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TRANSPORTS MEMBRANAIRES ELECTROGENIQUE

Fabrice DUPRATInstitut de Pharmacologie Moléculaire et CellulaireUniversité de Nice Sophia-Antipolis Décembre 2002

ELECTROPHYSIOLOGIEPRINCIPES ET TECHNIQUES

2

Objectifs de ce cours

• Comprendre le fonctionnement des canaux ioniques.

• Comprendre les données présentées dans un article scientifique.

Lecture des représentations classiques(courbes courant/potentiel, inactivation, ...)

Signification des paramètres mesurés en électrophysiologie(conductance, seuil d’activation, probabilité d’ouverture, ctes de temps...)

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Déroulement du cours

Durée du cours5 h sur les principes et techniques de l'Electrophysiologie.3 h sur les bases de neurosciences et la plasticité synaptique.

Evaluation (examen final du C4):Etude d’un ou plusieurs cas concrets (articles de littérature scientifique en Anglais).Questions de cours sur les principales notions.Prévoir un dictionnaire Anglais/Français et une calculatrice.

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Plan du cours

LES PHENOMENES ELECTRIQUES EN BIOLOGIEETUDE DES PHENOMENES ELECTRIQUES D ’ORIGINE BIOLOGIQUETRANSPORTS MEMBRANAIRESLES CANAUX IONIQUESNOTIONS DE BIOPHYSIQUETECHNIQUES D ’ETUDE: LE POTENTIEL IMPOSEGATING DES CANAUX IONIQUESLE PATCH CLAMPTECHNIQUE D ’ETUDE: LE COURANT IMPOSECANAUX ENDOGENES ET EXOGENESPOINTS DE REPERES

5

LES PHENOMENES ELECTRIQUES EN BIOLOGIE

6

Les phénomènes électriques en biologie

L'anguille électrique

La torpille

7

ETUDE DES PHENOMENES ELECTRIQUES D ’ORIGINE

BIOLOGIQUE

8

Animal entier: EEG

Electrodes externes

E.E.G.: Electroencephalogramme

Electrodes implantées

9

Animal entier: ECG

Electrodes externes

E.C.G.: Electrocardiogramme

10

Organe entier: coeur

200 ms

P

Q

R

S

T

Cœur isolé perfusé de souris

Drici et al Circulation 2002

Cœur entier

Electrodes

11

Organe entier: cerveau

Microélectrodes

12

Tissus: tranche de cerveau

Electrodes

13

Tissus: nerf isolé

14

Cellules: Neurones en culture

MicroélectrodePipette de patch clamp

15

Protéine canal

Zhou et al.

KcsA

16

TRANSPORTS MEMBRANAIRES

17

Assymétrie de la membrane plasmique

Bicouche lipidiqueProtéines membranaires

Interne Externe

Na+ 14 140K+ 160 3Ca++ 10-4 1Cl- 14 150

Concentrations ioniquesdans les cellules de vertébrés

18

Protéines de la membrane plasmique

x75000

19

Notions générales sur les transports membranaires

Gradient de [A]A

Transports passifs

C

ATP

Transports actifs avec consommation d’ATP

Transports actifs secondaires

Gradient de [C]

C

Qté transportée

Gradient de [ ]

Diffusion facilitée

20

Transports membranaires

A+ C

Gradient de C

Electrogène

SymportsA B

Gradients de A et B

Electroneutre

A+ B

Electrogène

UniportsA+

Electrogène

AntiportsA+

B+

Electroneutre

A

B

Electroneutre

C

ATP

Electroneutre

21

Synapse électrique, jonctions Gap

22

100 µm

Synapse électrique, jonctions Gap

30 µm30 µm

23

Conclusion sur les transports membranaires

Transports électrogèniques

Possibilité de mesures électrophysiologiques

Cas des canaux ioniques

24

LES CANAUX IONIQUES

25

Les canaux clonés ou exogènes

Structure protéique connue

• Nombre de segments transmembranaires• Homologies de séquence• Sites consensus• Réalisation d’anticorps, d’antisens, de sonde d’hybridation, ...

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Superfamilles des canaux clonés

Canaux Cl-Récepteurs canaux

+ sous unités α,α,α,α,

β,β,β,β,

δ,δ,δ,δ,

γγγγ

Canaux Ca2+

++++

++++

++++

++++

P P P P

Canaux Na+

++++

++++

++++

++++

P P P P

27

Sous unités auxiliaires: Kvββββ2

Van Huizen et al. 1999, FEBS Lett. 457, 107-111.

