l'hybridation fluorescente (fish) fluorescent in situ hybridization

L'hybridation fluorescente (FISH)

fluorescent in situ hybridization

Définition

• repérer la présence d'anomalies chromosomiques par un système couplé anticorps-fluorophore

• Les sondes• L'hybridation• La révélation• L'observation :

Les sondes

un brin d'ADN comportant des nucléotides modifiés, à partir d'un brin matrice

de départ. polymériser le brin complémentaire entre des hexamères de

monobrin (brins composés de six nucléotides aléatoires)

N : brin complémentaire synthétise entre l'hexamère 1 et l'hexamère 2

M: brin matrice

En rose : les nucléotides marqués

trois types principaux de sondes• séquences uniques: identification d’une séquence spécifique

• séquences multiples: spécifiques à un chromosome entier.

• ADN -satellite: identification de séquences au niveau du

centromère du chromosome.

Les sondes marquées : la biotine révélée par l'avidine

la digoxygénine révélée par un anticorps anti-digoxygénine,

les deux couplés à un fluorochrome

Le principeL'ADN cible parmi l'ADN cellulaire

Dénaturation de l'ADN cellulaire par chauffage

Une sonde d'ADN complémentaire de l'ADN cible et munie d'une molécule de reconnaissance (R).

Hybridation de la sonde et de la séquence cible.

Révélation par reconnaissance de la molécule R par un anticorps anti R muni d'un fluorophore F.L'observation au microscope à fluorescence permet de visualiser la présence de la séquence cible.

La révélationsystème biotine-avidine: reconnaître les sondes par des anticorps flanqués de sites

moléculaires fluorescent,

M : brin d' ADN matrice dénaturé , H : séquence sonde hybridée.

biotine liée de streptavidine possédant un site fluorescent.elles-mêmes reconnues par des anticorps anti-avidine "équipés" d'un site biotine et d'un site fluorescent (ou fluorophore).

L'observation microscope à fluorescence, la lumière émise par les sites fluorescent : sites hybridés.

INDICATIONSDiagnostic de la trisomie

21

Une sonde pour identifier le chromosome 13 (vert),

une sonde pour identifier le chromosome 21 (rouge)

Individu A Individu B

TECHNIQUE RAPIDE DE DIAGNOSTIC PRENATAL

•L’amniocentèse :dépister les anomalies chromosomiques

•L’analyse FISH : pas de culture cellulaire. Elle s’applique

directement aux cellules contenues dans le liquide

amniotique.

•fréquence anomalies chromosomiques: Les trisomies des

chromosomes 21,13, 18, X et Y représentent 70% des

anomalies.

•Ce test dépiste la trisomie 21, la trisomie 13 et la

trisomie 18 ainsi que les anomalies de nombre des

chromosomes sexuels (Turner, triple X, Klinefelter, Double

Y).

DIAGNOSTIC PRENATAL

• L’analyse fiabilité: 99,9%• Le taux de réussite technique: 97%

anomalies numériques des chromosomes 21, 18, 13, X, Y.

• 3 causes principales des échecs  : • le nombre de noyaux est trop faible; • les noyaux sont d’origine maternelle • un problème technique lors de la

manipulation.

Diagnostic d'une translocation équilibrée.

un chromosome ou un fragment

de chromosome se soude à un

autre chromosome.

translocation

équilibrée :phénotype de

l'individu est normal : il n'y a

alors ni perte , ni gain de

matériel génétique

ex: translocation équilibrée

entre les chromosomes 11 et 12

Une sonde du chromosome 11

(rose); une sonde

caractéristique du chromosome

12 (vert)

Diagnostic d'une délétionUne délétion : perte d'un fragment de chromosome.

ex : sd de Di George: anomalies thymiques, cardiaques ,hormonaux et

psychiques

individu normal individu malade

Les deux caryotypes après la technique du FISH

Individu normal individu malade

Marquage de l'extrémité du chromosome 22 sonde associée à un marqueur vert; marquage de la zone absente après délétion, avec une sonde associée à un marqueur rouge

Étude de cellules malignesmarquage avec un mélange de plusieurs sondes chacune associée à un fluorophore différent permet une "peinture des chromosomes".Exemple : étude chromosomique d'une cellule cancéreuse du foie chez l'homme. 

a: après révélation;

b: après traitement à

l'ordinateur

 cellules malignes :

nombreuses anomalies

chromosomiques

Limites du test

•Le FISH : 70% des anomalies en moins de 48 heures.

•Ce test ne dépiste que les anomalies des chromosomes;

• ne dépiste pas les anomalies des gènes des

chromosomes.

•recourir à un conseil génétique qui permettra

d’envisager le diagnostic prénatal souhaitable lors de

maladie génétique due à une mutation génique.

Caryotype

Le caryotype(ou caryogramme): arrangement

standard de l'ensemble des chromosomes d'une

cellule. Les chromosomes sont photographiés et

disposés selon un format standard : par paire et

classés par taille.

but : détecter des aberrations chromosomiques

(comme la trisomie 21) ou d'identifier certains

aspects du génome de l'individu, comme le sexe

(XX ou XY).

Caryotype d'un individu de sexe masculin (XY)