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Acclimatation à la nuit polaire puis au retour de la lumière chez la diatomée arctique Fragilariopsis cylindrus
Mémoire
Philippe-Israël Morin
Maîtrise en biologie Maître ès sciences (M.Sc.)
Québec, Canada
© Philippe-Israël Morin, 2017
Acclimatation à la nuit polaire puis au retour de la lumière chez la diatomée arctique Fragilariopsis cylindrus
Mémoire
Philippe-Israël Morin
Sousladirectionde:
MarcelBabin,directeurderecherche
iii
Résumé (Français) Durant l’hiver en Arctique, les algues de glace et le phytoplancton passent près de 6 mois à
l’obscurité totale avant que les conditions pour la croissance soient optimales au printemps.
Comment les algues polaires, composées principalement de diatomées, réussissent-elles à
survivre à d’aussi longues périodes d’obscurité et à croître dès le retour de la lumière?
Quels sont les mécanismes physiologiques impliqués? Les objectifs de l’étude présentée
visent à caractériser l’état cellulaire d’une diatomée arctique, Fragilariopsis cylindrus,
durant une période d’obscurité totale représentative de l’hiver polaire afin de mieux
comprendre les mécanismes qui permettent la survie à l’obscurité prolongée et au retour de
la lumière. Nous avons mesuré les mécanismes physiologiques impliqués en mesurant
plusieurs paramètres à des intervalles précis: les premiers jours, les premières semaines et
les trois premiers mois d’obscurité ainsi que les premières heures et les premiers jours des
retours à la lumière après 1,5 et 3 mois d’obscurité. Les paramètres mesurés comprenaient
le nombre et la taille des cellules, le carbone et l’azote particulaire, les lipides, la
composition en pigments, la flurorescence variable, les protéines photosynthétiques (D1,
RUBISCO), les paramètres photosynthétiques et le quenching non-photochimique (NPQ).
Quelques jours après la transition à l’obscurité, Fragilariopsis cylindrus s’est acclimatée à
un état stable qui s’est maintenu jusqu’au retour de la lumière. Cet état est caractérisé par
un nombre et une taille des cellules stables, une faible consommation des réserves
d’énergie, une faible diminution des pigments photosynthétiques et de très faibles capacités
photosynthétiques. Après 1,5 mois d’obscurité, la réexposition à la lumière a déclenché une
forte réponse du NPQ et un réassemblement de l’appareil photosynthétique, suivi d’une
reprise des activités métaboliques et de la croissance cellulaire. La réexposition après 3
mois s’est caractérisée par une reprise des activités beaucoup plus lente, probablement
causée par une mortalité plus importante.
iv
Résumé (Anglais) Polar winter in the Arctic can last as long as 6 months each year at high latitude. During
this period, no light is available for photoautotrophic growth. Nevertheless, when light
returns in spring, a sea-ice algae and phytoplankton bloom develops in the surface ocean
layers. Therefore, the following questions can be asked: How do photoautotrophic
communities (mainly diatoms) survive through winter darkness until light returns in spring?
What are the physiological mechanisms underlying such survival? Our goal was to
understand the acclimation processes at stake in both darkness and during the return to light
by closely looking at the changes in intra-cellular content and functional capacity of a polar
sea-ice diatom, Fragilariopsis cylindrus. We measured a set of parameters at specific time-
points: the first days and first weeks up to 3 months of darkness, and the first hours up to 6
days upon return to light. This set included cell number and cytometry, cellular carbon and
nitrogen quotas, lipid and pigment contents, fluorescence determinations, photosynthetic
proteins (D1, RUBISCO), photosynthetic parameters and non-photochemical quenching
(NPQ). A rather stable state was reached few days following transition to dark and was
maintained throughout until the return of light: stable cell size and number, low energy
reserve consumption, slow decrease of photosynthetic pigments and very low
photosynthetic capacities. Subsequent transition to light after 1.5 months induced strong
NPQ activity and reassembly/renewal of photosynthetic components, followed by
metabolic recovery and cell growth. Transition after 3 months showed a much slower
recovery and no cell growth, highlighting the increase of potential mortality with longer
periods of darkness.
v
Table des matières Résumé (Français)........................................................................................................iii
Résumé (Anglais)..........................................................................................................iv
Table des matières.........................................................................................................v
Listes des tableaux.......................................................................................................vii
Listes des figures........................................................................................................viii
Listes des abbréviations................................................................................................x
Listes des annexes........................................................................................................xii
Remerciements............................................................................................................xiii
Avant propos...............................................................................................................xiv
Chapitre 1. Introduction...............................................................................................11.1 Les diatomées en Arctique..................................................................................................11.2 Floraisons printanières.......................................................................................................11.3 Survivre à l’hiver polaire....................................................................................................3
1.3.1 Production de spores de résistance....................................................................................61.3.2 Nutrition hétérotrophe et métabolisme..............................................................................61.3.3 Régulation de la physiologie et des activités métaboliques...............................................81.3.4 Impact sur la photophysiologie.........................................................................................9
1.4 Retour de la lumière.........................................................................................................111.4.1 Photoprotection...............................................................................................................111.4.2 Reprise de la photophysiologie.......................................................................................12
Chapitre 2. Problématique..........................................................................................14
Chapitre 3. Objectifs et hypothèses de l’étude............................................................15
Chapitre 4. Développement.........................................................................................164.1 Introduction.....................................................................................................................174.2 Methods...........................................................................................................................19
4.2.1 Cell culturing...................................................................................................................194.2.2 Sampling design..............................................................................................................194.2.3 Cell number and volume.................................................................................................214.2.4 Carbon and nitrogen........................................................................................................214.2.5 Lipid droplets..................................................................................................................214.2.6 Pigments concentration...................................................................................................224.2.7 Photosynthetic proteins...................................................................................................224.2.8 Variable fluorescence......................................................................................................234.2.9 14C incubations................................................................................................................244.2.10 Statistical analysis.........................................................................................................26
4.3 Results & discussion.........................................................................................................284.3.1 Dark experiment..............................................................................................................28
4.3.1.1 Cell and reserves....................................................................................................................284.3.1.2 Photosynthetic apparatus dismantlement...............................................................................30
4.3.2 Light experiment.............................................................................................................36
vi
4.3.2.1 Photosensitivity and photosynthetic apparatus reassembly....................................................364.3.2.2 Metabolism recovery..............................................................................................................41
4.4 Conclusion.......................................................................................................................44
Chapitre 5. Conclusion................................................................................................45
6. Références................................................................................................................48
7. Annexes...................................................................................................................56
vii
Listes des tableaux
Tableau 1 Liste des expériences de survie à l’obscurité chez plusieurs espèces de diatomées. ............................................................................................................................... 4
viii
Listes des figures
Figure 1 (A) Schémas représentant le développement de la floraison printanière en Arctique selon le temps de l’année. ....................................................................................................... 2
Figure 2 Influence de la température sur la survie de différentes espèces à l’obscurité. ....... 5
Figure 3 Timeline of the sampling strategy for dark period and light return experiments. The vertical lines show the times of sampling, and the dashed arrow shows transfer of a fraction of the replicate cultures prior to light return #1 at 1.5 months following dark transition. .............................................................................................................................. 20
Figure 4.a) Biovolume (black, gray) and Cell number per mL (blue, skyblue) b) Cell volume (black, gray) and lipid droplets (blue, skyblue) c) POC (black, gray) and PON (blue, skyblue) per cell of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2 s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. ........................................................................ 29
Figure 5.a) Chlorophyll a (black, gray) and Fucoxanthin per cell (blue, skyblue) b) Diadinoxanthin (black, gray) and Diatoxanthin per cell (blue, skyblue) c) σPSII (black, gray) and PHP/NPHP (blue, skyblue) of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2 s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. ................................................................ 31
Figure 6.a) PsbA (black, gray) and RbcL (blue, skyblue) per cell b) initial slope of carbon fixation (α) (black, gray) and ΦM (blue, skyblue) of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2 s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. .............................. 33
Figure 7.a) Carbon fixation maximum (Pmax) (black, gray) of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2 s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. ...... 34
Figure 8.a) Non-photochemical quenching maximum (NPQmax) (black, gray) of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2 s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. ....................................................................................................... 35
Figure 9.a,b) NPQmax (black) and de-epoxidation state (DES) (blue) c,d) Diadinoxanthin (black) and Diatoxanthin (blue) per cell of Fragilariopsis cylindrus cultures for the Light1 and Light2 experiments. ....................................................................................................... 37
Figure 10.a,b) Chlorophyll a (black) and Fucoxanthin (blue) per cell b,c) σPSII (black,) and PHP/NPHP (blue) of Fragilariopsis cylindrus cultures for the Light1 and Light2 experiments.. ......................................................................................................................... 38
ix
Figure 11.a,b) PsbA (black) and RbcL (blue) per cell c,d) Pmax (black) and ΦM (blue) of Fragilariopsis cylindrus cultures for the Light1 and Light2 experiments. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bars. .......................... 40
Figure 12.a,b) POC (black) and PON (blue) per cell c,d) Cell volume (black) and Lipid droplets (blue) e,f) Biovolume (black) and Cell number per mL (blue) of Fragilariopsis cylindrus cultures for the Light1 and Light2 experiments. .................................................. 42
x
Listes des abbréviations POC Carbone organique particulaire PON Azote organique particulaire DOC Carbone organique dissous BODIPY 4,4-Difluoro-1,3,5,7-Tetramethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene LHCII Complexe antennaire de l’absorption de la lumière au photosystème II LHC Complexe antennaire de l’absorption de la lumière FCP Complexe protéique antennaire lié à la chlorophylle et la fucoxanthine PSII Photosystème II CP43-47 Protéines de l’antenne interne du photosystème II RCII Centre réactionnel du photosystème II Chl a Chlorophylle a Chl c Chlorophylle c Fuco Fucoxanthine DD Diadinoxanthine DT Diatoxanthine DES État de de-époxidation (DT/(DD+DT)) PHP Pigments photosynthétiques (Chl a + Chla c + Fuco) NPHP Pigments non-photosynthétiques (DD+DT) σPSII Section efficace d'absorption de la lumière du PSII [Å2 (quanta)-1] ΦM Rendemant photochimique maximale au PSII ΦPSII Rendement photochimique au PSII RLC Rapid light curve protocol
xi
ETRmax Taux maximal relatif du transport d’électron NPQ «Quenching» non-photochimique NPQmax «Quenching» non-photochimique maximal D1 Protéine du RCII PsbA Sous-unité de la D1 RUBISCO Ribulose-1,5-bisphophaste carboxylase/oxygénase (Enzyme responsable de
la fixation du carbone) RbcL Grande sous-unité de la RUBISCO Pchl Taux spécifique de fixation de carbone [mg C (mg chl a)-1 h-1] Pmax Taux maximal de fixation de carbone(mg C m-3 h-1) α Coefficient de l’activité photosynthétique ou pente initiale de la courbe P vs
E [mg C m-3 h-1 (µmol photons m-2 s-1)-1] EK Paramètre de saturation de la fixation de carbone (µmol photons m-2 s-1)
KE Éclairement auquel le taux de croissance sature (µmol photons m-2 s-1)
xii
Listes des annexes Annexe 1: Picture of Fragilariopsis cylindrus (Grunow) Krieger CCMP1102 (JGI)……..56 Annexe 2: Culture medium recipe (f/2 and L1)……………………………………………57 Annexe 3: Picture of the inside of the growth chamber with culture 1(left), culture 2(centerback) and culture 3(right) of Fragilariopsis cylindrus grown in 20L polycarbonate round vessels during light acclimation prior to dark transition…….....................................59 Annexe 4: Spectrum of the different light sources used during the experiment…………...60 Annexe 5: Picture of the culture 1(front), culture 2(middle) and culture 3(back) of Fragilariopsis cylindrus grown in 3L vessels during the Light1-2 experiment…………...61
xiii
Remerciements J’aimerais tout d’abord remercier mon directeur Marcel Babin pour avoir supervisé mes travaux tout au long de ma maîtrise, pour m’avoir bien conseillé lors des différentes étapes de mon cheminement et pour m’avoir transmis les bonnes pratiques de la science. Merci aussi pour toutes les opportunités de collaborations, d’expéditions, de conférences et de réseautages auxquelles j’ai eu accès. Enfin, merci pour avoir contribué à ma formation professionnelle et au développement de mon sens critique et de ma notion sur la rigueur qu’il faut appliquer en recherche. Pour la mise en œuvre de mon expérience, je remercie particulièrement Flavienne Bruyant. J’ai pu appliqué les bonnes techniques dans le laboratoire dès le départ et éviter de recommencer mes expériences plusieurs fois. Merci aussi pour avoir participé très activement lors des périodes d’échantillonnage. Enfin, merci pour avoir pris le temps de répondre à mes nombreuses questions. Pour l’évaluation du mémoire ci-présent, j’aimerais remercier les membres du jury d’évaluation composé de Connie Lovejoy, Line Lapointe et Marcel Babin. Merci pour votre temps et pour vos commentaires constructifs. J’aimerais aussi remercier Johann Lavaud, Joannie Ferland, Marie-Hélène Forget, Thomas Lacour, Pierre-Luc Grondin, Jade Larivière, Natalie Donaher et Doug Campbell pour avoir participé activement lors de l’échantillonnage et/ou lors de la révision de mon manuscript. Merci aussi à Catherine Lalande, Thibaud Dezutter, Marie-Josée Martineau, Gabrièle Deslonchamps, Chris Eberlein, Alexandre Dubé pour leur aide lors de l’analyse d’échantillons. Merci à Joannie Beaupré, Manon Bélanger et Gabriel Khelifi pour leur aide lors de périodes d’échantillonnage. Merci à Nicolas Schiffrine pour son aide en laboratoire pour le partage d’équipements. Merci à José Lagunas-Morales et Guislain Bécu pour leur aide lors de la conception de l’éclairage pour mes expériences. Merci à Marc-André Lemay et à Philippe Massicote pour leur aide en programmation et en statistique. Merci à Julie Sansoulet et Debra Christiansen-Stowe pour leur support administratif. Finalement, merci à toute l’équipe de l’Université de Mount Allison pour m’avoir accueilli lors de ma visite en été 2016 pour l’analyse d’échantillons. Un merci spécial à Natalie et Daniel Donaher pour m’avoir hébergé lors cette visite. Pour terminer, j’aimerais remercier mes amis pour leur support en dehors de l’université. Merci aussi à mes parents pour leur aide tant sur plan moral que sur le plan financier. Finalement, merci pour tous vos encouragements qui furent très appréciés.
