles consistaient uniquement en une mise en culture

des souches retrouvées dans des restes d'intestins (vieux de 12000 ans) suivi d'un séquençage des isolats (Rhodes et al., 1998). On ne

peut dans ce cas exclure la possibilité de contaminants.


103

Les micro-organismes associés aux algues ont été étudiés également par des techniques semblables

chez Halophila stipulacea (Weidner et al., 1996) et chez des algues vertes de la classe des

Charophyceae (Fisher et al., 1998).

Aux écosystèmes animaux, marins et terrestres naturellement colonisés par les micro-

organismes, les activités humaines ont contribué à adjoindre de nouveaux biotopes dérivant de

processus industriels de productions alimentaires ou chimiques (fermentation, bioconversion), de

transformation des déchets (traitements biologique) ou d'extraction des minerais (biolixiviation).

L'essor des biotechnologies, intégrant celui de la microbiologie industrielle, a contribué à faire prendre

pleinement conscience du rôle des micro-organismes dans notre économie. L'étude de ces

écosystèmes devait dépasser alors l'aspect purement écologique pour permettre de contrôler, c'est à

dire de prévoir et de modifier le comportement des différentes populations microbiennes au sein d'un

environnement confiné. L'emploi de méthodes moléculaires à grandement facilité cette tâche.

5.3 Les micro-organismes associés aux activités humaines

Deux biotopes liés à des activités anthropomorphiques ont été particulièrement étudiés à

l'aide des techniques moléculaires : les boues de station d'épuration et les bassins de biolixiviation. Le

fonctionnement de ces deux biotopes est intimement lié à la présence de micro-organismes qui dans

un cas (boues actives) vont accélérer la dégradation de la matière organique et les processus de

floculation et dans l'autre cas, faciliter la solubilisation des métaux précieux (lixiviation).

5.3.1 L'extraction de minerai

L'extraction des minerais comme le Cuivre ou l'Uranium est réalisée à grande échelle par des

procédés de solubilisation des minerais (soufrés généralement) par des solutions acides. Cette

solubilisation réalisée à l'air libre permet la colonisation des réservoirs par une communauté

bactérienne très abondante constituée essentiellement de micro-organismes soufre-oxydants,

autotrophes ou hétérotrophes. Les techniques moléculaires ont été mises à profit pour suivre les

successions de populations au sein de ces réservoirs soit par amplification et séquençage des ADNr

16S (Goebel et Stackebrandt, 1994), soit par amplification et séquençage de l'espace inter-génique

16-23S sur l'ADNr (Pizarro et al., 1996; Espejo et Romero, 1997; Vàsquez et Espejo, 1997), soit par

DGGE (Fournier et al., 1998). Une étude récente a permis de détecter, dans des extraits de

biolixiviation de cuivre des séquences archaéennes correspondant aux Thermoplasmales (la souche a

été cultivée mais n'a pas pu être obtenue en culture pure) (Vàsquez et al., 1999).


104

5.3.2. Les boues de stations d'épuration

Les stations d'épuration constituent un système complexe où se mêlent à la fois des

techniques physiques (filtration, sédimentation, chloration, cf. figure 2.22) et des techniques

biologiques mettant en jeu une importante communauté microbienne .

La connaissance de la structure de la communauté microbienne des boues actives (traitement

aérobie de la phase soluble) et des fermenteurs (traitement anaérobie de la phase insoluble) est un

axe de recherche majeur. En effet la connaissance de cette structure permet d'influer sur sa

dynamique (en jouant sur les nutriments ou sur l'ensemencement par une flore définie) et donc sur

l'efficacité du traitement des eaux usées (cf. figure 2.22). Compte tenu de la diversité des nutriments

disponibles dans les boues, la diversité métabolique et phylogénétique est aussi très importante.

Aussi les techniques de culture, d'analyse par immunofluorescence, comme les profils quinoliques et

polyaminiques ne rendent qu'une image très restreinte de cette diversité (Snaidr et al., 1997). Les

techniques moléculaires ont donc été utilisées abondamment pour rendre compte de la diversité aussi

fidèlement que possible.

Boues solides fraction insoluble

Effluant liquidefraction soluble

Boues actives Egouttage

SéchageIncinération

Désinfection:- chloration

Effluant traité rejetté dans les rivières

SédimentationFiltrationEaux

usées

Traitement anaérobie:digestion

Traitement aérobie:oxydation

Tra

item

ent

mic

robi

olog

ique

Figure 2.22. Représentation schématique du fonctionnement d'une station d'épuration (d'après Madigan, 1996)

Les tableaux 2.11 et 2.12 se proposent d'énumérer une partie des analyses réalisées à l'aide

de techniques moléculaires sur différents échantillons de boues actives ou d'eau usées de stations

d'épuration.Tableau 2.11. Analyse de la diversité microbienne totale

Références Techniques Commentaires

Bond et al. , 1995 Amplif. 16S / Séqu. Comparaison de la population microbienne de 2 fermenteurs dont l'un élimine les

phosphates.

Bradford et al. , 1996 Micromanipulation / Isolat

Amplif. 16S / Séqu.

Sondes 16S

Etude des bactéries filamenteuses. Isolement par micromanipulation,

séquençage et localisation à l'aide de sondes spécifiques.

Eichner et al. , 1999 TGGE 16S Effet de l'addition d'un micro-organisme pouvant dégrader les phénols sur une

population microbienne lors d'un choc phénolique.

Harmsen et al. , 1996b Sondes 16S Analyse des gradients de population dans des granules des boues actives.

Analyse des successions syntrophe/méthanogènes.

Kämpfer et al. , 1996 Isolats

Sondes 16S et 23S

70% des souches isolées (Proteobacteria β) ne correspondent qu'à 5% des

bactéries détectées par hybridation in situ.


105

Tableau 2.11. (suite)


Liu et al., 1997 T-RFLP Quantification de flore microbienne de boues actives et de fermenteurs.

Nielsen et al. , 1999 DGGE 16S

Sondes 16S

Analyse de la flore de boue d'un fermenteur pour l'élimination du phosphore.

Détection d'un nouveau groupe de Proteobacteria γ.

Pillai et al. , 1996 Ribotypage sur l'espace

intergénique 16-23S

Détection de Clostridium dans l'atmosphère à proximité des tanks d'épuration.

Sekiguchi et al. , 1998

Sekiguchi et al. , 1999


Sondes spécifiques

Microscopie confocale

Analyse des gradients de population dans des granules des boues actives

prélevées à 35 et 65°C. Relation entre les Syntrophobacter et les méthanogènes.

Snaidr et al. , 1997 Amplif. 16S / Séqu.

Sondes 16S

Concordance des proportions entre les hybridations réalisées sur la banque et

celles réalisées in situ.

Vainio et al. , 1997 Isolats

Amplif 16S/Séqu

Communauté microbienne cultivable et non cultivable. Aucun clone ne

correspond aux isolats.

Wagner et al. , 1993

Wagner et al. , 1994

Isolats / sondes 16S Effet de la charge en matière organique sur la population microbienne.

Proportion d'Acinetobacter dans les tanks éliminant les phosphates.

Wallner et al. , 1995

Wallner et al. , 1997

Sondes 16S

Cytométrie en flux

Analyse et sélection de la population microbienne des boues.

Tableau 2.12. Analyse de genres ou d'espèces particuliers


Harmsen et al. , 1996a Sondes 16S Analyse des bactéries oxydant le propionate et des syntrophes associés.

Neef et al. , 1998. Sondes 16S Recherche et quantification de Planctomycetales. Ces souches peuvent

correspondre jusqu'à 5% de la population totale mais ne sont pas détectées par

les sondes bactériennes (EUB 338).

Juretschko et al. , 1998

Rotthauwe et al. , 1997

Mobarry et al. , 1996

Holben et al. , 1998

Hallin et Lindgren, 1999

Isolats

Sondes 16S

Amplif. amoA et 16S

Séqu.

Analyse des bactéries oxydant l'ammoniac et les nitrites.

Raskin et al. , 1994b

Miguez et al. , 1999

sondes spécifiques 16S

Amplif. mmoX

Analyse de la flore anaérobie des boues : étude des méthanogènes.

Schuppler et al. , 1995

Schuppler et al. , 1998

de los Reyes et al. , 1997

de los Reyes et al. , 1998


Sondes sur clones


Recherche des Actinomycetes nocardioformes agents pathogènes responsables

de la prise en masse et de la mousse dans les tanks.

Straub et al. , 1994 PCR Détection d'entérovirus dans les boues.

Rocheleau et al. , 1999 Sondes 16S


Etude de Methanosaeta concilii et Methanosarcina barkeri

Tsai et al. , 1993

Lee et al. , 1999

Amplif. de 16S et de uidA

Sondes 16S


Détection spécifique de E.coli

Watanabe et al., 1998a

Watanabe et al. , 1998b

Selvaratnam et al. , 1995

TGGE 16S et LmPH

Isolats

Amplif. gyrB

RT-PCR tfdB et dmpN

Analyse de l'effet du phénol sur la population microbienne. Isolement d'une

souches spécifique de la dégradation de ce composé.

Quantification des bactéries dégradant le phénol dans un fermenteur par

quantification des produits de PCR

Mise au point de la technique puis suivi de l'expression des gènes métabolisant

les phénols par mesure des ARN messagers.

Amplif. : amplification par PCR Séqu : Séquençage

5.3.3 Les autres milieux

La gestion de déchets produits par les activités humaines est une préoccupation économique

et écologique majeure. En effet il ne s'agit pas simplement de se défaire de grandes quantités de

produits finaux des métabolismes humains ou animaux (matière organique, fèces), mais aussi de

détruire des composés uniquement produits par synthèse chimique : les xénobiotiques (pesticides,

herbicides, plastiques). Ces produits n'entrent pas naturellement dans les grands cycles de


106

dégradation des composés naturels, mais des micro-organismes peuvent avoir un rôle prépondérant

dans leur dégradation. Les études moléculaires ont été mises à profit pour étudier ces micro-

organismes, notamment pour suivre les dynamiques de dégradation. Le tableau 2.13 présente une

liste non-exhausive d'études réalisées sur des fermenteurs industriels ou sur des reproductions à

l'échelle du laboratoire de milieux naturels contaminés par des polluants d'origine anthropique. Ces

travaux sont très souvent associés à des méthodes culturales. Il est effet indispensable de disposer du

ou des micro-organismes impliqués dans les processus de dégradation afin d'envisager une mise à

l'échelle industrielle du processus.

Tableau 2.13. Etude d'autres processus de dégradation

Milieux Techniques d'étude Références

Effluent de papeterie culture Gonzàlez et al. , 1996

(riche en lignine) amplification de l'ADNr 16S

séquençage

quantification sur ADN total

Filtre biologique amplification de l'ADNr 16S Sakano et Kerkhof, 1998

pour contaminants aérosols amplification du gène amoA

séquençage

Biofilm bactérien dans les sondes nucléiques 16S Kalmbach et al. , 1997

canalisations d'eau potable sondes nucléiques 16S et 23S Manz et al. , 1993

Culture d'enrichissement amplification de l'ADNr 16S Pulliam Holoman et al. , 1998

sur milieux riches en PCB séquençage

de sédiments côtiers

Culture en flux continus de sondes nucléiques 16S Bruns et Berthe-Corti, 1998

sédiments côtiers pour suivre la

dégradation des hydrocarbures

Flore thermophile impliquée dans amplification de l'ADNr 16S Inagaki et al. , 1997

les dépôts siliceux dans une usine séquençage

géothermale

Processus de dégradation amplification de l'ADNr 16S Britschgi et Fallon, 1994

des cyanures séquençage

Fermenteur anaérobie amplification de l'ADNr 16S Godon et al. , 1997

sur vinasses et mélasses séquençage

Processus de dégradation amplification de l'ADNr 16S von Wintzingerode et al. , 1999

du trichlorobenzène séquençage

Reproduction d'un aquifère pollué par culture-isolement Hess et al. , 1997

des carburants à l'échelle du laboratoire sondes nucléiques 16S espèce-spécifiques

Fermenteur alimenté en eau usées culture-isolement Stoffels et al. , 1998

de peinture de carrosserie sondes nucléiques 16S

VI Conclusion et présentation du projet d'étude

Les formidables avancées dans le domaine des biotechnologies sont certes à attribuer aux

efforts réalisés par les microbiologistes pour cerner le fonctionnement des micro-organismes, mais

aussi à la manne financière de l'industrie pharmaceutique destinée au développement de nouvelles

molécules à forte valeur ajoutée. Comprendre le fonctionnement des populations microbiennes au

sein des écosystèmes naturels est certes une tâche laborieuse et coûteuse mais qui requiert avant

tout une approche holistique. Aux compétences du microbiologiste doivent s'ajouter celles de

l'écologiste, du biologiste moléculaire, du chimiste et du physicien afin d'appréhender


107

l'environnement dans sa totalité. Un inventaire complet de la diversité microbienne terrestre n'est

certes pas envisageable mais, comme cela a été proposé par Pace (1997), il est possible de définir sur

le globe une centaine de sites (biotopes aux conditions physico-chimiques différentes) pour lesquels

une étude intensive de la diversité tant procaryotique qu'eucaryotique serait entreprise. Certains sites

naturels, comme les sources chaudes du parc de Yellowstone (Etats-Unis), font déjà l'objet de suivis

réguliers depuis de nombreuses années. D'autres sites, comme les sources hydrothermales

profondes et les réservoirs pétroliers, pourraient être des candidats potentiels à cette entreprise

d'inventaire.

