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Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2009, 148, 93-114 ANTAGONISME IN VITRO ET IN VIVO DE DEUX

TRICHODERMA À L’ÉGARD DE QUATRE ESPÈCES DE BIPOLARIS PATHOGÈNES SUR LE

SORGHO (*)

Fadwa BERBER ( 1 ) , Amina OUAZZANI TOUHAMI ( 1 ) , Alain BADOC ( 2 ) , Allal DOUIRA ( 1 )

In vitro, la confrontation directe sur milieu PSA entre quatre isolats de Bipolaris pathogènes du Sorgho et trois souches de Trichoderma harzianum et trois souches de T. viride conduit à une inhibition de la croissance mycélienne et de la germination conidienne avec un certain degré de mycoparasitisme. Les substances volatiles et diffusibles libérées par les isolats réduisent la croissance et la germination du pathogène.

In vivo, la pulvérisation de spores des Trichoderma sur le Sorgho ‘Honey’ entraine une forte réduction de la maladie ; les traitements préventif et simultané sont plus efficaces que le curatif. La production de conidies est plus inhibée pour B. maydis et B. sorokiniana que B. sorghicola et B. tetramera. Le traitement simultané conduit à un poids de matière sèche des feuilles supérieur aux autres traitements.

(*) Manuscrit reçu le 8 février 2008. (1) Laboratoire de Botanique et de Protection des plantes, Département de Biologie,

Faculté des Sciences, Université Ibn Tofaïl, Kénitra, BP 133, Maroc. fadwaberber@yahoo.fr, touhami01@hotmail.com, douiraallal@hotmail

(2) Laboratoire de Sciences végétales, Mycologie et Biotechnologie, GESVAB – EA 3675, UFR Pharmacie, Université Victor Segalen Bordeaux 2, ISVV, 210, Chemin de Leysotte, CS 50008, 33882 Villenave-d’Ornon. alain.badoc@u-bordeaux2.fr

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INTRODUCTION

Les surfaces foliaires sont colonisées par des microorganismes pathogènes et saprophytes qui interagissent entre eux. L’utilisation de ces derniers permet de réduire l’incidence des maladies foliaires [46]. C’est un moyen de lutte biologique permettant un contrôle acceptable de la maladie ou une réduction des populations pathogènes [14].

Cette alternative pour assurer une protection phytosanitaire performante constitue une solution de substitution à l’emploi de produits chimiques nuisibles à l’équilibre naturel des écosystèmes [27].

Des microorganismes antagonistes capables d’inhiber les différentes séquences biologiques du pathogène ont été recherchés. Ils doivent pouvoir survivre dans l’habitat où ils seront appliqués [2]. De nombreux travaux ont démontré que les Trichoderma ont un potentiel de lutte intéressant contre divers agents pathogènes [29,31-32,37,39,43,45]. Leur commercialisation a favorisé leur utilisation en agriculture [22-23]. Trichoderma et Gliocladium sont des mycoparasites connus comme agents de lutte biologique [28]. L’effet antagoniste de Trichoderma harzianum se manifeste par un enroulement des hyphes autour des filaments du champignon pathogène [21]. S’ensuit une lyse grâce à la production d’enzymes, telles que la ß-1,3-glucanase et la chitinase [16].

La mycoflore du Sorgho, Sorghum bicolor (L.) Moench a révélé la présence de plusieurs champignons pathogènes (Bipolaris maydis et B. sorghicola, responsables d’une helminthosporiose, et B. tetramera et B. sorokiniana), capables d’infecter les différents organes de cette plante constituant ainsi une menace pour sa culture au Maroc [9].

Dans cette étude, nous avons évalué in vitro et in vivo le pouvoir antagoniste de Trichoderma harzianum et T. viride à l’encontre de Bipolaris maydis, B. sorghicola, B. tetramera et B. sorokiniana, parasites foliaires du Sorgho.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Matériel fongique

Les isolats HG2 de Bipolaris maydis, HS5 de B. sorghicola, HSA1 de B. sorokiniana et HTS3 de B. tetramera [8] ont été obtenus à partir de

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lésions foliaires et de grains de Sorgho (Sorghum bicolor (L.) Moench) cultivé dans la région du Gharb et du Loukkos. Ces isolats sont cultivés sur un milieu à base de farine de riz (14 g farine de riz, 4 g extrait de levure, 15 g agar, 1000 ml eau distillée). Les cultures sont incubées pendant dix jours à 28°C, celle de B. maydis sept jours à l’obscurité et trois jours en lumière continue, celle de B. sorokiniana dix jours en lumière continue et celles de B. sorghicola et B. tetramera dix jours à l’obscurité.

