biologie moléculaire des hépatites virales bases théoriques
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Biologie Moléculaire des Hépatites Virales
Bases Théoriques
QCM 1 GENOME HEPATITE B
ADN linéaire bicaténaire contenu dans une
nucléocapside
ARN linéaire monocaténaire de polarité positive
ADN circulaire partiellement double brin
il existe plusieurs cadres de lecture ouverte
il existe un seul cadre de lecture ouverte
code pour 6 protéines
QCM 2 STRUCTURE DE L’ARN
Structure en double hélice
Le sucre contenu dans le squelette de pentoses et de phosphate est le desoxyribose
Les bases azotées contenues dans l’ARN sont identiques à celles de l’ADN
Dans l’ARN, les bases azotées s’apparient 2 à 2, adénine avec thymine et cytosine avec guanine
L’uracile est une base contenue dans l’ARN
QCM 3 PCR ET RT-PCR
Technique qui permet de doubler la quantité d’ADN à chaque cycle
La RT-PCR est une technique plus sensible que la PCR
La préparation de l’ADN est plus délicate que celle de
l’ARN
Pour l’ARN, une étape supplémentaire est nécessaire à la réalisation de la technique
Possibilité de travailler dans une seule et unique pièce si on décontamine le matériel à la javel
QCM 4 Tm ET SONDE
La Tm est caractéristique d’une molécule d’ADN
donnée
La Tm ne dépend que du pourcentage en guanine contenu dans l’ADN
La Tm est la température à laquelle l’ADN est
complètement dénaturé
Une sonde d’hybridation permet de détecter n’importe quel ADN
Le choix de la sonde doit se faire en fonction de sa Tm et de celle des amorces
QCM 5 SEQUENCAGE ET SYNTHESE PROTEIQUE
Chaque nucléotide correspond à un acide aminée
Chaque triplet de nucléotide correspond à un acide
aminée différent
Un codon est constitué de trois nucléotides
Le code génétique est dit dégénéré
La mutation de trois nucléotides est nécessaire pour entraîner la modification d’un acide aminée
Le séquençage d’un ADN nécessite de faire une PCR
GENOME DU VIRUS DE L’HEPATITE C
•ARN linéaire simple brin de polarité positive de 9.6 kb
•3 régions distinctes: région 5’ non codante, un cadre de lecture ouverte unique, et la région 3’ non
codante
800
1600
2400
1/3182
Gène S
Gène P
Gène C
Gène X
GENOME DU VIRUS DE L’HEPATITE B
ADN circulaire, double brin sur 2/3 de sa longueur
Code pour 4 gènes:
gène S (AgHBs)
gène C (AgHBc, AgHBe)
gène P (ADN polymérase)
gène X (protéine HBX)
STRUCTURE ARN/ADN
REPLICATION DE L’ADN REPRESENTATION SCHEMATIQUE
Reproduction du génome (ADNpolymérase…)
Possibilité d’erreur dans la reproduction: apparition de mutations
APPLICATION AU LABORATOIRE: LA PCR – LA RT-PCR
PCR: Virus à ADN (HBV)
Réactifs: Taq Polymerase, dNTPs, amorces spécifiques
RT-PCR: Virus à ARN (HCV)
95°C
Dénaturation
50°C-60°C
Hybridation des amorces
72°C
Elongation
ADN
ARN
Réactifs: Reverse transcriptase, Taq Polymerase, dNTPs, amorces spécifiques
UN CYCLE DE PCR
Reverse Transcription
ADNc
Hybridation de l’amorce
Elongation Dénaturation
Hybridation des amorces et élongation
INSTABILITE DE L’ARN / L’ADN
⇒ plus facilement dégradable
Préparation de l’ARN : étape délicate (Rnases, présence éventuelle d’ADN)
Attention aux contaminations:
• différenciation des pièces de travail (pièce « tampon », pièce « pré-ampli », pièce « post-ampli »
• décontamination du plan de travail et de tout le matériel utilisé pour manipuler à la javel
PRECAUTIONS A PRENDRE POUR LA MANIPULATION DE L’ARN
DETECTION DES PRODUITS PCR: HYBRIDATION DE SONDE - PRINCIPE
La température de fusion Tm est la température à laquelle 50% de l’ADN est dénaturé (simple brin)
CALCUL DE LA TEMPERATURE DE FUSION (Tm)
La Tm est caractéristique d’une molécule d’ADN donnée
Pour la réalisation d’une PCR, le choix des amorces et de la (ou les) sonde(s) se fait Tm dépendant
Oligonucléotide inférieur à 20 nt
Tm (en °C) = (A+T)x2 + (G+C)x4
Oligonucléotide supérieur à 20 nt
Tm (en °C) = [(A+T)x2 + (G+C)x4] x (1 + [(N-20)/20])
SONDE HYBRIDEE
A chaque cycle, la fluorescence augmente proportionnellement à la quantité d’ADN produit.