Jusqu'à présent les informations concernant l'écologie de ces milieux ont été principalement

obtenues par des travaux fondés sur des techniques de cultures traditionnelles, peu d'études

moléculaires y ont été entreprises.

Le but de mon travail de thèse aura été d'utiliser des technologies moléculaires fondées sur

l'analyse des ARNr 16S (séquençage - hybridation in situ) au profit de l'étude de la diversité et de la

taxonomie microbienne, en association avec deux environnements extrêmes (un réservoir pétrolier et

des sources hydrothermales océaniques).

Après un exposé des méthodes générales utilisées, les résultats sont présentés sous forme

d'articles, soumis ou à soumettre.

Le premier article (Article 1) présenté dans ce manuscrit décrit l'analyse de la diversité

microbienne associée à un réservoir pétrolier situé dans le bassin Parisien. Si quelques travaux

décrivent l'isolement et la caractérisation de micro-organismes, mésophiles ou thermophiles, impliqués

dans des mécanismes de fermentation, de méthanogenèse ou d'acétogenèse, la majeure partie des

études réalisées sur les puits de pétrole se sont intéressées aux micro-organismes impliqués dans les

phénomènes de sulfato-réduction. L'originalité de cette étude était d'accéder à la diversité

microbienne totale d'un réservoir en s'affranchissant de toute étape de mise en culture. L'analyse a

porté sur des échantillons d'eaux de production prélevés en tête de puits et dans des collecteurs. On

observe que les communautés microbiennes s'organisent différemment selon les échantillons. Dans

certains puits, les BSR thermophiles ou mésophiles dominent les banques de clones, alors qu'elles

sont absentes d'autres échantillons provenant du même réservoir. En revanche on retrouve dans ces

échantillons des séquences associées à des souches micro-aérophiles pouvant être impliquées dans

le cycle du soufre. En introduction de cet article je présenterai une étude réalisée sur un échantillon

d'eau chaude prélevée sur un site hydrothermal terrestre en Roumanie. Les résultats obtenus sur cet

échantillon d'eau géothermale éclairent ceux qui sont présentés pour certains échantillons d'eau de

production.

Le second et le troisième articles décrivent l'utilisation conjointe de techniques

culturales (enrichissements) et moléculaires (séquençage et hybridation in situ) pour étudier la

diversité microbienne associée à des fluides hydrothermaux prélevés sur le site du "Snake Pit" sur la


108

dorsale médio-Atlantique durant la campagne "Microsmoke" (1995). Les fluides ont été collectés à

l'aide d'un échantillonneur original, le "Vent Cap", qui est déployé durant plusieurs jours sur le site

d'émission du fluide. Deux sites ont été échantillonnés au cours de déploiements de 2 et 5 jours.

L'article 2 décrit, par une approche d'extraction d'ADN total et séquençage des ADNr 16S, la

diversité bactérienne associée à un déploiement de 5 jours sur le "Chi". On observe que la banque de

clones est dominée par une grande diversité de micro-organismes associés ou proches des

Proteobacteria epsilon. Deux nouveaux phylums associés à la classe des Proteobacteria , mais

distincts des sous-classes décrites jusqu'à présent, sont aussi observés dans cet échantillon. Deux

sondes nucléiques spécifiques sont construites afin d'identifier les micro-organismes détectés par

séquençage.

L'article 3 (Manuscrit en préparation) présente une synthèse des résultats obtenus à partir

de l'ensemble des déploiements du "Vent Cap" lors de la campagne "Microsmoke". Il reprend les

résultats décrits dans l'article 2 sur le site "Chi" et ceux décrits par Reysenbach et al. (1999) sur le site

"Les Ruches". Il présente, de plus, des résultats originaux d'enrichissement de micro-organismes

thermophiles, de comptage de cellules totales, d'analyse par séquençage du déploiement de 2 jours

sur le site "Les Ruches" et de quantification de micro-organismes par hybridation in situ à l'aide de

sondes nucléiques spécifiques. La confrontation des résultats obtenus par ces différentes analyses

avec ceux obtenus lors de l'étude de cheminées hydrothermales nous permet de mieux cerner la

distribution des micro-organismes au sein des sources hydrothermales profondes.

Comme nous l'avons vu dans les deux premières parties de ce manuscrit, l'utilisation de

techniques moléculaires et l'emploi de méthodes culturales classiques ne sauraient s'exclure dans

l'étude de la diversité d'un écosystème. Dans le cadre de la caractérisation d'une nouvelle souche,

l'analyse phylogénétique de l'ADNr peut permettre d'asseoir une taxonomie sur une base cladistique.

Le travail que j'ai effectué pour les articles suivants constitue une contribution à la caractérisation de

souches isolées d'environnements hydrothermaux (articles 4, 5 et 6).

L'article 4 (article publié) présente la caractérisation d'une nouvelle espèce de

Methanococcales, Methanococcus vulcanius et l'identification d'une Methanococcales déjà isolée, M.

fervens.

L'article 5 (manuscrit en préparation) présente la caractérisation phylogénétique de 5

Thermococcales radiorésistantes isolées sur des sites hydrothermaux des dorsales médio-Atlantique

et est-Pacifique.

L'article 6 (manuscrit en préparation) présente la caractérisation phylogénétique d'une

souche de Bacillus thermophile isolée sur le site hydrothermal du bassin de Lau au sud-est des îles

Fidji.

Matériel et Méthodes

Paris

Ardennes

Marne

Haute-Marne

Aube

Seine-et-Marne

Val-d'Oise

Yvelines

Essonne

MONTMIRAIL

1 2

3 4

5

Légendes:1: Situation géographique de Montmirail.2: Puit de Pétrole (LMN).3: Décanteur (B01C).4: Echantillonnage en tête de puits (I50).5: Procédé de filtration de l’eau de production.

Figure 3.1. Echantillonnage des puits de pétrole. Site de Montmirail

Planche 1


109

I Echantillonnage et conservation de l'échantillon

Durant ce travail de thèse, trois types de sites ont été échantillonnés :

Ø des puits de pétrole en région parisienne (échantillons d'eau de production),

Ø des sources hydrothermales profondes sur la dorsale médio Atlantique (échantillons de

fluides et de cheminées),

Ø des sources chaudes terrestres Roumaines (échantillon d'eaux).

1.1 Echantillonnage des puits de pétrole

Les échantillons proviennent des puits de pétrole du site de Montmirail, dans le Bassin Parisien

(cf. planche photos figure 3.1). La société COPAREX, spécialisée dans l'exploitation des puits en fin

de production, en assure la gestion. Les techniques d'extraction utilisées nécessitent l'envoi d'eau

pressurisée dans le réservoir afin de faire remonter l'huile. Une fois en surface, le mélange eau/huile

est envoyé par des pipelines vers des bassins de décantation, puis vers des bassins de collecte.

Les échantillons étudiés sont des mélanges eau/huile prélevés en tête de puits ou dans un

décanteur. Après décantation des échantillons, la partie aqueuse a été conservée. Afin de récupérer

un grand nombre de micro-organismes, les échantillons ont été filtrés ou centrifugés. Les extractions

d'ADN sont donc réalisées à partir d'un filtre ou d'un culot de centrifugation.

La technique de filtration est dérivée de la technique décrite par Sommerville et al., 1989. Cette

technique peut s'appliquer à de nombreux échantillons liquides. Elle permet de concentrer les

échantillons et d'effectuer directement la lyse cellulaire sur filtre. Réalisée initialement sur des filtres

Millipore Sterivex GT (2 mL), elle peut être extrapolée à des filtres de plus grande taille afin de pouvoir

filtrer de plus gros volumes d'échantillons.

Il convient de filtrer l’échantillon à l'aide d'une pompe péristaltique. Le filtre utilisé est un filtre GT

(Millipore) de 0,2 µm en polycarbonate. En fin de filtration le filtre est lavé avec 10 mL de tampon SET

stérile (Sucrose EDTA Tris, voir composition § 2.1.1) puis stocké à -20°C.

1.2 Echantillonnage des sources hydrothermales profondes

Les échantillons ont été prélevés à 3500m de profondeur durant la campagne "Microsmoke" en

1995 (chef de mission Daniel Prieur). Cette campagne a été effectuée sur le site du Snake Pit

(23°22'118N, 44°56'984W) sur la dorsale médio Atlantique (cf. planche cartes figure 3.2). Le site du

"Snake Pit" a été retenu car il était profond (donc susceptible d'être colonisé par des micro-organismes

barophiles), la faune associée était relativement simple (essentiellement des crevettes) et les

cheminées présentaient des structures minéralogiques permettant un bon échantillonnage.

Plusieurs types de cheminées sont observables sur ce site. Les cheminées dénommées "Chi"

et "les Ruches" ont retenu notre attention.

Figure 3.2. Localisation : Campagne MICROSMOKE, Oct-Nov 95

Les RuchesChi

Localisation des sites d'échantillonnage sur le Snake Pit. Vignette: localisation du site Snake Pit sur la dorsale Médio-Atlantique. (d'après Y. Fouquet)

Localisation des cheminées sur le site du SnakePit . Section

Planche 2


110

Deux types d'échantillons ont été prélevés durant cette campagne : des échantillons de

cheminée (solides) et des échantillons de fluides collectés à l'aide d'un incubateur in situ , le Vent Cap.

La troisième planche de photos représente les différents échantillonneurs utilisés durant la campagne.

1.2.1 Echantillons de cheminée

Afin d'étudier la répartition des micro-organismes le long de la cheminée par des méthodes

culturales et moléculaires, les cheminées ont été sous-échantillonnées en suivant un axe longitudinal

et radial (cf. figure 3.3).

PARTIE Top

PARTIE B

PARTIE A

A

A’

B

B’

Section AA’Section BB’

12

12 3

Figure 3.3. Echantillonnage des cheminées prélevées sur le site du Snake-Pit.

Les échantillons ont été prélevés par grattage des cheminées à bord du bateau (Le Nadir) après

collecte de la cheminée à l'aide du sous marin (Le Nautile). Ils ont été conservés à -20 ou -80°C jusqu'à

extraction de l'ADN. Les échantillons conservés pour l'hybridation in situ ont été fixés par la méthode

décrite § 3.3.3.

La technique de conservation des échantillons pour l'extraction d'ADN n'a pas été optimale et a

sûrement contribué à une forte dégradation des échantillons. S'il n'est pas possible de réaliser

l'extraction d'ADN dès la remontée de la cheminée, il est préférable de conserver les échantillons dans

l'éthanol ou dans un milieu réducteur bloquant l'activité des DNAses afin d'éviter la dénaturation des

cellules et la dégradation de l'ADN. Par exemple il est possible de conserver les cellules dans un

tampon GIT (Guanidine isothiocyanate) 5 M, à raison de 1 volume de solution de GIT pour 1 volume

d'échantillon puis on stocke à 4°C.

solution de GIT 5M :

Dissoudre 60 g de GIT dans 5 mL 1 M Tris buffer pH 7,4, 5 mL 0,5 M EDTA (le GIT représente la majeure partie des 98,2 mL :

dissoudre le GIT dans le Tris l'EDTA et très peu d'eau en chauffant la solution au micro-ondes). Ajouter de l'eau MilliQ pour un volume

final de 98,2 mL. Ajouter 800 µl β-mercaptoethanol et 1 mL d’une solution de Sarkosyl stérile 10 % (p/v) (sodium N-lauroyl-

sarcosinate). Conserver la solution à température ambiante.

1.2.2 Echantillons de fluides

Le fluide a été collecté à l'aide d'un échantillonneur, le Vent Cap, qui permet, à la différence des

bouteilles Niskin ou des seringues de titane, de collecter du fluide sur plusieurs jours. Ce dispositif a

été mis au point par l'équipe de Norman Pace (Karl et al., 1988) (cf. planche photos figure 3.4).

1

2

3

4

5

Chambre

d’incubation

Jupe de

collecte

6

Légendes:

Figure 3.4. Echantillonnage des sites hydrothermaux profonds

Planche 3

Crédits photos:

1 IFREMER2,3 Laboratoire de microbiologie Roscoff4, 5, 6 A.L. Reysenbach

1 Submersible ”Le Nautile”2 Seringues de prélévement en titane3 Bouteille NIO4 Vent Cap sur site (2 jupes)5 Vent Cap sur site (1 jupe)6 Vent Cap schéma descriptif

Sonde de température


111

Disposé sur le lieu d'émission du fluide (petite cheminée ou fissure), le fluide est dirigé vers une

chambre d'incubation par une jupe en Téflon. Cette chambre est ouverte et fermée par une trappe

manoeuvrable par le submersible. A l'intérieur de la chambre on peut disposer des surfaces de

différents matériaux (Téflon, acier, porcelaine, etc.) qui serviront de support au développement des

micro-organismes. Le fluide ressort de la chambre à l'extérieur de la jupe lorsque la trappe est ouverte.

