approches classique et non-classique de la …cristech.cnrs.fr/img/pdf/veesler.pdfastier et veesler...

1

S. S. VeeslerVeesler CINaMCINaM, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non--Classique de la Cristallisation des ProtéinesClassique de la Cristallisation des Protéines1

Z. Z. HammadiHammadi, J.P. , J.P. AstierAstier, E. , E. RevalorRevalor, R. Morin, , R. Morin, S. S. VeeslerVeesler

Approches Classique et NonApproches Classique et Non--ClassiqueClassiquede la Cristallisation des Protéinesde la Cristallisation des Protéines


ASSEMBLAGE ET CRISTALLISATION DES BIOMOLÉCULES

2


ASSEMBLAGE ET CRISTALLISATION DES BIOMOLÉCULES

Interface Physique Interface Physique –– ChimieChimie -- BiologieBiologie

J.P. Astier (IR), N. Ferté(IE), R. Grossier (post-doc), Z. Hammadi (MCf), R. Morin (DR),S. Veesler (DR). Doctorants: E. Revalor, T. Detoisien

Interactions Moléculaires, Structuration, Assemblage et Croissance Cristalline

des Biomolécules

Croissance Cristalline desMolécules Organiques et Propriétés des Matériaux

Etude des Transformations et Transitions de PhasesImportance de la Nucléation:Cela passe par la Maîtrise de la Fréquence de Nucléation et de sa Localisation SpatialeApproche Expérimentale: Méthodologies Développées au Labo Adaptées

à l’étude In situ de la Cristallisation en Solution→ Champ Électrique→ Nucléation Photochimique→ Milieu Confiné


Cristallisation

Cristallisation en SolutionCristallisation en Solution

Faciès

Morphologie

Polymorphisme

Distribution des Tailles

Qualité

Propriétés d’Usage

Monocristaux

Populationde Cristaux

Mécanismes de CroissanceModèle Cinétique

TemperatureSursaturationMilieuHydrodynamique

3


Mécanismes de CristallisationConnaissance du Diagramme de Phases

BPTI/Cl- en Champ Electrique

Classiquement:T, Milieu, β, Hydrodynamique

Non- Classiquement :+ Champ ExterneB, E, hν, Ultrasons,…

-Nucléation-Croissance-Polymorphisme-Séparation de Phases-Murissement


Cristallisation :Voir et Contrôler

-Nucléation-Croissance-Polymorphisme-Séparation de Phases-MurissementParamètre: TempératureParamètre: Température

1µm

100µm

+

250µm 125µm 50µm

250µm

500µm

4


MicroscopeMicroscope + + VideoVideo+ PC + PC

Montage développé en 1988 par le Groupe de R. Boistelle à Marseille

Monopuit 0-80°C 15µL-2mL

Contrôle de la TempératureContrôle de la TempératurePar Effet PeltierPar Effet Peltier

Montage ExpérimentalMontage ExpérimentalVisualisation et Contrôle de la Cristallisation Visualisation et Contrôle de la Cristallisation In situIn situ

Cristallisation de 15µL à 2mL


Montage ExpérimentalMontage ExpérimentalCristallisation de 96x15µL à 24x1mL

Contrôle de la TempératureContrôle de la TempératurePar Effet PeltierPar Effet Peltier

Platine motorisée X-Y

96 Tubes de 15-100µL

48 Tubes de 0,1-1mL24 Tubes de 0,5-2mLMicroscopeMicroscope + + VideoVideo + PC + PC Multpuits 0-80°C 15µL-2mL - Anacrismat

5


T

C

Nucléation: Nucléation: balayage des Conditions par Variation de T balayage des Conditions par Variation de T Estimation duEstimation du Diagramme de Phases Diagramme de Phases


Murissement: Défauts et Qualité Cristalline

*

α-Amylase

Dissolution et Croissance Change le FacièsAstier et Veesler Crystal Growth & Design sous presse

6


0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40

Concentration mg.mL-1

Temperature /°C

Solution-Mediated PhaseTransition by Increasing T

Solution-Mediated Phase Transition by Decreasing T

Veesler et al. Crystal Growth & Design 2004, 4, 1137.