xiv
Avant propos La soumission de l’article inséré est prévue à l’été 2017 dans New Phytologist. L’étudiant Philippe-Israël Morin est le principal auteur du manuscript présenté. Il a contribué en majeure partie à toutes les étapes menant à la publication de l’article inséré. Les coauteurs listés ont participé activement lors l’acquisition de données et/ou lors de la révision du manuscript.
1
Chapitre 1. Introduction
1.1 Les diatomées en Arctique Les diatomées sont des eucaryotes unicellulaires et photosynthétiques qui dominent depuis
plus de 100 Ma la grande majorité des océans (Armbrust 2009, Bowler et al., 2010). Elles
forment le groupe de phytoplancton le plus diversifié et le plus abondant avec plus de 100
000 espèces et produisent à elles seules 40 % de la production primaire marine (Nelson et
al., 1995, Sarthou et al., 2005, Falkowski and Knoll 2007). Leur rôle est essentiel au sein
de la chaine alimentaire marine. En Arctique, les diatomées représentent le groupe de
phytoplancton et d’algues de glace le plus abondant durant la floraison printanière (Hsiao
1980, von Quillfeldt 2000, Poulin et al., 2011). Actrices majeures dans l’écosystème
arctique, elles font face aux conditions extrêmes de température, salinité et de lumière de
cet environnement. Les adaptations à ces conditions extrêmes chez les microorganismes et
chez les microalgues ont reçu une attention grandissante au cours des dernières années
(Morgan-Kiss et al., 2006, Casanueva et al., 2010, Lyon and Mock 2014, Lacour et al.,
2017), mais il reste encore beaucoup à découvrir sur les adaptions particulières des
diatomées polaires.
1.2 Floraisons printanières Aux pôles, quand le printemps approche et le jour s’allonge, la fonte de la banquise
annuelle débute et l’éclairement qui pénètre la colonne d’eau s’intensifie. La couche
superficielle de l’océan stratifiée par l’eau de fonte est alors riche en nutriments grâce au
mélange hivernal. Ces conditions permettent aux communautés phytoplanctoniques
d’entrer dans une période de croissance cruciale pour la production primaire et secondaire
en Arctique (Leu et al., 2011). Cette période de croissance est appelée la floraison
printanière. La production primaire atteint son maximum durant la floraison printanière et
elle fournit la majeure partie de la production annuelle en Arctique (Perrette et al., 2011).
Les premières à initier une croissance autotrophe au printemps après la nuit polaire sont les
« micro-algues de glace » (algues sympagiques) malgré les très faibles lumières qu’elles
reçoivent sous la banquise généralement couverte de neige (Mundy et al., 2005, Leu et al.,
2011, Wassmann 2011) (Fig. 1). Ces algues de glace peuvent contribuer jusqu’à 57% de la
2
production annuelle dans certaines régions de l’Arctique (Gosselin et al., 1997).
Néanmoins, les espèces pélagiques (phytoplancton) contribuent à la majeure partie de la
production primaire. Avant que les conditions pour la croissance soient optimales au
printemps, les algues de glace et le phytoplancton passent près de 6 mois à l’obscurité
presque totale.
Figure 1 (A) Schémas représentant le développement de la floraison printanière en Arctique selon le temps de l’année. La croissance des algues de glace débute à la mi-mai et est éventuellement remplacée par la floraison du phytoplancton lorsque la banquise se retire. Les mois de juin et juillet voient les communautés photoautotrophes (en vert) se développer jusqu’à ce que les nutriments s’appauvrissent. Les communautés hétérotrophes (en rouge) dominent la fin de l’été et l’automne. Les flèches indiquent le transport vertical de la matière organique. Cette figure est tirée de Wassmann (2011). Ces organismes sont des photoautotrophes, c’est-à-dire qu’ils utilisent l’énergie de la
lumière pour synthétiser du carbone organique par un processus biochimique complexe, la
photosynthèse. Les micro-algues peuvent être exposées régulièrement à des périodes
d’obscurité plus longues que la nuit. Par exemple, le mélange vertical peut être beaucoup
plus profond que la zone euphotique1(Marshall and Schott 1999). Le phytoplancton
emporté sous la zone euphotique peut passer une longue période à l’obscurité avant de
retourner à la surface. Privé de la photosynthèse, le phytoplancton doit acclimater son
métabolisme pour survivre. La survie à l’obscurité est fondamentale chez le phytoplancton
et elle l’est d’autant plus pour les espèces soumises à l’hiver polaire. En Arctique, leur
métabolisme doit forcément être compatible avec 6 mois d’obscurité, grâce à des
adaptations exclusives ou non aux espèces arctiques. Plus particulièrement, on s’intéressera
aux espèces de diatomées en raison de leur prépondérance en Arctique. 1 Profondeur dans la colonne d’eau à laquelle réside 1% de l’intensité lumineuse en surface (Babin et al., 1996).
3
1.3 Survivre à l’hiver polaire La survie des micro-algues à l’obscurité prolongée a été étudiée à de nombreuses reprises
au cours des dernières décennies. On a observé que la croissance reprenait dès le retour à la
lumière (Smayda and Mitchell.B 1974, Antia 1976, Palmisano and Sullivan 1983, Peters
1996, Peters and Thomas 1996, Zhang et al., 1998, Luder et al., 2002, Reeves et al., 2011,
Martin et al., 2012) (Tableau 1). La durée de la période d’obscurité qui fut imposée aux
micro-algues varie selon les expériences. La viabilité de certaines espèces s’est prolongée
jusqu’à 3 ans (Antia 1976). Peters and Thomas (1996) et Peters (1996) ont montré dans des
expériences séparées que les algues antarctiques semblent être mieux adaptées pour la
survie à de longue période d’obscurité que les algues tempérées. Ces résultats suggèrent
que les espèces polaires ont développé des adaptations qui leur permettent une meilleure
survie à l’obscurité que les espèces tempérées.
Cependant, la survie pourrait être dépendante de la température du milieu comme cela a été
observé chez la diatomée Skeletonema costatum (Smayda and Mitchell.B 1974) et plusieurs
autres espèces de diatomées (Peters 1996) (Fig. 2). La survie à l’obscurité chez la majorité
des espèces étudiées a diminué lorsque température d’incubation a augmenté. Dans le
contexte du réchauffement climatique, les espèces polaires seront vraisemblablement
confrontées à des températures moyennes plus élevées (Stroeve et al., 2007, Grebmeier
2012, McMinn and Martin 2013) et pourraient voir leur survie diminuer. Récemment, des
expériences menées au noir sur des diatomées polaires ont montré qu’elles tolèrent une
élévation de 6°C par rapport à la température ambiante de croissance, soit 4°C de plus que
les prédictions sur la hausse des températures de surface des océans d’ici la fin du 21e siècle
(Reeves et al., 2011, Martin et al., 2012, McMinn and Martin 2013) (IPCC 2014).
Toutefois, ces résultats ont été obtenus à partir d’expériences à l’obscurité inférieures à 60
jours. Dans un contexte où la nuit polaire dure jusqu’à 6 mois et où les conditions physico-
chimiques (nutriments, salinité, dynamique du mélange vertical, lumière, température) des
couches superficielles de l’océan Arctique peuvent changer, il n’est pas simple de tirer des
conclusions claires sur la survie des diatomées polaires sans connaître l’impact synergique
de ces variables entre elles.
4
Tableau 1 Liste des expériences de survie à l’obscurité chez plusieurs espèces de diatomées. Toutes les espèces présentées ont repris la croissance au retour de la lumière. Tableau tiré de Wulff et al., (2008)
Species Temperature Dark exposure times (days) Reference
Achnanthes brevipes Agardh 20°C 56* Antia & Cheng 1970 Achnanthes brevipes Agardh 2, 20°C 364 Antia 1976 Amphiprora paludosa Smith 20°C 56* Antia & Cheng 1970 Amphiprora paludosa var. duplex Donkin 2, 20°C 189, 133 Antia 1976 Amphora coffeaeformis (Ag.) Kütz 7°C 28* Anderson 1975b Anaulus australis Drebes et Schulz 18°C (±2) 62* du Preez & Bate Araphid, pennate diatom ca 10 µm -2°C 310 (364)a Palmisano & Sullivan 1982 Asterionella japonica Cleve (Asterionellopsis glacialis (Castracane) Round) 15°C 90* Smayda & Mitchell-Innes 1974 Bacteriastrum sp. 18°C 17* Jochem 1999 Bellerochea polymorpha Hargraves & Guillard (Minutocellus polymorphus (Hargraves & Guillard) Hasle, von Stosch & Syvertsen) 2, 10, 20°C 63, >140, 84 Antia 1976 Chaetoceros curvisetus Cleve 15°C 90* Smayda & Mitchell-Innes 1974 Chaetoceros didymus Ehrenberg 15°C 90d* Smayda & Mitchell-Innes 1974 Chaetoceros fragile Meunier -1.8°C 93* Bunt & Lee 1972 Chaetoceros gracilis Schütt 20°C 56* Antia & Cheng 1970 Chaetoceros gracilis Schütt 2, 10, 20°C 112,>210*,133 Antia 1976 Cyclotella cryptica Reimann, Lewin & Guillard 20°C 56* Antia & Cheng 1970 Cyclotella cryptica Reimann, Lewin & Guillard 2, 20°C 189,105 Antia 1976 Cyclotella nana Hustedt 20°C 49 Antia & Cheng 1970 Cylindrotheca fusiformis Reimann & Lewin 20°C 56* Antia & Cheng 1970 Cylindrotheca fusiformis Reimann & Lewin 2, 20°C 364 Antia 1976 Ditylum brightwellii (West) Grunow 8, 15°C 35**,30 Peters 1996 Ditylum brightwellii (West) Grunow 15°C 90* Smayda & Mitchell-Innes 1974 Fragilaria pinnata Ehrenberg (Staurosirella pinnata (Ehrenberg) D.M. Williams & Round) 2, 20°C 280, 364 Antia 1976 Fragilaria sublinearis van Heurck -1.8°C 93* Bunt & Lee 1972 Fragilariopsis kerguelensis (O'Meara) Hustedt 0°C (±1) 127 Peters & Thomas 1996 Lithodesmium undulatum Ehrenberg 15°C 90* Smayda & Mitchell-Innes 1974 Melosira nummuloides Agardh 20°C 56* Antia & Cheng 1970 Melosira nummuloides Agardh 2, 20°C 336, 105 Antia 1976 Navicula incerta Grunow ex Van Heurck 20°C 56* Antia & Cheng 1970 Navicula incerta Grunow ex Van Heurck 2, 20°C 364 (1092)a, 364 wks Antia 1976 Nitzschia angularis Smith 20°C 56* Antia & Cheng 1970 Nitzschia angularis var. affinis (Grunow) Grunow 2, 20°C 364 (1092)a, 364 Antia 1976 Nitzschia cylindrus (Grunow) Hasle, size 4 gm -2°C 155 (364)b Palmisano & Sullivan 1982 Nitzschia cylindrus (Grunow) Hasle, size 6 gm -2°C 155 (364)b Palmisano & Sullivan 1982 Nitzschia-like 18°C 17* Jochem 1999 Phaeodactylum tricornutum Bohlin 20°C 168* Antia & Cheng 1970 Phaeodactylum tricornutum Bohlin 2, 20°C 364, 364 Antia 1976
Phaeodactylum tricornutum Bohlin 5°C 93 Umebayashi 1972 cited in Anderson 1975b
Porosira pseudodenticulata (Hustedt) Jousé 0°C (±1) 272 Peters & Thomas 1996 Proboscia inermis (Castracane) Jordan & Ligowski 0°C (±1) 214 Peters & Thomas 1996 Rhizosolenia fragilissima Bergon (Dactyliosolen fragilissimus (Bergon) Hasle) 18°C 23* Ignatiades & Smayda Rhizosolenia setigera Brightwell 8°C 21 Peters 1996 Skeletonema costatum (Greville) Cleve 20°C 7 Antia & Cheng 1970 Skeletonema costatum (Greville) Cleve 2, 10, 20°C 168, 63, 28 wks Antia 1976 Skeletonema costatum (Greville) Cleve 15°C 49 Smayda & Mitchell-Innes 1974 Thalassiosira antarctica Comber 0°C (+1) 214 Peters & Thomas 1996 Thalassiosira fluviatilis Hustedt 20°C 56* Antia & Cheng 1970 Thalassiosira fluviatilis Hustedt 2, 20°C 140, 105 Antia 1976 Thalassiosira gravida Cleve 15°C 90* Smayda & Mitchell-Innes 1974 Thalassiosira pseudonana Hasle & Heimdal 2, 20°C 161, 105 Antia 1976 Thalassiosira punctigera (Castracane) Hasle 8°C 35** Peters 1996 Thalassiosira sp. 15°C 90* Smayda & Mitchell-Innes 1974
*Période maximale testée
**Nombre de cellules constant pendant 63 jours aViabilité jusqu’à 3 ans bCulture non-diluée laissée pendant 12 mois et dont la croissance a repris après une phase de latence de 3 à 6 mois
5
Figure 2 Influence de la température sur la survie de différentes espèces à l’obscurité. Figure reproduite de Peters (1996)
Alors que les premières études confirmant la survie des micro-algues à des périodes
d’obscurité prolongées n’ont pas offert d’explications sur les mécanismes physiologiques
impliqués, les expériences plus récentes les ont examiné de plus près à l’aide de techniques
de pointe maintenant plus accessibles. Les expériences de survie à l’obscurité prolongée
n’ont pas exclusivement traité de diatomées, mais les informations obtenues sur d’autres
groupes de micro-algues fournissent des pistes qui pourraient être pertinentes vis-à-vis de la
physiologie des diatomées.
