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République AlgérienneDémocratique etPopulaireMinistère de l’EnseignementSupérieuret delaRecherche

ScientifiqueUniversité A. MIRA-Bejaia

Faculté desSciences dela Nature et dela VieDépartement de MicrobiologieFilière :Sciences BiologiquesOption :Ecologie Microbienne

Réf :..........................

MémoiredeFin deCycle

Envuedel’obtention du diplôme

MASTER

Thème

Présenté par :AZZOUG Yamina & HAMOUCHE Malika

Soutenu le : 19-06-2017

Devantle jurycomposé de:

MrBensaid K. MAAPrésident

Mr BelhadiDj. MAA Examinateur

MrRamdaniN. MAA Promoteur

Annéeuniversitaire:2016 / 2017

Caractérisation phénotypique dessymbiotes d’unelégumineuse de la tribu des Genisteae

Remerciements

Nous remercions Dieu ; le tout puissant de nous avoir accordé

santé et courage pour accomplir ce modeste travail.

Nos remerciements les plus chaleureux et les plus vifs à notre

promoteur Mr RAMDANI Nacer « Maître Assistant A » pour

son entière disponibilité ainsi que ses grandes aides,

orientations et conseils et que sans lui, le présent travail ne

serait jamais abouti. Ainsi nos remerciements à Mr BELHADI

qui nous a beaucoup aidés.

Nous tenons à remercier également le président et les

membres du jury d’avoir accepté de juger notre travail.

Enfin, nous remercions toutes personnes ayant participés de

près ou de loin à l’élaboration de ce mémoire.

YAMINA & MALIKA

Dédicace

Je m'incline devant Dieu tout puissant qui m'a ouvert la portedu savoir et m'a aidé à la franchir.

Je dédie ce modeste travail:

Mes chers parents, pour leur endurance et leurs sacrificessans limites

A mon marie, BENAMARA Massinissa qui m’a encouragédans mon travail, et ma fille Aya

A ma belle mère, et mon beau père pour lesquels je souhaiteune longue et heureuses vie pleine de bonheur

Mon frère et ma sœur

A toute ma famille

Tous mes enseignants

A ma collègue de travail Yamina

Tous ceux qui m’ont aidé dans la réalisation de ce mémoire

MALIKA

Liste des abréviations

A%: Argiles.

ADH: Arginine Désidrogénase.

ADI:Acide Adipique.

BTB: Bleu de Bromothymol.

CAP:Acide Caprique.

CIT:Trisodium Citrate.

ESC:Esculine Citrate de fer.

GEL: Gélatine.

GLU:Glucose.

GNT: potassium gluconate.

LDC:Lysine Décarboxylase.

Lf: Limons fins.

Lg%: Limons grossiers.

MLT:Acide Malique.

MO%:Matiére organique.

NAG: N-acétyl- glucosamine.

ODC: Ornithine Décarboxylase.

ONPG: Ortho-nitrophényl-β-D-galactopyranoside.

PAC:Acide Phénylacétique.

RM:Rouge de Méthyle.

Sf%: Sables fins.

Sg% : Sables grossiers

TRP: Tryptophane.

URE: Urée.

Liste des abréviations

VP: VogesPraskaeur.

YMA: Yeast Mannitol Agar.

YMB: Yeast Mannitol Broth.

SOMMAIRE

Liste des figures et des tableaux

INTRODUCTION……………………………………………………………………...1

Chapitre I : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

I.La fixation biologique de l’azote………………………………………………………..3

I.1.Les bactéries fixatrices

d’azote………………………………………………………..…3

I.2.La nitrogénase……………………………………………………………………….…..3

I.3.Le fonctionnement de la

nitrogénase……………………………………………….........3

II. La symbiose rhizobia-

légumineuse………………………………………………..…...4

II.1.Caractéristiques de la relation

symbiotique……………………………………….….....4

II.2.Interet de la

symbiose………………………………………………………………...…5

III. La

nodulation…………………………………………………………………….…….5

III.1.Les étapes de la

nodulation………………………………………………………..…...5

III.2.Les facteurs NOD……………………………………………………………………...5

III.3.Les

flavonoïdes…………………………………………………………….…………..6

IV. Les bactéries nodulant les légumineuses (BNL ou

rhizobia)………..……………….6

IV.1. Taxonomie des

rhizobia……………………………………………………………….7

IV.2.le genre

Bradyrhizobium…...…………………………………………………….…………....7

V. Les

légumineuses………………………………………………………………….….....8

V.1.Généralités………………………………………………………………………….......8

V.2.Classification des légumineuses………………………………………………………..9

V.2.1.Caesalpinoideae…………………………………………………………………........9

V.2.2.Mimosoidea……………………………………………………………………..…....9

V.2.3.Papilionoideae……………………………………………………………………......9

VI.Imoportance des légumineuses………………………………………………….…...10

VI.1.Importance agronomique et

environnementale……………………………………….10

VI.2.Importance alimentaire……………………………………………………….............10

VI.3.Importance industrielle……………………………………………………………….10

VII. Généralités sur le genre

Genisteae………………………………………………….11

VIII.Description de la légumineuse impliquée dans ce travail :Spartium

junceumL……………………………………………………………………………………

……...11

IX. Intérêt de Spartium junceumL………………………………………………….…...12

IX.1.Intéret

industrielle………………………………………………………………….....12

IX.2.Intéret pharmaceutique…………………………………………………………….....12

X. Les facteurs limitant la symbiose rhizobia-

légumineuses………………….……..…13

X.1.Effet de la

température………………………………………………………….……..13

X.2.Effet de la

salinité…………………………………………………………………...…13

XI. La résistance des rhizobia aux

antibiotiques…………………………….………….14

Chapitre II : MATERIELS ET METHODES

1. Matériels……………………………………………………………………………..…15

1.1. Récolte des

échantillons………………………………………………..……...……....15

1.2. Souches de

référence……………………………………...……………………..…….15

2.

Méthodes………………………………………………………………………………..15

2.1. Analyse physico-chimique de sol………………………………………………..…....15

2.1.1.

Texture………………………………………………………..……………………..16

2.1.2. Carbone

organique……………………………………………………………..…....16

2.1.3. pH…………………………………………………………………………….....…..16

2.1.4. Dosage de l’azote

total…………………………………………………...……..…...16

2.1.5. Dosage du calcaire

total…………………………………………………...…….......17

2.1.6. Mesure de la conductivité électrique

(CE)………………………………………......17

3. Isolement des bactéries à partir des nodules de Spartium junceum

L…………..….17

3.1. Stérilisation des

nodules……………………………………………………………….17

3.2. Ecrasement des nodules…………………………………………………………….…18

3.3. Ensemencement sur milieu

YMA………………………………………………….….18

3.4. Purification……………………………………………………………………………18

3.5. Conservation des isolats purifiés……………………………………………………...18

3.6. Test d’authentification (test de nodulation)…………………………………………...19

3.6.1. Préparation des plantules axéniques………….……………………..…….………...19

3.6.1.1. Stérilisation des graines……………………………………….………………..…19

3.6.1.2. Mise en germination des graines…………………………..……………………...19

3.6.1.3. Culture des plantules …………………………………………………..................19

3.6.1.4. Inoculation des plantules……………………………………………………...…..20

4. Identification des bactéries associées aux nodules de Spartium junceum

L………….20

4.1. Caractérisation

morphologique……………………………………………………..21

4.1.1. Caractères cellulaire

………………………………………………………………...21

4.1.2. Coloration de

Gram……………………………………………...………………......21

4.1.3. Caractères des colonies

bactériennes……………………………………………..…21

4.2. Caractérisation biochimique…………………………………………………..…...21

4.2.1.Test de bleu de

bromothymol…………………………………...………………...….21

4.2.2. Recherche de la β-galactosidase…………………………………………….………22

4.2.3. Recherche de la

catalase……………………………………………………...…..….22

4.2.4. Recherche de l’oxydase………………………………………………..……..….....22

4.2.5. Recherche de la citrate

perméase…………………………………………..…...…...22

4.2.6. Réduction des nitrates……………………………………………………..…...…...23

4.2.7. Production d’indole…..……………………………………………………...……...23

4.2.8. Utilisation du lactose du glucose et production

d’H2S……………………….……...23

4.2.9. Recherche de la formation d’acétoine et la production

d’acides……………….…....23

4.2.10. Recherche des décarboxylases LDC, ODC, ADH…………………………….….24

4.2.11. Assimilation des sucres…………………………………………………………....24

4.2.12. La galerie biochimique API 20 NE……………..…………………………....……24

5. Caractérisation physiologique ………………………………………………………..25

5.1. Effet du

pH…………………………………………………………………………….25

5.2. Effet de la

température………………………………………………………………...25

5.3. Effet de NaCl………………………………………………………………………….25

5.4. Sensibilité des souches aux

antibiotiques……………………………………………...25

6. Analyse numérique des caractères phénotypiques

étudiés…………………………..26

Chapitre III : RESULTATS ET DISCUSSIONS

1. Caractéristiques physico-chimiques de

sol…………………………………………...27

2. Authentification des

souches……………………………………………………….….28

3. Caractères phénotypiques des bactéries nodulant Spartium junceum

L……….…...28

3.1. Caractérisation cellulaire et morphologiques des colonies………………………..28

3.1.1. Caractéristiques cellulaires……………………………………………………….…28

3.1.2. Caractéristiques des colonies………………………………...………….…………..29

3.2. Caractérisation

biochimique……………………………………….………….…….29

3.2.1. Le test de bleu de

bromothymol………………………………………………..……29

3.2.2. Les tests

biochimiques………………………………………………………………31

3.2.3. Assimilation des substrats

carbonés………………………………………………....32

3.3. Caractérisation physiologique……………………………………………………....34

3.3.1. Effet de la température……………………………………………………………...34

3.3.2. Effet du

pH………………………………………………………………………......35

3.3.3. Effet du

NaCl………………………………………………………………………..36

3.3.4. Résistance aux

antibiotiques…………………………………………………….......37

4. Analyse numérique des caractères

phénotypiques…………………………………...39

CONCLUSION…………………………………………………………………………...41

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES……………………………………………….43

ANNEXES


LISTE DES FIGURES

Figure 1 :La plante Spartium junceum L. et ses différentes parties………………….….12

Figure2:Les différents échantillons utilisés dans l’étude……………..………………….15

Figure3:Nodulesutilisés…………………………………...……...………………….….18

Figure4 : Mise en germination des graines de Spartium junceum

L.……………………....19

Figure5: Dispositif utilisé dans le test de nodulation……………………………………..20

Figure6:Résultats du test de bleu de bromothymol……………………………………….30

Figure 7: Effet de la température sur la croissance bactérienne des souches isolées de

SpartiumjunceumL…………………………..………………………………………..….34

Figure 8 : Effet du pH sur la croissance des souches isolées de

SpartiumjunceumL…………………………………………………………………………

………………...35

Figure 9 :Effet du NaCl sur la croissance des souches isolées de

SpartiumjunceumL…………………...………………………………………………………

………………36

Figures 10 :Résultats de l’antibiogramme de quelques souches testées………………….38

Figure 11: Dendrogramme généré par les caractères phénotypiques……………………..39

LISTE DES TABLEAUX

Tableau I:Classification récente de Bradyrhizobium………………………………….....8

TableauII:Résultats des analyses physico-chimiques du sol de TiziAdjissa(Smaoun)..27

Tableau III: Résultats de la caractérisation morphologique des colonies

bactériennes…...29

Tableau IV: Résultats des tests biochimiques des bactéries isolées de Spartium junceum L.

