cours franco-québécois d’enzymologie avancée...

Inhibition des réactions

enzymatiques

Cours Franco-Québécois d’Enzymologie Avancée

Dr. Laurent SalmonLaboratoire de Chimie Bioorganique et Bioinorganique (LCBB)

Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d’Orsay (ICMMO)

CNRS-UMR 8182, Directeur : Pr. Jean-Pierre MahyCentre Scientifique d'Orsay, Université Paris-Sud, bât. 420, 91405 Orsay Cedex, France

laurent.salmon@u-psud.fr

Bibliographie générale

Livres :

• L. Stryer : "Biochemistry" ( 3rd ed., Freeman)

• T. E. Creighton : "Proteins" (2nd ed., Freeman)

• D. Voet & J. G. Voet : "Biochimie" (2nd ed., DeBoeck Université)

• J. Pelmont : "Enzymes" (Presses Universitaires de Grenoble)

Sites internet/Bases de données :

• Entrez-PubMed : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/

• Expasy : http://www.expasy.ch/

• Protein Data Bank : http://www.rcsb.org/pdb/

• Brenda : http://www.brenda-enzymes.info/

• EzCatDB : http://mbs.cbrc.jp/EzCatDB/

• Enzyme Nomenclature : http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/

• Propka Web Interface : http://propka.ki.ku.dk/

Abbréviations utilisées

AS : activité spécifique

AT : activité totale

E : enzyme libre

EI : complexe enzyme-inhibiteur

EP : complexe enzyme-produit

ES : complexe enzyme-substrat

ESI : complexe enzyme-substrat-inhibiteur

I : inhibiteur

Ic : inhibiteur compétitif

Iirr : inhibiteur irréversible

kcat : constante catalytique

Ki : constante d'inhibition

Km : constante de Michaelis

P : produit

S : substrat

TO : turn-over

U : unité enzymatique (UI)

Vmax : vitesse maximale

Vo : vitesse initiale

Plan du cours

1. Présentation1.1. Généralités

1.2. Différents types cinétiques d’inhibiteurs d'enzymes

1.3. Intérêts et usages des inhibiteurs d’enzymes

1.4. Exemples d’agents thérapeutiques inhibiteurs d’enzymes

2. Inhibition réversible : généralités et cinétique2.1. Inhibition compétitive

2.2. Inhibition incompétitive (et par excès de substrat)

2.3. Inhibition non-compétitive pure

2.4. Inhibition non-compétitive mixte

3. Inhibiteurs réversibles : structure et mécanisme3.1. Inhibiteurs analogues de substrat

3.2. Inhibiteurs analogues de l’état de transition

3.3. Abzymes

4. Inhibiteurs irréversibles4.1. Marqueurs d'affinité

4.2. Inhibiteurs suicides

Cinétique de Michaëlis-Menten (rappels) :

E + S ESk1

E + Pk2

1. Présentation

1.1. Généralités

[E][S]

Constante de Michaelis-Menten

[S]VVo

Vitesse initiale

cat2 kk

[E][S]

Constante de dissociation

de ES en E + S

1. Equilibre rapide entre E + S et ES et k2 lente :

2. Hypothèse de l’état quasi-stationnaire :

[S]VVo

Equation de Michaelis-Menten

Km = KS si k2 « k-1

[E]T = [ES] + [E]

Vmax = kcat[E]T

Vo = kcat[ES]

Inhibiteur d’enzyme (I) :

-Entité l’activité enzymatique ( la vitesse d’une réaction enzymatique) :

-En se liant à l’enzyme, un inhibiteur peut :

• empêcher la fixation de S au site actif,

• provoquer une déformation du site actif (notamment à l’état de transition) et rendre

l’enzyme moins active (voire inactive) vs S.

-L’affinité de I pour E est traduite par la constante d’inhibition Ki :

• Ki = cte de dissociation de EI en E + I (unité : M),

• Ki = [I] pour laquelle la moitié des sites enzymatiques est occupée,

• + Ki est petit, + l’affinité de I pour E est grande,

• Inhibiteur « idéal » : forte affinité (Ki petit) pour E et forte sélectivité vs S (Km/Ki

grand).

[E][I]

kKE + I EI

VoVo I

Exemple : PGI µM 200F6P

nM 2005PAH

iK1000im KK

Conception des inhibiteurs :

-Beaucoup d'inhibiteurs (médicaments) ont été trouvés par hasard !

-Ethnopharmacologie

-Criblage à haut débit (HTS ou High Throughput Screening) de produits naturels ou

synthétiques (chimiothèques…)

-Criblage virtuel (screening « in silico »)

-Conception d’un I vs E ciblée par docking

Nature des inhibiteurs :

-Analogues de S (ou P)

-Analogues de l’ET ou IHE

-Complexants de métaux (EDTA…)

-Structures diverses (généralement trouvés par hasard)

« Mimes » : qui ressemblent à… sans être eux-mêmes transformés

Inhibition non-compétitive (IC50 = 3 nM) d’une protéine kinase (CK2) par un composé de type polyoxométallate (POM).

Chem. Biol., 2008, 15, 683-692

1.2. Différents types cinétiques d’inhibiteurs d'enzymes

Inhibiteurs réversibles :

-Liaison non-covalente (ou covalente) peu stable de l’inhibiteur à l’enzyme (complexes

EI, ESI).

