bases microbiologiques pour les cliniciens dr joaquim mateo département danesthésie réanimation...
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Bases microbiologiques pour les cliniciensDr Joaquim MATEO
Département d’Anesthésie Réanimation SMUR
Hôpital Lariboisière, Paris
Joaquim.mateo@lrb.aphp.fr
Microbiologie clinique ORIENTATION DIAGNOSTIC ET THERAPEUTIQUE
– LIEN OBLIGATOIRE AVEC LE LABORATOIRE
– Compétence
– Alerte
– Equipement, médecins, recherche
– Responsabilité conjointe
– partenariat INTERET MAJEUR
– Structure de la bactérie / implications cliniques
– Diagnostic en microbiologie clinique
– Traitement antibiotique
– Résistance aux antibiotiques
– Dosage d’antibiotique ECOLOGIE ET EPIDEMIOLOGIE BACTERIENNE EN
REANIMATION
Pathologie infectieuse et anesthésie réanimation
Pathologie omniprésente– Chirurgie septique, choc septique– Complications chirurgicales postopératoires– Médical
Environnement– Antibioprophylaxie– Infection nosocomiale– hygiène
Qualité : paramètre d’évaluation
Antibiothérapie : contrôle et coûtÉcologie bactérienne à l’hôpitalTransmission des bactéries multirésistantesTaux d’infections nosocomiales« AAA »
Intérêt du diagnostic précis et du traitement précoce et adapté des
infections en réanimation
Pourquoi connaître la microbiologie ?
Diagnostic et orientation thérapeutique
Bases microbiologique : la bactérie
Plus de bactéries que de cellules dans l’organisme humains
Virus, champignons, parasites, prions
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
bactérie virus champignons parasites prions
%
Table 3–4. Known and Estimated Numbers of Biologic Species.1
Group Known Species
Estimated Total Species
Percentage of Known Species
Viruses 5,000 130,000 4%
Bacteria 4,760 40,000 12%
Fungi 69,000 1,500,000 5%
Algae 40,000 60,000 67%
Protozoa 30,800 100,000 31%
Structure des bactéries
La paroi
Toutes sauf mycoplasme structure constante la plus externe Intégrité indispensable a la survie 2 types
– Paroi épaisse et dense : peptidoglycane ( chaine glucidique reliées entre elles par des peptides)
– Paroi fine et lâche• Peptidoglycane• Membrane externe : lipides ( phospholipides et
lipopolysaccharide ) (Mb cellulaire)• Espace périplasmique (penicillinase)
Paroi fine
Paroi épaisse
Paroi externe
Paroi : implications cliniques
Identification GRAMAntigeneLPSMultiplication \ BactéricidieEffluxPorine
Fonction de la membranePermeabilité et Transport
– Diffusion – Binding Protein-Dependent Transport – Chemiosmotic-Driven Transport – Chemotactic Systems
Membrane externe– bilayered structure; – lipopolysaccharide (LPS)– antigénémie antigène O
Cible des antibiotiques
Mort si Mb altérée
porine
IDENTIFICATION
Coloration de GRAM
Distingue les bactéries à parois épaisse et fineFixation des bactéries sur lameColoration violet de gentianeMordance à la solution de LugolLavage à l’alcool
– Décoloration des parois fines
– Parois épaisses restent violette
Surcolore par de la Fushine
GRAM - GRAM +
Klebsiella pneumonia
BGN
CG+amas
Poils•Pili communs
•courts, cassants•Adhésion donc virulence•Protéines : la piline•Antigénémie•Déplacement \ mobilité
•Pili sexuels•Relient 2 bactéries •Échange de matériel génétique•Détermine le sexe
Les pili
La mobilité
Examen direct , état frais InvasivitéColonisation du materiel (KT,SU…)Certaines bactéries sont très mobilesLeur déplacement est caractéristique
ORIENTATION DIAGNOSTIQUE
Exemples
pyo coli
KP
Le matériel nucléaire
• Pas de noyau• Chromosome unique, circulaire• Un filament hélicoidal d’ADN bicaténaire• 4 bases A-T-G-C• Support des information transmises aux ribosomes pour les synthèses• Cible des quinolones
Eléments circulaires : • matériel génétique extra-chromosomique• ADN• Autonomes• Se réplique indépendamment du chromosome• Synthèse protéique• Utilisation de substrat• Résistance aux antibiotiques
Transmissibles à d’autres bactéries (BLSE)
Transmission horizontale
Les plasmides
la spore
• Conditions défavorables de survie (bacilles Gram + : Bacillus et
Clostridium) formation de spores Sporulation.• Conditions favorables bactéries végétatives
Germination.