……………………………………………………………………………………………..31

Pages


Tableau V: Résultats d’assimilation des sucres par les souches isolées de

Spartiumjunceum

L……………………………………………………….......................................................33

Tableau VI:Résultats de l’antibiogramme sur les souches isolées………………….......37

INTRODUCTION

Introduction

1

Les sols méditerranéens sont en général fragiles, et ce pour plusieurs raisons : les

précipitations irrégulières et souvent violentes favorisent l’érosion; l’importance des pentes

dans les nombreux secteurs de collines et de montagnes aggrave le phénomène ; les

températures élevées accélèrent la minéralisation de la matière organique ; le couvert

végétal est souvent réduit à cause de la dureté du climat et des actions anthropiques, et, de

ce fait, protège mal le sol. Dans les zones arides ou semi-arides, l’érosion éolienne est

souvent importante ; dans certaines plaines littorales ou alluviales, la présence d’une nappe

salée peut amener la salinisation des sols. De plus, de nouvelles menaces sont apparues,

liées aux bouleversements sociaux et économiques de la période récente : fort

accroissement démographique dans des zones rurales pauvres, entraînant la surexploitation

des ressources naturelles (labour de zones marginales de pente très sensibles à l’érosion,

surpâturage, surexploitation du bois de feu) ; intensification agricole moderne mal conduite

dans certains secteurs (salinisation du sol par des irrigations mal contrôlées,

surconsommation d’engrais, de pesticides) ; consommation d’espace par l’urbanisation et

les infrastructures ; pollutions par des déchets urbains ou industriels. (Antipolis,2003).

L’Algérie à l‘instar des autres pays méditerranéennes, est confrontée à un

phénomène très dangereux, la dégradation des sols qui menace le patrimoine écologique et

la sécurité alimentaire.

Les légumineuses jouent un rôle très important dans la restauration des sols

dégradés, elles sont considérées comme des plantes pionnières qui favorisent

l’implantation d’autres espèces. En plus, par leur capacité de fixer l’azote atmosphérique,

par conséquence elles contribuent à fertiliser le sol et apporter de l’azote assimilable par les

plantes, et aussi réduire l’utilisation des fertilisants et autres produits chimiques provoquant

ainsi l’appauvrissement des sols et la pollution des nappes phréatiques.

Parmi ces légumineuses, le Genêt d’Espagne (Spartium junceum L.), malgré qu’elle

n’aitpas la faveur d’être classée parmi les légumineuses à intérêt alimentaire à cause de sa

toxicité, elle a un rôle plus important dans l’environnement grâce à sa capacité d’établir

des symbioses fixatrices d’azote avec des bactéries du sol. Cette caractéristique permet la

contribution de cette plante à la protection de l’environnement et à la lutte contre

ladégradation des écosystèmes, et ainsi à la régénération des sols pauvres par la

réhabilitation de sa fertilité.

Introduction

2

Cependant, l’utilisation de cette légumineuse, pour résoudre les problèmes des

zones dégradées, nécessite au préalableune étude et la reconnaissance de la diversité de

ses partenaires symbiotiques afin de sélectionner les couples rhizobia-légumineus les plus

performants, et les plus adaptés aux fortes contraintes de leur habitat.

C’est dans ce contexte que s’inscrit notre travail qui a pour objectif principal,

l’isolement et la caractérisation phénotypique des symbiotes de la légumineuse Spartium

junceumL.collectéed’un site situé à Tizi Adjissa de la commune de Smaoun de la région

de Bejaia.

REVUE

BIBLIOGRAPHIQUE

Chapitre I : Revue bibliographique

3

I. La fixation biologique de l’azote

La fixation biologique de l’azote atmosphérique est une étape du cycle de l’azote.

C’est un processus métabolique, réalisé exclusivement par les organismes procaryotes

possédant une enzyme appelée Nitrogénase. Cette enzyme permet de convertir l’azote de

l’air (N2) en azote minéral intermédiaire (azote ammoniacal, NH3) qui est alors assimilable

par les organismes vivants pour constituer les molécules organiques (notamment les

protéines) (Schneider et al., 2015).

I.1.Les bactéries fixatrices d’azote

Seuls certains procaryotes peuvent fixer N2. Quelques bactéries fixatrices d’azotes

sont libres et ne requièrent pas d’hôte pour effectuer le processus. En revanche, d’autres

fixateurs d’azote, comme Rhizobium, fixent l’azote seulement en association avec

certaines plantes de la famille des légumineuses (Madigan et Martink, 2007).

I.2. La nitrogénase

La nitrogénase fait partie d’un complexe moléculaire de très grande taille,

comprenant plusieurs sous unités et associant des protéines, des atomes de fer, de

molybdène et de soufre. Ce complexe fonctionne en consommant de l’ATP et en

particulier 16 ATP pour fixer une molécule d’azote. Il est très sensible à la présence

d’oxygène et fonctionne donc plus aisément chez les anaérobies. En fait, la nitrogénase et

l’hydrogénase sont étroitement associées au sein d’un complexe enzymatique, purifié pour

la première fois en 1972, comprenant également des protéines et une ferrédoxine qui sert

de transporteur d’hydrogène (Tourte et al., 2005).

I.3. Le fonctionnement de la nitrogénase

La nitrogénase est un complexe enzymatique, constitué de deux composantes :

- dinitrogénase : appelée aussi protéine MoFe (un hétérotétramère de type α2β2 codé par

les gènes nif D et nif K). C’est le site de la réduction du substrat

- dinitrogénase-réductase, appelée aussi protéine Fe (un homodimère codé par le gène nif

H). Cette deuxième protéine fournit les électrons à la dinitrogénase.


4

Le complexe nitrogénase est très conservé chez les bactéries fixatrices d’azote. Les

électrons nécessaires à la réaction sont fournis par un puissant donneur d’électrons, la

dinitrogénase-réductase accepte un électron et se complexe avec deux molécules de Mg-

ATP, puis s’associe avec la dinitrogénase pour former un complexe enzymatique actif. Il y

transfert d’un électron de la dinitrogénase-réductase à la dinitrogénase et simultanément, il

y a libération de deux molécules de Mg-ADP et de phosphate, puis les deux composants de

la nitrogénase se séparent et la dinitrogénase-réductase est prête à recommencer le

transport d’un électron vers la dinitrogénase. Lorsque la molécule de dinitrogénase est

suffisamment réduite, le substrat N2 est réduit en NH3. La réduction de protons en H2 se

produit en même temps que la réduction de N2, et requiert autant de protons qu’il y a

d’électrons impliqués dans la réduction de N2 (Ludden, 2001).

La réaction finale de la réduction enzymatique de l’azote atmosphérique est :

N2 + 8H+ + 8e-+ 16 Mg-ATP 2 NH3 + 3H2 + 16 Mg- ADP + 16Pi

II. La symbiose rhizobia-légumineuses

La symbiose est construite grâce à un dialogue moléculaire entre la bactérie et la

plante-hôte. En présence de substances inductrices provenant des racines (flavonoïdes), les

protéines régulatrices, synthétisées par les gènes nodD de la bactérie, sont activées et

induisent les gènes de structure de nodulation. Ceux–ci comprennent à la fois des gènes

dits communs (nod A, nod B, et nod C) car, ils sont rencontrés chez toutes les espèces de

Rhizobium, et des gènes spécifiques à une espèce de Rhizobium. L’expression des gènes

structuraux conduit à la production de signaux bactériens constitués de lipo-

oligosaccharides ; ce sont les facteurs de nodulation ou facteur Nod (Duhoux et Nicol,

2004).

Les gènes nod de la bactérie interférent avec des gènes nod de la plante qui, eux,

contrôlent la production de nodulines, protéiques intervenant dans la prolifération des

cellules racinaires et la formation des nodules (Tourte et al., 2005)

II.1.Caractéristiques de la relation symbiotique

La symbiose se caractérise par la présence d’organes particuliers, situés au niveau

de la racine appelés nodosités. Au sein desquels la bactérie réduit l’azote atmosphérique en

Nitrogénase


5

ammoniac assimilable par la plante, en contrepartie, la plante fournit à son symbiote une

niche écologique et les substrats carbonés issus de la photosynthèse, nécessaire à son

métabolisme (Debellé et al., 2007).

II.2. Intérêt de la symbiose

Grâce à cette association symbiotique, les légumineuses participent à la

végétalisation des écosystèmes pauvres en azote, en s’établissant comme flore pionnière,

initiatrice d’une succession écologique. Elles constituent par ailleurs une source

d’alimentation extrêmement importante aussi bien pour l’homme (soja, pois, haricot…)

que pour l’animal (trèfle, luzerne…) (Giraud, 2007).

III. La nodulation

Le processus de nodulation pour presque toutes les légumineuses étudiées est initié

par la production de légumineuses d’un mélange de composés, principalement des

flavonoïdes, qui induisent la synthèse de la protéine NodD dans les rhizobia. Différentes

légumineuses produisent différents types de mélanges de composés (Andrews et Morąg,

2017).

III.1. Les étapes de la nodulation

La nodulation se déroule en trois étapes principales d’après (Giraud, 2007).

- Déformation des poils absorbants de la racine permettant d’englober la bactérie située à

proximité.

- Formation d’un cordon d’infection conduisant la bactérie jusqu’à un primordium

nodulaire ;

- Libération des bactéries par endocytose dans des cellules du primordium nodulaire, et au

sein duquel, les bactéries se différencient en bactéroïdes capables de convertir le N2 en

NH3.

III.2. Les facteurs NOD

Les facteurs Nod sont constitués d'un squelette de 3 à 6 résidus N-acétyl-D

glucosamine, substitué par une chaîne d'acyl au niveau de l'extrémité non réductrice et

portant diverses décorations aux deux extrémités de la chaîne oligo-saccharidique. La

nature de l'acide gras et des autres substitutions varie selon la souche ou l'espèce de


6

rhizobia et joue un rôle déterminant dans la spécificité d'hôte de la bactérie (De Lajudie et

al., 2003).

La protéine NodD active la transcription des gènes impliqués dans le processus

de nodulation, y compris ceux requis pour produire les facteurs Nod, les molécules de

signal produites par les rhizobia et détectées par la plante, qui induisent l’organogenèse des

nodules (Andrews et Morag, 2017).

III.3. Les flavonoïdes

L'établissement et le fonctionnement de la symbiose rizhobia-légumineuses est le

résultat d'une interaction moléculaire entre la plante et la bactérie, contrôlée au niveau

génétique par chacun des deux partenaires. Les plantes sécrètent des flavonoïdes qui,

lorsqu'ils sont reconnus par le rhizobium, déclenchent la biosynthèse bactérienne de

molécules lipo-oligosaccharidiques appelées facteurs Nod. Ceux-ci induisent chez la plante

la formation d'un organe spécialisé, le nodule, à l'intérieur duquel la bactérie se différencie

en bactéroïde capable de fixer l'azote atmosphérique (De Lajudie et al., 2003).

Les flavonoïdes sont des métabolites de phénylpropanoïdes exsudés à partir de

racines de plantes, souvent en réponse à des éliciteurs générés par des microorganismes

présents dans la rhizosphère. Ces molécules sont des composés antimicrobiens qui

inhibent la croissance des agents pathogènes bactériens et fongiques. Cependant, dans

les rhizobia, les flavonoïdes agissent comme des promoteurs de croissance bactérienne,

des chimio-attracteurs, des inducteurs de gènes de nodulation, des déterminants de la

spécificité de l'hôte et des régulateurs de la résistance aux phytoaléxines. Rhizobia

établit des associations symbiotiques avec des légumineuses, évolue des événements de

réglage fin qui aboutissent à la formation de nodules et à la fixation de l'azote

atmosphérique (N2) en ammoniac (Del Cerro et al., 2017).

