la green fluorescent protein (gfp), une protéine incontournable pour limagerie du vivant exemples...
Post on 03-Apr-2015
120 Views
Preview:
TRANSCRIPT
La Green Fluorescent Protein (GFP), une protéine incontournable pour l’imagerie du vivant
Exemples d’applications à l’étude du développement végétal
Biologie Cellulaire
François Roudier
Equipe Différenciation et Identité Cellulaire
Aequorea victoria : ”l’inventeur” de la GFP
La GFP : une protéine fluorescente par transfert d’énergie
La GFP : une structure en lanterne et un fluorophore protéique auto-catalytique
- 238 aa (26 kDa), N- et C-terminal accessibles
- Forte stabilité : résiste à 65C, à pH entre 5,5-12,2, 8M urée, 1% SDS, protéases (2j)
De la GFP sauvage à la GFP “améliorée”
Un outil versatile pour l’étude du vivant…
Plusieurs mutations ont été introduites pour :
- Optimiser l’expression de la protéineUsage optimal des codons et élimination d’un intron cryptique (20X plus de protéine)Maturation du fluorophore (4X plus vite)
- Modifier les propriétés spectrales de la protéinePic d’excitation unique à 490 nmBrillance (X6)
La GFP : une protéine non toxique pour des méthodes de visualisation non invasives
Variants de la GFP et autres protéines fluorescentes
CFP GFP YFP (DsRED) RFP
Discosoma striata
Des protéines fluorescentes avec différentes propriétés spectrales
Une plante modèle: Arabidopsis thaliana
Embryon
Adulte
Zygote
PlanteAnimal
Le développement végétal est essentiellement post-embryonnaire et résulte de l’activité constante des méristèmes
Organogenèse et Croissance indéterminée
L1L2L3MMZPZPfeuilleprimordiumZCméristème
plantuleArabidopsis
adulte
Méristème apical
Méristème racinaire
Les méristèmes contiennent les cellules souches et sont organisés en domaines fonctionnels
Exemples d’application de la technologie GFP à l’étude du développement des plantes
- Profil d’expression d’un gène
Localisation subcellulaire
Interaction protéine-protéine (FRET)
pPromoteur:GFP (fusion transcriptionnelle)
- Etude fonctionnelle d’une protéine pPromoteur:CDS::GFP(fusion traductionnelle)
Mouvement
- Biosenseurs
Cell types in the Arabidopsis root meristem
lateral root cap
columella
cortexepidermis
stele endodermis
quiescent center (QC) cortex/
endodermis initial
Division asymétrique
Le méristème racinaire : une organisation dépendante de divisions stéréotypées des cellules souches
Wild type
corend
scarecrow(scr)
cor+end
short-root(shr)
cor
Deux mutants déficients dans la mise en place et la différenciation de l’endoderme
Expression de SCR dans la racine
GFP gene
Promoteur SCR
ARN GFP
Protéine GFP
GFPpSCR
QC
endodermis
cortex
c/e initiale
Localisation de la protéine de fusion SCR::GFP
SCR gene
ARN
SCR::GFP
Promoteur SCR
GFP
QC
endodermis
cortex
c/e initiale
pSCRGFPSCR
(Complémentation du mutant scr)
QC
endodermis
cortex
c/e initialeQC
endodermis
cortex
c/e initiale
SCR est nécessaire pour la mise et place et la différenciation de l’endoderme dans la racine
pSCRGFPSCRGFP
pSCR
GFPpSHR
GFPSHRpSHR
st
en
coep
inqc
st
en
coep
inqc
SHR contrôle la mise et place et la différenciation de l’endoderme dans la racine de façon non cellule-autonome …
… La protéine SHR bouge de la stèle vers l’endoderme !