Les échantillons de fluide contenus dans le Vent Cap ainsi que les coupons sont conservés dans

l'éthanol à - 20°C ou fixés pour des hybridations in situ.

1.3 Echantillonnage des sources chaudes terrestres

Un échantillon provenant d'une source chaude Roumaine a été analysé. Il provient du site de

Caciulata (Roumanie du sud) et a été prélevé (par D. Prieur et I. Gomoiu) à la sortie du puits 1003 ayant

3000 m de profondeur. La température de l'eau était de 89,6°C et le pH de 6,8-6,9. Cette eau très

riche en sel est utilisée dans un système de chauffage.

II Analyse de l'ADNr 16S

L'analyse de la diversité microbienne de nos échantillons s'est déroulée selon le schéma suivant

1. Extraction de l'ADN.

2. Amplification spécifique du gène codant pour l'ARNr 16S par PCR.

3. Clonage des fragments d'ADNr 16S dans un plasmide.

4. Analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction des clones (RFLP), afin

de déterminer des classes de clones (O.T.U. ou phylotype).

5. Séquençage des différents clones.

6. Analyse des séquences à l'aide d'outils informatiques et construction d'arbres

phylogénétiques.

2.1 Extraction d'ADN

Plusieurs protocoles d'extraction d'ADN ont été utilisés et testés notamment pour extraire l'ADN

des cheminées hydrothermales (cf. figure 3.5A). Différents essais ont été entrepris pour tester

l'efficacité des méthodes d'extraction. Des cellules de E. coli on été ajoutées à un échantillon de

cheminée et l'échantillon a été soumis à différents protocoles d'extraction. Les quantités d'ADN extrait

ont été comparées par Spot -test (cf. figure 3.5B). Les codes utilisés dans cette figure correspondent

à ceux utilisés dans la figure 3.5. Les méthodes qui semblent être les plus efficaces pour les

cheminées hydrothermales sont : la technique du CTAB (2), la technique du micro-ondes (5) et la

technique de Tiedje (6). Pour les échantillons de fluide d'hydrothermaux et d'eaux de production les

protocoles les plus efficaces ont été ceux décrits ci dessous.

Figure 3.5. Techniques d’extraction d’ADN

1 Pierre Chevaldonné,1995 personal communication.2 Currents protocols in Molecular Biology 2.4.1.3 M.A. Voytek and B.B. Ward, Detection of ammonium-oxidizing bacteria of beta-subclass of the class Proteobacteria in aquatic samples with the PCR, A.E.M., 1995, 61, 4, p 1444-1450.4 D.L. Distel, E.F. Delong and J.B. Waterbury, Phylogenetic characterization and in situ localization of the bacterial symbiont of shipworms (teredinidae: bilvalva) by using 16S rRNA sequence analysis and oligodeoxynucleotide probe hybridization, A.E.M. 1991, 57, 8, p 2376-2382.

5 C. Bollet, M.J. Gevaudant, X. de Lamballerie, C. Zandotti and P. de Micco, A simple method for the isolation of chromosomal DNA from Gram positive od acid-fast bacteria, Nucl.Acids Res., 1991,19, 1955.6 J. Zhou, M.A. Burns and J.M. Tiedje, DNA recovery from soils of diverse composition, A.E.M., 1996, 62, 2, p 316-322.7 Jeff Stein, personal communication.8 Sue Barns, personal communication.9 P.R. Herron, Phage ecology and genetic exchange in soil, Molecular Microbial Ecology Manual,1995, 5.3.2., p 1-12, Elsevier.

Méthode du Chelex/

PEG

Bead Beating/Chelex

PEG

Méthode par

sonication

Sonication/GIT

SDS

Méthode du CTAB

Méthode du Chelex

Chelex/100°C /

PCR directe

Méthode de Delong

Tampon sucrose

1min à 100°C

Méthode du

Micro-onde

SDS 65°C et M.O.

Méthode du GIT

GIT/ Bead Beating

Méthode deTiedje

pilon-mortier

congél°-décongél°

agitation

Méthode du PVPP

PVPP

4-aminosalicylate

Echantillonde

cheminée

1

2

3

4

9

65

8

7

Références:

(ng d’ADN)10255075100

1 2 3 4

5 6 7 8

A

B


112

2.1.1 Extraction de l'ADN sur filtre ou sur culot de centrifugation

(d'après Sommerville et al., 1989)

Ajouter sur le filtre ou sur le culot de centrifugation :

1,8 mL de tampon SET (voir composition plus bas) + 20 µL de lysosyme à 20 mg/mL (fragilisation

de la paroi cellulaire). Placer le mélange 15 min sur la glace. Ajouter 20 µL de SDS à 10% et 20 µL de

N-lauryl-sarcosyl à 10% (p/v) (dénaturant des protéines et des polysaccharides). Laisser 1 heure en

agitation à température ambiante. Ajouter 50 µL de protéinase K à 20 mg/mL. Laisser 2 heures à 50°C

(digestion des protéines). La solution est récupérée dans le filtre. Ajouter : 0,5 volume d'acétate

d'ammonium 7.5 M à pH 8 (précipitation des protéines et des polysaccharides). Il est possible à ce

niveau de réaliser une extraction au phénol chloroforme (extraction des protéines), mais il est aussi

possible de passer directement à l'étape suivante. Laisser 10 min à température ambiante. Centrifuger

à 12000 g à 20°C durant 10 min. Eliminer le culot et ajouter 2 volumes d'éthanol 100% au surnageant.

Laisser 20 min à -20°C (précipitation de l’ADN). Centrifuger à 10000 g à température ambiante durant

20 min. Eliminer le surnageant. Resuspendre le culot avec 1 mL d'éthanol à 70% (v/v) (lavage de l’ADN

et élimination des sels). Centrifuger à 13000 RPM à 4°C durant 30 min. Jeter le surnageant et sécher le

culot au SpeedVac.

Dissoudre le culot dans 30 µL d'eau milliQ ou du TE (voir composition ci-dessous).

Composition des tampons

SET : 20% saccharose (p/v) TE : 10 mM Tris

50 mM EDTA 1 mM EDTA

50 mM Tris pH=7,6

pH=7,6

2.1.2 Extraction de l'ADN chromosomique par la méthode de Sambrook et al. (1989)

Chaque milieu est centrifugé et les culots contenant les bactéries sont récupérés. Ces culots

sont resuspendus dans 400 µL de tampon TNE (Tris Cl /NaCl /EDTA). On ajoute 15 µL de lysozyme (5

mg/mL) et 10 µL de la protéinase K à 20 mg/mL. Ce mélange est incubé durant 1 heure à 50°C. Il est

alors possible de rajouter 0,1 volume de SDS à 10% (p/v) et 0,1 volume de L-Lauryl-Sarcosyl à 10%

(p/v) et d'incuber de nouveau pendant 2 heures à 50°C. Afin d'extraire les protéines, 1 volume de

phénol équilibré dans du Tris est ajouté. La phase aqueuse est récupérée après centrifugation de 5 à

10 min à 10000 g. Ajouter 1 volume d’un mélange contenant du phénol saturé TRIS, du chloroforme

et de l’alcool isoamylique (24:24:1) avant de centrifuger durant 10 min à 6000 g. La phase aqueuse

contenant l’ADN est récupérée et traitée au chloroforme et à l’alcool isoamylique (24:1), et centrifugée

à nouveau. L’ADN est précipité avec 0,1 volume d'acétate de sodium 3 M et 2 volumes d'éthanol

100% durant 1 heure à -20°C avant une dernière centrifugation. Le culot contenant l’ADN précipité est

séché puis repris dans de l'eau MilliQ ou dans du TE.


113

2.1.3 Méthode d'extraction au micro-ondes

(d'après Bollet et al., 1991)

Laver les cellules ou l'échantillon dans du TE ou du TNE. Ajouter du SDS à une concentration

finale de 5% (p/v). Mettre 30 min à 65°C. Centrifuger et supprimer le surnageant. Mettre le culot au

micro-ondes 2 fois 1 min à 900 W (ou 3 x 1 min à 750 W). Resuspendre le culot dans du TNE et

effectuer une extraction au phénol-chloroforme suivie d'une précipitation de l'ADN à l'éthanol.

2.1.4 Extraction de l'ADN chromosomique par la méthode de Pitcher et al. (1989)

Cette méthode peut être utilisée à la place de la méthode traditionnelle décrite par Sambrook et

al., (1989) pour extraire l'ADN à partir de cultures pures. Il conviendra de rajouter du L-Lauryl-Sarcosyl

pour lyser plus efficacement les Archaea.

1,5 mL de culture en phase exponentielle (ou d'échantillon) sont centrifugés durant 5 min à

5000 g. Les cellules sont resuspendues dans 100 µL de tampon TE et lysées avec 0,5 mL de tampon

GES (5 M guanidium thiocyanate, 100 mM EDTA, 0,5% v/v SDS, pH 8). Les cellules en suspension

sont agitées brièvement et laissées à température ambiante durant 10 min. Le lysat est refroidi sur

glace et on ajoute 0,25 mL d'acétate d'ammonium 7,5 M froid. Les échantillons sont maintenus sur

glace pendant 10 min et occasionnellement agités. On ajoute 0,5 mL de chloroforme/2-pentanol

(24:1). Après agitation les phases sont séparées par 2 min de centrifugation à 2000 g. La phase

aqueuse est transférée dans un nouveau tube et 0,54 volume d'isopropanol froid est ajouté. On agite

les tubes par inversion pendant 10 min et l'ADN précipité est recueilli par centrifugation durant 1 min à

7000 g. Les culots d'ADN sont lavés à l'éthanol 70% (v/v) et séchés (Speed Vac ou air ambiant). L'ADN

est resuspendu durant une nuit dans 100 µL de tampon TE stérile (pH 8).

2.1.5 Extraction de l'ADN au "Bead-Beater"

Cette technique a été utilisée avec succès par la société Diversa et par Paul Riley (1997) pour

extraire l'ADN de sédiments ou de cheminée.

Utiliser 10 à 20 grammes de cheminée ou de sédiments. Ajouter un volume de billes pour "bead-

beating". Puis ajouter un volume (billes + échantillons) de solution de 5M GIT contenant 0.1% (p/v) de

SDS. Agiter vigoureusement (Bead-beater ou Ribolyser) durant 30 min à 1 h. Centrifuger à faible

vitesse pour éliminer les débris cellulaires et extraire l'ADN de la solution de GIT. Le culot est

resuspendu dans un tampon de lyse (TE/SDS 10% (p/v) par exemple) et traité par la protéinase K et

subit ensuite une extraction phénol/chloroforme.

2.2 Amplification de l'ADNr 16S

Afin d'amplifier l'ADNr 16S de nos échantillons nous avons utilisé une technique d'amplification

classique. Il a toutefois été nécessaire d'introduire des modifications dans la technique lorsque l'ADN

extrait était en trop faible quantité ou lorsque des contaminants (hydrocarbures, métaux) inhibaient la

réaction.


114

2.2.1 Réactions d'amplification classiques

Deux types d’enzymes ont été utilisées. La Taq polymérase commercialisée par Promega et

l'ampliTaq Gold (Perkin Elmer). L'avantage de cette dernière est de n'être activée qu'après un passage

à 95°C. Ceci revient à réaliser une PCR Hot Start (moins d’hybridations aspécifiques lors de la montée

en température du mélange d'amplification). A chaque cycle de dénaturation un nouveau pool

enzymatique est libéré (il y a moins de risque d'erreur), il est donc possible de faire plus de cycles (cf.

tableau 3.1).Tableau 3.1. Protocole d'utilisation de la Taq polymérase et de l'AmpliTaq Gold

AmpliTaq Gold (Perkin Elmer) Taq polymérase (Promega)

Milieux d'amplification :

Tampon 10X 1X

MgCl2 25 mM 2,5 mM

dNTP 100 mM 200 µM de chaque

Amorce Foward 0,2 µM

Amorce Reverse 0,2 µM

AmpliTaq Gold 5U.µl-1 2,5 U/100 µL

Matrice d'ADN < 1 µg/tube

Eau MilliQ qsp

Milieux d'am plification:

Tampon 10X 1X

MgCl2 25 mM 1,5 mM

dNTP 100 mM 200 µM de chaque

Amorce Foward 0,2 µM

Amorce Reverse 0,2 µM

Taq polymérase 5U.µl-1 2,5 U/100 µL

Matrice d'ADN < 1 µg/tube

Eau MilliQ qsp

Cycles employés :

1 cycle : 12 min à 96°C (activation de l'enzyme), 1 min 15 à 50°C,

2 min 15 à 72°C.

34 cycles : 1 min 15 à 95°C, 1 min 15 à 50°C, 2 min 15 à 72°C.

1 cycle : 7 min à 72°C.

Cycles employés :

1 cycle : 5 min à 96°C puis 1 min 15 à 50°C, 2 min 15 à 72°C.

29 cycles : 1 min 15 à 95°C, 1 min 15 à 50°C, 2 min 15 à 72°C.

1 cycle : 7 min à 72°C.

Afin d'amplifier un fragment cloné (voir technique de clonage) nous avons directement réalisé

les réactions de PCR sur cellules entières. Les cellules sont prélevées sur boites à l'aide d'un cure-

dent ou d'un cône de pipette et sont resuspendues dans un mélange d'amplification sans enzyme.

