« analyse et méta-analyse des niveaux d’expression d’egf-r

Université Libre de Bruxelles Faculté de Médecine

« Analyse et méta-analyse des niveaux d’expression d’EGF-R, c-erbB-2, Ki-67 et des micro-vaisseaux aux différents stades

de développement des cancers bronchiques » Anne-Pascale Meert

Année académique 2006-2007

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Université Libre de Bruxelles Faculté de Médecine

Unité de Soins Intensifs Médico-chirurgicaux et Oncologie Thoracique

« Analyse et méta-analyse des niveaux d’expression d’EGF-R, c-erbB-2, Ki-67 et des micro-vaisseaux aux différents stades

de développement des cancers bronchiques »

Anne-Pascale Meert

Thèse déposée en vue de l’obtention du titre académique de docteur en sciences médicales

Promoteur : JP Sculier

Co-promoteur : V Ninane

Année académique 2006-2007

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Remerciements

Ce travail n’aurait jamais été possible sans l’aide précieuse d’un grand nombre de personnes

que je tiens à remercier chaleureusement :

- Le Professeur Jean-Paul Sculier qui, depuis des années, m’a donné le goût et la possibilité de

réaliser des travaux scientifiques. Sans lui, son enthousiasme, sa rigueur, sa disponibilité et

son soutien, cette thèse n’aurait jamais vu le jour

- Le Professeur Arsène Burny pour son enthousiasme chaleureux envers nos travaux et ses

précieux conseils dans la rédaction de cette thèse

- Le Professeur Vincent Ninane qui a supervisé mon travail et m’a fourni les échantillons

biospsiques

- Le Docteur Thierry Berghmans avec qui le partage du travail clinique quotidien est un réel

plaisir. Sa disponibilité constante, son amitié et sa collaboration me sont particulièrement

précieuses

- Le Docteur Céline Mascaux pour ses conseils pertinents

- Le Docteur Benoit Martin qui m’a apporté sa contribution dans la réalisation pratique de ces

travaux

- Le Professeur Bosschaerts qui m’a permis de recueillir les pièces chirurgicales

- Le Professeur Jean Klastersky qui m’a, dès mes cours de sémiologie, donné l’amour de la

médecine interne et de l’oncologie

- Le Professeur Jean-Jacques Lafitte et le Docteur Lothaire pour leur collaboration

- Le service d’anatomo-pathologie qui m’a gentillement accueillie, les Dr Verhest et Feoli et

plus particulièrement Jean-Marc Verdebout, pour ces longues soirées de révision de lames

- Marianne Paesmans pour ses compétences statistiques

- Le FNRS et le Télévie pour m’avoir accordé leur confiance et leur aide financière

- Les Amis de l’Institut Bordet pour leur soutien financier

- Les techniciennes de laboratoire (Marie, Sophie et Géraldine) pour leur aide pratique

- Les infirmières de l’ASTI, notre unité de soins intensifs, pour leur soutien quotidien dans

mon travail clinique

- Les secrétaires (Caroline et Chantal) et Nathalie Leclercq pour leur sourire et leur efficacité

- Mes meilleurs amis Sophie, Casper et Jean

- Mes parents et plus particulièrement ma maman pour sa présence constante depuis le début

de mes années d’études de médecine

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- Marraine avec qui j’aurais tellement aimé partager ces moments

- Enfin, je tiens à remercier plus particulièrement et avec tout mon amour, Laurent qui depuis

plus de 17 ans accepte sans rechigner mes horaires difficiles, mes absences, ma mauvaise

humeur et mes moments de découragement

5

But du travail Le rôle précis des facteurs biologiques dans la carcinogenèse bronchique est encore mal

compris. Le but de nos travaux est d’évaluer l’implication de certains d’entre eux dans le

pronostic du cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC) et de démontrer l’apparition

d’anomalies précédant le stade invasif, plus particulièrement dans le développement d’une de

ses formes, l’épithélioma épidermoïde,.

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Résumé

Dans un premier temps, nous avons réalisé des revues systématiques de la littérature

avec méta-analyses des données de survie. Ceci nous a conduits à sélectionner 4 marqueurs de

mauvais pronostic pour la survie des CBNPC: le récepteur au facteur de croissance

épidermique (EGF-R), un autre récepteur de cette famille (c-erbB-2) ainsi que deux autres

facteurs potentiellement témoins de leur activité, Ki-67 (impliqué dans la prolifération) et le

nombre des micro-vaisseaux (témoins de la néoangiogenèse).

Dans une deuxième phase, nous avons étudié au laboratoire diverses questions sur des

tumeurs bronchiques invasives.

Premièrement, nous avons investigué le mécanisme de surexpression d’EGF-R et de c-

erbB-2 et évalué si des anomalies génétiques pouvaient prédire cette surexpression, en

recourant à des techniques d’immunohistochimie et de FISH. Ceci nous a permis d’observer

que, si la majorité des CBNPC réséqués présentent des anomalies génétiques d’EGF-R et/ou

de c-erbB-2, une amplification de ces gènes n’est présente que dans une minorité d’entre eux

et n’est pas strictement corrélée à l’expression protéique. D’autre part, la survie de ces

patients exprimant ou ayant une anomalie génique d’EGF-R et/ou c-erbB-2 est plus courte

sans atteindre le seuil de signification statistique.

Deuxièmement, nous avons recherché sur des tumeurs opérées d’éventuels liens entre

les expressions d’EGF-R, de c-erbB-2 et de Ki-67. Aucune corrélation n’a été mise en

évidence entre l’expression de ces 3 facteurs. Par contre, chez ces patients, l’expression de Ki-

67 dans la tumeur s’est avérée être un facteur de mauvais pronostic pour la survie.

Troisièmement, nous avons voulu savoir si un de ces marqueurs (EGF-R) présentait

une valeur pronostique dans un groupe plus restreint de tumeurs plus avancées, les CBNPC de

stade III. Pour mener cette recherche sur des biopsies, nous avons d’abord démontré que

l’évaluation des marqueurs biologiques (EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67) sur biopsie ne différait

pas de celle réalisée sur des tumeurs réséquées. Comme les résultats étaient équivalents, nous

avons pu étudier EGF-R sur les biopsies de CBNPC au stade III et montrer qu’EGF-R n’était

pas un facteur pronostique pour la survie dans ce groupe assez homogène de tumeurs

avancées.

Dans la dernière phase, nous avons étudié des lésions représentatives des différents

stades prénéoplasiques et néoplasiques précoces radiooccultes. Ces lésions ont été prélevées

lors d’examens endoscopiques de photodétection. EGF-R, c-erbB-2, Ki-67 et le nombre des

micro-vaisseaux ont été étudiés par immunohistochimie dans ces différents stades de lésions

7

prénéoplasiques et néoplasiques précoces. Nous avons observé qu’EGF-R et Ki-67 sont

statistiquement plus exprimés dans les dysplasies sévères et les carcinomes in que dans les

dysplasies légères suggérant que, au moins pour ces 2 marqueurs, les dysplasies sévères se

rapprochent plus des carcinomes in situ que des dysplasies légères. Alors que l’expression

d’EGF-R est présente dès le stade de dysplasie sévère, une augmentation du nombre des

micro-vaisseaux n’est présente qu’au stade de tumeurs micro-invasives. C-erbB-2 n’est quant

à lui pas exprimé dans ces lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces.

En conclusion, les facteurs biologiques, EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67 et le nombre des

micro-vaisseaux s’avèrent des facteurs de mauvais pronostic dans le CBNPC. La

surexpression d’EGF-R et de c-erbB-2 dans les cancers réséqués résulte très rarement d’une

amplification génique et nous n’avons pas trouvé dans ces tumeurs de corrélation entre

l’expression des marqueurs moléculaires étudiés. Dans les tumeurs plus avancées de stade III,

EGF-R n’est pas un facteur discriminant pour le pronostic. Les anomalies de certains de ces

marqueurs (EGF-R et Ki-67) apparaissent précocement, dès les stades prénéoplasiques, avec

un seuil se situant entre les lésions bronchiques de bas et de haut grades. La néoangiogénèse,

évaluée par le nombre des micro-vaisseaux, s’observe à partir des cancers micro-invasifs

tandis que c-erbB-2 n’apparaît qu’au stade invasif. Dans la séquence d’apparition des

anomalies génétiques conduisant au cancer invasif, l’atteinte d’EGF-R précède la

néoangiogénèse.

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Avant-propos - Pour faciliter la lecture, les tableaux et figures ont été placés à la fin du manuscrit dans

l’ordre d’apparition dans le texte.

- Afin d’alléger le texte, les références des articles inclus dans les méta-analyses n’ont pas été

reprises dans la bibliographie de la thèse mais sont disponibles dans les publications

originales, dont les tirés à part se trouvent à la fin de ce syllabus.

- Toutes les évaluations de marquages immunohistochimiques ont été réalisées en aveugle par

plusieurs investigateurs dont un anatomopathologiste. En cas de discordance, les lames ont été

revues conjointement pour obtenir un consensus.

- Toutes les abréviations sont définies par ordre alphabétique en début de texte.

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Abréviations

Adénoc = adénocarcinome ADN = acide désoxyribonucléique ARN = acide ribonucléique ARNm = acide ribonucléique messager CA IX = carbonic anhydrase IX CBNPC= cancer bronchique non à petites cellules CBPC = cancer bronchique à petites cellules CEP = centrosome CIS = carcinome in situ CMI = carcinome micro-invasif Cox-2 = cyclooxygénase 2 DL = dysplasie légère DM = dysplasie modérée DS = dysplasie sévère ELCWP = European Lung Cancer Working Party EGF = epidermal growth factor ( = facteur de croissance épidermique) EGF-R = epidermal growth factor receptor ( = récepteur à l’EGF) FHIT = fragile histidine triad FISH = fluorescence in situ hybridation FDA = Food and Drug Administration GB = globules blancs H = hyperplasie HCl = acide chlorhydrique HE = hématoxyline éosine hnRNP = heterogeneous nuclear ribonucleoprotein HR = hazard ratio IASLC = International Association for the Study of Lung cancer IC = intervalle de confiance Ig = immunoglobuline IHC = immunohistochimie IP = indice de performance ISS = international staging system kDa = kilodalton LDH = lactate déshydrogénase M = Molaire MA = méta-analyse Me = métaplasie min = minute MCM = minichromosome maintenance ml = millilitre mm = millimètre MP = micropapillomatose µg = microgramme µl = microlitre µm = micromètre N = nombre NA = non applicable

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NC = non conclusif No = normal NOR = nucleolar organizer region NMV = nombre de micro-vaisseaux NS = non significatif OMS = Organisation Mondiale de la Santé PCNA =proliferating cell nuclear antigen (antigène nucléaire de cellule proliférante) PCR = polymerase chain reaction PECAM 1 = platelet/endothelial cell adhesion molecule Ph alc = phosphatases alcalines PMN = polymorphonucléaires Pts = patients RAR = retinoic acid receptor Rb = rétinoblastome ROC = receiver operating curve SM = survie médiane TGFα = transforming growth factor α (facteur de croissance de transformation alpha) TRIS = tris(hydroxyméthyl)aminométhane TTF-1 = thyroid transforming factor 1 VEGF = vascular endothelial growth factor VPN = valeur prédictive négative VPP = valeur prédictive positive W = watt

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Table des matières 1. Introduction ………………………………………………………………….. p 14 2. Hypothèse ..................................................................................................... p 14 3. Travaux réalisés ……………………………………………………….. p 15

3.1.Tumeurs invasives ....................................................................................... p 15 3.1.1. Revues systématiques de la littérature avec méta-analyses du rôle pronostique pour la survie : guides pour la sélection des marqueurs biologiques ....................................................................... p 15

3.1.1.1. Méthodologie …………….………………………….…. p 15 3.1.1.1.1. Méthode de sélection des études ………………… p 15 3.1.1.1.2. Evaluation de la méthodologie des études sélectionnées …………………………………................................. p 16 3.1.1.1.3. Méthodes statistiques …………..………………. p 16

3.1.1.2. Résultats des méta-analyses ………………………..…. p 18 3.1.1.2.1. EGF-R ……………………………………..….……. p 18 3.1.1.2.1.1. Caractéristiques des études ……..…………... p 18 3.1.1.2.1.2. Résultats des études individuelles ………... p 19 3.1.1.2.1.3. Résultats de l’analyse qualitative …..……. p 20 3.1.1.2.1.4. Méta-analyse …………………………………….. p 20 3.1.1.2.1.5. Conclusions …………………….………………. p 22 3.1.1.2.2. c-erbB-2 ……………………………………….…….. p 22 3.1.1.2.2.1. Caractéristiques des études …………….….... p 22 3.1.1.2.2.2. Résultats des études individuelles ……….... p 22 3.1.1.2.2.3. Résultats de l’analyse qualitative ………… p 24 3.1.1.2.2.4. Méta-analyse ......................................................... p 24 3.1.1.2.2.5. Conclusions ......................................................... p 25 3.1.1.2.3. Ki-67 ....................................................................... p 26 3.1.1.2.3.1. Caractéristiques des études ............................. p 26 3.1.1.2.3.2. Résultats des études individuelles ……..…. p 26 3.1.1.2.3.3. Résultats de l’analyse qualitative ............... p 26 3.1.1.2.3.4. Méta-analyse ………………………………….… p 26 3.1.1.2.3.5. Conclusions ……………………….…………… p 29 3.1.1.2.4. Micro-vaisseaux …………………….……………… p 29 3.1.1.2.4.1. Caractéristiques des études ………………….. p 29 3.1.1.2.4.2. Résultats des études individuelles ……..…. p 29 3.1.1.2.4.3. Résultats de l’analyse qualitative .……….. p 29 3.1.1.2.4.4. Méta-analyse ……………………………………. p 31 3.1.1.2.4.5. Conclusions ……………………………………. p 32

3.1.2. Etudes de marqueurs biologiques sur des pièces chirurgicales p 33 3.1.2.1. Etude de l’expression protéique et génique d’EGF-R et de c-erbB-2 ……………………………………………………. p 33

3.1.2.1.1. Techniques de laboratoire et évaluation du marquage p 33 3.1.2.1.1.1. Immunohistochimie ………………………….. p 33 3.1.2.1.1.2. FISH ………………………….………………….. p 34 3.1.2.1.2. Statistiques ……………………………………. p 36 3.1.2.1.3. Résultats ……………………………………….…….. p 36 3.1.2.1.3.1. EGF-R ……….....................……………………….. p 36 3.1.2.1.3.2. c-erbB-2 ....................................................................... p 38 3.1.2.1.3.3. « Co-expression » d’EGF-R et de c-erbB-2……. p 39

12

3.1.2.1.4. Conclusions ……………………………………. p 40 3.1.2.2. Corrélation entre EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67 ............... p 40

3.1.2.2.1. Population étudiée ......................................................... p 40 3.1.2.2.2. Immunohistochimie …………..….…………..… p 40 3.1.2.2.3. Evaluation du marquage ……….………….……….. p 41 3.1.2.2.4 .Statistiques …………………….……………… p 41 3.1.2.2.5. Résultats ……………………………………..………. p 41 3.1.2.2.6. Conclusions ………………………………….… p 42

3.1.3. Etude de marqueurs biologiques sur des tumeurs plus avancées . p 42 3.1.3.1. Corrélation biopsies/tumeurs ........................................... p 43

3.1.3.1.1. EGF-R …..………………………………………….. p 43 3.1.3.1.1.1. Matériel et méthode …………………………… p 43 3.1.3.1.1.2. Interprétation des résultats immunohistochimiques p 43 3.1.3.1.1.3. Statistiques ……………………………………. p 44 3.1.3.1.1.4. Résultats …………………….……………………….. p 44 3.1.3.1.1.5. Conclusions ……………………………………. p 45

3.1.3.1.2. C-erbB-2 et Ki-67 ……………………………………. p 45 3.1.3.1.2.1. Immunohistochimie …………………………… p 45 3.1.3.1.2.2. Résultats …………………………………..... p 45 3.1.3.1.2.3. Conclusions ……………………………………. p 46

3.1.3.2. EGF-R dans les stades III ……………………………………. p 46 3.1.3.2.1. Matériel et méthode ………………….………………… p 47

3.1.3.2.2. Immunohistochimie …………………………………….. p 47 3.1.3.2.3. Statistiques ………………………………..…………….. p 47 3.1.3.2.4. Résultats ....................................................................... p 47 3.1.3.2.5. Conclusions ……………………………….…………….. p 48

3.2. Lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces . p 51 3.2.1. EGF-R dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces ……………………………………………………..… p 51

3.2.1.1. Population étudiée …………………………..…………………. p 51 3.2.1.2. Préparations des échantillons et immunohistochimie ……..…. p 51 3.2.1.3. Interprétation des résultats immunohistochimiques ……..…. p 52 3.2.1.4. Statistiques ……………………………………………………….. p 52 3.2.1.5. Résultats ……………………………………………………….. p 54 3.2.1.6. Conclusions ……………………………………………………….. p 57

3.2.2. C-erbB-2 dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces ……………………………………………………….. p 58

3.2.2.1. Population étudiée, immunohistochimie ………………….. p 58 3.2.2.2. Résultats ……………………………………………………….. p 58 3.2.2.3. Conclusions ……………………………………………………….. p 59

3.2.3. Ki-67 dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces ……………………………………………………….. p 58

3.2.3.1. Population étudiée …………………………..…………………. p 58 3.2.3.2. Immunohistochimie ……………………………..………………. p 59 3.2.3.3. Interprétation des résultats immunohistochimiques ……..…. p 59 3.2.3.4. Statistiques ……………………………………………………….. p 59 3.2.3.5. Résultats ……………………………………..…………………. p 61 3.2.3.6. Conclusions ……………………………………………………….. p 63

3.2.4. Nombre de micro-vaisseaux dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces …………………………… p 64

13

3.2.4.1. Population étudiée ……………………………………………… p 64 3.2.4.2. Immunohistochimie ……………………………………………… p 64 3.2.4.3. Interprétation de l’immunohistochimie …………………. p 65 3.2.4.4. Statistiques ………………………………………………………. p 65 3.2.4.5. Résultats ………………………………………………………. p 65 3.2.4.6. Conclusions ………………………………………………………. p 68

4. Synthèse, limitations des études et discussion ………… p 68 4.1. Revues systématiques de la littérature avec méta-analyses ……....... p 69 4.2. Etude de marqueurs biologiques sur des pièces chirurgicales ………… p 70 4.2.1. Etude de l’expression protéique et génique d’EGF-R et de c-erbB-2 p 70

4.2.2. Corrélation entre EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67 …………………. p 73 4.3. Etude de marqueurs biologiques sur des tumeurs plus avancées ……... p 74

4.3.1. Corrélation biopsies/tumeurs ……………………………………. p 74 4.3.2. EGF-R dans les stades III ……………………………………………… p 76

4.4. Lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces ……… p 77 4.4.1. EGF-R dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces ……………………………………………….………. p 77 4.4.2. c-erbB-2 dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces ……………………………………………….………. p 79 4.4.3. Ki-67 dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces ……………………………………………….………. p 79 4.4.4. Nombre de micro-vaisseaux dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces ……………………………………. p 83 4.4.5. Autres anomalies des lésions bronchiques prénéoplasiques décrites dans la littérature ………………………….………………………….… p 84

5. Conclusions ……………..………………………………………………….. p 88

6. Perspectives ………………………………………………………..……….. p 88

7. Bibliographie ………………………………………………………………… p 90

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1. Introduction Le cancer bronchique est une des tumeurs les plus fréquentes et les plus mortelles: en

Europe, il a atteint, en 2004, plus de 380 000 personnes et causé plus de 340 000 morts (1).

