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Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

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Page 1: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

Biologie Moléculaire des Hépatites Virales

Bases Théoriques

Page 2: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

QCM 1 GENOME HEPATITE B

ADN linéaire bicaténaire contenu dans une

nucléocapside

ARN linéaire monocaténaire de polarité positive

ADN circulaire partiellement double brin

il existe plusieurs cadres de lecture ouverte

il existe un seul cadre de lecture ouverte

code pour 6 protéines

Page 3: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

QCM 2 STRUCTURE DE L’ARN

Structure en double hélice

Le sucre contenu dans le squelette de pentoses et de phosphate est le desoxyribose

Les bases azotées contenues dans l’ARN sont identiques à celles de l’ADN

Dans l’ARN, les bases azotées s’apparient 2 à 2, adénine avec thymine et cytosine avec guanine

L’uracile est une base contenue dans l’ARN

Page 4: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

QCM 3 PCR ET RT-PCR

Technique qui permet de doubler la quantité d’ADN à chaque cycle

La RT-PCR est une technique plus sensible que la PCR

La préparation de l’ADN est plus délicate que celle de

l’ARN

Pour l’ARN, une étape supplémentaire est nécessaire à la réalisation de la technique

Possibilité de travailler dans une seule et unique pièce si on décontamine le matériel à la javel

Page 5: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

QCM 4 Tm ET SONDE

La Tm est caractéristique d’une molécule d’ADN

donnée

La Tm ne dépend que du pourcentage en guanine contenu dans l’ADN

La Tm est la température à laquelle l’ADN est

complètement dénaturé

Une sonde d’hybridation permet de détecter n’importe quel ADN

Le choix de la sonde doit se faire en fonction de sa Tm et de celle des amorces

Page 6: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

QCM 5 SEQUENCAGE ET SYNTHESE PROTEIQUE

Chaque nucléotide correspond à un acide aminée

Chaque triplet de nucléotide correspond à un acide

aminée différent

Un codon est constitué de trois nucléotides

Le code génétique est dit dégénéré

La mutation de trois nucléotides est nécessaire pour entraîner la modification d’un acide aminée

Le séquençage d’un ADN nécessite de faire une PCR

Page 7: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

GENOME DU VIRUS DE L’HEPATITE C

•ARN linéaire simple brin de polarité positive de 9.6 kb

•3 régions distinctes: région 5’ non codante, un cadre de lecture ouverte unique, et la région 3’ non

codante

Page 8: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

800

1600

2400

1/3182

Gène S

Gène P

Gène C

Gène X

GENOME DU VIRUS DE L’HEPATITE B

ADN circulaire, double brin sur 2/3 de sa longueur

Code pour 4 gènes:

gène S (AgHBs)

gène C (AgHBc, AgHBe)

gène P (ADN polymérase)

gène X (protéine HBX)

Page 9: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

STRUCTURE ARN/ADN

Page 10: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

REPLICATION DE L’ADN REPRESENTATION SCHEMATIQUE

Reproduction du génome (ADNpolymérase…)

Possibilité d’erreur dans la reproduction: apparition de mutations

Page 11: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

APPLICATION AU LABORATOIRE: LA PCR – LA RT-PCR

PCR: Virus à ADN (HBV)

Réactifs: Taq Polymerase, dNTPs, amorces spécifiques

RT-PCR: Virus à ARN (HCV)

95°C

Dénaturation

50°C-60°C

Hybridation des amorces

72°C

Elongation

ADN

ARN

Réactifs: Reverse transcriptase, Taq Polymerase, dNTPs, amorces spécifiques

UN CYCLE DE PCR

Reverse Transcription

ADNc

Hybridation de l’amorce

Elongation Dénaturation

Hybridation des amorces et élongation

Page 12: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

INSTABILITE DE L’ARN / L’ADN

⇒ plus facilement dégradable

Préparation de l’ARN : étape délicate (Rnases, présence éventuelle d’ADN)

Attention aux contaminations:

• différenciation des pièces de travail (pièce « tampon », pièce « pré-ampli », pièce « post-ampli »

• décontamination du plan de travail et de tout le matériel utilisé pour manipuler à la javel

PRECAUTIONS A PRENDRE POUR LA MANIPULATION DE L’ARN

Page 13: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

DETECTION DES PRODUITS PCR: HYBRIDATION DE SONDE - PRINCIPE

La température de fusion Tm est la température à laquelle 50% de l’ADN est dénaturé (simple brin)

Page 14: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

CALCUL DE LA TEMPERATURE DE FUSION (Tm)

La Tm est caractéristique d’une molécule d’ADN donnée

Pour la réalisation d’une PCR, le choix des amorces et de la (ou les) sonde(s) se fait Tm dépendant

Oligonucléotide inférieur à 20 nt

Tm (en °C) = (A+T)x2 + (G+C)x4

Oligonucléotide supérieur à 20 nt

Tm (en °C) = [(A+T)x2 + (G+C)x4] x (1 + [(N-20)/20])

Page 15: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

SONDE HYBRIDEE

A chaque cycle, la fluorescence augmente proportionnellement à la quantité d’ADN produit.

