cours de chimie analytique jean-luc vialle jluc.vialle@gmail.com 2009-2010

Cours de Chimie Analytique

Jean-Luc Vialle jluc.vialle@gmail.com 2009-2010

Objectifs

• Maitriser les techniques utilisées dans les domaines: - De l’agroalimentaire (lipides, glucides, protides) - Connexes à la production (environnement, culture, élevage)

• Approfondir quelques techniques majeures et discriminatives

Sommaire

• Panorama des techniques• La Quantification et l’Echantillonnage• La Chromatographie• L’HPLC et La CPG• L’ Absorption Atomique et L’ Absorption

Moléculaire

Déroulement - Contrôle

• 5 Interventions: Cours • 1,5 TD + 0,5 TD Projet• 1 Projet (TP)• 1 contrôle

• Claroline: Chimie Analytique– Documents (cours + Power-Point)– Forum (Questions)

Chapitre N°1

Panorama des techniques analytiques

Sommaire

• IntroductionLes environnements Recherche, R&D, Production

• Contraintes des analysesPersonnel, Matériel, Normatives, Economiques

• Classifications des techniquesPropriétés, Etat, Seuil, Cibles

I°) Introduction• Objectifs: Adéquation entre un‘produit’ et

un cahier des charges et/ou une législation.• Moyens: Quantifications +/-

précises de différents paramètres

• Paramètres: Sensoriels, Physiques, Chimiques µ

biologiques liés à la matrice, à la molécule

• Représentativité: Analyse, Echantillonage, Extraction, Conservation.

• Adaptation de la méthode au résultat attendu

• Ciblage des paramètres en fonction des objectifs et de l’environnement

- Recherche- Recherche et

Développement - Production

11 L’environnement Recherche• Objectifs: Structurale / Evolution• Mots Clefs: Liés au produit

Nature, Origine, Matrice, Etat, Pureté

• Moyens: Techniques Lourdes disponibles en Centre de Recherche ou en externalisation

• Obligations de moyens: Pas / peu de contraintes économiques et temporelle

12 L’environnement R&D

• Objectifs: Quantification 2 phases:a) Centrée sur le produit

+ Niveau de détectionb) Transposition en production :

Contraintes normatives• Moyens plus softs• Techniques globales / discriminatives

13 L’environnement Production

• 3 mots clefs: Simplicité - Durée - Coût• Nouvelles contraintes: Obligations -

Références - Externalisation - Qualification• Techniques mises en œuvre :

Liées à la valeur ajoutée du produit:Faible GlobaleElevée Discriminative

II°) Contraintes des analyses

• Liées au personnel• Liées au matériel• Liées aux méthodes• Liées à l’aspect économique et à l’aspect

délai

21 Personnel compétent• Production : Faibles compétences

Analyses simples (globales) Automatisation

• Laboratoire d’analyse: Niveau de compétence + élevé Analyses discriminatives Automatisation

• Laboratoire de recherche: Niveau de compétence très élevé Interprétation des analyses

22 Contraintes matérielles• Coût d’investissement:

- Routine (Production) : 15.000 Euros- Analyse discriminative: 15.000 Euros par ligne d’analyse

- Analyse structurale: Quelques centaines de milliers d’Euros par technique.

• Coût de fonctionnement et de maintenance

23 Contraintes Normatives et Légales

• Normes ISO, Afnor, Din, Asae…font références et sont

incontournables si obligations légales• Méthodes officielles: AOAC pallient

l’absence de normes• Méthodes interprofessionnelles

Ex: Test de sédimentation de Zélény, saccharimétrique dans l’industrie sucrière, MS chez la pomme de terre.

• Méthodes internes (propres à l’entreprise)

24 Contraintes économiques et temporelles

• Liées à l’aspect légal ou marketting de l’analyse.

• Liées à l’impact sur la production (Immobilisation)

• Internalisation / Externalisation de l’analyse Impact sur le délai et sur le coût

• Liées au volume d’activité de l’entreprise et à la valeur ajoutée de la production

• C < 15 Euros , D < 3 joursMS, pH, Gravimétrie, Brix, tests simples

• 15 < C < 50 Euros, D < 3 joursTitrimétrie, Complexiométrie, AA, Absorption moléculaire

• 100 > C > 50 Euros, D < 3 joursTechniques chromatographiques

internalisées, simples• C > 100 Euros, D > 1 semaine

Analyse thermiques, structurales, analyses chromatographiques externalisées

III°) Classifications des techniques

• Selon les propriétés du soluté (matrice).• Selon le caractère ‘destructif’.• Selon l”état de la matière.• Selon le seuil de détection• Selon le caractère discriminant de l’analyse• Selon la ‘cible’ visée dans la molécule

• Propriétés du soluté (matrice)Chimiques et µbiologiques - Physiques -

Mécaniques - Thermiques - Optiques - Electriques - Magnétiques - Physico chimiques - Energétiques - Fragmentation

• Caractère destructif / non destructifMEB, RX, RMN du solide, Near FTIR

• Etat de la matière: S, L G

• Seuil de détection:– 0,1% (1000 ppm)Titrimétrie - Thermiques - IR - RMN - Gravimétrie

- 1 ppm: AA, AM , Chromatographie…

• Global / Discriminant: Titrimétrie / Séparatives

Classification selon la ‘cible’

• Molécule = atomes et ou de groupes fonctionnels liés entres eux par des électrons.