Les cancers bronchiques non à petites cellules (épithélioma épidermoïde et adénocarcinome)

sont les types histologiques les plus fréquents. Malgré les progrès réalisés, seuls les patients se

présentant avec un stade précoce de cancer bronchique pourront survivre à long terme: le taux

de guérison à 5 ans pouvant atteindre plus de 70 % dans les stades IA (2) et près de 95 % dans

les cancers radio-occultes (3). Malheureusement, la majorité des patients se présentent à un

stade avancé de la maladie lors du diagnostic. Le traitement consiste alors en chimio- et/ou

radiothérapie (4) dont l’efficacité reste limitée et beaucoup décèderont dans l’année du

diagnostic. Ce taux de mortalité important pourrait être réduit par l’arrêt du tabagisme, par la

détection plus précoce des cancers bronchiques et par de nouveaux traitements tels que les

thérapies biologiques ciblées. Une meilleure connaissance de la carcinogenèse bronchique et

de ses bases moléculaires est indispensable à la réalisation de ces objectifs.

Le développement d’un cancer bronchique résulte de l’accumulation d’altérations

génétiques et moléculaires séquentielles et/ou additives incluant des proto-oncogènes, des

gènes suppresseurs de tumeurs, des facteurs de prolifération et des protéines impliquées dans

les mécanismes d’angiogenèse et d’apoptose. Ces anomalies ont été détectées à des stades

précoces de l’évolution néoplasique. Elles peuvent déjà être présentes dans les lésions

bronchiques prénéoplasiques ou néoplasiques précoces des épithélioma épidermoïdes

(hyperplasie, métaplasie, dysplasie légère, modérée ou sévère et carcinome in situ) et des

adénocarcinomes (hyperplasie adénomateuse atypique), voire même dans l’épithélium

(phénotypiquement normal) de fumeurs avant même que n’apparaissent les anomalies

morphologiques (5).

Le rôle précis des facteurs biologiques impliqués dans le cancer bronchique est encore

mal compris aussi bien en termes de carcinogenèse qu’en termes de pronostic. Nos travaux

s’inscrivent dans l’évaluation de l’implication de certains d’entre eux dans leur

développement et dans le pronostic des cancers bronchiques non à petites cellules.

2. Hypothèse Le rôle pronostique des facteurs biologiques impliqués dans le cancer bronchique n’a

jusqu’à présent été étudié que dans les cancers bronchiques invasifs dans de petits groupes de

patients. Nous avons postulé que leur rôle pourrait être plus précoce (dès les stades

15

prénéoplasiques) dans la carcinogenèse bronchique. Pour étudier ce problème, nous avons,

dans un premier temps, réalisé des revues systématiques de la littérature sur plusieurs facteurs

biologiques et essayé de confirmer leur utilité potentielle en tant que facteur pronostique pour

la survie des patients atteints de cancer bronchique non à petites cellules. Dans un second

temps, nous avons voulu étudier le rôle de certains d’entre eux dans l’évolution du cancer

bronchique et, plus particulièrement, dans le développement d’une de ses formes,

l’épithélioma épidermoïde, afin de démontrer que certaines de ces anomalies biologiques

apparaissaient à des stades précédant le cancer invasif et que leur rôle dans la carcinogenèse

bronchique serait donc précoce.

3. Travaux réalisés 3.1. Tumeurs invasives

3.1.1. Revues systématiques de la littérature avec méta-analyses du rôle

pronostique pour la survie: guides pour la sélection des marqueurs biologiques

Afin de guider notre choix pour l’étude ultérieure de certains marqueurs biologiques et

d’évaluer leur rôle pronostique pour la survie chez les patients atteints de CBNPC, nous avons

dans un premier temps réalisé une revue de la littérature. La réalisation préalable de méta-

analyses de la littérature nous a permis d’opter pour une série de marqueurs à étudier en

démontrant leur intérêt potentiel grâce à la puissance apportée par l’agrégation de grands

nombres de cas. En effet, les lésions bronchiques prénéoplasiques que nous projetions

d’étudier sont de tout petits prélèvements. Leur faible nombre et leur taille très réduite les

rendent particulièrement précieux et nous imposent d’être économes dans leur utilisation.

3.1.1.1. Méthodologie

3.1.1.1.1. Méthode de sélection des études

Pour être éligibles pour une revue systématique, les études devaient concerner

uniquement le cancer bronchique primitif, évaluer l’association entre l’expression du

marqueur et la survie des patients, analyser l’ADN/ARNm ou la protéine dans la tumeur

primitive et/ou dans le sérum, et enfin être publiée dans la littérature anglophone ou

francophone, langue accessible à tous les lecteurs. Les articles ont été identifiés par une

recherche dans la base de données MEDLINE, complétée par la bibliographie personnelle des

auteurs et les références mentionnées dans les articles sélectionnés. Lorsqu’un auteur

rapportait une même cohorte de patients dans plusieurs publications, seule la plus récente ou

la plus complète était incluse dans l’analyse afin d’éviter le recoupement entre les cohortes.

16

3.1.1.1.2. Evaluation de la méthodologie des études sélectionnées

Afin d'analyser la qualité méthodologique et de garantir une interprétation correcte des

résultats, les articles ont été lus par plusieurs investigateurs et notés selon une échelle

d'évaluation de l’ELCWP spécialement adaptée aux facteurs pronostiques biologiques du

cancer du poumon (cf annexe). Le score global, sur 40 points, évalue 4 aspects

méthodologiques, notés chacun sur 10 points: le modèle scientifique, la description des

techniques utilisées pour révéler l’expression du marqueur, la "généralisabilité" (possibilité

d’extrapolation des résultats à une population non sélectionnée) et l’analyse des résultats de

l’étude. Plus le score global, exprimé en %, est élevé, meilleure est supposée la qualité

méthodologique de l’étude. Les études éligibles pour la revue sont appelées "éligibles" et

celles retenues pour la méta-analyse sont dites "évaluables". Seules les études rapportant les

résultats de la survie en fonction du marqueur investigué ont été considérées pour la méta-

analyse.

3.1.1.1.3. Méthodes statistiques

Le résultat d’une étude est considéré comme significatif si la probabilité de signification

associée au test statistique comparant les distributions de survie entre les groupes exprimant

ou n’exprimant pas le marqueur est < 0,05. L’étude est considérée « négative » lorsque

l’expression du marqueur est de mauvais pronostic pour la survie et « positive » dans le cas

contraire. Les études restantes sont considérées comme « non significatives ».

La corrélation entre les scores de méthodologie (ou deux autres variables continues) est

calculée par un coefficient de corrélation de Spearman. Des tests non paramétriques sont

utilisés pour comparer la distribution du score de méthodologie en fonction de la valeur d’une

variable discrète (test U de Mann-Whitney pour une variable binaire et test de Kruskall-Wallis

pour une variable comprenant plus de deux catégories).

Pour l’agrégation quantitative des résultats de survie, l'estimation de l'effet de

l'expression du marqueur est mesurée par le rapport des risques instantanés (Hazard ratio).

Celui-ci, de même que sa variance, peut être rapporté dans les résultats d’une étude donnée. Si

tel n’est pas le cas, il doit être calculé à partir des paramètres de l’analyse univariée (nombre

d'événements et statistique du logrank ou sa probabilité de signification, intervalle de

confiance à 95 % du HR). Si ces paramètres ne sont pas disponibles, le calcul approximatif de

l’estimation du HR se fait grâce au nombre total d’événements et à la statistique du logrank,

ou grâce à la valeur de p. Enfin, si les seuls résultats sont sous la forme d’une représentation

graphique des distributions de survie, la reconstruction de l’estimation du HR et de sa

variance se fait par extraction des taux de survie à des temps spécifiques, en considérant que

17

le taux de patients perdus de vue est constant durant tout le suivi (6). La méthode publiée par

Peto (7) est appliquée pour combiner les estimations des HR individuels en un HR global.

Cette méthode consiste en un modèle à effets fixes supposant l'homogénéité des HR

individuels. Afin de tester cette homogénéité, un test de chi carré d'hétérogénéité est réalisé.

Si l'hypothèse d'homogénéité est rejetée, nous utilisons un modèle à effets aléatoires. Par

convention, un HR >1 correspond à une réduction de la survie dans le groupe exprimant le

marqueur.

Annexe : Echelle de qualité évaluant les revues systématiques de facteurs biologiques 2 points 1 point 0 point A. Modèle scientifique Définition de l’objectif Primaire Secondaire Non défini Considérations statistiques Clairement définies

(évaluation du nombre de patients à inclure…)

Evaluation du nombre de patients à inclure selon le nombre de variables étudiées

Non définies

Modèle scientifique Prospectif Rétrospectif Non défini Définition de la survie Complète Incomplète Non mentionnée ou

inadéquate Méthodes statistiques Clairement définies Incomplètes Non définies B. Description des techniques

Tests biologiques Double aveugle Simple aveugle Non mentionné ou pas en aveugle

Nature du facteur dosé Clairement mentionnée Douteuse ou incomplète Non mentionnée Conservation des échantillons Tissu frais ou fixation et

conservation définie Douteuse ou incomplète Non mentionnée ou

inadéquate Description de la procédure de test

Clairement définie Incomplète Non mentionnée ou inadéquate

Contrôles négatifs et positifs Clairement mentionnés Incomplets Non mentionnés ou inadéquats

Contrôle de reproductibilité Clairement défini Douteux ou incomplet Non mentionné ou inadéquat

Niveau de positivité du test Validé Arbitraire Non mentionné C. Généralisabilité Critères de sélection des patients

Complets Partiels Non mentionnés

Caractéristiques des patients Complètes Partielles Non mentionnées Bilan initial Défini et complet Partiel Non mentionné Caractéristiques du traitement

Complètes Partielles Non mentionnées

Source des échantillons Clairement définie Extrapolable Non mentionnée Nombre de prélèvements non évaluables avec causes

Complet et adéquat Partiel ou inadéquat Non mentionné

D. Analyse des résultats Caractéristiques du suivi Clairement définies Partielles ou inadéquates Non mentionnées Survie selon le marqueur biologique

Clairement définie Partielle ou inadéquate Non mentionnée

Analyse univariée Avec HR et IC Sans HR et IC Non mentionnée Analyse multivariée Avec HR et IC Sans HR et IC Non mentionnée

18

3.1.1.2. Résultats des méta-analyses

3.1.1.2.1. EGF-R

EGF-R (ou c-erbB-1, le récepteur du facteur de croissance épidermique), une

glycoprotéine transmembranaire de 170 kDa, résulte de la transcription de l’oncogène HER-

1/erbB-1. Son domaine extracellulaire est le site de liaison de nombreux polypeptides : facteur

de croissance épidermique (epidermal growth factor ou EGF), facteur de croissance de

transformation alpha (transforming growth factor α ou TGFα), amphiréguline, bêtacelluline,

protéine de liaison à l’héparine (heparin binding protein), épiréguline et facteur de croissance

du virus de la vaccine (vaccinian virus growth factor). La liaison d’un de ces ligands au

domaine extracellulaire d’EGF-R entraîne une homo- ou une hétérodimérisation d’EGF-R

avec erbB-2, erbB-3 ou erbB-4 et une autophosphorylation, premier événement d’une cascade

de signalisations impliquée dans le contrôle de la division cellulaire, de la motilité cellulaire,

de l’adhésion, de l’invasion et de l’angiogenèse. Dans les cancers bronchiques non à petites

cellules, la surexpression d’EGF-R est rapportée dans 24 à 89 % des carcinomes épidermoïdes

et dans 23 à 46 % des adénocarcinomes. L’amplification et l’existence de mutations d’EGF-R

est décrite dans un faible pourcentage de CBNPC. De plus, les premières études cliniques

suggérant qu’EGF-R pouvait être une cible potentielle pour une thérapeutique ciblée sont

apparues au début des années 2000. Tout ceci nous a conduits à étudier le rôle de ce facteur

dans les CBNPC.

3.1.1.2.1.1. Caractéristiques des études

Vingt et une études, publiées entre 1989 et 2001, ont été répertoriées ; 5 d’entre elles ont

été exclues car elles étudiaient les mêmes cohortes de patients que d’autres études déjà

incluses (tableau 1). Deux mille huit cent dix patients étaient inclus dans ces travaux.

Quatorze publications concernaient des cancers bronchiques non à petites cellules tous sous-

types histologiques confondus, une uniquement des adénocarcinomes et une uniquement des

carcinomes épidermoïdes. Les patients traités par chirurgie pour une maladie loco-régionale

représentaient la majorité des cas. L’immunohistochimie était la technique la plus

fréquemment utilisée pour mettre EGF-R en évidence mais différents anticorps ont été

utilisés: un anticorps monoclonal de souris (Triton, Alameda, CA, USA), le clone EGFR 113

(de Novocastra, Newcastle, Royaume Uni), un anticorps EGF-R 1 (Amersham,

Buckinghamshire, Royaume Uni), un anticorps EGF-R Ab-4 (Dianova, Hambourg,

Allemagne), un anticorps de souris (Transformation Research, Framingham, USA), un

anticorps monoclonal 014H4819 (Sigma, St Louis, USA) ou des anticorps personnels.

19

Tableau 1: Caractéristiques des études de la littérature ayant évalué le rôle de

l’expression d’EGF-R pour la survie des patients atteints de cancer bronchique: seize

études, publiées entre 1989 et 2001, et incluant 2810 patients ont été répertoriées . Quatorze

études concernaient des CBNPC de tous sous-types histologiques, une uniquement des

adénocarcinomes et une uniquement des carcinomes épidermoïdes. Les patients traités par

chirurgie pour une maladie loco-régionale représentaient la majorité des cas. L’IHC était la

technique la plus fréquemment utilisée pour mettre EGF-R en évidence.

Auteur Année Histologie Stade N pts

Technique Estimation de l’HR Résultat

Brabender 2001 CBNPC I - IIIA 83 PCR HR + IC 95% NS Cox 2000 CBNPC I - IIIA 169 IHC logrank + n

évènements NS

D'Amico 2000 CBNPC I 408 IHC logrank + n évènements

NS

Dazzi 1989 CBNPC I - ? 152 IHC Pas de données NS

Fontanini 1998 CBNPC I - IIIA 195 IHC logrank + n événements

NS

Fu 1999 CBNPC I - IIIB 158 IHC Pas de données NS Giatromanola

ki 1996 CBNPC I - II 107 IHC Pas de données NS

Greatens 1998 CBNPC I - IV 101 IHC Pas de données NS Koukourakis 1997 CBNPC I - II 107 IHC Pas de données NS

Ohsaki 2000 CBNPC I - IV 290 IHC Courbes de survie négatif Pastorino 1997 CBNPC I 505 IHC HR + IC 95% NS Pfeiffer 1998 CBNPC I - IV 180 IHC Courbes de survie NS Rush 1997 CBNPC I - IIIA 96 Northern +

IHC Courbes de survie positif

Tateishi 1994 Adéno- carcinomes

I - IV 119 IHC Courbes de survie NS

Veale 1993 CBNPC I - III 19 Compétition

ligand HR + IC 95% négatif

Volm 1998 Carcinomes épidermoïdes

I - III 121 IHC Courbes de survie négatif

3.1.1.2.1.2. Résultats des études individuelles

Trois études étaient “négatives”, une était “positive” et 12 “non significatives”.

Selon le seuil utilisé par les auteurs, EGF-R était surexprimé dans la tumeur chez 51 % des

patients évaluables, chez 46 % dans l’étude sur les adénocarcinomes et chez 82 % dans

l’étude sur les carcinomes épidermoïdes. Une surexpression d’EGF-R était retrouvée

20

respectivement dans 50 %, 54 % et 49 % des patients présentant une maladie au stade I, I à III

ou I à IV.

3.1.1.2.1.3. Résultats de l’analyse qualitative

Le score de qualité global des études variait de 25,8 % à 70,7 % avec une médiane de

56,3 % (tableau 2). Il n’y avait pas de différence statistiquement significative entre les études

évaluables ou non pour la méta-analyse en termes de score de qualité (p = 0,19). De même,

aucune différence statistiquement significative n’était mise en évidence entre les quatre

études significatives et les douze non significatives (p = 0,44).

Tableau 2 : Score de qualité des études ayant évalué le rôle de l’expression d’EGF-R pour

la survie des patients atteints de cancer bronchique éligibles pour la méta-analyse: nous

n’avons pas trouvé de différence statistiquement significative entre les études évaluables ou

non pour la méta-analyse. De même, aucune différence statistiquement significative n’a pu être

mise en évidence entre les études significatives et les non-significatives.

Etudes (nombre) Modèle

scientifique(/10)

Méthode de laboratoire

(/10)

Générali- sabilité

(/10)

Analyse des

résultats (/10)

Score global (%)

Toutes (16) 4,00 6,43 6,67 5,00 56,34 Evaluables pour la MA (11) 4,00 7,14 6,67 5,00 61,70 Non évaluables pour la MA (5) 4,00 5,00 5,00 3,75 48,84 P = 0,28 0,11 0,61 0,14 0,19 Significatives (4) 5,00 6,43 5,42 5,00 54,70 Non significatives (12) 4,00 6,43 6,67 5,62 56,34 P = 0,36 0,85 0,27 0,95 0,90 Etudes significatives dans la MA (4) 5,00 6,42 5,41 5,00 54,70 Etudes non significatives dans la MA (7) 4,00 7,14 6,67 7,50 61,70 P = 0,57 0,70 0,13 0,57 0,44

3.1.1.2.1.4. Méta-analyse

Sur les 16 études éligibles pour la revue systématique, 5 n’ont pu être agrégées dans la

méta-analyse par manque de données pour calculer l’HR. Dès lors, la méta-analyse a été

limitée à 11 études et 2185 patients. Le test d’hétérogénéité était significatif (p = 0,02). Nous

avons donc calculé le HR combiné par une méthode à effet aléatoire et obtenu une valeur qui

n’était pas statistiquement significative: 1,14 (IC 95% : 0,94-1,39) (Figure 1). Afin de

diminuer l’hétérogénéité des études, les 8 études utilisant l’immunohistochimie (IHC) ont été

considérées, les résultats de la méta-analyse atteignaient ainsi juste la significativité: HR =

1,13 (IC 95% : 1,00-1,28) (Figure 2) en faveur des tumeurs ne surexprimant pas EGF-R.