Après un premier cycle de 10 min à 95°C, on ajoute l'enzyme et on effectue une PCR classique.

2.2.2 Techniques d'optimisation de la réaction

Différents paramètres peuvent être modifiés afin d'optimiser la réaction d'amplification :

La concentration de l'échantillon : une simple dilution du produit d'extraction contenant l'ADN suffit

parfois à faciliter l'amplification. En effet, les inhibiteurs de la PCR sont alors également dilués. On peut

effectuer des gammes de dilutions du 1/10e au 1/100e par exemple.

Le milieu réactionnel : il est possible d'ajouter de l'acétamide et de la BSA (Bovin Serum Albumin) ou

de la BSA seule. L'acétamide rend théoriquement l'amplification plus spécifique. La BSA, quant à elle,

tend à stabiliser la Taq polymérase en fixant les inhibiteurs possibles de la réaction.

L'enzyme : on peut utiliser de la Taq classique ou de l'AmpliTaq Gold (voir plus haut).

Les amorces : à partir d'un premier produit d'amplification, on effectue une nouvelle réaction mais en

utilisant des amorces différentes. Ces secondes amorces sont choisies de façon à permettre

l'amplification d'une portion de la séquence déjà amplifiée par fixation "à l'intérieur" de celle-ci. On parle


115

de "PCR nichée". Par exemple, si le premier couple d'amorces utilisé est 8F-1525R, le second peut

être 50F-1492R. La séquence alors amplifiée sera légèrement plus courte mais le rendement de la

"PCR interne" est parfois meilleur car les amorces peuvent s'hybrider sur plus de matrice.

Le nombre de cycles effectués : sur des produits ayant subi une première réaction, il est possible de

rajouter de l'enzyme (1 ou 1,5 U) et de relancer un nouveau cycle de PCR. La première amplification

est parfois insuffisante pour permettre de visualiser une bande lors de la vérification sur gel.

Réparation préalable du matériel génétique : lors d'un cycle particulier (1 fois : 5 min à 95°C puis 10 fois

: 30 sec à 95°C, 30 sec à 54°C et 45 sec à 72°C) on met l'ADN extrait en présence d'un milieu

réactionnel classique de PCR mais sans amorce. Il se produit alors une réparation de l'ADN; c'est-à-dire

que la polymérase ajoute des dNTP aux endroits dégradés. Les petits fragments d'ADN servent en

quelque sorte d'amorces à l'enzyme. Cette technique est susceptible d'augmenter la quantité de

chimères.

2.2.3 Choix des amorces d'amplification

Les amorces suivantes (cf. tableau 3.2) sont utilisées pour les différentes réactions

d'amplification.Tableau 3.2. Spécificité et description des amorces d'amplification

Amorces Localisation Séquence Spécificité

E. coli Archaea Bacteria Eukarya

Orientation “Forward”

4F (3-20) 5'- TCCGGTTGATCCTGCCRG -3' +

21F (2-21) 5'-TTCCGGTTGATCCYGCCGGA-3' +

333F (333-348) 5'- TCCAGGCCCTACGGG -3' +

8F (8-27) 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3' +

50F (50-68) 5'- AACACATGCAAGTCGAACG -3' +

515F (515-533) 5'-GTGCCAGC(AC)GCCGCGGTA-3' + + +

Orientation “Reverse”

1492R (1510-1492) 5'- CGGTTACCTTGTTACGACTT -3' + + +

1525R (1541-1525) 5'- AAGGAGGTGATCCAGCC -3' + + +

Universal MCS 5'- GGAAACAGCTATGACCAT -3' hybridation avec

Reverse MCS 5'- GTAAAACGACGGCCAGTG -3' le plasmide

MCS: site multiple de clonage localisé sur le plasmide de chaque coté de l'insert.

2.3 Clonage des produits de PCR

Deux techniques de clonage ont été utilisées durant ces études. La plus fréquemment utilisée

est la technique du “TA cloning". Il a été aussi possible de transformer les cellules en utilisant un

électroporateur.

2.3.1 Utilisation du kit TOPO TA Cloning (Invitrogen )

Le protocole de clonage repose sur une erreur de la Taq polymérase qui ajoute

systématiquement un dNTP de type adénine (A) aux extrémités 3' du brin néosynthétisé. Le vecteur

utilisé possède, quant à lui, une thymine (T) au niveau du site d'insertion, à ses extrémités 3'. Une


116

liaison entre ses deux bouts cohésifs est donc possible. Elle est facilitée par l'action d'une

topoisomérase qui va liguer les deux fragments d'ADN à température ambiante.

Clonage dans le plasmide pCR 2.1 et transformation:

Le protocole de clonage et de transformation est celui décrit par le fabriquant.

Analyse des clones positifs :

Couler en boîte de Pétri un milieu LB additionné de 0.1 g/L d'ampicilline et de 0.3 mL/L de tétracycline

à 50µg/mL. Appliquer sur le milieu une solution contenant 40µL de X-Gal 5% dans du DMSO (p/v) et

40µL d'IPTG 100 mM. Etaler 80 µl de la solution de transformation. Incuber au minimum 18 heures à

37°C. Puis placer les boîtes environ 2 heures à 4°C pour faire apparaître la coloration bleue. On

repique les colonies blanches sur des boîtes de Pétri contenant du milieu LB additionné d'ampicilline

et de tétracycline (même milieu que précédemment), ceci afin de les conserver. On réalise également

une PCR suivie d'une électrophorèse sur gel d'agarose 0.8% (p/v) pour vérifier la taille de l'insert. La

PCR est effectuée directement sur les souches contenues dans le milieu de réaction à l'aide des

amorces “universal et reverse“ s'hybridant sur le plasmide.

Conservation des clones :

Il est possible de conserver les clones obtenus en les cultivant sur microplaques dans du milieu LB

liquide. On ajoute par la suite 5% (final) de glycérol à la culture. La microplaque protégée (film plastique

ou couvercle) peut être conservée à - 20°C (pendant une nuit) puis - 80°C (pendant plusieurs mois).

Composition des milieux utilisés :

Milieu LB (Luria-Bertani) : 1.0% Tryptone, 0.5% d'extrait de levure (Yeast Extract), 1.0% NaCl, pH 7.0

Gélose LB : milieu LB + 15 g/L d'agar avant d'autoclaver

IPTG = isopropylthio-ß-D-galactoside

X-Gal = 5-bromo-4-chloro-3 indolyl-ß-D-galactopyranoside

2.3.2 Transformation des cellules par électroporation

Une autre technique de transformation des cellules a été utilisée. Moins rapide que la technique

du choc thermique, la technique d'électroporation est toutefois très efficace.

1- Dessaler les produits de ligation. S'il y a trop de sel dans les échantillons ou si la cuvette est trop

vieille, celle-ci peut exploser durant l'électroporation. Utiliser 2 µL de produit de ligation. Les déposer

sur un filtre 0,022 µm flottant dans une boite de Pétri remplie d'eau désionisée. Effectuer la dialyse

durant 45 min à 1 heure.

2- Décongeler les cellules compétentes (sur la glace) en évitant les chocs thermiques. Mettre la

cuvette d'électroporation dans la glace. Aliquoter dans des tubes de 5 mL, 50µL de cellules

compétentes. Conserver ces tubes au froid. Ajouter les 2 µL de produit de ligation dialysé aux cellules

compétentes. Laisser 1 min sur glace.


117

3- Mettre les cellules dans la cuvette à la fin de la minute et procéder à l'électroporation.

4- Puis rapidement : Récupérer la cuvette et y ajouter directement 1 mL de milieu SOC puis

retransférer le tout dans un tube. Mettre les tubes à 37°C durant 45 min avec agitation.

5- Déposer entre 100 et 800 µL de la culture sur boite de Pétri en fonction de l'efficacité de la

transformation. Mettre les boites à 37°C durant la nuit.

2.4 Analyse des clones par RFLP : Restriction Fragment Length

Polymorphism

Afin de réaliser un premier tri parmi les clones à séquencer, nous avons analysé ces derniers par

RFLP. A chaque profil de restriction correspondait une classe, ou phylotype ou OTU. A chaque classe

correspondait des séquences différentes mais au sein d'une même classe on pouvait retrouver des

séquences différentes. Le choix des enzymes a été dicté par les résultats obtenus par Moyer et al.

(1996). MspI et HinP1I (ou HhaI son isoschyzomère) sont parmi les enzymes les plus discriminantes sur

l'ADNr 16S.

Site de coupure des enzymes de restriction :

MspI → 5’ C*CGG 3’ HinP1I → 5’ G*CGC 3’ HhaI → 5’ GCC*C 3’

3’ GGC*C 5’ 3’ CGC*G 5’ 3’ C*GCG 5’

Coupure :

Sur une microplaque, on met en présence l'ADN, le tampon et l' (les) enzyme(s) dans les

proportions suivantes (pour un puits) : 9 µL d’ADN, 1,2 µL de tampon, 0,6 µL HinP1I ou HhaI, 0,3 µl

MspI. La microplaque est placée au bain-marie à 37°C durant au moins deux heures. L'ADN matrice est

le produit de PCR ayant permis de vérifier l'efficacité du clonage.

Electrophorèse des produits de restriction:

L'électrophorèse est réalisée dans des gels résolutifs pour des fragments de (100 à 1500 pb).

Idéalement elle sera effectuée dans un gel d'agarose "NU Sieve" à 4% (p/v) dans un tampon TAE. On

pourra aussi pour des raisons d'économie faire la migration dans du gel "Sea Kem LE" à 2% (p/v) avec

un tampon TAE. Les échantillons sont chargés avec un tampon de charge contenant de l'Orange G

afin de détecter la sortie des bandes à faible poids moléculaire. Le marqueur couramment utilisé est le

"100 bp DNA ladder" (5µL par puits soit 5 U) . Ce marqueur comporte 11 fragments d’ADN double-brin

de 100 à 1500 paires de bases .

Composition des produits d'électrophorèse

Tampon TAE : 0.04 M Tris-acétate Loading Buffer : 0.25% Orange G (p/v)

0.001 M EDTA 40% saccharose dans du TE (p/v).


118

2.5 Séquençage

Si une des séquences a été réalisée manuellement (souche de Bacillus SG9) la majeure partie

des séquences réalisées durant cette thèse (clones et autres souches) l'ont été à l'aide d'un

séquenceur automatique. Nous ne décrirons donc que cette méthode de séquençage.

2.5.1 Réactions de séquence

Le principe de séquençage utilisé est celui développé par Sanger : l'incorporation de

didésoxynucléotides. A ce principe de séquençage a été couplée une réaction de PCR afin d'amplifier

le signal de séquençage. Il s'agit donc de séquençage cyclique ou "cycle sequencing". L’amorce est

marquée au moyen d'un fluorochrome (Texas Red) fixé aux extrémités 3' du simple brin et l'enzyme

Thermo Séquénase, analogue de la Taq polymérase, est thermostable et très processive.

Les conditions de séquençage sont celles décrites par le fabriquant du kit de Séquençage

(Amersham). Seul le cycle de PCR est modifié et l'ADN matrice utilisé est le produit de PCR obtenu

après amplification des clones à l'aide des amorces "universal et reverse".

Cycle : 97°C - 5 min (1 cycle); 95°C - 1 min, 54°C - 1 min, 61°C - 1 min (24 fois).

2.5.2 Amorces de séquençage

Les amorces utilisées pour le séquençage (cf. tableau 3.3) sont semblables à celles utilisées pour

l'amplification de l'ADNr 16S. Il est nécessaire d'utiliser des amorces internes à l'ADNr 16S afin de

couvrir la totalité de la séquence de la molécule.

Tableau 3.3. Spécificité et description des amorces de séquençage.

Amorces Localisation Séquence Spécificité

E. coli Archaea Bacteria Eukarya

Forward

4F (3-20) 5'- TCCGGTTGATCCTGCCRG -3'TRed +

8F (8-27) 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'TRed +

515F (515-533) 5'- GTGCCAGCMGCCGCGGTAA -3'TRed +/- + +

906F (906-922) 5'- GAAACTTAAAKGAATTG -3'TRed + +

Reverse

515R (533-515) 5'- TTACCGCGGCKGCTGGCAC -3'TRed +/- + +

906R (922-906) 5'- CAATTCMTTTAAGTTTC -3'TRed + +

1492R (1510-1492) 5'- CGGTTACCTTGTTACGACTT -3'TRed + + +

Universal MCS 5'- GGAAACAGCTATGACCAT -3'TRed hybridation avec

Reverse MCS 5'- GTAAAACGACGGCCAGTG -3'TRed le plasmide

MCS: site multiple de clonage localisé sur le plasmide de chaque coté de l'insert. IUB nomenclature: M=A ou C, K=G ou T.


119

2.5.3 Migration des réactions de séquences

L'obtention d'une séquence nécessite donc quatre dépôts (1 par base). Le gel utilisé a un fort

pouvoir résolutif. C'est un gel dénaturant à 7% d'acrylamide-bisacrylamide. Le caractère dénaturant est

dû à la présence d'urée (6M)1.