-L'inhibition est réversible (peut être levée), i.e. l’enzyme n’est pas irréversiblement

inhibée :

• Inhibiteurs compétitifs

• Inhibiteurs incompétitifs (et inhibition par excès de substrat)

• Inhibiteurs non-compétitifs purs

• Inhibiteurs non-compétitifs mixtes

Inhibiteurs irréversibles :

-Liaison covalente (ou non-covalente) stable de l’inhibiteur à l’enzyme (complexe E-I)

-Inhibition ne peut pas être levée (inactivation l’enzyme est irréversiblement inhibée) :

• Marqueurs d'affinité

• Inhibiteurs suicides (ou mécanistiques)

• Cas particulier : inhibiteurs dits à interaction lente et/ou à forte affinité :

inhibition non-covalente mais quasi-irréversible (slow-binding, tight-binding

inhibitors)

1.3. Intérêts et usages des inhibiteurs d’enzymes

Recherche fondamental :

-Etudes cinétiques des mécanismes enzymatiques :

• Mode d'interaction d'un inhibiteur ?

• Stoechiométrie et mécanisme de l'inhibition ?

• Effet de l'inhibiteur sur les paramètres cinétiques Km et Vmax (Kmapp, Vmax

• Efficacité d'un inhibiteur (Ki vs Km)

• Comparaison de l'efficacité de ≠ inhibiteurs sur une cible (comparaison des Ki )

• Comparaison de l'efficacité d’un inhibiteur sur ≠ cibles (comparaison des Ki )

4PEA 0.028 1.7

4PEH 0.029 0.057

Ki (mM) Ki (mM)

Inhibiteur SoRpiA MtRpiB

SoRpiA : Rpi d’épinard, type AMtRpiB : Rpi de Mycobacterium tuberculosis, type B

Exemple : Etudes d’inhibition de ribose-5-

phosphate isomérases (Rpi) de type A et B

R5P (Km) 7.5 2.5

-Etudes cristallographiques des enzymes (complexes EI cristallisés) :

• Nature et rôle des résidus du site actif

• Mode de fixation du substrat (→ I analogues de S/P)

• Mode de fixation des intermédiaires réactionnels (→ I analogues de IHE/ET)

• Fonctionnement de l’enzyme (mécanisme)

-Etudes de métabolismes (rôle d’une enzyme dans un processus métabolique)

-Génération d’abzymes (anticorps catalytiques) :

• Enzymes artificielles générées par un organisme en réaction à la présence

d’un antigène (inhibiteur analogue de l’ET appelé « haptène »)

PDB 1G98

Biochemistry 2001, 40, 1560-1566

Complexe EI RmPGI-5PAA

Applications thérapeutiques :

-Enzymes : cibles de choix

-Utilisation biomédicale des inhibiteurs : bien avant de connaître les enzymes !

-Difficulté : spécificité de l’enzyme inhibée : souvent, les cellules « cibles » et « hôtes »

possèdent les "mêmes" enzymes (→ parasites, cellules cancéreuses…)

-Correction d’un métabolisme défectueux :

• Hypocholestérolémiant (vs excès de cholestérol)

• Antidiabétique (hypoglycémiants)

-Correction d’un "désordre physiologique" :

• Antidépresseurs

• Antiépileptiques

• Antihypertenseurs

• Antihistaminiques (vs effets de l’histamine produite lors de réactions allergiques)

• Antipyrétiques (vs fièvre)

• Analgésiques (vs douleur)

• Antiinflammatoires

Environnement :

-Lutte contre les plantes parasitaires, les insectes et les champignons (xylophages…)

• Herbicides

• Insecticides

• Fongicides

Armes chimiques (!) :

-Neurotoxiques (gaz Sarin, Tabun) : → I irrév. d’une enzyme du SNC

-Vésicants (gaz Moutarde/Hypérite) : → irritants (peau, yeux, muqueuses…)

-Destruction d’un organisme pathogène :

• Antiparasitaires (paludisme, trypanosomiases…)

• Antibactériens

• Antifongiques (vs champignons)

• Anticancéreux

• Antiviraux (antirétroviraux) (vs maturation des virus, interaction virus-cible…)

Pesticides (produits phytosanitaires)

Sarin Tabun

1.4. Exemples d’agents thérapeutiques inhibiteurs d’enzymes

http://www.wellesley.edu/Chemistry/Chem101/hiv/HIV-2.html

Infection par le VIH

Ritonavir

Trithérapie

-4 cibles dont 2 principales ; d’autres multi-thérapies existent

-résistances vs RT du VIH

(vs résistances)

Ritonavir®

Ic Protéase (VIH)

Zidovudine®

3’-azido-2’,3’-dideoxy-thymidine (AZT)AZT-TP :

Ic Transcriptase Inverse (VIH)

Aciclovir®

Aciclovir-TP :Ic ADN Polymérase (Herpes, VZV)

Antiviraux (antirétroviraux)

P OP P

AZT AZT

AZT-TP

kinases

2’,3’-dideoxy-cytidine (ddC) ddC-TP :

Ic Transcriptase Inverse (VIH)

P OP P

Antibactériens

Triméthoprim®

Ic Dihydrofolate ReductasePénicillineIirr Transpeptidase(paroi cellulaire bactérienne)

Sulfaméthoxazole®

Ic Dihydroptéroate Synthase

Autres activités

Kétoconazole®

AntifongiqueIc C14 -Demethylase à CytP450(biosynthèse de l’ergostérol de la paroi cellulaire des champignons)