21

Figure 1 : Méta-analyse des études de la littérature ayant évalué le rôle de l’expression

d’EGF-R pour la survie des patients atteints de CBNPC : le résultat ne montre pas de

différence significative en termes de survie pour les patients dont la tumeur surexprime ou

non EGF-R. En effet, le HR est égal à 1,14 (0,93-1,39).

Un HR <1 implique un bénéfice de survie pour le groupe de patients dont la tumeur exprime

EGF-R. La taille du rectangle est proportionnelle au nombre de patients inclus dans l’étude.

Le centre du losange correspond au HR combiné de la méta-analyse et ses extrémités à

l’intervalle de confiance à 95 %.


d’EGF-R pour la survie des patients atteints de CBNPC par IHC : le résultat atteint juste

la signification statistique en faveur des tumeurs ne surexprimant pas EGF-R avec un HR égal

à 1,13 (1,00-1,28)

22

3.1.1.2.1.5. Conclusions

Cette étude suggère que les patients dont la tumeur ne surexprime pas EGF-R en

immunohistochimie pourraient avoir une survie légèrement meilleure. Cet effet n’est pas

retrouvé quand toutes les techniques de détection sont regroupées (8).

3.1.1.2.2. c-erbB-2

Nous avons ensuite voulu étudier c-erbB-2 qui est une protéine de type récepteur

tyrosine kinase appartenant à la même famille qu’EGF-R. Le gène dominant HER-2/neu est

localisé chez l’homme sur le bras long (q21) du chromosome 17. Ce gène code pour une

protéine de 185 kDa (p185 neu ou c-erbB-2) similaire à EGF-R. Cette glycoprotéine

transmembranaire de 1255 acides aminés est composée de 3 domaines: un extra-cellulaire, un

transmembranaire et un intracellulaire avec activité tyrosine kinase. Lorsqu’un ligand de type

EGF (il n’existe pas de ligand spécifique connu pour c-erbB-2) se lie à un récepteur de la

famille d’EGF-R (c-erbB-1, 3 ou 4), il y a hétérodimérisation de ce récepteur avec c-erbB-2.

C-erbB-2 est nécessaire à la régulation de la croissance cellulaire normale et à la

différenciation. L’amplification d’HER-2 peut mener à une surexpression de ce récepteur et à

une formation de plus d’hétérodimères et être impliquée dans le développement de nombreux

cancers dont le cancer bronchique. La protéine c-erbB-2, p185, est exprimée dans 20 à 30 %

des cancers bronchiques non à petites cellules et plus particulièrement dans les

adénocarcinomes.


Trente-neuf études étaient éligibles pour cette revue systématique. Neuf articles ont été

exclus car comportant des cohortes de patients identiques. Notre revue a inclus 4582 patients.

Les caractéristiques principales des publications éligibles sont rapportées dans la tableau 3.

Vingt-quatre d’entre elles concernaient des CBNPC de tous sous-types histologiques

confondus, cinq des adénocarcinomes uniquement et une des cancers bronchiques à petites

cellules. La plupart des observations concernaient des patients présentant une maladie

locorégionale (stades I à IIIB). De même, la plupart des études utilisaient

l’immunohistochimie pour mettre c-erbB-2 en évidence.


Douze études concernant les CBNPC étaient “négatives”, une était “positive” et seize

“non significatives”. Selon le seuil utilisé par les auteurs, c-erbB-2 était surexprimé dans 31 %

des CBNPC et dans 30 % des adénocarcinomes. Une surexpression de c-erbB-2 était retrouvée

respectivement dans 32 % des patients avec une maladie locorégionale et dans 36% des

maladies avancées.

23

Tableau 3 : Caractéristiques des 30 études de la littérature ayant évalué le rôle de

l’expression de c-erbB-2 pour la survie des patients atteints de cancer bronchique: 30

études différentes, incluant 4582 patients étaient éligibles pour cette revue systématique.

Vingt-quatre d’entre elles concernaient des CBNPC de tous sous-types, cinq des

adénocarcinomes uniquement et une des cancers bronchiques à petites cellules. La plupart des

études concernaient des patients présentant une maladie locorégionale. De même, une grande

majorité des études utilisaient l’IHC pour mettre c-erbB-2 en évidence.

Auteur Année Histologie Stade N pts

Technique Estimation HR

Résultat

2001 CBNPC III-IV 84 ELISA (+ IHC)

Logrank + n événements

Négatif

Brabender 2001 CBNPC I-IIIA 83 PCR Courbes de survie Négatif Cantero 2000 CBNPC I-IIIA 102 ELISA HR + IC Négatif

Carbognani 2002 CBNPC I-IIIA 78 IHC Pas de données NS D’Amico 1999 CBNPC I 408 IHC Logrank + n

événements Négatif

Fu 1999 CBNPC I-IIIB 158 IHC Pas de données NS Giatromanolaki 1996 CBNPC I-II 107 IHC Courbes de survie NS

Graziano 1998 CBNPC IIIA 47 IHC Pas de données NS Greatens 1998 CBNPC I-IV 101 IHC Pas de données Positif

Han 2002 CBNPC I 85 IHC Courbes de survie Négatif Harpole 1996 CBNPC I 275 IHC Logrank + n

événements Négatif

Hirsch 2002 CBNPC I-IIIA 187 IHC (+FISH)

Courbes de survie NS

Hsieh 1998 Adénoc I 42 IHC Logrank + n événements

Négatif

Kern 1990 CBNPC I-IV 44 IHC HR + IC Négatif Kim 1998 CBNPC I-IV 238 IHC HR + IC NS

Kwiatkowski 1998 CBNPC I 243 IHC Logrank + n événements

NS

Liao 2001 CBNPC I-IIIA 127 IHC Logrank + n événements

NS

MacKinnon 1997 Adénoc ? 162 IHC Pas de données NS Moldvay 2000 CBNPC I-IV 227 IHC Logrank + n

événements NS

Nemunaitis 1998 Adénoc I-IV 103 IHC Pas de données NS Pastorino 1997 CBNPC I 483 IHC HR + IC NS Pfeiffer 1996 CBNPC I-IV 186 IHC Courbes de survie NS

Potti 2002 CBPC Etendu 193 IHC Courbes de survie Négatif Schneider 2000 CBNPC I-IIIA 103 IHC Pas de données Négatif Selvaggi 2002 CBNPC I-III 130 IHC HR + IC Négatif

Shou 2001 CBNPC I-III 111 IHC Courbes de survie NS Tateishi 1994 Adénoc I-IV 119 IHC Courbes de survie Négatif Visscher 1997 Adénoc I-IV 31 IHC Pas de données NS

Volm 1993 CBNPC I-III 241 IHC Pas de données NS Yu 1997 CBNPC I-IIIA 116 IHC Courbes de survie Négatif

24


Le score de qualité global variait de 37,4 % à 82,6 % avec une médiane de 57,6 %

(tableau 4). Il n’y avait pas de différence statistiquement significative entre les études

évaluables ou non pour la méta-analyse mais une différence statistiquement significative a été

mise en évidence entre les études significatives et les études non significatives (p = 0,03),

principalement en terme d’analyse des résultats.

Tableau 4 : Score de qualité des études ayant évalué le rôle de l’expression de c-erbB-2

pour la survie des patients atteints de cancer bronchique éligibles pour la méta-analyse :il

n’y avait pas de différence statistiquement significative entre les études évaluables ou non pour

la méta-analyse en termes de score de qualité mais une différence statistiquement significative

a été mise en évidence entre les études significatives et les études non significatives,

principalement en terme d’analyse des résultats.

Etudes (nombre) Modèle

scientifique(/10)


(/10)

Générali- sabilité

(/10)

Analyse des

résultats (/10)

Score global (%)

Toutes (30) 5,00 6,42 6,66 5,62 57,58 Evaluables pour la MA (21) 5,00 6,42 6,66 6,25 61,07 Non évaluables pour la MA (9) 5,00 6,42 7,50 3,75 54,34 P = 0,15 0,94 0,83 0,02 0,09 Significatives (14) 5,00 6,42 6,66 6,87 61,19 Non significatives (16) 4,50 6,07 6,66 5,00 52,64 P = 0,30 0,26 0,27 0,03 0,03 Etudes significatives dans la MA (12) 5,00 6,42 6,66 7,50 61,19 Etudes non significatives dans la MA (9) 5,00 6,42 6,66 6,25 53,18 P = 0,91 0,47 0,59 0,14 0,22


Douze des quatorze études significatives et neuf des seize non significatives ont été

incluses dans la méta-analyse. Lorsque l’on considérait uniquement les vingt études

concernant les CBNPC, le test d’hétérogénéité était significatif (p = 0,001). Nous avons donc

calculé le HR global en utilisant la méthode à effets aléatoires et obtenu une valeur

statistiquement significative: HR = 1,55 (IC 95% : 1,29-1,86) (Figure 3). Lorsque nous

considérions uniquement les études utilisant l’immunohistochimie, l’hétérogénéité était

toujours présente (p < 0,001) et le résultat statistiquement significatif: HR 1,46 (95% IC: 1,19-

1,78).

25


de c-erbB-2 pour la survie des patients atteints de CBNPC : le résultat montre que les

patients dont la tumeur surexprime c-erbB-2 ont une survie statistiquement plus courte que

ceux dont la tumeur ne surexprime pas cette protéine (HR = 1,55 avec un IC 95 % : 1,29-

1,86).


Cette étude suggère que les patients dont la tumeur ne surexprime pas c-erbB-2 ont une

meilleure survie (9).

26

3.1.1.2.3. Ki-67

EGF-R étant impliqué dans la prolifération tumorale, nous avons voulu étudier cet

aspect dans la cancer bronchique et voir si un marqueur de la prolifération était un facteur

pronostique. En routine pour évaluer l'activité proliférative, les anticorps dirigés contre Ki-67

sont utilisés. Ki-67 est une protéine nucléaire et nucléolaire exprimée spécifiquement au cours

de tout le cycle cellulaire des cellules proliférantes à l'exception de la phase G0 où son

expression est absente. La fonction exacte de cette protéine est inconnue mais il semble qu'elle

soit un facteur important pour la progression dans le cycle de division cellulaire.


Quarante-deux études publiées entre 1991 et 2002, ont été répertoriées ; cinq d’entre

elles ont été exclues car elles incluaient les mêmes cohortes de patients que d’autres études

déjà incluses. Les caractéristiques de ces études sont répertoriées au tableau 5. Vingt-neuf

concernaient des cancers bronchiques non à petites cellules de tous sous-types histologiques

confondus, 5 tous les types de cancers bronchiques, une uniquement des cancers bronchiques à

petites cellules et deux uniquement des tumeurs carcinoïdes. Les patients traités par chirurgie

pour un CBNPC loco-régional représentaient la majorité des cas. L’immunohistochimie était

la seule technique utilisée pour mettre Ki-67 en évidence mais les anticorps utilisés variaient

selon les études : clone MIB-1 dans 68 % des cas et clone de chez DAKO dans 16 %.


Quinze études étaient “négatives” et 22 “non significatives”. Selon le seuil utilisé par les

auteurs, Ki-67 était exprimé dans 49 % des tumeurs.


Le score de qualité global variait de 21,2 % à 84,1 % avec une médiane de 50,6 %

(tableau 6). Il n’y avait pas de différence statistiquement significative entre les études

significatives et les études non significatives (p = 0,42) mais bien entre les études évaluables

ou non pour la méta-analyse (p = 0,002) en termes de score de qualité.


Pour les CBNPC (16 études, 1863 patients), l’agrégation des résultats (figure 4) a mis

en évidence que les patients dont la tumeur exprime Ki-67 avaient un moins bon pronostic

(HR : 1,55 ; IC 95% 1,34-1,78). Il n’y avait pas d’hétérogénéité entre le études (p=0,12). Ceci

a été aussi montré pour les adénocarcinomes (HR : 2,45 ; IC 95% 1,66-3,64), les carcinomes

épidermoïdes (HR : 2,47 ; IC 95% 1,32-4,57), les stades I (HR : 1,56 ; IC 95% : 1,26-1,93) et

les stades I-III (HR : 1,79 ; IC 95% 1,40-2,28)

27

Tableau 5 : Caractéristiques des 37 études de la littérature ayant évalué le rôle de

l’expression de Ki-67 pour la survie des patients atteints de cancer bronchique : vingt-neuf

concernaient des cancers bronchiques non à petites cellules de tous sous-groupes histologiques,

une uniquement des cancers bronchiques à petites cellules et deux uniquement des tumeurs

carcinoïdes. Les patients traités par chirurgie pour un CBNPC loco-régional représentaient la

majorité des cas. L’immunohistochimie était la seule technique utilisée pour mettre Ki-67 en

évidence.

Auteur Année Histologie Stade N pts Estimation HR Résultat Bellotti 1997 CBNPC I à II 67 Pas de données NS Bohm 1996 carcinoïde I à IV 59 Pas de données négatif Cagini 2000 CBNPC I - II 99 Logrank + n événements NS Carbognani 2002 CBNPC I à IIIA 78 Logrank + n événements NS Carvalho 2000 adénoc I à IV 45 Pas de données NS Costes 1995 carcinoïde I - ? 47 Logrank + n événements négatif D'Amico 1999 CBNPC I 408 Logrank + n événements NS Dazzi 1999 CBNPC I à IIIB 76 Pas de données NS Demarchi 2000 adénoc I à IIIB 64 Données individuelles négatif Dingemans 1999 CBPC Tous 93 Logrank + n événements négatif Dingemans 2001 CBNPC III à IV 38 Logrank + n événements NS Ferreira 2001 CBNPC I à IIIA 144 Pas de données NS Fontanini 1996 CBNPC I à IIIA 70 Courbes de survie NS Giaccone 1995 CBNPC I à IV 33 Pas de données NS Giatromanolaki 1996 CBNPC I à II 107 Pas de données NS Harpole 1995 CBNPC I 271 Courbes de survie négatif Hayashi 2001 adénoc I à IV 98 Pas de données négatif Hommura 2000 CBNPC I - II 109 Courbes de survie négatif Ishida 1997 adénoc I à IIIA 114 Courbes de survie négatif Kawai 1994 Tous I à III 165 Pas de données NS Komaki 1998 CBNPC N1 137 Pas de données NS Mehdi 1998 CBNPC I à II 203 Courbes de survie NS Minami 2002 adénoc I 47 Logrank + n événements négatif Nguyen 2000 CBNPC I à IV 49 Courbes de survie NS Pelosi 2001 CBNPC I 222 Pas de données négatif Pence 1993 CBNPC I à IV 61 Courbes de survie négatif Puglisi 2001 CBNPC I à IIIB 74 Courbes de survie NS Pujol 1996 Tous I à IV 133 Courbes de survie NS Ramnah 2001 CBNPC I à IV 221 HR NS Rigau 2002 CBNPC I à IV 86 Pas de données NS Santinelli 1999 Tous I à II 42 Pas de données NS Shiba 2000 CBNPC I à III 156 Logrank + n événements négatif Shiba 2001 Tous I à IIIB 57 Courbes de survie négatif Soomro 1998 CBNPC I à IV 105 Courbes de survie négatif Tsoli 2001 CBNPC I à III 69 Données individuelles NS Tungekar 1991 Tous IA et IIA 187 Courbes de survie négatif Van de Vaart 2000 CBNPC I à II A 27 HR NS

28

Tableau 6 : Score de qualité des études ayant évalué le rôle de l’expression de Ki-67 pour

la survie des patients atteints de cancer bronchique éligibles pour la méta-analyse : il n’y

avait pas de différence statistiquement significative entre les études significatives et les études

non significatives mais bien entre les études évaluables ou non pour la méta-analyse en terme

de score de qualité.

Etudes (nombre) Modèle scientifique

(/10)


(/10)

Générali- sabilté (/10)

Analyse des résultats

(/10)

Score global (%)

Toutes les études (37) 4,0 5 6,7 6,2 50,6 Evaluables pour la MA (20) 5,0 5,7 6,7 7,5 60,7 Non évaluables pour la MA (17) 3,0 4,3 5,8 5,0 45,8 P = 0,009 0,009 0,57 0,004 0,002 Significatives (15) 4,0 5,0 6,7 6,2 52,5 Non significatives (22) 3,5 5,0 6,2 5,0 49,2 P = 0,30 0,82 0,44 0,47 0,42

Figure 4: Méta-analyse des études de la littérature ayant évalué le rôle de l’expression de

Ki-67 pour la survie des patients atteints de CBNPC : le résultat montre que les patients

dont la tumeur surexprime Ki-67 ont une survie statistiquement plus courte (HR = 1,55 avec

un IC 95 % :1,34-1,78).

29


Ki-67 est un facteur de mauvais pronostic pour la survie des patients atteints d’un

CBNPC (10).

3.1.1.2.4. Le nombre des micro-vaisseaux

L’angiogenèse tumorale est un processus multifactoriel complexe impliquant des

facteurs de croissance dont EGF-R et des enzymes de la matrice extra-cellulaire. La néo-

angiogenèse est fondamentale pour la croissance et la progression tumorale. Trois anticorps

peuvent être utilisés pour mettre les vaisseaux tumoraux en évidence par immunohistochimie:

le facteur VIII ou facteur de von Willebrand impliqué dans l’adhérence et l’agrégation

plaquettaire; le CD31 ou PECAM 1 (platelet/endothelial cell adhesion molecule) associé à

l’adhésion dans l’inflammation, la cicatrisation et la migration cellulaire; le CD34 impliqué

dans l’adhérence leucocytaire et la migration de cellules endothéliales durant l’angiogenèse.


Le nombre des micro-vaisseaux a été évalué sur des pièces chirurgicales par

immunohistochimie à l’aide du facteur VIII dans 14 études (tableau 7), du CD34 dans 10

(tableau 8) et du CD31 dans 8 (tableau 9). Respectivement 1866, 1440 et 1093 patients atteints

d’un CBNPC ont été inclus. Certains patients ont été évalués par 2 techniques différentes.


Lorsque le facteur VIII est étudié, huit études étaient “négatives”, cinq non significatives

et une ne permettait pas de tirer de conclusion. Sept étaient évaluables pour la méta-analyse.

En ce qui concerne CD34, six études étaient “négatives” et quatre non significatives. Neuf

étaient évaluables pour la méta-analyse. En terme de CD31, cinq études étaient “négatives” et

trois non significatives. Sept étaient évaluables pour la méta-analyse.


La médiane des scores de qualité était respectivement de 52,4, 59,3 et 59,5 % pour les

études évaluant les micro-vaisseaux par le facteur VIII, le CD34 et CD31, sans différence

statistiquement significative entre les études évaluables ou pas pour la méta-analyse ni entre

les études significatives ou non.

30

Tableau 7: Caractéristiques des 14 études de la littérature ayant évalué le rôle du nombre

des micro-vaisseaux par le facteur VIII pour la survie des patients atteints de cancer

bronchique: 12 d’entre elles concernaient des CBNPC de tous sous-types et 2 des

adénocarcinomes uniquement. Mille huit cent soixante-six patients sont inclus.