La spore contient, sous forme condensée, • le génome • une partie du cytoplasme déshydraté • autour d'une enveloppe très résistante.
forme de résistance des bactéries contaminations d'origine tellurique (tétanos, charbon, C difficile).
Sporulation
Très résistant– Sporicide– désinfection
ManuportéeeAéroportéeRésiste au solutions hydro-alccolique
•BactériostatiqueInhibition de la multiplication bactérienne
•Bactéricide Mort de la bactérie, dissolution, ne peut plus se reproduire, IRREVERSIBLE
•StérilisationProcessus physique ou chimique qui détruit complètement toute bactéries vivante SPORES inclues
•DésinfectantsProduits capables de tuer les microorganismes sur des objets ou des surfaces inertes. Les désinfectants sont sporostatiques mais pas obligatoirement sporicides.
•SepticCaractérise la présence de bactéries vivantes dans les tissus humains.
•AntisepticDestruction ou blocage de la multiplication des microorganismes dans des tissus vivants.
•Asepticabsence de microorganismes pathogènes.
•Preservation (conservateur)Prévenir la multiplication des microorganismes dans des produits pharmaceutiques ou l’alimentation.
.
Clostridium Difficile & Diarrheal DiseasePseudomembranous Colitis
« difficile »
Anaérobie, sporuléSpores : sols, hôpitaux…La forme active de la bactérie : intestinGerme G+, la spore G-COMMENSALTransmission féco-orale2 toxines A et B
– Enterotoxine : perméabilté– Cytotxine : ç épithéliale
• Temps transit• absorption
Diarrhée
Infections à anaérobies La majorité des bactéries de la flore humaine normale sont anaérobies. Leur présence en dehors des sites habituelles (tissus,espaces anatomiques)
entraine une infection. Caractéristiques
– (1) Toujours en continuité avec une muqueuse– (2) souvent plurimicrobienne. – (3) tendance a former des espaces clos comme des abcès
(poumons,cerveau,plèvre,péritoine,pelvis) et a creuser les couches de tissus.
– (4) Pus est extrèmement malodorant. – (5) Sensible à la penicilline sauf Bactéroides et prevotella. – (6) favoriser par la baisse du débit sanguin localement , tissu nécrotique,
pas de diffusion des ATB.– (7) Milieux de transport spéciaux, méthode de culture adaptées.
Diagnostic difficile et souvent pas de mise en évidence
PORINE Membrane externe
Permet la diffusion passive des composés hydrophyles de bas poids moléculaire– Sucres– Acides aminés– Ions
Pénétration lente des “gros” antibiotiques
Modification des porines \ résistance
PLP
Imperméabilité au Tienam chez Pseudomonas aeruginosa
Efflux
La multiplication bactérienne
The Meaning of Growth Table 4–2. Phases of Microbial Growth Curve.