Pour 30 mL de gel à 7% de polyacrylamide : 4,2 mL de Long Ranger 50% (mélange Acrylamide-

Bisacrylamide) TEBU-FMC Bio Products, 11g d'urée, qsp 27 mL d'eau MilliQ. Le mélange est

désionisé (aide d'une résine échangeuse d'ions) et 3 mL de TBE X10 filtrés sont ajoutés. Avant de

couler le gel on ajoute les agents polymérisants : 150µL de TEMED et 15µL d'APS 10% (p/v)2. Le gel

est coulé entre deux plaques de verre borosilicaté et polymérisé durant 45 min à 1 heure. Le gel est

placé verticalement dans le séquenceur. Un peigne à dents de requin permet de former les puits. Les

échantillons peuvent ensuite être chargés.

Principe du séquenceur

La migration de 10 réactions de séquences (40 puits) s'effectue verticalement (cf. figure 3.6).

Les brins les plus courts migrent plus rapidement; ils vont donc se retrouver les premiers en bas du

gel. 512 photodiodes sont situées en ligne au bas du gel. Un faisceau laser de longueur d'onde 594

nm traverse le gel dans sa largeur et excite les fluorochromes qu'il rencontre. Les photodiodes

enregistrent l'intensité lumineuse émise à 612 nm par les fluorochromes excités. Le signal est

numérisé et transmis à l'ordinateur qui enregistre et analyse les données.

Figure 3.6. Représentation schématique du fonctionnement d'un séquenceur automatique.

1 La teneur en urée du gel peut varier de 4 à 7 M.2 APS = Ammonium Persulfate, Long Ranger = Acrylamide et N,N'-méthylenebisacrylamide 50%, TEMED = N,N,N',N'Tétraméthyléthylènediamine


120

2.6 Analyse des séquences

Les principes d'analyse des séquences ont été rappelés dans la première partie de ce

manuscrit. Après migration les séquences sont vérifiées afin d'éliminer d'éventuelles erreurs de

lecture (logiciel du séquenceur Vistra V 2.0). Puis elles sont comparées aux banques de données

(RDP et GenBank), alignées contre les séquences les plus proches et assemblées (logiciel ARB).

L'analyse phylogénétique est réalisée par la suite en comparant les résultats obtenus par les

techniques d'analyse des distances, de maximum de parcimonie et de maximum de vraisemblance

(logiciel ARB).

III Hybridation in situ

La technique d'hybridation in-situ peut elle aussi se diviser en plusieurs étapes : la construction

des sondes, la mise au point des sondes et l'hybridation in situ.

3.1 Construction des sondes

La construction des sondes est réalisée sur ordinateur. A partir d'un choix de séquences le

logiciel ARB permet de construire des sondes spécifiques des séquences à cibler. Les paramètres à

considérer sont le nombre de mésappariements, la longueur de la sonde, le Tm relatif de la sonde, le

G+C% de la sonde (plus il est important plus le signal d'hybridation sera fort).

A partir de la liste de sondes fournie par le logiciel il convient de déterminer la plus efficace , c'est à dire:

Ø la sonde qui ciblera le plus grand nombre d'organismes que l'on souhaite marquer.

Ø la sonde qui aura un nombre de mésappariements suffisant avec les micro-organismes

que l'on souhaite exclure; l'idéal est 3 mésappariements répartis sur toute la longueur

de la sonde (notamment au centre de la sonde).

Ø la sonde qui s'hybridera sur une région de l'ADNr 16S où la structure secondaire de la

molécule n'empêchera pas sa fixation (cf. la structure secondaire analysée par Fusch et

al., 1999 et voir exemple de structure secondaire en annexe).

3.2 Mise au point des sondes - Test de spécificité

Avant de réaliser les hybridations in situ il convient de tester la spécificité de la sonde sur

membrane (pour vérifier la fixation de la sonde sur l'ADN) et sur culture pure (afin de vérifier la

pénétration de la sonde dans la cellule et son hybridation sur la structure secondaire de l'ARN).

3.2.1 Hybridation sur membrane

On va déposer sur membrane l'ADN génomique, l'ARNr ou l'ADNr de souches dont on souhaite

vérifier l'hybridation avec la sonde. Il convient de choisir à la fois:

Ø des espèces qui sont spécifiquement ciblées par la sonde,


121

Ø des espèces de groupes phylogénétiques proches et éloignés ne s'hybridant pas avec la sonde,

Ø des espèces non recherchées mais pour lesquelles la sonde présente peu de mésappariements.

Il est possible de fixer sur la membrane des ARNr ou de l'ADNr 16S. Les ARN sont extraits à

l'aide des techniques classiques d'extraction (cf. Harmsen et al., 1997a). Les ADNr 16S déposés sur la

membrane peuvent être le produit d'amplification de l'ADNr 16S de souches pures ou d'ADNr 16S

clonés.

Dépôt sur membrane :

On dépose sur la membrane (par puits) soit 30 ng d'ARNr soit 100 ng d'ADNr. Avant dépôt,

l'appareil est nettoyé à l'eau MilliQ et séché à l'éthanol absolu. La membrane (Zeta Probe, GT-BioRad

ou Hybond N+-Amersham) est humidifiée par flottaison dans de l'eau MilliQ stérile puis séchée sur

papier Whatman. Les ADN ou les ARN sont dénaturés durant ce temps dans 1 volume de 0,4N NaOH,

4 mM EDTA 10 min à 100°C. On ajoute 0,1 volume de solution stop (2M d'acétate d'ammonium +

Bleu). Les échantillons sont conservés sur glace avant leur dépôt. Le volume total est de 50µL/dépôt.

On dépose les matrices dénaturées sur la membrane à l'aide d'un appareil à Dot-Blot ou à Slot-Blot.

Après séchage sommaire (sur papier Whatman) et emballage dans du film alimentaire, les matrices sont

fixées sur la membrane à l'aide d'un Cross linker (2 cycles de 30 mJoules). Les membranes sont

conservées à - 20°C.

Marquage de la sonde :

La sonde est commandée non marquée. Pour les tests de spécificité la sonde est marquée à

l'[γ -32P]ATP à l'aide de la T4 polynucléotide kinase. 100ng (dans 1µL) de sonde sont marqués à

chaque réaction. On ajoute 2µL de tampon, 16µL d'eau MilliQ stérile, 1 µL de sonde et 0,5 à 1 µL de

T4-Kinase et pour finir 1 µL de [γ -32P]ATP.

Hybridation sur membrane :

Les membranes sont préhybridées dans un volume minimal de tampon d'hybridation (10 à 20

mL) préchauffé durant 15 min à 45°C. Après marquage, la sonde (20µL) est introduite dans le tube et

l'hybridation se déroule durant la nuit à 45°C. Le lendemain, le mélange d'hybridation est éliminé et la

membrane est lavée 2 ou 3 fois avec du tampon 5X SSC. 20 mL de tampon de lavage préchauffé

(45°C) sont ajoutés et la membrane est incubée 20 min à 45°C. Le tampon est renouvelé et la

membrane est incubée à Td (voir plus bas) durant 1 heure au moins. Les membranes sont emballées

(humides) dans du film alimentaire et déposées contre un écran photo-stimulable. Les écrans sont lus

après 15 min à 1 heure d'exposition sur un Fluorimager (Storm, Molecular Dynamics). Les membranes

sont stockées à -20°C jusqu'à leur lavage.

Tampon d'hybridation Tampon SSCx20 Tampon de lavage

0,5M tampon phosphate 0,15 M NaCl 1X SCC

7% SDS (p/v) 0,015M Citrate de sodium 1% SDS (p/v)

1% BSA (p/v)

1 mM EDTA pH7,2


122

Mesure de la T d :

La technique de mesure de la Td est celle mise au point par Raskin et al. (1994a). Elle consiste a

effectuer des lavages successifs à des températures de lavage croissantes (avec un pas de 3 °C par

lavage par exemple).

CPM

Température de lavage

2000

4000

6000 CPM max

Td

CPM 50%

40 50 60 70 80 °C

Figure 3.7. Mesure de la température de dissociation (Td)

Dans un premier temps, la sonde est hybridée avec sa cible en duplicat ou en triplicat puis est

lavée comme précédemment 2 à 3 fois par 5X SSC. Après ce premier lavage, chaque "dot" est

découpé et déposé dans des tubes à scintillation contenant 2,5 mL de tampon de lavage préchauffé.

Le premier lavage est effectué à 38°C durant 20 min (pour supprimer l'excès de sonde). Puis un

deuxième lavage est effectué à 38°C durant 45 min à 1 heure. Après chaque lavage le "dot" est

transféré dans un nouveau tube à scintillation contenant du tampon de lavage. L'ancien tube est

rempli de 2,5 mL de liquide à scintillation et est conservé jusqu'au comptage. On procède alors à un

nouveau lavage à 41°C durant 45 min à 1 heure (puis à 44, 47, 50, etc., jusqu'à 71 ou 74°C). Lorsque

tous les lavages sont effectués, les tubes sont comptés et la courbe de valeur cumulées de

CPM=f(température de lavage) est construite. La Td est la température pour laquelle 50% de la

radioactivité aura été libérée (cf. figure 3.7).

Lavage des membranes pour réhybridation :

Les membranes peuvent être réhybridées plusieurs fois pour peu qu'elles aient été lavées.

Pour ce faire les membranes froides (-20°C) sont plongées dans une solution chaude (85°C) de 0,5%

SDS (p/v) dans de l'eau MilliQ. Elles y sont laissées durant 30 min au minimum. Puis les membranes

sont lavées avec du tampon de lavage froid, emballées dans du film alimentaire et stockées à -20°C.

3.2.2 Hybridation sur culture pure

Pour les hybridations sur culture pure, on choisit généralement deux souches. Chacune d'entre

elles s'hybride avec la sonde générale (EUB 338 par exemple pour la sonde bactérienne) et une seule

des souches s'hybride avec la sonde à analyser. Les hybridations sur souche pure permettent

d'optimiser la stringence du tampon d'hybridation en utilisant différentes concentrations de formamide.

Pour les conditions d'hybridation voir (§ 3.3).


123

3.3 Hybridation in situ

3.3.1 L'enrobage des lames d'observation

Avant le dépôt des cellules, les lames sont traitées. Laver les lames dans du KOH-éthanol (10%

KOH : 10 mL 5M KOH+ 40 mL éthanol). Rincer abondamment avec de l'eau MilliQ (2X). Plonger dans

une solution chaude (70°C) de gélatine 0,1% (p/v) et CrKSO4 0,01% (p/v). Sécher à l'air et conserver à

l'abri de l'humidité.

3.3.2 Fixation des cellules

Cette technique s'applique aux cellules obtenues par culture pure ou aux échantillons.

Préparation de la solution de fixation:

Chauffer 20 mL d'eau MilliQ dans un tube de 50 mL à 60°C (micro-onde). Ajouter 2 g de

paraformaldéhyde. Ajouter 100 µl de NaOH 5N et agiter. La poudre doit se dissoudre rapidement.

Ajouter 100 µl HCl 5N. Ajouter 15 mL PBS 10x et 10 mL d'eau. Refroidir la solution à température

ambiante. Equilibrer le pH à 7,2 et ajuster à 50 mL. Stériliser par filtration à 0,2 µm.

Fixation des cellules

Centrifuger 1 mL de culture en fin de phase logarithmique dans un microtube à 4000 g durant 5 min.

Supprimer le surnageant. Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS 3x et centrifuger à 4000 g durant 5

min. Resuspendre le culot dans 1 mL de solution de fixation (paraformaldéhyde 4% (p/v) dans du PBS

3x). Fixer les cellules durant 3 heures à 4°C (au minimum) ou 1,5 heure à température ambiante.

Centrifuger 5 min à 3000 g (attention les cellules sont fragiles). Resuspendre le culot dans 1 mL de

PBS 3x et centrifuger 3000 g (optionnel). Resuspendre le culot dans 100 µL de PBS 1x /0,1%

IGEPAL (p/v) et ajouter 100 µL d'éthanol. Stocker à -20°C.

3.3.3 Extraction des cellules de l'échantillon

Afin de limiter le bruit de fond lié à des hybridations non spécifiques des sondes sur des

morceaux de cheminée, il a été nécessaire d'extraire les cellules de l'échantillon avant de réaliser les

hybridations. Les cellules sont extraites après agitation avec un agent chélateur (le Chelex) et

migration sur un gradient de sucrose.

Déposer l'échantillon fixé dans un tube de 25 mL. Ajouter 5 mL de PBS 1x/2% PEG8000 (p/v)

et 1 g Chelex-100. Agiter vigoureusement. Puis agiter durant 1 heure à 4°C à l'aide d'un agitateur

horizontal. Centrifuger à 700 g pendant 1 min et récupérer le surnageant. Effectuer deux nouvelles

extractions sur le culot en ne rajoutant que 3 mL de PBS 1x/2% PEG8000 (p/v). Après centrifugation,

rassembler les surnageants et les centrifuger 5 min à 700 g. Le surnageant est finalement centrifugé

10 min à 4000g. Le culot (contenant les cellules) est resuspendu dans 1 mL de PBS 1x/0,1% IGEPAL

(p/v) (Sigma) et est déposé à la surface de 2 mL d'une solution de PBS 1x/0,1% IGEPAL (p/v)/ 50%

Ficoll (p/v) (Sigma). Après 1 min de centrifugation à 4000 g les cellules sont récupérées à la surface du

gradient de Ficoll et sont lavées dans du PBS 1x/0,1% IGEPAL (p/v). Elle sont resuspendues dans 60

µL de PBS 1x/ 0,1% IGEPAL (p/v) et 60µL d'éthanol 100%.