Les isolats de Trichoderma harzianum (TH1, TH2, THS1) et T. viride (TV1, TV2, I2) ont été utilisés comme antagonistes et proviennent de la mycothèque du Laboratoire de Botanique et de Protection des Plantes. Ils ont été cultivés sur le milieu PSA (200 g pomme de terre, 20 g saccharose, 15 g agar, 1000 ml eau distillée) et incubés à 28°C trois jours à l’obscurité et sept jours en lumière continue.

Activité antagoniste des Trichoderma in vitro

L’activité antagoniste a été abordée de différentes manières. Trois boites de Petri ont été utilisées pour chaque test, avec trois répétitions. Confrontation directe

Dans une boite de Petri contenant le milieu PSA, deux disques de 5 mm de diamètre constitués par l’inoculum du pathogène et celui de l’antagoniste ont été placés à 40 mm l’un de l’autre, symétriquement par rapport au centre de la boite. Pour le témoin, un disque mycélien du pathogène a été déposé au centre de la boite.

Après incubation trois jours à 28°C et à l’obscurité, le pourcentage d’inhibition

!

IC de la croissance mycélienne du pathogène par les antagonistes a été évalué selon la méthode de Sy [44] :

!

IC (%) = DT "DPA

DT x 100

!

DT : croissance diamétrale du témoin

!

DPA : croissance diamétrale mycélienne du pathogène en présence de l’antagoniste.

À partir des cultures des différents antagonistes et pathogènes, des suspensions ajustées à 103 conidies /ml pour le pathogène et 103 spores /ml pour l’antagoniste ont été préparées. Dans des boites contenant 20 ml d’eau gélosée (15 g agar, 1000 ml eau distillée), 0,1 ml des deux suspensions ont été successivement étalés. Après 20 h d’incubation à 28°C, le pourcentage d’inhibition de la germination

!

IG des conidies du pathogène est déterminé en utilisant la formule suivante :

!

IG (%) = NT " NPA

NT x 100

96

!

NT : nombre de conidies germées chez le témoin ; les conidies renferment une spore et la germination est observée au microscope.

!

NPA : nombre de conidies germées en présence de l’antagoniste. Mycoparasitisme

Le comportement parasitaire des souches de Trichoderma a été mis en évidence par la technique de Camporota [12]. Dans les boites de Petri des confrontations directes pour la croissance, la zone d’interpénétration des deux colonies a été observée au microscope afin d’estimer l’intensité de l’enroulement des hyphes de Trichoderma sur ceux des pathogènes testés selon l’échelle arbitraire suivante : enroulement absent (0), faible (25), moyen (50), important (75), intense (100). Production de substances volatiles

Elle est mise en évidence par la technique de Dennis et Webster [18]. Un disque mycélien de 5 mm de diamètre de chaque pathogène et antagoniste est placé au centre de boites de Petri contenant le milieu PSA. Les couvercles sont enlevés aseptiquement, puis le fond de chaque boite contenant l’antagoniste testé est placé en dessous de celui contenant le pathogène. Les deux fonds juxtaposés sont fermés par des couches de Parafilm. Pour le témoin, un fond de boite contenant le milieu seul est placé en dessous d’un fond de boite contenant le pathogène. Après quatre jours d’incubation à 28°C à l’obscurité, l’inhibition de la croissance mycélienne est estimée comme précédemment.

Pour mesurer l’effet des substances volatiles sur la germination conidienne, 0,2 ml de suspension conidienne du pathogène (103 conidies/ml) ont été étalés sur le milieu de culture après 48 h d’incubation de Trichoderma.

On place un fond de boite de Petri présentant une culture de 48 h de Trichoderma sur PSA en-dessous d’un fond de boite de Petri contenant de l’eau gélosée sur lequel on a étalé 0,2 ml de suspension conidienne du pathogène (103 conidies/ml). Après incubation 20 h à 28°C et à l’obscurité, l’inhibition de la germination est estimée comme précédemment. Production de substances diffusibles

La mise en évidence de la sécrétion des substances diffusibles par Trichoderma est réalisée par la technique de la cellophane [17]. Le milieu PSA est recouvert par une feuille de cellophane stérile. 24 h après (afin de permettre à la feuille de cellophane d’adhérer au milieu), un disque de 5 mm de diamètre, pris d’une culture de Trichoderma âgée de sept jours, est placé au centre de la surface de la feuille de cellophane. Les boites sont incubées 48 h à 28°C à l’obscurité. La membrane de cellophane et la colonie de Trichoderma adhérente sont alors enlevées et un disque mycélien du pathogène âgé de dix jours est placé au centre du milieu de culture. Les

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boites témoins sont ensemencées par un disque mycélien du pathogène. Après huit jours d’incubation à l’obscurité et à 28°C, le pourcentage d’inhibition de la croissance mycélienne du pathogène est calculé par rapport au témoin.

