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Chapitre 1. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
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Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
Publication 1- Biotechnol. Agro. Soc. Environ.
Biotechnology, Agronomy, Society and Environnment
Mputu Kanyinda Jean-Noël (1,2)
, Pierart Céline(3)
, Destain Jacqueline (1)
, Noki Philippe (2)
,
Thonart Philippe (1)
(1) Université de Liège-Gembloux Agro-Bio Tech, Dpt. de Chimie et Bio-industrie. Passage
des Déportés, 2. B-5030 Gembloux (Belgique). E-mail : kanyinda2004@gmail.com.
(2) Université de Kinshasa, Faculté des Sciences, Dpt. de Chimie. Mont-Amba, B.P. 190
KinXI. Kinshasa (R.D.Congo).
(3) Artechno SA, rue Camille Hubert, 17-Crealys Science Park, 5032 Isnes/ Gembloux,
Belgique.
Remerciements
Nous remercions très sincèrement la Coopération Technique Belge et la Wallonie Bruxelles
pour leur soutien financier.
* Corresponding author: Centre Wallon de Biologie Industrielle, Passage des déportés n°2
Tel.+32.81.62.23.05, Fax.+32.81.61.42.22, E-mail:kanyinda2004@gmail.com.
Chapitre 1. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
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Résumé
Le séchage de Pseudomonas fluorescens rend plus économique sa conservation, son
transport et sa commercialisation. Il a pour but d’arrêter et de stabiliser toute activité
biologique en vue d’une conservation optimale, compatible avec la préservation d’une
viabilité maximale. La viabilité des bactéries après séchage dépend des conditions opératoires
de ce dernier. L’un des critères les plus importants à considérer lors du séchage de produits
biologiquement actifs est la qualité du produit final sec. La lyophilisation est la méthode de
séchage la plus utilisée pour Pseudomonas. Mais les changements de température induit par le
séchage ne sont pas sans conséquence pour les cellules. Ils sont responsables des altérations
cellulaires (peroxydation des acides gras) de l’oxydation des protéines et de l’ADN.
L’utilisation de composés protecteurs avant la lyophilisation permet de réduire les
phénomènes d’oxydation tout en maintenant une viabilité élevée au cours du stockage.
Mots-clés. Acide gras, Composé protecteur, lyophilisation, oxydation, Pseudomonas,
viabilité.
Abstract
The drying Pseudomonas fluorescens makes more economical storage, transportation
and marketing. It aims to stop and to stabilize all biological activities for an optimal storage,
compatible with the conservation of maximum viability of microorganisms desired. The
viability of bacteria after drying depends on the operating conditions of the latter. One of the
most important criteria to consider during the drying of biologically active products is the
quality of the final dried product. Freeze-drying is the most drying method used for
Pseudomonas. But temperature changes it induced are not without consequence for the cells.
They are responsible for cell damage (peroxidation of fatty acids) and genetic (proteins and
DNA oxidation). However, use of protective compounds during freeze-drying and during
storage increases significantly the rate of cell viability.
Chapitre 1. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
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Keys words: Fatty acids, Freeze-drying, oxidation, protective compounds, Pseudomonas,
viability.
1. Pseudomonas fluorescens
1.1 Introduction
Pseudomonas fluorescens est une bactérie gram-négative, fermentant le glucose mais
pas le lactose, oxydase positive en forme de bâtonnets avec des flagelles polaires qui lui
assurent la mobilité. C’est une bactérie ubiquitaire rencontrée dans les sols, sur les racines des
végétaux, sur les plantes, ainsi que dans les eaux douces et marines (Charan, Reddy et al.
2011; Wong, Levi et al. 2011). Il appartient à la classe des Gammaproteobacteria, famille des
Pseudomonadacea et au genre Pseudomonas. La fluorescence est due à la production d’un
pigment fluorescent jaune-vert appelé pyoverdine soluble dans l’eau et insoluble dans le
chloroforme (Paulsen, Press et al. 2005; Wong, Levi et al. 2011; Gao, Yin et al. 2012; Trögl,
Chauhan et al. 2012). Sa température de croissance optimale se situe entre 25 et 30°C.
1.2. Ecologie
Pseudomonas fluorescens est une espèce commensale chez les plantes, leur permettant
d’atteindre les éléments nutritifs indispensables à leur croissance. Il dégrade les polluants et
produit des antibiotiques. Cette espèce est connue pour son aptitude à réduire l’incidence des
maladies racinaires des plantes, ainsi qu’à inhiber la croissance d’un grand nombre d’agents
phytopathogènes (Akram et al., 2008; Aremu et al., 2010; Gao et al., 2012). Cette inhibition
résulte de plusieurs mécanismes incluant la production d’une large gamme de métabolites
antagonistes et de sidérophores. Ces derniers ont une grande affinité pour le fer et engendrent
donc une compétition avec d’autres organismes du sol (Dhanya and Potty, 2007;
Bhattacharya, 2010). On note également pour certaines souches une capacité à induire les
mécanismes de défense chez la plante, mais dans la plupart des cas d’inhibition, le facteur
Chapitre 1. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
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déterminant est la production d’antibiotiques agissant directement sur l’agent pathogène
(Walsh et al., 2001; Charde and Dawande, 2010).