Auteur Année Histologie Stade N Estimation de l’HR

Résultat Anticorps

Aikawa 1999 CBNPC I-IIIB 97 Pas de données Négatif TaKaRa Mo AbChandrachud 1997 CBNPC I-IIIA 88 Logrank NS Dako A0082 D’Amico 1999 CBNPC I 408 Logrank Négatif Biogenex Mo

Ab Duarte 1998 CBNPC I 96 Courbes de

survie Négatif Ventana Mo Ab

Fontanini 1995 CBNPC I-IIIB 248 Courbes de survie

Négatif Dako

Giatromanolaki 1997 CBNPC I-II 134 Pas de données Négatif Dako Mo F8/86 Imoto 1998 CBNPC I-IIIB 91 HR + IC NS Dako Po A0082Macchiarini 1994 CBNPC I-III 28 Pas de données Négatif Dako Mo Ab Mattern 1995 CBNPC I-III 204 Courbes de

survie NS Dako

Ohta 1999 CBNPC I 104 Pas de données Négatif Dako Po Ab Sheng 2000 CBNPC I-IV 98 Pas de données NC Santa Cruz Takanami 1997 Adénoc I-IV 120 Courbes de

survie Négatif Nichirei Mo Ab

Yamazaki 1994 Adénoc I-IV 42 Pas de données NS Dako Po Ab Yano 2000 CBNPC I-IV 108 Pas de données NS Dako Mo Ab

Tableau 8: Caractéristiques des 10 études de la littérature ayant évalué le rôle du

nombre des micro-vaisseaux par le CD34 pour la survie des patients atteints de cancer


adénocarcinomes uniquement avec au total 1440 patients inclus.


Résultat Anticorps

Cagini 2000 CBNPC I-IIB 99 Logrank NS Clone QB END 10 Cox 2001 CBNPC I-IIIA 167 HR + IC Négatif Clone QB END 10 Dazzi 1999 CBNPC I-IIIB 76 Logrank NS Clone QB END 10 Fontanini 1997 CBNPC I-III 407 Logrank Négatif Clone QB END 10 Liao 2001 CBNPC I-III 115 Pas de données NS Pas de données Matsuyama 1998 CBNPC I-IIIB 101 Logrank Négatif Clone QB END 10 Offersen 2001 CBNPC I-III 143 Courbes de

survie NS Clone QB END 10

Shibusa 1998 Adénoc I 44 Courbes de survie

Négatif Clone QB END 10

Takanami 2000 Adénoc I-IIIA 180 Courbes de survie

Négatif Novocastra Mo Ab

Yano 2000 CBNPC I-IV 108 Logrank Négatif Clone QB END 10

31

Tableau 9: Caractéristiques des 8 études de la littérature ayant évalué le rôle du nombre

des micro-vaisseaux par le CD31 pour la survie des patients atteints de cancer


adénocarcinomes uniquement avec au total 1093 patients inclus. Toutes les études

concernaient des patients présentant une maladie locorégionale.


Résultat Anticorps

Apolinario 1997 CBNPC I-IIIA 104 Courbes de survie

Négatif Clone JC70

Duarte 1998 CBNPC I 96 Courbes de survie

NS Dako Mo Ab

Han 2001 CBNPC I 85 Courbes de survie

Négatif Ventana

Hasegawa 2001 CBNPC I-III 53 Pas de données NS Clone JC70 Kawagushi 1997 Adénoc I 42 Courbes de

survie Négatif Clone JC70

O’Byrne 2000 CBNPC IIIA 183 Courbes de survie

Négatif Clone JC70

Ohta 1996 CBNPC I 15 Logrank Négatif Dako Mo AbPastorino 1997 CBNPC I 515 HR + IC NS Clone JC70


L’agrégation des résultats de survie a permis de montrer qu’un nombre élevé de micro-

vaisseaux dans les CBNPC était un facteur de mauvais pronostic quel que soit le facteur

utilisé: facteur VIII (HR:1,81 ; IC 95%:1,16 – 2,84) (figure 5), CD34 (HR:1,99 ; IC 95%:1,53

– 2,58) (figure 6) ou CD31 (HR:1,80 ; IC 95% 1,10 – 2,96) (figure 7).

Figure 5: Méta-analyse des études de la littérature ayant évalué le rôle du nombre des

micro-vaisseaux, évalués par le facteur VIII, pour la survie des patients atteints de

CBNPC: le résultat montre que les patients dont la tumeur présente un nombre important de

micro-vaisseaux ont une survie statistiquement plus courte que les autres patients (HR = 1,81

avec un IC 95 % :1,16-2,84).

32

Figure 6: Méta-analyse des études de la littérature ayant évalué le rôle du nombre des

micro-vaisseaux, évalués par CD34, pour la survie des patients atteints de CBNPC: le

résultat montre que les patients dont la tumeur présente un nombre important de micro-

vaisseaux ont une survie statistiquement plus courte que les autres patients (HR = 1,99 ; IC 95

%:1,53 – 2,58)

Figure 7: Méta-analyse des études de la littérature ayant évalué le rôle du nombre des micro-

vaisseaux, évalués par CD31, pour la survie des patients atteints de CBNPC: le résultat montre

que les patients dont la tumeur présente un nombre important de micro-vaisseaux ont une survie

statistiquement plus courte que les autres patients (HR =1,80; IC 95 %:1,10 – 2,96)

3.1.1.2.4.5. Conclusion

La néoangiogenèse tumorale est un facteur pronostique péjoratif pour la survie des

patients atteints de CBNPC (11).

33

3.1.2. Etudes de marqueurs biologiques sur des pièces chirurgicales

Dans une deuxième phase, afin de mieux appréhender l’implication de ces facteurs

dans la carcinogenèse et le pronostic des patients atteints de CBNPC, nous avons étudié au

laboratoire diverses questions sur des tumeurs bronchiques invasives.

3.1.2.1. Etude de l’expression protéique et génique d’EGF-R et de c-erbB-2

Le but de cette étude était d’investiguer le mécanisme de surexpression protéique

d’EGF-R et de c-erbB-2 et d’évaluer si des anomalies géniques pouvaient prédire cette

surexpression en recourant à des techniques d’IHC et de FISH sur les mêmes pièces

tumorales.

3.1.2.1.1. Techniques de laboratoire et évaluation du marquage

Tous les tissus ont été fixés en routine et mis en paraffine. De chaque bloc, des sections

de 5 µm ont été coupées et déposées sur des lames SuperFrost Plus (Menzel-Gläser,

Braunschwein, Germany).

3.1.2.1.1.1. Immunohistochimie

Tous les réactifs ont été utilisés sans purification préalable. Le méthanol, l’acide

citrique, le citrate de sodium, le tris(hydroxyméthyl)aminométhane (TRIS) et l’acide

hydrochlorhydrique proviennent de chez Merck (Darmstadt, Allemagne). Les lames ont été

déparaffinées dans du xylène et les tissus réhydratés dans des solutions aqueuses comprenant

des concentrations croissantes d’éthanol. L’immunohistochimie a été réalisée selon la

méthode standard du complexe avidine-biotine-peroxydase.

Immunohistochimie EGF-R

La peroxydase endogène a été inactivée par incubation des lames dans du peroxyde

d’hydrogène 0,3 % dans du méthanol pendant 30 minutes à température ambiante. Les lames

ont été rincées 2 fois dans un tampon TRIS-HCl 0,005 M, NaCl 0,9 %, pH 7,6 pendant 10

minutes. Un démasquage de l’antigène a été réalisé par triple passage (3 fois 5 minutes) au

four à micro-ondes à 650 W en tampon citrate 0,01 M à pH 7. Les lames ont ensuite été

refroidies pendant 25 minutes à température ambiante. L’anticorps monoclonal de souris anti-

EGF-R dirigé contre le domaine extracellulaire d’EGF-R (Ig G2a; NCL–EGF-R; clone EGF-

R.113) de chez Novocastra (Newcastle Upon Tyne, Royaume Uni) (dilution 1/20, titration

finale 5 µg/ml) a été déposé et incubé pendant 60 minutes à 37° C. Toutes les étapes suivantes

ont été réalisées de façon automatique à 37° C dans le système NexES (Ventana Medical

Systems, Tucson, AZ, USA). Le complexe entre EGF-R et l’anticorps a été fixé avec du

glutaraldéhyde en NaCl 0,9 %. L’anticorps secondaire a été incubé pendant 8 minutes. Les

coupes ont ensuite été colorées par de la diaminobenzidine (DAB) (kit de détection Ventana

34

Medical Systems, Tucson AZ, USA) et contre-colorées avec de l’hématoxyline. Le marquage

obtenu est membranaire.

Des contrôles négatifs ont été obtenus en omettant l’anticorps primaire et en

substituant des Ig G2a normales de souris à l’anticorps primaire. Le contrôle positif externe

était un adénocarcinome bronchique positif pour EGF-R et du placenta.

Le niveau de positivité a été exprimé en pourcentages de cellules marquées (0-100 %)

et les lames ont été considérées comme positives si ≥ 1 % des cellules étaient marquées.

Immunohistochimie c-erbB-2

Un démasquage de l’antigène a été réalisé par 5 passages de 5 minutes au four à

micro-ondes à 650 W en tampon citrate 0,01 M à pH 6. Les lames ont ensuite été refroidies

pendant 25 minutes à température ambiante et rincées 2 fois dans du TRIS-HCl 0,005 M NaCl

0,9 % pH 7,6 pendant 10 minutes. Toutes les étapes suivantes ont été réalisées de façon

automatique à 37° C dans le système NexES (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA).

La peroxydase endogène a été inactivée par incubation dans du peroxyde d’hydrogène 0,3 %

dans du méthanol pendant 30 minutes à température ambiante. L’anticorps anti-c-erbB-2

monoclonal de souris (clone CB11) de chez Novocastra (Newcastle Upon Tyne, Royaume

Uni) (dilution 1/30, titration finale 0,9 µg/ml) a été déposé et incubé pendant 30 minutes. Le

complexe entre c-erbB-2 et l’anticorps a été fixé avec du glutaraldéhyde NaCl 0,9 %.

L’anticorps secondaire a été incubé pendant 8 minutes. Les coupes ont ensuite été colorées

par de la diaminobenzidine (DAB) (kit de détection Ventana Medical Systems, Tucson AZ,

USA) et contre-colorées avec de l’hématoxyline. Le marquage obtenu est membranaire.

Des contrôles négatifs ont été réalisés par omission de l’anticorps primaire et par

substitution des Ig G1 normales de souris à l’anticorps primaire. Le contrôle positif externe

était un cancer du sein positif pour c-erbB-2.

Pour c-erbB-2, la classification utilisée dans le cancer du sein et acceptée par la FDA a

été utilisée. Les lames ont été considérées comme faiblement positives (2+) si plus de 10 % des

cellules tumorales avaient un marquage complet faible à modéré de la membrane et fortement

positives (3+) si le marquage complet était fort dans plus de 10% des cellules. Tous les autres

marquages ont été interprétés comme négatifs (0 - 1+).

3.1.2.1.1.2. FISH

Le nombre de copies du gène HER-2/Neu a été déterminé en utilisant le kit de sondes

PathVysion (Vysis, IL, USA). Pour Her-2/Neu, le kit contient une sonde marquée par un

fluorophore à spectre orange marquant le locus du gène HER-2/Neu et une sonde marquée par

un fluorophore à spectre vert marquant la région du centromère du chromosome 17 (CEP 17).

35

Pour EGF-R, le kit contient une sonde marquée par un fluorophore à spectre orange marquant

le locus du gène EGF-R (7p12) et une sonde marquée par un fluorophore à spectre vert

marquant la région du centromère du chromosome 7 (CEP 7).

Après séchage une nuit à 55°C, les lames ont été déparaffinées dans le toluol pendant

10 min puis les tissus réhydratés dans l’éthanol 100 % pendant 5 min à température ambiante

et enfin les lames séchées à 45°-50°C pendant quelques secondes. La zone d’intérêt a été

délimitée par comparaison avec les lames marquées à l’hématoxyline éosine. Les lames ont

été immergées dans l’HCl 0,2N pendant 20 min, rincées dans l’eau pendant 2 min, immergées

dans du 2xSSC (saline sodium citrate = NaCl 3M+ citrate de sodium 0,3M) pH 7 pendant 2

min à température ambiante puis séchées à 45°-50°C pendant quelques secondes. Elles ont

ensuite été plongées dans la solution de pré-traitement à 80°C pendant 30 min, rincées dans

l’eau pendant 2 min, dans du 2xSSC pH 7 pendant 2 minutes à température ambiante et

séchées à 45°-50°C pendant quelques secondes. Les lames ont ensuite été immergées pour

15 min dans une solution de protéase à 37°C ; elles ont ensuite été rincées dans du 2xSSC pH

7 pendant 1 min à température ambiante puis séchées à 45°-50°C pendant quelques secondes.

La digestion des échantillons a été vérifiée en ajoutant 15 µl de DAPI (4, 6-diamidino-2-

phenylindole) dans du phénylènediamine dihydrochloride et du glycérol sur les lames. Après

vérification de la digestion, les lames ont été rincées dans du 2xSSC 10 min. Si la digestion

était insuffisante, les lames étaient réimmergées quelques minutes dans la solution de protéase

et la digestion était à nouveau contrôlée. Lorsque celle-ci était satisfaisante, les lames étaient

rincées dans un tampon neutre de formaline à température ambiante pendant 10 min, puis

dans le 2xSSC pH 7 2 fois 5 min et enfin séchées quelques secondes à 45°-50°C. Après ce

prétraitement, la dénaturation de l’ADN a été réalisée par immersion pendant 5 min dans une

solution dénaturante (28 ml formamide + 8 ml H2O + 4 ml 20xSSC pH 5,3) pH 7-8

préchauffée à 73°C. Ensuite les lames ont été immergées dans de l’éthanol 70% 1 min, dans

de l’éthanol 85% 1 min, dans de l’éthanol 100 % 1 min et séchées à 45°-50°C sur la plaque

chauffante pendant 2 à 5 min. Dix µl de la solution de sondes ont été appliqués sur la zone

d’intérêt des lames et un couvre-lame de 22 x 22 mm a été placé puis collé sur celles-ci. Elles

ont ensuite été placées pendant une nuit dans une chambre noire humidifiée à 37°. Le tampon

de post-hybridation (50 ml 20xSSC + 150 µl NP-40 0,3 %) a été préchauffé à 73°C et un autre

récipient de tampon à température ambiante a été préparé. La colle et le couvre-lame ont été

enlevés et les lames ont été plongées dans le tampon de post-hybridation à température

ambiante pendant 5 min puis dans celui à 73°C pendant 5 min. Elles ont ensuite été séchées

36

en position verticale dans le noir à température ambiante. Une application de 10 µl de DAPI

et d’un nouveau couvre-lame a finalement été réalisée. Les lames ont été stockées dans le noir

à – 20 °C jusqu’à la lecture. L’analyse de la fluorescence a été réalisée sur un microscope à

fluorescence Olympus BX51.

Le nombre total de signaux de HER-2/Neu (ou EGF-R) et du CEP17 (ou CEP7) a été

compté en utilisant les filtres correspondants dans 60 noyaux de cellules tumorales. Un

rapport HER-2 (ou EGF-R) /CEP17 (ou CEP7) ≥ 2 a été défini comme une amplification de

Her-2/Neu (ou EGF-R). Une disomie bien équilibrée (statut normal) a été définie comme un

rapport proche de 1 avec un nombre de HER-2/Neu (ou EGF-R) et de CEP17 (ou CEP7) entre

1,5 et 2,5 chacun. Une trisomie équilibrée a été définie comme un nombre de HER-2/Neu (ou

EGF-R) et de CEP17 (ou CEP7) entre 2,5 et 3,5 chacun. Une quadrisomie équilibrée a été

définie comme un nombre de HER-2/Neu (ou EGF-R) et de CEP17 (ou CEP7) entre 3,5 et 4,5

chacun. Tous les autres cas étaient considérés comme aneuploïdes. Les amplifications, les

trisomies, les quadrisomies et les autres aneuploïdies ont été regroupées sous le terme de

"anomalies géniques".

3.1.2.1.2. Statistiques

L’analyse a été réalisée en considérant que le FISH était le test de référence pour

l’amplification et les autres anomalies génétiques. La valeur prédictive positive de l’IHC pour

l’amplification génique (ou les autres anomalies géniques) et la valeur prédictive négative ont

été calculées. Des tests de Fisher bilatéraux ont été utilisés pour vérifier s’il y avait une

association entre d’une part l’expression de c-erbB-2 ou d’EGF-R et d’autre part l’histologie,

le stade, le degré de différenciation ou les anomalies géniques. La survie a été calculée à partir

de la date de l’intervention chirurgicale selon la méthode de Kaplan-Meier. Des tests du

logrank ont été utilisés pour comparer les distributions de survie entre les groupes.

3.1.2.1.3. Résultats

3.1.2.1.3.1. EGF-R

Cent treize pièces chirurgicales de patients opérés entre novembre 1992 et juillet 2000

d’un cancer bronchique non à petites cellules ont été évaluées par IHC, 77 (pour lesquelles du

tissu était encore disponible) l’ont également été par FISH.

Par IHC, 40 % des tumeurs étaient positives pour EGF-R : respectivement 56 % des

carcinomes épidermoïdes et 22 % des adénocarcinomes (p=0,0005). Il n’y avait pas de

différence statistiquement significative en terme d’expression d’EGF-R selon le stade de la

maladie (respectivement 37 %, 39 % et 19 % de positivité dans les stades I, II et III).

37

En FISH, 74 % des tumeurs présentaient une disomie, 9 % une trisomie, 3 % une

quadrisomie et un autre type d’aneuploïdie dans 14% des cas. Aucune amplification n’a été

observée.

Dans le groupe de tumeurs étudiées par les 2 techniques (n = 77), 40 % étaient négatives

par IHC et avaient un statut génique normal, 21 % étaient positives par IHC et présentaient des

anomalies géniques et les résultats étaient discordants pour 39 % des tumeurs (p=0,009)

(tableau 10). Les valeurs prédictives positives et négatives de l’IHC pour la présence d’une

anomalie génique étaient respectivement de 38 et 88 %.

Tableau 10: Etude de l’expression génique et protéique d’EGF-R dans les CBNPC opérés:

sur une série de 77 tumeurs, 40 % étaient négatives par IHC et avaient un statut génique normal

en FISH, 21 % étaient positives en IHC et présentaient des anomalies géniques et les résultats

étaient discordants pour 39 % des tumeurs. Les valeurs prédictives positives et négatives de

l’IHC pour les anomalies géniques étaient respectivement de 38 et 88 %.