6
1.3.1 Production de spores de résistance
Plusieurs groupes de micro-algues peuvent produire des spores de résistance lorsque les
conditions environnementales deviennent instables. Chez les diatomées, la production de
spores de résistance avec une paroi de silice plus épaisse améliore la longévité. Ce type de
cellule au repos limite les échanges avec le milieu et réduit la respiration à un taux
négligeable (Hargraves and French 1983). Bien que la formation de spores de résistance est
souvent déclenchée suite à l’épuisement des nutriments, les changements de lumière et de
température pourraient aussi induire leur production chez les diatomées polaires (Doucette
and Fryxell 1983). En Antarctique, la production de ces spores chez les diatomées a été
documentée à plusieurs reprises dans la littérature (Hart 1942, Hoban et al., 1980, Doucette
and Fryxell 1983, Fryxell 1994). Néanmoins, la production de spores de résistance ne peut
pas expliquer à elle seule la survie à l’obscurité prolongée. Les expériences réalisées sur la
survie au noir n’ont généralement pas signalé la formation de ces spores. Les cellules
garderaient leur forme végétative et il semble qu’elles entreraient dans un état
physiologique de dormance (Peters and Thomas 1996). À l’opposé des spores de résistance,
les cellules végétatives en dormance reviennent à leur état actif en l’espace de quelques
heures (Anderson 1975, Sicko-Goad et al., 1986).
1.3.2 Nutrition hétérotrophe et métabolisme
L’hétérotrophie est un mode de nutrition par lequel les organismes utilisent le carbone
organique présent dans le milieu comme source d’énergie. Bien que les organismes
photosynthétiques puissent fabriquer leur propre carbone organique grâce à l’énergie de la
lumière, plusieurs d’entre eux sont capables d’utiliser en plus une variété de substrats
organiques, incluant acides aminés et acides gras, pour satisfaire leurs besoins en énergie et
en nutriments (Neilson and Lewin 1974). Ces organismes, dits mixotrophes, sont à la fois
photoautotrophe et hétérotrophe. Chez les diatomées, la nutrition hétérotrophe a été décrite
il y a longtemps déjà (Lewin 1953, Hellebust and Lewin 1977, Tuchman et al., 2006). Dans
l’expérience de White (1974), elle a permis à deux diatomées centriques tempérées de
survivre et de croître pendant 1 an à l’obscurité dans un milieu enrichi. Les diatomées
peuvent ainsi être caractérisées comme des photohétérotrophes, c’est-à-dire qu’elles
peuvent satisfaire leurs besoins nutritionnels grâce à des sources de carbone organique
autres que celui produit par la photosynthèse (Rivkin 1987, Tuchman et al., 2006). La
7
consommation de différentes sources d’acides aminés et de glucose a été observée chez des
diatomées antarctiques dans des conditions d’obscurité et de lumière (Rivkin 1987). La
survie des diatomées durant l’hiver polaire pourrait donc faire intervenir l’hétérotrophie.
Palmisano and Sullivan (1982) ont mesuré chez des diatomées de glace antarctiques une
augmentation de l’hétérotrophie lors d’une simulation expérimentale de la transition été-
hiver en Antarctique. En dépit des informations obtenues jusqu’à présent sur l’hétérotrophie
des diatomées, la survie des algues polaires durant la nuit polaire grâce à la nutrition
hétérotrophe reste incertaine (Popels and Hutchins 2002, McMinn and Martin 2013).
La publication des génomes de Thalassiosira pseudonana et Phaeodactylum tricornutum a
permis de comprendre davantage l’endosymbiose en série dans l’évolution des diatomées
(Armbrust et al., 2004, Bowler et al., 2008, Bowler et al., 2010). Plusieurs gènes de l’hôte
hétérotrophe seraient retenus et plusieurs autres seraient acquis de bactéries par transfert
horizontal. Ce mélange de gènes offrirait aux diatomées une panoplie de voies
métaboliques à l’origine de leur succès écologique dans un large éventail de conditions
environnementales. Par exemple, la voie complète du cycle de l’urée chez les diatomées
(absente chez les algues vertes) est vue comme un moyen de redistribuer le carbone et
l’azote inorganique dans la cellule lorsque les nutriments sont faibles (Allen et al., 2011,
Fernie et al., 2012). Il est possible que les diatomées polaires possèdent aussi plusieurs
transporteurs membranaires pour les plus grosses molécules organiques. La publication du
génome de Coccomyxa subellipsoidea, une algue verte polaire, révèle par ailleurs un
nombre plus élevé de transporteurs pour les acides aminés que chez les espèces tempérées
(Blanc et al., 2012). De plus, la publication récente du génome de la diatomée polaire
Fragilariopsis cylindrus révèle une différenciation allélique importante qui serait
avantageuse lors des fluctuations physico-chimiques extrêmes des océans polaires (Mock et
al., 2017). Ces différentes informations laissent à penser que les diatomées arctiques
possèderaient un métabolisme flexible et adapté qui leur permet d’optimiser l’incorporation
et l’assimilation des nutriments dans les conditions extrêmement variables de l’Arctique
(Lyon and Mock 2014).
8
1.3.3 Régulation de la physiologie et des activités métaboliques
La production de spores de résistance n’a pas été observée dans des expériences au noir
impliquant des diatomées polaires (Palmisano and Sullivan 1983, Peters and Thomas 1996)
et très peu dans les communautés échantillonnées en Arctique et subséquemment placées au
noir (Zhang et al., 1998). Néanmoins, toutes les espèces testées ont repris leur croissance
lors du retour à la lumière. Il est possible que les cellules placées à l’obscurité ajustent leur
métabolisme et entrent dans un état de « dormance » physiologique. Des mesures de
fluorescence par cytométrie en flux ont révélé chez trois chlorophytes une diminution
suivie d’une stabilisation de l’activité métabolique lors d’une courte période à l’obscurité
(10 jours). Les concentrations de carbone et d’azote organique particulaire par cellule
durant 80 jours d’obscurité sont restées stables chez trois diatomées antarctiques (Peters
and Thomas 1996). Ces résultats suggèrent que le métabolisme cellulaire a été réduit pour
ne pas épuiser rapidement les réserves énergétiques. Des conclusions similaires ont été
rapportées suite à une expérience au noir sur des diatomées tempérées et elles suggèrent
une réduction concomitante de la respiration cellulaire (Peters 1996).
Le stockage de composés organiques sous forme de lipides est fréquent chez les diatomées
et est proposé comme un moyen de survie à l’hiver polaire. Jusqu’à 80% du carbone
nouvellement fixé serait incorporé sous forme de lipides chez le phytoplancton antarctique
maintenu à faible température et à faible lumière (Smith and Morris 1980). L’accumulation
de lipides et de carbohydrates ainsi que leur utilisation subséquente ont été observées chez
des diatomées antarctiques lors d’une simulation de la transition lumière-obscurité
(Palmisano and Sullivan 1982). Toutefois, cette accumulation n’était peut-être pas
suffisante pour assurer les besoins énergétiques durant tout un hiver compte tenu de la
courte période expérimentale (30 jours). Néanmoins, le catabolisme des lipides et des
carbohydrates semble être important au début de la période d’obscurité. Chez F. cylindrus,
une expérience de 7 jours à l’obscurité a montré une augmentation de gènes transcrits
impliqués dans le métabolisme des sucres et des lipides (Mock et al., 2017). De plus,
Schaub et al., (2017) ont récemment mesuré une dégradation des ressources lipidiques plus
intense lors des deux premières semaines d’obscurité chez la diatomée benthique arctique
Navicula cf. perminuta. Cependant, lors d’expériences inférieures à 1 mois chez la
9
diatomée tempérée Skeletonema Costatum (Handa 1969) et chez la pelagophyceae
Aureococcus anophagefferens (Popels et al., 2007), une dégradation des carbohydrates et
des protéines préférentielle aux lipides a été observée. Ce patron d’utilisation des réserves
énergétiques a aussi été mesuré lors d’une expérience plus longue de 3 mois d’obscurité
chez la chlorophyceae Scenedesmus acuminatus (Dehning and Tilzer 1989). Les
observations accumulées jusqu’à présent suggèrent une utilisation des réserves énergétiques
plus importante au début de la période d’obscurité avec une variabilité interspécifique
dans le patron d’utilisation. Tous s’entendent sur une diminution du métabolisme et d’une
réduction dans le taux d’utilisation des réserves énergétiques avec le nombre de jours
passés à l’obscurité.
1.3.4 Impact sur la photophysiologie
L’appareil photosynthétique chez tous les photoautotrophes s’acclimate aux variations de
lumière qui surviennent dans l’environnement par différents processus de la
photoacclimatation. La photophysiologie s’ajuste selon la lumière disponible par des
changements dans la composition macromoléculaire de l’appareil: proportions relative des
pigments photoprotecteurs et photosynthétiques, des centres réactionnels des
photosystèmes I et II, des complexes de la chaîne de transport des électrons, et des enzymes
impliquées dans le cycle de Calvin (Falkowski and Laroche 1991, Demmig-Adams and
Adams 1992, Brown et al., 2008). Passant de 24 heures d’ensoleillement par jour en été à
l’obscurité totale en hiver et sous une bonne épaisseur de glace couverte de neige, on peut
s’attendre à ce qu’un stress survienne au niveau de l’appareil photosynthétique.