Pour tester la germination conidienne, la technique de la feuille de cellophane a été également utilisée. Après avoir enlevé la feuille de cellophane et la colonie de Trichoderma adhérente, on étale 0,2 ml de suspension ajustée à 103 conidies/ml. Après 20 h d’incubation, l’inhibition de la germination des conidies est estimée.

Effet des Trichoderma in vivo

Matériel végétal La variété ‘Honey’ de Sorgho, très sensible aux quatre pathogènes

testés, a été utilisée. Les grains sont désinfectés par trempage 15 min dans une solution d’hypochlorite de sodium à 5 % puis rincés trois fois à l’eau distillée stérile. Ils sont ensuite semés avec un peu de terre au-dessus dans des pots contenant un sol provenant du massif de la Mamora. Ces derniers sont placés sous serre et arrosées avec de l’eau de robinet jusqu’au stade requis pour l’inoculation, soit 5 à 6 feuilles par plante. Suspensions conidiennes

Les six souches de Trichoderma et les quatre isolats de Bipolaris sont cultivés, puis des suspensions sont préparées et ajustées avec de l’eau distillée stérile contenant 0,05 % de Tween 20 et 0,5 % de gélatine de façon à avoir une concentration finale de 106 conidies/ml pour les antagonistes et 105 conidies/ml pour les pathogènes. Inoculation

L’inoculation est faite au laboratoire par pulvérisation de 60 ml des suspensions sur la surface foliaire des pieds de Sorgho. Trois types de traitement ont été effectués :

- traitement préventif par la suspension sporale de l’antagoniste, 24 h avant l’inoculation par le pathogène ;

- traitement simultané par pulvérisation des suspensions de l’antagoniste et du pathogène ;

- traitement curatif par la suspension sporale de l’antagoniste après le début d’apparition des symptômes sur les pieds, 48 h après l’inoculation du pathogène.

Trois types de témoins ont été réalisés : - plantes inoculées uniquement par chaque pathogène (témoin

positif) ; - plantes traitées uniquement par chaque antagoniste ;

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- plantes traitées par l’eau distillée contenant de la gélatine et du Tween 20 (témoin négatif).

Les pots traités sont placés pendant 48 h sous une housse en plastique noire afin de maintenir une humidité relative de 100 %. Puis les plantes sont ramenées sous serre pour le développement des symptômes.

Trois pots avec trois pieds par pot ont été utilisés par condition et l’expérience est répétée trois fois.

L’évaluation des symptômes est faite au bout de sept jours en estimant la sévérité de la maladie déterminée à partir du pourcentage de surface foliaire malade à l’aide de l’échelle de notation de Notteghem et al. [38] :

Note

!

Xi Surface foliaire malade (%) 0 0 1 0,05 2 0,5 3 1,5 4 3,5 5 7,5 6 17,5 7 37,5 8 62,5 9 87,5

La multiplication de l’incidence de la maladie (nombre de feuilles

infectées) par la sévérité de la maladie (note attribuée à la surface foliaire infectée) donne le coefficient d’infection. Le pourcentage de réduction de la maladie

!

RM est déterminé par la formule suivante :

!

RM (%) = CIP "CIPACIP

x 100

!

CIP : coefficient d’infection des plantes inoculées par le pathogène

!

CIPA : Coefficient d’infection des plantes inoculées par le pathogène et traitées par l’antagoniste. Production de conidies

Dix jours après l’inoculation, les feuilles présentant des lésions sont prélevées à partir des pieds de Sorgho provenant des différents traitements. Trois à quatre fragments de 1 cm sont déposés dans autant de boites de Petri contenant deux rondelles de papier filtre superposées imbibées d’eau distillée stérile. Les boites sont placées à 28ºC à 30 cm d’une lumière continue fluorescente.

Après 48 h, les fragments de chaque feuille sont déposés dans un tube à essai contenant 1 ml d’eau distillée stérile et agités par un vortex

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pendant 2 min de manière à détacher les conidies. La richesse des suspensions est déterminée à l’aide d’une lame de Malassez (dix comptages par échantillon) au grossissement x 100. Les conidies sont facilement distinguables ; ainsi, celles de B. maydis sont courbes et fusiformes, brun doré, de 100 x 19 µm et formées de 7 cellules, celles de T. harzianum globulaires, lisses, vertes et de petite taille.

Le pourcentage d’inhibition de la production de conidies

!

IPc est calculé par la formule suivante :

!

IPc (%) = NCP " NCPA

NCP x 100

!

NCP : nombre moyen de conidies par unité de surface (1 mm2) des feuilles inoculées par le pathogène

!