1.3. Métabolisme
Pseudomonas fluorescens a des besoins nutritionnels simples et peut facilement se
développer dans des milieux minéraux complétés par une variété de sources de carbone,
certaines souches peuvent utiliser l’ion nitrate (NO3-) comme accepteur d’électrons en lieu et
place de l’O2. Il produit de la pyoverdine, responsable de la chélation de fer (Bhattacharya,
2010). Il produit également certaines enzymes stables à la chaleur (lipases et protéases) qui
sont impliquées dans l’altération du lait (Bakker et al., 2007; Charde and Dawande, 2010) ;
mais aussi certains antibiotiques (2,4-diacetylphloroglucinol, phenazines, pyrrolnitrine, HCN
etc…) qui contribuent à la protection contre les pathogènes (Walsh et al., 2001; Paulsen et al.,
2005; Anand and Kulothungan, 2010).
1.4. Caractéristique de la structure membranaire de la bactérie gram négative
Structure membranaire
La paroi cellulaire des bactéries Gram-négatives est fine et élastique; elle est couverte
d’une membrane externe contenant les lipides liés de manière covalente à des polysaccharides
tandis que celle des bactéries Gram-positives est épaisse et rigide (Coulibaly et al., 2008;
Coulibaly, 2010; Volodymyr, 2010). Les bactéries gram-négatives ont une couche de
peptidoglycane d’environ 5 à 10 nm d'épaisseur entre les membranes plasmiques intérieure et
extérieure, tandis que l'épaisseur de cette couche est d'environ 20 à 80 nm chez les bactéries
Gram-positives (Figure 1) (Beveridge, 1999; Tripathi et al., 2012). Les parois cellulaires des
bactéries Gram-négatives, avec une couche plus mince de peptidoglycane que celles de
bactéries Gram-positives, ont tendance à se rompre plus facilement pendant les processus de
dessiccation et de réhydratation (Pembrey et al., 1999).
Chapitre 1. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
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Figure 1. Différence entre la paroi d’une bactérie gram-négative et gram-positive d’après
Tripathi et al. (2012).
L’absence d’acide techoïque chez les bactéries Gram-négatives réduit encore leur
résistance au séchage par rapport aux bactéries Gram-positives. Enfin la plupart des bactéries
Gram-négatives ont des lipopolysaccharides sur leur surface, ces lipopolysaccharides peuvent
piéger des molécules d'eau, entraînant une baisse des taux de survie au cours du stockage à
long terme ( Miyamoto-Shinohara et al., 2008; Miyamoto-Shinohara et al., 2010).
1.5. Applications de Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas fluorescens a plusieurs applications, les plus connues concernent
l’agriculture où il est utilisé en lutte biologique et comme stimulateur de croissance des
plantes PGPB (Plant Grown Promoting Bacteria) (Ongena et al., 2000; Ongena et al., 2005;
Russo et al., 2005; Couillerot et al., 2009; Anita and Samiyappan, 2012; Gao et al., 2012).
Pseudomonas fluorescens combat plusieurs infections des plantes, leurs modes d’action dans
la suppression des maladies des plantes incluent les sidérophores pour la compétition du fer
disponible, l’antibiose, la production d’enzymes lytiques et le Système de Résistance Induit
(ISR) (Ongena et al., 1999; Ongena et al., 2005; Paulsen et al., 2005; Russo et al., 2005;
Bakker et al., 2007; Anita and Samiyappan, 2012). Il est également utilisé comme catalyseur
dans la réaction de transestérification de l’huile de Jatropha pour la production de biodiesel
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(Devanesan et al., 2007). Pseudomonas fluorescens joue aussi un rôle dans la protection de
l’environnement par la dégradation des hydrocarbures et d’autres types de polluants (Lemire
et al., 2010; Pandey and Upadhyay, 2010; Moneke et al., 2010). Pseudomonas fluorescens est
actuellement étudié en médecine car il produit un antibiotique particulier (mupirocine) qui a
prouvé son efficacité dans le traitement de certaines maladies de la peau, des troubles
oculaires et auditifs (Mazereeuw-Hautier, 2006).
2. Généralités sur le séchage des micro-organismes
2.1. Introduction
Les souches microbiennes, qu’ils s’agissent de bactéries, de levures ou de moisissures,
nécessitent un conditionnement stable durant une longue période en vue de leur
commercialisation (Zamora et al., 2006). Les cellules microbiennes se conservent rarement à
l’état natif dans leur milieu de culture. Leur croissance est souvent réalisée en fermenteur dans
un substrat liquide mais conservés dans ce milieu après leur croissance; les cellules y
consomment les derniers nutriments disponibles et révèlent, pour la plupart un métabolisme
fermentaire qui nuit à la qualité du produit (modification du pH, émanation d’odeurs, etc.). De
plus, les cellules, après avoir épuisé leurs réserves, meurent en grand nombre. Il est donc
nécessaire de stabiliser la population microbienne et le séchage des cellules apparaît comme
une solution pratique (Zhao and Zhang, 2005; Coulibaly et al., 2011).
Le séchage des micro-organismes a pour but de leur assurer une conservation
optimale, compatible avec la préservation d’une viabilité maximale, et rendre ainsi plus
économique leur stockage, leur transport et leur commercialisation. (Bossart and Halloin,
2001; Demirhan and Özbek, 2010). Il existe plusieurs techniques de séchage des
microorganismes appliquées à l’échelle industrielle à savoir l’atomisation (Bucio et al., 2005;
Coulibaly et al., 2011), la fluidisation (Li et al., 2004) et la lyophilisation (Rey, 1965; Perry,
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1998; Palmfeldt et al., 2003; Zhao and Zhang, 2005; Nanasombat and Sriwong, 2007;
Coulibaly et al., 2009). Ces méthodes sont assez agressives vis-à-vis des micro-organismes
puisqu’elles soumettent ces derniers à des variations plus ou moins importantes de
température et ou de pression. Par ailleurs, des effets liés au flux d’eau à travers les
membranes cellulaires peuvent également être déterminants sur la qualité du produit séché
(Bossart and Halloin, 2001; Coulibaly et al., 2011). Ces techniques entrainent des dommages
à la membrane cellulaire, comme une peroxydation lipidique, une dénaturation des protéines
et de l'ADN conduisant in fine à une perte de viabilité (Zhao and Zhang, 2005). De toutes ces
techniques, la littérature indique que la lyophilisation apparaît la plus utilisée en dépit de son
coût, pour le séchage et la conservation des bactéries en général et des Pseudomonas spp en
particulier car elle est adaptée pour les souches sensibles à des températures élevées (Harrison
and Pelczar, 1963; Vidhyasekaran and Muthamilan, 1995; Palmfeldt et al., 2003).