Méthotrexate®

AnticancéreuxIc Dihydrofolate Reductase

Bactrim®

AspirineAnalgégique, antipyrétique, antiinflammatoireIirr Prostaglandine Synthase (Cyclooxygénase)

IsocarboxazideAntidépresseurIirr (suicide) Monoamine Oxidase

Allopurinolvs goutte/calculs rénauxIc Xanthine oxydase(biosynthèse acide urique)

Autres activités (suite)

CaptoprilAntihypertenseurIc Enzyme de Conversionde l’Angiotensine (ACE)

MévinolineHypocholestérolémiantIc Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase

2. Inhibition réversible : généralités et cinétique

2.1. Inhibition compétitive

Fixation réversible exclusive

Différents modèles de l’inhibition compétitive :

A. Modèle classique : S et I ont le même site de fixation

Arg304

Lys310

Ser109 Gln111

His113

His285

Glu138

S et I sont en compétition vs site actif

de part leur analogie de structure.

Site actif de la phosphomannose

isomérase (PMI)

Bioorg. Med. Chem. 2009, 17, 7100-7107

B. Modèles alternatifs : les sites de fixation de S et I sont distincts

L’encombrement stérique de I

empêche la fixation de S

S et I ont un groupe en commun

qui se fixe sur un 3ème site

Les sites de fixation de S et I

se recouvrent

Régulation allostérique :

La fixation de I induit un

changement de conformation de

l’enzyme qui déforme ou

masque le site de fixation de S

(et inversement)

"Enzyme Kinetics " I. Segel (1975), Ed. J. Wiley & Sons, Inc.

Exemples :

-aspartate transcarbamylase

-glutamine synthétase

• S et I sont en compétition pour leur fixation sur E (inhibition exclusive)

• L’affinité apparente de E : Kmapp

• I peut être déplacé par un excès de S : Vmax n’est pas modifié

[E][S]mK

[E][I]iK Vo = kcat[ES][E]T = [E] + [ES] + [EI]

Cinétique de l’inhibition compétitive (rappels) :

Vmax/2

Km Kmapp

[I] > 0

[S][I]

[S]VVo

avec m

app [I]1 K

Inhibition compétitive : Vo = f([S])

[S]VVo

appmax

mKsoit

Km/Vmax

1/Vmax +

-1/Km1app

sans inhib.

Km1app/Vmax

Inhibition compétitive : 1/Vo = f(1/[S]) (Lineweaver-Burk)

[I]3 > [I]2 > [I]1

pente =max

oao = 1/Vmax

pente et oao = cte lorsque [I]

Inhibition compétitive (Lineweaver-Burk)

représentation secondaire : pente = f([I])

-Ki[I]

pour pente = 0, [I] = -Kipentei =

VoI/Vo

[I]IC50

Mesure du paramètre IC50

IC50 = [I] pour VoI = Vo/2

IC50 = conc. d’inhibiteur pour laquelle Vo mesurée (VoI) = 50% Vo sans inhibiteur :

(mesure réalisée généralement à [S] = Km)

Inhibition compétitive : (IC50 = 2 Ki pour [S] = Km)i

i[S]IC50 K

2.2. Inhibition incompétitive

Un inhibiteur incompétitif (uncompétitif) ne se fixe que sur le complexe ES (le site de fixation de I est induit par celle de S) :L’affinité de E pour S (induit par la formation de ESI) : Kmapp

E apparaît moins active (à cause de ESI, inactif) : Vmaxapp

[E][S]mK

Si [S] >> Km :

[E]T = [ES] + [ESI]

Vmaxapp = kcat([E]T - [ESI])

(< Vmax)

[ES][I]iK Vo = kcat[ES]

[E]T = [E] + [ES] + [ESI]

[S][I]

maxapp

[S]VVo

appmaxapp

Inhibition incompétitive : Vo = f([S])

avec et

• Lineneaver-Burk nous donne :

pente = cte et oao lorsque [I]

[I]1oao

Km/Vmax

1/Vmax

-1/Km1app

sans inhib.[I]1[I]2[I]3

1/Vmax1app

(IC50 = 2 Ki pour [S] = Km)

[S]IC50 K

Inhibition incompétitive : 1/Vo = f(1/[S])

pente = Km/Vmax

Inhibition par excès de substrat

• Cas particulier de l’inhibition incompétitive : 2 molécules de S peuvent se lier à E, mais ne peuvent être transformées en P (autorégulation de l’activité enzymatique).

Exemple de l’excès d’acétylcholine vs acétylcholinestérase :

Site allostérique

Site actif

PDB 2HA4

E + S ES E + P

inactif

Bourne et al., J. Biol. Chem. 2006, 281, 29256

Inhibition par excès de substrat (suite)

http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/3CoursINHIBITEURS/6CoursInhib.pdf

[E][S]mK

[ES][S]iK

Vo = kcat[ES]

[E]T = [E] + [ES] + [ESS] i

[S][S]

[S]VVo

2.3. Inhibition non-compétitive pure

• Un inhibiteur non-compétitif peut se fixer sur E et sur ES (mais n’est pas en compétition avec S pour sa fixation à l’enzyme). Il ne peut être déplacé par augmentation de *S+

• E apparaît moins active (à cause de ESI, inactif) : Vmaxapp

• L’affinité de E (et EI) pour S n’est pas modifiée : Km n’est pas modifié (I nc pure)

[EI][S]

[E][S]mK

[ES][I]

[E][I]iK

Vo = kcat[ES]

[E]T = [E] + [ES] + [EI] + [ESI]

Vmax/2

[I] > 0

K avec

maxapp

[S]VVo

maxapp

Inhibition non-compétitive pure : Vo = f([S])

Vmaxapp

Vmaxapp/2

Si [S] >> Km :

[E]T = [ES] + [ESI]

Vmaxapp = kcat([E]T - [ESI])

(< Vmax)

Km/Vmax

1/Vmax

sans inhib.