Généralement, une diminution de la chlorophylle a chez différents groupes de
phytoplancton a été observée lors de longues périodes d’obscurité (Dehning and Tilzer
1989, Peters 1996, Baldisserotto et al., 2005a, Baldisserotto et al., 2005b, Ferroni et al.,
2007, Veuger and van Oevelen 2011). Des mesures de microspectrofluorimétrie et de
microscopie électronique en transmission chez Koliella antartica et Xanthonema sp. (une
algue verte et une xanthophyceae de neige) ont aussi révélé des changements rapides dans
l’appareil photosynthétique dès les premiers jours d’obscurité (Baldisserotto et al., 2005a,
Baldisserotto et al., 2005b, Ferroni et al., 2007). Les chloroplastes sont devenus moins
nombreux au centre des cellules et ont montré des signes de dégradation. Les rapports de
fluorescence mesurés pour RCII/CP43-47 et LHCII/PSII (indiquent respectivement le degré
10
d’association au cœur du photosystème II et le degré d’assemblage entre l’antenne externe
et le photosystème II) ont changé durant la période d’obscurité. Le cœur du photosystème II
s’est dégradé plus rapidement, alors que l’association du complexe antennaire LHCII avec
le photosystème II est restée plus stable. Cette stabilité du LHCII pourrait être bénéfique au
retour de la lumière après l’hiver polaire (Ferroni et al., 2007). Cependant, chez la
chlorophyte Chlamydomonas raudensis isolée en Antarctique, le complexe antennaire
LHCII serait dissocié du photosystème II durant l’hiver selon le modèle suggéré par
Morgan-Kiss et al., (2006). Toutefois, la conservation du complexe pigments-protéines
LHCII a été proposée comme une caractéristique qui facilite la réassociation avec le
photosystème II dès le retour de la lumière. Malgré ces conclusions, les informations
présentées ici ne sont pas issues d’expériences conduites chez des diatomées (bien que
Xanthonema sp. soit plus proche des diatomées que des algues vertes) (Adl et al., 2005).
Une réponse différente pourrait être observée chez une diatomée arctique.
Le taux de fixation maximale de carbone normalisé par la chlorophylle a (PChl) [mg C (mg
chl a)-1 h-1] diminue fortement chez plusieurs groupes de phytoplancton (Hellebust and
Terborgh 1967, Griffiths 1973, Dehning and Tilzer 1989, Peters and Thomas 1996, Popels
et al., 2007) et chez la diatomée arctique Chaetoceros neogracile (non-publié, Lacour et al.,
2017) lorsqu’ils sont placés à l’obscurité. Cette réponse suggère un démantèlement de
l’appareil photosynthétique plus important combiné avec une dégradation partielle de
l’antenne comme mentionné ci-haut. Une diminution concomitante de l’activité et de la
quantité de RUBISCO (enzyme responsable de fixation de carbone) serait à l’origine des
faibles valeurs de PChl mesurées après une longue période d’obscurité (Dehning and Tilzer
1989, Popels et al., 2007) (non-publié, Lacour et al., 2017). Lors d’expériences portant sur
des diatomées polaires, des communautés phytoplanctoniques arctiques et antarctiques et
des communautés d’algues de glace antarctiques (composées principalement de diatomées),
des modifications similaires sur les capacités photosynthétiques des cellules ont été
décrites. La diminution des valeurs du rendement photochimique du PSII [unité relative]
(ΦPSII), du coefficient d'efficacité́ photosynthétique [mg C m-3 h-1 (µmol photons m-2 s-1)-1]
(α), et du taux maximal du transport d’électron [unité relative] (ETRmax) a indiqué une
11
baisse progressive des performances photosynthétiques à l’obscurité (Luder et al., 2002,
Reeves et al., 2011, Martin et al., 2012).
1.4 Retour de la lumière
1.4.1 Photoprotection
Au retour de la lumière après une longue période d’obscurité, les cellules photosynthétiques
encore viables doivent gérer les photons qui les atteignent. Elles doivent optimiser leur
propriétés d’absorption de la lumière et surtout éviter les dommages par d’éventuels
éclairements excessifs. Les algues de glace reçoivent des quantités de lumière qui
augmentent à mesure que le jour s’allonge et que la glace s’amincit. Lors de la débâcle, le
phytoplancton peut subir une augmentation plus brusque de l’éclairement. Particulièrement,
la fonte du manteau neigeux intervient souvent brusquement et s’accompagne de mares de
fonte et de chenaux. Différents processus de photoacclimatation permettent aux micro-
algues de s’ajuster à ces fluctuations plus ou moins rapides qui impactent la transmission de
lumière.
À faible lumière, le complexe antennaire change sa composition pigmentaire pour optimiser
l’absorption de lumière et le transfert de celle-ci au centre réactionnel du photosystème. À
forte lumière, le complexe antennaire se protège du surplus d’énergie et dissipe l’excès par
« quenching » non-photochimique [unités relatives] (NPQ) (MacIntyre et al., 2002). En
bref, le NPQ dissipe l’énergie lumineuse en trop avant qu’elle n’atteigne le centre
réactionnel du photosystème (Holt et al., 2004). Le rôle photoprotecteur des caroténoïdes
grâce au cycle des xantophylles fait partie du NPQ et ce mécanisme est bien connu chez les
plantes (Demmig-Adams and Adams 1996). Chez les diatomées, le cycle des xanthophylles
repose principalement sur l’inter-conversion de la diadinoxanthine et la diatoxanthine
(caroténoïdes), et constitue le mécanisme de première importance pour contrer l’excès de
lumière (Arsalane et al., 1994, Goss and Jakob 2010). La composition en protéines fait
aussi partie des changements structuraux du complexe antennaire. Les gènes FCP (protéine
liant la chlorophylle et la fucoxanthine) appartenant à la grande famille des LHC (complexe
antennaire d’absorption) codent pour des protéines qui forment différents complexes selon
les conditions de lumière (Wilhelm et al., 2014). Les différents complexes formés se lient à
12
la fucoxanthine, la chlorophylle a et c et à la diadinoxanthine ou diatoxanthine (Alberte et
al., 1981, Beer et al., 2006) Ces complexes sont impliqués dans le transfert d’énergie aux
photosystèmes ou dans la dissipation d’énergie (NPQ) selon leur composition pigmentaire.
Une étude portant sur l’expression du transcriptome chez Chaetoceros neogracile lorsque
transférée à forte lumière révèle une régulation positive et négative de différents gènes
FCPs (Park et al., 2010). Les gènes FCP phylogénétiquement associés à la grande famille
LHCx ont montré une régulation positive alors que ceux associés à la famille LHCf ont
montré une régulation négative. La famille LHCx regroupe les gènes qui codent pour les
protéines impliquées dans le NPQ alors que la famille LHCf code pour celles impliquées
dans l’absorption de la lumière (Wilhelm et al., 2014). La régulation positive de gènes qui
appartiennent à la famille des LHCx a aussi été mesurée dans d’autres études (Oeltjen et
al., 2002, Becker and Rhiel 2006, Beer et al., 2006) qui confirment leur rôle dans la
photoprotection. Récemment, le génome de Fragilariopsis cylindrus a révélé un nombre
supérieur de gènes de la famille des LHCx (FCP) en comparaison à deux autres génomes de
diatomées tempérées (T. pseudonana, P. tricornutum) (Mock et al., 2017). Le grand
nombre de gènes LHCx observés chez Fragilariopsis cylindrus suggère une adaptation
pour une meilleure capacité de photoprotection face aux stress de lumière qui sévissent en
milieu polaire. Cette hypothèse est appuyée par les résultats de Petrou et al., (2011) qui
présente Fragilariopsis cylindrus comme une espèce adaptée aux conditions de faibles
lumières (glace de mer), mais qui possède une grande capacité d’acclimatation à
l’augmentation rapide de lumière expliquée par les fortes valeurs de NPQ mesurées. Ces
résultats aident à comprendre pourquoi elle peut croître aussi bien dans la glace, dans l’eau
de fonte ou en milieu pélagique et qu’elle soit présente en abondance en Antarctique et en
Arctique (Gleitz et al., 1998, von Quillfeldt 2000). Une grande capacité à dissiper l’excès
de lumière semble être une caractéristique physiologique importante lors du retour de
lumière suite à une longue période d’obscurité (McMinn et al., 2010).
1.4.2 Reprise de la photophysiologie
Malgré les changements importants mesurés dans la photophysiologie lors du passage à
l’obscurité prolongée, les performances photosynthétiques (PChl, ETRmax, ΦPSII)
augmentent fortement en quelques jours après le retour de la lumière (Griffiths 1973, Luder
et al., 2002, Popels et al., 2007, Martin et al., 2012) (non-publié, Lacour et al., 2017). Des
13
expériences sur Chaetoceros neogracile après un mois d’obscurité ont évalué la capacité de
reprendre la croissance au retour de la lumière à différentes intensités (5 à 154 µmol
photons m-2 s-1) (non-publié, Lacour et al., 2017). Dans tous les cas, les algues ont entamé
une croissance exponentielle en moins de 48 heures grâce à une rapide acclimatation de la
photophysiologie. ETRmax et Ek (l’éclairement auquel le taux de transport d’électron sature)
ont augmenté dès les premières heures du retour à la lumière. La reprise de la
photophysiologie et de la croissance est plus importante pour les plus fortes intensités de
lumières (41 et 154 µmol photons m-2 s-1).
14
Chapitre 2. Problématique Notre compréhension des mécanismes fondamentaux qui permettent la survie des
diatomées à de longues période d’obscurité comme celles de l’hiver polaire en Arctique est
incomplète malgré les expériences déjà réalisées. Les adaptions des diatomées aux
conditions extrêmes de l’Arctique sont de plus en plus documentées (Lacour et al., 2017),
mais on ne sait pas encore dans quel état se trouvent les diatomées arctiques lorsqu’elles
traversent l’hiver polaire. Aussi, on ne connaît pas bien les processus impliqués lors de la
reprise de croissance au retour de la lumière. D’une part, les expériences d’obscurité
prolongée de plusieurs mois sur les diatomées polaires conduites à ce jour n’offrent pas
suffisamment d’explications sur l’état physiologique des cellules (Antia 1976, Palmisano
and Sullivan 1983, Peters and Thomas 1996, Zhang et al., 1998). D’autre part, les
expériences dans lesquelles on a mesuré certains paramètres physiologiques ne sont pas
suffisamment représentatives de la longueur de l’hiver polaire (Hellebust and Terborgh
1967, Griffiths 1973, Popels et al., 2007, Wulff et al., 2008, Reeves et al., 2011, Martin et
al., 2012, McMinn and Martin 2013, Nymark et al., 2013, Mock et al., 2017) (non-publié,
Lacour et al., 2017), ne traitent pas de diatomées (Dehning and Tilzer 1989, Baldisserotto
et al., 2005a, Baldisserotto et al., 2005b, Ferroni et al., 2007, Popels et al., 2007) ou
n’intègrent pas toutes les réponses physiologiques de la cellule (Veuger and van Oevelen
2011, Schaub et al., 2017).
Une étude qui identifiera les caractéristiques physiologiques et biochimiques des cellules à
l’obscurité chez une diatomée arctique et durant une période représentative de la longueur
de l’hiver polaire permettra de mieux comprendre la phénologie des communautés de
producteurs primaires en Arctique et leur survie durant de longues périodes d’obscurité. La
caractérisation plus complète des espèces phytoplanctoniques clés de l’Arctique aidera à
mieux prédire leur réponse face aux changements climatiques dans le contexte de la
floraison printanière.
15
Chapitre 3. Objectifs et hypothèses de l’étude L’étude comporte une expérience en laboratoire réalisée à l’aide de bioréacteurs placés
dans l’obscurité totale pour une durée qui est représentative de l’hiver polaire. Des mesures
physiologiques et biochimiques à des intervalles précis fournissent un suivi temporel de
l’état des cellules et des activités métaboliques durant la période de noirceur et lors de la
réexposition à la lumière. La diversité des mesures effectuées vise à combiner les
informations biochimiques et celles sur les capacités physiologiques.
Objectif 1 :
Caractériser l’état cellulaire d’une diatomée arctique durant une période d’obscurité totale
représentative de l’hiver polaire afin de comprendre les mécanismes de survie au noir.
Hypothèse 1 :
La cellule ralentit son métabolisme et démantèle partiellement l’appareil photosynthétique.
Objectif 2 :
Caractériser les processus impliqués dans la reprise de croissance d’une diatomée arctique
lorsque qu’elle est réexposée à la lumière suite à une longue période d’obscurité totale
représentative de l’hiver polaire.
Hypothèse 2 :
La cellule minimise les dommages grâce aux mécanismes de photoprotection et reprend
rapidement les activités photosynthétiques et métaboliques.
16
Chapitre 4. Développement Response of a sea-ice diatom, Fragilariopsis cylindrus, to simulated polar winter darkness and spring-like return to light Morin, Philippe-Israël1; Lacour, Thomas1 ; Grondin Pierre-Luc1; Bruyant, Flavienne1; Ferland, Joannie1; Forget, Marie-Hélène1; Donaher, Natalie2; Campbell, Douglas2 ; Lavaud Johann1 & Babin, Marcel1
1UMI Takuvik, Université Laval, Québec, QC, G1V 0A6, Canada ([email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]) 2Mount Allison University, Sackville, NB, E4L 3M7, Canada ([email protected]; [email protected])
17
4.1 Introduction Diatoms experience a wide range of environmental conditions across the oceans, some of
which being extremely stressful for the cells. Light spans the largest variations where
diatoms may temporarily experience high light exposure in the sunlit surface layer or
darkness due to ocean mixing or during the night. Diatoms may spend several weeks in
total darkness during deep ocean mixing events (Cullen and Lewis 1988, Marshall and
Schott 1999). Moreover, at high latitudes, darkness takes over for several months as a
consequence of sea-ice cover and low sun elevations. Such conditions are exclusive to polar
winter in the Arctic and Antarctic Oceans. Winter darkness under sea-ice can last as long as
6 months during which photoautotrophic organisms such as diatoms must survive. Since
their main energy source is from sunlight, one can wonder how diatoms satisfy their
metabolic needs when no light is available for such a long period of time.
