128 Immunoanal Biol Spec (1993) 2, 128-132 © Elsevier, Paris

Techniques au quotidien

Anticorps antithyroperoxydase et anticorps antimicrosomaux en pathologie thyroi'dienne

autoimmune: comparaison de deux techniques, RIA et immunofluorescence indirecte

C Johanet 1, G Coutris 2, E Soulie 1, C Brunel 2, F Duron 3, JN Talbot 4

1 Services d'immunologie; 2 rnedecine nucl6aire; 3 endocrinologie, hSpital Saint-Antoine, 184, rue du Faubourg- Saint-Antoine, 75571 Paris Codex 12; 4 Service de medecine nucleaire, h6pital Tenon, 4, rue de la Chine, 75970 Paris

Codex 20, France

(Regu le 7 avril 1992; accepte le 8 juillet 1992)

R~sum~ - - L'antigene microsomal thyro'idien, implique dans de nombreuses pathologies autoimmunes thy- ro'fdiennes, a et6 identifi~ en 1985 & la thyroperoxydase (TPO). Nous avons compare les r6sultats des dosages d'anticorps antithyroperoxydase obtenus par radioimmunologie (RIA) et d'anticorps antimicrosomaux obtenus par immunofluorescence indirecte (IFl) sur coupe de thyro'fde humaine, dans los serums de 184 sujets se r~partissant comme suit: 22 provenant de patients atteints de myxoedeme, 35 de patients atteints de maladie de Basedow, 23 de goitre euthryoi'dien, 14 de thyro'fdite d'Hashimoto, 5 de goitre toxique, 35 de sujets pre- sentant une pathologie autoimmune associee et 50 temoins. II existe une tres bonne correlation entre los deux m~thodes de dosage (r= 0,98). Notre etude montre que I'IFI reste une technique competitive puisque de sensibilit6 (0,68 & 0,93 en fonction de la pathologie) et de sp~cificit6 (0,98) identiques au dosage RIA. thyro'fde / anticorps antimicrosemaux / anticorps antithyroperoxydese / RIA / immunofluorescence indi- recte

Summary m Comparison between radio-immunoassay of anti-TPO antibodies and indirect immuno- fluorescence patterns of antimicrosomal antibodies. The thyroid microsomal antigen, involved in thyroid autoimmunity, is identif ied to thyroperoxydase (TPO). We compared the anti-TPO antibody values by radio- immunoassay with the results of microsomal antibody by indirect immunofluorescence assay. Both assays were performed in 184 subjects: 22 with idiopathic myxedema, 35 with Graves'disease, 23 euthyroid, 14 Hashimoto's thyroiditis, 5 with toxic goitre, 35 with autoimmune associated pathology and 50 blood donors. We noted a high correlation between the two methods (r = 0,98). Our study revealed a similar sensitivity (0,68 to 0,93) and specificity (0,98) with immunofluorescence assay and radioimmunoassay. thyroid / thyroid microsomal antibodies / thyroid peroxydase antibodies / RIA / indirect immunofluores- cence

Introduct ion

Los patients atteints de pathologie thyrofdienne autoimmune possedent tres souvent dans leur s6rum des anticorps diriges contre un antigone microsomal thyro'fdien [2]. Celui-ci a ete iden- tifie en 1985 & la peroxydase thyroidienne (TPO), enzyme cle de la biosynth~se des hor- mones thyro'fdiennes [7, 8].

II existe plusieurs m~thodes d'identif ication de cos anticorps: I'hemagglutination passive, I' immunofluorescence indirecte (IFI), et plus r~- centes, les techniques d'immunoblot [8, 16, 17], Elisa [7, 14] et RIA [9, 11, 12].