Km/Vmax1app

Inhibition non-compétitive pure : 1/Vo = f(1/[S]) (Lineweaver-Burk)

pente et oao lorsque [I]

1/Vmax1app

[I]3 > [I]2 > [I]1

pente =max

[I]1oao

IC50 = Ki

2.4. Inhibition non-compétitive mixte

• Par rapport au cas précédent, dans le cas d’un inhibiteur non-compétitif mixte, les affinités de E pour I (Ki) et de ES pour I (K’i) sont .

• Il en résulte que les affinités de E pour S (KS) et de EI pour S (K’S) sont également .

[E][S]mK

[E][I]iK

Vo = kcat[ES]

[E]T = [E] + [ES] + [EI] + [ESI][ESI]

[ES][I]iK'

[EI][S]mK'

k’-1

Deux cas peuvent être distingués :

• Ki > K’i : Kmapp

• Ki < K’i : Kmapp

Dans les deux cas :

• Vmaxapp (à cause de ESI)

[S]α'

[S]VVo

appmaxapp

maxapp

[I]1α

[I]1α'

Inhibition non-compétitive mixte : Vo = f([S])

• Lineneaver-Burk nous donne :

Inhibition non-compétitive mixte : 1/Vo = f(1/[S])

pente =max

pente et oao lorsque [I]

[I]1oao

Km/Vmax

1/[S]1/Vmax

sans inhib.

1Km/Vmax

[I]3 > [I]2 > [I]1

’1/Vmax

Ki < K’i

Km/Vmax

1/[S]1/Vmax

sans inhib.[I]1

1Km/Vmax

[I]3 > [I]2 > [I]1

’1/Vmax

Ki > K’i

Deux modèles alternatifs d’inhibition non-compétitive (mixte)

Ki K’i

EI peut fixer S (pour donner ESI inactif),

mais ES ne peut pas fixer I

ES peut fixer I (pour donner ESI inactif),

mais EI ne peut pas fixer S

Tableau comparatif des inhibitions réversibles

Finalement, les inhibitions compétitive, incompétitive et non-compétitive pure sont des cas particuliers de l’inhibition non-compétitive mixte :

Inhibition Effet sur Vmax Vmaxapp Effet sur Km Km

K’i = compétitive - Vmax Km

Ki = incompétitive Vmax / ’ Km/ ’

Ki = K’i non-compétitive pure Vmax / - Km

Ki > K’i non-compétitive mixte Vmax / ’ Km/ ’

Ki < K’i non-compétitive mixte Vmax / ’ Km/ ’

[I]1α

[I]1α'

3. Inhibiteurs réversibles : structure et mécanisme

3.1. Inhibiteurs analogues de substrats

• Leur structure ressemble à celle du S (ou cofacteur) dans son état fondamental

• Ils sont reconnus par E, sans être transformés (sauf dans le cas des substrats compétitifs)

• Les + courants et les + faciles à concevoir

• Cinétique d'inhibition compétitive

• N'exploitent que l'étape de reconnaissance de S (≠ aux analogues de l'état de transition)

• Sauf cas particulier, sont en général peu efficace (Km/Ki < 10)

• Souvent, il faut [I] >> [S] pour pouvoir entrer en compétition avec le S

Caractéristiques principales :

Structure des inhibiteurs analogues de substrat :

• La fonction réactive de S peut être supprimée ou remplacé par un groupe ne pouvant être transformé : I compétitif classique

• Un groupement de S autre que la fonction réactive peut être supprimée ou remplacé :

- soit I n'est pas transformé : I compétitif classique- soit I est transformé : I compétitif particulier = S compétitif

O- CH3

I analogue du cofacteur

O- CHO

PLP (cofacteur)

fonction

réactive

I analogue de S (2d-G6P)

G6P F6P

fonction

réactive

Exemples d'inhibiteurs analogues de substrat :

Inhibition de l'ornithine décarboxylase

-Enzyme à PLP impliquée dans la biosynthèse des polyamines (métabolites de la division cellulaire)

-Abondantes dans les cellules à division rapide (parasites, cellules tumorales…)

Km/Ki = 5 : moyen

Ornithine décarboxylase

PLPNH2

L-ornithine Putrescine

H HB+B

H2O PLPH2O

CH3COOH

-methyl-L-ornithine

I compétitif : Ki = 19 µm

(autre fonction remplacée)

Km = 100 µm

Inhibition de la dihydroptéroate (DHP) Synthase

• Enzyme présente uniquement chez les bactéries (exemple : M. leprae) : cible idéale !