Several studies in the past decades have contributed to the understanding of polar winter
darkness survival of microalgaes (including diatoms) (Smayda and Mitchell.B 1974, Antia
1976, Palmisano and Sullivan 1983, Peters 1996, Peters and Thomas 1996, Zhang et al.,
1998, Luder et al., 2002, Wulff et al., 2008, Reeves et al., 2011) (unpublished, Lacour et
al., 2017). In all experiments, cell growth recovered after the dark period. Strategies such as
spore production (Doucette and Fryxell 1983) and heterotrophy (Lewin 1953, White 1974,
Hellebust and Lewin 1977) may explain diatoms survival to prolonged darkness, but most
of the experiments so far have not recorded the presence of spores nor measured
heterotrophy. However, a physiological resting state that is characterized by a stabilized
metabolism and a low rate of energy reserve consumption may play a significant role
(Handa 1969, Palmisano and Sullivan 1982, Dehning and Tilzer 1989, Peters and Thomas
1996, Jochem 1999, Popels et al., 2007, McMinn and Martin 2013, Schaub et al., 2017).
Recently, the Fragilariopsis cylindrus transcriptome response to darkness (7 days) was
investigated (Mock et al., 2017). Among the different abiotic stresses tested, darkness
triggered the largest transcriptome response involving approximately 60% of all genes with
most of them downregulated.
Despite the numerous studies reporting survival over long periods of darkness, only a few
18
have investigated the physiological mechanisms involved during the light return recovery
(Griffiths 1973, Luder et al., 2002, Popels et al., 2007, Reeves et al., 2011) (unpublished,
Lacour et al., 2017). In the latter studies, photosynthetic performances recovered but were
low after several weeks of darkness. However, longer periods of darkness could
compromise the recovery.
With the aforementioned literature, our study aimed to provide answers to the key question:
How do diatoms survive during such conditions of darkness and resume fast growth as
soon as light becomes available? What are the physiological mechanisms underlying such
survival? Because our understanding of dark survival strategies in diatoms is still limited
and nearly lacking for the processes involved upon the return of light, the objectives of this
study were to (i) understand the response of diatoms to both darkness and return of light,
(ii) to provide an extensive description of relevant physiological mechanisms over a
darkness period that mimics the polar winter and (iii) to highlight physiological
peculiarities that were not documented previously.
19
4.2 Methods
4.2.1 Cell culturing
Axenic cultures of Fragilariopsis cylindrus (National Center for Marine Algae and
Microbiota CCMP3323, Annexe 1), collected as CCMP1102 during the Islas Orcas cruise
in the Southern Ocean (64,08° S 48,7033 °W) were grown in semi-continuous cultures in
pre-filtered L1 medium (Guillard and Hargraves 1993) (Annexe 2). Cultures in triplicate
started in 50 mL borosilicate tubes and were subsequently transferred to larger borosilicate
vessels several times semi-continuously until a final transfer to 20-L polycarbonate round
vessels (Annexe 3). At this step, 5 L of each culture were transferred to the vessels and
addition of L1 media followed thereafter to increase culture volume while matching growth
rate so that the cell density remains constant (Wood et al., 2005). The illumination was
provided continuously with DURIS® E3 LED bands (GW JCLMS1.EC, 4000 K) at 30
µmol photon m-2 s-1 as measured with a QSL-100 quantum sensor (Biospherical
instruments, San Diego, CA, USA) placed in the centre of the vessel. This irradiance was
chosen based on the parameter KE, i.e. the irradiance at which the growth rate saturated for
our F. cylindrus strain. Each culture was gently mixed with a 12.5 cm magnetic stirrer and
bubbled with air filtered through a 0.3µm capsule filter (Carbon CAP, 6704-7500).
Temperature of the growth chamber was kept at 0°C for the whole experiment.
4.2.2 Sampling design
Sampling was made for the first time (-1 day and 0 day, light acclimated) once the cultures
had reached a steady state (MacIntyre and Cullen 2005), i.e when growth rate, cell diameter
and chlorophyll a (chl a) were constant and acclimated to the growth condition. Cultures
were considered acclimated when those parameters remained unchanged for a minimum of
10 cell generations. In order to avoid light limited growth, the cultures were kept optically
thin for the light acclimation period. Cell density ranged from 4×104 to 6×105 cell mL-1
during the exponential growth phase and was maintained around 5×105 cell mL-1 prior to
the dark transition. After the light acclimated sampling, the light system was immediately
switched off and each vessel was carefully covered with opaque material. Sampling in the
dark was made 24 hours following the transition to the dark and subsequent «dark»
samplings followed the timeline shown in Fig. 3.
20
The first “return to light” experiment (Light1) took place after 1.5 months (48 days) in the
dark and was conducted outside of the initial growth chamber. Culture volume was
carefully transferred to gently aerated 3-L vessels cooled with ethylene glycol at 0°C and
illuminated at 30 µmol photon m-2 s-1 with a slightly different light spectrum than that of the
light acclimation system (pre-acc)(Annexe 4). This second light system was provided by a
customized LED system (uncommercialized) encompassing 8 colours independently
variable in intensity. The light system surrounded the 3L vessel via 6 panels each equipped
with a LED system (Annexe 5). The cultures were sampled at specific times as shown on
Fig. 3 until no culture volume was left in the vessels. The second “return to light” (Light2)
took place after 3 months (90 days) in the dark.
Figure 3 Timeline of the sampling strategy for dark period and light return experiments. The vertical lines show the times of sampling, and the dashed arrow shows transfer of a fraction of the replicate cultures prior to light return #1 at 1.5 months following dark transition. In the first phase, cultures were acclimated to the light conditions for 52 days. Cultures were then transferred in complete darkness (grey arrow). In the third phase, dark acclimated subsamples were transferred to light after 1.5 months and 3 months.
For each sampling time-point, cultures aliquots were harvested to measure cell number,
biovolume, cellular organic carbon and nitrogen (POC & PON), lipid droplets, pigments,
quantum yields of charge separation in photosystem II (PSII), non-photochemical
quenching (NPQ), photosynthetic proteins (D1, RUBISCO) and carbon fixation rates.
However, not all variables were measured for every time-point. The NPQ was measured for
the light-return experiments and for several time-points during the dark period (2 weeks, 1
21
month, 1.5 months, 3 months). Carbon fixation rates were measured at all points except for
the third month of darkness. Lipid droplets were measured from 5 hours to 6 days
following both light return experiments and for every time-points during the dark period.
4.2.3 Cell number and volume
Cells were counted and sized using a Beckman Multisizer 4 Coulter Counter. Culture
aliquots were first diluted 50 times in Milli-Q water adjusted to 36 ‰, Sodium Chloride
(CAS: 7647-14-5, S7653, Sigma Aldrich). Three consecutive countings were
systematically achieved for each replicate. Total cell counts ranged from 5115 to 21090
depending on the volume diluted (either 200 or 500 µL) and the sampling time. Near all of
the cells (> 95%) ranged between 2.822 and 7.165 µm length with a peak at 3.809 to 4.245
µm (mean size) depending on the sampling time. The system was previously calibrated
using 10 µm latex beads (COULTER CC Size Standard L10, REF: 6602796, Beckman
Coulter) with an aperture diameter of 50 µm. The cell volume was computed using the
mean size as the length and assuming a cylindrical shape with an average diameter of 2 µm.
4.2.4 Carbon and nitrogen
For measuring the cellular content of organic carbon and nitrogen, three replicates were
harvested per algal culture. Aliquots of 20 mL were filtered onto glass-fiber filters (0.7µm,
25mm) pre-combusted at 500°C for 24 hours. Filters were then dried at 60°C for at least 12
hours and kept desiccated before elemental analysis with a CHN analyzer (2400 Series II
CHNS⁄ O; Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA).
4.2.5 Lipid droplets
Cells were assessed for their lipid droplets content using the molecular probe BODIPY®
505/515 (4,4-Difluoro-1,3,5,7-Tetramethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene, REF:D3921,
LOT:1740601, www.lifetechnologies.com) according to Brennan et al. (2012).
Fluorescence emitted from the BODIPY probes was measured using flow cytometry. The
first 2 months of the dark experiment (including Light1 experiment) were covered with a
dual laser excitation flow cytometer (Millipore Guava easycyte 8 HT, excitation at 488 nm,
emission measured at 525/30 nm). For the third month of dark experiment and the Light2
experiment, another flow cytometer was used (Milipore Guava easycyte HT BGV,
excitation at 488 nm, emission measured at 512/18 nm). A 500 µM BODIPY stock solution
22
was prepared by dissolving the dye in anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) and was ~20
fold-diluted in DMSO for a working solution of 25.43 µM. To determine the optimal
BODIPY 505/515 concentration, a range of 17 final concentrations from 0.085 µM to 1.59
µM was assayed. The optimal concentration was of 0.33 µM and 1.32% DMSO, which was
4 µL of the working solution in 300 µL of culture. Samples in three technical replicates for
each culture were then incubated for 1 hour into a dark styrofoam box filled with ice in
order to keep the temperature as close as possible to the growth chamber (0°C). A 96-well
plate containing the samples was used for the fluorescence analysis. Samples were
quantified for their relative fluorescence emission with 2000-5000 cells per well. Each cell
population was analysed with R©. Technical replicates were averaged together for their
mean signal of fluorescence.
4.2.6 Pigments concentration
Samples for pigment analysis were filtered onto glass-fiber filters (GF/F) (0.7µm, 25mm,
Millipore). 10 mL of each culture was harvested. Filters were immediately flash-frozen in
liquid nitrogen and stored at -80°C until analysis. Pigment separation was performed with
high performance liquid chromatography (HPLC) according to Manuel et al. (2000). Prior
to HPLC analyses, pigments were extracted in 95% methanol and sonicated during 20
seconds three times. Samples were then centrifuged (4500 rpm) 15 minutes at 4°C and
filtered on polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes (0.2 µm). Data were analysed using
ChromQuest 5.0 software.
4.2.7 Photosynthetic proteins
For RbcL and PsbA quantitation, 30 mL of each culture was harvested onto GF/F. Filters
were flash-frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C. Protein extractions were
performed using the FastPrep-24 and bead lysing “matrix D” (MP Biomedicals), using 3
cycles of 60 s at 6.5 m/s in 300 µL of 1X extraction buffer (Agrisera), then spun at 16 000 g
for 5 minutes. The supernatant was removed and spun for 2 additional minutes, then
prepared for electrophoresis based on equivalent nitrogen content using 1x sample buffer
(Invitrogen) and 50 mM DTT. Separation of proteins was done in a Bolt 4-12% Bis Tris
SDS-PAGE gel (Invitrogen). Each gel had a 4-point quantitation curve using RbcL
(www.agrisera.se).
23
Proteins were separated via electrophoresis at 200 V for 40 minutes then transferred to
polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes at 30 V for 60 minutes. Membranes were
blocked for 1 h in 2% w/v ECL blocking agent (GE Healthcare) dissolved in TBS-T (Tris,
20 mM; NaCl, 137 mM; Tween-20, 0.1%v/v), then incubated in 1:10 000 rabbit polyclonal
anti-RbcL antibody for 1 h (Agrisera) and finally in 1:10 000 goat anti-rabbit IgG HRP
conjugated antibody (Agrisera) for 1 h. Membranes were rinsed with TBS-T solution five
times after each antibody incubation. Chemiluminescent images were obtained using ECL
Ultra reagent (Lumigen, TMA-100) and a VersaDoc CCD imager (Bio-Rad). Band
densities for samples were determined against the standard curve using the ImageLab
software (v 4.0, Biorad).
4.2.8 Variable fluorescence
Variable in vivo chl a fluorescence was measured using a Fluorescence Induction and
Relaxation (FIRe) fluorometer (Satlantic, Halifax, NS, Canada) that applies a saturating,
single turnover flash (STF, 100µs) of blue light (455 nm, 60-nm bandwidth) to the
incubated sample. The FIRe generates a fluorescence induction curve (fluorescence
detected at 680 nm) that can be used to estimate the absorption cross-section (σPSII), the
minimum fluorescence (F0) and the maximum fluorescence of dark acclimated cells (FM)
with the FIReWORX algorithm (Pers. Comm. Audrey Barnett, www.sourceforge.net).