Section of Curve Phase Growth Rate
A Lag Zero
B Acceleration Increasing
C Exponential Constant
D Retardation Decreasing
E Maximum stationary Zero
F Decline Negative (death)
La paroi et la multiplication
PLP
PLP
2 ÉlongationPLPe
3 SeptalisationPLPs
bactérie
ÉlongationPLPe
Filament pas de PLPs
Sphéroblaste pas de PLPe
SeptalisationPLPs
Implication pour le clinicien
“Temps dépendance”– ATB bloque la synthèse du peptidoglycane
– n’agit que si la bactérie qui se multiplie
– Le taux efficace doit être constant
– Admisnistration répétées ou perfusion continue
“Dose dépendance”– Mècanisme de bactéricidie indépendant de la division
– Synthèse protéique (ribosome, ADN)
– Bolus , dose élevée
Lipopolysaccharides of Gram-Negative Bacteria
LPS, EndotoxineBase de la physiopathologie septiqueDéclenchement de la réaction
inflammatoireConstituant de la paroi externe de tous les
BGNLibération lors de la lyse de la bactérie
Le LPS : composant essentiel de la membrane Le LPS : composant essentiel de la membrane externe des BGNexterne des BGN
Alexander , J Endotox Res 2001
Paroi d’un BGN
1
1 0
1 0 0
1 0 0 0
1 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0 0
3 0 6 0 9 0 1 2 0 1 5 0 1 8 0
C U L T U R E
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
3 0 0
L P S (U /m l)
0
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
5 0 0 0
6 0 0 0
T N F (b io s s a y )
R a b b it m o d e l ; E co li 1 0 7 C F U IVH yp oten s ion occu rred in ab s en c eof an y resu sc ita tion .
Q u a n tita tiv e B C sh ow ed a rap idd ec rea se n u m b er o f b lo od [ b ac teria ] L P S w as rap id ly re lea sed w ith in m inan d rem a in ed a t low lev el th erea fte r. S IR S is a cco m p an ied b y T N F re lea seth a t p eak ed a t 6 0 m in .
= = > r a p id c le a r a n ce o f b a cter ia w ith“ im m ed ia te” re lea se o f L P S , h a v in g a lsoa ra p id c lea ra n ce .
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
1 0 0
1 1 0
3 0 6 0 9 0 1 2 0 1 5 0 1 8 0
B P
2 0 0
2 2 0
2 4 0
2 6 0
2 8 0
3 0 0
3 2 0
3 4 0
3 6 0
3 8 0
4 0 0
H R
3 9
4 0
4 1
4 2
T °
m m H g B P M
°C
DOSAGE DU LPS
Endotoxin Activity Assay
Spectral diagnostics
Structure du LPS
Chaîne O-terminale
Jusqu’à 50 unités oligosaccharidiques répétées,
formées de 2 à 8 monosaccharides.
Haute variabilité donc spécifiques d’espèce et de de souche.
Donne lieu à la classification sérologique des bactéries
sauvages.
Lipide AStructure relativement
conservée entre les espèces.
Disaccharide central, 2 groupements phosphate, 6
groupements acyl.Responsable de l’activité
endotoxique du LPS.