pSCR:GFPPlantules in vitro
Récolte pointe racinaire (15000)
Digestionparoi
Triage par fluorescence des protoplastes GFP+
Extraction ARNAmplification
Marquage des sondes
Hybridation
Puce Affymetrix ATH125K gene arrays
Analyse du transcriptome de l’endoderme racinaire
300 000 protoplastes
Collection de marqueurs spécifique d’un type cellulaire
Pericycle
Endo-dermis
Lateral rootcap
Epidermis
QC
Endo+Cortex
Le méristème apical caulinaire
Le méristème apical caulinaire : Une zonation fonctionnelle pour la croissance, l’organogenèse et auto-maintien
ZC
ZM ZMZM
Auto maintien
Tige
Organes latéraux
Feuille
Jeune feuille
Primordium
P
Le méristème apical caulinaireUne organogenèse dynamique et structurée
QuickTime™ et undécompresseur TIFF
sont requis pour visionner cette image.
Vue d’avion
Cinétique sur 65h
Acquisition toutes les 2h30
SHOOT MERISTEMLESS LEAFYAINTEGUMENTA
CLAVATA3 ATML1
CLAVATA1 CUP-SHAPED COTYLEDONSWUSCHEL
Marqueurs moléculaires des zones fonctionnelles et identités cellulaires du MAC
pANT:GFP, un marqueur de l’initiation et de la mise en place des primordia foliaires
pANT:GFP
Coloration vitale + pANT::GFP
Dynamique de la différenciation des primordia : recrutement puis prolifération
T = 0h
T = 48h
pANT:GFP
T = 24h
T = 32h
après le recrutement : prolifération cellulaire
Dynamique de la différenciation des primordia : recrutement puis prolifération
P7P4
P5P3
P6P2
P1
Phyllotaxie : initiation des primordia en 3D
P0Une disposition en spirale prédictible
Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs
Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs
Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs
L’auxine, une phytohormone transportée de façon polarisée,
est impliquée dans le contrôle de la phyllotaxie
Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs
AIA-H++
Sen
s d
u
TP
A
AIAH
PINPIN
AIAH
AUXAUX
Transporteur d’influx(membrane apicale)
Transport polarisé de l’auxine (AIA): Localisation des transporteurs à l’aide de FPs
pAUX1:AUX1::YFPAUX1::YFP
pPIN1:PIN1::GFP
Transporteur d’efflux(membrane basale)
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Auxine
Modèle du contrôle de la phyllotaxie par PIN1 et des flux d’auxine (DR5:GFP)
(pDR5 : 9 x AuxREs)
pDR5:GFP Un senseur transcriptionnel de l’auxine
P0
P1P2
P3
Gradients locaux d’auxine par pompage
Interaction entre deux protéines
D AAD
1- Compatibilité spectrale des fluorochromes
2- Proximité moléculaire des fluorochromes
Mesure de l’interaction entre deux protéines par"Fluorescence Resonance Energy Transfert » (FRET)
GFP RFP
Co-localisation de deux protéines…
Application de la technology FRET au vivant :la protéine caméléon, un biosenseur du calcium
Mesure ratiométrique de flux calciques chez le ver, C. elegans
Mesure ratiométrique de flux calciques chez le ver, C. elegans
[Ca2+] forte
[Ca2+] faible
YFP/CFP élevé
(FRET max)
YFP/CFP faible
(peu de FRET)
[Ca2+] nulle
CFP séparée de YFP
(pas de FRET)
Excitation 440 nm
QuickTime™ et undécompresseur Video
sont requis pour visionner cette image.
Exemples d’application de la technologie GFP
- Profil d’expression de gènesLocalisation subcellulaire
Interaction protéine-protéine(FRET)
- Etude fonctionnelle de protéines Mouvement
- Biosenseurs
Limites :- Sensibilité (difficile de détecter les gènes faiblement exprimés)- Ajout d’une protéine (encombrement, environnement bio)- Panoplie de FPs encore limitée
Quelques limites
LHP1::GFP
QuickTime™ et undécompresseur Video
sont requis pour visionner cette image.
Début de floraisonTransformation de la lignée
germinale
Sélection des transformants à partir des graines
Principe de transformation génétique stable chez les plantes
Eta
pes
de
déve
lopp
emen
t
Assises cellulaires
In situ “digitale” des différents types cellulaires de la racine
top related