σPSII, F0 and FM were measured on culture subsamples shortly after volume harvest during
the dark experiment (already dark-acclimated) or dark-acclimation for 30 min during the
Light1 and Light2 experiments. We estimated the maximum quantum yield of PSII (ΦM) as
follow.
𝛷! = !!!!
= !!!!!!!
(1)
We also measured variable in vivo chl a fluorescence using the Pulse Amplitude Modulated
technique with the PhytoPAM (Walz, Germany) instrument. Cells were dark-acclimated for
30 minutes when applicable (Light1 and Light2 experiments) and subsequently exposed to
the rapid light curve protocol (RLC). Subsamples were exposed to a 8 step-wise increasing
continuous irradiances (1, 1.8, 3.5, 7.1, 14, 28, 56, 111 µmol photons m-2 s-1) for 10 seconds
each. For measuring variable fluorescence, light saturation of the photosystems was
24
achieved with a strong actinic red flash (500 ms, >550 µmol photons m-2 s-1) at each
irradiance-step of the RLC protocol while a non-actinic modulated light source was used
for each incubation-irradiance. Both of the actinic and non-actinic light sources were
provided by the Measuring LED-Array-Cone (Phyto-ML). Although the instrument allows
excitation of fluorescence at four different wavelengths, actinic light was only provided by
the actinic LEDs peaking at 655 nm (Annexe 4). The non-photochemical quenching (NPQ)
was calculated for each irradiance-step as:
𝑁𝑃𝑄 = !!!!!!!!!
(2)
where FM and FM’ are the maximum fluorescence of dark and light (incubation-irradiance)
adapted cells respectively. The NPQmax was estimated from a least-square fit of the
following equation to the data (Serôdio and Lavaud 2011):
𝑁𝑃𝑄 (𝐸) = 𝑁𝑃𝑄!"# ⋅!!
!50!!!!
(3)
NPQmax is the maximum NPQ value reached during the light curve, E50 is the irradiance
at which 50% of NPQmax is reached and n is the Hill coefficient (the sigmoidicity of the
curve).
4.2.9 14C incubations
A 35-mL culture sample was first collected for each culture, and inoculated with inorganic 14C (NaH14CO3, 2 µCi mL-1). Then 1-mL aliquots of the inoculated culture sample were
dispensed into twenty-four 7-mL glass scintillation vials cooled in separate thermo-
regulated alveoli (0°C). The vials were exposed to 24 different light levels provided by
separate LEDs (LUXEON Rebel, Philips lumileds) from the bottom of each alveolus. The
PAR (µmol photon m-2 s-1) in each alveolus was measured before incubation with a
quantum sensor (Biospherical QSL-100) equipped with a 4π spherical collector . After 20
min of incubation, culture aliquots were fixed with 50 µL of buffered formalin then
acidified (250 µL of HCl 50%) and placed under the fume hood for 3 hours in order to
remove the excess inorganic carbon (JGOFS protocol, UNESCO 1994). Finally, 6 mL of
scintillation cocktail were added to each vial prior to counting in the liquid scintillation
counter (Perkin Elmer® Tri-Carb 2910TR). This step allowed determining the amount of
radiolabeled carbon assimilated by the cells from the number of disintegration per minute
(DPM).
25
To determine the total amount (total activity) of bicarbonate added, three 20-µL aliquots of
radioactive sample were added to 50 µL of an organic base (ethanolamine) and 6 mL of the
scintillation cocktail (Ecolume) into glass scintillation vials. The carbon fixation rate was
finally computed according to Parsons et al. (1984a)
𝑃 = (!!!!!) ⋅ !! ⋅ !
(4)
where P is the rate of carbon fixation [mg C m-3 h-1], R is the total activity (DPM), N is the
number of hours of incubation, RS is the sample count (DPM) corrected for quenching, RB
is the blank (or dark sample) count (DPM) corrected for quenching and W is the weight of
total carbon dioxide present [mg C m-3] calculated as:
𝑊 = 12 000 ⋅ 𝑇𝐶 (5) where 12 000 is the molar weight of carbon (mg) and TC is the total carbon dioxide
calculated according to Parsons et al. (1984b)
𝑇𝐶 = 0.96 [(𝑆‰ ⋅ 0.067 𝑚𝑒𝑞/𝐿)− 0.05] (6)where the formula [(S‰ · 0.067meq/L) – 0.05] is the carbonate alkalinity and 0.96 is the Ft
factor that is function of the salinity, the temperature and the pH in the media here at 36‰,
0°C and 8.1, respectively.
The relationship between the rate of carbon fixation (P) and irradiance (PAR) was fitted
according to Platt et al. (1980) to obtain the photosynthetic coefficients:
𝑃 = 𝑃! [1 – 𝑒𝑥𝑝(– !"#$!!
)]𝑒𝑥𝑝(– !!"#!!
)+ 𝑃! (7)
where PS is the maximum carbon fixation rate in absence of photoinhibition [mg C m-3 h-1],
α is the initial slope of the carbon fixation vs. irradiance curve [mg C m-3 h-1 (µmol photons
m-2 s-1)-1], PAR is the incubation irradiance (µmol photons m-2 s-1), β is the photoinhibition
coefficient [mg C m-3 h-1 (µmol photons m-2 s-1)-1] and P0 is the intercept of the curve [mg C
m-3 h-1]. The maximum carbon fixation rate at saturating irradiance was calculated as
follow.
𝑃𝑚𝑎𝑥 = 𝑃!(!
!!!)(
!!!!
)!! (8)
26
4.2.10 Statistical analysis
Statistical power of the experiment was limited to the three grown cultures assumed to be
identical to each other. Most of the studied parameters were measured once for each culture
at each harvest time, except for the carbon, nitrogen and lipid droplets content that
additionally had three technical replicates per culture. Time elapsed after the onset of a
condition (darkness or light return) and experiment types (pre-acc, Dark, Light1, Light2)
were the main factors explaining the parameter variances. To determine whether there was
a significant variation of the measured parameters during an experiment type, we compared
appropriate sampling days to the t0 (assumed to represent normal conditions) with a paired
t-test (n=3). Alternatively, we used a one-way ANOVA over several sampling days when a
culture replicate was lacking. An exponential decay function was fitted to the
photosynthetic parameters of the carbon fixation curves measured during the dark
experiment as follow:
𝑃(𝑡) = 𝑃0 𝑒𝑥𝑝(−𝑆・𝑡)+𝐾 (9)where P(t) is a given photosynthetic parameter value (Pmax, α, Ek) at time t (days after
dark transition), P0 is the initial value at t(0), S is the exponential decay constant and K is
the value of P (t→ ∞).
We also compared the Light1 and Light2 experiments for their physiological recovery over
time. Where linear regressions were applicable, we used ANCOVA to compare the slopes
between Light1 and Light2 experiments. The data of each culture were pooled together for
all sampling days. Linear regressions were not suitable for the Pmax and ΦM data. We used
the equation (9) to compare the Pmax and ΦM “recovery slope” in Light1 and Light2 as
follow:
𝑃(𝑡) = −𝑃0 𝑒𝑥𝑝(−𝑆・𝑡)+𝐾 (10)where P(t) here is Pmax or ΦM at time t (days after light transition) and S is the exponential
recovery slope constant. The variances of the Light1 and Light2 non-linear models were
used to simulate 5000 fits in order to compare the slopes (S) in a suitable manner. Then, a
paired t-test applied to the simulated slopes computed for Light1 and Light2 searched for
statistical differences. Statistical reports of t-tests are shown as follow in the results section:
Mean±SD (group 1) to Mean±SD (group 2); t(degrees of freedom) = t-value (* if p-value <
0.05 unless otherwise specified). In case of a one-way ANOVA, reports are as follow:
27
F(degrees of freedom between groups, degrees of freedom within groups) = F-value (* if p-
value < 0.05 unless otherwise specified). Slope significance reports of the fitted exponential
functions (Eq. 9,10) are shown as follow: S: t(degrees of freedom) = t-value (* if p-value <
0.05 unless otherwise specified).
28
4.3 Results & discussion
4.3.1 Dark experiment
Several physiological processes in a diatom species exposed to darkness were monitored
over a period of three months (90 days), which is significantly longer than in any
previously published experiments with detailed characterization that seldomly lasted more
than 1 month in darkness (Dehning and Tilzer 1989, Peters and Thomas 1996, Baldisserotto
et al., 2005a, Reeves et al., 2011, Martin et al., 2012, Schaub et al., 2017). Our results are
consistent with their findings on common parameters.
4.3.1.1 Cell and reserves Cell number per mL (Fig. 4a) of the three cultures ranged from 4.76×105 to 6.53×105
before the transition to the dark, i.e. during the last two days of the acclimation period. It
increased during the first month of the dark period by 27.27±3.21% of the value measured
at t0 (5.93±0.66×105 to 7.53±0.66×105; t(2) = 62.62*), which is likely due to a final cell
division for a subset of the cell population as observed in previous experiments
(unpublished, Lacour et al., 2017). The biovolume (µm3) (cell volume x cell number)
increased by 23.70±3.95% (7.54±0.87×106 to 9.30±0.80×106; t(2) = 31.83*) which was
lower than the increase in cell number since the cell volume decreased by 2.82±0.64% as a
consequence of cell division (12.71±0.05 to 12.35±0.04; t(2) = -7.53*) (Fig. 4b). The cell
number and the biovolume then decreased until the third month to end up at values slightly
above the t0, but their decrease were not significant. Cellular carbon and nitrogen quotas
(µg/cell) decreased during the first month of darkness by 33.58±10.12% (5.40±0.23×10-6 to
3.58±0.50×10-6; t(2) = -5.57*) and 31.62±3.20% (9.92±0.28×10-7 to 6.78±0.23×10-7; t(2) =
-14.07*), respectively (Fig. 4c). Carbon quota then increased until the third month to values
slightly above the t0 (6.18±0.39×10-6; F(2,4) = 27.11*). Note that a culture (black dots) was
discarded of the analysis after 1 month of darkness as an outlier. The apparent increase until
the third month of cellular nitrogen was not significant.
A potential mechanism for long-term dark survival is to reduce metabolism and fine-tune
the utilization rate of stored energy products (Handa 1969, Palmisano and Sullivan 1982,
Dehning and Tilzer 1989, Jochem 1999, Popels et al., 2007, Schaub et al., 2017).
29
Figure 4.a) Biovolume (black, gray) and Cell number per mL (blue, skyblue) b) Cell volume (black, gray) and lipid droplets (blue, skyblue) c) POC (black, gray) and PON (blue, skyblue) per cell of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2
s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. Values from the light return experiments are shown in lighter colors. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bars, except for the POC points after the first month of darkness. A POC replicate was discarded (black dots) of the mean and standard deviation calculations.
30
We observed a decrease in the cellular carbon and nitrogen content for the first month of
the dark period. However, this decrease was likely the consequence of cell division to a
smaller volume. Indeed, the carbon quotas per mL (data not shown) did not decrease
significantly during the first month. Furthermore, the lipid droplets signal probed with
BODIPY (RFU) was only 4.48±0.35% lower than the t0 value (641.44±13.04) after 1
month (Fig. 4b). It then slowly decreased to 13.15±2.46% lower than the t0 value after
three months of darkness (t(2) = -8.71*). Hence, this suggests very low metabolic rates and
low energy reserve consumption as a survival process in F.cylindrus. The increase of the
carbon quotas after 1 month was unexpected and remains unexplained. Note that similar
trends can be found in Figure 3 and 4 of Peters and Thomas (1996). If bacterial presence
were to account for this increase, sufficient amount of dissolved organic carbon (DOC)
would have had to be present in the culture medium to sustain heterotrophic growth (Rivkin
and Anderson 1997). We did not measure the DOC level in our experiment since the
cultures were axenically maintained and the fresh culture medium was free of DOC.
4.3.1.2 Photosynthetic apparatus dismantlement When cells are exposed to long period of darkness, it is obvious that the photosynthetic
machinery is not operating its main function of converting light to chemical energy. A
metabolic cost is associated with sustaining the molecular components of the
photosynthetic apparatus (Geider and Osborne 1989, Quigg and Beardall 2003). Based on
the assumption of a reduced metabolism, renewal of degraded photosynthetic components
should be limited. We measured degradation of the chlorophyll a (Chl a) and the main
photosynthetic accessory pigment fucoxanthin (Fuco) as in past experiments (Peters and
Thomas 1996, Baldisserotto et al., 2005a, Veuger and van Oevelen 2011). Chl a and Fuco
(µg/cell) decreased after three months of darkness by 40.45±9.86% (2.09±0.34×10-7 to
1.227±0.059×10-7; t(2) = -4.535*) and 47.02±7.50% (1.79±0.22×10-7 to 0.938±0.047×10-7;
t(2) = -6.178*), respectively (Fig. 5a). The non-photosynthetic pigments (µg/cell), which
include the photoprotective xanthophylls (NPHP: diadinoxanthin (DD) + diatoxanthin
(DT)) decreased by 19.63±7.60% (2.56±0.18×10-8 to 2.05±0.13×10-8; t(2) = -4.12, p-value
= 0.054). The NPHP pool decreased mainly as the DD form since DT immediately returned
to its epoxidized form (DD) after 1 day of darkness (Fig. 5b).