28

Structure et assemblage des Kv

1 2 3

5

64

Kv++++

x4=P

29

Structure et assemblage des Kir

P

30

Structure et assemblage d’autres canaux

31

Structure du récepteur-canal nicotinique

32

Miller et al.

Passage des ions K+

33

Zhou et al2001

Filtre de sélectivité

34Zhou et al 2001

Deshydratation des ions K+

35

Zhou et al 2001

Passage des ions K+

36

Classification des canaux ioniques

Nature du/des principaux ions transportés

25.10-9m

Face externe

Face interne

Na+

Ca++

K+Cl-

37

Régulation des canaux ioniques

Régulation par un ligand intracellulaire (SMOC)Ca++ AMPc

Régulation par un agoniste (ROC)AMPA GABA

Face externe

Face interne

Régulation par le potentiel (VOC)

+ + +

- - -

++++

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Biophysique des canaux ioniques

Propriétés biophysiques:• Canaux à rectification entrante• Canaux à rectification sortante• Canaux voltage dépendant• Canaux avec une inactivation .…

39

Pharmacologie des canaux ioniques

Classification selon la sensibilité

Exemple: Canaux apamine sensible (KCa)

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Pathophysiologie des canaux ioniques

♦ Diabète,♦ Ataxie épisodique de type 1♦ Syndrome du long QT ♦ Syndrome de Bartter

Canaux potassiques

♦ La paramyotonie congénitale, la paralysie périodique familiale hyperkaliémique♦ Syndrome du long QT ♦ Syndrome de Liddle ♦ Pseudohypoaldostéronisme de type 1

Canaux sodiques

♦ La paralysie périodique familiale hypokaliémique ♦ L'hyperthermie maligne♦ Syndrome de Lambert-Eaton, sclérose latérale amyotrophique, diabète de type I

Canaux calciques

♦ La mucoviscidose♦ La myotonie congénitale et la myopathie pseudohypertrophique de Becker.

Canaux chlore

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Pharmacologie clinique des canaux ioniques

• Anti-arythmiques de la classe IA (quinidine, lidocaïne, encaïnide)• Anti-arythmiques de la classe IB (lidocaïne)• Anti-arythmiques de la classe IC (encaïnide)• Pyréthrinoïdes (bioperméthrine)• Diurétiques (amiloride).

Canaux sodiques

Canaux potassiques• Anti-arythmiques de la classe III (amiodarone)• Sulphonylurées (glibenclamide)• Ouvreurs KATP (nicorandil).

♦ Anti-arythmiques de la classe IV (vérapamil).Canaux calciques

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NOTIONS DE BIOPHYSIQUE

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Analogie électricité /eau / ion

Courant électrique: i ou IQté de charges (e-) circulant par unité de temps. Porteurs de charges: électronsProduit par un générateur de courant:Sens positif = celui des charges positives

Courant d’un fleuveDébit d’eau entre 2 pointsPompe péristaltique

Courant ionique: i ou IQuantité de charges (et non d’ions) par unité de temps= flux global entre 2 pointsPorteurs de charges: ionsAmpères: 10-6 A=1µA, 10-9 A=1nA, 10-12A=1pA

PHENOMENE ELECTRIQUE ANALOGIE AVEC L’EAU PHENOMENE IONIQUE

Conductance : g= 1/R

Résistance: R

Obstacle au passage des électrons

Résistance d’un canal:

Résistance R ou r en ohm: Ω (109 Ω = 1 MΩ)

Conductance d’un canal:

r = 1/g

Conductance g ou γ en siemens: 10-12 S = 1 pS

= capacité à laisser passer des ions

Barrage sur un fleuve

Les vannes sont ± ouvertes

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Analogie électricité /eau / ion

Différence de potentielDifférence de quantité de chargesVolts: mV: 10-3 V

Quantité d’eau en un pointPotentiel électrique: E (U, V)Quantité de charges en un point

PHENOMENE ELECTRIQUE ANALOGIE AVEC L’EAU PHENOMENE IONIQUE

Différence de potentiel ou tension: U, V (E)