• Impliquée dans la biosynthèse de l'acide tétrahydrofolique nécessaire à la synthèse des

bases purines, pyrimidines (ADN) et de certains aa

• Inhibiteurs : dérivés sulfonamides (sulfamides)

Sulfaméthoxazole® (Bayer)

I compétitif : Ki = 0,03 M

Km/Ki = 20 ! Bon inhibiteur analogue de S,

et de plus, spécifique (la DHP Synthase

n'existe pas chez l'homme !)

J. Bacteriol. 1999,181, 6814-6821

HN COO-

Dihydroptéridine acide p-aminobenzoïque

Dihydroptéroate

P2DHP Synthase

Km = 0,6 µM

autre fonction remplacée

NH2 COOH NH2 SO2NH

Inhibition de la dihydrofolate réductase

-Biosynthèse de l'acide tétrahydrofolique (suite)

-Enzyme présente chez l'homme et les bactéries (exemple : M. tuberculosis)

Trimethoprim

Km = 20 M

Km/KI = 3

HN COO-

Dihydroptéroate

DihydrofolateSynthase

HN CONH

DihydrofolateRéductase

Dihydrofolate

Tétrahydrofolate

CH COO-

(CH2)2

CONH CH COO-

(CH2)2

Km = 4 µM

Km/Ki = 0,5

Mauvais I, mais sélectivité > efficacité !

H. sapiens : Km = 3 µM, Ki = 41 µM : Km/Ki = 0,07 FEMS Microbiol Lett. 2004, 232, 101-105

I compétitif sélectif de

l'enzyme bactérienne : Ki = 8 M

fonction réactive

remplacée

sélectivité

(pas d’effets secondaires chez l’homme)

Résumé de la biosynthèse du tétrahydrofolate chez les bactéries

acide p-aminobenzoïque

Dihydroptéroate

Dihydrofolate

Tétrahydrofolate

DHP Synthase

DHF Synthase

DHF Réductase

acide folique

(vitamime B9)

mammifères

XTrimethoprim®

Sulfamethoxazole®

Purines

Pyrimidines

Aminoacides

Sulfamethoxazole®+

Trimethoprim®Bactrim®

Bithérapie antibiotique

Methotrexate® (anticancéreux à effets secondaires importants).

-I compétitif "spécial", dit "à forte affinité".

Inhibition de la dihydrofolate réductase (suite)

Methotrexate®

I compétitif : Ki = 6 pM !

DihydrofolateKm = 3 M

Km/Ki = 500 000 !

-En réalité, bien que cet I compétitif soit a priori analogue au S, des études structurales ont

montré qu'il se fixait dans le site actif de la DHF réductase à l'envers vs. S, du fait

d'interactions très favorables fortuites !Arch. Biochem. Biophys. 1971, 142, 417-425

inhibe aussi la DHFR des cellules saines

Cf. C. Blonski : inhibiteurs dits « slow-/tight-binding »

COO-, Na+

Ethylène glycol Oxalate

alcool déshydrogénase

Ethanol Acétaldéhyde

Acétate

non toxique

Inhibition de l'alcool déshydrogénase par un substrat compétitif

-Alcool déshydrogénase (ADH) : enzyme à NAD+/NADH

-Intoxication à l'éthylène glycol (S de l'ADH) : 50 décès / an

-Cette réaction peut être inhibée compétitivement par ingestion d'un excès d'éthanol… si

l'intoxication est traitée à temps !

-L'éthanol, S naturel de l'ADH, est un I compétitif particulier : c'est un S compétitif de la

transformation de l'éthylène glycol

précipite dans les reins !

Inhibition de la transcriptase inverse du VIH

2’-deoxythymidine-5’-TP

(dTTP)

3’-azido-2’,3’-dideoxy-thymidine-5’-TP

(AZT-TP)

3’-azido-2’,3’-dideoxy-thymidine

(AZT, 1985, BW)(Jérôme Horwitz, 1964)

• AZT-TP (issu de l'AZT) : I compétitif (S

compétitif) ~ spécifique de la transcriptase

inverse du VIH, analogue du S dTTP

• AZT-TP est utilisé par l'enzyme, mais termine la

réplication de l'ADN virale (arrêt de chaîne → Ic)

• Effets secondaires importants :

AZT-TP vs. ADN polymérases humaines ?

AZT vs. thymidine kinase (TK) humaine ?

fonction réactive

remplacée

enzyme propre aux rétrovirus

Inhibition de l'ADN-polymérase virale

-Aciclovir/Ganciclovir : Ic/Sc spécifiques de la thymidine kinase

du virus de l'Herpès-VZV, analogues de la déoxyguanosine .

Ki TKhumaine/Ki TKvirale = 3000(aciclovir)

-Les dérivés TP formés, Ic/Sc de l'ADN-polymérase, terminent

la réplication de l'ADN viral (→ Ic).

Ki ADN-Phumaine/Ki ADN-Pvirale

= 100 (aciclovir-TP)

P PPPTKvirale TKcell.

ADN-polym.

Ganciclovir

Ganciclovir-TP

Aciclovir

Aciclovir-TP

aucun effets

secondaires

2’-Déoxyguanosine (dG)

Aciclovir – Modèle du « dead-end complex » en présence du prochain dNTP(Cf. Barbara Selisko, Univ. Aix-Marseille II)

Liu et al., J. Biol. Chem. (2004), 281, 18193

3.2. Inhibiteurs analogues de l'état de transition

• I analogues de ET : analogues stables de S à l'ET (espèce instable !)