IV. Les Bactéries Nodulant les Légumineuses (BNL ou rhizobia)

Les BNL sont des bactéries du sol qui peuvent s'engager dans une symbiose avec

des légumineuses qui produisent des nodules de racine fixant l'azote (Herman Spaink,

2000). La plupart des rhizobia appartiennent à la classe α, β et des protébactéries

(Amadou et al ., 2008).


7

La majorité des espèces de rhizobia synthétisent le PHB, mais pas toutes les espèces

l'accumulent pendant la symbiose avec les légumineuses (Trainer et Chareles, 2006).

IV.1.Taxonomie des rhizobia

Les premières classifications du rhizobia étaient basées sur des tests d'inoculation

croisée entre rhizobia et leurs plantes hôtes. Pour lesquelles des espèces ont été classées en

deux groupes : les bactéries à croissance rapide et les bactéries à croissance lente (Elkan,

1992). Cette classification des rhizobia est en fonction de leur temps de génération et de

leur taux de croissance sur le milieu de culture, cependant il avait beaucoup de doute sur la

validité de cette classification. L’apport des méthodes comparatives telles que la sérologie,

le coefficient de chargaff, l'ARN/ADN ou Hybridation ADN/ADN, analyse des plasmides,

a marqué le début d'une nouvelle étude de taxonomie basée sur les résultats de différentes

analyses phénotypiques et biochimiques pour l'identification des bactéries symbiotiques.

Depuis lors, l'isolement des rhizobia et leur caractérisation par la taxonomie polyphasique

moderne a conduit à la description d'autres nouveaux genres et espèces. Sur la base de la

séquence d'ADN ribosomique 16S, les symbiotes des légumineuses décrites actuellement

appartiennent à trois principales sous-classes phylogénétiques distinctes: α, β et γ-

Proteobacteria. Plus de 98 espèces regroupées dans 11 genres appartenant à la sous-classe

α- Proteobactéries et 2 genres appartenant à l'ordre de Burkholderiales dans la sous-classe

β- Proteobactéries, et enfin, un genre appartenant à l'ordre Pseudomonales dans la sous-

classe γ-Proteobacteria (Berrada et Fikri-Benbrahim, 2014).

IV.2. Le genre Bradyrhizobium

Ce genre a été défini pour inclure tous les rhizobia à croissance lente, avec un

temps de génération situé entre 10-12h. Ce sont des petits bacilles avec un seul flagelle

polaire ou subpolaire. Leurs colonies ne dépassent pas 1 mm de diamètre en milieu YMA.

Ces bactéries symbiotiques utilisent de nombreux sucres et acides organiques mais

préfèrent les pentoses, avec production de mucus polysaccharidique. Cette branche a

inclus, depuis longtemps, une seule espèce: Bradyrhizobium japonicum qui regroupe toutes

les souches qui nodulent le soja (Glycine max), Très hétérogène, c'était alors divisé en trois

groupes (I, Ia et II), basé sur des homologies obtenues par hybridation ADN/ADN, une

nouvelle espèce: Bradyrhizobium elkanii a été créé dans le Groupe II, qui diffère de


8

l'espèce Bradyrhizobium japonicum par une croissance très lente (Berrada et Fikri-

Benbrahim, 2014).

Ce genre est considéré comme l'épine dorsale de la taxonomie des procaryotes, est

le plus difficile en terme de taxonomie des rhizobia, en raison de sa forte séquence de gène

de l'ARNr 16S conservée et il est considéré comme l’ancêtre de tous les rhizobia (Azevedo

et al., 2015).

Tableau I : Classification récente de Bradyrhizobium (Berrada et Fikri-Benbrahim, 2014).

Espèces Plante hôte Références

Classe : AlphaproteobacteriaOrdre : RhizobialesFamille : BradyrhizobiaceaeGenre: Bradyrhizobium

B. japonicum Glycine max, Glycine soja Jordan, 1980B. elkanii Glycine max KuyKendall et al., 1992B. liaoningensese Glycine max Xu LM, 1995B. yuanmingense Lespedeza Yao et al., 2002B. betae Betae vulgaris Rivas, 2004B. canariense Genisteae et Loteae Vinuesa, 2005

B. denitrificans Aeschynomene Van Berkum, 2006

B. iriomotense Entadakoshunensis Islam, 2008

B. lablabi Lablab purpureus Islam, 2008

B. jicamae Pachyrhizuserosus Ramirez-Bahana, 2009B. pachyrhizi Pachyrhizuserosus Ramirez-Bahana, 2009B. cytisi Cytisusvillosus Chahbourne, 2011B. huanghuaihaiense Glycine max Zhang, 2012B. daqingense Glycine max Wang, 2013B. oligotrophicum Ramirez-Bahana, 2013

V. Les légumineuses

V.1. Généralités

Les légumineuses ou Fabacea, représentent une famille importante et variée pour

les angiospermes. En effet, il s'agit de la troisième plus grande famille de plantes

supérieures après les Orchidaceae et les Asteraceae (Bourdja et al., 2015). Elles sont des


9

composants de la plupart des types de végétation du monde. Avec 19.300 espèces et 750

genres qui se produisent comme des herbes, des arbustes, des vignes ou des arbres dans des

habitats principalement terrestres (Andrews et Morąg ,2017).

V.2. Classification des légumineuses

En se basant sur la forme florale (différences florales), la famille des légumineuses est

divisée en trois sous-familles : les Caesalpinioideae, Mimosoideae et Papilionoideae.

V.2.1. Caesalpinoideae

Elle est la deuxième plus grande des trois sous-familles des légumineuses,

comprenant environ 170 genres et 2250-3000 espèces. Les Caesalpinioideae sont

particulièrement abondantes en Amérique du Sud, l'Afrique tropicale et l'Asie du Sud-Est

(Estrella et al., 2006).

La majorité des Caesalpinioideae sont des arbres et des arbustes tropicaux ou

subtropicaux. Les fleurs des Caesalpinioideae sont irrégulières (zygomorphes) avec cinq

pétales qui ne sont pas différenciés en standard, les ailes et la quille. Les étamines sont

visibles à l'extérieur (Judd et al., 2001).

V.2.2. Mimosoideae

Les plantes de la sous-famille Mimosoideae, avec environ 80 genres et quelques

3000 espèces sont principalement tropicales à subtropicales, elles sont abondantes dans les

régions arides et semi-arides du monde entier (Lavinet et al., 2005).

Les Césalpiniacées et les Mimosacées, deux sous-familles dont la plupart des

représentants poussent dans les régions chaudes du globe. On citera par exemple le mimosa

avec ses fleurs en pompons comme exemple de Mimosacée et l'arbre de Judée comme

exemple de Césalpinacée (Florin, 2007).

V.2.3. Papilionoideae

Les Papilionacées (aujourd'hui renommées Faboideae d'après le nom de genre

Faba, la fève) qui est la seule famille représentée en région tempérée. Comprenant environ

12 000 espèces et 440 genres (Oliveira et Paiva, 2005).


10

Il y a lieu de signaler qu’une nouvelle classification des légumineuses a été

proposée avec six sous-familles basées sur les séquences de gènes matK du plastide à partir

de 20% de toutes les espèces de légumineuses à travers 90% de tous les genres

actuellement reconnus. Les six sous-familles proposées sont Caesalpinioideae réarrangés,

Cercidoideae, Detarioideae, Dialioideae, Duparquetioideae et Papilionoideae (Andrews

et Morąg, 2017).

VI. Importance des légumineuses

VI.1.Importance agronomique et environnemental

L’intérêt des légumineuses provient en premier lieu de leur aptitude à la fixation

symbiotique de l'azote. Les légumineuses ont la particularité de pouvoir être cultivées sans

utilisation des engrais azoté, et être une source d’azote au niveau du système de culture,

grâce à leur capacité de s’associer avec des bactéries du sol fixant l’azote atmosphérique.

Cette propriété leur confère un rôle particulier dans la gestion des flux d’azote au sein des

systèmes de culture (Voisin et al., 2015). Leur utilisation en rotation ou en association

dans les systèmes de culture, leur permettent de contribuer à la fertilisation azotée en fixant

et en intégrant une partie de l’azote atmosphérique dans le système (Babo, 2002).

VI.2. Importance alimentaire

Les légumineuses constituent un taux élevé de protéines dans leur feuille et dans

leurs graines (Pointereau, 2001), elles peuvent être broyées et incorporées dans la farine

pour la préparation du pain, les beignets, les tortillas, les bonbons de soja (Graham et

Vance, 2003).

VI.3. Importance industrielle

Les légumineuses ont été utilisées dans l’industrie pour préparer les plastiques

biodégradables, les huiles (fournissent plus de 35% d’huile végétal transformée du monde),

sont aussi utilisées pour la fabrication des encres, les gommes, ainsi que les colorants et

dans le dimensionnement des textiles et du papier. Dans plusieurs villes les véhicules sont

alimentés par les carburants biodiésels de soja (Graham et Vance, 2003).


11

VII. Généralités sur le genre Genista

Le genre Genista est le plus riche en espèces au sein de la tribu de Genisteae, il est

connu dans la plupart des pays du Bassin Méditerranéen et surtout dans sa partie

occidentale ou l’on rencontre environ la moitié de ses représentants. Ce genre est l’un des

plus importants dans la région méditerranéenne sur le plan écologique et biogéographique

avec une centaine d’espèces, et plus de cinquante sous-espèces, représenté essentiellement

par des ligneux, il contribue beaucoup à la diversité et à la richesse des écosystèmes

forestiers de cette région (Azzoui et al., 2000).

Les espèces de ce genre appartiennent à la famille des Papilionoideae (Hakki et

al ., 2010) et la plupart d’entre eux prospèrent des sols secs (Geraldes et al., 2014).

VIII. Description de la légumineuse impliquée dans ce travail : Spartium junceum L.

Spartium junceum L., appelé également faux-genêt d’Espagne ou genêt

d’Espagne, est un petit arbuste de la famille des légumineuses ; une espèce indigène,

pionnière utilisée pour la récupération des écosystèmes perturbés, pour fixer les pentes

érodées et instables, et dans les stratégies de restauration (Quatrini et al., 2002). C’est la

seul espèce dans le genre Spartium (Katovic`et al., 2011). Elle s’adapte aux concentrations

élevées en sel dans le sol et elle pousse dans des conditions extrêmes du désert (Bezic et

al., 2003).

Spartium junceum L. est un arbrisseau de 1 à 3 m de haut non épineux, dressé, à

ramilles effilées, cylindriques, jonciformes, compressibles, finement striées, glabres, vert

glauque, peu feuillées. Affectionne les terrains calcaires, mais pousse en tout sol. Il a des

feuilles simples, oblongues-lancéolées, entières, glabres en dessus, poils appliqués en

dessous, et des fleurs jaunes, grandes, odorantes, en grappes terminales. Calice scarieux,

glabre, fendu jusqu'à la base en une seule lèvre coupée obliquement et terminée par 5

petites dents. Etendard grand, orbiculaire, redressé. Carène en bec acuminé. Etamines

monadelphes. Style courbé au sommet, il a des fruits sous forme de gousses de 6 à 8 cm

sur 7 mm linéaire, presque glabre, noire à la maturité (Jullien, 2016).