NCPA : nombre de conidies par mm2 des feuilles inoculées par le pathogène et traitées par l’antagoniste. Poids de matière sèche

Les parties aériennes des pieds de Sorgho inoculés par le pathogène et traités par l’antagoniste sont ramenées au laboratoire et séchées dans une étuve 48 h à 70°C, puis pesées à l’aide d’une balance de précision pour obtenir le poids de matière sèche.

Traitement statistique

Le traitement statistique des données a porté sur l’analyse de la variance et le test ppds (plus petite différence significative) au seuil de 5 %.

RÉSULTATS

Confrontation directe

Les six antagonistes testés se sont révélés efficaces en inhibant la croissance mycélienne des quatre pathogènes testés (Tableau I). La réduction de croissance mycélienne varie de 68 à 83 %.

La souche TV2 apparait plus efficace chez B. sorghicola.

100

Tableau I : Effet de la confrontation directe des six souches de deux Trichoderma sur l’inhibition à 28°C et à l’obscurité de la croissance mycélienne sur milieu PSA et de la germination sur eau gélosée de quatre isolats de

Bipolaris.

B. maydis B. sorghicola B. sorokiniana B. tetramera croissance mycélienne après trois jours d’incubation TH1 72,30a 69,52c 67,02a 67,02a TH2 73,15a 73,32bc 70,32a 70,32a THS1 68,55a 70,47bc 67,02a 67,02a TV1 68,15a 76,18b 71,22a 71,22a TV2 74,48a 82,85a 73,61a 73,61a I2 67,55a 69,52c 68,12a 76,66a inhibition de la germination après 20 h d’incubation TH1 90,64a 90,64a 89,43a 89,43cd TH2 90,72a 90,72ab 82,67a 82,67bc THS1 81,86bc 81,86b 79,00ab 79,00abc TV1 86,40ab 86,40ab 83,33b 83,33a TV2 93,33a 93,33ab 87,33ab 87,33ab I2 77,55c 77,55c 55,73b 55,73d

Pour la croissance et pour la germination, deux résultats d’une même colonne sont significativement différents au seuil de 5 % s’ils ne sont affectés d’aucune lettre en commun.

Les conidies des Trichoderma testés ont inhibé la germination des conidies des Bipolaris (Tableau I).

La germination des conidies de B. maydis est fortement inhibée (78 à 94 %), suivie de celle de B. sorghicola (55 à 89 %), B. sorokiniana (62 à 87 %) et B. tetramera (50 à 75 %). La souche I2 donne les moins bons résultats.

101

Mycoparasitisme

L’interaction hyphale est importante sur Bipolaris maydis, suivi de B. sorghicola et inférieure à 60 % pour les deux autres pathogènes (Figure 1). TV2 a montré un enroulement intense à la zone de contact avec B. maydis (100 %) et B. sorghicola (91 %), alors qu’il est moyen à l’égard de B. tetramera et B. sorokiniana.

Fig. 1 : Notes de mycoparasitisme (intensité de l’enroulement des hyphes) attribuées à six souches de deux Trichoderma vis-à-vis de quatre isolats de

Bipolaris après trois jours d’incubation à 28°C à l’obscurité. Deux résultats sont significativement différents au seuil de 5 % s’ils ne sont affectés

d’aucune lettre en commun.

Production de substances volatiles

Les métabolites volatils inhibent surtout la croissance mycélienne de Bipolaris maydis (Tableau II). Les souches de Trichoderma diffèrent significativement entre elles. La souche THS1 donne une faible croissance mycélienne contrairement aux souches TH2 ou TV2.

102

Tableau II : Effet des substances volatiles libérées par six souches de deux

Trichoderma sur l’inhibition à 28°C et à l’obscurité de la croissance mycélienne sur milieu PSA et de la germination des conidies sur eau

gélosée de quatre isolats de Bipolaris.

B. maydis B. sorghicola B. sorokiniana B. tetramera croissance mycélienne après quatre jours d’incubation TH1 76,05ab 33,07a 34,20ab 33,07bc TH2 78,16ab 36,08a 53,39a 36,08a THS1 55,62b 8,63c 32,83b 8,63c TV1 75,34ab 30,81ab 43,80ab 30,81b TV2 92,60ab 29,31ab 39,69ab 29,31b I2 56,33b 24,80b 31,46b 24,80b inhibition de la germination après 20 h d’incubation TH1 54,33b 23,00a 26,66a 17,00bc TH2 40,00c 14,00b 16,33c 16,66bc THS1 20,33d 8,00c 22,33b 23,00a TV1 58,33ab 15,00b 11,66d 21,00ab TV2 64,00a 20,00a 15,66b 16,33c I2 14,66d 6,00c 27,00a 15,00c

Pour la croissance et pour la germination, deux résultats d’une même colonne sont significativement différents au seuil de 5 % s’ils ne sont affectés d’aucune lettre en commun.