• Leur structure et ppts électroniques ressemblent à celles du S à l'état de transition (ET)

ou d'un intermédiaire réactionnel de haute énergie (IHE)

• La plupart des I dits "analogues de ET" sont en fait des I "analogues d'IHE" plus proches

de l'ET que du l'EF

• Ils sont reconnus par E, sans être transformés

• Conception rationnelle (si mécanisme connu ou postulé)

• Cinétique d'inhibition compétitive

• Exploitent l'étape de reconnaissance de S et l'étape catalytique

• Sont en général très efficaces (Km/Ki très grand)

• Même si [I] << [S], I peut entrer en compétition avec S

Caractéristiques principales :

• E a beaucoup plus d'affinité pour le substrat à l'ET (S≠) que pour le substrat à l'EF (S) :

Théorie : E doit avoir bcp + d'affinité pour un I qui ressemble (mime) à S≠ plutôt qu'à S

• I très efficace (Km/Ki très grand) ne signifie pas automatiquement que I est analogue de

ET/IHE (ex. : Methotrexate®). Pour cela, il faut en plus :

-Structures X comparatives

-log Ki = f[log(Km/kcat)] ≈ linéaire pour ≠ S et I analogues de l'ET correspondants :

H CH2CH(CH3)2

H CH2CH(CH3)2Y

H CH2CH(CH3)2

Substrats

IHE tétrahèdriquesO

I analogues de ET(phosphonamides)

Biochemistry (1983) 22, 4618-4624

log Ki

log(Km/kcat)

-5 -4 -3

= G# (E+S→ES#)/RT

Exemples d'inhibiteurs analogues de l'ET/IHE :

Inhibition de la triosephosphate isomérase (TIM) de levure

La TIM a 100 x plus d’affinité pour le PGH que pour le DHAP

CH2OPO3

DHAP IHEs 1,2-cis-ènediolate G3P

Km = 1,5 mM

CH2OPO3

Phosphoglycolate

CH2OPO3

Acide phosphoglycolohydroxamique (PGH)

Ki = 30 µMKm/Ki = 50

Ki = 15 µMKm/Ki = 100

enzyme glycolytique

boucle flexible

Glu165

Structure du complexe TIM-PGH

[Allen, 1994]

PDB 7TIM

Inhibition de la phosphoglucose isomérase de lapin

enzyme glycolytique

PGI PGI

IHE 1,2-cis-ènediolate

5P-D-arabinonate Acide 5P-D-arabinonohydroxamique

Ki = 2 M Ki = 0,2 M

Km/K i = 100 Km/Ki = 1000

CH2OPO32-

Km = 200 M

CH2OPO32-

Hardré et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1998) 8, 3435-3438

Hardré et al., Carbohydr. Res. (1999) 319, 110-115

Biochemistry 2001, 40, 1560-1566

Structure cristalline du complexe RmPGI-5PAA (1.9 Å)

(en collaboration avec l'équipe du Pr. Jeffery, Chicago)

PDB 1G98

Structure du site actif de RmPGI-5PAA (1.9 Å)

Ser209

Lys210

Thr211

Thr214

Ser159

Site phosphate

Wat819

2.57 Å

Mime O1H de IHE ?

Arg272

Stabilisation IHE

Glu357

Base catalytique

-idem TIM, GlmS ...

His388* Lys518

Ouverture du cycle ?

Ser209

Lys210

Thr211

Thr214

Ser159

His388* Lys518

Glu357

Arg272

PDB 1KOJ

Structure du site actif de RmPGI-5PAH (1.9 Å)

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 5872

Ser209

Lys210

Thr211

Thr214

Ser159

His388* Lys518

Glu357

Arg272

PDB 1KOJ

PDB 1G98

Ser209

Lys210

Thr211

Thr214

Ser159

His388* Lys518

Glu357

Arg272

PDB 1KOJ

Transfert de proton entre O1 et O2 des IHE

Représentation schématique

du site actif de RmPGI-5PAH

OGlu357 NH2

Gln353

Arg272

Alignement structural PGI-5PAH et TIM-PGH

Wat241

PGI vs. TIM : pas de base nécessaire pour ce même transfert

F6P G6P

ènediolate 1 ènediolate 2

Lys518

NH His388

Thr214

Glu357

OHArg272

déprotonation en C2

Lys518

NH His388

Glu357

Arg272

transfert de protonentre O1 et O2

Thr214

Lys518

NH His388

Thr214

Glu357

Arg272

reprotonation en C1(face Re)

Lys518

NH His388

Thr214

Glu357

Arg272

Mécanisme de l'étape d'isomérisation

Schéma du site actif de la structure 3D de RmPGI-F6P à 1.8 Å

(obtenue à partir du G6P)

Thr214

His388

Lys518 NH3+ 2.7

Wat389

PDB 1HOX

[Lee, 2001]

(étude indépendante de Jeffery et coll.)

F6P (6P- -D-fructofuranose)

Structure 3D du complexe RmPGI-F6P

Superposition de structures tridimensionnelles

des complexes RmPGI-F6P et RmPGI-5PAH

Arg272

Glu357

Val514

Lys518

Thr214

4 Å !

La ≠ce d’affinité de la PGI pour le S (F6P)

et l’I analogue de l’ET (5PAH) est visible

structuralement.