12

http://www.correzitude.fr/NATURABRIVA/7-MATORRAL/Spartium-junceum.html

Figure 1 : La plante de Spartium junceum L. et ses différentes parties

(a : fleure, b : gousses, c : plante entière)

IX. Intérêt de Spartium junceum L.

IX.1. Intérêt industriel

Les huiles et les fibres de Spartium junceum L. peuvent jouer un rôle important

dans certaines applications industrielles. Elles pourraient être utilisées avec succès pour la

fabrication de savon, shampoing pour cheveux et la résine alkyde (Cerchiara et al., 2010).

IX.2. Intérêt pharmaceutique

Le genêt d’Espagne est exploitable en tant que plante médicinale à cause de son

contenu d’alcaloïdes (spartéines) qui sont isolés de la tige de cet arbuste, il est montré

qu’ils ont un effet analeptique sur le système vasculaire (Bezic et al., 2003).

Il présente une certaine toxicité sur toute la plante, mais surtout les fleurs et les

graines contiennent de la cytisine alcaloïde quinolizidinique toxique, pouvant provoquer

une altération de l’état général avec des symptômes digestifs (nausées, vomissements,

diarrhée) et même des symptômes neurologiques (convulsions) (Hameg, 2015).

aa b

Jullien J, 2016


13

X. Les Facteurs limitant la symbiose rhizobia-légumineuse

Généralement, les souches tropicales de rhizobia possèdent des propriétés

physiologiques leur permettant de se développer dans les milieux arides et semi-arides. Les

principaux facteurs limitant l'activité biologique dans les sols sont le déficit hydrique, la

salinité, les températures élevées, les pH extrêmes et les carences en éléments

nutritionnels. Ces stress peuvent interférer avec les processus d'infection ou de nodulation,

ou encore influencer l'activité fixatrice d'azote après établissement de la symbiose (De

Lajudie et al., 2003).

X.1. Effet de la température

La température affecte directement la symbiose rhizobia-légumineuse en limitant la

croissance du micro-symbiote et/ou indirectement, en régulant la croissance de la macro-

symbiote, même avant l’établissement du nodule. La température de la zone racinaire

influence la survie des rhizobia dans le sol ainsi que les échanges de signaux moléculaires

entre les partenaires symbiotiques, la température à un effet inhibiteur sur l’adhérence des

bactéries aux poils absorbants, la formation des poils racinaires et du fil d’infection

(Dudeja et Suneja, 2014).

La température optimale pour la croissance des rhizobia varie selon la zone climatique où

ils sont isolés (Cacciari et al., 2003).

X.2. Effet de la salinité

La salinité des sols et des eaux d’irrigation demeure dans les écosystèmes arides et

semi arides, un obstacle majeur au développement et à la croissance des végétaux. Cette

contrainte sur la symbiose légumineuses-rhizobia se manifeste par un effet osmotique et

/ou ionique inhibant les différents processus physiologiques et biochimiques gouvernant la

croissance de la plante hôte, la survie et la prolifération des rhizobia et par la suite

l’inhibition des processus d’infection et de la fixation biologique de l’azote. La capacité

des plantes à prévenir et réparer les dommages engendrés sous conditions salines est

associée à différents changements physiologiques et biochimiques incluant la séquestration

du sodium dans les vacuoles, le maintien d’un haut ratio cytosolique K+/Na+,

l'accumulation d’osmoprotecteurs, et l’induction d’une réponse anti-oxydante et des

phytohormones (Farissi et al., 2014).


14

XI. La résistance des rhizobia aux antibiotiques

Une résistance intrinsèque aux antibiotiques peut donc être importante, du point de

vue écologique, pour les micro-organismes du sol, en raison d'une compétitivité plus

élevée et d'une plus grande aptitude à survivre, principalement dans les sites arides où la

sécheresse et le pH alcalin favorisent la croissance d'actinomycètes producteurs

d'antibiotiques.

Plusieurs études ont indiqué que les isolats provenant des sites tunisiens sont, globalement,

tolérants à tous les antibiotiques, bien qu'à différents degrés. Par contre, les isolats

provenant des sites sénégalais ne présentent que de faibles niveaux de résistance (Cacciari

et al ., 2003).

MATERIEL

ET

METHODES

Chapitre II: Matériel et méthodes

15

1. MATERIEL

1.1. Récolte des échantillons

Les échantillons de sol et des nodules sont récoltés au niveau du site de Tizi Adjissa

(Latitude Nord : 36°36ʼ32.21ʼʼ ; Longitude Est : 4°49ʼ38.92ʼʼ 77’’ et à une altitude moyenne

de 416m), situé sur la commune de Smaoun de la wilaya de Bejaia.

Le sol a été transporté dans des sachets en plastique et les nodules ont été conservés dans

des tubes contenants du CaCl2 (qui absorbe l’humidité) surmonté de coton, par contre les

graines de Spartium junceum L. sont disponibles dans le laboratoire (Figure 2)

Le sol a été étalé sur la paillasse, laissé sécher à l’air libre pendant quelques jours, puis tamisé

à travers un tamis de 2mm de diamètre. La terre fine obtenue a subi plusieurs analyses

physico-chimiques dans le but de définir ces caractéristiques pédologiques.

Figure 2 : Les différents échantillons utilisés dans l’étude(A : Nodules, B : Gousses, C : Graines, D : Sol).

1.2. Souches de référence

Deux souches de référence du genre Bradyrhizobium ont été utilisées. Il s’agir de :

Bradyrhizobium jabonicum (USDA6) et Bradyrhizobium elkanii (USDA76). Elles sont

utilisées pour la comparaison des résultats obtenus par nos isolats à ceux obtenus par les

souches de référence.

2-METHODES

2.1. Analyses physico-chimiques du sol

Ces analyses sont portées essentiellement sur la texture, carbone, pH, azote total, et le

calcaire total. Toutes ces analyses sont effectuées sur la terre fine (ø = 2mm).

A B C D


16

2.1.1. Texture

La granulométrie classe les éléments minéraux, d’après leur grosseur et détermine le

pourcentage de chaque fraction, elle contribue à définir la texture du sol. On distingue dans un

premier temps les éléments grossiers de diamètre supérieur à 2mm, de la terre fine de

diamètre inférieur à 2mm.

Cette méthode est basée sur la destruction totale de la matière organique de sol par l’eau

oxygéné et dispersion du complexe argilo-humique par le pyrophosphate de sodium, les

particules les plus fines (argiles et limons fins) sont prélevées au cours de leur sédimentation

par la pipette de Robinson. Les sables et les limons grossiers sont récupérés après élimination

des fractions fines par siphonage.

Les contenus des prélèvements seront versés dans des capsules en porcelaine et séchés à

l’étuve 105°C. La texture de notre sol a été déterminée par le triangle de texture U.S.D.A.

2.1.2. Carbone organique

Le dosage de la matière organique du sol a été effectué par la méthode ANNE

modifiée.

Le carbone de la matière organique est oxydé à chaud en CO2 par un mélange de bichromate

de potassium et d’acide sulfurique concentré. Le bichromate est en excès, on titre cet excès à

froid par une solution réductrice de sel de Mohr de titre connu.

2.1.3. pH

L’acidité du sol a été déterminée à l’aide d’un pH-mètre à électrode de verre

préalablement étalonné à l’aide des solutions tampons de pH connu. La réaction du sol est

déterminée sur une suspension aqueuse dans laquelle le rapport sol/eau=1/2,5.

L’échantillon de sol a été mis en suspension dans un bécher (20g pour 50ml d’eau distillé). Ce

mélange est agité pendant une heure puis laissé en repos quelques minutes avant la première

lecture qui correspond à l’acidité actuelle (pHeau). Ensuite une deuxième lecture a été

effectuée après l’ajout de 3.72g de KCl qui correspond à l’acidité potentielle (pH KCl).

2.1.4. Dosage de l’azote total

L’azote total du sol est dosé par la méthode de Kjeldahl. L’échantillon de sol est

minéralisé, à chaud en milieu acide sulfurique en présence d’un mélange catalyseur

renfermant du sélénium. Dans ces conditions de minéralisation, l’azote organique se retrouve

sous forme de sulfate d’ammonium. Celui-ci est neutralisé par NaOH (40%), puis distillé dans


17

un appareil de distillation (VELP, UDK 142). L’ammoniac entraîné par la vapeur d’eau est

fixé par l’acide borique (4%) et titré à l’aide d’une solution d’acide sulfurique de titre connu

(N/50) et en présence de l’indicateur de Tashiro.

2.1.5. Dosage du calcaire total

La calcimétrie est une méthode d’analyse permettant de transformer facilement le

carbone inorganique total (CIT), essentiellement constitué de carbonates et de bicarbonates,

par attaque acide, en dioxyde de carbone (CO2), selon la réaction:

CaCO3 + 2 HCl CO2+H2O+CaCl2

Le calcaire total du sol est déterminé au moyen du calcimètre de Bernard, préalablement

étalonné avec des quantités connues de CaCO3. Le volume de CO2 dégagé est proportionnel à

la quantité de carbonate présent dans le sol. La teneur en carbonates, exprimée en %, est

donnée par la formule suivante :

P x vCaCO3 (%) = x 100

p xVAvec :

P : poids de CaCO3 utilisé pour l'étalonnagep : poids de la prise d'essai de solV : volume de CO2 dégagé par le poids d'échantillon de solv : volume de CO2 dégagé par le poids de CaCO3.

2.1.6. Mesure de la conductivité électrique (CE)

La conductivité électrique (CE) d’un sol renseigne sur sa teneur globale en sels dissous

sur un extrait aqueux dont le rapport sol/eau égal à 1/5.

L’échantillon de sol a été mis en suspension dans un bécher (20g pour 100ml d’eau distillée),

puis agité pendant une heure, ensuite laissé 30min au repos. Le mélange obtenu a été

centrifugé pendant 10 min à 3000 tours/min. A partir du surnageant obtenu (extrait de sol), la

CE a été mesurée à l’aide d’un conductimètre, après calibrage de l’électrode à une

température de 25°C.

3. Isolement des bactéries à partir des nodules de Spartium junceum L.

3.1. Stérilisation des nodules

L’isolement des BNL a été réalisé selon la méthode de Vincent (1970).

Au laboratoire, les nodules de Spartium junceum L. sont lavés à l’eau courante, puis

réhydratés avec de l'eau distillée stérile (pendant une demi-heure) dans des boites de Pétri


18

(figure 3). Après avoir éliminé l'eau, ils sont stérilisés par immersion dans de l’éthanol

95℅ pendant 30 secondes puis transférés dans de l’eau de javel 5° pendant 3min. Ensuite, ils

sont rincés abondamment à l’eau distillée stérile.

Figure 3: Nodules utilisés

3.2. Ecrasement des nodules

Les nodules désinfectées sont écrasés dans des tubes eppendorf stériles (contenant

0.5ml d’eau distillée stérile). A l'aide d'une tige stérile en plastique afin d’obtenir le broyat

nodulaire qui sert à l’ensemencement du milieu YMA.

3.3. Ensemencement sur milieu YMA

Une goutte du broyat nodulaire obtenu est étalée à l'aide d'une öse sur milieu YMA

renfermant du rouge Congo (0.025%) en boîte de Pétri, selon la technique des stries serrées.

Les boites ainsi ensemencées, sont scellées avec du Parafilm et incubées à 28°C pendant une

semaine à 15 jours.