Intérêt d’un dosage du LPS
Nombreux arguments impliquant le LPS dans la physiopathologie du sepsis:
– LPS est un des plus puissants immunostimulants connus parmi les composants de la paroi bactérienne
– LPS in vitro sur des cellules immunitaires induit la modification de l’expression de + de 300 gènes
– LPS in vitro sur des cellules immunitaires induit la production des cytokines impliquées dans la physiopathologie du sepsis
– LPS iv reproduit la plupart des manifestations observées au cours du sepsis (fièvre, frissons, hyperleucocytose, thrombopénie, coagulopathie,…)
– Absence de LBP, CD14 ouTLR4 chez l’animal, qui sont impliqués dans la reconnaissance du LPS, les protègent contre un choc septique par des BGN
Dosage du LPS par le LAL en clinique
Pathologies non septiques :– Cirrhose, transplantation hépatique, hépatite, pancréatite :
nombreuses études +, gradient porto-systémique en LPS– Choc hémorragique– Chirurgie cardiaque ou vasculaire – Coureurs de marathon nauséeux …
Translocation à partir du TD Pathologies septiques :
– LPS + dans 20-40% des cas de sepsis– LPS + dans 20-55% des sepsis à BGN qqsoit site– LPS + dans 53-79% des bactériémies à BGN– Mais LPS également + dans 10-50% des bactériémies à CGP– Se = 50-55% , VPP = 40-50% pour bactériémie à BGN (Hurley, J Clin
Microbiol 1994, Meta-analyse) Corrélation à l’outcome :
– OUI dans la méningococcémie ou bactériémies à BGN (OR 6.3)– PAS de corrélation sinon
Patients à investiguer
Sepsis qq soit germeEtat de choc non septique avec ischémie
reperfusion (cardiogénique, hémorragique) : translocation
Valider le diagnostic de choc septiqueHomogénéiser les patients dans les protocoles
! Prix d’un dosage = 25 euros
Les délais
Examen direct
TransportAcheminementTechnique
< 1 heure
Examen macro
5 min
Etat frais examen direct
PNN, cellulesBactéries, champignonsmobilité
GRAM
KP
CG+amas
Cg+chaînette
amas
Bg+clostridium
coryne
actinomycete
aspergillus
cholera
candida
acineto
ALA test Haemophilus influenzae \ H parainfluenzae
Bacitracin (A) disk group A β-hemolytic streptococci,
Bile solubility pneumococci (lysé par la bile)
Catalase staphylococci [catalase +], streptococci [catalase -]).
Coagulase Staphylococcus aureus C+, S. epidermidis C-
Indole Escherichia coli indol +
Optochin identification of Streptococcus pneumoniae.
OxidaseEnterobacteries : oxidase negativePseudomonas : oxidase positive
PYR hydrolysisStreptococcus pyogenes, Enterococcus sp.,
ECBU E. coli 2 heures
E. coli 24 heures
antibiogramme
GRAM
ATBgramme
48 heures
men
men
men
pyo
pyo
oxydase
ATBgramme pyo
pneumo
pneum
pneu
KPhc
kp
kp
staph
staph
staph
listeria
Pathogénécité
“agent pathogène”– Endotoxine– Exotoxine
Comment et pourquoi un germe de la flore normale (commensale) devient pathogène ?
Les conditions de réanimation– Actes invasifs– Intervention, inflammation– ATB– Rupture des barrières– Altération de l’équilibre des flores
Habitat habituel des BGN
Tube digestif Peau Pli Muqueuses
E. coli normal ± ± +
KES normal — — +
Citrobacter sp. normal — — +
Proteus sp. normal — ± +
Salmonella sp. anormal — — —
Yersinia sp. anormal — — —
Acinetobacter sp. normal ± — ±
Ecologie hospitalière des bacillesà Gram négatif (présence possible) (1)
mains peau peau plis muqueuses saine lésée macération saines
E. coli — ± ± + +
KES — — ± ± +
Proteus sp. ± ± + + +
Acinetobacter sp. + + + + ±
Ecologie hospitalière des bacillesà Gram négatif (présence possible) (2)
muqueuse eau dispositifs surface désinfectants lésée médicaux paillasse savon
E. coli + ± + ± —
KES + + ± ± ++
Proteus sp. + — — ± —
Acinetobacter sp. + ± + — ++
Colonisation / infection
Seuil > 10 5 CFU/ g de tissus ou mL
De liquide normalement stérileChangement de flore cutanée
– Vêtements– Douche , toilettes …
EnvironnementFaute d’hygiène
Identifier la bactérie responsable de l’infection Symbiose
– La bactérie s’adapte à son envirronnement incluant les animaux et les humains ou elle réside et subsiste normallement.
– La bactérie assure sa survie et se reproduit assurant sa descendance.