Malgre I'identification de I'antigene, plusieurs sources antigeniques sont encore uti l isees: microsomes thyroidiens non purifies, peroxy- dase thyroidienne humaine [13, 16, 17] purifi~e par chromatographie d'affinit~ [8] ou par chro- matographie ~changeuse d'ion [4], thyrope- roxydase recombinante. La peroxydase thyroi'dienne recombinante est obtenue a partir de cellules eucaryotes non thyroi'diennes [5, 6] et constitue une source illimit6e d'antigene pu- rifie utilise en Elisa [7].

Nous avons compare los r6sultats de I'IFI sur coupe de thyroide humaine, permettant la de- tection des anticorps antimicrosomaux, avec

Anticorps antithyroperoxydase et antimicrosomaux 129

ceux d'une technique rad io immunolog ique par compet i t ion, permet tant la d~tect ion des anti- corps ant i thyroperoxydase.

P a t i e n t s e t m d t h o d e s

Nous avons inclus sous le terme myxoedeme les insuffisances thyrofdiennes primitives sans goitre, sont exclues les insuffisances thyrofdiennes chirur- gicales et les hypothyrofdies avec goitre.

Les serums ont ete conserves & -20°C.

Methodes

Patients

Les serums de 134 patients presentant diverses pa- thologies thyrofdiennes ont ete etudies entre mars et juillet 1991. IIs proviennent pour la plupart du service d'endocrinologie de I'hepital et nous avaient ete adresses pour dosage d'anticorps anti-micro- some thyrofdien.

La selection a ete faite apres consultation des dossiers cliniques sur les crit~res suivants: - &ge, sexe, traitements connus; - taux de TSH; - echographie pour les diagnostics de goitre et de thyrofdite; - autres autoanticorps (antirecepteur de TSH pour la maladie de Basedow, anticorps antithyroglobu- line).

Cinquante serums de donneurs de sang, fournis par I'INTS, dont la normalite du taux de TSH ainsi que I'absence d'anticorps antithyroglobuline ont ere verifies, 35 serums de sujets presentant une patho-- Iogie autoimmune associ~e (diabete insulinodepen- dant, vitiligo, maladie de Biermer, syndrome de Gougerot-Sjegren [3], cirrhose biliaire primitive [1]), et 99 serums de patients presentant diverses pa- thologies thyrofdiennes ont ete etudies.

Le groupe des pathologies thyrofdiennes comprend: 22 cas de myxoedeme, 35 cas de ma- ladie de Graves Basedow, 23 cas de goitre euthy- ro'idien, 14 cas de thyrofdite d'Hashimoto, 5 cas de goitre toxique.

Detection des anticorps antimicrosomaux par immunofluorescence indirecte sur coupe de thyroTde humaine Les coupes d'organes sont realisees dans le ser- vice au microtome & - 16°C, sur des organes frais.

Le test consiste & incuber ces coupes, dans un premier temps avec le serum du malade, puis, avec une antiglobuline polyvalente marquee & la fluores-

Fig 1. Immunofluorescence indirecte sur coupe de thyroJde humaine. On observe une fluorescence homog~ne au ni- veau du cytoplasme des thyreocytes.

% de resultats positifs

100--

7 5 -

5 0 -

2 5 - A B 2 2

25--

50-- 98 98

75--

100- 1

% de resultats negatifs

B A 8,7 lr~,1

86,9

91,3

A

8t ,8

86,4 A B A B

92,8 92,~ 68,5 68,5

18,2 3,6 7,2 7,2 31,5 31,5 3

4

A B

A B

34,3 31

65,7

68 !1 00 00

, 4

,6

Fig 2. Frequence des anticorps antithyro'fdiens dans les differentes pathologies, A (par IFI) et B (par RIA). 1: temoins (50); 2: goitre euthyro'fdien (23); 3: myxoed~me (22); 4: Hashimoto (14); 5: Basedow (35); 6: goitre toxique (5); 7: pa- thologies associees (35).

130 C Johanet et al

ceine (Pasteur) qui va r6v61er les anticorps fix6s sur le tissu.