• Atome = noyau + électrons• Propriétés physiques , chimiques +/-

spécifiques et des Propriétés physico-chimiques spécifiques Techniques Séparatives

• Possibilité de la casser par apport d’énergie mécanique (chimique) analyse élémentaire , Spectrométrie de masse.

• Possibilité de modification de la molécule par apport d’énergie sous forme thermique ATD, ATG, DSC, Fusion…

• Possibilté d’action sur les molécules et ses atomes constitutifs par apport d’énergie sous forme lumineuseE = h = hc /

En fonction de l’énergie apportée, on agit sur des cibles différentes: SAA, IR, Absorption moléculaire

• µ onde et ondes radio 3 106 nmModification de la matrice

• Infra-Rouge de 2500 à 1000 nmVibration des atomes constitutifs des liaisons

• Visible de 800 à 400 nmExcitation des electrons constitutifs des liaisons

(les plus mobiles). Excitation des electrons atomiques

• UV de 350 à 200 nmExcitation des électrons constitutifs des liaisons (les moins mobiles)

• RX et rayons < 3 nmArrachage des electrons constitutifs

P r o p r ié té s m o lé c u la ir e s e t io n iq u e s+ / - S p é c if iq u e s

R é a ctio n sp é c ifiq u es C o m p le x io m é tr ie

R é ac tiv itéC h im iq ue

p H m é tr ie

A r g en tim é tr ie P e r iod im é tr ie

M a n ga n im é tr ie C h r o m im é tr ie

C é r im é tr ie C h lo m é trieIo d o m é trie

B ro m om é trie

P o te n tio m é tr ie

P rop riétés C h im iq u es

P r o p r ié té s m o lé c u la ir e s e t io n iq u e s+ / - sp é c if iq u e s

A n a lyse é lé m e nta ire

C onstitu tives

G r a v im é tr ie

D e n sim é tr ie

V o lu m é tr ie

T o n o m é tr ie

P hysiquesP , V , m ...

E b ulliosc op ie

C r y o sc o p ie

C alorim étrie

A .T .D

A .T .G

D .S .C

A nalyse T herm ique

T herm iques

R é fr a c to m é tr ie

P o la r im é tr ie

O ptiques

C o n du c tim é tr ie

A m pé r o m é tr ie

V o lta m é tr ie

C o u lom é tr ie

P o la ro g r ap h ie

E lec tr od essp é cifiqu es

E lectriques

P r o p r ié té s P h y s iq u e s

P r o p r ié té s M o lé cu la ire s e t Io n iq u esS é lec tiv e s

C .P C .C .MH P C C M

Surface

H P L CP h a se l iq u id e

C P GP h a se g a z u e se

V olum e

C h r o m a to gr a p h ie

P a p ier G el

Surface

E le c tr o p h o r è sec a p i l la ire

V olum e

E le ctr op h or è se

In tér a c tio n s P h y sico c h im iq u es

P r o p r ié té s E n e r g é tiq u e s d e s m o lé c u le sS p é c if iq u e s

S p ec tro sco p ieIn fr a -r o u ge

S p ec tro sco p ieR a m a n

V ibration des atom es

A b sor p tionm o lé c u la ireU V - V is ib le

F lu or im é tr ie

E xcitation dese- de co valenc e

M olécu le

E m iss iona to m iq u e

F la m m e F la m m eF r o ide

T o r c h e àP la sm a

F o u r

A b sor p tionA to m iq u e

E xcitation dese- atom iques

A tom e

C ib le u tilisée(E c ro issa n te )

P r o p r ié té s d uN o y a u A to m iq u e

R .M .N

M agnétiques

S c in tigr a p h ie

R adioactive s

M icr o sco p ieE lec tro n iq u e

à b a la y a ge

D iffr a c tio n X

P hysiques

P rop riétés d u n oyauet d e l'a tom e

Chapitre N° 2

La quantification

Sommaire

• IntroductionLes calculs d’incertitudes

• Les méthodes ‘Absolues’Methodes directes

Dosages chimiques• Les méthodes comparatives

Etalonnage interne et externeLes ajouts dosés

• Conclusion

I°) Introduction

• Analyse = Quantification• Structurale = Identification• Rappels sur les incertitudes

Incertitudes absolues n xIncertitudes relatives x /x

II°) Les méthodes ‘absolues’

• Mesure de paramètre physiquesExemple Taux de cendres NF V 18-101

• Méthodes basées sur l’application d’une loi simple

Exemple ; L’amidon (3ème directive du JO du 23/11 1980)