Contrôle du PolymorphismeDu BPTI – 2M NaBr à pH=4,9


Une Approche PhysicoUne Approche Physico--chimique:chimique:Caractérisation des Macromolécules en SolutionCaractérisation des Macromolécules en Solution→→ Diffusion de la Lumière Diffusion de la Lumière –– Statique et DynamiqueStatique et Dynamique→→ DDiffusion des RX aux Petits Angles (DXPA)iffusion des RX aux Petits Angles (DXPA)

Besoin de Critères pour Choisir/DéterminerBesoin de Critères pour Choisir/Déterminerde Manière Rationnelle les Conditions de Cristallisationde Manière Rationnelle les Conditions de Cristallisation

«« PrédictionPrédiction » du Diagramme de Phases» du Diagramme de Phases

Approche Complémentaire à la Cristallisation à Haut Débit (HTS)Approche Complémentaire à la Cristallisation à Haut Débit (HTS)

Diffusion des Rayonnements et CristallisationDiffusion des Rayonnements et Cristallisation

7


IntensitéIntensité DiffuséDiffusé = = FacteurFacteur de de FormeForme x x FacteurFacteur de Structurede StructureI(c,s) = I(0,s) x S(c,s)

Taille, Forme, Masse et PolydispersitéUnité de Croissance

Interactions moléculairesDiagramme de Phases

Nucléation

Diffusion des RayonnementsDiffusion des Rayonnements


Hamiaux et al. J. Mol. Biol. (2000) 297, 697-712

Cristallographie : Décamère = Unité de CroissanceBPTI à pH acide

Sel et T°CpH et Sel

UnitéUnité de de CroissanceCroissance CristallographiqueCristallographique

8


Atomic Force MicroscopyAtomic Force MicroscopyDXPA DXPA

[BPTI]=21 mg/ml, 20°C [BPTI]=21 mg/ml, 20°C

0.04

S (Å-1)

Ajuster (43% Décamère)

100

Décamère

Best F

Expérience

0.01 0.02 0.030.00

10

1

1000

Monomère

Intensité (a.u)

0.04

Unité de Croissance en Solution:Unité de Croissance en Solution: BPTI 350mM KSCN pH=4.5

Hauteur Marches par AFM = Taille Décamère


Macromolécule en solution, Detergent + Lipide⊕

Température, pH, Force Ionique et Nature, [PEG],...

Diagramme de Phases / Courbes de SolubilitéDiagramme de Phases / Courbes de Solubilité

Dépletion

van der Waals, Coulombienne,et Hofmeister

+

-+

+

+

+

+

+

- --

--

-

DiagrammeDiagramme de Phasesde Phases Interactions Interactions MoleculairesMoleculaires

9


5

6

7

8

9

0 20 40 60

1.4 M NaCl1.7M NaCl2M NaCl0.35M KSCN

D 10 7 (cm2/s)×

C (mg/ml)

= 1.25M (NH4)2SO4

Interactions Moléculaires Interactions Moléculaires par DQELpar DQEL

Rh = 23,1 Å

D=D0(1+KDC)

BPTIBPTIpH 4pH 4,,55

En Conditions de En Conditions de CristallisationCristallisation les Interactions les Interactions sontsont AttractivesAttractives


0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6

Solubilités (mg/ml)

Force Ionique (M)

KSCN

NaCl

(NH4)2SO4

-40

-30

-20

-10

0

10

0 1 2 3 4 5 6Force Ionique (M)

NaClKSCN

(NH4)2SO4

ΚD

Solubilités Solubilités Interactions MoléculairesInteractions Moléculaires

Lafont et al. J. Cryst. Growth (1997)

BPTIBPTIpH 4pH 4,,55

Très Bonne Très Bonne CorrelationCorrelation entre l’Intensité des Interactionsentre l’Intensité des Interactionset la Solubilité:et la Solubilité:

Plus les Interactions sont Fortes, Plus la Solubilité est FaiblePlus les Interactions sont Fortes, Plus la Solubilité est Faible

10


Demixtion : 2 Liquides 1 Phase Haute C + 1 Phase Faible c

Concentration

Température

Cc

Tc

Solubilité

Binode

Cc

Grouazel et al. Acta Cryst. (2002)

SiSi les Interactions les Interactions sontsont trop trop IntensesIntensesDemixtionDemixtion

cascas dudu BPTIBPTI--KSCNKSCN


Concentration

Températureou[Cristallisant]-1

Cc

Tc

Séparation de Phases ThermoSéparation de Phases Thermo--InduiteInduiteFacile à RéaliserFacile à Réaliser

Séparation de PhasesSéparation de Phases par Variation de Compositionpar Variation de CompositionBalayage IsothermeBalayage Isotherme

Séparation de Phases LiquideSéparation de Phases Liquide--LiquideLiquide

MeilleursConditions

11


Caractérisation des Macromolécules en SolutionCaractérisation des Macromolécules en Solution

Besoin de Critères pour Choisir/Déterminer de Manière RationnellBesoin de Critères pour Choisir/Déterminer de Manière Rationnelle les e les Conditions de CristallisationConditions de Cristallisation

La La MonodispersitéMonodispersité est un bon Critère est un bon Critère -- Les Les AgrégatsAgrégats sont à Évitersont à Éviter

«« PrédictionPrédiction » du Diagramme de Phases» du Diagramme de PhasesTrès Bonne Corrélation entre les InteractionsTrès Bonne Corrélation entre les Interactions et les Conditions de et les Conditions de CristallisationCristallisation

Diffusion des Rayonnements et CristallisationDiffusion des Rayonnements et Cristallisation

En Conclusion:En Conclusion:


Objectifs : Observer, Objectifs : Observer, ControlerControleret Comprendre la Nuclet Comprendre la Nuclééation.ation.