3.4. Purification

La purification des colonies a été réalisée par des repiquages successifs sur d'autres

boîtes de Pétri contenant le même milieu YMA de façon à avoir, au bout d’une semaine à 15

jours d’incubation à 28°C, des colonies bien isolées.

3.5. Conservation des isolats purifiés

Les colonies purifiées sont conservés dans des tubes contenant le milieu YMA incliné

additionné de 3g/l de CaCO3 comme agent neutralisant de l’acidité, puis conservés à 4°C pour

une utilisation ultérieure.


19

3.6. Test d’authentification (test de nodulation)

Dans le but d’évaluer l’aptitude des souches isolées à induire de nouveau la formation

des nodules chez leur plante hôte Spartium junceum L. dans des conditions

bactériologiquement contrôlées, nous avons suivi les étapes préconisées par (Vincent, 1970).

3.6.1. Préparation des plantules axéniques

3.6.1.1.. Stérilisation des graines

Des graines de la plante Spartium junceum L., sont stérilisées à l’éthanol 95 % pendant

30 secondes puis par une solution d’acide sulfurique concentré pendant 30mn. Les graines

sont ensuite rincées abondamment à l’eau distillée stérile. Au dernier rinçage, les graines sont

laissées gonfler pendant 3 heures, afin d’éliminer celles en mauvais état. Les semences qui

flottent ont été écartées, seules jugées saines sont mises à germer dans des boites de Pétri.

3.6.1.2. Mise en germination des graines

La germination des graines a été réalisée dans des boites de Pétri en verre stériles

contenant du papier filtre humidifié avec de l’eau distillée stérile. Les boites sont enveloppées

avec du papier aluminium et incubées à 25°C à l’obscurité jusqu'à apparition des radicelles

(Figure 4).

Figure 4 : Mise en germination des graines de Spartium junceum L.

3.6.1.3. Culture des plantules

Après germination des graines et apparition des radicelles, les plantules sont

transférées stérilement dans des tubes contenant le milieu Fahraeus (dont la composition

figure en Annexe I), de sorte que la radicelle immerge dans ce milieu, et on couvre la partie


20

inférieure de tube avec du papier aluminium afin de leur assurer l’obscurité nécessaire

(Figure5).

3.6.1.4. Inoculation des plantules

L’inoculation des plantules à été réalisée par l’injection de 1 ml d’une suspension

bactérienne de chaque souche obtenue sur milieu YMA, après l’ajout de 2ml d’eau

physiologique stérile dans chaque tube YMA incliné et agitation.

Les plantes cultivées en tubes ont été placées dans des conditions ambiantes du laboratoire et

sous un éclairement supplémentaire fourni par le rayonnement de 2 lampes de 75w et une

lampe de néon de 85 w. Les plantules sont examinées chaque semaine afin de suivre

l’apparition des nodules sur leur système racinaire, visible grâce à la transparence du milieu

Fahraeus.

Figure 5: Dispositifs utilisés dans le test de nodulation

4. Identification des bactéries associées aux nodules de Spartium junceum L.

Les souches bactériennes authentifiées par le test de nodulation ont été caractérisées par

une approche phénotypique, basée sur une caractérisation morphologique, biochimique et

physiologique.


21

4.1. Caractérisation morphologique

4.1.1. Caractères cellulaires

L’observation microscopique à l’état frais d’une suspension bactérienne cultivée sur milieu

YMB après une semaine d’incubation à 28°C, nous a permis de déterminer la mobilité, la

forme et la présence des polyhydroxybutyrates (PHB).

4.1.2. Coloration de GRAM

La coloration de Gram a été effectuée à partir des suspensions bactériennes incubées

pendant 7 jours à 28°C sur milieu YMB, selon la méthode classique.

Après la réalisation d’un frottis sur une lame à la chaleur, le frottis a été recouvert par le violet

de gentiane (1 min), suivi d’un mordançage au lugol (20 sec) ; une décoloration à l'alcool (20

sec); et une recoloration à la fuchsine (1 min). Enfin l'observation du frottis au microscope

(grossissement x 100) a permis de différencier entre les bactéries Gram + et Gram-. Les bactéries

Gram- sont colorées en rose, et les bactéries Gram+ sont colorées en violet.

4.1.3. Caractères des colonies bactériennes

Après une semaine d’incubation à 28°C sur des boites de Pétri contenant le milieu

YMA, les colonies bactériennes obtenues sont étudiées selon la forme, l’aspect de la surface,

la couleur, la translucidité, la mucoidité, le diamètre et l’élévation.

4.2. Caractérisation biochimiques

Il consiste à mettre en évidence la capacité des isolats à alcaliniser ou a acidifier le

milieu YMA additionné du bleu de Bromothymol, ainsi que la présence ou l’absence de

certaines enzymes impliquées dans le métabolisme bactérien à savoir : les nitrates et nitrites

réductases, citrate perméases, la catalase, l’oxydase et la β-galactosidase (par le test ONPG).

4.2.1. Test de bleu de bromothymol (BTB)

Nos souches ont été évaluées selon leur capacité à acidifier ou à alcaliniser le milieu

milieu YMA additionné de bleu de bromothymol. L’aptitude à modifier le pH du milieu

distingue les bactéries à croissance rapide (genres Rhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium)

de celles à croissance lente (genre Bradyrhizobium).


22

Des boites de Pétri double compartiment contenant le milieu YMA additionné de bleu

de bromothymol, comme un indicateur coloré de pH a une concentration de 0.25% (w /v),

sont ensemencées par nos isolats et incubées à 28°C pendant 7 jours.

L’acidification se traduite par le virage du milieu au jaune (caractéristique des bactéries à

croissance rapide) ; alors que l’alcalinisation du milieu se traduite par le virage du milieu au

bleu foncé (caractéristique des bactéries à croissance lente).

4.2.2. Recherche de la β-galactosidase

La mise en évidence de la β-galactosidase est effectuée par les disques ONPG.

Des disques d’ONPG sont introduits dans des tubes à essai contenant 1ml d’eau

physiologique stérile et quelques gouttes d’une suspension bactérienne dense obtenue sur

milieu YMB. Les tubes sont incubées au bain marie à 28°C pendant 7 jours. L’apparition

d’une coloration jaune dans le milieu indique une réaction positive (présence d’une β-

galactosidase).

4.2.3. Recherche de la catalase

Des colonies bactériennes des souches isolées sur milieu YMA sont prélevées et mises

dans des lames additionnées d’une goutte d’eau oxygénée à 10 volumes. La présence de la

catalase se traduit par un dégagement immédiat des petites bulles gazeuses.

4.2.3. Recherche de l’oxydase

Ce test consiste à mettre en évidence la capacité que possède la bactérie à oxyder un réactif

incolore par une enzyme la phénylène diamine oxydase.

A l’aide d’une pince flambée on dépose un disque d’oxydase sur une lame, ensuite on prélève

une colonie à partir du milieu YMA et on la dépose sur le disque d’oxydase en utilisant une

pipette Pasteure stérile. Une réaction oxydase positive se traduit par l’apparition d’une tache

rose violette, si le disque reste incolore c’est une réaction oxydase négative.

4.2.4. Recherche de la citrate perméase

Ce test est effectué sur milieu Citrate de Simmons incliné. La pente du milieu est

ensemencée par stries à partir d’une culture prélevée sur milieu YMA et incubée à 28°C

pendant 7 jours. La coloration du milieu au bleu foncé indique l’alcalinisation du milieu,

indiquant que les bactéries possèdent une citrate perméase et sont donc capables d’utiliser le

citrate comme source de carbone et d’énergie.


23

4.2.5. Réduction des nitrates

Des tubes contenants 10ml de bouillon nitraté ont été ensemencés par des colonies

bactériennes et incubés à 28°C pendant 7 jours. La mise en évidence de la réduction des

nitrates se faite par l’addition de 5gouttes de réactif NR1 (Acide Sulfanilique dans l’acide

acétique 5M) et 5 gouttes de réactif NR2 (α-naphtylamine dans l’acide acétique 5M).

La coloration rose ou rouge du milieu se traduit par une réaction positive (NR+) mais si le

milieu reste incolore, on ajoute un peu de poudre de zinc. Si le milieu devient rose ou rouge

ce résultat indique l’absence d’une nitrate réductase (NR-), et si le milieu reste toujours

incolore, il indique la présence d’une nitrate et d’une nitrite réductase (NR+).

4.2.6. Production d’indole

Des tubes contenants 10 ml d’eau peptonée exempt d’indole sont ensemencés par une

suspension bactérienne obtenue sur milieu YMB et incubés à 28°C pendant 7 jours. Après

l’addition de quelques gouttes de réactif de Kovacs, la présence d’indole se traduit par la

formation d’un anneau rouge vermillon à la surface du milieu, alors que l’absence d’indole se

traduit par la formation d’un anneau jaunâtre (teinte original de réactif).

4.2.7. Utilisation du lactose, du glucose et production d’H2S

Des tubes contenant le milieu spécifique de Kligler- Hajna (KIA), sont ensemencés par

piqure centrale dans le culot et par stries sur la pente par une culture bactérienne, puis incubés

à 28°C Pendant 7 jours. Quatre caractères ont été mis en évidence :

- culot jaune indique la fermentation du glucose,

- pente virant vers le jaune indique l’utilisation du lactose par la bactérie,

- noircissement de la zone joignant la pente et le culot indique la production d’H2S,

- Décollage du culot vers le haut du tube et /ou l’apparition des bulles indique la production

du gaz.

4.2.8. Recherche de la formation d’acétoine et la production d’acide

Des tubes contenant le milieu Clark et Lubs sont ensemencés à partir des cultures

bactériennes sur milieu YMB. Après une incubation de 7 jours à 28°C, des réactifs VP1 et

VP2 ont été ajouté à 1ml de ce milieu à raison de 0.5ml de chaque réactif, ensuite on laisse la

réaction agir pendant 10 à 15min avant la lecture. Dans le cas où la souche testée produit de

l’acetoine à partir du glucose, le milieu devient rouge cerise (VP+), mais si elle ne produit pas

de l’acetoine et elle suit un métabolisme hétéro fermentaire, le milieu reste de coulure jaune.


24

Dans un autre tube à hémolyse on met 2ml de milieu Clark et Lubs on ajoute une à deux

gouttes de rouge de méthyle 0.5℅. Si la souche fermente le glucose et produit de l’acide

(formique et acétique), le milieu devient rouge (RM+), et si le milieu reste jaune (RM-) donc

la souche ne produit pas de l’acide.

4.2.9. Recherche des décarboxylases : LDC, ODC, ADH.

A partir des ampoules stériles contenant les milieux LDC, ODC, ADH, 1ml de chaque

ampoule est prélevé dans des tubes ependoff stériles qui sont ensuite ensemencés par 0.2ml

des suspensions bactériennes sur milieu YMB. Les tubes sont incubés à 28°C pendant 7 jours.

Une réaction positive se traduit par le jaunissement du milieu.

4.2.10. Assimilation des sucres

L’utilisation des différents substrats carbonés par nos souches a été testé dans des

boites de Pétri contenant le milieu YMA dépourvu de mannitol. Le mannitol a été remplacé à

chaque fois par l’un des sucres suivants : Maltose, Mannose, Lactose, Lévulose, Cellobiose,

Glycérol, Arabinose Tréhalose, Raffinose, Galactose et Rhamnose.