• Méthodes basées sur des réactions chimiques

• Acido-basique• Rédox• Complexiométrie - Précipitation

• Conservation du nombre d’équivalents échangés

• Méthodes à point final• Méthode directe: (NF T 60-204)• Méthode en retour (NF V 18-100)

III°) Méthodes comparatives

• Etalonnage externe

• Etalonnage interne

• Méthode des ajouts dosés

31 Etalonnage externe

• Pas de dépendance d’un facteur extérieur

• Application au dosage du phosphore soluble dans les terres (NF X 31-161)– Etalonnage– Exploitation des résultats– Avantages et inconvénients

32 Méthode de l’étalonnage interne

• Domaine d’utilisation• Principes• Application à l’analyse des FAME (NF T 60-234)• Avantages et inconvénients• Choix de l’étalon interne

33 Méthode des ajouts dosés

• Analyse de traces

• Application en absorption atomique

• Application en chromatographie

• Avantages et inconvénients

Chapitre N° 3

Introduction à laChromatographie

Sommaire

• Introduction• Aspect thermodynamique• Aspect cinétique• Facteurs liés à la chromatographie

I°) Introduction

• Technique séparative• Dualité Analytique / Préparative

Lié à la valeur ajoutée• Les différents états de la matière

solide – liquide – gaz – critique• Classification des techniques séparatives - Suivant les forces mises en jeu - Suivant l’état de la matière

Un peu d’histoire…• Khrômatos = Couleur Graphikos = Tracé• 1903 Tswett: CaCO3 Colonne ouverte• 1940 Martin et Synge : Théorie de la

partition• 1950 Snyder: Théorie de l’adsorption• 1950 Martin et James CPG• 1960 CCM• 1970 HPLC et phase inverse• 1975 CPG Capillaire• 1985 HPLC en phase supercritique

Glossaire

• Soluté: Espèce à séparer / à doser• Solvant: Solubilise le soluté• Eluant: Phase mobile• Eluat: Phase mobile (+ soluté)• Phase stationnaire:

Phase immobilisée dans le système chromatographique

Schéma d’un chromatographeRéserveEluant

Système de Mobilité

Injecteur

Passeur

Gradient Séparateur

Micro Proesseur

Détecteur

Traitement du signal

Collecteur

Classification des techniques chromatographiques

• Suivant la technologie: Surface / Volume• Suivant la nature des phases:

Phase mobile: Liquide ou Gazeuse(Critique)

Phase stationnaire: Solide ou Liquide

immobilisé

RécapitulatifPhase Mobile

Phase Stationnaire

Technologie Application Principe

GazLiquide

VolumeCPGG/L

Partage

Solide CPGG/S

AdsorptionExclusion

LiquideSurface CCM

L/LPartage

LiquideVolume HPLC

L/LPartage

SolideSurface CP

L/SAdsorptionExclusion

Volume LC, HPLCL/S

AdsorptionExclusion

II°) Aspect ThermodynamiqueThéorie des plateaux

• Un soluté P qui se distribue entre les deux phases stationnaire et mobile = Equilibre K = [P]stat / [P]mob

• K varie avec la force des interactions• Objectif: Multiplication du nombre d’équilibre : n• Ecoulement discontinu ; 1 plateau = 1 équilibre• y = fraction de P (stat) et x = fraction de P (mob) k’

= y/x = cste x + y = qo = 1

0 1 2 3 ….. p … n-2 n-1 n

Evolution du soluté PInjection

n 0 1 2 n - 1 n

Stat. 1 0 0

Mob. 0 0 0

Equilibre

n 0 1 2 n -1 n

Stat. y

Mob. x

Transfert

n 0 1 2 n - 1 n

Mob 0 x 0

Stat y 0 0

Equilibre

n 0 1 2 n -1 n

Mob xy x²

stat y² xy

Transfert

n 0 1 2 n - 1 n

Mob 0 xy x²

Stat y² xy 0

Equilibre

n 0 1 2 n -1 n

Mob xy² 2x²y x3

Stat y3 2xy² x²y

Généralisation• Après n transferts:

Le soluté se disperse suivant une loi du type (x + y)n

• Facteur de capacité: k’ = y / x Grandeur caractéristique d’un soluté dans un système chromatographique donné

• Qnp = f(n,p, q0)

Equation d’une Gaussienne Courbe à maximum

• Après n transferts, la phase mobile a parcourue une distance ln et l’extrémum se situe à une distance lp tel que

lp / ln = 1 / (1+k’)

• Soit en terme de vitesse

vp / vn = 1 / (1+k’)• Soit t = Cste On mesure l Surface

• Soit l = Cste On mesure t Volume

Quelques grandeurs fondamentales

• Temps de rétention: Apparition de l’extrémum Tr = T0 (1+k’)

• Temps de rétention nulle: Soluté non retenuT0

• Rf Rf = lp / l0

• Efficacité : N = Nb de plateaux théoriques

• HEPT: H = L / N

Séparation de plusieurs solutés

• Sélectivité = k’2 / k’1 Traduit la différence d’affinité pour 1 et 2

• Résolution Rs Traduit la séparation entre deux pics chromatogaphiques

III°) Aspect Cinétique

• Ecoulement Continu : Déformation des pics:• Transfert de système chromatographique et