N tumeurs IHC positives

(n = 42)

IHC négatives

(n = 35)

Anomalies géniques en FISH

(n = 20)

21 % 5 %

Amplifications en FISH

(n = 0)

0 0

FISH normal

(n= 57)

34 % 40 %

Au moment de l’analyse, 52 % des patients étaient décédés: respectivement 41 % des

patients de stade I, 61 % des stades II et 78 % des stades III ; la survie médiane était

respectivement de 207/ 97/ 75 mois pour les stades I/ II/ III (p=0,05).

Les médianes de survie étaient respectivement de 25 et 45 mois pour les patients avec et

sans surexpression protéique d’EGF-R dans la tumeur. Les patients avec des anomalies

géniques tumorales d’EGF-R avaient également une médiane de survie plus courte (31 mois)

que ceux qui n’en avaient pas (43 mois). La survie médiane était de 17 mois pour les patients

38

présentant dans leur tumeur une surexpression protéique et une anomalie génique et de 45 mois

pour les patients qui ne surexprimaient pas EGF-R et ne présentaient pas d’anomalies géniques.

Toutes ces différences n’atteignaient pas le seuil de la signification statistique.

3.1.2.1.3.2. c-erbB-2

Par IHC (n=106), 36/46/20/4 tumeurs étaient respectivement 0/1+/2+/3+ pour c-erbB-2.

Un statut c-erbB-2 positif (2+ et 3+) était donc retrouvé chez 22 % des patients [17 % des

carcinomes épidermoïdes et 31 % des adénocarcinomes (sans différence statistiquement

significative)] mais seulement 4 % des cas présentaient une surexpression à 3+. Il n’y avait pas

de différence en terme d’expression de c-erbB-2 selon le stade (respectivement 22 %, 23 % et

20 % dans les stades I, II et III).

Une amplification était observée dans 6 % des tumeurs des 102 patients évaluables par

FISH. Quarante-quatre % des tumeurs présentaient une disomie, 12 % une trisomie et 2 % une

quadrisomie. D’autres types d’aneuploïdie étaient observés dans 36 % des tumeurs.

Trois % des tumeurs étaient positives par IHC et présentaient une amplification

génique, 72% étaient négatives par IHC et n’avaient pas d’amplification génique et les résultats

étaient discordants dans les autres cas (p = 0,13). Les valeurs prédictives positive et négative de

l’IHC pour l’amplification génique étaient respectivement de 14 et 96 %. Quand toutes les

anomalies génétiques étaient considérées, 19 % des tumeurs étaient positives par IHC et avaient

des anomalies géniques, 38 % étaient négatives par IHC et avaient un statut génique normal et

43 % des résultats discordaient (p = 0,05) (tableau 11). Les valeurs prédictives positive et

négative de l’IHC pour les anomalies génétiques étaient respectivement de 72 et 53 %.

La survie médiane était respectivement de 17 et 40 mois pour les patients avec ou sans

surexpression protéique tumorale de c-erbB-2. Les patients présentant une amplification de c-

erbB-2 dans leur tumeur avaient une médiane de survie plus courte (18 mois) par rapport à ceux

qui n’en avaient pas (38 mois). La survie médiane était de 16 mois pour les patients avec la

surexpression de c-erbB-2 et les anomalies géniques et 28 mois pour les patients sans

surexpression de c-erbB-2 et un statut génique normal. Toutes ces différences n’atteignaient

pas le seuil de signification statistique.

39

Tableau 11: Etude de l’expression génique et protéique de c-erbB-2 dans les CBNPC

opérés: 19 % des tumeurs étaient positives par IHC et avaient des anomalies géniques, 38 %

étaient négatives par IHC et avaient un statut génique normal, les autres résultats discordaient.

Les valeurs prédictives positives et négatives de l’IHC pour les anomalies génétiques étaient

respectivement de 72 et 53 %.

N tumeurs IHC positives

(n = 22)

IHC négatives

(n = 74)

Anomalies géniques en FISH

(n = 51)

16 % 34 %

Amplification en FISH

(n = 6)

3 % 3 %

FISH normal

(n = 45)

6 % 38 %

3.1.2.1.3.3 . « Co-expression » d’EGF-R et de c-erbB-2

Pour 106 patients, l’IHC a été réalisée pour EGF-R et pour c-erbB-2. Quarante-sept %

des tumeurs n’exprimaient aucune des protéines, 11 % exprimaient les 2, 30 % exprimaient

uniquement EGF-R et 11 % uniquement c-erbB-2 (p = 0,35).

Pour 69 patients, le FISH a été réalisé pour c-erbB-2 et EGF-R . Le nombre de gènes

était normal pour EGF-R et c-erbB-2 dans 38 % des tumeurs, anormal pour les 2 marqueurs

dans 19 %, anormal pour EGFR seulement dans 7 % et anormal pour c-erbB-2 seulement dans

36 % des cas (p = 0,07) (tableau 12).

La survie médiane était respectivement de 44, 40 et 17 mois pour les patients qui

surexprimaient 0, 1 ou 2 protéines (p = 0,59) et de 50, 41 et 40 mois pour ceux qui présentaient

0, 1 ou 2 anomalies géniques (p = 0,40) dans leur tumeur .

40

Tableau 12 : Etude par FISH de la co-expression d’EGF-R et de c-erbB-2: pour 69

patients, le FISH a été réalisé pour c-erbB-2 et EGF-R. Le nombre de gènes était normal pour

EGF-R et c-erbB-2 dans 38 % des tumeurs, anormal pour les 2 marqueurs dans 19 %, anormal

pour EGFR seulement dans 7 % et anormal pour c-erbB-2 seulement dans 36 % des cas.

Résultats FISH EGF-R normal (n = 51) EGF-R anormal (n = 18)

c-erbB-2 normal (n = 31) 38 % 7%

c-erbB-2 anormal (n = 38) 36 % 19 %

3.1.2.1.4. Conclusions

Si la majorité des CBNPC réséqués présentent des « anomalies géniques » au sens

large du terme d’EGF-R et/ou de c-erbB-2, une amplification de ces gènes n’est présente que

dans une minorité d’entre eux et n’est pas parfaitement corrélée à l’expression protéique. La

survie des patients dont la tumeur surexprime EGF-R et/ou c-erbB-2 ou manifeste une

anomalie de ces gènes est plus courte sans différence statistiquement significative avec les

patients dont la tumeur ne présente pas ces anomalies (12).

3.1.2.2. Corrélation entre EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67

EGF-R et c-erbB-2 jouent un rôle dans la progression des CBNPC. Cependant, les

relations entre EGF-R et c-erbB-2 et d’autres facteurs impliqués dans cette progression

tumorale ne sont pas bien compris. L’objectif de ce travail est de corréler l’expression de ces

marqueurs avec la prolifération tumorale.

3.1.2.2.1. Population étudiée.

Des 129 patients consécutifs ayant été traités chirurgicalement pour un cancer

bronchique de novembre 1992 à juillet 2000, 104 étaient éligibles pour cette étude car il restait

assez de matériel pour réaliser les trois immunomarquages. Après résection chirurgicale, les

tissus étaient fixés dans du tampon formaline 10 % puis enrobés en paraffine.

3.1.2.2.2. Immunohistochimie

Pour Ki-67, les lames ont été déparaffinées dans du xylène et les tissus réhydratés dans

des solutions aqueuses comprenant des concentrations croissantes d’éthanol. L’antigène a été

démasqué en le chauffant dans du tampon citrate 0,01 M pH 6 3 x 5 min au four à micro-ondes

à 600 W. Les lames sont ensuite restées pendant 25 min à l’air ambiant avant d’être rincées

deux fois dans du tampon TRIS-HCl 0,005 M pH 7,6 en NaCl 0,9 % pendant 10 min. Toutes

les étapes suivantes ont été réalisées automatiquement à 37 °C dans le système NexES

(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA). La peroxydase endogène a ensuite été inhibée

41

par incubation dans du peroxyde d’hydrogène 0,3 % pendant 4 min à température ambiante.

Les anticorps murins monoclonaux anti-Ki-67 donnant un marquage nucléaire (clone MIB-1 de

Neomarkers, Union City, USA ; dilution 1/50, titration finale 1,9 µg/ml) ont ensuite été

déposés et les lames ont été incubées pendant 30 min. Le complexe entre Ki-67 et l’anticorps a

été fixé avec du glutaraldéhyde NaCl 0,9 %. L’anticorps secondaire a incubé pendant 8 min.

Pour EGF-R et c-erbB-2, le protocole de marquage décrit plus haut a été appliqué (voir

3.1.2.1.1.1.).

Les contrôles négatifs ont été réalisés en omettant l’anticorps primaire et par

substitution de celui-ci avec une Ig normale de souris. Les contrôles positifs externes étaient

du tissu de cancer bronchique positif pour EGF-R, du tissu de cancer du sein positif pour Ki-

67 et c-erbB-2.

3.1.2.2.3. Evaluation du marquage.

Le taux de positivité a été exprimé en pourcentage de cellules présentant un marquage

membranaire (pour EGF-R) ou nucléaire (pour Ki-67) et les lames ont été considérées comme

positives pour le marqueur quand ≥ 1 % des cellules étaient marquées.

Pour c-erbB-2, la classification appliquée dans le cancer du sein et décrite plus haut a

été adoptée (voir 3.1.2.1.1.1.).

3.1.2.2.4. Statistiques.

L’analyse statistique a été réalisée grâce à des tests de Mc Nemar pour comparer les

taux de positivité entre deux variables binaires. Les distributions des variables biologiques ont

été comparées selon l’histologie par les tests de Mann-Whitney. La survie a été mesurée à partir

de la date de la chirurgie et les distributions de survie estimées selon la méthode de Kaplan-

Meier. Les comparaisons des survies ont été réalisées par un test du logrank bilatéral.

3.1.2.2.5. Résultats.

Quatre-vingt-six hommes et dix-huit femmes ayant bénéficié d’une résection

chirurgicale de CBNPC ont été inclus. Selon la classification de l’OMS de 1998, 49 patients

présentaient un adénocarcinome, 47 un carcinome épidermoïde et 8 un autre type

histologique. La majorité des patients présentaient une maladie limitée: 62 stades I, 26 stades

II, 15 stades III et 1 stade IV.

Le taux de marquage d’EGF-R variait entre 0 et 100% (médiane 0%) et était plus élevé

dans les carcinomes épidermoïdes (7% de médiane, variant de 0 à 100%) que dans les

adénocarcinomes (0% de médiane, variant de 0 à 100%) (p< 0,001). Quarante-deux % des

tumeurs étaient positives pour EGF-R.

42

Vingt-deux % des tumeurs étaient positives pour c-erbB-2 avec une différence

statistiquement significative entre les adénocarcinomes (30%) et les carcinomes épidermoïdes

(15%) (p=0,05).

L’expression de Ki-67 variait entre 0 et 92% (médiane 20 %) et était plus élevée dans

les carcinomes épidermoïdes (33,3%) que dans les adénocarcinomes (8,3 %) (p < 0,001) ; au

total, 97 % des tumeurs étaient positives pour Ki-67.

En considérant les variables comme continues, nous n’avons pas pu mettre en évidence

de corrélation entre EGF-R et Ki-67 (r = 0,0026; p = 0,97). En dichotomisant les variables

(positif versus négatif), nous avons observé que la surexpression d’EGF-R diffère en fonction

de la positivité de Ki-67 (p < 0,001), ainsi qu’en fonction du statut c-erbB-2 (p < 0,001) et que

celle de c-erbB-2 diffère en fonction de celle de Ki-67 (p < 0,001) (tableau 13).

Tableau 13 : Etude de l’expression d’EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67 dans les CBNPC opérés

N cas Ki-67 positif Ki-67 négatif c-erbB-2 positif c-erbB-2 négatif

EGF-R positif 41 3 12 32

EGF-R négatif 60 0 11 49

Ki-67 positif - - 22 79

Ki-67 négatif - - 1 2

Le suivi médian était de quarante-huit mois. Soixante-deux patients étaient décédés au

moment de l’analyse. La survie médiane était de 53 mois sans différence significative selon le

statut EGF-R et c-erbB-2: 49 mois pour les tumeurs EGF-R positives et 55 pour les négatives

(p = 0,42), 18 mois pour les tumeurs c-erbB-2 positives et 55 pour les négatives (p = 0,76).

Cependant, une différence significative a été mise en évidence selon l’expression de Ki-67: 54

mois pour les tumeurs Ki-67 positives et 95 pour les négatives (p < 0,005).


Aucune corrélation n’a été mise en évidence entre l’expression d’EGF-R et c-erbB-2

et la prolifération tumorale évaluée par Ki-67 (13). L’expression de Ki-67 est associée à une

mauvaise survie dans les CBNPC.

3.1.3. Etude de marqueurs biologiques sur des tumeurs plus avancées

Dans la plupart des études publiées, les paramètres biologiques sont évalués par

immunohistochimie sur des tissus fixés au formol et conservés en paraffine obtenus lors de la

43

résection chirurgicale de la tumeur primitive. Avant de pouvoir étudier ces marqueurs sur des

biopsies provenant de tumeurs plus avancées pour lesquelles une pièce opératoire est souvent

absente, nous avons d’abord exploré si, chez des patients opérés, l’expression de marqueurs

sur des petites biopsies obtenues avant la chirurgie par des techniques non chirurgicales (par

bronchoscopie) est corrélée à celle observée sur les pièces chirurgicales de patients. Dans un

deuxième temps nous avons étudié l’expression d’EGF-R dans un groupe plus homogène de

CBNPC : les stades III.

3.1.3.1. Corrélation biopsies/tumeurs

Le but de notre étude est de rechercher si l’expression de marqueurs biologiques

évaluée par immunohistochimie sur les biopsies bronchiques est corrélée à celle observée sur

du matériel chirurgical.

3.1.3.1.1. EGF-R

Comme première étude, nous avons évalué l’expression d’EGF-R sur les biopsies et sur

les tumeurs réséquées correspondantes.

3.1.3.1.1.1. Matériel et méthode

Nous avons recherché les patients opérés d’un CBNPC chez lesquels une biopsie

préopératoire donnant le diagnostic de CBNPC était disponible. La même cohorte de 129

patients opérés décrite plus haut a été étudiée. Soixante-huit de ces cas ont eu un diagnostic

anatomopathologique préopératoire de cancer bronchique dans notre institution. Parmi ces

patients, le diagnostic préopératoire avait été réalisé sur des prélèvements cytologiques dans

16 cas et 3 patients avaient reçu de la chimiothérapie néoadjuvante; ces 19 cas ont été exclus

de l’analyse. De plus, pour 22 patients, le tissu (biopsique et/ou chirurgical) n'était plus

disponible en quantité suffisante pour réaliser un immunomarquage. Dès lors, 27 patients

étaient évaluables en terme de biopsie obtenue par bronchoscopie et de prélèvement

chirurgical. Tous les prélèvements ont été fixés dans du formol 10 % et conservés dans la

paraffine.

3.1.3.1.1.2. Interprétation des résultats immunohistochimiques

Le même protocole de marquage que celui décrit au point 3.1.2.1.1.1. a été appliqué.

Le pourcentage de cellules positives tumorales a été évalué de façon semi-quantitative à

grossissement 200 sur l'ensemble de la lame: seul le marquage membranaire a été pris en

compte. Pour les pièces opératoires, un seul bloc a été évalué. Les lames ont été considérées

positives si plus de 1% des cellules étaient marquées sans tenir compte de l'intensité du

marquage. D'autre part, pour évaluer un autre seuil et comme validé pour les récepteurs

44

hormonaux dans les tumeurs mammaires, un score EGF-R combinant un score de proportion

plus un score d'intensité a été calculé. Le score de proportion comporte 5 groupes: 0 = pas de

cellules marquées; 1 = <1/100 cellules marquées; 2 = 1/100 à 1/10 cellules marquées; 3 = 1/10

à 1/3 cellules marquées; 4 = 1/3 à 2/3 cellules marquées et 5 > 2/3 cellules marquées. Le score

d'intensité du marquage a été divisé en 4 catégories (0 = pas de marquage; 1 = marquage faible;

2 = marquage modéré et 3 = marquage intense). Les prélèvements ont été considérés comme

positifs si le score global atteignait minimum 4 afin de considérer un minimum de 10 % de

cellules marquées avec une intensité minimale de 1.

3.1.3.1.1.3. Statistiques

La corrélation entre l’expression d’EGF-R sur les biopsies et les pièces chirurgicales a

été mesurée par le coefficient de Spearman. Des tests de Wilcoxon ont été utilisés pour

comparer le marquage d’EGF-R sur les biopsies et les pièces chirurgicales. Des tests de Mann

Whitney ont été utilisés pour comparer la distribution d’EGF-R en fonction de l’histologie.

Pour évaluer la concordance entre les biopsies et les tumeurs, nous avons également réalisé des

évaluations sur des variables binaires par des tests de Mc Nemar et par le calcul de coefficients

d’agrément kappa en considérant uniquement la positivité des résultats sur les biopsies et les

tumeurs. Une probabilité de signification bilatérale p inférieure à 0,05 a été considérée comme

significative. Nous avons également recherché si un seuil autre que 1 % ou 10 % de cellules

positives pour les biopsies pouvait être plus adéquat pour conclure à la positivité (plus de 1 %

ou 10 % des cellules marquées) de la tumeur en utilisant une courbe ROC.

3.1.3.1.1.4. Résultats

La population de patients étudiés consiste en 22 hommes et 5 femmes d’âge médian de

60 ans. Les types histologiques sont : 15 carcinomes épidermoïdes, 11 adénocarcinomes et 1

tumeur à grandes cellules de type neuroendocrine. Dix-sept patients présentent un stade I, 6 un

stade II et 4 un stade III. Le pourcentage moyen de cellules néoplasiques positives pour EGF-R

est de 11 % sur les pièces chirurgicales et de 28 % dans les biopsies (p = 0,02).

En utilisant le seuil de 1 % de cellules marquées pour EGF-R, 55% des biopsies sont

considérées comme positives. Avec ce même seuil, 48% des tumeurs réséquées sont

considérées comme positives pour l’expression d’EGF-R. Si l’on considère que les résultats

trouvés sur la tumeur opérée sont les plus corrects, lorsque l’on compare les résultats de

marquage immunohistochimique d’EGF-R obtenus sur des biopsies avec ceux obtenus sur les

tumeurs réséquées, on retrouve 4 % de faux négatifs et 11 % de faux positifs sur les biopsies

avec 85 % de résultats concordants entre les biopsies et les tumeurs réséquées (tableau 14). Le

taux de positivité n’est pas statistiquement différent entre les biopsies et les pièces chirurgicales

45

(p = 0,63). La valeur prédictive positive des biopsies est de 80 % et la valeur prédictive

négative de 92 %. Une corrélation significative (coefficient de Spearman r = 0,67; p = 0,0001)

est observée entre les biopsies et les tumeurs réséquées.