31
Figure 5.a) Chlorophyll a (black, gray) and Fucoxanthin per cell (blue, skyblue) b) Diadinoxanthin (black, gray) and Diatoxanthin per cell (blue, skyblue) c) σPSII (black, gray) and PHP/NPHP (blue, skyblue) of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2 s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. Values from the light return experiments are shown in lighter colors. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bars.
32
Thus, we measured a decrease of the photosynthetic (PHP: Chl a + Chl c +Fuco) to non-
photosynthetic pigments ratio by 30.73±4.59% (16.87±1.92 to 11.63±0.41; t(2) = -6.86*)
(Fig. 5c). As a consequence of this specific pigmental degradation, the effective absorption
cross-section (σPSII) decreased by 26.15±7.33% (514.76±47.80 to 377.82±5.16; t(2) = -
4.59*) (Fig. 5c) (Falkowski and Raven 2007).
Photosynthetic proteins (µg/cell) also decreased during the dark period, but they reached a
much lower level than the photosynthetic pigments after the second and the third month
(Fig. 6a). PsbA, a D1 protein sub-unit of the RCII, decreased by 85.01±4.83% of the t0
values (5.75±1.01×10-9 to 0.84±0.21×10-9; t(2) = -8.07*). This massive decrease is
indicative of a PSII core complex degradation as seen in other experiments with a green
chlorophyte and a snow xanthophycean algae (Baldisserotto et al., 2005a, Baldisserotto et
al., 2005b, Ferroni et al., 2007). The large subunit of RUBISCO (RbcL, the carbon fixation
enzyme) decreased similarly as PsbA by 71.34±12.48% (1.41±0.11×10-7 to 0.39±0.15×10-7;
t(2) = -6.79*) (Fig. 6a). Based on the photosynthetic proteins results, one would expect that
carbon fixation was largely dismantled in absence of those proteins (especially RbcL).
Indeed, the carbon fixation vs. irradiance curves showed a major decrease after 2 months of
the initial-slope (α, Fig. 6b) and the maximal rate of carbon fixation (Pmax, Eq.8, Fig. 7a,b)
by 91.790±0.013% (4.90±2.04×10-12 to 0.39±0.10×10-12; t(2) = -4.03, p-value = 0.056) and
97.560±0.018% (8.47±2.10×10-11 to 0.20±0.14×10-11; t(2) = -6.90*), respectively
(Hellebust and Terborgh 1967, Dehning and Tilzer 1989, Peters and Thomas 1996, Popels
et al., 2007) (unpublished, Lacour et al., 2017). Both parameters decreased exponentially to
minimal values during the first month of darkness and remained very low until the end of
the dark period (significance of the slope parameter (S): tPmax(15) = 4.85*, tα(15) = 2.70*).
Pmax per cell decreased faster relatively to the RbcL content, possibly because of an early
inactivation of the carbon fixation enzyme (Hellebust and Terborgh 1967, MacIntyre et al.,
1997). Pmax also decreased faster relative to α per cell, which lowered the light saturation
parameter Ek (Pmax/α). Hence, Ek decreased exponentially (S: tEk(15) = 2.35*, data not
shown). Thus, the susceptibility to photoinhibition increased as the cells aged in the
darkness. Non-photochemical quenching (NPQ, Eq.2) was triggered in the rapid light curve
(RLC) protocol as a consequence of impaired electron sink capacities such as the carbon
33
Figure 6.a) PsbA (black, gray) and RbcL (blue, skyblue) per cell b) initial slope of carbon fixation (α) (black, gray) and ΦM (blue, skyblue) of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2 s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. Values from the light return experiments are shown in lighter colors. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bars, except for the PsbA Light1 points. A replicate was discarded (black dots) of the mean and standard deviation calculations.
34
Figure 7.a) Carbon fixation maximum (Pmax) (black, gray) of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2 s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bars. b,c,d) Carbon fixation curves, of which Pmax is calculated, are shown for the dark period (Dark panel) and light experiments (Light1 and Light2 panels). Each curve is fitted on the three cultures data points together for each sampling time.
35
Figure 8.a) Non-photochemical quenching maximum (NPQmax) (black, gray) of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2 s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bars. b,c,d) NPQ curves, of which NPQmax is calculated, are shown for the dark period (Dark panel) and light experiments (Light1 and Light2 panels). Each curve is fitted on the three cultures data points together for each sampling time.
36
fixation (Huner et al., 1998, Joliot and Alric 2013). NPQ did not show significant
variations with the number of days spent in the dark once Pmax and α have reached low
levels (Fig. 8a,b).
While the carbon fixation curve parameters decreased exponentially, the maximum
quantum yield of PSII (ΦM, Eq.1) showed no significant variation while a decrease is
commonly observed in darkness (Reeves et al., 2011, Martin et al., 2012)(unpublished,
Lacour et al., 2017) (Fig. 6b). To explain such a difference between the variation in ΦM and
the carbon fixation curve parameters, we suggest that the measured ΦM in our experiment
reflected the remaining viable cells whereas α and Pmax reflected the whole cell population
because they were normalized per total cell count (including the dead ones). Additionnally,
the single turnover flash applied to measure ΦM lasted 100µs whereas 14C incubations
lasted 20 minutes. Viable cells taken out of an extended period of darkness and exposed to 14C incubations likely have suffered more from impaired electron sink capacities than the
single turnover flash. Therefore, the large discrepancies between ΦM and the carbon
fixation curve parameters are likely due to the nature of their protocol and their
normalization.
4.3.2 Light experiment
The dark acclimated F.cylindrus cultures were exposed back to light after 48 days and 90
days and monitored for the same physiological parameters. Despite the limited
documentation on light return experiments found in the literature (Griffiths 1973, Popels et
al., 2007), light transition experiments provided relevant insight on how diatoms cope with
sudden high light shift (Anning et al., 2000, Nymark et al., 2009, Wu et al., 2011, Nymark
et al., 2013) which corroborate the results of our light experiments. Additionally, Lacour et
al. (2017, unpublished) measured similar physiological processes after 1 month of darkness
and we find consistent results with their study on Chaetoceros neogracile.
4.3.2.1 Photosensitivity and photosynthetic apparatus reassembly We showed that acclimated cells to darkness dismantled their photosynthetic apparatus
with high susceptibility to photoinhibition. To avoid photo-damages, diatoms mainly rely
on the NPQ mediated by the xanthophylls cycle as their mean for photoprotection (Goss
and Jakob 2010), especially for F.cylindrus (Petrou et al., 2011). Given the low
37
photosynthetic capacities reached during the dark period, a rapid NPQ response was
expected to occur in the early hours of the light return experiments to get rid of the
excessive light stress. For the Light1 experiment, the highest NPQmax (Eq.3) values were
measured after 2 hours of light exposure and decreased by 47.81±10.59% after 3 days to a
“relaxed-state” (0.51±0.03 to 0.27±0.04; t(2) = -4.39*) (Fig. 9a, Fig. 8c). The de-
epoxidation state (DES: DT/(DD+DT)) showed consistent variations supporting that the
measured NPQ was related to the action of DT (Lavaud et al., 2004, Lavaud and Goss
2014)(Fig. 9c).
Figure 9.a,b) NPQmax (black) and de-epoxidation state (DES) (blue) c,d) Diadinoxanthin (black) and Diatoxanthin (blue) per cell of Fragilariopsis cylindrus cultures for the Light1 and Light2 experiments. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bars. In Light2, NPQmax began at the lowest level measured during the whole experiment and
increased by 260.00±55.99% within 1 day of light exposure (0.121±0.015 to 0.312±0.063;
t(2) = 5.513*) (Fig. 9b, Fig. 8d). It then remained at this level until the 6th day. DES in
38
Light2 was not consistent within the early hours of light exposure. Despite DT increased
within 30 minutes of light exposure (1.15±0.31 (Dark, 3 months) to 6.36±1.06×10-9; t(2) =
6.90*), NPQmax remained low (Fig. 9b,d). This particular inconsistency was also observed
in other experiments with Phaeodactylum tricornutum and F. cylindrus (Casper-Lindley
and Bjorkman 1998, Kropuenske et al., 2009). According to Kropuenske et al. (2009), 30
minutes of dark-acclimation prior to the NPQ measurements were not sufficient to achieve
complete re-epoxidation of the accumulated DT for the highly light-stressed samples. Thus,
the NPQmax was likely underestimated for the first 5 hours.
Figure 10.a,b) Chlorophyll a (black) and Fucoxanthin (blue) per cell b,c) σPSII (black,) and PHP/NPHP (blue) of Fragilariopsis cylindrus cultures for the Light1 and Light2 experiments. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bars.
Variations of the pigment composition were typical of a response to high light transition as
described by Anning et al. (2000) and Nymark et al. (2009) on the temperate diatoms
Skeletonema costatum and P. tricornutum. The simultaneous decrease of Chl a and Fuco
39
(Fig. 10a) and increase of DD (Fig. 9c) led to a decrease of the PHP/NPHP ratio until the
third day of Light1 (13.09±0.94 to 7.43±1.78; t(2) = -5.21*) (Fig. 10c). After 3 days,
photosynthetic pigments stopped decreasing and started to build up, although not
significantly, which stabilised the PHP/NPHP ratio until the 6th day of the experiment.
In Light2, we observed similar variations in Chl a and Fuco (Fig. 10b), but DD did not
increase as in Light1 (Fig. 9d). In both light experiments, PHP/NPHP decreased until the
6th day of light exposure to values 45.50±9.33% (Light1) and 54.05±8.36% (Light2) lower
than the t0 prior to dark transition. Thus, the pigment composition of the antennae shifted
gradually to a higher proportion of the xanthophyll carotenoids (DD+DT), typical of high
light acclimated cells (MacIntyre et al., 2002, Kropuenske et al., 2009). The effective
absorption cross-section (σPSII) showed similar variations as PHP/NPHP during the light
experiments (Fig. 10c,d), but was only 4.10±2.08% (Light1) and 22.62±11.90% (Light2)
lower than the dark transition t0 values after 6 days of light exposure. Hence, this suggests
σPSII was not only affected by the pigment composition during the light return experiments
(Falkowski and Raven 2007).
We observed an increase of the photosynthetic proteins PsbA and RbcL during the Light1
experiment (Fig. 11a). PsbA remained stable within the first 5 hours of light exposure,
consistent with the fast-induced photoprotection preventing a further degradation of PsbA
(Wu et al., 2011). It then increased linearly to 117.92±18.50% of the t0 values in 6 days
(1.690±0.098 to 6.28±0.39×10-9; F(5,6) = 17.57*), supporting a reassembly of the RCII to
the pre-acclimation state. A replicate was discarded of the analysis as an outlier because it
did not increase after 1 day (Fig. 6a, black dots). The RbcL increase was delayed relatively
to PsbA and was not as linear. RbcL was nearly undetectable within the first 5 hours, was
only 16.08±8.12% of the t0 values after 1 day of light exposure and increased to
254.72±25.45% in 6 days (0.23±0.12 to 3.58±0.25 x 10-7; t(2) = 31.068*) (Fig. 11a).
However, Pmax increased much faster and reached 74.20±14.48% of the t0 values within 1
day of light exposure (S: t(18) = 3.87*) (Fig. 11c,e) as also observed by Popels et al.
(2007). Note that the Pmax fitted values have additional time-points from the first and the
second month of darkness since much of the increase occurred within 30 minutes of Light1
exposure. The discrepancies with the photosynthetic proteins are possibly explained by an
40
Figure 11.a,b) PsbA (black) and RbcL (blue) per cell c,d) Pmax (black) and ΦM (blue) of Fragilariopsis cylindrus cultures for the Light1 and Light2 experiments. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bars. e,f) Exponential fits (Eq.10) to the Pmax and ΦM data, including the time-points of the first and second month of darkness for the Light1 et Light2 experiment respectively.