Transposition: Notion de grandeurs réduites (l, h et vitesse réduite)

• Si l, h et la vitesse réduite sont constant, N est constant

Mécanismes de Dispersion

• Knox (HPLC) et Van Dempter (CPG)

• H = A + B / u + C u• A = Anisotropie d’écoulement• B = Diffusion longitudinale• C = Résistance aux transferts de masse• U = vitesse linéaire de la phase mobile• Optimisation

IV°) Facteurs liés à la chromatographie

• La température: Fondamentalk’ est fonction de T Si

T augmente k’ diminue• La composition de la phase mobile (HPLC -

CCM)• Le débit de la phase mobile (u)• Loi de Darcy: Perte de charge dans un

écoulement à travers un tube rempli

Chap N°4 La CPGSommaire

• Introduction• Les phases stationnaires en colonne remplie• Transposition colonne remplie / colonne

capillaire• L’injection• La détection• La dérivatisation

I°) Introduction

• 1ère technique développée dès 1950• Simplicité de mise en œuvre• Rapidité des analyses complexes• Matériel disponible et peu onéreux• Nombreuses applications :• NF T60-234 FAME Carbowax

20 M DB 20 F.I.D NF T60-237BHA et BHT DC 200 CP Sil 5F.I.D

NF T90-120 PcB et Organo-chlorésOV17 DB5 ECD

NF T90-121 Atrazine et SimazineDB5 Thermo ionique

NF T90-125 COV halogénésCarbowax 1500 CPSil 5 ECD

Nombreuses autres applications - Gaz Permanents Porapak

Catharomètre- Solvants résiduels – Composés volatils - Résidus d’incendies – Arômes –

Huiles essentielles….

II°) Les phases stationnaires en colonne remplie

• Colonne remplie = Tube + Support + Phase Liquide Imprégnée (Solide)

• Tube:2 m 1/8ème ‘’ Inox• Support: Diatomées P, W, G Granulométrie

80-100 mesh (175-150µm) Pertes de charge faibles (1-2 bars) Taux d’imprégnation 10 - 30%

Traitements: Tamisage, AW, TMCS

21 Les phases stationnaires

• Les hydrocarbures ramifiésréférence : Polarité nulle

• Les Polysiloxanes et polysiloxanes substitués:R = CH3,

Phényl, Cyanopropyl… Polarité très faible (DB1, 100% de CH3) à très forte (CP Sil 88, 100% de cyanoéthyl)

Référence en capillaire

• Les polyéthylènes glycols (carbowax 20M, FFAP..) équivalence CP Wax, DB 20

• Les Polyesters: Polarités intermédiaires et fortes (DEGS, EGA….)

• Les Adsorbants Tenax, Carbopack, Tamis moléculaires

• Classification selon la polarité • Equivalence entre remplie et capillaire

22 Les indices de Kovat’s

• Série homologue: log10 Tr’ = an + b

• Notion de droite de similitude: - Prédiction de la rétention - Approche d’identification

• Application à la série des n alcanes - Notion d’indice de rétention

23 Classification suivant la polarité

• Constantes de Mac Reynolds – Rohrschneider

– 1 phase de référence : Squalane P = 0– 5 solutés de référence:

Benzène X’ n Butanol Y’ MeCOPr Z’Nitropropane U’ Pyridine S’

Cste de Mac Reynods = Différence d’indice de rétention du soluté entre la phase et la référence

Polarité = Somme des cstes de Mac Reynolds des cinq solutés(Existence de 3+2 autres solutés références)

Exemples

Phase X’ Y’ Z’ U’ V’ Somme

Squalane 0 0 0 0 0 0

SE 30 15 53 44 54 41 217

OV 17 119 158 162 243 202 884

FFAP 340 590 397 602 627 2546

OV 275 666 1001 895 1177 1099 4838

24 Choix raisonné des phases stationnaires

• Classification des solutés en 5 catégoriesLiées à la polarité

• Classification des phases en 4 catégoriesLiées à la polarité

• Associations par catégories: - Apolaire – Apolaire - Polaire – Polaire - Moyennement polaire – Moyennement polaire

III°) TranspositionColonne Remplie / Colonne Capillaire

Remplie Capillaire

Phases Variées Variées (mais +

restreint)Longueur

Perte de charge2 m

1 bar / m10 - 100 m

1 bar / 50 m

Diamètre 1/8 ‘’1/4 ‘’

0.32 et 0.25 mm

0.53 et 0.1 mm

Classification

• Colonnes de Golay:-

COT et WCOT : Wall Coated Open Tubular - SCOT : Support Coated Open Tubular - PLOT : Porous Layer Open Tubular - Micropacked Columns

• Perméabilité k importante : Efficacité importante et vitesses linéaires importantes soit tr faibles

• B = VG/VL 2 à 10 x supérieur / remplie• B= dc / 4ef et tr = t0 (1 + K / B)