La fluorescence observ6e est homogene et situee au niveau du cytoplasme des thyr6ocytes (fig 1).

Pour ces anticorps sp~cifiques d'organe, un r6sultat positif des la dilution au 1/10 est patholo- gique.

Dosage des anticorps anti-TPO par RIA Nous avons utilise la trousse RIA Dynotest anti- TPO, Henning-Berlin (Behring, France). C'est une technique RIA classique par comp6tition utilisant des tubes rev~tus d'anticorps [13]. Pendant I'incu- bation, les anticorps anti-TPO de I'echantillon ou des etalons sont en competition avec les anticorps monoclonaux anti-TPO fixes sur le tube vis-&-vis des sites de liaison de la thyroperoxydase marqu6e & 1'1251.

Les dosages ont 6te realises selon le protocole indiqu6 dans la trousse. Le seuil de positivit6 a 6t6 fix~ & 130 U/ml, ce qui correspond & notre moyenne des temoins plus trois ecarts types. Cette timite donne moins de sujets normaux ou pathologiques mal classes qu'une limite & la moyenne plus deux ecarts-types.

Resultats

Tableau I. Concordance des deux techniques.

Pathologie Concordance (%)

Temoins 100 Goitre euthyro'i'dien 95,6 Myxoedeme 86,3 Hashimoto 100 Basedow 100 Goitre toxique 100 Pathologies associ6es 91,4

Tableau II. Resultats des serums discordants.

Pathologie IFI normale < 1/10

RIA normale

< 130 (U/ml)

Myxoedeme n~gatif 663 Myxoed~me negatif 7 203 Myxoed~me 1/50 76 Goitre euthyro'fdien negatif 4 626 Pathologie associ~e (DID) negatif 2 609 Pathologie associ~e

(SjSgren) 1/10 0 Pathologie associ~e

(h6patite chronique) 1/10 0

Les r6sultats obtenus dans les differents groupes de patients sont present~s sur ta figure 2.

Par les deux techniques, la frequence des anticorps antithyrofdiens reste tres voisine, pour chacune des pathologies ~tudi6es. Ainsi, la sensibilit~ par IFI et RIA est de 0,68 pour le groupe des maladies de Basedow, et de 0,93 pour les thyrofdites d'Hashimoto. Elle est de 0,82 par IFI et de 0,86 par RIA pour le groupe des myxoed~mes. Nous n'avons pas re- trouve d'anticorps antithyro'idiens dans les cinq s6rums de malades presentant un goitre toxi- que. Le peu de malades etudi~s ne nous per- met pas de conclure pour cette pathologie. Cependant, d'apres Mariotti et al [9], sur 26 cas d'ad6nomes toxiques, 19% pr6sentent des taux eleves d'anticorps antimicrosome thyrof- diens (d~tect6s par RIA).

La sp6cificit~, calculee sur les dosages des serums de t~moins provenant de I'INTS, est de 0,98 pour les deux techniques; elle est de 0,95 pour I'IFI et de 0,93 pour la RIA si I'on y inctut le groupe des goitres euthyrofdiens. En effet, la frequence des resultats n~gatifs chez les goitres euthyrofdiens est proche de celle des temoins.

La concordance des deux techniques est donn6e dans le tableau I. Le coefficient de concordance est compris entre 86,3% et 100% en fonction des pathologies. Compte tenu de

10.000

3 .000

1 .000 - -

D Y N O T E S T

A N

T 300 I

T P 130 O

1 0 0 -

5 0 - -

3 0 - -

~•**

/ 9 3 cas • <3o * *

I I

Neg 1 / 1 0

I I I

1 / 2 0 1 / 5 0 1/100 et sup~r ieu r

tMMUNOFLUORESCENCE

Fig 3. Comparaison des titres d'anticorps antimicrosomes (IFI) avec la concentration d'anticorps anti-TPO (Dynotest anti-TPO).