Mécanisme de l'étape d’ouverture de cycle

Lys518

NH His388

Thr214

Glu357

Arg272

: départ de H2O

: déplacement Lys518

: rotation C3-C4 : 140°

Lys518

NH His388

Thr214

Glu357

OHArg272

Lys518

H His388

Glu357

Arg272

Thr214

ouverture de cycle

Lys518

H His388

Glu357

Arg272

Lys518

NH His388

Thr214

Glu357

Arg272

Lys518

NH His388

Thr214

Glu357

OHArg272

+ : départ de H2O

: déplacement Lys518

: rotation C3-C4 : 140°

Thr214

ouverture de cycle

autocatalyse par phosphate via Thr214 ?

Mécanisme de l'étape d’ouverture de cycle

Inhibition des glycosidases

X = OH, NHAcR1 = glycoside

R2 = H, glycoside

R1OHOR2O

IHE oxocarbonium stabilité par -COO - du site actif :

-par liaison électrostatique (inverting glycosidases : → , → )

-par liaison covalente (retaining glycosidases : → , → )

C anomère trigonal (plan) sp2

HOHO OH

HOOH H

gluconolactones

X = NHAc, R 2 = H

Ki = 5 10 -7 M ( -N-Ac-glucosaminidase)

Km/K i moyen = 40 000

Km = 1 à 3 10 -3 M

nojirimycine

Ki = 6 10 -10 M (sucrase)

Km/K i moyen = 3 106 !

sp3sp2 sp2

sp2 sp2

Inhibition de la neuraminidase virale par le Tamiflu®

Oseltamivir® (Tamiflu®)

out in

O COOH

O+ COOH

O COOH

AcHN+ R OH

I analogue IHE

acide sialique

(acide N-acétyl-neuraminique)Virus « accroché »

Virus « libre »

Inhibition des protéases

Nu + R'NH2

IHE tétraèdriqueNu = OH -, SerO-, CysS-

Nu+ R'OH

IHE tétraèdriqueNu = OH -, SerO-, CysS-

Activité estérase

Activité peptidase

sp2sp3

(NuH = H2O, SerOH, CysSH

Quelques types d'analogues de l’IHE des protéases

aldéhydes

R CF2R'

cétones -difluorées

acides boroniques/boronates

phosphates

RO P OR'

phosphonates

R P OR'

phosphinates

R P R'

phosphonamidates

R P NHR'

fluorophosphates(gaz Sarin)

RO P F

NuH NuH NuH

RO P Nu

ONuH HF

(inhibition irréversible)R

alcools secondaires(Ritonavir® vs. protéase du VIH)

L’espèce tétraèdrique I anal. de l’IHE est formée par réaction réversible de l’E → complexe EI stable anal. de ES#

I anal. de l’IHE « classiques » (tétraèdriques)

I anal. de l’IHE « irréversibles »

ONHR'HO O-

Ritonavir

Saquinavir

Inhibition de la protéase du VIH (protéase à acides aspartiques)

R-Phe–Pro-R’

Alcools secondaires : liaison C–C

très stable, non-hydrolysable !

Stereoview of the overlay of the inhibitor bound to HTLV-1 protease with the clinical

inhibitors of HIV-1 protease.

Li et al. PNAS (2005)102,18332-18337

Amprenavir, Ritonavir, Nelfinavir, Saquivavir, Indivavir

3.3. Abzymes

• Application du concept des analogues

de l'état de transition :

1. Un analogue de l'état de transition

d'une réaction choisie est synthétisé

2. Cet "antigène" (appelé haptène)

injecté dans un organisme (souris)

va générer la production

d'anticorps dirigés contre lui

3. Cet anticorps, en théorie, est

similaire à une enzyme : il doit être

bien plus complémentaire de

l'analogue de l'ET que du substrat

de la réaction ciblée

• Abzymes = Anticorps catalytique =

Enzyme "artificielle"

S [ES#] PPas d’enzyme connue

I analogue de S# postulé(antigène ou haptène)

Production d’anticorps

S [AbS#] P

Si anticorps à

activité catalytique :

Haptène

(I anal. de l’IHE)

IHE (S#)

Abzyme : activité cocaïne hydrolase(détoxification de la cocaïne)

Exemple d'abzyme : la cocaïne hydrolase

kcat = 1.8 10-3 s-1 (abzyme)

kn = 3.3 10-6 s-1

kcat/kn = 540 (facteur d’accélération)

KTX = 0.88 10-6 M (affinité de E pour S#)

Ki = 2.0 10-6 M (affinité de E pour I)

Science (1993) 259, 1899

Cocaïne

Enzyme à activité estérase

Km = 4.7 10-4 M

Ki > KTX

I plutôt bon analogue de S#

4. Inhibiteurs irréversibles

4.1. Marqueurs d'affinité

• Principaux types d'inhibiteurs irréversibles : marqueurs d'affinité et inhibiteurs suicides

• Inhibiteurs irréversibles non-spécifiques du site actif (réactifs dits « résidus-spécifiques »)

[E][I]

kKE + I EI E-I

ki kinact

complexecovalentinactif

• Marqueur d'affinité = Réactif chimique formant une liaison covalente stable avec un résidu du

site actif de l'enzyme (réactifs spécifiques du site actif ou « site-spécifiques »)

• "active-site irreversible inhibitors"

• Analogues de S ou de l'ET avec en plus un groupement réactif

• Réagissent de manière stoechiométrique

• L'enzyme est protégée de l'inhibition par le S (ou cofacteur) ou un I compétitif