• Si B augmente : tr diminue ; possibilité de diminuer la température

B élevé: Analyses rapides : substances lourdes B faible: Substances volatiles

• Epaisseur du film: De l’ordre du micron• Tr augmente en f(Log e) e x 2 = Tr (-15°)• Films minces et films épais

• Films Minces: 0,15 < e < 0,5 µmAvantages: Meilleures performances Réduction du temps d’analyse Possibilité d’analyse de composés ‘lourds’ Inconvénients:Charges + faibles : restreint la possibilité d’analyse de traces - Interactions avec la surface

• Films Epais: e > 1 µmAvantages: Analyses de traces Analyses de volatils

Inconvénients Pb de Bleeding (e > 5µm)• Diamètre: Wide Bore = Remplie

Narrow bore: Analyses courtes : Couplage GC / MS

IV°) L’injection

• Colonne remplie: Injecteur à Septum Volume injecté: 0,5 à 1 µl Gaz : 100 µl à 500 µl Head-Space (Statique et dynamique)

• Colonne capillaires: Charges + faiblesUtilisation de diviseurs - Split / Splitless - On column - Injecteur de verre

V°) La détection

• 2 classes de détecteurs: I : Réponse proportionnelle à la concentrationCatharomètre, E.C.D

II : Réponse proportionnelle au débit massique: F.I.D , N.P.D

• Sélectivité : Universels / Spécifiques• Quantité minimale détectable : variable de (1-

10 ng) TCD à 0,1 pg ECD(30-100 pg) FID

• Catharomètre: Pont de Wheastone (I)Universel Gaz permanents

• F.I.D: Combustion (II)Universel (sauf incombustibles) Notion de Make-up

• E.C.D Capture d’électrons (I)Spécifique: Dérivés Halogénés

• N.P.D Thermoionique (II)Spécifique: Dérivés N et P

VI°) La dérivatisation

• Objectifs: Volatilisation des espècesAmélioration des analyses

(trainées de pic)Amélioraion des résolutions

• Méthodes:Estérification :

Diazométhane, BF3/CH3OHSilylation : TMCS / HMDS

obtention d’éthers, d’esters silylés volatils: Pb H2O

Chapitre N°5La chromatographie Liquide

L’adsorptionLe Partage

Sommaire• La chromatographie d’adsorption

Théorie de SnyderFacteurs liés à la phase stationnaire, la phase mobile et le soluté

• Le Greffage• La chromatographie en phase inverse• La chaîne chromatographique

I°) Introduction• Le dosage de l’aflatoxine B1 dans les aliments pour

animaux (NF V 18-200)

Extraction Liquide / solide au CHCl3Purification Colonne ouverte de gel de silice (50-200

µm) conditionnée dans CHCl3 – Lavage à l’étherDésorption avec CHCl3 / CH3OH (97/ 3)Chromatographie Monodimensionnelle sur silice: Phase mobile: CHCl3 / Acétone (90/10) Ether / méthanol/ eau (96/3/1)

Lecture visuelle / Fluorodensitométrique

II°) La chromatographie d’Adsorption

• Supports solides polaires: Silice Caractère acide

Alumine Caractère basique

Utilisables en CCM, HPLC, colonne ouverte

Principe: Formation de liaisons H entre le support et le soluté. (interactions)

• Phases mobiles : peu polaires

• Applications analytiques: – Fonctionnalités Différentes– Isomères– Solutés peu et moyennement polaire

• Applications en extraction (purification)Fixation des espèces plus polaires

• Ordre d’élution: suivant l’ordre de polarité• Faible coût – Pb de la phase mobile

21 Mécanismes d’adsorption

• Adsorption / désorption en surface• Equation de Snyder• log k’ = log Va + B*(E° - As °) + log (Wa/Vm)• k’ = facteur de capacité

– Phase stationnaire: Va, Wa et Vm , B*– Phase mobile: B* , °– Soluté: As et E°

Facteurs liés à la phase stationnaire

• Va, Wa et Vm Liés à la taille des particules et au remplissage

Peu d’actionsInfluence la transposition Surface / volume

• B* Etat d’activité de l’adsorbant (0<B*<1)Séchage des plaques et conservation au dessicateur

Facteurs liés à la phase mobile• ° et B*• B* liée à la teneur en eau de la phase mobile

Solvant isohydriqueutilisation d’acide et de base pour réduire l’activité

• °: Force éluante Série éluotropique si ° Augmente, alors Rf augmente

(k’ diminue)

Développement isocratique et en gradient de concentration.Utilisation de mélanges binaires et ternaires

Facteurs liés au soluté

• As et E°• As: surface spécifique : Pas d’action si ce n’est

une dérivatisationChangement de la nature du soluté et des interactions

• E°: même remarque

III°) Le greffage• Adsorption

Contraintes Activité du supportIsohydrie de la phase mobile

Limites2 types de phase : Silice (alumine)échelle de polarité limitée

problèmes de traînées de pics• 1970 Le greffage

II°) Le Greffage• Modification du support siliceux par greffage

chimique d’espèces liquides: Si-OHSi-O-Si-R R =

Alkyl (C18, C8, C3, C2)PhénylAmino alkylNitro alkylDiols , Cyano….