De même, les substances volatiles inhibent la germination conidienne de Bipolaris maydis (14 à 64 %) et ont peu d’effet sur les autres pathogènes (< 27 %) (Tableau II).

Production de substances diffusibles

Les métabolites libérés par les souches de Trichoderma dans le milieu de culture inhibent moyennement la croissance mycélienne de B. maydis et peu celle de B. tetramera (Tableau III).

Les métabolites produits par TV2 n’ont pas d’effet sur la croissance mycélienne de B. sorokiniana.

L’inhibition est plus nette sur la germination des conidies, surtout de B. maydis (Tableau III).

103

Tableau III : Effet des substances diffusibles libérées dans le milieu PSA par six

souches de deux Trichoderma sur l’inhibition à 28°C et à l’obscurité de la croissance mycélienne sur milieu PSA et de la germination des

conidies sur eau gélosée de quatre isolats de Bipolaris.

B. maydis B. sorghicola B. sorokiniana B. tetramera croissance mycélienne après huit jours d’incubation TH1 53,59a 38,72a 18,88bc 18,88a TH2 44,91bc 41,33a 24,43ab 24,43a THS1 34,55d 33,81a 37,58ab 37,58a TV1 49,52ab 40,22a 36,10ab 36,10a TV2 39,55cd 34,82a 0,00c 0,00a I2 25,50e 18,24b 42,21a 42,21a inhibition de la germination après 20 h d’incubation TH1 63,33b 42,00c 42,00c 17,00bc TH2 52,66c 52,00d 52,00ab 16,66ab THS1 52,33c 47,66e 47,66bc 23,00c TV1 72,00a 31,66a 31,66d 21,00ab TV2 64,00b 26,00b 26,00d 16,33a I2 43,66d 57,33f 57,33a 15,00a

Pour la croissance et pour la germination, deux résultats d’une même colonne sont significativement différents au seuil de 5 % s’ils ne sont affectés d’aucune lettre en commun.

I2 est peu efficace sur la germination de B. maydis et B. sorghicola contrairement à B. sorokiniana et B. tetramera.

Effet des Trichoderma in vivo

Le nombre de feuilles infectées est très élevé chez les plantes inoculées avec les isolats pathogènes, l’incidence allant de 29 à 41 % et la sévérité variant de 4,0 à 8,4 (Tableaux IV et V).

Les traitements préventif et simultané par les Trichoderma entrainent une réduction importante aussi bien du nombre des feuilles infectées par les quatre Bipolaris que de la sévérité de la maladie et du coefficient d’infection.

La réduction de la maladie est plus importante pour B. maydis (> 88,9 %) que pour B. sorokiniana (< 90,3 %). Les souches THS1 et I2 donnent de bons résultats en traitement préventif, suivies de la souche TV1 en traitement simultané sur les quatre pathogènes.

Tableau IV :Effet six souches de deux Trichoderma sur l’incidence, la sévérité, le coefficient Cinf d’infection et la réduction de

la maladie RM causée par Bipolaris maydis et B. sorghicola sur le Sorgho ‘Honey’ en traitements préventif,simultané et curatif.

Préventif Simultané Curatif

Incidence (%)

Sévérité(%)

Cinf RM

(%)

Incidence (%)

Sévérité(%)

Cinf RM

(%)

Incidence (%)

Sévérité(%)

Cinf RM(%)