Les boites sont subdivisées en carrés et chaque carré a été ensemencé en spot à partir des

colonies prélevées sur milieu YMA. Les boites sont incubées à 28°C pendant 7 jours et

l’assimilation des sucres par les souches testées se traduit par une croissance bactérienne,

matérialisée par la présence des colonies bactériennes visibles.

4.2.11. La Galerie biochimique API 20NE

La galerie API 20NE est un système standardisé pour l’identification des bacilles à

Gram négatif non entérobactéries et non fastidieux Elle contient 20 tests à la fois :8 tests

conventionnels et 12 tests d'assimilation, et une base de données.

L’ensemencement de ces tests a été effectué selon les recommandations du fournisseur

indiquées sur la notice.

- Les tests : NO3, TRP, GLU, ADH, URE, ESC, GEL, PNPG, sont ensemencés par une

suspension bactérienne préparée par prélèvement de 1 à 2 colonies à partir de milieu

YMA dans 2ml de NaCl 0.85℅, l’ensemencement par remplissage des tubes sans les

cupules.

- Le reste des tests sont ensemencés par une suspension composée de l’addition de 200µl

de la première suspension à une ampoule de 7 ml de la solution Moller, on remplit les

tubes et les cupules.


25

- Pour les tests (GLU, ADH, URE), on ajoute quelques gouttes d’huile de vaseline stérile.

Les galeries ainsi préparées sont incubées à l’étuve à 28°C pendant 7 jours.

5. Caractérisation physiologique

Les caractères physiologiques étudiés dans ce travail sont : l’effet de pH, effet de la

température et l’effet de NaCl sur la croissance des isolats de Spartium junceum L.ainsi que la

sensibilité des bactéries aux antibiotiques

5.1. Effet du pH

L’effet du pH du milieu sur la croissance des isolats a été étudié dans des tubes à essai

contenant 10 ml de milieu YMB ensemencés par 0.2ml de chaque suspension bactérienne

obtenue sur le même milieu après une incubation à 28°C sous agitation pendant 7 jours.

Le milieu YMB est ajusté à des valeurs de pH allant de 4 à 10 par l’ajout de quelques gouttes

de NaOH (10℅) ou de HCl (1N), les tubes sont ensuite incubés à 28°C.

La croissance bactérienne a été évaluée à l’aide d’un spectrophotomètre à une longueur

d’onde λ=570 nm.

5.2. Effet de la température

Des tubes de 10 ml de milieu YMB sont ensemencés par 0.2ml des suspensions

bactériennes obtenues préalablement sur le même milieu, ensuite ces tubes sont incubés à

différentes températures : 10°C, 20°C ,30°C, et 40°C.

Après 7 jours d’incubation, la croissance bactérienne des souches testées est estimée par

mesure de la densité optique à 570nm.

5.3. Effet de NaCl

Des tubes contenant10ml de milieu YMB sans NaCl comme témoin, et d’autres tubes

de 10 ml à des différentes concentrations de NaCl (100mM, 200Mm, 300Mm ,400mM,

500Mm, 600Mm) sont ensemencés par les souches isolées, en ajoutant pour chaque tube

0.2ml des suspensions bactériennes obtenues préalablement sur milieu YMB. Les tubes sont

incubés à 28°C pendant 7 jours et la croissance bactérienne est évaluée par mesure de la

densité optique à λ=570nm.

5.4. Sensibilité des souches aux antibiotiques

La résistance aux antibiotiques a été fréquemment utilisée dans l’étude des Rhizobium,

comme un moyen d’identification (Vincent, 1970 ; Beck et al., 1993).


26

Des boites de Pétri contenant le milieu Muller Hinton sont ensemencées par

inondation avec 0,5 ml de chaque suspension bactérienne des souches cultivées sur milieu

YMB. Après élimination de l’excès du milieu, on dépose stérilement les disques

d’antibiotiques à la surface des boites. Après incubation à 28°C pendant 7 jours, des zones

d’inhibitions peuvent être observées autour de certains disques. La lecture des résultats

consiste à mesurer, à l’aide d’un pied à coulisse, le diamètre des zones d’inhibition pour

chaque antibiotique.

Les souches sont classées en souches sensibles (S), intermédiaires (SI) et résistantes (R) selon

les valeurs limites du comité de l’antibiogramme de la société française de microbiologie

(Annexe II).

6. Analyse numérique des caractères phénotypiques étudiés

Les résultats de tous les caractères phénotypiques ont été soumis à une analyse

numérique pour situer le degré de rapprochement entre les souches isolées des nodules de

Spartium junceum L d’une part.et entre ses souches et les souches de référence d’autre part.

Cette analyse est appuyée par une Classification Ascendante Hiérarchique (CAH), basée sur

le calcul des distances de similarité de Gower à l’aide du logiciel XL STAT (2017).

A partir de tous les caractères obtenus, nous avons réalisé une matrice dans laquelle les

variables sont codés comme suit : (0) : absence du caractère ou faible ; (1) : présence du

caractère ou fort. Par contre les caractères en communs ne sont pas utilisés car ils ne sont pas

discriminants.

RESULTATS

ET

DISCUSSIONS

Chapitre III : Résultats et discussions

27

1. Caractéristiques physico-chimiques de sol

Les résultats obtenus par l’analyse physico-chimiques de sol étudié (Tableau II)

sont discutés par apport aux travaux de Soltner (1988) concernant les sols méditerranéens.

TableauII:Résultats des analyses physico-chimiques du sol de TiziAdjissa (Smaoun).

Paramètres Résultats

Granulométrie

%A 24.71

%Lf 10.56

%Lg 7.42

%Sf 24.67

%Sg 32.64

Texture SA

Analyse physico-chimique

pH (eau) 7.30

pH (KCl) 5.98

%C 2.11±0.21

%MO 3.62±0.36

%N 0.176 ± 0.003

C/N 11.98

%CaCO3 0

% Calcaire actif 0

CEµS/cm 89

Couleur 5YR4/3

Les résultats du tableau indiquent que le sol de Tizi Adjissa (Smaoun), avec une

valeur de pHeau=7.30, est légèrement alcalin, de couleur rouge brunâtre (code 5YR4/3D

d’après le guide de Mansell).

D’après le triangle de texture USDA, la texture du sol de Smaounest sablo-

argileuse, avec une teneur élevée en sables (57.31℅) et en argiles (24.71℅), ce qui donne

une texture équilibrée pour ce sol. La présence de sables en excès permet une bonne

aération ce qui favorise un bon développement des plantes, et la présence des argiles en


28

grande quantité par rapport aux limons (17.98℅), permet une structure rigide au sol.La

teneur élevée en argiles et en sables rendent le sol facile à travailler. Ce type de sol ne

présente pas des défauts au niveau de ses propriétés physiques, il est caractérisé par une

structure cohérente et bien développéeet par une capacité de rétention en eau relativement

élevée, ce qui facilite son, drainage et son aération.

Il est pauvre en calcaire ce qui diminue sa perméabilité et son réchauffement

rapide, tandis qu’il est riche en matière organique (MO℅=3.62) et en azote (0.176℅).

Il présente une faible salinité (CE =89µS/cm à 25°C), ce qui indique d’après

l’échelle de (Durand, 1983in soltner), qu’il n’est pas salé, par conséquent sa salinité n’a

pas un effet néfaste appréciable sur la croissance des plantes.

2. Authentification des souches

A partir des nodules prélevés des racines de la plante Spartiumjunceum L., nous

avons constitué une collection de 13 souches bactériennes. Cependant les résultats de la

réinoculation de nos isolats aux cultures de SpartiumjunceumL.montrent que seules 7

souches bactériennes ont induit la formation de nodules visibles à l’œil nu sur la plante.

Les premières nodosités sont apparues 5 semaines après inoculation.

3. Caractérisation phénotypique des bactéries nodulantSpartiumjunceumL.

Les souches qui ont montré une capacité à former des nodules sur leur plante-hôte

SpartiumjunceumL.ont été retenues pour une caractérisation phénotypique, basée sur les

tests morphologiques, biochimiques et physiologiques afin d’étudier leur diversité.

3.1.Caractérisation cellulaire et morphologique des colonies

3.1.1. Caractéristiques cellulaires

L’observation microscopique à l’état frais des différentes suspensions bactériennes

prélevées sur milieu YMB a montré que toutes les souches isoléesà partir des nodules

racinaires de SpartiumjunceumL., se présentent sous forme de petits bâtonnets à extrémités

arrondies et possèdent toutes du PHB (β-polyhydroxybutyrate).Elles sont mobiles et à

Gram négatif.


29

3.1.2. Caractéristiques des colonies

On observe que les colonies bactériennes n’apparaissent qu’après 7à 10 jours

d’incubation sur milieu YMA à 28°C ce qui indique que les souches isolées ont une

croissance lente, caractéristique des Bradyrhizobium(Moreira et al., 1993).

Toutes les colonies visibles sont lisses et bombées, punctiforme avec un contour

régulier, de couleur crème ou transparente, non mucoidales, avec des tailles qui varient

entre 0.5 et 1mm (Tableau III).

Tableau III: Résultats de la caractérisation morphologique des colonies bactériennes

CaractèresSouches

Forme Couleur Contour Aspect Elévation Mucoidité Taille

LPunctiformecirculaire

crème régulier Lisse Bombée / 1mm

OPunctiformecirculaire

transparente régulier Lisse Bombée / 0.5mm

GPunctiformecirculaire

transparente régulier Lisse Bombée / 1mm

HPunctiformecirculaire

crème régulier Lisse Bombée / 0.5mm

MPunctiformecirculaire


NPunctiformecirculaire

crème régulier Lisse Bombée / 0.5mm

PPunctiformecirculaire


3.2.Caractérisation biochimique

3.2.1. Le test de bleu de bromothymol

La figure 6, montre l’alcalinisation ou l’acidification du milieu YMA additionné de

BTB de toutes les souches isolées.

La majorité des souches testées alcalinisent le milieu YMA additionné du bleu de

bromothyml, à l’exception des souches G, et O qui acidifiant le milieu (virage du milieu au

jaune).


30

L’alcalinisation du milieu se traduit par le virage du milieu au bleu foncé

(caractéristique des bactéries du genre Bradyrhizobiumà croissance lente).Tandis que, le

virage du milieu au jaune caractérise des bactéries à croissance rapide.

Nos résultats sont aussi en accord avec ceux obtenus parJordan (1984)etBoakye

et al.,(2016) qui ont considéré que les isolats qui ont changé la couleur du milieu

YMA+BTB au jaune ont acidifié le milieu et sont considérés comme des bactéries à

croissance rapide. En revanche, les isolats ayant changé la couleur du milieu au bleu ont

alcalinisé le milieu et sont considérés comme des bactéries à croissance lente.

Figure 6 : Résultats du test de bleu de bromothymol.


31

3.2.2. Les tests biochimiques

Les résultats des tests biochimiques réalisés ainsi que ceux de la galerie API 20NE

sont cosignés dans le tableau suivant.

Tableau IV: Résultats des tests biochimiques des bactéries isolées de SpartiumjunceumL.