41
adjustment of the D1 (PsbA) and Rubisco (RbcL) catalytic activities. Indeed, we would
expect the low content of Rubisco to operate at maximal activity within 1 day of light
exposure (MacIntyre et al., 1996, MacIntyre et al., 1997). ΦM also increased to
111.93±5.21% within 1 day of light exposure (S: t(12) = 4.93*) (Fig. 11c,e), supporting a
fast recovery of the photophysiology (Luder et al., 2002) (unpublished, Lacour et al.,
2017). Note that ΦM values from the 6th day were discarded of the fitting because they
added high variance on the slope parameter. Despite the slower increase of photosynthetic
proteins and the decrease of PHP/NPHP, the cells achieved efficient energy transfer from
the RCII to the carbon fixation within 1 day after Light1 experiment.
In the Light2 experiment, PsbA and RbcL were nearly undetectable and the “recovery
slopes (S)” of Pmax and ΦM were significantly lower than in Light1 (14.43±3.73 to
0.27±0.25; tPmax(4999) = 268.13*) (6.04±1.22 to 0.46±0.15; tΦM(4999) = 319.77*) (Fig.
11b,d,f). Nevertheless, ΦM increased to 112.18±4.40% (S: t(15) = 2.95*) and Pmax
increased to 42.86±13.13% of the t0 values within 6 days (S: t(17) = 1.11, p-value > 0.05).
The recovery in Light2 was probably hindered by a larger dismantlement of the
photosynthetic apparatus and of the electron sink capacities. As in the dark experiment, the
variations of ΦM likely reflected the recovery of viable cells while Pmax reflected the
recovery of the whole cell population.
4.3.2.2 Metabolism recovery The data shown in the previous section indicate that the cells were photosynthetically
competent after 1 day of light return, at least in the Light1 experiment. This means that
organic carbon could be photosynthesized to support anabolism and ultimately cell growth.
Cellular carbon and nitrogen quotas increased significantly by 62.62±44.01% (4.34±0.24 to
7.05±1.52×10-6; F(5,6) = 4.40*) and 64.72±10.90% (0.89±0.12 to 1.47±0.29×10-6; t(2) =
5.72*) in 6 days for the Light1 experiment (Fig. 12a). The lipid droplets signal also
increased by 14.26±0.31% in 6 days (650.42±5.94 to 743.16±7.10; t(2) = 73.44*) (Fig.
12c). However, carbohydrates were probably the main carbon source synthesized that
accounted for the increase in POC (Myklestad 1974, Chauton et al., 2013). The cell volume
size increased by 9.32±1.02% in 6 days (12.13±0.05 to 13.26±0.08; t(2) = 16.26*) (Fig.
12c), which is consistent with the larger content in lipids, carbon and nitrogen. As expected,
42
Figure 12.a,b) POC (black) and PON (blue) per cell c,d) Cell volume (black) and Lipid droplets (blue) e,f) Biovolume (black) and Cell number per mL (blue) of Fragilariopsis cylindrus cultures for the Light1 and Light2 experiments. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bar. the cell population entered an exponential growth phase measured between 1 day and 6
days following exposure to light with a mean growth rate of 0.1455±0.0099 d-1 (Fig. 12e).
43
This was nearly two times lower than the mean growth rate measured during the
acclimation period (0.244±0.041 d-1), probably as a consequence of the larger grown cells
and of potential mortality. For the Light2 experiment, carbon content similarly increased as
in Light1 (ANCOVA, p-value > 0.05) while nitrogen, lipid droplets, cell volume and cell
number slopes were significantly lower than in Light1 (ANCOVA, p-value < 0.05) (Fig.
12b,d,e). In fact, cell growth could not be measured. Important mortality may have
compromised the population ability to reinitiate growth upon light exposure. The lag phase
was previously reported to increase with increasing dark period (Dehning and Tilzer 1989,
Peters and Thomas 1996). In three species of antarctic diatoms, the lag phase lasted 4 days
following 74 days in the dark (Peters and Thomas 1996). Perhaps F. cylindrus needed a
couple more days before entering an exponential growth phase during the Light2
experiment.
44
4.4 Conclusion Our study measured strong acclimation processes in F. cylindrus to both darkness and
return of light. A physiological resting state was reached a few days following transition to
dark and was maintained throughout until the return to light. This rather stable state was
characterized by low energy reserve consumption, slow decrease of photosynthetic
pigments and very low photosynthetic capacities. Subsequent transition to light after 1.5
months triggered fast photoprotection and renewal of photosynthetic components. Rapid
recovery of photophysiology occurred already within a few hours of return to light,
followed by subsequent cell growth after 1 day. The re-acclimated light state showed
similar characteristics to high light grown cells. The results from transition to light after 3
months highlighted the importance of a lag phase that increases in length with longer period
of darkness. Important mortality may have delayed the full recovery of the population to a
lag phase longer than 6 days.
Survival to long period of darkness is crucial to the polar algal communities and to the
phytoplankton experiencing deep ocean mixing events. The physiological mechanisms
underlying this survival may be more efficient in some species than others. Fragilariopsis
cylindrus is found in both Arctic and Antarctic Ocean and have evolved adaptive strategies
to thrive in these extreme habitats (Lyon and Mock 2014, Mock et al., 2017). The low rate
of energy comsuption and high photoprotective capacity involved in darkness survival may
be two physiological traits that allow F. cylindrus to outcompete other polar species that
have limited NPQ capacity or temperate species that burn energy reserve faster. Our
understanding of dark survival has now gained in completeness, yet it remains to be
investigated wether mortality is a major factor explaining the decreases and the delayed
recoveries of measured physiological and molecular parameters. Accurate measures of
mortality should be monitored in future studies as suggested by our results. Progressive
dark and light transitions, rather than sudden lights shift as in our experiment, should also
be tested and coupled with mortality measurements to determine if a particular light regime
compromise survival more than another one. Finally, the importance of heterotrophy should
be also clarified, because available DOC under sea-ice could improve survival to long
period of darkness.
45
Chapitre 5. Conclusion Notre étude a démontré une forte acclimatation chez Fragilariopsis cylindrus, une diatomée
arctique, lors du passage à l’obscurité et lors du retour de la lumière. Nous avons intégré
plusieurs descripteurs physiologiques et biochimiques sur une durée de 3 mois d’obscurité.
La transition à l’obscurité a déclenché une réponse typique de dormance physiologique qui
a été maintenue durant toute la période d’obscurité. Dans cet état de dormance, les cellules
ont peu varié en nombre et en taille. Le métabolisme a été réduit à un minimum puisque les
réserves énergétiques n’ont presque pas été consommées selon les mesures de carbone,
d’azote et de gouttelettes de lipides. Le complexe antennaire du photosystème II s’est
relativement bien conservé malgré la diminution importante des pigments
photosynthétiques. Les capacités photosynthétiques ont fortement diminué jusqu’à des
valeurs minimales couplées avec des diminutions concomitantes de la protéine D1 et de
l’enzyme RUBISCO en quantité et en activité. Les faibles capacités photosynthétiques
mesurées ont montré une vulnérabilité à la photoinhibition pouvant ainsi compromettre la
reprise de croissance lors du retour de la lumière.
Au premier retour à la lumière après 48 jours de noirceur, le NPQ développé via la
diatoxanthine a été fortement sollicité comme mécanisme de photoprotection dès les
premières heures. Ce mécanisme s’est ensuite relaxé simultanément avec une augmentation
rapide des activités photosynthétiques en moins de 24 heures. Jusqu’à ce jour, la
photoprotection n’avait jamais été aussi rigoureusement suivie et couplée avec autant de
mesures physiologiques et biochimiques lors d’expériences de retour à la lumière. Le
développement du NPQ avait toutefois fait l’objet d’expériences chez des diatomées
antarctiques et les résultats obtenues avaient suggéré l’importance de ce mécanisme dans la
reprise des activités photosynthétiques (McMinn et al., 2010). L’analyse des variations de
la composition en pigments a montré que les cellules se sont acclimatées d’une manière
similaire à une expérience de transition de faible à forte lumière. Finalement, une reprise de
la croissance s’est rapidement manifestée par l’augmentation du carbone, de l’azote, des
lipides, de la taille et du nombre de cellule après 24 heures et s’est poursuivie jusqu’au 6e
jour.
46
La mortalité des cellules ne semble pas avoir été un problème majeur pour le premier retour
à la lumière après 48 jours d’obscurité, mais les résultats du deuxième retour la lumière ont
montré que la viabilité de la population était compromise après 90 jours d’obscurité totale.
Bien que nous ne puissions pas confirmer cette progression de la mortalité grâce à des
mesures de viabilité, les écarts dans la vitesse de reprise des activités photosynthétiques et
de la croissance entre le premier et le deuxième retour à la lumière ont suggéré un effet
important de la mortalité. La phase de latence (temps écoulé avant la reprise de croissance)
est influencée par la mortalité et augmente avec la longueur de la période d’obscurité
(Dehning and Tilzer 1989, Peters and Thomas 1996). Un suivi de 6 jours n’a probablement
pas été suffisant pour observer une reprise de croissance lors du deuxième retour à la
lumière.
Les résultats obtenus suite à cette expérience confirment ceux des expériences passées et
répondent aux hypothèses énoncées. Ils fournissent une compréhension plus complète de
l’acclimatation à la nuit polaire puis au retour de la lumière chez les diatomées arctiques.
Les espèces qui composent les communautés polaires ont différentes niches écologiques
selon leurs particulartités physiologiques et leur capacité à s’acclimater (Petrou et al.,
2016). Les mécanismes qui permettent la survie à l’obscurité peuvent varier en efficacité
selon les conditions de croissance et selon l’espèce étudiée. Notre étude s’est concentrée sur
la réponse de F.cylindrus. Une réponse différente pourrait être attendue chez une diatomée
centrique comme la Chaetoceros socialis qui est observée plus tard que F. cylindrus dans la
succession des espèces de l’efflorescence printanière en Arctique (Booth et al., 2002).
Néanmoins, la prépondérance de F. cylindrus vis-à-vis d’autres espèces en Arctique et en
Antarctique est peut-être expliquée en partie par des caractéristiques physiologiques
compétitives de survie à l’obscurité, soit une très faible consommation des réserves
énergétiques et une forte capacité de NPQ (Petrou et al., 2011) au retour de la lumière.
.Des expériences futures pourront creuser davantage les secrets moléculaires qui
caractérisent la survie à l’obscurité. Elles pourront intégrer un point de vu axé davantage
sur la génétique qui est maintenant plus accessible (Mock et al., 2017). Toutefois, la
47
mortalité est un paramètre crucial qu’il faudra savoir mesurer avec précision et exactitude.
Aussi, les transitions de lumière en Arctique ne sont pas aussi abruptes que celles imposées
lors de notre expérience, notamment pour la transition vers l’obscurité. Une transition plus
graduelle de l’obscurité et de la lumière pourrait influencer la mortalité ainsi que la nature,
la vitesse et l’amplitude de l’acclimatation observée chez F. cylindrus. Finalement,
l’importance de l’hétérotrophie est une caractéristique qui devra être clarifiée dans de
futures expériences. Cette dernière pourrait améliorer considérablement la survie à de
longues périodes d’obscurité. Les conclusions tirées suite à cette étude et aux futures
recherches sur ce sujet fondamental contribueront à une meilleure description de la survie à
l’obscurité chez les communautés d’algues polaires et chez le phytoplancton soumis au
mélange vertical profond.
48
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7. Annexes
Annexe 1: Picture of Fragilariopsis cylindrus (Grunow) Krieger CCMP1102 (JGI)
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Annexe 2: Culture medium recipe (f/2 and L1)
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Annexe 3: Picture of the inside of the growth chamber with culture 1(left), culture 2(centerback) and culture 3(right) of Fragilariopsis cylindrus grown in 20L polycarbonate round vessels during light acclimation prior to dark transition. The growth chamber’s front door equipped with LED bands provided illumination to all cultures. Culture 1 and 3 shaded the back of the chamber, but culture 2 was half-surrounded by a customized aluminum panel in order to reflect photons and increase light exposure. Yet, culture 2 received 29.5 µmol photon m-2 s-1 while culture 1 and 3 received 33.5 µmol photon m-2 s-1. Yellow numbers describe each culture vessel components: 1(air outflow), 2(air inflow), 3(media inflow), 4(media outflow), 5(magnetic stirrer).
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Annexe 4: Spectrum of the different light sources used during the experiments. The integer of each spectrum gives 30 µmol photons m-2 s-1.
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Annexe 5: Picture of the culture 1(front), culture 2(middle) and culture 3(back) of Fragilariopsis cylindrus grown in 3L vessels during the Light1-2 experiment. Illumination of ~30 µmol photon m-2 s-1 was provided by 3 out of 6 panels equipped with a customized LED system. Two bands of 10 LEDS each composed one LED panel. Each panel is made with a ½ inch thick acrylic mirror. Yellow numbers describe each culture vessel components: 1(cooling inflow), 2(cooling outflow), 3(air inflow), 4(light sensor), 5(temperature sensor), 6(sampling syringe). **The labeled LED system seen on this picture is turned off.