En utilisant le seuil de 4 pour le score EGF-R, 45 % des biopsies et 33 % des tumeurs

sont considérées comme positives pour EGF-R. On retrouve ainsi 67 % de résultats

concordants entre les biopsies et les tumeurs réséquées, 22 % de faux positifs et 11 % de faux

négatifs sur les biopsies (si l’on considère que les résultats trouvés sur la tumeur opérée sont les

plus corrects). Le taux de positivité n'est pas statistiquement différent entre les biopsies et les

pièces chirurgicales (p = 0,36). La valeur prédictive positive des biopsies est de 60 % et la

valeur prédictive négative de 80 %. Une corrélation significative (coefficient de Spearman r =

0,60; p = 0,0008) est observée entre les biopsies et les tumeurs réséquées pour l’expression

d’EGF-R.

En utilisant une courbe ROC, l’aire sous la courbe est estimée à 0,88 (significativement

différente de 0,5: p < 0,001; intervalle de confiance à 95 %: 0,74-1,00). Le seuil optimal est 0,

ce qui signifie que quand une biopsie est positive, on peut conclure que la tumeur est positive

avec une sensibilité de 92 % et une spécificité de 79 %.


Cette étude démontre que les biopsies peuvent donner des informations suffisantes sur

le statut d’EGF-R dans le cancer bronchique. En utilisant un seuil de 1 % de cellules marquées,

nous avons observé 85 % de résultats concordants en comparant les biopsies et les pièces

chirurgicales réséquées chez les mêmes patients avec un faible taux de faux positifs et négatifs

et de bonnes valeurs prédictives positive et négative (14).

3.1.3.1.2. C-erbB-2 et Ki-67

Afin de voir si les résultats obtenus pour EGF-R étaient généralisables, nous avons

décidé d’explorer les autres marqueurs que nous étudions: Ki-67 et c-erbB-2.

3.1.3.1.2.1. Immunohistochimie

Pour c-erbB-2 et Ki-67, les techniques de marquage décrites plus haut ont été

appliquées (voir 3.1.2.1.1.1. et 3.1.2.2.2.).

3.1.3.1.2.2. Résultats

Vingt-huit et vingt-six paires biopsies/tumeurs étaient respectivement évaluables pour

Ki-67 et c-erbB-2.

Le pourcentage moyen de cellules positives (> 1 % des cellules marquées) pour Ki-67

était de 32 % dans les tumeurs réséquées et 14 % dans les biopsies. Nous avons observé 82 %

46

de résultats concordants entre les biopsies et les tumeurs, 14 % de faux négatifs et 4 % de faux

positifs sur les biopsies. La valeur prédictive positive des biopsies était de 96 %.

Huit % des biopsies et 19 % des tumeurs réséquées étaient considérées comme

positives pour c-erbB-2 (tumeurs 2 ou 3+). Nous avons observé 15 % de faux négatifs et 4 %

de faux positifs sur les biopsies avec 81 % de résultats concordants. La valeur prédictive

négative de la biopsie était de 83 % (tableau 14).

Tableau 14: Etude de l’expression d’EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67 sur les biopsies

bronchiques et sur les tumeurs bronchiques réséquées correspondantes : nous avons

observé plus de 80 % de résultats concordants en comparant les biopsies et les pièces

chirurgicales réséquées chez les mêmes patients avec un faible taux de faux positifs et

négatifs et de bonnes valeurs prédictives positive et négative. Ces données démontrent que

l’évaluation de ces marqueurs peut être réalisée sur de petites biopsies bronchiques.

EGF-R c-erbB-2 Ki-67 Résultats concordants 85% 81% 82% Faux négatifs 4% 15% 14% Faux positifs 11% 4% 4% Valeur prédictive positive 80% NA 96% Valeur prédictive négative 92% 83% NA


Comme pour EGF-R, nous avons donc observé une concordance satisfaisante entre les

biopsies et les tumeurs réséquées pour les immunomarquages de c-erbB-2 et Ki-67 (15).

3.1.3.2. EGF-R dans les stades III

Afin d’évaluer l’impact de l’expression d’EGF-R dans un groupe plus homogène de

CBNPC à un stade avancé, nous avons étudié sa valeur pronostique dans les CBNPC de stade

III. La classification internationale de 1997 sépare les patients de stade III en stade IIIA et

IIIB. Ce groupe de patients est hétérogène et inclut des patients dont la tumeur est résécable

chirurgicalement et des patients avec des tumeurs irrésécables qui bénéficient de chimio-

et/ou de radiothérapie. Précédemment (16;17), nous avons observé que la répartition des

stades III en stades ΙΙΙβ (T3-4N3M0) et ΙΙΙα (les autres stades III) discrimine mieux les

patients en terme de survie que la classification standard. Dès lors, cette classification IIIαβ a

été utilisée également dans cette étude.

47

3.1.3.2.1 Matériel et méthodes

Nous avons recherché les biopsies de tous les patients présentant un CBNPC au stade III

non préalablement traités.

3.1.3.2.2. Immunohistochimie

L’immunohistochimie a été réalisée comme décrit plus haut (voir 3.1.2.1.1.1.).

3.1.3.2.3. Statistiques

La survie a été mesurée depuis la date du diagnostic. L’analyse univariée pour la

comparaison de survie a été réalisée selon un test du logrank. Toutes les variables avec une

probabilité de signification inférieure ou égale à 0,2 en analyse univariée ont été incluses dans

un modèle de Cox pour l’analyse multivariée. La comparaison des caractéristiques des patients

selon le statut EGF-R a été réalisée par un test de chi-carré en cas de variable binaire ou selon

un test de Mann-Whitney. Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement

significative.

3.1.3.2.4. Résultats

De janvier 1987 à juillet 2002, 298 patients consécutifs avec un CBNPC de stade III ont

été traités dans notre département d’oncologie thoracique. Chez 175 d’entre eux, les biopsies

avaient été réalisées dans une autre institution et étaient indisponibles pour un marquage par

immunohistochimie. Dans 17 cas, il n’y avait plus de tissu tumoral dans le bloc. Sept autres

patients ont été exclus parce qu’ils n’ont pas été traités ou parce qu’ils avaient reçu un

traitement dans une autre institution. Nonante-neuf patients étaient donc évaluables. La

majorité des patients ont été traités par chimiothérapie seule (n = 40) ou avec une association (n

= 42) incluant de la chimiothérapie et de la radiothérapie (n = 36) ou de la chirurgie avec ou

sans radiothérapie (n = 6). Les autres patients ont reçu de la radiothérapie exclusive (n = 15) ou

de la chirurgie seule (n = 2). Une chimiothérapie à base de cisplatine ou de carboplatine a été

administrée chez 71 et 5 patients, respectivement. Le taux de réponse à la thérapie d’induction

a été de 39,4 %.

Respectivement, septante-six et vingt-trois tumeurs étaient négatives ou positives pour

EGF-R. Au total, le taux de positivité était de 23,2 %. Il était de 39,6 % pour les carcinomes

épidermoïdes et de 7,8 % pour les autres histologies (p = 0,0002). L’expression d’EGF-R en

fonction des caractéristiques des patients est décrite dans la tableau 15. Excepté pour

l’histologie, il n’y avait pas de différence statistiquement significative entre les tumeurs EGF-R

positives ou négatives.

La durée médiane de suivi était de 78,4 mois. Au moment de l’analyse, 10 patients

étaient toujours en vie, 83 décédés et 6 perdus de vue. Les survies à 1, 2, 3 et 4 ans étaient

48

respectivement de 51,6 %, 19,8 %, 9,1 % et 2,4 %. Les résultats d’analyse univariée pour la

survie sont rapportés tableau 16. Un bon indice de performance, un traitement chirurgical, un

taux d’hémoglobine et de sodium normal et le stade T étaient associés statistiquement à une

meilleure survie. En plus de ces 5 variables, celles ayant une probabilité de signification

inférieure ou égale à 0,2 en analyse univariée (la perte de poids, le taux de neutrophiles et de

plaquettes, le taux de LDH sérique et la créatininémie) ont été incluses dans un modèle de Cox

multivarié. Quatre-vingt-trois observations étaient complètes. Trois variables étaient

indépendamment associées à la survie en analyse multivariée : un bon indice de performance (p

= 0,006), la résection chirurgicale (p = 0,007) et le taux de créatinine (p = 0,02).

La même analyse a été réalisée dans les tumeurs positives et négatives pour EGF-R,

séparément. Pour les tumeurs EGF-R positives (n = 23), seule la résection chirurgicale était

associée avec un avantage en termes de survie en analyse univariée (p = 0,01). Dans les

tumeurs négatives pour EGF-R (n = 76), un bon indice de performance (p = 0,004), la résection

chirurgicale (p = 0,0002), une créatininémie basse (p = 0,04), une natrémie normale (p = 0,02)

et un stade T1-T2 (p = 0,01) étaient associés à une meilleure survie en analyse univariée.

Toutes les variables avec une probabilité de signification inférieure ou égale à 0,2 en analyse

univariée ont été entrées dans un modèle de Cox. En analyse multivariée, la résection

chirurgicale (p = 0,02) et l’indice de performance (p = 0,03) étaient associés significativement à

la survie.


EGF-R n’est pas un facteur pronostique significatif pour la survie dans le sous-groupe

des patients atteints d’un CBNPC au stade III (18).

49

Tableau 15: Etude de l’expression d’EGF-R chez les patients présentant un CBNPC au

stade III : 23,2 % des tumeurs surexpriment EGF-R. Les caractéristiques des patients en

fonction du statut d’EGF-R sont similaires excepté pour l’histologie (39,6% de positivité pour

les carcinomes épidermoïdes et 7,8% pour les autres histologies).

EGF-R + EGF-R - p

Tous 23 76

IIIA/IIIB 9/14 31/45 0,89

IIIα/IIIβ 19/3 61/12 0,75

IP

80-100

60-70

<60

15

6

1

39

27

6

0,30

Age

≤ 60 ans

> 60 ans

7

16

25

51

0,83

Sexe

Hommes

Femmes

18

5

57

19

0,75

Histologie

Epidermoïdes

Non- épidermoïdes

19

4

29

47

0,0002

Perte de poids

≤ 5%

> 5%

15

6

51

18

0,82

50

Tableau 16 : Etude de la survie chez les patients présentant un CBNPC au stade III :

l’analyse univariée pour la survie des 99 patients a montré qu’un bon IP, un traitement

chirurgical, un taux d’hémoglobine normal, une natrémie normale et le stade T étaient associés

statistiquement à une meilleure survie alors que le statut EGF-R ne modifiait pas le pronostic.

SM (jours) N patients N décès p EGF-R négatifs EGF-R positifs

371 411

76 23

65 18

0,26

IIIA IIIB

408 332

40 59

35 48

0,36

III α

III β

413 140

80 15

67 13

0,25

T1-T2 T3-T4

448 263

41 54

32 48

0,05

N0-2 N3

413 215

68 30

59 23

0,41

IP 80-100 < 80

500 220

54 40

43 36

0,001

Age ≤ 60 ans > 60 ans

424 375

32 67

28 55

0,57

Hommes Femmes

400 310

75 24

62 21

0,37

Perte de poids ≤ 5% > 5%

416 219

66 24

55 21

0,13

Epidermoïdes Non-épidermoïdes

420 332

48 51

41 42

0,46

Chirurgie : Oui Non

1085 365

8 91

4 79

0,00002

PMN ≤ 7500/mm³ > 7500/mm³

403 332

67 32

55 28

0,15

Plaquettes ≤ 44.104/mm³ > 44.104/mm³

401 199

78 21

64 19

0,07

Hémoglobine 12-18 g/dl < 12 g/dl

401 216

71 28

59 24

0,03

LDH ≤ 200 mUI/ml > 200 mUI/ml

419 311

67 31

53 29

0,07

Créatininémie ≤ 0,9 mg/dl > 0,9 mg/dl

412 288

70 29

55 28

0,07

Calcémie 8,5-10,3 mg/dl <8,5 ou > 10,3 mg/dl

383 370

89 9

73 9

0,31

Natrémie 135-146 mEq/l < 135 ou > 146 mEq/l

404 147

83 16

68 15

0,01

Bilirubine ≤ 0,5 mg/dl > 0,5 mg/dl

381 383

64 35

55 28

0,59

51

3.2. Lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces

La fumée de tabac induit des anomalies génétiques au sein de la muqueuse

bronchique. Celles-ci sont diffusément réparties dans les voies respiratoires et sont

responsables d’apparition de tumeurs successives (19). Le système endoscopique LIFE (Light

Induced Fluorescence Endoscopy), basé sur l’autofluorescence des muqueuses bronchiques,

permet la mise en évidence de lésions prénéoplasiques et néoplasiques précoces à différents

stades : hyperplasie, métaplasie, dysplasie (légère, modérée et sévère), carcinome in situ et

cancer micro-invasif avec une sensibilité nettement meilleure que celle de la bronchoscopie

ordinaire en lumière blanche (20). Nos patients bénéficient donc de cet examen dans le bilan

préopératoire et le suivi du cancer bronchique (et ORL) opéré ainsi que pour le dépistage de

cancer bronchique. Pour être inclus pour le LIFE, les patients doivent avoir fumé au minimum

30 paquets de cigarettes-années et/ou avoir une histoire de cancer bronchique ou de la tête et

du cou. La bronchoscopie en fluorescence a été réalisée sous anesthésie locale et toutes les

zones anormales en fluorescence et en lumière blanche ont été biopsiées. Cette technique nous

a permis de constituer une banque de biopsies représentatives des différents stades

prénéoplasiques et néoplasiques précoces. Nous avons ensuite réalisé les études décrites ci

dessous.

3.2.1. EGF-R dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces

3.2.1.1 Population étudiée

Cent vingt-quatre patients ayant bénéficié d'une bronchoscopie en fluorescence entre

février 1996 et octobre 2001 (98 hommes et 26 femmes, de 63 ans d'âge médian) ont été

inclus dans l’étude. Plusieurs biopsies ont été réalisées chez chaque patient; seule la lésion

avec le grade histologique le plus avancé a été prise en compte de sorte que chaque patient n'a

été inclus qu'une seule fois dans l'étude.

3.2.1.2. Préparation des échantillons et immunohistochimie

Toutes les biopsies ont été fixées en routine dans un formol 10 % tamponné,

immédiatement après la bronchoscopie (pendant minimum 3 et maximum 10 heures) et ont

été enrobées dans la paraffine. Pour chaque bloc, des sections de 5 µm ont été coupées à partir

des blocs de paraffine et déposées sur des lames SuperFrost Plus (Menzel-Gläser,

Braunschwein, Allemagne). Toutes les lésions marquées à l'hématoxyline éosine ont été

classifiées selon la classification histologique OMS/IASLC des lésions bronchiques pré-

invasives.

52

Le protocole d’immunohistochimie décrit précédemment et utilisé pour les tumeurs

invasives a été appliqué (voir 3.1.2.1.1.1.).

3.2.1.3. Interprétation des résultats immunohistochimiques

Les lésions bronchiques ont été évaluées par un score de proportion et un score

d'intensité. Le score de proportion a été défini comme suit: 0 = pas de marquage ou marquage

de la couche basale uniquement; 1+ = marquage des cellules basales et suprabasales (maximum

dans le tiers inférieur de l'épaisseur de l'épithélium); 2+ = marquage des cellules dans les deux-

tiers inférieurs de l'épaisseur de l'épithélium; 3+ = marquage des cellules dans toute l'épaisseur

de l'épithélium (figure 8). L'intensité du marquage a été évaluée comme suit: 0 = pas de

marquage, 1 = intensité comparable à celle de l'épithélium bronchique normal, 2 = intensité

plus forte que l'épithélium bronchique normal, 3 = intensité aussi forte que le contrôle positif de

cancer bronchique. Un score EGF-R global a ensuite été calculé: il correspond à la somme du

score de proportion et du score d'intensité.

3.2.1.4. Statistiques

Nous avons regroupé les lésions bronchiques en 5 catégories selon l'histologie: groupe

1 = épithelium normal, hyperplasie et métaplasie; groupe 2 = dysplasie légère; groupe 3 =

dysplasie modérée; groupe 4 = dysplasie sévère et groupe 5 = CIS et tumeurs microinvasives.

En terme de score de proportion, nous avons comparé deux catégories: les lésions 0 et 1+

versus 2+ et 3+. En terme d'intensité, nous avons dichotomisé les lésions en 2 groupes:

intensités 0 et 1 versus intensités 2 et 3. En ce qui concerne le score global EGF-R, nous

avons dichotomisé les lésions entre celles ayant un score < 5 et celles avec un score ≥ 5 afin

d'avoir au minimum une proportion de marquage de 2/3 de l'épaisseur de l'épithélium avec

une intensité de grade 3 ou un marquage des 3/3 de l'épithélium avec une intensité de grade 2.

Les comparaisons d’expression d’EGF-R entre les différents groupes ont été réalisées par des

tests de chi-carré ou des tests exacts de Fisher quand il y avait trop peu de cas par catégorie.

53

Figure 8: Exemple d'immunomarquage EGF-R des lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces A B

C D

E

A. Hyperplasie des cellules basales: EGF-R est présent dans la couche basale de l'épithélium mais pas dans les couches plus superficielles

B. Transition de l'hyperplasie des cellules basales au carcinome in situ: dans l'hyperplasie, EGF-R est présent dans la couche basale de l'épithélium mais pas dans les couches plus superficielles; dans le carcinome in situ, EGF-R est présent dans toutes les couches de l'épithélium

C. Dysplasie sévère: EGF-R est présent dans toutes les couches de l'épithélium D. Carcinome in situ: EGF-R est présent dans toutes les couches de l'épithélium E. Tumeur micro-invasive: EGF-R est présent dans toutes les couches de l'épithélium

54

3.2.1.5. Résultats

Sur les 124 patients éligibles, nous disposions de matériel biopsique en quantité

suffisante pour réaliser le marquage immunohistochimique d'EGF-R chez 94 patients (74

hommes et 20 femmes). L'âge médian des patients était de 63 ans. Vingt-huit patients étaient

fumeurs, quarante-neuf ex-fumeurs, deux non-fumeurs et, pour quinze d'entre eux, les

habitudes tabagiques n’étaient pas connues. La bronchoscopie de photodétection a été réalisée

dans le cadre d'un dépistage de cancer bronchique pour 20 patients ; chez 14 patients lors d’un

bilan pré-opératoire de cancer bronchique (10 patients) ou cervicofacial (4 patients) ; dans le

suivi d'un cancer bronchique guéri chez 40 patients ou dans le suivi d'un CIS chez 14 patients

et dans 6 cas pour des raisons diverses. Les prélèvements suivants ont été étudiés: 13

épithéliums bronchiques normaux, 19 hyperplasies, 16 métaplasies, 10 dysplasies légères, 1

dysplasie modérée, 10 dysplasies sévères, 14 CIS et 11 tumeurs microinvasives.

