des bio-puces pour la mesure des contaminations microbiennes. outils de mesure des contaminants des...

Des bio-puces pour la mesure des contaminations microbiennes

Delphine Guillebault

13 novembre 2013

Des dinoflagellés Des diatomées

Des efflorescences d’algues toxiques

La biologie moléculaire, des bases de

données, des technologies de pointes

La diversité microbienne, les

empreintes génétiques et

chimiques

L’eau est le vecteur de nombreux microorganismes

ayant un impact sociétal et économique fort

Des bactéries

Des contaminations bactériennes

** *

• Révision des standards microbiologiques CE en 2015

• Augmentation de la population mondiale, réchauffement climatique avec (ré-) émergence de microorganismes indésirables pour l’homme

• Les questions:

Quelle qualité des eaux de consommation, d’élevage et récréatives?

Les réservoirs naturels?

Le recyclage de l’eau?

La réutilisation des eaux industrielles?

Des enjeux environnementaux…

Un individu

Des gènes

Des séquences

Une identité

Le principe des bio-puces

Quiestlàetcombiensont-ils?

Aujour’huiencatalogue:

Zig,Puce,Jules,Jimetc….

Ungène

Uneséquence

Uneiden té! "#$%"&$

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Une population

= un assemblage

d’individus

Un assemblage

d’individu

= un assemblage

d’identité

Le principe des bio-puces

Reconnaissance des

séquences par une sonde

spécifique

Sondes hiérachiques:

Groupe

phylum

Classe

Genre

Espèces

Contrôle interne de présence de la cible

Choix d’un gène reconnu pour ses propriétés phylogénétiques:

• molécule possédant des régions très conservée entre les différentes

espèces et moins conservée

• Ubiquiste: présent chez tous les organismes vivants

• Peu de transfert horizontal

• Très abondante

• Bases de données très riches et bien alimentées

Développement et/ou adaptation de sondes ciblant des micro-organismes d’intérêt

Ensemble de séquences

uniques

Isolation des messagers RNA

Marquage

Fluorescent des RNA

Hybridation

sur la bio-puce

Échantillon

environnemental

ou issu de culture

Plus le signal

fluorescent est fort

plus la cible est

présente en grande

quantité

En pratique…. L’identification d’espèces à l’aide de sondes

Indicateur

d’activité

Lame dotée d‘un revêtement

spécifique

Sondes immobilisées

(Oligonucleotides,

PCR-Fragments, cDNA)

ARN marqué

fluorescent

En pratique… Schéma d’une expérience d’hybridation de bio-puce

En pratique…

Les résultats obtenus

Objectifs:

Designer des sondes spécifiques ciblant des cyanobactéries et des diatomées toxiques, des

bactéries, virus et protozoaires pathogènes

=> participer aux efforts européens de surveillance des eaux côtières en matière de pathogènes véhiculés par l’eau douce à travers l’évaluation de la qualité microbiologiques de l’eau

Le projet européen MicroAQUA 7th Framework Programme

Theme: Innovative aquatic biosensors

Group Pathogen

2stepdetectionrRNA

andtoxingeneon

micro-arrayglassclide

Standardprobeon

microtiterplateassay

Standardprobeon

microarrayglassslide

Standardprobeto

designedand

validated

Bacteria Campylobacter √

E.coliO157:H7 √

Legionella √

Mycobacterium √

Salmonella √

Shigella √

Aereomonasspp. √

Bacilluscereus1 √

Clostridiumbotulinum √

Clostridiumperfringens √

Listeriamonocytogenes √

Pseudomonaspp. √

Staphylococcusaureus √

Vibriospp. √

Yersiniaenterocolitica √

Cyanobacteria Microcystisaeruginosa x

Planktonthrix x

Nodulariaspumigena x

Anabaenaspp. x

Aphanizomenonflos-aquae x

Cylindrospermopsis x

Les micro-organismes ciblés dans ce projet:

Une bio-puce dédiée à la

détection et la

quantification de

nombreuses cibles

microbiennes

La finalité du projet

Set de sondes spécifiques de

chaque cibles

Sondes hiérarchiques:

Groupe

phylum

Classe

Genre

Espèces

Impression des sondes sur

un support

Commercialisation de la bio-puce AQUA prévue 2015-2016

Grille

Super-grille

Cluster de

Super-grille

Dupliqua

Du cluster de

Super-grille

L’organisation d’une bio-puce

Impression des sondes sur

un support

Plusieurs millions de

spots (NimbleGen

Systems, Affymetrix,

Agilent Technologie)

Toxine Anticorps

+ =

SPR CHIP SURFACE

Plus le signal est faible, plus il y a de

toxines dans l’échantillon

Un autre type de puce: les puces ciblant les toxines

• Acide okadaïque

• Acide domoique

• Neosaxitoxine

• Saxitoxine

• Microcystine

• Anatoxines

• Cylindrospermopsines

• Nodularines

Les toxines détectées à l’aide de puces

• Pyroséquençage 454: délai de plusieurs semaines

• Spectrométrie de masse: réponse en plusieurs jours et coût élevé

• Microscopie (LM & SEM): temps et expertise taxonomique, faible nombre

d’échantillons

• Hybridation FISH: une espèce à la fois parfois deux

• qPCR limitée à 8 espèces maximum (multiplexe), inhibitions fréquentes des

réactions d’amplification

Les avantages des bio-puces sur les autres méthodes

Bio-puces

• Nombre illimité d’espèces déposées sur la bio-puce avec possibilité

d’étudier facilement les nouvelles espèces

• Coût raisonnable 40 € par échantillon avec 2 réplicas et un nombre

d’espèces très important

L’accès à ces technologies?

Une jeune société créée en Avril 2013 co-fondée par les Drs Carmem-Lara Manes et Delphine Guillebault (Présidente):

Microbia Environnement

R&D

Commercialisation

produits

Prestation de services

Bio-puce diagnostic

algues toxiques,

microorganismes

pathogènes

Développement de bio-

puce et biocapteurs

diagnostic et aide au

transfert de technologies

similaires

Diagnostic biologique

et caractérisation

phylogénétique d’un

environnement naturel

ou industriel à façon

Vente de la bio-puce MIDTAL ou de

la prestation MIDTAL pour la

surveillance des algues toxiques

contact@microbiaenvironnement.com

Prestations de services: diagnostic, identification,

surveillance, valorisation, projets à façon

Développement technologique d’outils moléculaires de

détection

Commercialisation de bio-puces de diagnostic

Merci de votre attention