EXPRESSION DU GENOME: SYNTHESE DES PROTEINES
TRADUCTION
• Chaque triplet de bases ADN code pour un triplet de bases ARN (codon).
Un codon code pour un acide aminé.
Le code génétique
Un codon START (AUG) donne le signal du début de séquence.
Trois codons STOP (UAA, UAG, UGA) stoppe la synthèse protéique
Le code génétique est dit dégénéré:
APPLICATION AU LABORATOIRE Séquençage -
PrincipeCCAGGAAGATGG
CCAGGAAGATG
CCAGGAAGAT
CCAGGAAGA
CCAGGAAG
CCAGGAA
CCAGGA
CCAGG
CCAG
CCA
CC
C +
Réalisation d’une PCR avec un mélange de dNTPs et de ddNTPs (blocage de la synthèse d’ADN).
Chaque ddNTP est marqué avec un fluorochrome spécifique.
Après la PCR, migration sur gel pour séparer les brins en fonction de leur taille et lecture de la séquence en fonction des couleurs de la fluorescence émise
APPLICATION AU LABORATOIRE Séquençage – exemple de
l’hépatite BLes mutants précore : Absence d’AgHBe
TRP GLY
Souche sauvage : 1892- T-T-T-G-G-G-G-C-1901
STOP GLY
Mutant M1 : 1892- T-T-T-A-G-G-G-C-1901
STOP ASP
Mutant M2 : 1892- T-T-T-A-G-G-A-C-1901
APPLICATION AU LABORATOIRE Séquençage – exemple de
l’hépatite BLa mutation YMDD sur la polymérase (position
204): résistance au traitement à la lamivudine
Y M D D
Souche sauvage : -T-T-A-T-A-T-G-G-A-T-G-A-T-G- Y I D D
Mutant YIDD: -T-T-A-T-A-T-A-G-A-T-G-A-T-G- Y V D D
Mutant YVDD: -T-T-A-T-G-T-G-G-A-T-G-A-T-G-
QCM 1 GENOME HEPATITE B
ADN linéaire bicaténaire contenu dans une
nucléocapside
ARN linéaire monocaténaire de polarité positive
ADN circulaire partiellement double brin
il existe plusieurs cadres de lecture ouverte
il existe un seul cadre de lecture ouverte
code pour 6 protéines
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QCM 2 STRUCTURE DE L’ARN
Structure en double hélice
Dans l’ARN, les bases azotées s’apparient 2 à 2, adénine avec thymine et cytosine avec guanine
Le sucre contenu dans le squelette de pentoses et de phosphate est le desoxyribose
Les bases azotées contenues dans l’ARN sont identiques à celles de l’ADN
L’uracile est une base contenue dans l’ARN√
QCM 3 PCR ET RT-PCR
Technique qui permet de doubler la quantité d’ADN à
chaque cycle
La RT-PCR est une technique plus sensible que la PCR
La préparation de l’ADN est plus délicate que celle de
l’ARN
Pour l’ARN, une étape supplémentaire est nécessaire à la réalisation de la technique
Possibilité de travailler dans une seule et unique pièce si on décontamine le matériel à la javel
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QCM 4 Tm ET SONDE
La Tm est caractéristique d’une molécule d’ADN
donnée
La Tm ne dépend que du pourcentage en guanine contenu dans l’ADN
La Tm est la température à laquelle l’ADN est complètement dénaturé
Une sonde d’hybridation permet de détecter n’importe quel ADN
Le choix de la sonde doit se faire en fonction de sa Tm et de celle des amorces
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QCM 5 SEQUENCAGE ET SYNTHESE PROTEIQUE
Chaque nucléotide correspond à un acide aminée
Chaque triplet de nucléotide correspond à un acide
aminée différent
Un codon est constitué de trois nucléotides
Le code génétique est dit dégénéré
La mutation de trois nucléotides est nécessaire pour entraîner la modification d’un acide aminée
Le séquençage d’un ADN nécessite de faire une PCR√
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