Différence en quantité de charges entre 2 points

Produit par un générateur de tension

Différence niveau d’eau

45

Analogie électricité /eau / ion

PHENOMENE ELECTRIQUE ANALOGIE AVEC L’EAU PHENOMENE IONIQUE

2 réservoirs

Loi d’ohm: U = RI

Si U = constante:

si R alors I

Si I=constante:

si R alors U

Capacité: C

composé d’un isolant entouré de 2 surfaces de conducteur

= capacité d’accumuler des charges

Capacité membranaire

=la membrane plasmique est un isolant entouré de 2 conducteurs

Capacité spécifique (µF/cm2)

Barrage:

si le courant alors la différence de niveau

-------

++++

+ -

---

+

+

+

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Potentiel d’équilibre - Loi de Nernst

Interne Externe Eion = 58 log [ion]ext / [ion]int

Na+ 14 140 + 58 mVK+ 160 3 - 100 mVCa++ 10-4 1 + 232 mVCl- 14 150 + 60 mV

Potentiels d’inversion dans les cellules de vertébrés-90 mVPolarisée

- +

Gradient de chargesInclusion d ’un canal K+

K+ Na+Cl- Cl- K+

Na+Cl- Cl-

K+

Na+Cl- Cl- K+

Na+Cl- Cl-

K+ Na+Cl- Cl-

K+ Na+Cl- Cl-

Gradient de [Na+]Gradient de [K+]

Gradient de charges

Voltmètre0 mV

Gradient de [Na+]Gradient de [K+]

K+ Cl- Cl-

K+ Na+Cl- Cl-

K+ Na+Cl- Cl-

K+ Na+Cl- Cl-

K+ Na+Cl- Cl-

K+ Na+Cl- Cl-

Gradient de charges

+60 mVDépolarisée

-+

Inclusion d ’un canal Na+

Gradient de [Na+]Gradient de [K+]

K+ Cl- Cl-

K+ Na+Cl- Cl-

K+

Na+Cl- Cl-

K+ Na+Cl- Cl-

K+Na+Cl- Cl-

K+ Na+Cl- Cl-

Na+

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Enoncé de la loi de Nernst

Potentiel d’équilibre d’un ion Eionint][][ln

ionion

zFRTE ext

ion =

R: constante des gaz parfaits: 8,315 J.K-1.mole-1 (1 J = 1 V.C)T: température absolue en °K (°K = °C + 273,16)z: valence de l’ion (+1 pour Na+ et K+, +2 pour Ca2+ et -1 pour Cl-)F: constante de Faraday: 9,648.104 C.mole-1

Valeurs de RT/F selon la température:

Température RT/F(°C) (mV)

0 23,545 23,9710 24,4015 24,8320 25,2625 25,6930 26,1235 26,5537 26,73int][

][log58ionionE ext

ion =

Ln = 2,303 LogSi z = +1 et à 20°C on a:

48

TECHNIQUES D ’ETUDELE POTENTIEL IMPOSE

49

ImposéE

Eimposé

Aspect technique du potentiel imposé

Double microélectrodesCalculé

= R

Emb

x IMesuré

Iinjecté

Calculé= 1/gE / I = 1 / gI / E = g

50

Le modèle de l’ovocyte de xénope

Ovocytes de xénopes

Injection d’ARN ou d’ADN

Double microélectrodes

Etude des canaux clonés ou exogènes

51

Préparation des ovocytes de xénopes

52

Ovocytes: Injection d’ARN ou d’ADN

53

Le poste d’enregistrement en double microélectrodes

54

Préparation des pipettes

55

Etude des courants natifs ou endogènes

Preparation d’un tissu

56

Potentiel imposé par l’expérimentateur[ + ]Gradient de charges imposé

[ - ]Flux net de K+ sortant

Flux net de K+ nul

= état d’équilibre (Nernst)Flux net de K+ entrant

[K+]

[ K+ ]

Gradient de [K+]

Interne

Externe

Flux net de K+ sortant

57

Potentiel imposé

E = R x IImposé MesuréCalculé

Potentiel (mV)

Courant (µA, nA, pA)

0 +50-50-100

+5

-5 Interne

ExterneEK+=-70 mV

Gradient [K+]