• Notion de chromatographie de partage• Echelle de polarité inversée / Adsorption• End-Capping

Soluté Polaire Moyennement

PolaireMoyennement

PolaireNon

Polaire

Eluant Moyennement

PolaireTrès

Faiblement

Polaire

Fortement

PolaireMoyennement

Polaire

ExemplesCH2Cl2 / Hexane80/20

CH2Cl2 / Hexane

5/95

CH30H / H20

40 / 60

CH30H / H20

90 / 10

HPLCPartage Phase

NormaleNH2, CN,

Partage Phase

NormaleNH2, CN,

PartagePhase Inverse

C18, Phényl

PartagePhase Inverse

C18, Phényl

IV°) La Phase Inverse

• Application : Dosage de 6 PAH (µ polluants) en phase aqueuse NFT 90-115 : Fluoranthène, Benzofluoranthène b et k; Benzopyrène a; (10

ppb) Benzopérylène, Indénopyrène (50 ppb)• Extraction au cyclohexane - Concentration à 1ml sous vide• Purification sur colonne d’alumine • Concentration à sec et reprise dans 1ml de solvant:• Phase stationnaire: RP 18, Lichrosorb C18 L = 250 mm Diam: ¼ ‘’• Phase mobile: CH3-CN / H2O (85/15 ; 90/10) Débit: 1ml mn-1

• Injection 20 µl• Fluorimétrie: Excitation 360 nm Emission > 420 nm

La phase stationnaire

• Apolaire Lipophile = Hydrophobe• Nature du greffon: CH3-(CH2)n-CH2-

si n augmente: La rétention augmente• Nombre de greffon: Plus le taux de greffage

est élevé, plus la rétention est importante• Généralisation à la surface hydrocarbonée• Pratique: Entre 8 et 15 % de Carbone

La phase mobile• Base:H20 + CH3OH ou H20 + CH3CN

Attention à la perte de charge (Darcy)• Utilisation éventuelle de modificateurs:

THF, Acétone, CHCl3… Attention à la détection

• Influence de la teneur en eau : La rétention augmente avec la teneur en eau

• Elution en mode isocratique : Composition de la phase mobile constante

• Elution en mode gradient de concentration

Le soluté

• Rétention Inverse à la polaritéPlus le soluté est polaire, plus la rétention est faible.

• Liée à l’hydrophobie: Cste de partage dans le système octanol / eau P

• Rekker:log P = Somme fi + CM (somme kj)fi = Incréments CM = Cste = 0,268 kj

= effets de proximité log k’ = a log P + b

IV°) La chaîne chromatographique

L’Injection

• Couramment : 20 µl (1 à 50 µl)• Injection en boucle Etalonnage

externe• Vanne d’injection Six Voies• Automatisation Passeurs automatiques

La détection - Généralités

• Notion de dérive (1 heure) bruit à long terme (10 mn)bruit à court terme (1 mn)

• Sensibilité:Pente de la courbe: Réponse = f (Concentration initiale)

• Concentration minimale détectable: n fois le bruit à court terme

• Détection directe et différentielle

Les différents Détecteurs

Détecteurs Simples

Ultra violetFluorimétrieRéfractométrieDiffusion de lumière

ElectrochimiqueConductimétrique

Détecteurs semi Informatifs

UV multi lambdaFluorimètre programmable

Multi électrodes

Détecteurs intelligents

Spectométrie de MasseFT IRBarrette de diodesRMN

Dérivatisation pré et post colonneDérivatisation Pré Colonne

SimplicitéModification des conditions chromatographiquesEx: Acides aminés (OPA)

Réactions reproductiblesPossibilité de réactions secondaires

Dérivatisation Post Colonne

SélectifMulti détectionExemple:Vitamine C

Matériel plus sophistiquéModification du pic chromatographique

VI°) Les autres techniques HPLC

Technique Phase stationnaire

Phase mobile Solutés

Paire d’ions C8, C18 CH3CN, CH3OH, H2O

Espèces ionisables

Echange d’ions

Résines échangeuses

Tampons aqueux

Ions minéraux cations et

anions

Exclusion Polymères poreux

THF, Tampons aqueux

Polymères hydrophiles et organiques

Chirale Chirale cyclodextrines,

Pirkle

Aqueuses et organiques

Enantiomères

Chapitre N°6

L’absorption Moléculaire UV-VisibleEt

L’absorption atomique

L’absorption moléculaireSommaire

IntroductionDétermination de l’indice Phénol NF T 90-109

Détermination de As3+ NF T 20-054

Détermination du Fer total et du Fe2+ NF T 90-017

Détermination du Phosphore soluble NF X 31-161

Le spectrophotomètre d’absorption moléculaire

Introduction

• Absorption Atomique: Concerne les électrons atomiques (absorption et émission)

• Absorption et Émission Moléculaire: Concerne les électrons des liaisons moléculaires, les électrons délocalisables ().