L'immunomarquage pour EGF-R était observé dans la couche cellulaire basale de

l'épithélium bronchique normal. Il était visible dans la couche basale mais pas dans les

couches plus superficielles de l'épithélium hyperplasique. Sept des seize métaplasies

présentaient un marquage positif pour EGF-R étendu plus haut que la couche basale mais

seulement deux cas (12 %) avaient un marquage des 3 tiers de l'épithélium. Toutes les

dysplasies légères et modérées présentaient un marquage semblable à l'épithélium normal. Six

des dix dysplasies sévères (60 %) avaient un marquage positif de toute l'épaisseur de

l'épithélium. L'épaisseur de tout l'épithélium de la majorité des CIS (86 %) et des tumeurs

microinvasives (82 %) était positive pour EGF-R (tableau 17). Cette différence de répartition

du marquage entre les stades de lésions bronchiques est statistiquement significative (chi carré

p < 0,001). Lorsque les données sont analysées en fonction des groupes définis dans la partie

statistique, il n'y a pas de différence de positivité entre les groupes histologiques 1 et 2 (p =

0,58) ni entre les groupes 4 et 5 (p = 1) mais il y a une différence statistiquement significative

entre les groupes 2 et 4 (p = 0,01).

Un grade d'intensité de marquage 2 ou 3 a été obtenu dans 1 (6 %) métaplasie, dans

aucune des dysplasies légères ou modérées, dans 6 (60 %) dysplasies sévères, dans 6 (43 %)

CIS et dans 6 (55 %) tumeurs microinvasives (test chi carré p < 0,001) (tableau 18). Il n'y a

pas de différence significative d'intensité entre les groupes histologiques 1 et 2 (p = 1) ni entre

les groupes 4 et 5 (p = 0,71) mais il y a une différence statistiquement significative entre les

groupes 2 et 4 (p = 0,006).

55

Tableau 17: Localisation de la positivité du marquage EGF-R dans les lésions

bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces: l'immunomarquage pour EGF-R

est observé dans la couche cellulaire basale de l'épithélium bronchique normal. Il est visible

dans la couche basale mais pas dans les couches plus superficielles de l'épithélium

hyperplasique. Sept des seize métaplasies présentent un marquage positif pour EGF-R étendu

plus haut que la couche basale et deux cas ont un marquage des 3/3 de l'épithélium. Toutes les

dysplasies légères et modérées présentent un marquage semblable à l'épithélium normal. Six

des 10 dysplasies sévères ont un marquage positif de toute l'épaisseur de l'épithélium.

L'épaisseur de tout l'épithélium de la majorité des CIS et des tumeurs microinvasives est

positive pour EGF-R.

Types de lésions

Groupe Nombre de

cas

0 1+ 2+ 3+

Normaux 1 13 13 0 0 0

Hyperplasies 1 19

19 0 0 0

Métaplasies 1 16 9 1 4 2

Dysplasies légères 2 10 10 0 0 0

Dysplasies modérées 3 1 1 0 0 0

Dysplasies sévères 4 10 3 1 0 6

CIS 5 14 2 0 0 12

Tumeurs micro-

invasives

5 11 2 0 0 9

0= pas de marquage ou marquage de la couche basale uniquement

1+ = marquage des cellules de la couche basale et de la région suprabasale (maximum le 1/3

inférieur de l’épithélium

2+ = marquage de cellules jusqu’à 2/3 de l’épaisseur de l’épithélium

3+ = marquage de cellules dans les 3/3 de l’épaisseur de l’épithélium

Les lésions bronchiques ont été catégorisées en 5 groupes selon l'histologie: groupe 1 =

épithelium normal, hyperplasie et métaplasie; groupe 2 = dysplasie légère; groupe 3 =

dysplasie modérée; groupe 4 = dysplasie sévère et groupe 5 = CIS et tumeurs micro-invasives.

56

Tableau 18: Intensité du marquage EGF-R dans les lésions bronchiques prénéoplasiques

et néoplasiques précoces: un grade d'intensité de marquage 2 ou 3 a été observé dans 6 %

des métaplasies, dans aucune des dysplasies légères ou modérées, dans 60 % des dysplasies

sévères, dans 43 % des CIS et dans 55 % des tumeurs micro-invasives

Types de lésions

Groupe Nombre de

cas

0 1 2 3

Normaux 1 13 0 13 0 0

Hyperplasies 1 19 4 15 0 0

Métaplasies 1 16 0 15 0 1

Dysplasies légères 2 10 0 10 0 0

Dysplasies modérées 3 1 0 1 0 0

Dysplasies sévères 4 10 1 3 4 2

CIS 5 14 2 6 6 0

Tumeurs micro-

invasives

5 11 2 3 2 4

0 = pas de marquage

1 = intensité de marquage comme l’épithélium bronchique normal

2 = marquage plus fort que l’épithélium bronchique normal

3 = marquage aussi fort que le contrôle positif de tumeur bronchique


épithelium normal, hyperplasie et métaplasie; groupe 2 = dysplasie légère; groupe 3 =

dysplasie modérée; groupe 4 = dysplasie sévère et groupe 5 = CIS et tumeurs micro-invasives.

57

Tableau 19: Score EGF-R dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques

précoces: un score EGF-R global supérieur ou égal à 5 a été obtenu dans 16 % des

métaplasies, dans aucune des dysplasies légères ni dans la dysplasie modérée, dans 60 % des

dysplasies sévères, dans 43 % des CIS et dans 55 % des tumeurs microinvasives

Types de lésions

Groupe Nombre

de cas 0 1 2 3 4 5 6

Normaux 1 13 0 13 0 0 0 0 0

Hyperplasies 1 19 4 15 0 0 0 0 0

Métaplasies 1 16 0 9 1 4 1 0 1

Dysplasies légères 2 10 0 10 0 0 0 0 0

Dysplasies modérées 3 1 0 1 0 0 0 0 0

Dysplasies sévères 4 10 1 2 1 0 0 4 2

CIS 5 14 2 0 0 0 6 6 0

Tumeurs micro-

invasives

5 11 2 0 0 0 3 2 4

Le score EGF-R a été obtenu en faisant la somme du score de positivité et du score d’intensité.


épithelium normal, hyperplasie et métaplasie; groupe 2 = dysplasie légère; groupe 3 = dysplasie

modérée; groupe 4 = dysplasie sévère et groupe 5 = CIS et tumeurs micro-invasives.

Un score EGF-R global supérieur ou égal à 5 a été obtenu dans 1 (6 %) métaplasie,

dans aucune des dysplasies légères ni dans la dysplasie modérée, dans 6 (60 %) dysplasies

sévères, dans 6 (43 %) CIS et dans 6 (55 %) tumeurs microinvasives (p < 0,001) (tableau 19)

avec les mêmes résultats statistiques que pour l'intensité entre les différents groupes

histologiques.

3.2.1.6. Conclusions

EGF-R est statistiquement plus exprimé dans les dysplasies sévères et les carcinomes

in situ que dans les lésions de grade moins élevé (21).

58

3.2.2. C-erbB-2 dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques

précoces

3.2.2.1. Population étudiée, immunohistochimie

Les critères d’éligibilité et la population de départ pour cette étude étaient similaires à

l’étude précédente sur EGF-R (voir 3.2.1.1.). De même, le protocole de marquage et la

classification histologique utilisée étaient semblables à ceux décrits précédemment (voir

3.1.2.1.1.1.).

3.2.2.2. Résultats

Septante-quatre biopsies provenant de 56 hommes et 18 femmes ont permis

l’évaluation de c-erbB-2. L’âge médian était de 63 ans. Vingt patients étaient fumeurs, 38 ex-

fumeurs, 2 non-fumeurs et, pour 14 d’entre eux les habitudes tabagiques n’étaient pas

connues. La bronchoscopie avait été réalisée chez 15 patients lors d’un dépistage du cancer

bronchique, chez 14 durant le bilan préopératoire d’une tumeur bronchique (10 patients) ou

ORL (4 patients), chez 33 dans le suivi d’un cancer bronchique en rémission ou guéri, chez 8

pour le suivi d’un CIS et chez 4 pour d’autres raisons. Neuf épithéliums bronchiques

normaux, 16 hyperplasies, 12 métaplasies, 12 dysplasies légères, 8 dysplasies sévères, 11 CIS

et 6 tumeurs microinvasives étaient évaluables.

Aucune de ces 74 lésions ne montrait de marquage pour c-erbB-2 (le contrôle positif

montrant bien un marquage 3+).


Dans notre étude, c-erbB-2 n’est pas exprimé dans les lésions bronchiques

prénéoplasiques et néoplasiques épidermoïdes précoces (22).

3.2.3. Ki-67 dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces

3.2.3.1. Population étudiée

Les critères d’éligibilité pour cette étude étaient similaires à ceux d’EGF-R (voir

3.2.1.1) mais nous avons uniquement étudié 55 biopsies (provenant de 55 patients différents)

gradées à partir du stade de dysplasie et obtenues par bronchoscopie en autofluorescence entre

mars 1996 et novembre 2000.

59

3.2.3.2. Immunohistochimie

L’immunohistochimie a été réalisée selon la méthode décrite précédement pour les

biopsies et les tumeurs réséquées (voir 3.1.2.2.2.).

3.2.3.3. Interprétation des résultats immunohistochimiques

Plusieurs biopsies présentaient différents grades de dysplasies. Pour chaque cas,

l'évaluation immunohistochimique a été réalisée sur la partie de la coupe correspondant à

l'altération histologique la plus grave. Nous avons exclu les régions où la section était coupée

tangentiellement (ce qui peut résulter en la présence de noyaux positifs dans une couche

apparemment superficielle de l'épithélium). Les lymphocytes intraépithéliaux positifs pour

Ki-67 associés à un infiltrat inflammatoire ont été différenciés des cellules épithéliales à plus

fort grossissement.

Le niveau de positivité a d'abord été exprimé en pourcentage de cellules anormales

marquées (23-25). De plus, nous avons appliqué des méthodes déjà utilisées pour classifier

l'activité proliférative observée sur des lésions précancéreuses du col utérin (26) ou du sein

(27) et de lésions cancéreuses. La première évalue la présence d’amas positifs pour Ki-67. Un

"amas" (cluster) étant défini comme un groupe d'au moins 2 cellules contiguës présentant un

noyau fortement marqué pour Ki-67 dans le tiers supérieur de l'épithélium pathologique. Par

la deuxième, pour chaque lésion, un score Ki-67 global a été calculé en faisant la somme d'un

score de proportion et d'un score d'intensité. Le score de proportion varie de 0 à 5 selon le

pourcentage de cellules positives pour Ki-67: 0 = pas de cellules marquées; 1 = <1/100

cellules marquées; 2 = 1/100 à 1/10 cellules marquées; 3 = 1/10 à 1/3 cellules marquées; 4 =

1/3 à 2/3 cellules marquées et 5 > 2/3 cellules marquées. Le score d'intensité varie de 0 à 3:

0 = pas de marquage; 1 = marquage faible; 2 = marquage modéré et 3 = marquage intense. Un

score Ki-67 global ≥ à 4 a été considéré comme positif. Un exemple de marquage est présenté

figure 9.


Des tests de Mann-Whitney et de Kruskall-Wallis ont été utilisés pour comparer la

distribution du pourcentage de cellules positives pour Ki-67 selon les groupes histologiques.

Les comparaisons entre les groupes histologiques et la présence d’amas Ki-67 ont été

réalisées par des tests de chi-carré et des tests de Fisher bilatéraux. Le niveau de signification

choisi était de p ≤ 0,05.

60

Figure 9: Exemple d'immunomarquage Ki-67 des lésions bronchiques prénéoplasiques

et néoplasiques précoces

A, C, E, G: marquage hématoxyline-éosine.

B, D, F, H: l'immunomarquage Ki-67 correspondant

A et B: dysplasie légère

C et D: dysplasie modérée

E et F: dysplasie sévère

G et H: carcinome in situ: noter la désorganisation marquée de la muqueuse bronchique très mince.

Une activité mitotique superficielle est présente.

Des groupes de noyaux de cellules positives pour Ki-67 (flèches) sont observés sur les figures

F et H mais pas sur les figures B et D.

A

H

F

D

G

E

C

B

61

3.2.3.5. Résultats

Sur les cinquante-cinq patients inclus, 45 étaient des hommes et 10 des femmes. L'âge

médian était de 62 ans. Vingt-cinq patients étaient fumeurs actifs, 25 ex-fumeurs et 2 non-

fumeurs. Pour 3 patients, les habitudes tabagiques n'étaient pas connues. La bronchoscopie en

fluorescence était réalisée chez 14 patients pour le dépistage d'un cancer bronchique, chez 10

dans le bilan préopératoire d'un carcinome bronchique (7 patients) ou cervicofacial (3

patients), 15 patients ont bénéficié de biopsies pour le suivi d'un cancer bronchique traité, 7

dans le suivi d'un CIS et 9 pour diverses raisons. Dix-sept DL, 9 DM, 11 DS et 15 CIS ont été

diagnostiqués; pour 3 lésions, aucun consensus sur le grade exact de la lésion n'a pu être

obtenu à cause des artefacts de coupes tangentielles (un cas) ou d'une inflammation très

importante et de la desquamation de l'épithélium de surface (2 cas). Ces 3 lésions ont été

exclues de l'analyse.

Une médiane (distribution) de 10 % (2-80 %), 20 % (5-70 %), 30 % (10-75 %) et 40 %

(30-70 %) de cellules positives pour Ki-67 a été trouvée respectivement dans les DL, DM, DS

et les CIS (tableau 20). L'augmentation de pourcentage de cellules positives pour Ki-67 de la

DL au CIS est statistiquement significative (p = 0,04) mais les distributions observées sont

trop étendues pour discriminer correctement les 4 groupes. Il n'y a pas de différence

significative en terme d’expression de Ki-67 lorsqu’on compare la combinaison du sous-

groupe de DL et de DM avec celle du sous-groupe de DS et des CIS .

Si l'on considère les amas de cellules positives pour Ki-67 dans le tiers supérieur de

l'épithélium, 31 % des DL, 77 % des DM, 91 % des DS et 100 % des CIS ont au moins un

amas Ki-67 en superficie de l'épithélium (tableau 21). Deux ou plus de 2 amas Ki-67 ont été

observés dans 15 % des DL et 22 % des DM, par rapport à 91 % des DS et 94 % des CIS (p <

0,01). Il n'y avait pas de différence entre les DL et les DM ni entre les DS et les CIS quand on

recherchait la présence de 2 ou plus de 2 amas Ki-67 dans le tiers supérieur de l'épithélium.

Une différence statistiquement significative (p < 0,01) en terme de distribution des amas Ki-

67 a été observée quand on combine les DL avec les DM et les DS avec les CIS. Cette

différence est accentuée quand les lésions sont évaluées pour la présence de 2 ou plus de 2

amas Ki-67.

62

Tableau 20: Etude de l’expression de Ki-67 en terme de pourcentage d’expression dans

les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces: l'augmentation de

pourcentage de cellules positives pour Ki-67 de la dysplasie légère au CIS est statistiquement

significative (p = 0,04) mais les distributions observées sont trop étendues pour discriminer

correctement les 4 groupes.

Types de lésions

Nombre de cas

Moyenne de cellules positives pour Ki-67

Médiane de cellules positives pour Ki-67

Distribution

Dysplasies légères

17 16 % 10 % 2-80 %

Dysplasies modérées 9 28 % 20 % 5-70 % Dysplasies sévères 11 38 % 30 % 10-75 % Carcinomes in situ 15 45 % 40 % 30-70 %

Tableau 21: Etude de l’expression de Ki-67 en terme d’amas dans les lésions

bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces: on ne trouvait pas de différence

entre les DL et les DM ni entre les DS et les CIS quand on recherchait la présence de 2 ou

plus de 2 amas Ki-67 dans le tiers supérieur de l'épithélium. Une différence statistiquement

significative (p<0,01) en terme de distribution des amas Ki-67 a été observée quand on

combine les DL avec les DM et les DS avec les CIS en 2 groupes. Cette différence est

accentuée quand les lésions sont évaluées pour la présence de 2 ou plus de 2 amas Ki-67.

Types de lésions

Nombre de cas Présence d’amas

1 amas 2 ou plusieurs

amas Dysplasies légères 17 31 % 15 % 15 %

Dysplasies modérées 9 77 % 55 % 22 % Dysplasies sévères 11 91 % 0 % 91 % Carcinomes in situ 15 100 % 6 % 94 %

Quand le score Ki-67 est calculé, 8 dysplasies légères (47 %), 6 modérées (67 %), 10

dysplasies sévères (91 %) et 15 (100 %) CIS ont un score supérieur ou égal à 4 (tableau 22).

A nouveau, il y a une différence statistiquement significative entre le groupe combinant les

dysplasies légères avec les modérées et le groupe combinant les dysplasies sévères plus les

CIS (p=0,05) mais il n'y a pas de différence entre les dysplasies légères et les dysplasies

modérées ni entre les dysplasies sévères et les CIS.

63

Tableau 22: Etude de l’expression de Ki-67 dans les lésions bronchiques prénéoplasiques

et néoplasiques précoces: en étudiant le score Ki-67 global qui est la somme du score de

proportion (1) et du score d’intensité (2), on trouve une différence statistiquement

significative entre le groupe combinant les dysplasies légères avec les modérées et le groupe

combinant les dysplasies sévères plus les CIS (p = 0,05) mais il n'y a pas de différence entre

les dysplasies légères et les dysplasies modérées ni entre les dysplasies sévères et les CIS.

Types de

lésions

Nombre

de cas

0 2 3 4 5 6 7 8

DL 17 0 % 18 % 12 % 24 % 29 % 12 % 5 % 0 %

DM 9 0 % 0 % 0 % 33 % 22 % 12 % 33 % 0 %

SD 11 0 % 0 % 0 % 9 % 27 % 27 % 37 % 0 %

CIS 15 0 % 0 % 0 % 0 % 13 % 40 % 47 % 0 %

Le score global est la somme du score (1) et du score (2) :

(1) Le score de proportion varie de 0 à 5 selon le nombre de cellules positives pour Ki-67:

0 = pas de cellule marquée 1 = <1/100 cellules marquées 2 = 1/100 à 1/10 cellules marquées 3 = 1/10 à 1/3 cellules marquées 4 = 1/3 à 2/3 cellules marquées 5 > 2/3 cellules marquées (2) Le score d'intensité varie de 0 à 3: 0 = pas de marquage 1 = marquage faible 2 = marquage modéré

3 = marquage intense


Cette étude montre que l'expression de Ki-67 change en fonction du grade des lésions

bronchiques prénéoplasiques en augmentant de la dysplasie légère au CIS. Il existe une

différence statistiquement significative entre le groupe des dysplasies légères et modérées par

rapport à celui des dysplasies sévères et des CIS. Ces résultats suggèrent que, lorsque l'on

64

considère l'activité proliférative, les dysplasies sévères ont un comportement similaire à celui

des CIS et non à celui des dysplasies de bas grade (28).