2.2. Impact du séchage sur la viabilité des bactéries
Le séchage a un impact direct sur la viabilité des bactéries. Il existe plusieurs facteurs
qui influencent directement cette viabilité, il s’agit notamment des facteurs physiques
(Lievense and Riet van't, 1994; Morgan et al., 2006; Coulibaly et al., 2011) mais aussi des
facteurs biologiques (Lievense and Riet van't, 1993; Miyamoto-Shinohara et al., 2008). Les
bactéries gram-positives résistent mieux à la lyophilisation comme les bactéries lactiques
(Castro et al., 1995; Perry, 1998; Selmer-Olsen et al., 1999; Nanasombat and Sriwong, 2007)
tandis que leurs homologues gram-négatives, et notamment Pseudomonas et Escherichia coli
sont très sensibles à toute forme de séchage surtout en l’absence de composés protecteurs
(Louis et al., 1994; Palmfeldt et al., 2003). Cette différence de résistance au séchage entre les
bactéries gram-positives et gram-négatives est principalement due à la composition de leur
paroi cellulaire. Il a été établi que la température, l’exposition à la lumière et l’humidité
relative affectent la stabilité des bactéries lyophilisées au cours de leur stockage et favorisent
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les phénomènes d’oxydation (Teixeira et al., 1996; Coulibaly et al., 2010). D’autres aspects
affectant la survie des bactéries pendant le séchage sont notamment l’acidité, la concentration
de la biomasse et les réactions d’oxydation (Lievense and Riet van't, 1994). Une forte
concentration d’acide est nuisible à la cellule tandis que la concentration élevée d’autres
composants par exemple les sels dans le milieu provoque une augmentation de la pression
osmotique pouvant conduire à la plasmolyse de la cellule (Lievense and Riet van't, 1994). Les
travaux réalisés par Palmfeldt et al. (2003) et Stephan et al. (2007) ont montré que le fait de
récolter les cellules après la phase stationnaire leur permettait de s’adapter aux conditions des
stress et améliorer leur viabilité après le séchage tandis que (Jørgensen et al., 1994) ont
confirmé qu’il était essentiel pour la survie de Pseudomonas fluorescens que son activité
d’eau soit comprise entre 0,2 et 0,4.
2.3. Les dégâts oxydatifs cellulaires
Le séchage et la conservation rendent les bactéries vulnérables aux phénomènes
d’oxydation et sont responsables de différentes formes de dommages cellulaires. La
lyophilisation entraine des dommages à la membrane cytoplasmique, une modification de la
composition des lipides, une altération de l’ADN/ARN et une dénaturation des protéines
(Lievense and Riet van't, 1994; Santivarangkna et al., 2008). Tous ces changements
conduisent à la perte de la viabilité (Palmfeldt et al., 2003; Nanasombat and Sriwong, 2007).
L’oxydation des lipides membranaires est l’une des principales causes de la mortalité
cellulaire durant le stockage (Halliwell and Chirico, 1993; Lievense and Riet van't, 1994).
Castro et al. (1995 et 1996) et Coulibaly et al., (2009) ont démontré que les dommages subits
par la membrane cellulaire de Lactobacillus durant son stockage étaient en partie dus à la
présence de l’humidité relative et à une température de stockage élevée. Jusqu’à ce jour peu
d’études ont été menées sur la compréhension des mécanismes responsables de la perte de
viabilité chez les bactéries Gram-négatives. Israeli et al., (1993) ont montré que l’exposition à
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l’air et à la lumière augmentaient le taux de mortalité d’Escherichia coli et de Pseudomonas
syringae. Palmefeldt et al. (2003) ont émis l’hypothèse selon laquelle la perte de viabilité des
bactéries était en partie due à l’oxydation du DNA.
2.4. Modifications de la structure membranaire
La structure membranaire est la première cible de la détérioration de l’état
physiologique des cellules lors d’une situation de stress (Béal et al., 2008), ce qui conduit à
une rupture de la paroi cellulaire (Lievense and Riet van't, 1994). Le dommage subit par la
membrane cytoplasmique est principalement du à la déshydratation, ce qui entraine comme
conséquence le relargage en solution des composants intracellulaires (cations, nucléotides,
enzymes, protéines etc) des cellules lyophilisées au cours de leur réhydratation (Lievense and
Riet van't, 1994; Yao et al., 2008). Les températures élevées modifient les propriétés des
molécules hydrophobes (acides gras) de la membrane et les interactions solvant-protéines au
cours du séchage. Cela se traduit entre autres par une diminution de la stabilité des
interactions hydrophobes entre deux molécules apolaires (acides aminés) au sein des
membranes, par une modification de la configuration des protéines membranaires pouvant
entraîner leur dénaturation (Mazur, 1970), et par la modification de la composition lipidique
de la membrane au cours du stockage (Coulibaly et al., 2010; Coulibaly et al., 2011). Cette
situation de stress pousse les cellules à utiliser leurs propriétés d’auto-défense contre ces
phénomènes d’oxydation (production du glutathion, de la superoxyde dismutate etc.) (Leslie
et al., 1995; Luqman and Rizvi, 2006). Le glutathion est un tripeptide utilisé comme
marqueur du degré de stress environnemental. Il protège les cellules contre les sous-produits
générés par le métabolisme oxydatif en maintenant l’intégrité cellulaire et participe aux
principaux processus cellulaires tels que la synthèse des protéines, la régulation de l’activité
enzymatique, la synthèse du DNA. Tandis que la superoxyde dismutase détruit les radicaux
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toxiques aux systèmes biologiques (Leslie et al., 1995 ; Hultberg, 1998 ; Luqman and Rizvi,
2006).