• Mêmes concepts: Dualité Onde / Énergie E = h = h c /

• Spectre de la lumièreDomaine UV: 200-350 nm

Domaine Visible: 350 – 800 nm

• Complémentarité Absorption / CouleurTriangle des couleurs

• Utilisation des propriétés d’absorptions pour une quantification

• Nombreuses applications : Cations , Anions, Molécules Organiques

• Sélectivité plus ou moins importante

• Loi de Beer-Lambert: log10 I0/It = .l.Ce : Coefficient d’extinction molaire

. Quantification par étalonnage externe

Détermination de l’indice phénolEaux NF T 90-109

• PrincipeDistillation des phénols en milieu acide

(H3PO4) en présence de CuSO4(action bactérienne) (Entraînement à la vapeur)Enregistrement du spectre UV à 254 et 270 nm ( # 6000 et 1500) cuve quartz 1cmComparaison à un étalonnage externe

• Applications: 0,025 – 0,5 mg/l

Dosage de l’arsenicCorps gras NF T 20-054

• PrincipeRéduction de l’arsenic sous forme d’arsine AsH3

par Zn en milieu HCl Absorption de l’arsine par le diéthyldithiocarbamate d’argent: Ag(DDTC) AsH3 + 6 Ag(DDTC)…. 6 Ag + 3H(DDTC) + As(DDTC)3

• Formation d’Argent colloïdal dispersé: Rouge – Violet• Mesure de la DO à 540 nm cuve 1cm• Comparaison à un étalonnage externe• Application: masses de 1 à 20 µg d’Arsenic

Dosage du ferEaux NF T 90-017

• Fet = Fe dissous + Fe suspension• Formation d’un complexe coloré entre Fe2+ et l’ortho

phénanthroline (1-10) Rouge –Orangé (510nm)• Fer total: Oxydation par le peroxodisulfate

Fe3+ Réduction par le chlorydrate d’hydroxylamine pH # 4,5

Fe2+ Complexation (15mn à l’obscurité)• Fer dissous: Réduction du Fe3+ dissous

Complexation• Fe2+ dissous Complexation directe• Applications 10 µg/l – 10mg/l

Le phosphore solubleSols NF X 31-161

• Principe: Méthode de Joret-HébertExtraction du phosphore soluble (sous toutes ses formes) par l’oxalate d’ammonium (pH = 7)

• Complexation du phosphore sous forme de complexe phosphomolybdique réduit avec le réactif sulfomolybdique (heptamolybdate d’ammonium, Acide ascorbique, thiosulfate de sodium, formol)

• Développement chaud (100°C, 5mn) d’une coloration violette

• Mesure de la DO à 825 nm• Domaine d’application: 1 – 10 mg/l de P

sols: Expression du résultat en P2O5

Le spectrophotomètre

• Source• Monochromateur• Fentes (Slit)• Cuve• Photomultiplicateur• Amplificateur• Calculateur

Sources et rayonnement incident

• Lampes à décharge (lumière blanche)• Multi longueurs d’onde

- Deutérium (Domaine UV)- Vapeur de mercure (Domaine visible)

• Simple et double faisceaux• Sélecteur: Monochromateur• Fente (Slit): Permet de réguler l’énergie du

rayon incident

Cuves

• Cuves:- Plastique (jetables)Attention aux solvants organiques- Verre (domaine du visible)- Quartz (domaine UV)

• A remplissage et à circulation (Cinétique – Passeurs automatiques)

• Trajets optiques: 0,1 à 5 cmfonction de la concentration et du coefficient d’extinction molaire

• Zéro optique: Sur Blanc (0 d’absorbance)

Rayonnement transmis

• Photomultiplicateur : Comptage des photons transmis: Travail en Absorbance (A) ou en Transmitance (T)

• Amplificateur• Calculateur: Io, It, A (T), log10(A), C• Restitution du spectre, des concentrations…• Gamme de linéarité de Beer-Lambert

(Étalonnage externe)

L’absorption atomique

Sommaire• Introduction• Principe de l’absorption et de l’émission• Schéma général d’un spectromètre d’AA• Les différentes parties du spectromètre• La quantification• Applications• Analyse de traces

Introduction

• Analyse de cations minéraux• Actuellement: Environ 60 éléments du tableau de

Mendeleiev• Nombreuses applications: Métallurgie, Géologie,

Environnement, Agriculture, Agro alimentaire…• Impératif: Mise en solution de l’échantillon

Eaux NF T90-112 FlammeEaux NF T90-119 Four Eaux NF T90-131 Flamme Froide Sols NF X31-151 Flamme

Principe• Atome = Noyau + électrons• Électrons: Gravitent autour du noyau (Champs

électrostatique): Notion d’orbitales: Niveaux d’énergie quantifiés

• État fondamental + Énergie électromagnétique:État excité (Passage de l’e- d’un niveau fondamental à un niveau supérieur) : Instable : Retour à l’état fondamental