B. maydis 41 8,35 342,35 - 40 7,5 300 - 39 7,42 289,38 -

TH1 14 1,67 23,38 93,17bc 14 2,38 33,32 88,89c 17 2,62 44,54 84,60c

TH2 18 1,87 33,66 90,16c 11 1,87 20,57 93,14bc 16 3,73 59,68 79,37d

THS1 13 0,94 12,22 96,43a 13 1,67 21,97 92,67bc 14 2,59 36,26 87,46bc

TV1 16 1,49 23,84 93,03bc 7 0,5 3,5 98,83a 14 3,4 57,60 80,09cd

TV2 17 1,50 25,50 92,55bc 11 1,95 21,45 92,85bc 9 1,52 13,68 95,27a

I2 16 1,34 21,44 93,73ab 12 1,67 20,04 93,32b 12 2,27 27,24 90,58ab

B. sorghicola 29 8,18 237,22 - 32 6,9 220,80 - 30 7,3 219,00 -

TH1 21 1,67 35,07 85,21b 12 1,43 17,16 92,22bc 16 2,14 34,24 84,36a

TH2 15 2,37 35,55 85,01b 8 1,14 9,12 95,86ab 14 3,47 48,58 77,81b

THS1 15 1,58 23,70 90,00a 10 1,8 18 91,84bc 17 3,31 56,27 74,30b

TV1 19 1,77 33,63 85,82b 8 0,58 4,64 97,89a 15 3,66 54,90 74,93b

TV2 16 1,49 23,84 89,95ab 14 2,72 38,08 82,75c 13 2,66 34,58 84,21a

I2 17 1,36 23,12 90,25a 11 1,63 17,93 91,87bc 15 3,47 52,05 76,23b

Pour une même espèce de Bipolaris, les moyennes d’une même colonne ayant la même lettre ne diffèrent pas significativement entre elles au seuil de 5 %.

Tableau V :Effet six souches de deux Trichoderma sur l’incidence, la sévérité, le coefficient Cinf d’infection et la réduction de la

maladie RM causée par Bipolaris sorokiniana et B. tetramera sur le Sorgho ‘Honey’ en traitements préventif,simultané et curatif.

Préventif Simultané Curatif

Incidence (%)

Sévérité(%)

Cinf RM

(%)

Incidence (%)

Sévérité(%)

Cinf RM

(%)

Incidence (%)

Sévérité(%)

Cinf RM(%)

B. sorokiniana 31 3,98 12,.38 - 30 4,14 124,20 - 29 3,63 105,27 -

TH1 15 1,37 20,55 83,34ab 12 1,53 18,36 85,21b 14 3,18 44,52 57,70bc

TH2 16 2,49 39,84 67,70c 10 1,40 14 88,72a 10 2,40 24 77,20a

THS1 12 1,34 16,08 86,96a 11 1,30 14,30 88,48a 14 2,60 36,40 65,42ab

TV1 16 1,08 17,28 85,99a 10 1,20 12 90,33a 11 2,60 28,60 72,83ab

TV2 19 1,60 30,40 75,36bc 11 1,80 19,80 84,05bc 14 2,86 40,04 61,96bc

I2 13 1,74 22,62 81,66ab 13 1,80 23,40 81,15c 17 2,13 53,21 49,45c

B. tetramera 32 6,73 215,36 - 28 7,05 197,4 - 29 4,69 136,10 -

TH1 20 1,19 23,80 88,94a 14 1,27 17,78 90,99ab 14 1,96 27,44 79,83ab

TH2 22 1,42 21,24 90,13a 14 2,93 41,02 79,21c 13 2,4 31,2 77,07b

THS1 12 1,67 20,04 90,69a 9 2,4 21,6 89,05b 15 3 45,00 66,93c

TV1 17 1,28 21,76 89,89a 13 0,87 11,31 94,27a 9 1,77 15,93 88,29a

TV2 21 1,84 38,64 82,05b 10 1,39 13,90 92,95ab 14 2,71 37,94 72,12bc

I2 19 1,23 23,37 89,14a 11 1,02 11,33 94,26a 14 2,47 34,58 74,59bc

Pour une même espèce de Bipolaris, les moyennes d’une même colonne ayant la même lettre ne diffèrent pas significativement entre elles au seuil de 5 %.

106

Les souches de Trichoderma réduisent aussi la maladie lorsqu’ellessont appliquées après le début d’apparition des symptômes, mais de manièremoindre (de 49,5 à 95,3 %). Le traitement curatif est ici encore efficacecontre B. maydis et beaucoup moins contre B. sorokiniana (< 77,2 %).

Les traitements préventif, simultané et curatif entrainent uneréduction de la sporulation des différentes espèces testées allant de 7,3 à98,3 % (Tableau VI). Les réductions sont plus importantes pour B. maydis(56,2-98,3 %), B. sorokiniana (46,6-90,9 %) que B. tetramera (31,7-80,7 %)et B. sorghicola (7,3-64,3 %).

Tableau VI :Nombre moyen de conidies / mm2 (NCP) et pourcentage d’inhibition dela production de conidies (IPc) de quatre espèces de Bipolaris, sur les

feuilles de Sorgho ‘Honey’, suite aux traitements préventif, simultané etcuratif par six souches de Trichoderma.