2.4.1. Peroxydation lipidique
Pendant la lyophilisation et au cours du stockage, les bactéries subissent d’intenses
phénomènes de dégradation, liés pour la plupart à l’oxydation des lipides membranaires. Ces
réactions d’oxydation sont les principaux facteurs déterminant la durée de vie des cellules
(Coulibaly et al., 2011). La peroxydation lipidique est un phénomène général qui se produit
en présence d’oxygène. Tous les lipides contenant des acides gras insaturés sont concernés.
Coulibaly et al. (2008) ; Yao et al. (2008) ont montré chez les bactéries gram-positives que
les acides gras polyinsaturés étaient les premières cibles des attaques des radicaux libres au
cours de leur stockage à l’état sec et génèrent des peroxydes lipidiques qui sont très réactifs.
Ils ont également établi une relation entre la perte de la viabilité et la diminution du ratio
acides gras polyinsaturés/ acides gras saturés (U/S) de cellules de Lactobacillus lyophilisées.
Zhang et al. (2007) ont montré que les acides gras polyinsaturés avec au moins deux double
liaisons étaient plus facilement oxydés. Cette peroxydation lipidique fournit une grande
variété de produits, dont certains réagissent avec les protéines et l’ADN. Parmi ceux-ci
citons : le malondialdéhyde (MDA) et le 4-hydroxynonénal (4-HNE) qui sont les plus étudiés
comme marqueurs de la peroxydation lipidique (Marnet, 1999; Yao et al., 2009). Les
mécanismes en chaine de la dégradation des acides gras membranaires conduisent à la
formation d’hydroperoxydes instables (ROOH) responsables de la diminution de la fluidité
membranaire, de la dénaturation des protéines et du DNA, de la diminution de la perméabilité
et de la sensibilité des membranes (Alberts et al., 2012).
Chapitre 1. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
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2.4.2. L’oxydation des protéines
Comme pour les lipides, la lyophilisation et le stockage entraine des dommages aux
protéines, étant donné que leur structure dépend partiellement de l’eau. Ces protéines forment
avec l’eau des liaisons qui sont rompues lors de la lyophilisation conduisant ainsi à leur
dénaturation. Les composés carbonyles réactifs tels que le ribose, le diacétyle et le pyruvate,
doivent être enlevés de la suspension cellulaire avant la lyophilisation parce qu’ils peuvent
réagir avec les groupes aminés des composants cellulaires essentiels et rendre ainsi les
protéines vulnérables aux phénomènes d’oxydations (Lievense and Riet van't, 1994). Les
réactions d’oxydations des protéines modifient les résidus d’acides aminés (lysine, arginine,
proline et hystidine) et génèrent des fragments carbonylés identifiés comme marqueur de
l’oxydation des protéines (Luqman and Rizvi, 2006; Suzuki et al., 2010; Wong et al., 2011;
Jha and Rizvi, 2011) (figure 2).
Figure 2. Le mécanisme de la modification oxydative des protéines (d’après Petropoulos
2011).
Chapitre 1. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
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Les protéines les plus sensibles aux attaques radicalaires sont surtout celles qui comportent un
ou plusieurs groupements sulfhydryles (SH). Leslie et al. (1995) ont montré que les protéines
modifiées par oxydation s’insolubilisent et deviennent beaucoup plus sensibles à l'action des
protéases.
2.4.3. Dommage de l’ADN
Bien que le dégât subit par la membrane cellulaire pendant la lyophilisation joue un
rôle essentiel dans la perte de viabilité, les dommages des composants cellulaires (ADN et
ARN) affectent considérablement la viabilité des cellules lyophilisées. L’ADN est très
sensible au séchage comme démontré chez E. coli (Santivarangkna et al., 2007). Les
modifications observées après l’oxydation du DNA sont très nombreuses, il s’agit entre autre
de la conversion des résidus thymine en thymine glycol et en 5-hydroxyméthyluracile, de la
guanine en 8-hydroxyguanine, l’oxydation du désoxyribose entraîne une coupure des brins.
En effet, la guanine est la cible privilégiée de nombreux oxydants (Cadet et al., 1995; Cadet et
al., 2003; Saumaa et al., 2007; Kumari et al., 2008).
3. La cryoprotection des bactéries
La lyophilisation a longtemps été considérée comme la technique de déshydratation
appropriée pour les bactéries (Palmfeldt, Radström et al. 2003; Morgan, Herman et al. 2006;
Santivarangkna, Higl et al. 2008). Le choix d’un composé protecteur appropriés est très
important pour assurer une viabilité élevée des bactéries pendant la lyophilisation et au cours
du stockage (Lievense and Riet van't 1993; Leslie, Israeli et al. 1995; Kawahara 2008).