Colonisation– micro-organismes “résident” sont en majorité inoffensifs– Essentiels pour l’homme
• photosynthesis, • production de vitamines dans l’intestin • decomposition de la matière organique. Les vrais “recycleurs” de notre planète
Pathogenicité
– infection accidentelle à partir de bactéries qui infectent les animaux Salmonelle et campylobacter sont transmis par la nourriture.
– Yersinia pestis, la peste– Bacillus anthracis (anthrax) viande crue et poils d’animal infecté.
– Clostridium species ubiquitaire de l’envirronnement transmis par ingestion ou contact, C perfringens gangrene gazeuse gastroenteritis and C botulinum [botulism]) C tetani
Pathogénicité Escherichia coli flore normale ,intestin de
l’homme mais aussi le germe responsable d’infections urinaires, diarrhée du touriste et d’autre infections.
Pourquoi cette souche est pathogène ?. – La virulence de cette souche est retrouvée chez l’animal– L’infection est reproductible in vitro– Génétiquement cette bactérie possède un marqueur
associé au déclenchement de l’infection.
pseudomonas species, Stenotrophomonas maltophilia, et la majorité des levures ne provoquent des infections que chez les patients immunodépprimés ou débilités Opportunistes
Processus Infectieux : le pneumocoque– Cultivé à partir du nasopharynx de 5 à 40 %
des sujets sains– Passage dans les poumons
• Coma
• Abolition des reflexes…
– Multiplication dans les alvéoles• Pas d’anticorps contre la capsule
polysaccharridique de cette souche
– Passage dans les lymphatiques et le sang• Pneumopathie
• Méningite
• Endocardite
• Arthrite….
Postulat de Koch
L’agent responsable d’une maladie doit répondre au postulat de Koch– agent présent chez tous les individus présentant la
pathologie– Agent pouvant être cultivé– Agent qui lorsqu’il est introduit chez l’hôte ou dans un
modèle s’en rapprochant induit le développement de la pathologie
– Possibilité de réisoler l’agent à partir d’un animal présentant la pathologie
ExotoxinesProduites par les G+ et les G-C. diphtheria
– Muqueuses ORL et plaies cutanés– Bactériophage– diphtérie
C tetani, C botulinum– Sol , eau, multiplication si anaérobiose– Toxine absorbé par l’intestin– Membrane pré synaptique des motoneurones des nerfs
périphériques et nerfs crâniens– Inhibe la libération de l’acetylcholine– paralysie
Exotoxines
C perfringens– Alpha toxin , lécithinase, collagénase, DNAse– Destruction des membranes
S aureus– TSST 1, toxic shock syndrom
Streptocoque β hémolytique A– Pyrogenic exotoxin A– Super antigène– scarlatine
Exotoxines associées aux diarhée et aux intoxications alimentaires V cholerae
– pénétration par voie digestive
– Se fixe aux microvillosités
– 2 sérotypes : O1 et O139
– Production de la toxine
S aureus
– enterotoxines déja présentes dans l’alimentation – 6 types d’enterotoxine de staphylocoque
Y enterocolitica
Vibrio parahaemolyticus
Aeromonas species,
C perfringens
Activité antimicrobienne in vitro
AntibiogrammeDosage des antibiotiques (sang,
tissus)
Définition de la résistanceCA - SFM
Sensible (S) : probabilité acceptable de succès thérapeutique si traitement par voie générale à dose habituelle (CMI<<<C° sérique
Résistant (R) : forte probabilité d’échec thérapeutique quel que soit le type de traitement (CMI >>> C° sérique)
Intermédiaire (I) : succès imprévisible (CMI proche C° sérique)
Résistance naturelle
Caractéristique propre à une espèce bactérienne
Partagée par toutes les souches normales de cette espèce
Définit le phénotype sauvage ou sensible de cette espèce
Référence pour établir le spectre d’activité des ATB (espèces habituellement sensible)
Résistance acquise