Anticorps antithyroperoxydase et antimicrosomaux 131

ces r6sultats, nous pouvons nous permettre de d6terminer un coefficient de concordance glo- bal de 96% (soit un coefficient de correlation de 0,98).

La comparaison des titres d'anticorps antimi- crosomes en IFI avec la concentration d'anti- corps anti-TPO en U/ml est represent~e sur la figure 3.

Seuls sept des 184 patients test6s presen- tent des resultats discordants. Les sept discor- dances ont 6t6 contr61~es; cetles-ci, rares (3,8%), sent par centre franches cinq fois sur sept: soit taux d'anticorps anti-TPO franche- ment anormal (de 663 9. 7203U/ml) avec IFI negative (quatre cas), soit au contraire IFI fran- chement positive & la dilution au 1/50 avec RIA negative (un cas). Trois patients appartiennent au groupe des hypothyrofdies, un & celui des goitres euthyro'fdiens et trois aux pathologies autoimmunes associees. Aucune discordance n'a 6te observ6e dans les groupes de maladie de Basedow et de thyrofdite d'Hashimoto (tableau II).

Conclusion

Les resultats que nous observons dans cette etude ne montrent pas de difference de sen- sibilite entre les dosages d'anticorps antimicro- somaux par IFI et le dosage des anticorps anti-TPO par RIA. La thyroperoxydase purifiee n'apparaft donc pas comme un meilleur subs- trat antigenique. Nos resultats sent en accord avec des travaux similaires realis6s par diffe- rentes equipes [10, 15]. Celles-ci s'accordent pour montrer qu'il existe une parfaite corr61a- tion entre les resultats d'anticorps antimicro- some et d'anticorps anti-TPO, par les techniques RIA, Elisa, et d'hemagglutination passive. Nous n'avons pas trouve, cependant, de travaux recents comparant RIA et IFI.

Recemment, Schvartz et al [15], sur une etude de 107 patients pr~sentant diverses pathologies thyrofdiennes, n'ont pas montr6 une meilleure sensibilite du dosage RIA anti- TPO compare au dosage RIA des anticorps antimicrosomaux. Ces auteurs observent ega- lement quelques discordances (quatre cas d'anticorps anti-TPO positifs avec anticorps antimicrosomaux negatifs chez un sujet hyper- thyrofdien et trois sujets presentant une hypo- thyrofdie). Les cinq discordances franches observ~es dans notre serie de 184 sujets vent dans le m~me sens que I'etude de Schvartz, anti-TPO positifs avec antimicrosomes negatifs dans quatre cas, sugg~rant que celles-ci

seraient dues & I'antigene utilise et non & la technique.

Mariotti et al [10, 11] ont conclu & une meil- leure sensibilite et sp~cificite du dosage des anticorps anti-TPO (par RIA) compare au do- sage d'anticorps antimicrosomaux realis~ par h6magglutination passive (HP). De plus, des etudes d'absorption montrent I'interf6rence des anticorps antithyroglobuline dans les dosages d'anticorps antimicrosome par HP [11]. L'IFI semble donc 6tre une technique plus sensible et plus specifique que cette derniere.

Notre etude montre que I'tFI reste une tech- nique competitive puisque de sensibilite et de specificite identiques au dosage RIA. En raison de la difficult6 d'obtention des thyrofdes hu- maines, I'IFI est peu utilisee et seulement en laboratoire hospitatier. Elle est cependant d'un coet beaucoup plus faible que la RIA.