Tableau 1. Quelques caractéristiques et substances utilisées comme cryoprotecteurs
intracellulaires (CPI) et extracellulaires (CPE) d’après Coulibaly et al. (2011).
Chapitre 1. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
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Caractéristiques Intracellulaires (CPI) Extracellulaires (CPE)
Poids moléculaire (g/mol) <400 >10000
Activité à une concentration de l’ordre de la mole (M) de la millimole (mM)
Exemples de molécules utilisées glycérol, méthanol, lactose, saccharose, tréhalose
éthanol, dyméthylsulfoxyde polyvinyl pyrrolidone, dextran
polyéthylène oxyde (PEO-400) maltodextrine, amidon
Ces composés protecteurs doivent être peu volatils, solubles dans l’eau et n’avoir aucun
caractère toxique au niveau cellulaire. Ils ont des origines diverses : polyols, sucres, protéines
laitières, acides aminés, antioxydants ou macromolécules (Béal, Marin et al. 2008). Le
Tableau 1 nous donne les différentes classes des composés protecteurs.
Yao et al. (2008 et 2009) ; Coulibaly et al., (2009 et 2010) ont prouvé pour les
bactéries Gram-positives que plus l’activité d’eau est basse mieux est la conservation des
poudres lyophilisées. Dans ce système, l'activité de l’eau influence les réactions d’oxydation
des lipides, car l'eau permet la mobilisation favorise la formation des substances pro-
oxydantes. En général, une activité d’eau (aw) comprise entre 0,2 et 0,3 correspond aux
vitesses d’oxydation les plus faibles. Par contre, une aw comprise entre 0,6 et 0,8 correspond
aux vitesses d’oxydation les plus grandes (Coulibaly et al., 2011). De nombreux auteurs dont
Harrison and Pelczar, (1963) ; Daigle et al. (2002) ; Palmfeldt et al. (2003) et Stephan et al.
(2007) ont mis en évidence l’apport des composés protecteurs sur la viabilité de Pseudomonas
lors des opérations de séchage (tableau 2).
Tableau 2. Viabilité des Pseudomonas après les différentes opérations de séchage.
Souches technique [cfu/ml] [cfu/g] auteurs
avant séchage après séchage
Pseudomonas sp Lyophilisation 7,8x109
1,3x109 (a)
P. fluorescens 1,0x1010
3,2x107 (a)
Harrison et Pelczar, 1963
P. chlororaphis 4,4x109 6,8x10
7 (a)
P. chlororaphis Lyophilisation 3,5x109 9,1x10
8 (a)
3,5x106 (b)
Palmfeldt et al., 2003
P. fluorescens BRG100 Fluidisation 3,1x109 6,6x10
6 (a) Daigle et al., 2002
(a) Poudre avec composé protecteur, (b) poudre sans composé protecteur
Chapitre 1. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
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4. Conclusions
La lyophilisation reste à ce jour la technique la mieux adaptée pour le séchage et la
conservation de Pseudomonas fluorescens, car elle permet l’obtention d’une poudre ayant une
viabilité assez élevée comparativement à celles obtenues par atomisation ou par fluidisation.
Les conditions opératoires d’obtention et de conservation d’une poudre ayant une meilleure
activité métabolique sont relativement bien connues chez les bactéries Gram-positives, mais
pas chez les Gram- négatives. Cependant les mécanismes de leur altération restent obscurs à
ce jour. La connaissance de certains paramètres responsables de la perte de viabilité de
Pseudomonas fluorescens pendant leur lyophilisation et au cours de leur stockage permettra
de résoudre le problème lié à leur conservation et aussi à leur transport. Dans le souci
d’optimiser la conservation de la poudre lyophilisée de Pseudomonas fluorescens, certaines
techniques et voies de recherches doivent être explorées. Nous retenons parmi elles, l’étude
des modifications subies par les structures cellulaires au cours des traitements de séchage et
de conservation (la composition en acides gras membranaires, l’oxydation des acides gras,
l’oxydation des protéines et l’oxydation de l’ADN) ainsi que l’utilisation d’un emballage
adéquat (imperméable à la lumière et à l’oxygène).
5. Remerciements
Nous remercions très sincèrement la Coopération Technique Belge (CTB) et Wallonie
Bruxelles International (WBI) pour leur soutien financier.
6. Bibliographie
Akram, A., M. Ongena, F. Duby, J. Dommes and P. Thonart, 2008: Systemic resistance and
lipoxygenase-related defence response induced in tomato by Pseudomonas putida
strain BTP1. BMC Plant Biol. 8, 1-12.
Chapitre 1. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
27
Alberts, B., D. Bray, K. Hopkin, A. Johnson, Julian Lewis, M. Raff, K. Roberts and P.
Walter, 2012: L'essentiel de la biologie cellulaire. lavoisier, Paris France.
Anand, R. and S. Kulothungan, 2010: Antifungal metabolites of Pseudomonas Fluorescens
against Crown Rot Pathogen of Arachis Hypogaea. An. Biol. Res. 1, 199-207.
Anita, B. and R. Samiyappan, 2012: Induction of systemic resistance in rice by Pseudomonas
fluorescens against rice root knot nematode Meloidogyne graminicola. J. Biopest. 5,
53-59.
Aremu, M. O., O. A. Olu-Arotiowa, S. K. Layokun and B. O. Solomon, 2010: Growth of
Pseudomonas fluorescens on Cassava Starch hydrolysate for Polyhydroxybutyrate
production. J. Appl. Sci. Environ. Manage. 14, 61-66.