• Modification irréversible (covalente) de l'enzyme par l'inhibiteur :

-inactivation irréversible de l'enzyme

-l'inhibiteur reste lié à l'enzyme même après dialyse ou filtration sur gel (ou membrane)

• Un I irréversible présente un équilibre de fixation (Ki) avec l'enzyme, avant l'étape de

l'inactivation proprement dite (kinact)

Cinétique de l'inhibition irréversible

- La perte d'activité de l'enzyme mesurée en fonction du temps à différentes concentration

de I suit une cinétique du premier ordre :

inactobs

-La représentation de 1/kobs = f(1/[I]) permet de déterminer les paramètres Ki et kinact :

1/kinact

pente = Ki/kinact

inactobs k

ln (activité résiduelle

activité initiale) = kobs t

Exemple de marquages par affinité

Histidine du site actif de la Chymotrypsine :

Substrat Tosyl Phenylalanine Chloromethyl Ketone (TPCK)

-I irr. analogue de S (mime de S + gpe réactif)

-Egalement sur Cys du site actif de la papaïne

(Cys-S- 100 x plus réactif que His)

-halocétone

Liaison covalente stable : His du site actif de la

chymotrypsine est irréversiblement modifiée

Sérine (activée) du site actif des protéases (acétylcholinestérase) :

-I irr. analogue de l’IHE (mime de IHE + gpe réactif)

H2O AcOH

OHNMe 3

acétylcholine choline

E impliquée dans la régulation de la

transmission des impulsions nerveuses

aux muscles (notamment respiratoires) !

Gaz Sarindiisopropylphosphofluoridate

Forte affinité de E pour I + Ser irréversiblement

inactivée : inactivation rapide de l’enzymeParalysie respiratoire (asphyxie)

Triosephosphate isomérase :

I irr. analogues des S (mimes de S + gpe réactif)

• Nombreux autres exemples

• Peu utilisés en thérapeutique, car forte réactivité chimique (armes chimiques !)

His OPO3

OPO32-

TIMO OPO3

DHAP G3P

OPO32-

vs His du sa

OPO32-

vs Asp du sa

4.2. Inhibiteurs suicides

• Inhibiteurs basés sur le mécanisme : « mechanism-based inhibitors » (1978) :

1) Au départ, la réactivité de l'inhibiteur est cachée : il agit comme un substrat.

2) Ensuite, l'enzyme, par son activité, génère l'espèce inhibitrice active EI*.

• Caractéristiques d'inhibition analogues à celles des marqueurs d'affinité, si ce n'est la

participation de l'étape catalytique au processus d'inactivation (effet isotopique sur la

cinétique de l'inhibition).

• Présentent une sélectivité encore meilleure que celles des marqueurs d'affinité

• Absence de réactivité intrinsèque initiale : agents thérapeutiques de choix

• Autorise la génération de fonctions très réactives, inaccessibles aux marqueurs d'affinité

• Très nombreux exemples, notamment dans le cas des enzymes à PLP dont le mécanisme

implique la formation d'un carbanion, stabilisé par le PLP. En effet, le substrat "inhibiteur

suicide" restant lié au coenzyme n'aura pas tendance à diffuser en dehors du site actif.

E EI EI*

E-I+ I

kcat kinact

Inhibition de l'ornithine décarboxylase par le DFMO

(enzyme régulatrice de la biosynthèse des polyamines)

enzyme

PLPH2N

HH + CO2

• Le difluoromethylornithine (DFMO) est un inhibiteur suicide de cette enzyme

• Le DFMO est reconnu comme substrat (voir inhibition compétitive par l' -méthylornithine)

• L'espèce réactive formée au cours de la réaction (imine conjuguée, EI*) est un accepteur de

Michaël qui va réagir avec un nucléophile du site actif (Cys)

CF2HCOOHH2N

COOH H2N

-methylornithine DFMO EI*

1. - COOH ,

2. 2. - F-

DFMO + PLP

O H B R

H2O CO2

H S Cys

Mécanisme d’inhibition de l'ornithine décarboxylase par le DFMO

1. - COOH

2. - F-

3. + CysS-

4. + H+

accepteur de Michaël (EI*)

Liaison C–S stable : Cys irréversiblement modifiée → enzyme inactivée

cours franco-québécois d’enzymologie avancée...

Documents

cours d'évei cours d'évei pour tous à partir cours de foi

l’ a.c.a.i. – enregistrement et formation · –...

cours d’économie d’entreprise - cours en...

livret 17 outils d’analyse - e-presse.ca · cours outlook...

idrs pmc présentation de l’aspect -...

f:/cours thermo s1/cours/version papier/cours thermo

cours individuel d'espagnol cours particuliers en espagne |...

master professionnel –dess cours...

cours , exercices et examens : §لإمتحان... · cours...

inhibition de l'activité enzymatique en se liant à l...

cours log odile cours 2

bcm 6225 enzymologie moléculaire et...

cours bus student - cours | projets divers

cours de dramaturgie - cours avancé (deuxième niveau de...

cours comptabilite-gestion ahsan cours et exercices

biocell cours 4 résumé du cours précédant

les cours cours de morale n - enseignement.be

cours cours sur la - sciences de l'ingénieur

cours geometrie descriptive universite liege...

cours d'initiation à l'écriture hiéroglyphique cours de...