Caractéristique de certaines souches au sein d’une espèce bactérienne
Résulte d’une modification génétique– Mutation– Acquisition de matériel génétique étranger
Définit des phénotypes résistantsFréquence prise en compte dans la nouvelle
nomenclature du CA-SFM (espèces inconstamment sensibles)
Comité de l’antibiogramme
Antibiogramme : méthodes, doses …Données pharmacocinétiquesDiamètre en fonction
– Milieu de culture– Conditions de culture– Disque et C°– espèce
Supports de la résistance
Chromosomique– Stable
– Transmission verticale (descendance)
– Épidémie de souches
Plasmidique– Instable(cure si pas de pression de sélection)
– Transmission verticale
– Transmission horizontale
– Épidémie de souches ou du support lui-même
La résitance bactérienne pour les cliniciens
Il suffit de le savoir !!!!!!!!!Orientation diagnostiqueTerrain Infections hospitalièresAntibiothérapie préalable
L’antibiothérapie initiale doit tenir compte d’une potentielle résistance bactèrienne
Adapter au bout de 48 heures
Acquisition de résistance
mutants résistants– Mutant : augmentation de la CMI
– Apparition d’un mécanisme de résistance
– Modification de la séquence nucléotidique du gène responsable
La sélection– Mutant présent dans la population sensible
– L’antibiotique permet la sélection de ces mutants
Facteurs favorisant la sélection
La bactérie– Nombre d’étape mutationnelle– Proportion élevée de mutants– Bas niveau de résistance naturelle ou acquise
L’antibiotique– Concentration locale comprise entre CMI/S et CMI / R– Bactéricidie sur les bactéries sensibles
Foyer infectieux– Inoculum bactérien important– Site – Corps étranger
Prévention de la sélection
Identifier les situations « à risque »(bactérie,ATB,foyer)
Diminuer l’inoculum bactérien– Drainage– Premier antibiotique peu sélectionnant
(oxacilline ou glycopeptide sur SAPosologie élevéeAssociation d’antibiotiques
Activité antimicrobienne in vivoDiffusion, distribution, métabolisme, et
toxicitéRelations drogue-pathogène
– Diffusion au site de l’infection• Intra-cellulaire
– Quinolones, tetracyvlines– Aminosides
• Anaérobie, tissus nécrotique, ischémie– Aminosides, quinolones– liposolubilité chloramphenicol, rifampin, trimethoprim,
isoniazid imidazole • Inoculum. • pH du milieu• Pus et tissus nécrotiques
– Aminosides polymixines • hémoglobine. Penicillins and tetracyclines
Le choix du “bon” antibiotique Identification de l’agent infectant
– GRAM, examen direct, PNN, …– Antigene, latex, PCR– bacteriologic statistics and epidemiology
antibiogramme Facteurs liés à l’hôte
– allergie – Age – acidité gastrique
• reduit l’absorption des peni, • absorption du ketoconazole diminuée par les antiacides
– tetracyclines . Fixation sur l’émail dentaire– quinolone . Toxique pour les cartilages et ligaments – Anomalies Genetiques ou Metabolique (ISONIAZIDE acetyleur)– grossesse– Renal and Hepatic Function
Corps étranger glycocalyx or biofilm,
glycocalyx
Mécanisme de bactéricidie
Paroi bactérienne – Beta lactamines, glycopeptides
Membrane cytoplasmique– Polymyxines
Synthèse protéique– Aminosides, cyclines, macrolides, lincosamides,
streptogramines, rifampicine, chloramphenicol, acide fusidique, triméthoprime-sulfaméthoxazole
Réplication de l’ADN– Fluoroquinolones
Inhibiteurs de beta-lactamases
OGM
Le microbe n'est rien. Le terrain est tout. »
Conclusion
Apport majeur de l’examen directIdentification rapide et traitement adaptéConfirmer le choc septiqueEssayer de limiter la diffusion de la
résistance bactérienneControle de l’antibiothérapie
Merci de votre attention….
Et lavez vous bien les mains…
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