Bakker, P. A. H. M., C. M. J. Pieterse and L. C. V. Loon, 2007: Induced Systemic Resistance
by Fluorescent Pseudomonas spp. Amer. Phytopat. Soc. 97, 239-243.
Béal, C., M. Marin, E. Fontaine, F. Fonseca and J. P. Obert, 2008: Production et conservation
des ferments lactiques et probiotiques. In: G. Corrieu and F.-M. Luquet eds. Bactéries
lactiques, de la génétique aux ferments. pp. 661-785. Tec & Doc Lavoisier, Paris.
Beveridge, T. J., 1999: Structures of Gram-Negative Cell Walls and Their Derived Membrane
Vesicles. J. Bacteriol. 4725-4733.
Bhattacharya, A., 2010: Siderophore Mediated Metal Uptake By Pseudomonas Fluorescens
and Its Comparison To Iron (III) Chelation. Cey. J. Sci. (Bio. Sci.) 39, 147-155.
Bossart, L. and V. Halloin, 2001: Séchage des levures en lit fluidisé Congrès Francophone de
Génie des Procédés de Nancy. Lavoisier, Nancy, France.
Chapitre 1. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
28
Bucio, A., R. Hartemink, J. W. Schrama, J. Verreth and F. M. Rombouts, 2005: Survival of
Lactobacillus plantarum 44a after spraying and drying in feed and during exposure to
gastrointestinal tract fluids in vitro. J. Gen. Appl. Microbiol. 51, 221-227.
Cadet, J., M. Berger, B. Morin, S. Raoul and J. R. Wagner, 1995: Oxydative damage to DNA.
: . Deutsche Bibliothek Cataloging-in-Publication Data, Germany.
Cadet, J., T. Douki, D. Gasparutto and J.-L. Ravanat, 2003: Oxidative damage to DNA:
formation, measurement and biochemical features. Mut. Res. 531, 5-23.
Castro, H. P., P. M. Teixeira and R. Kirby, 1995: Storage of Lyophilized Cultures of
Lactobacillus bulgaricus under different relative humidities and atmospheres. Appl.
Microbiol. Biotechnol. 44, 172-176.
Charan, A. R., V. P. Reddy, P. N. Reddy, S. S. Reddy and S. Sivaramakrishnan, 2011:
Assessment of genetic diversity in Pseudomonas fluorescens using PCR-based
methods. Biorem. Biodiv. Bioav. 5, 10-16.
Charde, A. and A. Y. Dawande, 2010: Purification and characterization of proteinaceous
compound from Pseudomonas fluorescens (ATCC 948). Asiatic J. Biotech. Res. 1,
20-22.
Couillerot, O., C. Prigent-Combaret, J. Caballero-Mellado and Y. Moënne-Loccoz, 2009:
Pseudomonas fluorescens and closely-related fluorescent pseudomonads as biocontrol
agents of soil-borne phytopathogens. Let. Appl.Microbiol. 48, 505-512.
Coulibaly, I., 2010: Contribution à l'étude de la resistance au séchage des bactéries lactiques
Gembloux Agro-Bio Tech. pp. 235. Université de Liège, Gembloux.
Chapitre 1. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
29
Coulibaly, I., D. R. Dauphin, J. Destain and P. Thonart, 2008: Characterization of lactic acid
bacteria isolated from poultry farms in Senegal. Afr. J. Biotechnol. 7, 2006-2012.
Coulibaly, I., R. Dubois-Dauphin, S. Danthine, L. Majad, T. Mejoub, J. Destain, F. Béra, J.-P.
Wathelet and P. Thonart, 2011: Techniques de séchage des starters lactiques et
mécanismes affectant la viabilité cellulaire suite à la lyophilisation. Biotechnol.
Agron. Soc. Environ. 15, 287-299.
Coulibaly, I., R. Dubois-Dauphin, J. Destain, M.-L. Fauconnier, G. Lognay and P. Thonart,
2010: The resistance to freeze-drying and to storage was determined as the cellular
ability to recover its survival rate and acidification activity. Inter. J. Microbiol., 1-9.
Coulibaly, I., A. A. Yao, G. Lognay and M. L. Fauconnier, 2009: Survival of freeze-dried of
Leuconostoc mesenteroides and Lactobacillus plantarum related to their cellular fatty
acids composition during storage. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 70-84.
Demirhan, E. and B. Özbek, 2010: Drying kinetics and effective moisture diffusivity of
purslane undergoing microwave heat treatment. Korean J. Chem. Eng. 27, 1377-1383.
Devanesan, M. G., T. Viruthagiri and N. Sugumar, 2007: Transesterification of Jatropha oil
using immobilized Pseudomonas fluorescens. Afr. J. Biotechnol. 6, 2497-2501.
Dhanya, M. K. and V. P. Potty, 2007: Siderophore production by Pseudomonas fluorescens
isolated from the rhizosphere of Solenostemon rotundifolius. J. Root Crops 33, 138-
140.
Gao, G., D. Yin, Y. Chen, F. Xia, J. Yang, Q. Li and W. Wang, 2012: Effect of Biocontrol
Agent Pseudomonas fluorescens 2P24 on Soil Fungal Community in Cucumber
Rhizosphere Using T-RFLP and DGGE. Soil Fungal Com. Cucum. Rhizos. 7, 1-9.
Chapitre 1. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
30
Halliwell, B. and S. Chirico, 1993: Lipid peroxydation: its mechanism, measurement and
significance 1-3. Amer. J Clin. Nutr. 57, 715S-725S.