B. maydis B. sorghicola B. sorokiniana B. tetramera

NCP IPc NCP IPc NCP IPc NCP IPc

Traitement préventifTémoin 6,00 - 5,40 - 8,33 - 12,20 -TH1 0,12 98,00a 1,93 64,25ab 0,83 90,03a 2,36 80,65a

TH2 0,13 97,83a 2,16 60,00ab 2,16 74,06bc 3,10 74,59ab

THS1 0,33 94,50a 3,03 43,88b 2,66 68,06c 3,76 69,91bc

TV1 0,16 97,33a 1,93 64,25ab 1,63 80,43ab 4,33 64,50c

TV2 0,10 98,33a 3,20 40,74b 1,56 81,27ab 3,06 74,91ab

I2 1,26 79,00b 2,96 45,18b 1,03 87,63ab 3,50 71,31bc

Traitement simultanéTémoin 6,00 - 5,60 - 8,00 - 12,20 -

TH1 0,96 84,00ab 4,76 15,00b 1,53 80,87ab 5,90 51,63b

TH2 0,80 86,66ab 5,00 10,71b 1,33 83,33ab 7,73 36,63c

THS1 0,36 94,00a 2,03 63,75a 1,96 75,50b 5,50 54,91b

TV1 0,83 86,16ab 4,06 27,50b 0,73 90,87a 4,23 65,32ab

TV2 0,73 87,83ab 3,33 40,53ab 2,06 74,25b 3,00 75,40a

I2 1,13 81,16b 2,26 59,64a 2,06 74,25b 4,13 66,14ab

Traitement curatifTémoin 6,00 - 5,40 - 8,30 - 12,20 -

TH1 0,73 87,83ab 3,30 38,88a 2,13 74,43ab 4,53 62,86a

TH2 2,63 56,16c 4,03 25,37ab 4,43 46,62c 8,33 31,72b

THS1 0,40 93,33a 2,96 45,18a 1,60 80,72a 4,76 60,98a

TV1 0,86 85,66ab 5,01 7,27b 2,63 68,31ab 8,20 32,78b

TV2 1,20 80,00b 4,90 9,25b 2,56 69,15ab 5,16 57,70a

I2 0,73 87,83ab 3,13 42,03a 1,56 81,20a 4,10 66,39a

Pour un même traitement, les moyennes d’une même colonne ayant la même lettre nediffèrent pas significativement entre elles au seuil de 5 %.

107

L’inhibition moyenne de THS1 contre B. sorokiniana en traitementpréventif (68,1 %) ne se retrouve pas dans le traitement curatif (80,7 %).

Par rapport au témoin négatif, les témoins positifs ont perdu plus dela moitié de leur poids de matière sèche (Tableau VII).

Tableau VII :Moyennes du poids de matière sèche (mg) des feuilles de Sorgho

‘Honey’ inoculées par quatre espèces de Bipolaris et traitées par sixsouches de Trichoderma.

B.maydis

B.sorghicola

B.sorokiniana

B.tetramera

Total

Traitement préventifTémoin négatif 197ab 197b 197a 197b 788Témoin positif 91c 82d 96d 97c 366TH1 139bc 273a 134c 181b 727TH2 189ab 276a 177ab 209ab 851THS1 177ab 91cd 94d 164b 526TV1 151bc 305a 163bc 266a 885TV2 216a 290a 179ab 172b 857I2 196ab 135c 140c 220ab 691Total 1356 1649 1180 1506 5691

Traitement simultanéTémoin négatif 197bc 197ab 197abc 197ab 788Témoin positif 91d 82c 96e 97d 366TH1 283ab 218ab 161cd 179abc 841TH2 208bc 174b 198ab 241a 821THS1 242abc 194ab 140d 107cd 683TV1 313a 211ab 179abc 233a 936TV2 265ab 249a 211a 149bcd 874I2 173cd 152bc 166bcd 223ab 714Total 1772 1477 1348 1426 6023

Traitement curatifTémoin négatif 197a 197a 197a 197a 788Témoin positif 91c 82c 96c 97cd 366TH1 116bc 85c 159b 93cd 453TH2 115bc 88c 141b 94cd 438THS1 111bc 89c 94c 95cd 389TV1 114bc 86c 91c 117bc 408TV2 130b 167ab 171ab 151b 619I2 91c 141b 141b 94cd 467Total 965 935 1090 938 3928

Témoin négatif : plantes traitées par l’eau distillée contenant de la gélatine et du Tween 20.Témoin positif : plantes inoculées uniquement par chaque pathogène.Pour un même traitement, les moyennes d’une même colonne ayant la même lettre nediffèrent pas significativement entre elles au seuil de 5 %.Les plantes traitées uniquement par les souches de Trichoderma donnent 280ab (TH1), 265b

(TH2), 251b (THS1), 342a (TV1), 270ab (TV2) et 235c mg (I2).

108

Le traitement simultané donne des poids de matière sècheglobalement élevés, suivis du traitement préventif, alors qu’ils sontrelativement faibles pour le traitement curatif.

En traitement préventif, on observe quelques valeurs nettementsupérieures à celle du témoin négatif, par exemple pour TV1 (305, 266).Inversement, THS1 apparait sans action contre Bipolaris sorghicola (91) etB. sorokiniana (94).