Page 16: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

EXPRESSION DU GENOME: SYNTHESE DES PROTEINES

TRADUCTION

• Chaque triplet de bases ADN code pour un triplet de bases ARN (codon).

Un codon code pour un acide aminé.

Page 17: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

Le code génétique

Un codon START (AUG) donne le signal du début de séquence.

Trois codons STOP (UAA, UAG, UGA) stoppe la synthèse protéique

Le code génétique est dit dégénéré:

Page 18: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

APPLICATION AU LABORATOIRE Séquençage -

PrincipeCCAGGAAGATGG

CCAGGAAGATG

CCAGGAAGAT

CCAGGAAGA

CCAGGAAG

CCAGGAA

CCAGGA

CCAGG

CCAG

CCA

CC

C +

Réalisation d’une PCR avec un mélange de dNTPs et de ddNTPs (blocage de la synthèse d’ADN).

Chaque ddNTP est marqué avec un fluorochrome spécifique.

Après la PCR, migration sur gel pour séparer les brins en fonction de leur taille et lecture de la séquence en fonction des couleurs de la fluorescence émise

Page 19: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

APPLICATION AU LABORATOIRE Séquençage – exemple de

l’hépatite BLes mutants précore : Absence d’AgHBe

TRP GLY

Souche sauvage : 1892- T-T-T-G-G-G-G-C-1901

STOP GLY

Mutant M1 : 1892- T-T-T-A-G-G-G-C-1901

STOP ASP

Mutant M2 : 1892- T-T-T-A-G-G-A-C-1901

Page 20: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

APPLICATION AU LABORATOIRE Séquençage – exemple de

l’hépatite BLa mutation YMDD sur la polymérase (position

204): résistance au traitement à la lamivudine

Y M D D

Souche sauvage : -T-T-A-T-A-T-G-G-A-T-G-A-T-G- Y I D D

Mutant YIDD: -T-T-A-T-A-T-A-G-A-T-G-A-T-G- Y V D D

Mutant YVDD: -T-T-A-T-G-T-G-G-A-T-G-A-T-G-

Page 21: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

QCM 1 GENOME HEPATITE B

ADN linéaire bicaténaire contenu dans une

nucléocapside

ARN linéaire monocaténaire de polarité positive

ADN circulaire partiellement double brin

il existe plusieurs cadres de lecture ouverte

il existe un seul cadre de lecture ouverte

code pour 6 protéines

√√

Page 22: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

QCM 2 STRUCTURE DE L’ARN

Structure en double hélice

Dans l’ARN, les bases azotées s’apparient 2 à 2, adénine avec thymine et cytosine avec guanine

Le sucre contenu dans le squelette de pentoses et de phosphate est le desoxyribose

Les bases azotées contenues dans l’ARN sont identiques à celles de l’ADN

L’uracile est une base contenue dans l’ARN√

Page 23: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

QCM 3 PCR ET RT-PCR

Technique qui permet de doubler la quantité d’ADN à

chaque cycle

La RT-PCR est une technique plus sensible que la PCR

La préparation de l’ADN est plus délicate que celle de

l’ARN

Pour l’ARN, une étape supplémentaire est nécessaire à la réalisation de la technique

Possibilité de travailler dans une seule et unique pièce si on décontamine le matériel à la javel

Page 24: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

QCM 4 Tm ET SONDE

La Tm est caractéristique d’une molécule d’ADN

donnée

La Tm ne dépend que du pourcentage en guanine contenu dans l’ADN

La Tm est la température à laquelle l’ADN est complètement dénaturé

Une sonde d’hybridation permet de détecter n’importe quel ADN

Le choix de la sonde doit se faire en fonction de sa Tm et de celle des amorces

Page 25: Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

QCM 5 SEQUENCAGE ET SYNTHESE PROTEIQUE

Chaque nucléotide correspond à un acide aminée

Chaque triplet de nucléotide correspond à un acide

aminée différent

Un codon est constitué de trois nucléotides

Le code génétique est dit dégénéré

La mutation de trois nucléotides est nécessaire pour entraîner la modification d’un acide aminée

Le séquençage d’un ADN nécessite de faire une PCR√

√√