Potentiel imposé

58

Représentation schématique d’un canal

Externe

Interne

gK = 0gNa = 0

IK = 0INa = 0

Vm = 0 mV

Externe

Interne

gK > 0gNa = 0

IK > 0INa = 0

Vm = EK = - 84 mV

Externe

Interne

gK = 0gNa > 0

IK = 0INa > 0

Vm = ENa = + 58 mV

- - - -+ + + +

+ + + +- - - -

59

Loi de Goldman Hodgkin Katz

Flux sortant

Flux entrant

Flux sortant

Flux entrant

TotalEK+

[K+]int > [K+]ext[K+]int = [K+]ext

Total

EK+

60

Technique d’étude: le voltage clamp

Courants totaux

61

Technique d’étude: le voltage clamp

Courants totaux

62

GATING DES CANAUX IONIQUES

63

Biggin & Sansom 2001

Structure et gating des canaux clonés

64

Canaux voltage-dépendant

Seuil d’activation

EK+

[K+]int > [K+]ext

EK+

[K+]int = [K+]ext

Seuil d’activation

65

Interactionssenseur au voltage et pore (Kcsa)

Fermé(rétracté)

Inactivé(rétracté)

Inactivé(extrudé)

Ouvert(extrudé)

Gandhi et al. 2000

ActivationInactivation

66

Gating des canaux ioniques

Rectification entrante

V

I

Diffusion facilitée

V

I

Blocage des courants sortants

67

Rectification entrante

Milieu interne

K+

Membrane

Milieu externe

K+Spermine

Mg2+

68

Canaux temps-dépendant

InactivationActivation

69

Patch Clamp

Enregistrements de courants unitaires

70

LE PATCH CLAMP

71

Configurations du Patch Clamp

72

Poste de Patch clamp

73

Courant unitaire

74

Courant unitaire

75

Modèle

F2 OF1 Ik2

k-2

k1

k-1

ki

76

Histogramme d’amplitude

77

Sommation des courants unitaires

78

Courant total

Itotal = iunitaire . N . Po = gion . (Vm-Eion)

iunitaire = γion . (Vm-Eion)

79

Cas d’une membrane comportant plusieurs conductances

Courants du nœud de Ranvier

Schéma électrique

80

TECHNIQUE D ’ETUDELE COURANT IMPOSE

81

Current clamp

Potentiel d’action en current-clamp

82

CANAUX ENDOGENES ET EXOGENES

83

Etude des canaux natifs ou endogènes

Patch clamp

Dissociation mécanique et enzymatique

84

Etuce des canaux clonés ou exogènes

Cultures de cellules

Transfection, infection, injection

Patch clamp

85

POINTS DE REPERES

86

Canaux ioniques des végétaux: Arabidopsis thaliana

87

Historique 1

2600 ans avant JCLes Egyptiens étudient les phénomènes liés à l’anguille électrique.1790 GALVANI:Existence de phénomènes électriques au niveau de la matière vivante.1827: Loi d’OHM.1848 DU BOIS REYMOND:Propriétés électrogènique de la peau de grenouille.1868 BERNSTEIN:L’intérieur et l’extérieur des cellules sont composés d’électrolytes de différentes concentrations séparées par une membrane perméable à ces électrolytes.1888 NERNST:Loi de Nernst donnant le potentiel d’équilibre d’un ion.1902 BERNSTEIN: Théorie de la membrane:- le potentiel de repos est du à la membrane,- notion de membrane électrique et de membrane biologique,- les concentrations ioniques sont différentes de part et d’autres de la membrane- au repos la membrane n’est perméable qu’au potassium.

88

Historique 2

1910 EINTHOVEN:Naissance de l’ECG (électrocardiogramme) 1920-1945:Naissance de l’électrophysiologie, due aux améliorations techniques après la II nde guerre mondiale .1935: Microélectrode intracellulaire.1937 HODGKIN:Des courants locaux peuvent dépolariser la membrane.1948 ROSENBERG-USSING:Différence entre les transports actifs et les transports passifs, au niveau des épithéliums. 1949 LING-GERARD:Première microélectrode de verre.1952 HODGKIN-HUXLEY:Technique du voltage clamp1952 CORABOEUF:Naissance de l’électrophysiologie en France.1958 USSING:Etude des différentes perméabilités (K+ et Na+) sur les épithéliums, chambre de Ussing.1981 NEHER - SAKMANN:Technique de patch clamp.2000 NEHER - SAKMANN :Prix Nobel de Médecine.