124

3.3.4 Hybridation in situ

Il faut dans un premier temps fixer les cellules sur la lame puis réaliser l'hybridation. Les lames

sont ensuite lavées et conservées jusqu'à leur observation.

Fixation des cellules sur la lame :

Essuyer les côtés de la lame avec du papier Whatman. Ajouter 1 à 5 µL de la solution de cellules fixées

(1µL pour les cultures pures). Laisser sécher à l'air en agitant avec un cône de pipette. Sécher 10 min à

46°C. Pour les bactéries Gram + ajouter 10 µL de lysozyme à 2 mg/mL (5 min à température ambiante).

Laver à l'eau MilliQ et sécher à l'air. Sécher les cellules en transférant les lames dans des tubes de 50

mL contenant : 50% (v/v) d'éthanol dans l'eau MilliQ (5 min), 70% (v/v) d'éthanol dans l'eau MilliQ (5

min), 96% (v/v) ou éthanol pur (5 min). Sécher les lames à l'air comprimé.

Chambre humide :

Utiliser un petit récipient avec un couvercle. Mettre des serviettes en papier au fond et les humidifier

avec une solution de la même force ionique que le tampon d'hybridation. On peut utiliser du tampon

d'hybridation ou une vieille solution de lavage. Préchauffer la chambre à 48°C.

Hybridation :

0,5 µL de sonde (50 ng pour chacune des deux sondes) sont mélangés à 9 µL de tampon

d'hybridation (Les solution filles de sondes sont préparées à 100 ng/µL; la solution stock est

généralement à 1µg/µl). Déposer les 10 µl dans les puits de la lame. Transférer rapidement dans la

chambre humide pour éviter l'évaporation. Incuber 3h à la température d'hybridation (généralement à

46°C).

Stringence des tampon d'hybridation (% de formamide)

Pour Eub/Arch : 20% (optimum) 40% (maximum). Pour Cren/Eury : 0%.

Pour Thermus : 60%. Pour Thermus/Eub: 60%. Pour Bacillus : 40%. Pour Bacillus/Eub: 40%.

Pour Hydrogeno : 60%. Pour Hydr/Eub: 60%. Pour Toga : 20 à 40%. Pour Toga/Eub: 20 to 40%.

Pour Epsi : 40%. Pour Epsi/Eub: 40%. Pour GroupC : 40%. Pour GroupC/Eub: 40%.

Pour Cren/Arch : 30% Pour Arch : pas plus de 40%

Tampon d'hybridation Tampon de lavage

0,9M NaCl 180mM NaCl

20mM Tris pH 7,5 20mM Tris pH 7,5

0,1% SDS (p/v)

% de formamide désiré

(voir articles 2 et 3 pour la description des sondes)

Lavage des cellules :

Préchauffer 50 mL de solution de lavage dans un tube de 50 mL à la température d'hybridation plus

2°C (soit 48°C). Prévoir deux lames par tube au maximum. Rincer les lames avec de la solution de

lavage et les mettre dos à dos dans les tubes de 50 mL. Incuber de 15 minutes à 1 heure. Rincer les

lames sur les deux faces avec précaution à l'eau MilliQ pour supprimer le tampon de lavage. Sécher


125

rapidement à l'air comprimé (pour éviter l'élution de la sonde par l'eau MilliQ). Conserver à 4°C ou

observer directement.

Epifluorescence :

Ajouter environ 20 µL de Citifluor (dans du PBS-glycérol) à la surface de la lame (pas directement dans

les puits) et mettre une lamelle. Laisser 15 à 30 min à température ambiante. Le Citifluor (pH 9)

équilibre le pH des cellules et limite les phénomènes de fading (affaiblissement). Visualiser les cellules

sous un microscope à épifluorescence à l'aide de filtres appropriés :

Fluorescéine : excitation à 490 nm, émission à 520 nm.

Rhodamine : excitation à 550 nm, émission à 580 nm.

IV Observation et quantification des cellules

Les échantillons fixés sont colorés au SYBR-Green I ou II pour réaliser des comptages de

cellules totales. A la différence du DAPI, le SYBR Green se fixe spécifiquement sur les acides

nucléiques. Il y a très peu de bruit de fond avec cette coloration, même sur des échantillons dans

lesquels les cellules n'ont pas été extraites.

1 à 5 µL d'échantillon ou de cellules extraites sont resuspendus dans 4,5 mL de TE stérile. Le

mélange est agité et filtré sur Anodisc 25 à 0,2 µm (Whatman). Afin d'assurer une filtration régulière un

second filtre de 0,65 µm (Millipore) est placé sous le filtre de 0,2 µm. Le filtre 0,2 µm est récupéré puis

est déposé sur une goutte (100 µL environ) de solution diluée de SYBR Green I ou II (dilution au

1/1000e de la solution mère). La coloration s'effectue par diffusion durant 15 min (au moins) à

l'obscurité. Le filtre est monté sur lame, recouvert d'un mélange d'anti-fading (100 à 150 µL) puis d'une

lamelle.

Les comptages sont effectués au grossissement X 1000. Un filtre est compté lorsque le nombre

de bactéries dans le champ est compris entre 30 et 200. On compte 20 champs par filtre et 2 filtres par

échantillon. L’oculaire de comptage permet le dénombrement soit sur toute la surface de l’oculaire soit

sur la surface quadrillée. Le filtre optique du SYBR Green est le même que celui utilisé pour

l'observation des cellules marquées à la fluorescéine.

Les comptages de cellules marquées par des sondes nucléiques sont effectués sur le même

nombre de filtres et de champs.

Solution d'anti-fading Solution Fille de SYBR Green

50% 1x PBS (v/v) dilution au 1/1000ede la solution mère dans du TE

50% Glycérol (v/v) le SYBR Green est instable dans l'eau MilliQ.

0,1% p-phénylènediamine (p/v)

Articles

127

Article 1

- Analyse moléculaire de la diversité phylogénétique de réservoirs pétroliers continentaux et d'une

source chaude terrestre.

- Article soumis à Applied and Environmental Microbiology (Janvier 2000).

Corre Erwan, Laurent Toffin,and Christian Jeanthon. Molecular Phylogenetic Analysis of the

Microbial Diversity of Continental Oil reservoirs.

Article 2

- Etude de la diversité phylogénétique bactérienne associée à un échantilloneur déployé sur un site

hydrothermal de la dorsale médio-Atlantique.

- Article à soumettre Applied and Environmental Microbiology (Janvier 2000)

Corre Erwan, Daniel Prieur and Anna Louise Reysenbach. Molecular Phylogenetic Bacterial

Diversity Associated with In Situ Growth Chambers deployed on a Vent Site on the Mid Atlantic Ridge.

Article 3

- Article en préparation :

Corre Erwan, Laurent Toffin, Julie Kirshtein, Anna-Louise Reysenbach, Daniel Prieur et Christian

Jeanthon. Analyse de la diversité procaryotique associée à des fluides hydrothermaux profonds par

séquençage des ADNr 16S, hybridation in situ et enrichissement.

Article 4

-Caractérisation d'une Archaea hyperthermophile méthanogène provenant d'un site hydrothermal

profond.

- Article publié dans International Journal of Systematic Bacteriology (1999).

Jeanthon C., S. L'Haridon, A.L. Reysenbach, E. Corre, M. Vernet, P. Messner, U.W. Sleytr and D.

Prieur. 1999. Methanococcus vulcanius sp. nov., a novel hyperthermophilic methanogen isolated

from East Pacific Rise and identification of Methanococcus spp. DSM 4213 as Methanococcus fervens

sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 49:583-589.

Article 5

- Article en préparation : Caractérisation phylogénétique d'Archaea hyperthermophiles

radiorésistantes isolées d'un site hydrothermal profond.

Edmond JOLIVET, Stéphane L'HARIDON, Erwan CORRE, Patrick FORTERRE and Daniel PRIEUR

Article 6

- Article en préparation : Caractérisation phylogénétique d’une Bacteria thermophile isolée sur le site

du Bassin de Lau.

128

Bibliographie :

Les références bibliographiques non citées dans les articles sont présentées dans la partie références

du manuscrit.

Conclusion générale


209

Le but de ce travail de thèse était d'étudier, à l'aide de techniques de phylogénie moléculaire,

la diversité microbienne inféodée aux réservoirs pétroliers et aux sources hydrothermales profondes.

A la lumière des résultats présentés dans ce manuscrit, une représentation schématique des relations

s'établissant entre les différents groupes bactériens et archaéens des écosystèmes pétroliers (cf.

figure 11.1) et hydrothermaux (cf. figure 11.2) peut être proposée.

Les processus de production primaire autotrophes au sein du réservoir pétrolier sont encore

méconnus. Il est donc probable que les micro-organismes se développant dans les réservoirs utilisent,

en absence d'oxygène, les hydrocarbures et leurs dérivés comme sources de carbone et comme

donneurs d'électrons. Les hydrocarbures peuvent soit subir une dégradation abiotique liée aux fortes

pressions, aux fortes températures et à des réactions physico-chimiques avec la roche mère, soit subir

une dégradation biotique liée aux micro-organismes présents dans l'eau de production ou dans la

roche réservoir. Il a en effet été démontré que les alcanes et un grand nombre d'alkyles benzènes

pouvaient être dégradés en anaérobiose par des micro-organismes (Heider et al., 1999 pour revue;

Zengler et al., 1999). Il s'agit de bactéries réduisant le sulfate et fer ferrique, ainsi que de bactéries

dénitrifiantes. Certains consortiums de bactéries syntrophes et méthanogènes peuvent dégrader les

hydrocarbures si l'hydrogène et l'acétate sont consommés activement par méthanogenèse

acétoclastique et hydrogénoclastique. Enfin, certaines fermentations peuvent être impliquées dans la

dégradation des hydrocarbures (Heider et al., 1999). Les composés simplifiés (chaînes d'alcanes

réduites, composés cycliques "ouverts") vont être disponibles pour des micro-organismes pratiquant

la respiration anaérobie ou la fermentation. Le méthane et le CO2 peuvent être présentés comme les

produits terminaux de cette dégradation anaérobie des hydrocarbures. Or le méthane pourrait être à

son tour consommé par d'autres micro-organismes. Il y a peu, seuls les mécanismes d'oxydation

aérobie du méthane étaient connus, mais la détection récente de micro-organismes assimilant en

anaérobiose le méthane au sein de sédiments marins (Hinrichs et al., 1999) rend cette réaction

également envisageable au sein d'un réservoir pétrolier.

Les études réalisées par des techniques moléculaires (article 1) et culturales (L'Haridon et al.,

1995; Jeanthon et al., 1995) dans le réservoir de Montmirail, nous ont permis de détecter ou de

cultiver des micro-organismes fermentaires, sulfato- ou thiosulfato-réducteurs, des bactéries

syntrophiques et des méthanogènes. Ces populations pourraient dégrader à forte température et en

absence d'oxygène les hydrocarbures et constitueraient la communauté indigène. Cette

communauté a pu être "enrichie" par des micro-organismes injectés dans le réservoir lors des

processus de récupération secondaire. Présents dans l'eau potable, l'eau de nappe phréatique ou

dans les eaux de production retraitées, ces micro-organismes, exogènes et généralement aérobies,

sont par la suite retrouvés dans les échantillons prélevés en tête de puits. Les conditions physico-

chimiques régnant au sein du réservoir ne permettent probablement pas à ces micro-organismes de

participer très activement à la dégradation des hydrocarbures. Toutefois il est probable que certaines

micro-niches, à proximité de la zone d'injection d'eau ou dans le puits, rendent cette dégradation

possible dans des conditions d'aérobiose ou de micro-aérophilie. Les canalisations des puits

CO2

CO2

NO3-

N2

Mn4+

Mn2+

Fe3+

Fe2+

SO42-

S2-

Composés en C1

CO2

CH4

MnO2(S)

NO3-

Mn4+Fe3+

SO42-

N2

Mn2+

Fe2+

S2-

Acides gras àlongue chaine

H2 CO2

Gaz d’origine géologique

CH4

Matière organique

n-Alcanes

Composéscycliques

HCO3-

Gaz

FeXOXOHX(S)

sous forme soluble

Injection d’eau

de production

Respirations anaérobies

Fermentations

Acétogenese

Méthanogenèseacétoclastique

hydrogénoclastiqueCH4

NO3- Mn4+Fe3+ SO42- S2O32-

de nappe phréatiquepotable

Bactéries du sol et souterraines

Processus indigènes thermophiles et mésophilesZone mésophile d’aérobiose

partielle

Apport de micro-organismes aérobies

contaminants

Proteobacteria epsilon(Campylobacteriaceae)

Thermococcales

Thermotogales

Propionibacteriaceae

Thermoanaerobacter

Thermodesulfobacterium

Proteobacteria delta(Desulfovibrionaceae)Peptococaccaceae(Desulfotomaculum)

Methanosarcinales

Proteobacteria delta(Desulfobulbaceae, Desulfovibrionaceae)

Archaeoglobales

Peptococaccaceae(Desulfotomaculum)

Bactéries sulfato-réductrices thermophiles

Dégradation aérobie

Acides gras àcourte chaine

Acétate

CO2

Bactéries syntrophiquesFirmicutes Proteobacteria

Alcools

Bactéries sulfato-réductrices mésophiles

Proteobacteria alpha

Proteobacteria beta

Proteobacteria gamma

Firmicutes à haut G+C%

Micro-organismes hétérotrophes ou fermentaires

CO2

Proteobacteria alpha

Proteobacteria beta

Proteobacteria gamma

Firmicutes à haut G+C%

Micro-organismes hétérotrophes ou fermentaires

Processus de sulfato-réduction etfermentaires mésophiles

induisant le “Pitting”

Fig. 11.1. Ecologie microbienne des réservoirs pétroliers


210

constituent par ailleurs des biotopes favorables au développement de micro-organismes sulfato-

réducteurs mésophiles intervenant activement dans les phénomènes de biocorrosion. La présence

de cette communauté mésophile est corrélée à un faible débit d'extraction. Plus la longueur de

canalisation est importante, plus le débit est réduit et plus il est possible aux micro-organismes de se

développer au sein des installations. Tout autour du réservoir, les communautés de micro-organismes

souterrains peuvent elles aussi interagir avec celles présentes dans le réservoir. Il a été proposé

(Voordouw et al., 1996) que des micro-organismes sulfo-oxydants (pouvant correspondre dans notre

cas à des Proteobacteria epsilon) interviendraient dans la réoxydation des composés soufrés réduits

produits par les bactéries sulfato-, thiosulfato- et soufre-réductrices du réservoir. Mais d'autres

interactions entre ces deux communautés sont envisageables notamment via les processus de

respiration anaérobie.