• Restitution calorifique: Absorption atomique• Restitution lumineuse: Émission atomique

• E = f (h, c et longueur d’onde)• Notion de transitions spectrales• Spectres de raies spécifiques à chaque élément• Possibilité de dosage spécifique par éléments

(Interférences)• Équation de Boltzman: Ne = Cste x N0e-(E/kT)

• Emission: Ne élevé• Absorption: N0 élevé• Loi # Beer-LambertA = I0/It

• Log10 A = K.l.C K = Coef. d’absorption monochromatique

Schéma général d’un spectromètre d’Absorption Atomique (Emission)

• Une source de photons: Source d’émission• Une source d’atomes: Source d’atomisation• Un monochromateur: Sélecteur de radiations• Un détecteur: Photomultiplicateur +

amplificateur

Source de photons

• Tube à décharge à cathode creuse– Cathode : Élément à doser (sel)– Anode: Lame de Zirconium– Tube ‘rempli’ de gaz inerte (Ne, Ar) – Décharge : Tension 500 - 800 volts – Intensité = qqes mA (suivant élément)

• Obtention du spectre d’émission de l’élément à doser

• Lampes mono élément et multi éléments

Générateurs d’atomes

• Fonction de la nature des éléments à doser• Flamme: Cas général• Atomisation thermique: Détection

plus basse• Flamme froide et générateurs d’hydrures:

spécifique à certains éléments (Hg,As..)• Torche à plasma

Atomisation en flamme

• Objectif: Transformer des espèces de la forme ionique à la forme atomique

• Analyse d’échantillons liquides exempts de particules solides.

• Capillaire: Transfert de l’échantillon vers la chambre de nébulisation

• Nébuliseur: Formation d’un brouillard dans le comburant: Fines gouttelettes

• Brûleur: Transformation des espèces à l’état atomique

Principales Flammes

Combustible

Hydrogène

Comburant

Argon

Température

1000 K

PropaneButane

Air

Oxygène

2200 K

3200 K

AcétylèneAir

OxygèneProtoxyde

d’azote

2500 K3400 K3200 K

Autres Générateurs d’atomes

• Atomisation électrothermique: Four - Séchage (# 100°C)

- Décomposition thermique (100 à1800°C)- Atomisation (1800-2600°C)- Nettoyage Four (2800°C)

• Générateur de mercure HgCl2 + SnCl2….Hg° + SnCl4

• Générateurs d’hydrures As, Sb…Formations d’hydrures (AsH3) + Flamme froide (1000°C)

Sélecteur de radiations et PM

• Monochromateur: Sélection d’une longueur d’onde

• Bande passante: 0,05 à 0,1 nm si spectre complexe sinon 0,5 à 2 nm

• Photomultiplicateur: Permet de compter les photons transmis

• Amplificateur + calculateur

La quantification

• Étalonnage externe (ajouts dosés)• Flamme: Mesure en continu à flux

constant…..Permet de minimiser les fluctuations de la flamme

• Pb des interférences (chimiques, spectrales…)• Utilisation de modificateurs LaCl3, HNO3..• Réalisation de dilutions• Sensibilités: Flamme # ppm

Four # ppb

Exemples d’Applications

• Sols, Sédiments NF X 31-151- Calcination à 450°C -

Solubilisation (HF,HCLO4) - Evaporation et mise à sec - Reprise eau régal(HCl/HNO3)

• Dosage par absorption atomique (Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Zn)

Eaux : Dosage du Hg par SAA sans flamme NF T 90-113

• Minéralisation de l’échantillon par KMnO4 et K2S2O8 à 95°C

• Réduction par SnCl2 Obtention de Hg°• Entraînement sous argon• Mesure à 253,7 nm Cuve à fenêtre• Limite de dosage 0,5 µg/l

Eaux: Dosage de dix éléments métalliques (directe et indirecte)

• NF T90-112 (Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ag, Cd et Pb)

• Flammes air / acétylène - Oxydantes Fe, Ni, Cu, Mn - Réductrices Cr - Normales Co, Zn, Ar, Cd et Pb

• Ex du plomb: 283,3 nm et/ou 217 nm• Dosage direct

Elément Longueur d’onde Détection (ppm)

Cr 357,9 0,1-10

Mn 279,5 0,05 - 4

Fe 248,3 0,1 - 10

Co 240,7 0,1 - 10

Ni 232 0,1 - 10

Cu 324,7 0,05 - 6

Zn 213,8 0,05 - 2

Ag 328,1 0,05 - 4

Cd 228,8 0,05 - 2

Pb 217 0,2 - 10

Dosage indirect

• Complexation(APDC) et extraction du complexe par la MIBC

• Dosage dans le phase organique

Cr 1-200 ppbMn 1-200 ppbFe 1-200 ppbCo 1-200 ppbNi 1-200 ppbCu 1 -200ppbZn 0,5 - 50ppbAg 0,5 - 25ppbCd 0,5 - 50ppbPb 1- 200 ppb