les enzymes : outils de biologie moléculaire enzymes de restriction: endonucléases kinases:...
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Les enzymes : outils de biologie moléculaire
• Enzymes de restriction: endonucléases
• Kinases: ajoutent un phosphate (P*)
• Phosphatases: retirent un phosphate
• Ligases: joignent un OH et un phosphate
• ADN Polymérase: ADN => ADN
• Reverse transcriptase : ARN => ADNc
Nomenclature des enzymes de restriction
Tailles des séquences inclusesTailles des séquences incluses
–Plasmide bactérien ( 3-4 kb )Plasmide bactérien ( 3-4 kb )
–Phage Phage λλ ( 9-22 kb )( 9-22 kb )
–Cosmide ( Cosmide ( ≈ ≈ 45 kb )45 kb )
–PAC : P1-derived Artificial Chromosome ( 75-95 PAC : P1-derived Artificial Chromosome ( 75-95 kb )kb )
–BAC : Bacterial Artificial Chromosome ( 100-350 BAC : Bacterial Artificial Chromosome ( 100-350 kb )kb )
–YAC : Yeast Artificial Chromosome ( 300-1000 kb YAC : Yeast Artificial Chromosome ( 300-1000 kb ))
Vecteurs de clonage
NOMBRE DE CLONES A OBTENIR
PROJET PUBLIC: ETAPE 1
PROJET PUBLIC: ETAPE 2
PROJET PRIVE : CELERA
– Amplification d’ADN.
– Base pour différentes techniques de biologie moléculaire :
• Séquençage
• Amplification de l’ADN pour le clonage
• mutation ponctuelle
• « differential display »
• préparation d’ADNc « RT-PCR »
• détermination de polymorphisme entre génomes (RFLP…)
• ….
PCR : Polymerase Chain Reaction
Séquençagenucléotide : méthode de Sanger
• ddNTP : analogues structuraux des dNTP.• ddNTP : incapables de réaliser une liaison phosphodiester.• ADN polymérase incorpore dNTP ou ddNTP.
Séquençagenucléotide : méthode de Sanger
Séquençage : Méthode de SangerÉlectrophorèse
Séquençagenucléotide : méthode de Sanger
• Liaison de l’amorce avec l’ADN à séquencer.
• La fixation des ddNTP aux brins d’ADN va créer des brins de différentes tailles.
• Les brins vont migrer sur un gel d’électrophorèse selon leur taille : le plus petit migre le plus vite.
Séquençagenucléotide : méthode de Sanger
Séquençagenucléotide : méthode de Sanger
• Automatisation de la méthode :
– Ajout sur les ddNTP de fluorochrome de différentes couleurs.
– 1 seul tube regroupant les ddNTP.– Lecture par un laser des fragments qui migrent sur le
gel.– Stockage des données dans la mémoire de l’ordinateur.
Séquençagenucléotide : méthode de Sanger
Les ddNTPs fluos
Séquençagenucléotide : méthode de Sanger
Automatisation
• Séquençage sur capillaires :megabace
• Permet de séquencer 96 ou 386 échantillons en parallèle
RESTE A LIRE LA SEQUENCE ET COMPRENDRE
TOUTES LES INFORMATIONS CONTENUES
DANS LE GENOME
ANNOTATION DU GENOME
Comment fonctionne le génome
Quelle est l’organisation du génome?
Comment est lue l’information contenue dans
le génome?
Mise en place du programme génétique
Paradoxe !!!!
Complexité du génome Humain
• Taille 3 200 Mb pour 30 000 gènes
• Nature répétitive– Séquences répétées localement
• ADN satellite
– Séquences répétées dispersées• SINES (Short Interspersed Repeated Sequences)
– Ex: ALU, 300 pb tous les 6000 nucleotides• LINES (Long Interspersed Repeated Sequenes)
– Ex: L1, 5 kb, 100 000 copies dans génome
• Rôle de l’ADN non génique ???– Régulation globale de l’expression des gènes– Nucléosquelette
Complexité du génome humain
• Pourquoi les gènes sont dispersés?
• Pourquoi autant de répétitions?
• Pourquoi les gènes sont morcelés?
• Toutes les parties du génome sont elles utilisées dans toutes les cellules?
• Le génome évolue t-il avec la spécialisation des cellules?
Epissages alternatifs
Complexité du génome humain
• Pourquoi les gènes sont dispersés?
• Pourquoi autant de répétitions?
• Pourquoi les gènes sont morcelés?
• Toutes les parties du génome sont elles utilisées dans toutes les cellules?
• Le génome évolue t-il avec la spécialisation des cellules?
Initiation de la transcription
Répresseur
Activateurs
FT
FT
FT
Promoteur basal
Facteurs d’initiation
RNA Pol II Région codante
Coactivateurs
Régulation du niveau d’expression des gènes
Interaction protéine -ADN
Interaction protéine – ADN
Quelques chiffres sur le génome
• Exons 1.1 % du génome
• Introns 70 % du génome
• Partie avec fonction inconnue 80%
• Gènes protéiques 5%
• Gènes d’ARN spécifiques (ARNt,r) <2%
• Gènes régulateurs (réplicateurs, recombinateurs,
ségrégateurs) # 10%
Identifier les gènes spécifiques d’un tissu
ADNTous les gènes
possibles
Tous les gènes
nécessaires
EST Libraries construction
Collection d’ESTs
Suivre l’expression des gènes
La Bioinformatique
• Les domaines explorés sont– Génomes
– Transriptomes
– Protéomes
– Physiome
Les séquences
• Définition: suite de constituants unitaires des chaînes moléculaires représentées par un code lettre dans un chaîne de caractères.
• Ex: ADN suite de ATCG• Ex : protéine suite des 20 AA
Sont les objets manipulés le plus par les bioinformaticiens.
Exemple de séquence
>mutant 1
MVSKLSQLQTEHLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAEL
PNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVK
SYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHA
GQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAE
CIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHKLAMDTYSGPPPGPGPGPALP
AHSSPGLPPPALSPSKVHGVRXGQPATSETAEVPSSSGGPLVTVSTPLHQVSPTGLEPSH
SLLSTEAKLVSAAGGPLPPVSTLTALHSLEQTSPGLNQQPQNLIMASLPGVMTIGPGEPA
SLGPTFTNTGASTLVIGLASTQAQSVPVINSMGSSLTTLQPVQFSQPLHPSYQQPLMPPV
QSHVTQSPFMATMAQLQSPHALYSHKPEVAQYTHTGLLPQTMLITDTTNLSALASLTPTK
QVFTSDTEASSESGLHTPASQATTLHVPSQDPAGIQHLQPAHRLSASPTVSSSSLVLYQS
SDSSNGQSHLLPSNHSVIETFISTQMASSSQ
Séquence de protéine au format fasta
Comparaison de séquences
Les outils d’alignement
Exemple d’alignement
Score = 1213 bits (612), Expect = 0.0
Identities = 621/624 (99%)
Strand = Plus / Plus
Query: 374 aagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctc 433
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Sbjct: 134 aagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctc 193
Query: 434 gttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcg 493
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Sbjct: 194 gttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcg 253
Query: 494 ttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaa 553
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Sbjct: 254 ttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaa 313
Query: 554 agctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatg 613
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Sbjct: 314 agctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatg 373
Les médicaments