Harrison, A. P. and M. J. Pelczar, 1963: Damage and survival of bacteria during freeze-drying
and during storage over a ten-year period. J . Gen. Microbiol. 30, 395-400.
Jha, R. and S. I. Rizvi, 2011: Carbonyl formation in erythrocyte membrane proteins during
aging in humans. Biomed. Pap. 155, 1-4.
Jørgensen, F., O. Nybroe and S. Knøchel, 1994: Effect of starvation and osmotic stress on
viability and heat resistance of Pseudomonas fluorescens AH9. J. Appl. Microbiol. 77,
340-347.
Kawahara, H., 2008: Cryoprotectants and Ice-Binding Proteins. In: R. Margesin, F. Schinner,
J. C. Marx and C. Gerday eds. Psychrophiles: from Biodiversity to Biotechnology. pp.
229-243. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg.
Kumari, S., R. P. Rastogi, K. L. Singh, S. P. Singh and R. P. Sinha, 2008: DNA Damage:
Detec. Strat. EXCLI J. 7, 44-62.
Lemire, J., R. Mailloux, C. Auger, D. Whalen and V. D. Appanna, 2010: Pseudomonas
fluorescens orchestrates a fine metabolic-balancing act to counter aluminium toxicity.
Environ. Microbiol. 12, 1384-1390.
Leslie, S. B., E. Israeli, B. Lighthart, J. H. Crowe and L. M. Crowe, 1995: Trehalose and
Sucrose Protect Both Membranes and Proteins in Intact Bacteria during Drying. Appl.
Environ. Microbiol. 61, 3592–3597.
Li, J., Y. Pan, G. Chen, A. S. Mujumdar and M. Zhou, 2004: Fluidized-bed drying of
biological materials: two cases studies Inter.Drying Symp. Sâo Paulo, Brazil.
Chapitre 1. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
31
Lievense, L. C. and K. Riet van't, 1993: Convective Drying of Bacteria. The drying process.
Adv. Biotechnol. Eng. Biotechnol. 50, 45-63.
Lievense, L. C. and K. Riet van't, 1994: Convective Drying of Bacteria. Factors influencing
survivol. Adv.Biotechnol. Eng. Biotechnol. 51, 77-88.
Louis, P., H. G. Trüper and E. A. Galinski, 1994: Survival of Escherichia coli during drying
and storage in the presence of compatible solutes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 41,
684-688.
Luqman, S. and S. I. Rizvi, 2006: Protection of lipid peroxidation and carbonyl formation in
proteins by capsaicin in human erythocytes subjected to oxidative stress. Phytot. Res.
20, 303-306.
Marnet, L. J., 1999: Lipid peroxydation-DNA damage by malondialdehyde. Mutat. Res. 424,
83-95.
Mäyrä-Mäkinen, A. and M. Bigret, 1998: Industrial use and production of lactic acid bacteria.
In: S. Salminen and A. Von Wright eds. Lactic acid bacteria: microbiology and
functional aspects. pp. 73-102. Marcel Dekker, New York.
Mazereeuw-Hautier, J., 2006: Formation médicale continue: Impétigo. Ann. Dermatol.
Venereol. 133, 194-207.
Mazur, P., 1970: The freezing of biological systems. Cryobiology 168, 939-949.
Miyamoto-Shinohara, Y., F. Nozawa, J. Sukenobe and T. Imaizumi, 2010: Survival of yeasts
stored after freeze-drying or liquid-drying. J. Gen. Appl. Microbiol. 56, 107-119.
Miyamoto-Shinohara, Y., J. Sukenobe, T. Imaizumi and T. Nakahara, 2008: Survival of
freeze-dried bacteria. J. Gen. Appl. Microbiol. 54, 9-24.
Chapitre 1. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
32
Moneke, A. N., G. N. Okpala and C. U. Anyanwu, 2010: Biodegradation of glyphosate
herbicide in vitro using bacterial isolates from four rice fields. Afr. J. Biotechnol.9,
4067-4074.
Morgan, C. A., N. Herman, P. A. White and G. Vesey, 2006: Preservation of micro-organisms
by drying. J. Microbiol. Met. 66, 183-193.
Nanasombat, S. and N. Sriwong, 2007: improving viability of freeze-dried lactic acid bacteria
using lyoprotectants in combination with osmotic and cold adaptation. Sci. Tech. J. 7,
61-67.
Ongena, M., F. Daayf, P. Jacques, P. Thonart, N. Benhamou, T. C. Paulitz and R. R.
Bélanger, 2000: Systemic induction of phytoalexins in cucumber in response to
treatments with fluorescent pseudomonads. Plant Pathol. 49, 523-530.
Ongena, M., F. Daayf, P. Jacques, P. Thonart, N. Benhamou, T. C. Paulitz, P. Cornélis, N.
Koedam and R. R. Bélanger, 1999: Protection of cucumber against Pythium root rot
by fluorescent pseudomonads: predominant role of induced resistance over
siderophores and antibiosis. Plant Pathol. 48, 66-76.
Ongena, M., E. Jourdan, M. Schäfer, C. Kech, H. Budzikiewicz, A. Luxen and P. Thonart,
2005: Isolation of an N-alkylated Benzylamine Derivative from Pseudomonas putida
BTP1 as Elicitor of Induced Systemic Resistance in Bean. Amer. Phytopat. Soc. 18,
562–569.
Palmfeldt, J., P. Radström and B. Hahn-Hägerdal, 2003: Optimisation of initial cell
concentration enhances freeze-drying tolerance of Pseudomonas chlororaphis.
Cryobiology 47, 21-29.