Les mécanismes biotiques et abiotiques se déroulant au sein des réservoirs pétroliers sont

encore mal connus en raison, notamment, des difficultés d'échantillonnage et de notre incapacité à

prévenir les contaminations par les micro-organismes des sols ou injectés dans la nappe. Aussi

considère-t-on comme endémiques des micro-organismes dont les conditions de croissance sont

compatibles avec les conditions physico-chimiques des puits. Il est toutefois difficile de connaître

l'ensemble des conditions physico-chimiques inhérentes à un réservoir s'étendant sur une surface de

plusieurs kilomètres carrés, sur plusieurs dizaines de mètres de profondeur et au travers de

différentes roches. Aussi, il est probable que des conditions de température modérée et/ou

d'aérobiose partielle puissent exister au sein du réservoir en particulier lorsque la nappe est en contact

avec la roche couverture.

Il ne nous aura pas été possible au cours de cette étude d'estimer la représentativité des

séquences détectées au sein du réservoir. Si les séquences correspondant aux micro-organismes

sulfato-réducteurs semblent dominer certaines des banques obtenues, seules des expériences

d'hybridation in situ nous permettraient de préciser la contribution de ces micro-organismes dans cet

environnement. Par ailleurs ce type d'étude n'a jamais été réalisé à partir d'échantillon de réservoirs

pétroliers.

Au sein des écosystèmes hydrothermaux profonds on distingue les micro-organismes se

développant dans la "zone chaude" à proximité des fumeurs, dans le fluide ou les parois des

cheminées (partie gauche de la figure 11.2), de ceux se développant dans la zone froide ou à

température modérée, dans l'eau de mer, sous forme libre ou en association symbiotique avec la

macro-faune des sources hydrothermales (partie droite de la figure 11.2).

Dans la zone froide, la production primaire est assurée par des bactéries chimiosynthétiques

autotrophes sulfo-oxydantes sous une forme libre ou associées à la macrofaune. Les Proteobacteria

epsilon que nous avons détectées dans les échantillons de "Vent Cap" pourraient intervenir dans ces

processus puisqu'elles semblent être associées à certaines espèces d'Annélides (Haddad et al.,

1994) et de Crustacés (Poltz et Cavanaugh, 1995) mais qu'elles sont aussi présentes sous une forme

libre dans des tapis bactériens ou sur des édifices minéraux (Moyer et al., 1995; Poltz et Cavanaugh,

Oxydation/précipitation par mélange avec l'eau de mer froide

FeS + O2

Mn + O2

Fe(O)OH

MnO2

Lessivage de Ca2+, Mn2+, Fe2+ et Cu2+

BASALTE

Eau de mer chaufféeenrichie en minéraux

Macro-faune et communautémicrobienne mésophile symbiotique

Communauté microbiennethermophile sous une forme libre

dans les panaches ou dans les paroisdes cheminées

100°C

1000°C

Percolation de l'eau demer froide

Fort débitTempérature élevée

Communauté microbiennemésophile sous forme libre ou

sous forme de tapis

CH4 CO2

SO42-

S2-

(CH2O)n

CH4

CO2

Micro-organismes sulfo-oxydants

Micro-organismes methylo, methanotrophes

Proteobacteria Proteobacteria

Proteobacteria Proteobacteria

Communauté microbienne marine

Micro-organismes hétérotrophes

Proteobacteria

Cytophagales

Verucomicrobiales

Planctonomycetales

Firmicutes

Archaea Groupes I et II

CO2(CH2O)n

Cyanobactéries

Micro-organismes photosynthétiques

CO2

(CH2O)n

Consommateurs

Micro-organismes aérobies

Micro-organismes fermentaires

Micro-organismes à respiration anaérobie

Micro-organismes méthanogènes

(dont micro-organismes sulfato réducteurs)

Production primaire

Micro-organismes autotrophes

Sulfato-réducteurs

Soufre-réducteurs

Méthanogènes hydrogénoclastiques

Hydrogène-oxydants

Archaeoglogus

Desulfurobacteriales

Aquificales

MethanococcalesMethanopyrus

Pyrodictium 60 à 100°C

SO42-

S2-

S2-

S°

CH4

CO2

(CH2O)n

CO2

H2

H2O

S2-

S°

SO42-

S2-

CO2

(CH2O)n

O2

H2O

Micro-organismes hétérotrophesSulfato-, thiosulfato- réducteurs

Soufre-réducteurs

Fermentaires

Aérobies

Archaeoglogus

Thermococcales

Thermus sp.

Thermococcales

Bacillus sp.

Thermosipho sp.

Consommateurs

Thermotoga

S2O32-

Desulfurococcus sp.

Staphylothermus

StaphylothermusPyrodictium

Production primaire

Archaea non cultivéesProteobacteria inconnues

??

O2

H2O

SO42-

S2-

Mn4+

Fe3+

Mn2+

Fe2+

CO2

(CH2O)n

SO42-

S2-

NO3-

N2

CO2

(CH2O)n

Mn4+Fe3+

Mn2+Fe2+

CO2

CH4

??

Zone de mélange des eaux

Température moyenne

Communauté microbiennesoutérraine

Fig. 11.2. Ecologie microbienne des sources hydrothermales profondes

(voir Fig. 11.1)

Micro-organismes sulfo-oxydantsProteobacteria Thiomicrospira sp.Thiobacillus sp.Beggiatoa sp.

Micro-organismes Fe-, Mn- oxydantsThiobacillus sp.

350°C

350°C

350°C350°C


211

1995; Cary et al., 1997) ou dans le fluide (articles 2 et 3). Jusqu'à présent aucun micro-organisme

méthanotrophe autotrophe n'a été détecté sous une forme libre mais ceux-ci interviennent activement

en tant que producteurs primaires sous une forme symbiotique associée à des Mythilidés (Nealson et

Fischer, 1995). D'autre part, des activités in situ correspondant à une oxydation du méthane par des

formes libres ont déjà été enregistrées à proximité des sources hydrothermales profondes (De Angelis

et al., 1991). Des micro-organismes n'oxydant strictement que les métaux, tels que le Fe(II) et le Mn(II),

n'ont pas été isolés. Si certains Thiobacillus peuvent se développer en autotrophie en oxydant les

métaux, le fer ferreux n'est quant à lui stable que dans des conditions acidophiles qui ne sont

rencontrées dans les sources hydrothermales que dans le fluide chaud. Les consommateurs du pôle

froid sont soit les macro-organismes associés aux bactéries symbiotiques, soit d'autres micro-

organismes sous une forme libre se développant en hétérotrophie en conditions d'anaérobiose

(fermentations, respirations anaérobies) ou d'aérobiose complète ou partielle (respiration aérobie,

micro-aérophilie). On connaît peu de chose sur ces micro-organismes mésophiles en grande partie

parce que les études microbiologiques se sont très vite focalisées sur les micro-organismes

thermophiles. Il est toutefois probable qu'on puisse retrouver dans cette communauté des micro-

organismes issus des communautés microbiennes marines et souterraines. Ces micro-organismes

transportés par les courants, déposés avec les sédiments ou charriés par des émissions de fluide

hydrothermal à base température, profiteraient d'un apport abondant en matière organique pour se

développer activement et contribuer aux différents cycles géochimiques (C, N, S, métaux) au sein de

l'écosystème hydrothermal.

Dans la zone chaude, c'est à dire dans le panache du fluide hydrothermal, à proximité et dans

les parois des cheminées, la production primaire pourrait être assurée par des micro-organismes

chimiolithoautotrophes thermophiles. Il est aussi possible que la matière organique produite dans les

zones froides se retrouve dans les zones chaudes ou que des processus géochimiques de

profondeur puissent être générateurs de matière organique. Les Methanococcales réalisant une

méthanogenèse hydrogénoclastique (article 4), les Archaeoglobales sulfato-réductrices et les

Desulfurobacteriales soufre-réductrices détectées dans nos échantillons pourraient contribuer

activement à la production primaire biotique du pôle chaud (Harmsen et al., 1997b; article 3). Les

micro-organismes associés aux Aquificales détectés dans l'échantillon VC 2.1 pourraient quant à eux

intervenir dans la production primaire en oxydant l'hydrogène (article 3; Reysenbach et al., 1999). Les

micro-organismes thermophiles hétérotrophes se développant dans le pôle chaud sont mieux connus

que leurs analogues du pôle froid. Les enrichissements d'hétérotrophes thermophiles en présence

de soufre sont généralement dominés par les Thermococcales, micro-organismes fermentaires

réduisant le soufre (articles 3 et 5). Il nous a été possible, par ailleurs, de détecter des Thermotogales

et des Thermus dans de faibles proportions, pouvant eux aussi se développer, respectivement en

anaérobiose et aérobiose, au niveau du pôle chaud (article 3). Bien qu'ils n'aient pas été détectés

dans nos échantillons, des Bacillus ont déjà été isolés sur le site du Snake Pit (cf. tableau 6.1;

Marteinson et al., 1996). Ces micro-organismes sont présents de manière ubiquiste dans de

nombreux environnements terrestres ou marins, en raison notamment de leur capacité à sporuler. Ils


212

dominent généralement les enrichissements aérobies à haute température. Ces micro-organismes

peuvent prendre part activement à la consommation de la matière organique au niveau du pôle chaud

des sources hydrothermales (article 6).

Les variations de disponibilité des nutriments, liées aux caractère abrupt des gradients

physico-chimiques à la sortie des sources hydrothermales, mais aussi aux forts courants de fond,

favorisent très probablement le développement des micro-organismes mixotrophes. Mais les

techniques d'isolement généralement utilisées ne favorisent pas la détection de ce type métabolique

(Karl, 1995). La forte variabilité de séquences d'ADNr 16S observée pour de nombreux groupes

phylogénétiques (notamment pour les Proteobacteria epsilon) dans chacun de nos échantillons

(articles 2 et 3, Reysenbach et al., 1999) pourrait correspondre à une réponse adaptative corrélée aux

variabilités des conditions environnementales.

Les écosystèmes pétroliers et hydrothermaux profonds présentent de fortes similitudes tant

au niveau de leur localisation (environnements souterrains ou profonds), de leurs conditions physico-

chimiques (forte température, forte pression, anoxie) que des communautés microbiennes qu'ils

hébergent (micro-organismes thermophiles, fermentatifs, sulfato-réducteurs, soufre-oxydants). Le

soufre et les composés soufrés y sont considérés comme des éléments-clés des processus

métaboliques indigènes. Comme les micro-organismes décrits les plus intimement associés au dernier

ancêtre commun sont des hyperthermophiles anaérobies réduisant le soufre, il a été suggéré que la

réduction du soufre pourrait être l'une des premières formes de respiration microbienne (Madigan et

al., 1996). Il a cependant été récemment démontré qu'un grand nombre de micro-organismes

thermophiles isolés d'écosystèmes chauds (par exemple des méthanogènes, des fermentatifs ou des

sulfato-réducteurs) étaient également capables de réduire le fer ferrique en présence d'H2 comme

seule source d'électrons (Vargas et al., 1998; Slododkin et al., 1999). Compte tenu de l'abondance de

ce métal dans l'ensemble de la biosphère terrestre, la réduction du fer aurait pu constituer un

processus majeur sur la Terre primitive et serait encore actuellement prépondérante dans les

biosphères souterraines (Liu et al.,1997b; Lovley, 1997).