Refdrences

1 Berg PA, Klein E, Lindenborn-Fotinos J (1986) Antimitochondrial antibodies in primary binary cirrhosis. J Hepatol 2, 123-131

2 Doniach D, Bottazzo F, Drexhage HA (1982) The autoimmune endocrinopathies. In: Clinical as- pects of immunology (Lachmann P J, Peters K ed). Blackwell Scientific Oxford Publication, 2, 903-937

3 Fox RI, Robinson CA, Curd JG, Kozin F, Howell FU (1986) Sjogren's syndrome: proposed criteria for classification. Arth Rheum 29, 577- 585

4 Gustafsson J, MendeI-Hartvig I, Totterman TH, Karlsson FA (1987) Purification of human thyro'id peroxidase using ion exchange liquid chromato- graphy. J Cfin Lab Immunol 23, 57-61

5 Hata J, Yamashita S, Yagihashi S, Kate H, Ka- beno S, Hirai K, Kuma K, Kimura S, Umeki K, Kotani T et al (1989) Stable high level expres- sion of human thyroid peroxidase in cultured chinese hamster ovary cells. Biochem Biophys Res Commun 164, 1268-73

6 Kaufman KD, Rapoport B, Seto P, Chazanbalk GD, Magnusson RP (1989) Generation of re- combinant, enzymatically active, human thyroid peroxidase and its recognition by antibodies in the sera of patients with Hazashimoto's thyrof- dis. Cfin Invest 84, 394-403

7 Kaufman KD, Filetti S, Seto P, Rapoport B (1990) Recombinant human thyroid peroxidase generated in eukaryotic cells: A source of spe- cific antigen for the immunological assay of anti- microsomal antibodies in the sera of patients with autoimmune thyroid disease. J Cfin Endo- crinol Metab 70, 724-727

8 Kotani T, Umeki K, Matsunaga S, Kate E, Ohtaki S (1986) Detection of autoantibodies to thyroid peroxidase in autoimmune thyroid disease by micro-Elisa and immunoblotting J Clin Endocri- nol Metab 61, 928-33

132 C Johanet et al

9 Mariotti S, Pinchera A, Vitti P, Chiovato L, Mar- cocci C, Urbano C, Tosi M, Baschieri L (1978) Comparison of radioassay and haemagglutina- tion methods fo r anti-thyroid microsomal antibo- dies. Cfin Exp Immunol 34, 118-125

10 Mariotti S, Anelli S, Ruf J, Bechi R, Czamocka B, Lombardi A, Carayon P, Pinchera A (1987) Comparison of serum thyroid microsomal and thyroid peroxidase autoantibodies in thyroid diseases. J Clin Endocrinol Metab 65, 987-993

11 Mariotti S, Ruf J, Caturegli P, Rossi U, Boniolo A, Piccolo P, Carayon P, Pinchera A (1989) Me- thodological approach and diagnostic useful- ness of a new assay for antithyroid peroxidase autoantibodies. Ann Biol Clin 47, 541-545

12 Mori T, Kriss JP (1971) Measurements by competitive binding radioassay of serum antimi- crosomal and antithyroglobulin antibodies in Graves' disease and other thyroid disorders. J Clin Endocrinol Metab 33, 688-698

13 Ruf J, Czarnocka B, Ferrand Me t al (1988) No- vel routine assay of thyroperoxydase autoanti- bodies. Cfin Chem 34, 2231-2234

14 Schardt CW, Mc Lachian SM, Matheson J, Smith BR (1982) An enzyme-linked immuno assay for thyroid microsomal antibodies. J Immunol Methods 55, 155-168

15 Schvartz C, Larbre H, Maes B, Delisle M J, Del- tour G (1991) Comparaison du dosage des anti- corps antithyroperoxydase et des anticorps antimicrosomaux par methode radio-immunolo- gique. Immunoanal Bio lSpec 29, 49-52

16 Yokoyama N, Taurog A, Klee GG (1989) Thyroid peroxidase and thyroid microsomal autoantibo- dies. J Clin Endocrinol Metab 68, 766-773

17 Yokoyama N, Taurog A, Dorris ML, Klee GG (1990) Studies with purified human thyroid peroxidase and thyroid microsomal autoantibo- dies. J Clin Endocrinol Metab 70, 758-765