Souches

Tests H G L M N O P USDA6 USDA76

Oxydase + + + + + + + + +

catalase + + + + + + + + +

Indole - - - - - - - - -

H2S - - - - - - - - -

RM + + + + - - + - +

VP - - - - + + - + -

Gaz - + - + - - + - -

TRP - - - - - - - - -

GLU - - + - - + + - -

ADH - - - - - + + - -

Urée - - - - - - - + -

ESC - + + - + + + + +

GEL - + + + + + + + -

ONPG - + + - + + + - +

NAG + + + + + + + + +

GNT + + + + + + + + +

CAP - - - - - - - - -

ADI - - - - - - + - -

MLT + + + + + + + + +

CIT + + + + - + + + -

PAC + + + + + + + + +

LDC + - + + + + + - +

ODC + + + + + + + + +

Nitrate + + + + + + + + +

Nitrite + + - + - - - + +

Les résultats du tableau IV montrent que les activités (catalase, oxydase, nitrate

réductase et ornithine décarboxylase) sont retrouvées chez toutes les bactéries.

Le potassium gluconate (GNT) et le N-acétyl-glucosamine (NAG) ainsi que

l’acide malique (MLT) et l’acide phénylacétique (PAC), sont assimilés par toutes les

souches. Par contre l’acide caprique (CAP) n’est assimilé par aucune souche.


32

Elles ne produisent pas l’H2S ni l’indole à partir de tryptophane. La nitrite réductase

est présente que chez 3 souches : H, G, M, et les deux souches de référence USDA6 et

UASDA76. Par contre, l’uréase n’est retrouvée que chez la souche de référence USDA6.

A l’exception des souches G et USDA6, toutes les souches isolées ont une Lysine

décarboxylase. La gélatinase (GEL+) est présente chez toutes les souches à l’exception des

H et USDA76.

L’utilisation du citrate est remarquée chez la majorité des souches sauf la souche N

et la souche de référence USDA76.L’acide adipique n’est assimilé que par la souche P.

Les souches G, L, N, O, P et USDA76 possèdent une β-galactosidase (ONPG+) et

une β-glucosidase (ESC+). La souche USDA6 possède une β-galactosidase mais pas une

β-glucosidase (ESC-).

Seules les souches O et P possèdent une arginine déhydrolase (ADH+) et

fermentent avec la souche L le glucose.La production du gaz n’est remarquée que chez 3

souches : G, M et P.

Les souches H, G, L, M, P et USDA76 produisent de l’acide (RM+) à partir du

glucose, alors que le reste des souches produisent de l’acétoine à partir du glucose.

3.2.3. Assimilation des substrats carbonés

Le tableau V montre que la majorité des souches testées assimilent les

disaccharides à l’exception de tréhalose pour la souche M et le Lactose pour la souche

USDA76.

Tous les polyalcools sont assimilés par la majorité des souches sauf les souches M

et P qui n’assimilent pas le glycérol.

Toutes les souches assimilent les hexoses et les pentoses à l’exception de la

souche USDA6 qui n’assimile ni le mannose ni le glucose, ni l’arabinose. La souche N

n’assimile pas le Rhamnose, et les souches L et M n’assimilent pas le lévulose.

Le Trissacharide (Raffinose) est assimilé que par les souches H, M, O, et les deux

souches de référence USDA6 et USDA76.


33

Nos résultats sont en accord avec ceux obtenus par(Stowers, 1985) qui a montré

que les bactéries du genre Bradyrhizobium ont une aptitude variable pour l’assimilation des

monosaccharides, avec une préférence marquée pour certaines hexoses et

pentoses,notamment le galactose et l’arabinose, ou à certaines polyalcool tels que le

mannitol ou le glycérol.

Tableau V: Résultats d’assimilation des sucres par les souches isolées de

SpartiumjunceumL.

Souches

Sucres

H G L M N O P USDA6 UDSA76

Pentoses

Arabinose + + + + + + + - +

Hexoses

Mannose

Galactose

Rhamnose

Lévulose

Glucose

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+

-

+

+

+

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

+

+

-

+

+

+

+

+

Disaccharides

Maltose

Lactose

Tréhalose

Cellobiose

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

+

Trisaccharides

Raffinose + - - + - + - + +

Polyalcools

Mannitol

Glycérol

+

+

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+

3.3.Caractérisation physiologique

3.3.1. Effet de la température

Comme le montre l

croissance à 30°C,à l’exception des souches P

croissance à 20°C.

Figure 7: Effet de la température sur la croissance bactérienne des souches isolées d

0

0,1

0,2

0,3

10

DO

(57

0n

m)

0

0,1

0,2

0,3

10

DO

(57

0n

m)

Chapitre III : Résultats et discussion

aractérisation physiologique

de la température

Comme le montre la figure (7),la plupart des souches présente un optim

xception des souches P et N et O qui présentent une meilleure

Effet de la température sur la croissance bactérienne des souches isolées d

Spartiumjunceum L.

20 30

20 30

: Résultats et discussions

34

a plupart des souches présente un optimum de

qui présentent une meilleure

Effet de la température sur la croissance bactérienne des souches isolées de

40T°C

M

N

O

P

USDA76

40

T°C

H

G

L

USDA6

Il y a lieu de remarquer que la tempér

optimum de croissance se située entre 20°C et 30°C

La plupart des souches tolèrent les températures situées entre 30°C et 40°C

que les Bradyrhizobiumsont thermotolérants

par(Yates, 2004)qui a montré

une température de 37°C.

3.3.2. Effet du pH

La Figure (8) montre que l’optimum de croissance de toutes les souches t

situe entre pH 6 et 8. La souche USDA6 présente un

Figure 8: Effet du pH sur la croissance des souches isolées de

Il ya lieu de remarqué que les

et pH 9, et sont inhibées à des

souches G, P et O est inhibée

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

4

DO

(57

0n

m)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

4

DO

(57

0n

m)


Il y a lieu de remarquer que la température préférable par la souche G

e se située entre 20°C et 30°C

La plupart des souches tolèrent les températures situées entre 30°C et 40°C

sont thermotolérants (Robert et al., 1982). Ce résultat est confirmé

a montré que les bactéries à croissance lente peuvent se

) montre que l’optimum de croissance de toutes les souches t

a souche USDA6 présente unebonne croissance à

: Effet du pH sur la croissance des souches isolées de Spartiumjunceum

a lieu de remarqué que les souches N, L ont une croissance stable entre les pH 5

et pH 9, et sont inhibées à des valeurs de pH 4 et pH 10, par contre la croissance des

souches G, P et O est inhibée à partir du pH 8 et s’arrête complètement à pH 10.

5 6 7 8 9

5 6 7 8 9


35

ature préférable par la souche G pour son

La plupart des souches tolèrent les températures situées entre 30°C et 40°C, de fait

e résultat est confirmé

à croissance lente peuvent se développer à

) montre que l’optimum de croissance de toutes les souches testées se

croissance à pH 10.

Spartiumjunceum L.

ont une croissance stable entre les pH 5

valeurs de pH 4 et pH 10, par contre la croissance des

à pH 10.

10 11pH

H

G

USDA76

O

P

10 11pH

N

USDA6

M

L

Toutes les souches étudiées

l’alcalinité est due du fait que ces souches proviennent de sollégèrement alcalin.

Yadav etVyas(1971) ; Jordan

genre Bradyrhizobiumont pu tolérer des pH élevés

sensibles aux pH acides.

par(Yates, 2004) qui a considéré que t

satisfaisante à pH 9 et peuvent

3.3.3. Effet du NaCl

La majorité des souches testées

0mM et 200mM de NaCl figure (9).

Figure 9: Effet du NaCl su

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 100 200

DO

(57

0n

m)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 100 200

DO

(57

0n

m)


Toutes les souches étudiées tolèrent les pH alcalins que les pH acides. C

que ces souches proviennent de sollégèrement alcalin.

; Jordan (1984)ont rapporté que les bactéries à croissance lente du

ont pu tolérer des pH élevés de l’ordre de 10 alors qu’elles sont

Par ailleurs, nos résultats sont en accord avec ceux obtenus

qui a considéré que tous les isolats à croissance lente ont

peuvent croitre à pH5.

é des souches testées présente un optimum de croissance située entre

et 200mM de NaCl figure (9).

Effet du NaCl sur la croissance des souches isolées de Spartium junceum

300 400 500 600 700

[NaCl]mM

200 300 400 500 600 700


36

acides. Cette tolérance à

que ces souches proviennent de sollégèrement alcalin.

à croissance lente du

de l’ordre de 10 alors qu’elles sont

accord avec ceux obtenus

te ont une croissance

um de croissance située entre

Spartium junceum L.

[NaCl]mM

M

N

O

P

USDA76

700

[NaCl] mM

H

G

L

USDA6


37

Il est important de remarquer que toutes les souches ne tolèrent pas des

concentrations supérieures à 200mM de NaCl à l’exception de la souche G qui semble

tolérer toutes les concentrations de NaCl, par contre sa croissance s’annule à 600 mM de

NaCl.

Nos résultats sont ont accord avec ceux obtenus par Elmustafa Elsheikh(1998) qui

a montré que la croissance des Bradyrhizobium commence à diminuer à partir d’’une

concentration de 200mM de NaCl sur milieu YMB et cette croissance s’annule à 600mM

de NaCl.

L’adaptation de la souche G aux fortes concentrations en sel est due, d’après

Zahran et al.,(1994), à sa faculté de synthèse et d’accumulation intracellulaire des solutés

compatibles. Ces solutés ont pour rôles d’osmo-régulation et de protection des bactéries

contre les effets de stress salin. Les principaux solutés rencontrés chez les bactéries sont:

les ions K+, glycine- betaïne, proline, glutamate, divers glucides.

3.3.4. Résistance aux antibiotiques

Le tableau VI montre la résistance ou la sensibilité des différentes souches isolées de

SpartiumjunceumL.aux différents antibiotiques utilisés.

Tableau VI: Résultats de l’antibiogramme sur les souches isolées

Souches

Antibiotiques

H G L M N O P USDA6 USDA76

Tobramycine(10g) S S S R S S S S S

Cyflotaxine(30g) R R S S S S R S R

Acide Nalidixique(30g) S S S S S SI S SI S

Kanamycine(30g) S S S S S S S R R

Ampicilline(10g) R S R R R R R R R

Erythromycine(15g) S S S R S S R S R

Gentamycine(10g) S S S S S S S S R

Tétracycline(30g) S S R S S SI R S R

Oxacilline(1g) R R R S R R R S R

Pénicilline(10g) SI SI SI R SI SI SI SI R


38

A partir de ce tableau on note que toutes les souches sont sensibles à l’Acide

nalidixique, alors que les souches M et USDA6 ont une sensibilité intermédiaire à cet

antibiotique. Par contre, elles sont toutes résistantes à l’ampicilline sauf la souche G.

Seule la souche USDA76 présente une résistance à la Gentamycine, par contre

pour la Kanamycine seulement les souches de référence (USDA6 et USDA76) qui sont

résistantes.

La majorité des souches sont sensibles à la Tobramycine à l’exception de la souche

M.Les souches : H, G, P et USDA76 sont résistantes à la Cyflotaxine.

Il faut noter que sauf les souches M et USDA6 qui ont une sensibilité à

l’Oxacilline.Les souches (H, I, G, M, N et USDA6) sont sensibles à la Tétracycline, tandis

que la souche O a une sensibilité intermédiaire à cet antibiotique

Il ya lieu de noter également que seule 3 souches (M, P, USDA76) ont une

résistance à l’Erythromycine

Une sensibilité intermédiaire à la Pénicilline est remarquée par la majorité des

souches à l’exception des souchesM et la souche de référence USDA76.

Figure 10 : Résultats de l’Antibiogramme de quelques souches testées.