En traitement simultané, les antagonistes ont une action positivecontre B. maydis. TV2 donne d’assez bons résultats en traitement curatif.

DISCUSSION ET CONCLUSION

Les six souches de Trichoderma ont inhibé efficacement lacroissance mycélienne et la germination conidienne de Bipolaris maydis,B. sorghicola, B. sorokiniana et B. tetramera, à des degrés variables et parle biais de différents mécanismes.

Le test de confrontation directe a mis en évidence le pouvoirmycoparasitaire des deux espèces de Trichoderma. Le mycélium deT. harzianum peut envahir d’autres genres et espèces fongiques comme lechampignon tellurique Pythium ultimum [7].

On a constaté l’effet de métabolites volatils et diffusibles pour les sixsouches. La production de composés volatils par T. harzianum comme la1-hydroxy-3-méthylanthraquinone a montré une forte capacité à limiter ledéveloppement de plusieurs champignons pathogènes du sol [5]. L’antibioses’est avérée inégale pour les souches des deux espèces de Trichoderma.Cela pourrait s’expliquer par des mécanismes de détoxification mis en placepar le pathogène [4,13,20].

La pulvérisation des spores de Trichoderma testées sur les plantes deSorgho entraine une forte réduction de la maladie et inhibe la sporulationdes quatre espèces de Bipolaris. L’antagonisme des champignonssaprophytes contre l’helminthosporiose des feuilles de céréales a été étudiépar plusieurs auteurs [34]. Trichoderma viride peut réduire la pathogénicitéd’Helminthosporium sativum [11]. La présence de Bacillus subtilis,B. cereus, B. licheniformis et B. laterosporus sur les feuilles de Blé réduitl’helminthosporiose causée par Bipolaris sorokiniana [1].

Les souches de Trichoderma sont plus efficaces contre les Bipolaristestés s’ils sont appliqués simultanément et préventivement plutôt qu’entraitement curatif. Ces résultats sont en accord avec ceux de Bill et Hill [10]et Mouria [35].

109

Le poids de matière sèche des plantes traitées a été parfois supérieurau témoin négatif. On peut avancer comme explication que certainessouches de Trichoderma semblent exercer une action stimulatrice sur lacroissance des plantes, aussi bien in vitro, dans des conditions contrôlées eten l’absence de tout agent pathogène que dans des substrats de culture [3].L’addition de T. harzianum et T. koningii au substrat de culture a amélioréle poids de matière sèche des racines et des parties aériennes de tomate et detabac [47].

L’effet antagoniste des Trichoderma concerne aussi d’autrespathogènes foliaires [19,30,41]. T. koningii réduit sur les feuilles de Sorgho lepiétin-verse provoqué par Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli. [37] ;T. harzianum assure une protection des feuilles de Riz contrel’helminthosporiose due à Helminthosporium oryzae [36]. L’application deT. harzianum sur les feuilles de Fraisier réduit de plus de 85 % les attaquesde Botrytis cinera [25]. L’enrobage des semences de tomate parT. harzianum réduit de 80 % la fusariose des racines et du collet [42].

Les mécanismes mis en jeu par Trichoderma in vivo seraient lesmêmes que ceux mis en évidence in vitro, à savoir le mycoparasitisme, lasécrétion des substances volatiles et diffusibles et la compétition pourl’espace et les nutriments [6,15,21,26,39]. De plus, T. harzianum peut stimulerles mécanismes de défense des plantes traitées et augmenter ainsi leurprotection [24,33,47-48].

Trichoderma apparait efficace comme agent de lutte biologiquecontre l’helminthosporiose du Sorgho causée par Bipolaris maydis etB. sorghicola, et la présence de B. tetramera et B. sorokiniana sur lefeuillage de cette plante hôte.

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ABSTRACT

In vitro and in vivo antagonism of two species of Trichoderma againstfour pathogenic Bipolaris on sorghum

In vitro, direct confrontation on PDA medium between fourpathogenic isolates of Bipolaris on sorghum and three strains ofTrichoderma harzianum and three strains of T. viride revealed an inhibitionof mycelial growth and conidia germination with a level of mycoparasitism.Volatile and diffusible substances liberated by isolates reduced the growthand germination of the pathogen.

In vivo, sporal pulverisation of Trichoderma on ‘Honey’ sorghumplants involved a strong reduction of the disease. Preventive andsimultaneous treatments were more effective than a curative treatment. Theconidial production was more inhibited by B. maydis and B. sorokinianathan B. sorghicola and B. tetramera. Simultaneous treatment allowed ahigher leaf dry weight than the others.

Key words: Bipolaris, helminthosporiose, sorghum, Trichoderma.__________