Chapitre 1. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
33
Pandey, B. V. and R. S. Upadhyay, 2010: Pseudomonas fluorescens can be used for
bioremediation of textile effluent Direct Orange-102. Trop. Ecolo. 51, 397-403.
Paulsen, I. T., C. M. Press, J. Ravel, D. Y. Kobayashi, G. S. Myers, D. V. Mavrodi, R. T.
Deboy, R. Seshadri, Q. Ren, R. Madupu, R. J. Dodson, A. S. Durkin, L. M. Brinkac,
S. C. Daugherty, S. A. Sullivan, J. M. Rosovitz, M. L. Gwinn, L. Zhou, D. J.
Schneider, S. W. Cartinhour, W. C. Nelson, J. Weidman, K. Watkins, K. Tran, H.
Khouri, E. A. Pierson, L. S. Pierson, L. S. Thomashow and J. E. Loper, 2005:
Complete genome sequence of the plant commensal Pseudomonas fluorescens Pf-5.
Nat. Biotechnol. 23, 873-885.
Pembrey, R. S., K. C. Marshall and R. P. Schneider, 1999: Cell Surface Analysis Techniques:
What Do Cell Preparation Protocols Do to Cell Surface Properties? Appl. Environ.
Microbiol., 2877–2894.
Perry, S. F., 1998: Freeze-Drying and Cryopreservation of Bacteria. Molecular Biotechnology
9, 59-64.
Rey, L., 1965: Un dévloppement nouveau de la lyophilisation: La cryodessiccation des
systbmes non aqueux. . Experentia 21, 241-304.
Russo, A., M. Basaglia, S. Casella and M. P. Nuti, 2005: Pseudomonas fluorescens 134 as a
Biological Control Agent (BCA) Model in Cell Immobilization Technology.
Biotechnol. Prog 21, 309-314.
Santivarangkna, C., B. Higl and P. Foerst, 2008: Protection mechanisms of sugars during
different stages of preparation process of dried lactic acid starter cultures. Food
Microbiol. 25, 429-441.
Santivarangkna, C., M. Wenning, P. Foerst and U. Kulozik, 2007: Damage of cell envelope of
Lactobacillus helveticus during vacuum drying. J. Appl. Microbiol. 102, 748–756.
Chapitre 1. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
34
Saumaa, S., A. Tover, M. Tark, R. Tegova and M. Kivisaar, 2007: Oxidative DNA Damage
Defense Systems in Avoidance of Stationary-Phase Mutagenesis in Pseudomonas
putida. J. Bacteriol. 189, 5504-5514.
Selmer-Olsen, E., S.-E. Birkeland and T. Sorhaug, 1999: Effect of protective solutes on
leakage from and survival of immobilized Lactobacillus subjected to drying, storage
and rehydration. J. Appl. Microbiol. 87, 429-437.
Suzuki, Y. J., M. Carini and D. A. Butterfield, 2010: Protein Carbonylation. Ant.t Red. Sign.
3, 323-326.
Teixeira, P., H. Castro and R. Kirby, 1996: Evidence of membrane lipid oxidation of spray-
dried Lactobacillus bulgaricus during storage. Let. Appl. Microbiol. 22, 34-38.
Tripathi, P., A. Beaussart, A. Rolain, S. Lebeer, J. Vanderleyden, P. Hols and Y. Dufrêne,
2012: Towards a nanoscale view of lactic acid bacteria. Micron 43, 1323-1330.
Trögl, J., A. Chauhan, S. Ripp, A. C. Layton, G. Kuncová and G. S. Sayler, 2012:
Pseudomonas fluorescens HK44: Lessons Learned from a Model Whole-Cell
Bioreporter with a Broad Application History. Sensors 12, 1544-1571.
Vidhyasekaran, P. and M. Muthamilan, 1995: Development of formulations of Pseudomonas
fluorescens for control of chickpea wilt. Amer. Phytopat. Soc. 79, 782-786.
Volodymyr, I., 2010: Environmental microbiology for engineers. In: G. F. Taylor, eds ed.
Microbial ecology,Bioremediation. pp. 89-98. Bookseller, New York USA.
Walsh, U. F., J. P. Morrissey and F. O’Gara, 2001: Pseudomonas for biocontrol of
phytopathogens: from functional genomics to commercial exploitation. Cur.Opin.
Biotechnol. 12, 289-295.
Chapitre 1. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
35
Wong, W., K. Levi, B. Baddal, J. Turton and T. C. Boswell, 2011: Spread of Pseudomonas
fluorescens Due to Contaminated Drinking Water in a Bone Marrow Transplant Unit.
J. Clin. Microbiol. 49, 2093–2096.
Yao, A. A., F. Bera, C. Franz, W. Holzapfel and P. Thonart, 2008: Survival Rate Analysis of
Freeze-Dried Lactic Acid Bacteria Using the Arrhenius and z-Value Models. J. Food
Protect. 71, 431-434.
Yao, A. A., B. Wathelet and P. Thonart, 2009: Effect of protective compounds on the
survival, electrolyte leakage and lipid degradation of freeze-dried Weissella
paramesenteroides LC11 during storage. J. Microbiol. biotechnol. 19, 810-817.
Zamora, L. M., C. Carretero and D. Parés, 2006: Comparative Survival Rates of Lactic Acid
Bacteria Isolated from Blood, Following Spray-drying and Freeze-drying. Food Sci.
Tech. Int. 12, 77-84.
Zhao, G. and G. Zhang, 2005: Effect of protective agents, freezing temperature, rehydration
media on viability of malolactic bacteria subjected to freeze-drying. J. Appl.
Microbiol. 99, 333-338.
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