Un grand nombre de séquences, en particulier celles affiliées à des groupes phylogénétiques

où aucun isolat n'est disponible (Crenarchaeota et Euryarchaeota non cultivées, Bacteria "branchant"

profondément, nouvelles Proteobacteria ) ne peuvent clairement être associées à un biotope ou à un

processus métabolique. L'utilisation de nouvelles techniques d'isolement (comme par exemple les

pinces optiques) combinée à celle de sondes moléculaires, l'analyse phylogénétique et la

quantification de gènes impliqués dans des fonctions métabolique (via le séquençage, les puces à

ADN et l'analyse des ARNm) ainsi que la généralisation des études génomiques pourraient permettre

d'attribuer une fonction et une place dans l'écosystème à ces micro-organismes.

L'origine endémique ou cosmopolite des communautés de micro-organismes thermophiles et

mésophiles des écosystèmes hydrothermaux et pétroliers reste encore indéterminée. Si certains


213

genres, à l'instar de Thermococcus, de Bacillus, de Thermotoga, de Thermosipho ou de

Methanococcus, ont été détectés de manière ubiquiste en milieu hydrothermal côtier et profond, et

en milieu pétrolier marin et continental, d'autres semblent strictement associés à un environnement

donné, comme les Petrotoga et les Geotoga dans les réservoirs pétroliers ou les Pyrolobus et

Desulfurobacterium dans les écosystèmes hydrothermaux profonds. En poursuivant l'analyse de ces

écosystèmes, en entreprenant par exemple des études de génétique des populations, sur la base

des espaces intergéniques ou des gènes codants pour des protéines, de différencier les populations

écologiquement distinctes et d'établir leur origine biogéographique.

L'analyse de la diversité des communautés microbiennes d'environnements extrêmes peut

présenter un intérêt économique autant que fondamental. Hunter-Cevera s'interrogeait récemment

sur la valeur que pouvait présenter cette diversité (Hunter-Cevera, 1998). On peut y voir une valeur

pécuniaire au travers des processus métaboliques que l'on peut détecter, cloner et exprimer à une

échelle industrielle (Garrity et Hunter-Cevera, 1999). Mais elle présente avant tout une valeur

fondamentale. De telles études contribuent d'une part à un inventaire des espèces vivantes tel que

cela a été proposé par Pace (1997), et d'autre part à mieux définir quelles pourraient être les frontières

géographiques et physico-chimiques du vivant et la nature des premières formes de vie terrestres.

Références biobliographiques

Références bibliographiques

214

A

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Annexes

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Structure secondaire de l’ARN r 16S d’E. coli.

Methanospirillum hungatei str. JF1 (DSM 864)

Methanosarcina barkeri str. 227 (DSM 1538)

Haloferax volcanii str. DS-2 (ATCC 29605)

Thermoplasma acidophilum str. 122-1B2

Santa Barbara Channel bacterioplankton DNA clone SBAR16 Archaeoglobus fulgidus str. VC-16 (DSM 4304)

Methanothermus fervidus

Methanobacterium formicicum (DSM 1312)

Thermococcus celer str. VU 13 (DSM 2476)

Methanococcus vannielii str. EY33

Methanococcus jannaschii str. JAL-1 (DSM 2661)

Methanopyrus kandleri str. av19 (DSM 6324)

Mud Volcano area of Yellowstone NP ("Black Pool") hot spring DNA clone pJP27

Santa Barbara Channel bacterioplankton DNA clone SBAR12

Mud Volcano area of Yellowstone NP ("Black Pool") hot spring DNA clone pJP89 Thermofilum pendens str. Hvv3 (DSM 2475)

Sulfolobus acidocaldarius str. 98-3 (ATCC 33909)

Thermoproteus tenax

Aquifex pyrophilus str. Kol5a

Fervidobacterium islandicum str. H-21 (DSM 5733)

Thermotoga maritima str. MSB8 (DSM 3109)

Chloroflexus aurantiacus str. J-10-fl

Thermomicrobium roseum (ATCC 27502)

Meiothermus ruber str. Loginova 21 (ATCC 35948)

Deinococcus radiodurans (ATCC 35073)

Acholeplasma laidlawii str. JA1

Clostridium ramosum str. 113-I (ATCC 25582)

Mycoplasma capricolum (ATCC 27343)

Streptococcus thermophilus (ATCC 19258)

Enterococcus faecalis

Lactobacillus casei subsp. casei (NCDO 161)

Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii str. Calvert (NCIMB 8130)

Listeria monocytogenes

Korarchaeota

Aquificales

Thermotogales

Deinococcus -Thermus Group

Bacillus cereus (IAM 12605)

Bacillus stearothermophilus (NCDO 1768)

Bacillus subtilis str. 168

Eubacterium barkeri (NCIMB 10623)

Heliobacterium chlorum (ATCC 35205)

Clostridium quercicolum (ATCC 25974)

Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum (ATCC 25586)

Streptomyces ambofaciens

Corynebacterium xerosis (ATCC 373)

Bifidobacterium bifidum (DSM 20456)

Arthrobacter globiformis (DSM 20124)

Clostridium leptum (ATCC 29065)

Clostridium pasteurianum (ATCC 6013)

Clostridium butyricum str. E.VI.3.6.1 (NCIMB 8082)

Spirillum volutans (ATCC 19554)

Rubrivivax gelatinosus str. ATH 2.2.1 (ATCC 11169)

Rhodocyclus purpureus str. 6770 (DSM 168)

Neisseria gonorrhoeae str. B 5025 (NCTC 8375)

Stenotrophomonas maltophilia (NCIMB 9203)

Escherichia coli

Pseudomonas aeruginosa (NCPPB 965)Chromatium vinosum (ATCC 17899)

Ectothiorhodospira halochloris str. A (ATCC 35916)

Rhodospirillum rubrum str. ATH 1.1.1; S.1 (ATCC 11170)

Azospirillum brasilense str. Sp 7 (DSM 1690) {1461 bp}

Rickettsia prowazekii str. Breinl (ATCC VR-142)

Sphingomonas capsulata (JCM 7508)

Rhizobium leguminosarum (IAM 12609)

Rhodomicrobium vannielii str. EY33 (ATCC 51194)

Bradyrhizobium japonicum (LMG 6138)

Myxococcus xanthus str. DK1622 Desulfobacter postgatei str. 2 ac 9 (DSM 2034)

Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774)

Bdellovibrio stolpii str. UKi2 (ICPB 3291)

Campylobacter jejuni subsp. jejuni str. TGH 9011 (ATCC 43431)

Fusobacteria

Campylobacter jejuni subsp. jejuni str. TGH 9011 (ATCC 43431)

Helicobacter pylori (RPH 13487)

Wolinella succinogenes str. 602W (FDC) (ATCC 29543)

Treponema pallidum str. Nichols

Spirochaeta stenostrepta str. Z1 (ATCC 25083)

Borrelia burgdorferi str. B 31 (ATCC 35210)Spirochaeta halophila str. RS1 (ATCC 29478)

Serpulina hyodysenteriae str. B204 (ATCC 31212)

Leptonema illini str. 3055

Leptospira interrogans str. Kennewicki, serovar pomona

Acidobacterium capsulatum str. 161

Fibrobacter succinogenes str. S85 (ATCC 19169)

Zea mays (maize) -- chloroplast

Olisthodiscus luteus (stramenopile) -- chloroplast

Synechococcus sp. (PCC 6301)

Nostoc muscorum (PCC 7120)

Gloeobacter violaceus (PCC 7421)Mount Coot-tha region (Brisbane, Australia) 5-10cm depth soil DNA clone MC 18

Chlamydia psittaci str. 6 BC (ATCC VR-125)

Pirellula staleyi (ATCC 27377)

Chlorobium limicola str. 8327

Thermonema lapsum (ATCC 43532)

Flexibacter litoralis str. Lewin SIO-4 (ATCC 23117)

Cytophaga hutchinsonii str. D465 (P.H.A. Sneath) (ATCC 33406)

Cytophaga diffluens str. Lewin LIM-1 (ATCC 23140)

Saprospira grandis (ATCC 23119)

Flexibacter canadensis (ATCC 29591)

Cytophaga lytica str. LIM-21 (ATCC 23178)

Empedobacter brevis (ATCC 14234)

Bacteroides fragilis (ATCC 25285)

Prevotella ruminicola subsp. ruminicola (ATCC 19189)

Chloroplastes

Fibrobacter group

Planctomycetes-Verrucomicrobia-Chlamydia group

GS

0,5

RESUMEL'étude des communautés de micro-organismes des sources hydrothermales profondes et des réservoirs

pétroliers a longtemps été limitée par l'utilisation exclusive de méthodes culturales ne permettant d'accéder qu'à unepart restreinte de la diversité microbienne. Afin de dépasser cette restriction, nous avons utilisé les approchesculturales en combinaison avec des approches moléculaires pour étudier les communautés microbiennes de deuxréservoirs pétroliers du bassin parisien et des fluides hydrothermaux profonds collectés sur la dorsale médio-Atlantique. Ces approches ont consisté d'une part en une analyse phylogénétique des gènes codant pour l'ARNr 16Spar amplification et hybridation in situ en s'affranchissant de toute étape de culture, d'autre part dans l'enrichissementde diférents types métaboliques à haute température, et enfin dans le positionnement phylogénétique de souchesisolées d'environnements hydrothermaux.

L'étude réalisée à partir d'échantillons d'eau de production de deux réservoirs pétroliers a conduit à ladescription de séquences d'Archaea méthanogènes, halophiles ou hyperthermophiles affiliées aux Methanosarcinalesou aux Thermococcales. Pour deux échantillons, les séquences de Bacteria étaient associées à des Thermotogales,des Proteobacteria delta et des Firmicutes à bas G+C% généralement impliqués dans des processus thermophiles etmésophiles de sulfato- ou thiosulfato-réduction. Des séquences associées au genre Arcobacter pouvant intervenirdans le cycle des composés soufrés au sein du réservoir ont été détectées dans un troisième échantillon. Enfin undernier échantillon au sein duquel les séquences associées au genre Herbaspirillum, provenant probablement d'unecontamination liée aux processus d'extraction secondaires des hydrocarbures, étaient dominantes.

Des fluides hydrothermaux ont été échantillonnés à l'aide d'un collecteur original, le "Vent Cap". Desenrichissements de différents types métaboliques (soufre-réducteurs autotrophes et hétérotrophes, sulfato- etthiosulfato-réducteurs, et méthanogènes) à 65 et 80°C ont été positifs dans la majorité de nos échantillons.L'amplification et le séquençage des ADNr 16S bactériens et archaéens a conduit à la détection d'une grande diversitéde séquences. Les Proteobacteria epsilon dominent généralement les banques de séquences bactériennes et sontdétectées avec les Desulfurobacteriales en forte proportion par hybridation in situ. Des séquences d'Archaeacommunément isolées en milieu hydrothermal profond, telles que les Thermococcales, les Methanococcales et lesArchaeoglobales ont également été détectées.

L'utilisation combinée de différentes méthodes moléculaires et de méthodes culturales nous a permis dedépasser les limitations inhérentes à chacune de ces méthodes et de proposer une image des relations s'établissantentre les différentes communautés de micro-organismes présents dans ces deux environnements.

ABSTRACTStudies of the microbial communities from deep sea hydrothermal vents and oil reservoir have been for a long

time exclusively limited to the use of cultural techniques which described only a restricted part of the diversity. Tocircumvent this limitation we used cultural techniques in conjunction with molecular methods to investigate microbialcommunities of continental oil reservoirs in the East Paris Basin and of hydrothermal fluids collected on the Mid AtlanticRidge. Our approach combined total 16S rDNA sequencing and in situ hybridization without any cultural step,enrichments of differents metabolic types at high temperature and phylogenic characterisation of strains isolated fromhydrothermal environment.

The study of oil reservoirs water production lead to the description of archaeal sequences affiliated with themethanogenic, halophilic or hyperthermophilic, Methanosarcinales and Thermococcales orders. Bacterial sequencesare mostly affiliated, in two of our samples, to thermophilic or mesophilic sulfate- or thiosulfate-reducing bacteriabelonging to the Thermotogales and δ-Proteobacteria phylum and to the Low G+C Gram-positive bacteria. Sequencesaffiliated to the genus Arcobacter, probably involved in the sulphur cycle inside/or in the vicinity of the oil reservoir, werealso detected in another sample. Finally a last sample was dominated by sequences related to the aerobic genusHerbaspirillum, that may come from contaminations occuring during the secondary oil recovery process.

Deep hydrothermal fluids were sampled by a special collector, the Vent Cap. Enrichments of heterotrophic andautotrophic sulphur-reducers, sulphate and thiosulfate reducers and methanogenes at 65 and 80°C were positive inmost of our samples. Archaeal and bacterial 16S rDNA analyses revealed a wide sequences diversity. ε-Proteobacteriadominated the bacterial clones libraries and have been detected in high proportions by in situ hibridization withDesulfurobacteriales . Archaeal sequences associated to genera commonly isolated in the deep hydrothermalenvironment, as Thermococcales, Methanococcales and Archaeoglobales were also detected.

Combined use of molecular and cultural methods allows us to overcome the limitations inherent to eachtechniques and yield to the description of the relations between the different microbial communities in theirenvironments.

approches moléculaires de la diversité microbienne de deux

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