39

4. Analyse numérique des caractères phénotypiques

La caractérisation phénotypique des souches isolées des nodules racinaires de

Spartiumjunceum L. est basée sur 51 caractères discriminants.Les caractères en commun

ont été éliminés et les caractères les plus discriminants sont traités par XLSTAT basé sur le

calcul de l’indice de similarité de Gower (Annexe III). Le dendrogramme de la figure

(11)établi par une CAH montre qu’à une distance de similarité 3, les souches sont reparties

en deux classes distinctes A et B.

Figure 11 : Dendrogramme généré par les caractères phénotypiques.

La classe A renferme uniquement la souche USDA6, et la classe B renferme le

reste des souches y compris la souche de référence USDA76. Cependant cette classe est

subdivisée en 3 sous- classes distinctes B1, B2, B3, dont la sous-classe B1 renferme la

majorité des souches isolées des nodules de Spartium junceum L. elle-même est subdivisée

en 2 sous- groupes B1a et B1b.

Le sous-groupe B1a renferme les souches P, L, N et O. Elles ne différent entre elles

que par 15 caractères (BTB, RM et VP, la production de gaz, GLU*, ADH, ADI, CIT,

rhamnose, lévulose, raffinose, Glycérol, cyflotaxine, érythromycine, tétracycline).

US

DA

6

M

US

DA

76

P L N O H G

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

Sim

ilar

ité

AB1

B

B1aB1b

B3B2

Souches


40

Le sous-groupe B1b constitué uniquement de deux souches H et G qui partagent 41

caractères phénotypiques en communs. Elles se distinguent par leurs capacité de réduire les

nitrates et les nitrites (NR+). Elles sont incapables de produire l’H2S, l’indole, la

désaminase, de même sont incapables de fermenter le glucose, elles possèdent une catalase

et une oxydase, elles utilisent (mannitol, glycérol, cellubiose, tréhalose,lactose, maltose,

glucose,lévulose, rhamnose,galactose, mannose et l’arabinose) comme seule source de

carbone et d’énergie. Elles ne possèdent pas une arginine dehydrolase (ADH-) et une

uréase (URE -), sont incapables d’assimilerl’acide caprique (CAP-), l’acide adipique

(ADI),par contre elles sont capables d’assimiler le N-acétyl-glucosamine (NAG +),le

potassium gluconate (GNT+) l’acide malique (MLT+) et phénylacétique (PAC+),ont

aussila capacité d’utilisés le citrate (CIT+).Ces deux souches partageant aussi le caractère

de sensibilité et de résistance aux différents antibiotiques, elles sont sensibles à (la

tobramycine, gentamycine, acide nalidixique, kanamycine, érythromycine, tétracycline et

pénicilline), mais sont résistantes à l’oxacilline et la cyflotaxine.

La sous- classe B2 est une classe à part renferme seulement la souche M.

La sous- classe B3 renferme uniquement la souche de référence USDA76 qui

englobe la majorité des souches étudiées, c’est la souche la plus proche de nos isolats en

terme de similarité.

L’ensemble des caractères phénotypiques étudiés montre qu’à l’exception de la

souche M, il existe une similarité phénotypique entre la majorité des isolats

nodulantSpartiumjunceum L.

Malgré que les isolats proviennent de la même station Tizi Adjissa(Smaoun)mais

ils présentent des caractéristiques phénotypiques différentes, et ceci reflète une importante

diversité phénotypique des isolats.

CONCLUSION

Conclusion et perspectives

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Par le présent travail, nous avons procédé à une caractérisation phénotypique des

bactéries nodulant la légumineuse Spartium junceumL., collectée de la station Tizi Adjissa de

la région de Bejaia.

Une étude pédologique sur le sol prélevé de la stationTizi Adjissaa été réalisée dans

le but de connaitre les conditions édaphiques d’habitat de cette légumineuse et de son

microsymbiote.Les résultats des analyses physico-chimiques ont montré que le sol est

légèrement alcalin, non salé et présente une texture sablo-argileuse avec des teneurs élevées

en sables et en argiles, il est riche en matière organique et en azote, maisil est pauvre en

calcaire.

Une collection de 13 souches bactériennes isolées à partir des nodules racinaires de la

légumineuse Spartium junceumL. a été réalisée. Cependant, le test de nodulation par

inoculation de ces souches à leur plante hôte d’origine (Spartium junceum L.)a révélé que

seules 7 souches bactériennes ont abouti à la formation de nodules racinaires, ce qui confirme

leur appartenance aux BNL.

Ces souches sont soumises à une étude phénotypique basée sur les caractères

morphologiques, biochimiques et physiologiques et appuyée par une analyse numérique.

Le fait que les colonies de la majorité de nos souches n’apparaissent qu’après 7 à 15

jours d’incubation sur le milieu YMA et que la plupart d’entre elles alcalinisent le milieu

YMA additionné de bleu de bromothymol, nous permet, sous réserve d’autres tests, d’orienter

l’appartenance de nos souches au genre Bradyrhizobium à croissance lente.

Toutes les souches ont une forme de petitsbâtonnets à extrémités arrondies, mobiles, à

Gram négatif et présentent toutes des granules réfringents de PHB. Elles possèdent une

catalase, une oxydase et une nitrate réductase. Elles présentent une large gamme d’utilisation

de substrats carbonés avec une préférence aux polyalcools, monosaccharides et

particulièrement lespentoses. Elles assimilent toutes le mannitol et le galactose comme source

de carbone et d’énergie,

Toutes les souches ont un optimum de croissance situé entre 20 et 30°C et la plupart

d’entre elles sont capables de tolérer des températures situées entre 30°C et 40°C.

La majorité des souches présentent un optimum de croissance entre pH 6 et pH 8 avec

une préférence aux pH basiques que les pH acides.

Conclusion et perspectives

42

L’optimum de croissance de toutes les souches testées est situé entre 0mM et 200mM

de NaCl, au-delà de cette concentration (200mM),la croissance des souches diminue

progressivement en fonction de la salinité élevée du milieu, à l’exception de la souche G.

La majorité des souches isolées sont sensibles aux dix antibiotiques testés, cependant

elles présentent toutesune résistance à l’oxacilline et à l’ampicilline à l’exception de deux

souches M et USDA6 pour l’oxacilline et la souche G pour l’ampicilline.

L’analyse numérique des caractères phénotypiques par une CAH indique que toutes

les souches isoléesde Spartium junceum L. sont regroupées dans une seul classe (B) qui est

liée à la souche de référence USDA76 (Bradyrhizobium elkanii).

En perspective, il est souhaitable d’approfondir ce travail par :

L’enrichissement de cette collection par d’autres souches bactériennes provenant

d’autres régions d’Algérie.

L’étude d’autres caractères et réalisation d’autres tests, notamment le test de

nodulation croisé, pour affiner l’analyse phénotypique. Cette dernière doit être suivie

dans une second étape par une caractérisation génotypique et moléculaire basée sur

l’analyse des séquences d’ADNr 16S,del’IGS,des gènes nodetdesgènes de

ménage(recA,glnII…..),ceci afin de situer avec précision la position taxonomique des

microsymbiotes de la légumineuse Spartium junceum L.

REFERENCESBIBLIOGRAPHIQUS

ANNEXES

Liste des annexes

Annexe I :

1-Milieu YMA (Vincent, 1970)

Extrait de levure 0.4g

Mannitol 10g

NaCl 0.1g

KH2PO40.5g

MgSO4, 7H2O 0.2g

Agar15 à 18g

Eau distillée1000ml

Le pH du milieu est ajusté à 6,8. Le milieu est stérilisé par autoclavage pendant 20 min à

l20°C.

2-Milieu YMB (Vincent, 1970)

Extrait de levure 0.4g

Mannitol10g

NaCl0.1g

KH2PO4 0.5g

MgSO4 ,7H2O 0.2g

Eau distillée 1000ml

PH ajusté a 6.8

3-Milieu de culture de la légumineuse :

Milieu Fahraeus :

Macroéléments :

KH2PO4 100mg

NaH2PO4 150mg

CaCl2 100mg

Liste des annexes

MgSO4 (H2O) 120mg

Citrate de fer 5mg

Eau distillée 1000ml

1ml de la solution d’oligoéléments

4-La solution d’oligoéléments

H3BO3 2.86g

MnSO4 (H2O) 2.08g

ZnSO4 (7H2O) 0.22g

CuSO4 (5H2O 0.08g

Na2MOPO4 0.11g

Eau distillée 1000mg

Liste des annexes

Annexe II :les valeurs limites du comité de l’antibiogramme de la société française de

microbiologie

ØD :soucherésistante

Ø< d : souchesensible

d Ø<D :souche intermédiaire

Antibiotiques Charge de disqueg

Diamètres(mm)

D d

TETRACYCLINE 30 19 17

AMPICILINE 10 19 < 14

ACIDE NALIDIXINE 30 20 < 15

KANAMYCINE 30 17 < 15

CENTAMICINE 10 16 < 14

PENICLINE 10 29 < 8

TOBRAMYCINE 10 16 < 14

CEFOTAXILE 30 21 < 15

ERYTHROMYCINE 15 22 < 17

OXACILINE 1 20 < 20

Liste des annexes

Annexe III : La matrice de proximité

Matrice de proximité (Indice de Gower) :

souches H G L M N O P USDA6 USDA76

H 1 0,651 0,687 0,673 0,699 0,658 0,583 0,624 0,659

G 0,651 1 0,629 0,536 0,601 0,623 0,580 0,527 0,549

L 0,687 0,629 1 0,617 0,796 0,730 0,712 0,591 0,643

M 0,673 0,536 0,617 1 0,571 0,556 0,601 0,591 0,602

N 0,699 0,601 0,796 0,571 1 0,765 0,646 0,632 0,610

O 0,658 0,623 0,730 0,556 0,765 1 0,703 0,631 0,565

P 0,583 0,580 0,712 0,601 0,646 0,703 1 0,468 0,564

USDA6 0,624 0,527 0,591 0,591 0,632 0,631 0,468 1 0,559

USDA76 0,659 0,549 0,643 0,602 0,610 0,565 0,564 0,559 1

Résumé :

13 souches de bactéries ont été isolées à partir des nodules racinaires de la

légumineuseSpartiumjunceum L. récolté de la région de Tizi Ajdissa (Smaoun, Bejaia). Le

test de nodulation à confirmé l’appartenance de 7 souches auxBNL vu leur capacités

d’induire des nodules sur la racine de leur plante hôte d’origine (Spartium junceum L.).

Les isolats authentifiés par le test de nodulation ont fait l’objet d’une caractérisation

phénotypique à travers une étude morphologique, biochimique et physiologique suivie

d’une analyse numérique. Les résultats montrent que la majorité des souches sont à

croissance lenteet se répartissent en deux groupes distincts dont la plupart sont liées à la

souche de référence USDA76, Bradyrhizobium elkanii.

Mots clés:BNL.,Spartium junceum L., Caractérisation phénotypique.Bejaia.

Abstract :

13 strains wereisolated from nodules of leguminous Spartium junceum L., sampled

at station of Tizi Adjissa .The nodulation test confirm that the 7strains belonging to LNB

for their ability to induce the root nodules on their leguminous hot Spartiumjunceum L.

Isolates authenticated were subjected to phenotypic characterization through

morphological biochemical and physiological study followed by a numerical analysis.

Theresults show that the strains were slow growing and divided into two distinct groups

which, for the most, were closely related to the reference strain USDA76, Bradyrhizobium

elkanii.

Key words:LNB., Spartium junceum L., phenotypic characterization. Bejaia.

00 page de gardecératite - copie final

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