les enzymes : outils de biologie moléculaire enzymes de restriction: endonucléases kinases:...

Les enzymes : outils de biologie moléculaire

• Enzymes de restriction: endonucléases

• Kinases: ajoutent un phosphate (P*)

• Phosphatases: retirent un phosphate

• Ligases: joignent un OH et un phosphate

• ADN Polymérase: ADN => ADN

• Reverse transcriptase : ARN => ADNc

Nomenclature des enzymes de restriction

Tailles des séquences inclusesTailles des séquences incluses

–Plasmide bactérien ( 3-4 kb )Plasmide bactérien ( 3-4 kb )

–Phage Phage λλ ( 9-22 kb )( 9-22 kb )

–Cosmide ( Cosmide ( ≈ ≈ 45 kb )45 kb )

–PAC : P1-derived Artificial Chromosome ( 75-95 PAC : P1-derived Artificial Chromosome ( 75-95 kb )kb )

–BAC : Bacterial Artificial Chromosome ( 100-350 BAC : Bacterial Artificial Chromosome ( 100-350 kb )kb )

–YAC : Yeast Artificial Chromosome ( 300-1000 kb YAC : Yeast Artificial Chromosome ( 300-1000 kb ))

Vecteurs de clonage

NOMBRE DE CLONES A OBTENIR

PROJET PUBLIC: ETAPE 1

PROJET PUBLIC: ETAPE 2

PROJET PRIVE : CELERA

– Amplification d’ADN.

– Base pour différentes techniques de biologie moléculaire :

• Séquençage

• Amplification de l’ADN pour le clonage

• mutation ponctuelle

• « differential display »

• préparation d’ADNc « RT-PCR »

• détermination de polymorphisme entre génomes (RFLP…)

• ….

PCR : Polymerase Chain Reaction

Séquençagenucléotide : méthode de Sanger

• ddNTP : analogues structuraux des dNTP.• ddNTP : incapables de réaliser une liaison phosphodiester.• ADN polymérase incorpore dNTP ou ddNTP.

Séquençagenucléotide : méthode de Sanger

Séquençage : Méthode de SangerÉlectrophorèse

Séquençagenucléotide : méthode de Sanger

• Liaison de l’amorce avec l’ADN à séquencer.

• La fixation des ddNTP aux brins d’ADN va créer des brins de différentes tailles.

• Les brins vont migrer sur un gel d’électrophorèse selon leur taille : le plus petit migre le plus vite.

Séquençagenucléotide : méthode de Sanger

Séquençagenucléotide : méthode de Sanger

• Automatisation de la méthode :

– Ajout sur les ddNTP de fluorochrome de différentes couleurs.

– 1 seul tube regroupant les ddNTP.– Lecture par un laser des fragments qui migrent sur le

gel.– Stockage des données dans la mémoire de l’ordinateur.

Séquençagenucléotide : méthode de Sanger

Les ddNTPs fluos

Séquençagenucléotide : méthode de Sanger

Automatisation

• Séquençage sur capillaires :megabace

• Permet de séquencer 96 ou 386 échantillons en parallèle

RESTE A LIRE LA SEQUENCE ET COMPRENDRE

TOUTES LES INFORMATIONS CONTENUES

DANS LE GENOME

ANNOTATION DU GENOME

Comment fonctionne le génome

Quelle est l’organisation du génome?

Comment est lue l’information contenue dans

le génome?

Mise en place du programme génétique

Paradoxe !!!!

Complexité du génome Humain

• Taille 3 200 Mb pour 30 000 gènes

• Nature répétitive– Séquences répétées localement

• ADN satellite

– Séquences répétées dispersées• SINES (Short Interspersed Repeated Sequences)

– Ex: ALU, 300 pb tous les 6000 nucleotides• LINES (Long Interspersed Repeated Sequenes)

– Ex: L1, 5 kb, 100 000 copies dans génome

• Rôle de l’ADN non génique ???– Régulation globale de l’expression des gènes– Nucléosquelette

Complexité du génome humain

• Pourquoi les gènes sont dispersés?

• Pourquoi autant de répétitions?

• Pourquoi les gènes sont morcelés?

• Toutes les parties du génome sont elles utilisées dans toutes les cellules?

• Le génome évolue t-il avec la spécialisation des cellules?

Epissages alternatifs

Complexité du génome humain

• Pourquoi les gènes sont dispersés?

• Pourquoi autant de répétitions?

• Pourquoi les gènes sont morcelés?

• Toutes les parties du génome sont elles utilisées dans toutes les cellules?

• Le génome évolue t-il avec la spécialisation des cellules?

Initiation de la transcription

Répresseur

Activateurs

FT

FT

FT

Promoteur basal

Facteurs d’initiation

RNA Pol II Région codante

Coactivateurs

Régulation du niveau d’expression des gènes

Interaction protéine -ADN

Interaction protéine – ADN

Quelques chiffres sur le génome

• Exons 1.1 % du génome

• Introns 70 % du génome

• Partie avec fonction inconnue 80%

• Gènes protéiques 5%

• Gènes d’ARN spécifiques (ARNt,r) <2%

• Gènes régulateurs (réplicateurs, recombinateurs,

ségrégateurs) # 10%

Identifier les gènes spécifiques d’un tissu

ADNTous les gènes

possibles

Tous les gènes

nécessaires

EST Libraries construction

Collection d’ESTs

Suivre l’expression des gènes

La Bioinformatique

• Les domaines explorés sont– Génomes

– Transriptomes

– Protéomes

– Physiome

Les séquences

• Définition: suite de constituants unitaires des chaînes moléculaires représentées par un code lettre dans un chaîne de caractères.

• Ex: ADN suite de ATCG• Ex : protéine suite des 20 AA

Sont les objets manipulés le plus par les bioinformaticiens.

Exemple de séquence

>mutant 1

MVSKLSQLQTEHLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAEL

PNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVK

SYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHA

GQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAE

CIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLAMDTYSGPPPGPGPGPALP

AHSSPGLPPPALSPSKVHGVRXGQPATSETAEVPSSSGGPLVTVSTPLHQVSPTGLEPSH

SLLSTEAKLVSAAGGPLPPVSTLTALHSLEQTSPGLNQQPQNLIMASLPGVMTIGPGEPA

SLGPTFTNTGASTLVIGLASTQAQSVPVINSMGSSLTTLQPVQFSQPLHPSYQQPLMPPV

QSHVTQSPFMATMAQLQSPHALYSHKPEVAQYTHTGLLPQTMLITDTTNLSALASLTPTK

QVFTSDTEASSESGLHTPASQATTLHVPSQDPAGIQHLQPAHRLSASPTVSSSSLVLYQS

SDSSNGQSHLLPSNHSVIETFISTQMASSSQ

Séquence de protéine au format fasta

Comparaison de séquences

Les outils d’alignement

Exemple d’alignement

Score = 1213 bits (612), Expect = 0.0

Identities = 621/624 (99%)

Strand = Plus / Plus

Query: 374 aagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctc 433

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Sbjct: 134 aagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctc 193

Query: 434 gttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcg 493

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct: 194 gttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcg 253

Query: 494 ttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaa 553

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct: 254 ttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaa 313

Query: 554 agctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatg 613

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Sbjct: 314 agctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatg 373

Les médicaments