Maîtriser la Fréquence de Nucléation et sa Localisation SpatialeMaîtriser la Fréquence de Nucléation et sa Localisation Spatiale↓↓

RechercheRecherche des Conditions de des Conditions de CristallisationCristallisation -- PolymorphismePolymorphisme


12


Modèle Classique en 1 étape

Structure

Densité

Nucléation

Modèle en 2 étapes de Kashchiev

MMéécanismes de canismes de NucleationNucleation??

On s’intéresse a la non PrédictibilitéSpatiale et Temporelle du Premier Nucléi!

Où et quand regarder?


Comment Mesurer la Fréquence de Nucléation?

Nucléation = Phénomène Stochastique Traitement statistique sur grand nombre de données expérimentales

(1) Mesure du temps d’induction

(2) Décompte des cristaux en fonction du temps

13


T

C T

t

1

TN

TN

2

TG

TG

Δt

FréquenceFréquence de de NucléationNucléation

“Double-Thermal-Pulse technique”


Temps (Δt)

Nombre de Cristaux

Pente = J = ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛−= 2exp

σBACJ

N0

tN

dd

Fréquence de NucléationFréquence de Nucléation

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Microfluidique voir Présentation J.B. Salmon


Puce et Moule Fournis par JB Salmon


Lysozyme 20mg/mL, pH =4,5, 0,7M NaCl, TN = 20°C, Δt = 2h, TG = 25°C

~ 200 gouttes de ~300nL


0

0.1

0.2

0.3

0.4

0 1 2 3 4 5

Fréquence Normalisée

Nb Cristaux

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 2 4 6 8 10

Nb cristaux

Δ t (h)

Microfluidique: Adaptée à l’Etude de la Nucléation:

15


NucleationNucleation dans la Zone Métastabledans la Zone Métastable

Non-Classique: Addition d’un Champ ExterneB, E, hν,Ultrasons,…Fluctuation de Densité et Structuration

+

250µm

Champ électrique Point Froid Champ Magnétique Photochimique


Fort Champ electrique

Fort Gradient de Champ

Cristallisation de Protéines Cristallisation de Protéines induite par un Champ Electrique Localinduite par un Champ Electrique Local

Une pointe Ultra-fine

Pour Induire et Contrôler une Inhomogénéité Locale dans la solution:

On souhaite Nucléer dans cette zone de la Cellule de Cristallisation,

Localisation et sa Reproductibilité.

16


On mesure le courant:Reproductibilité & Détection des premiers stades.

⊕ Solution :BPTI & NaCl[BPTI] = 20mg/ml[NaCl] = 1.6M à 1.7M

Huile de paraffine prévient l’évaporation

2 électrodes de W

Pointe Ultra fine Electrode ronde

La cellule de cristallisationLa cellule de cristallisation


Cellule thermostatée à 20°C

Micro-manipulateur Y, Z

125µm

On contrôle la distance entre les 2 électrodes

Montage ExpérimentalMontage Expérimental

17


Des observations InDes observations In--situ sous microscope optiquesitu sous microscope optique

-- Une tension continue de 0 à Une tension continue de 0 à ±±1V.1V.

-- Expériences menées à 20°C, à différentes valeurs de courant dExpériences menées à 20°C, à différentes valeurs de courant de 0 à 2µA.e 0 à 2µA.

-- Pour chaque valeur de courant, on change les électrodes mais laPour chaque valeur de courant, on change les électrodes mais la géométrie géométrie est conservée.est conservée.

-- Expériences avec le Lysozyme et le BPTI (Tous deux chargés + àExpériences avec le Lysozyme et le BPTI (Tous deux chargés + à pH=4.5).pH=4.5).

On attend une Cristallisation à la Cathode (On attend une Cristallisation à la Cathode (--))

MéthodeMéthode


BPTI/BPTI/NaClNaCl àà 20°C, 20°C, ßß=1,7=1,7 I=0,6µA (0,7V)I=0,6µA (0,7V)

1.Localisation à l’Anode!2.Temps de Nucléation Réduit3.Vitesses de Croissance Différentes

+

-

Résultats ExpérimentauxRésultats Expérimentaux

Des Cristaux de Différentes Tailles Des Cristaux de Différentes Tailles et une Gangue/Gel …et une Gangue/Gel …

18


Experiment december 9th, 2004

+ -

AvantAvant125µm

190µm 240µm

160µm 190µm

AprèsAprès

Dissolution de la Gangue maisDissolution de la Gangue mais

Les Cristaux continuent de CroîtreLes Cristaux continuent de Croître


+

-

0,40,4µA (µA (0,60,6V)V) [BPTI] =20mg/mL in 1,6M [BPTI] =20mg/mL in 1,6M NaClNaCl ((ββ=1,4)=1,4)

Experiment of june 7th, 2006

A plus Basse Valeur du Courant:A plus Basse Valeur du Courant:

Gradient de Concentration etDifférentes Vitesses de Croissance

0

500

1000

1500

2000

2500

0 2 4 6 8 10 12

volA

volB

volC

Volume du cristal a.u.

Temps (h)

19


Experiment of june 30th, 2006

+

-

Même solution mais un courant de Même solution mais un courant de 1µA (1V)1µA (1V)

A plus Haute Valeur du Courant:A plus Haute Valeur du Courant:

Pas de Pas de Cristaux mais Cristaux mais

une Gangue/Gelune Gangue/Gel


Experiment of October 2, 2006 :

Gel

DémixtionLa Gangue ?La Gangue ?

Gel = Séparation liquide-liquide(LLPS):

Solution de BPTI = décamères et monomèresLLPS = décamères de BPTI [JPCB, 2006]

+

20


Concentration

Température

Cc

Tc

Solubilité

Binode

+

+

250µm

cC

Demixtion : 2 Liquides 1 Phase Haute C + 1 Phase Faible c

Cristallisation du BPTI/Cristallisation du BPTI/NaCl NaCl induite par un Champ Electrique Localinduite par un Champ Electrique Local


U~10−3 V, I~2 µA

lysozyme

Sans E

Avec E

Electrodes dans la Solution, moins de Cristaux et Plus gros. (Moreno et al. 2004, Mirkin et al. 2003)

+ -

Pourquoi le BPTI Cristallise à l’AnodePourquoi le BPTI Cristallise à l’AnodeAu lieu de la Cathode?Au lieu de la Cathode?

21


Vitesse des MonomèresVitesse des Décamères

Pourquoi le BPTI Cristallise à l’Anode ?Pourquoi le BPTI Cristallise à l’Anode ?

-

MonomèresCristal & LLPS

= Association de décamères

+


Aujourd’hui, on contrôle Aujourd’hui, on contrôle

Gangue/GelGangue/GelCroissance et Croissance et Nucléation Nucléation sur la sur la

pointe:pointe:(+) = BPTI & Lysozyme(+) = BPTI & Lysozyme

Cristaux Cristaux Croissance et Croissance et localisationlocalisation près de la près de la

pointe:pointe:(+) = BPTI & ((+) = BPTI & (--) = Lysozyme) = Lysozyme

NucléationNucléation ??

Contrôler le Transfert de MatièreContrôler le Transfert de Matière

Visualiser les Lignes de Courant (Protéines Fluorescentes).Visualiser les Lignes de Courant (Protéines Fluorescentes).

Changer la Géométrie pour Comprendre comment les Lignes de Changer la Géométrie pour Comprendre comment les Lignes de Courant peuvent influencer la Nucléation/Croissance. Courant peuvent influencer la Nucléation/Croissance.

Expériences avec la Diffusion de la Lumière et/ou des RX Expériences avec la Diffusion de la Lumière et/ou des RX →→espespéérer rer détecter les premiers stades de la nucléation.détecter les premiers stades de la nucléation.

Hammadi et al. Crystal Growth and design (2007)

ConclusionConclusion

22


PERSPECTIVESPERSPECTIVESApproches Classique et NonApproches Classique et Non--ClassiqueClassique

de la Cristallisation de la Cristallisation :Augmenter le Nombre d’expériences et Diminuer la

Quantité de Matière Première

Classique

• Cristallisation Batch Multi-puits thermostaté ( µL)+ videomicroscopie

• Nouvelles Technologies Microfluidique (nL)Milieux Confinés (pL and fL?)

Non -Classique

• Champ ElectriqueLocalisation

• lumière



Jean-Pierre Astier,Thirou Bactivelane,Brice Detailleur,Thibaud Detoisien, Natalie Ferté,Romain Grossier,Zoubida Hammadi,Vasile Heresanu,Roger Morin,Eve Revalor

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Jean-Pierre Astier,Thirou Bactivelane,Brice Detailleur,Thibaud Detoisien, Natalie Ferté,Romain Grossier,Zoubida Hammadi,Vasile Heresanu,Roger Morin,Eve Revalor

approches classique et non-classique de la …cristech.cnrs.fr/img/pdf/veesler.pdfastier et veesler...

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