3.2.4. Nombre de micro-vaisseaux dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et

néoplasiques précoces

La néoangiogenèse est la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de

l’endothélium de la vascularisation existante. Cette néoangiogenèse est fondamentale dans les

processus de croissance tumorale et de progression tumorale ainsi que dans le développement

de métastases. Quand une tumeur atteint une taille de 1 à 2 mm, sa croissance et son

expansion requièrent l’induction de nouveaux vaisseaux. L’angiogenèse tumorale est un

processus complexe impliquant des facteurs de croissance et des enzymes de la matrice extra-

cellulaire. Ainsi, l’activation d’EGF-R augmente la production de molécules angiogéniques

telles que VEGF. Il en résulte un effet indirect d’EGF-R sur l’angiogenèse. Nous avons voulu

étudier l’association entre les changements morphologiques de l’épithélium bronchique, le

statut angiogénique et l’expression d’EGF-R.

3.2.4.1. Population étudiée

Les critères d’éligibilité et la population étudiée étaient similaires à ceux pris pour

l’étude d’EGF-R (voir 3.2.1.1.).

3.2.4.2. Immunohistochimie

Nous avons utilisé la technique décrite pour EGF-R (voir 3.1.2.1.1.1.).

Pour le comptage des micro-vaisseaux (NMV), un anticorps monoclonal de souris

(IgG1; clone QBEND10 de Immunotech ; Marseille, France ) dirigé contre l’antigène CD34

présent sur les cellules vasculaires endothéliales a été choisi. Le démasquage de l’antigène a été

réalisé par chauffage des lames dans de l’acide citrique monohydrate 0,01 M pH 6, au four à

micro-ondes à 650 W pour 3 durées successives de 5 min. Elles ont ensuite été refroidies

pendant 25 minutes à température ambiante puis rincées deux fois dans du tampon TRIS-HCl

0,05 M NaCl 0,09 % pH 7,6 pendant 10 minutes. Toutes les autres étapes ont été réalisées

automatiquement à 37° C par le système NexES (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ,

USA). La peroxydase endogène a été inhibée par du peroxyde d’hydrogène pendant 4 minutes.

L’anticorps CD34 (titration finale 0,2 mg/ml) a été déposé et a incubé pendant 30 minutes. Le

complexe entre la protéine et l’anticorps a été fixé par du glutaraldéhyde NaCl 0,9 %.

L’anticorps secondaire biotinylé a incubé pendant 8 minutes. Les lames ont été marquées avec

le kit de détection diaminobenzidine (DAB) (Ventana Medical Systems, Tucson AZ, USA) et

65

contre-colorées avec de l’hématoxyline. Les contrôles négatifs ont été réalisés en omettant

l’anticorps primaire.

3.2.4.3. Interprétation de l’immunohistochimie

Pour EGF-R, les critères d’interprétation ont été décrits plus haut. Pour le NMV, un

micro-vaisseau a été défini comme toute cellule endothéliale immunomarquée séparée d’un

micro-vaisseau adjacent, d’une cellule tumorale et d’autres éléments du tissu conjonctif. Le

nombre de micro-vaisseaux CD34 positifs présents dans et sous la lésion a été compté à faible

grossissement (200x) selon la technique de Weidner. En cas de “hotspots” (zones les plus

vascularisées) multiples, la valeur moyenne de deux ou trois aires les plus vascularisées a été

considérée. Des exemples d’immunomarquage par CD34 sont présentés figure 10.


Des tests non paramétriques ont été utilisés pour comparer les distributions du NMV

selon l’histologie (tests de Mann-Whitney ou tests de Kruskal-Wallis). La comparaison de

l’expression d’EGF-R et du NMV a été réalisée grâce à des tests de Wilcoxon.

3.2.4.5. Résultats

Quatre-vingt-trois biopsies ont pu être évaluées pour le NMV : 4 épithéliums

bronchiques normaux, 23 hyperplasies, 26 métaplasies, 2 dysplasies légères, 5 dysplasies

modérées, 9 dysplasies sévères, 3 CIS, 6 carcinomes épidermoïdes micro-invasifs et 5

micropapillomatoses. Cette dernière lésion consiste en touffes de capillaires juxtaposées aux

cellules épithéliales métaplasiques. Ces capillaires se projettent dans la muqueuse bronchique

en formant des structures papillaires microscopiques (29). Dans aucun de ces 5 cas,

l’épithélium ne montrait de signes de dysplasie (figure 11).

La distribution du NMV selon l’histologie est rapportée tableau 23. En appliquant des

tests de Kruskal-Wallis à l’ensemble des lésions, nous avons mis en évidence une différence

statistiquement significative en terme de NMV (p = 0,006) avec une nette augmentation du

NMV dans les carcinomes micro-invasifs. En dichotomisant les sous-groupes histologiques,

nous avons observé une différence statistiquement significative entre les carcinomes micro-

invasifs et toutes les autres lésions et entre les micropapillomatoses et toutes les autres lésions.

Il y avait également une différence statistiquement significative entre les micropapillomatoses

et les carcinomes micro-invasifs. Les micropapillomatoses apparaissent comme les lésions les

plus vascularisées. Il n’y avait pas de différence significative en terme de NMV entre les

muqueuses normales, les métaplasies, les hyperplasies, les dysplasies et les CIS.

66

Figure 10: Exemple de marquage par le CD34 pour l’évaluation du nombre des micro-

vaisseaux des lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces: les

micropapillomatoses et dans une moindre mesure les carcinomes micro-invasifs apparaissent comme

les lésions les plus vascularisées. Les autres lésions ne présentent que peu de micro-vaisseaux.

(A) Micropapillomatose (B) Dysplasie légère (C) Carcinome micro-invasif

67

Figure 11: Exemple de micropapillomatose (marquage HE): cette lésion consiste en touffes

de capillaires juxtaposées aux cellules épithéliales métaplasiques. Ces capillaires se projettent dans la

muqueuse bronchique en formant des structures papillaires microscopiques.

Tableau 23: Etude du nombre des micro-vaisseaux dans les lésions bronchiques

prénéoplasiques et néoplasiques précoces: on ne trouve pas de différence significative en

terme de NMV entre les muqueuses normales, les métaplasies, les hyperplasies, les dysplasies

et les CIS mais bien entre les carcinomes micro-invasifs et toutes les autres lésions et entre les

micropapillomatoses et toutes les autres lésions. Il y a également une différence statistiquement

significative entre les micropapillomatoses et les carcinomes micro-invasifs. Les

micropapillomatoses apparaissent comme les lésions les plus vascularisées.

Types de lésions

Nombre de cas

NMV (médiane)

NMV (moyenne)

NMV (étendue)

No+H+Me 53 11 13 1-30 DL 2 22 22 22 DM 5 14 14 7-24 DS 9 8 13 5-24 CIS 3 15 13 5-19 CMI 6 27 31 16-71 MP 5 41 51 38-73

68

Pour 62 patients, nous avions assez de tissus biopsiques pour comparer le NMV et

l’expression d’EGF-R. Ces biopsies incluaient 3 épithéliums normaux, 15 hyperplasies, 20

métaplasies, 2 dysplasies légères, 2 dysplasies modérées, 7 dysplasies sévères, 3 CIS, 5

carcinomes micro-invasifs et 5 micropapillomatoses. La distribution d’EGF-R selon

l’histologie est rapportée tableau 24. EGF-R était plus exprimé dans les dysplasies sévères, les

CIS et les carcinomes micro-invasifs alors qu’il était très peu exprimé dans les

micropapillomatoses. On a retrouvé une différence statistiquement significative entre

l’expression d’EGF-R et le NMV (p < 0,001) dans ces catégories.

Tableau 24: Comparaison du nombre des micro-vaisseaux avec l’expression d’EGF-R

dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces: EGF-R est

surexprimé à partir du stade de la dysplasie sévère alors que le NMV ne s’élève réellement

qu’à partir du stade de CMI ; l’expression d’EGF-R semble donc précéder la néoangiogenèse.

Types de lésions Nombre des cas

NMV (médiane)

EGF-R grade (médiane)

EGF-R grade (étendue)

No+H+Me 38 12 1 0-6 DL 2 22 1 1-1 DM 2 19 2,5 0-5 DS 7 8 5 4-5 CIS 3 15 5 5-5 CMI 5 31 4 0-6 MP 5 41 0 0-3


A l’exception des micropapillomatoses, l’expression d’EGF-R est un facteur plus

précoce que le développement de la néoangiogenèse dans la carcinogenèse bronchique (30).

4. Synthèse, limitations des études et discussion Nos travaux ont permis de confirmer notre hypothèse : l’expression de certains

marqueurs (EGF-R et Ki-67) apparaît précocement, dès les stades prénéoplasiques, avec un

seuil se situant entre les lésions bronchiques de bas et de haut grade. La néoangiogénèse,

évaluée par le nombre des micro-vaisseaux, s’observe, quant à elle, à partir des cancers micro-

invasifs tandis que c-erbB-2 n’apparaît qu’au stade invasif.

69

4.1. Revues systématiques de la littérature avec méta-analyses

La réalisation préalable de revues systématiques d’une littérature abondante et confuse

nous a permis de choisir une série de marqueurs à étudier dans les CBNPC. Les méta-analyses

des données de survie ont permis de démontrer l’intérêt potentiel de certains marqueurs grâce

à la puissance apportée par l’agrégation de grands nombres de cas. Cette approche nous a

conduits à sélectionner 4 marqueurs: le récepteur au facteur de croissance épidermique (EGF-

R) et un autre récepteur de cette famille (c-erbB-2) ainsi que deux autres facteurs

potentiellement témoins de leur activité, Ki-67 (impliqué dans la prolifération) et le nombre

des micro-vaisseaux (témoins de la néoangiogenèse). Dans nos méta-analyses, c-erbB-2, Ki-

67 et le NMV sont des facteurs de mauvais pronostic pour la survie des patients atteints de

CBNPC. De plus, EGF-R présente un intérêt tout particulier en clinique .

Depuis ces méta-analyses, de nouvelles études sont parues et de nouvelles méta-

analyses ont été publiées. Nakamura (31;32) a aussi réalisé des méta-analyses des

observations publiées évaluant la survie des patients atteints des CBNPC. Il a également

montré que c-erbB-2 est un facteur de mauvais pronostic pour la survie. En ce qui concerne

EGF-R, il n’a pas trouvé d’impact sur le pronostic, même en ne considérant que les études

évaluant ce marqueur par IHC.

Il convient de discuter certains aspects liés à la méthodologie de l’approche que nous

avons choisie pour analyser la littérature. En effet, certains considèrent que les méta-analyses

basées sur les données individuelles des patients inclus dans les études doivent être préférées

à celles basées sur les publications. Il s’agit en fait de deux approches différentes. Une revue

systématique de littérature est une analyse de la littérature avec une méthodologie adéquate

qui peut être contrôlée par les lecteurs. Cette approche est uniquement basée sur les études

publiées et permet une analyse exhaustive et critique du sujet avec agrégation des résultats

(méta-analyse) si possible. Les méta-analyses des données individuelles sont quant à elles de

nouvelles études prenant en compte tous les travaux sur le sujet qu’ils soient publiés ou non et

avec une mise à jour des données individuelles des patients par les investigateurs.

Nos analyses ont été réalisées en agrégeant uniquement les résultats de survie rapportés

en analyse univariée. La décision de réaliser la méta-analyse était basée sur une évaluation

qualitative préalable de la méthodologie de ces études. Pour ce faire, une échelle spécifique

pour l’évaluation des facteurs pronostiques biologiques basée sur notre expérience dans le

domaine a été créée (33), dans le but de mettre en évidence d’éventuelles différences

suggérant un biais induit par la méthodologie des études. L’absence de différence de qualité

entre les études significatives et non significatives est un arguement en faveur d’une

70

agrégation interprétable des résultats. Malgré la méthode utilisée, tous les biais ne peuvent

être évités. Le plus important est le biais de publication. Les études rapportant des résultats

non significatifs sont moins souvent publiées et les études non significatives qui sont publiées

le sont avec des résultats moins bien détaillés. Un autre biais potentiel concerne la langue de

publication: nos revues sont limitées aux articles publiés en anglais ou en français ce qui peut

favoriser les études significatives, plus souvent publiées en anglais. Une autre source possible

de confusion est l’utilisation par les auteurs de cohortes similaires de patients dans des

publications différentes, au risque d’inclure les mêmes malades plusieurs fois dans la méta-

analyse, avec comme corrolaire une pondération plus forte des résultats de ces études. Nous

avons donc essayé d’écarter les études pour lesquelles nous pouvions avec certitude identifier

des cohortes de patients identiques. Nous avons tenté d’obtenir cette information des auteurs

le plus souvent sans obtenir de réponse. Une autre cause de biais potentiels concerne les

techniques utilisées par les auteurs pour identifier l’expression des facteurs biologiques. La

plupart utilisent des techniques d’IHC. Cependant les techniques de mise en évidence du

marqueur (type d’anticorps, dilution de celui-ci, démasquage de l’antigène…) sont variables

d’une étude à l’autre. Le seuil de positivité d’une tumeur pour un marqueur est souvent

arbitraire et varie d’un auteur à l’autre. Un seuil optimal n’a pas encore été déterminé. Des

biais peuvent également être dus à la méthode employée pour réaliser la méta-analyse

notamment pour estimer le HR. Régulièrement, le HR a été extrapolé à partir des courbes de

survie en imaginant le processus de censure comme constant au cours du temps et le choix

des intervalles de temps pour la lecture sur les courbes n’est pas consensuel. Finalement, nos

résultats sont basés sur une agrégation de données d’analyse univariée de la survie d’études en

majorité rétrospectives. C'est pourquoi ces résultats doivent être validés par des études

prospectives en tenant compte des facteurs pronostiques classiques et bien définis pour le

cancer bronchique dans une analyse multivariée.

4.2. Etude de marqueurs biologiques sur des pièces chirurgicales

Dans une deuxième phase, nous avons étudié au laboratoire diverses questions sur des

tumeurs bronchiques invasives.

4.2.1. Etude de l’expression protéique et génique d’EGF-R et de c-erbB-2

Nous avons investigué le mécanisme de surexpression d’EGF-R et de c-erbB-2 et

étudié si des anomalies géniques pouvaient prédire cette surexpression en recourant à des

techniques d’IHC et de FISH. Ceci nous a permis d’observer que, si la majorité des CBNPC

réséqués présentent des anomalies géniques d’EGF-R et/ou de c-erbB-2, une amplification de

ces gènes n’est présente que dans une minorité d’entre eux et n’est pas strictement corrélée à

71

l’expression protéique. Comme dans nos méta-analyses, nous avons observé que les patients

dont la tumeur surexprime EGF-R et/ou c-erbB-2 et/ou présente une anomalie de ces gènes

avaient une survie plus courte. Ces différences n’étaient cependant pas statistiquement

significatives.

Nous avons observé 40 % de tumeurs positives pour l’expression protéique d’EGF-R.

Le mécanisme moléculaire exact de la surexpression d’EGF-R n’est pas connu. Cette

surexpression est probablement le résultat de différents mécanismes incluant l’amplification

génique, des mutations géniques, des événements transcriptionnels ou post-transcriptionnels.

Dans la littérature, 0 à 27 % d’amplifications du gène d’EGF-R sont observées (34-41). Le plus

souvent, la protéine est surexprimée quand le gène est amplifié (39;42;43). Cependant,

certaines tumeurs ont un statut génique normal mais surexpriment la protéine (43;44). Nous

n’avons pas retrouvé d’amplification du gène d’EGF-R et nous avons observé que seulement

38 % des tumeurs surexprimant EGF-R avaient des anomalies du nombre de gènes. Ceci

suggère que la surexpression d’EGF-R est probablement contrôlée par d’autres mécanismes tels

que des événements transcriptionnels ou postranscriptionnels (45-47). La surexpression d’EGF-

R pourrait également être la conséquence d’une polysomie du chromosome 7 (39) ou d’une

mutation (48).

Nous avons trouvé 22 % de surexpression de c-erbB-2. La surexpression de cette

protéine peut être la conséquence de différents mécanismes. Un mécanisme pouvant expliquer

la surexpression est l’amplification génique. Dans notre travail, nous n’avons mis en évidence

que 6 % d’amplification génique. Dans la littérature, 2 à 14 % d’amplifications du gène de c-

erbB-2 sont observées par FISH (40;49-52) et pour certains il existe une bonne corrélation

entre la surexpression et cette amplification (53). D’autres techniques ont également été

utilisées pour évaluer cette amplification. Un nombre normal de copies du gène de c-erbB-2 a

été retrouvé dans 94 % des cas de CBNPC évalués par PCR (41). Par une méthode

d’hybridation quantitative de l’ADN, Harpole (54) a observé 6% d’amplification dans des

tumeurs c-erbB-2 positives en immunohistochimie et Shiraishi (34) n’a trouvé qu’un cas

d’amplification sur 51 adénocarcinomes. Finalement, par analyse de type southern,

l’amplification du gène de c-erbB-2 est également rare: 2/60 CBNPC pour Schneider (55). La

surexpression de c-erbB-2 pourrait également être la conséquence d’une polysomie du

chromosome 17. Dans notre série, 73 % des tumeurs qui surexprimaient c-erbB-2 présentaient

une anomalie génique mais très peu une amplification. En particulier, nous avons trouvé 7 cas

de polysomie du chromosome 17 dont 4 surexprimaient la protéine. Une augmentation du

nombre de gènes sans réelle amplification a également été observée dans 13 cas dont 9

72

surexprimaient la protéine. Des anomalies chromosomiques plutôt qu’une réelle amplification

du gène de c-erbB-2 pourraient donc expliquer la surexpression de c-erbB-2. Une autre cause

de surexpression de c-erbB-2 pourrait être une activation de mécanismes transcriptionels ou

posttranscriptionels: nous avons observé que 27% des patients présentant une surexpression

avait une disomie balancée. En effet, une surexpression de l’ARN messager de c-erbB-2 serait

fréquente dans les CBNPC (56). Trois des six patients présentant une amplification en FISH

ne surexprimaient pas la protéine. Cette différence entre l’IHC et le FISH pourrait être due à

des perturbations des mécanismes de transcription. Finalement, des mutations du gène de c-

erbB-2 pourraient également jouer un rôle dans l’expression de cette protéine (57;58).

De nombreux problèmes peuvent être liés à la technique. Aucun protocole standard

d’immunohistochimie n’a été développé pour le cancer bronchique. Des variations dans la

fixation des tissus, dans la sensibilité et la spécificité des anticorps et des différences dans

l’interprétation du marquage peuvent modifier les résultats (59). Par exemple, seul le

marquage membranaire est pris en considération dans l’HercepTest® et non le marquage

cytoplasmique. De plus, l’anticorps utilisé peut modifier les résultats. Pour c-erbB-2, nous

avons choisi le clone CB11 qui est utilisé en routine dans notre laboratoire. Finalement, le

seuil utilisé pour déterminer la positivité d’une tumeur peut également affecter les résultats.

Le seuil de positivité d’une tumeur est une notion relative sans signification biologique. Pour

les méta-analyses nous avons utilisé le terme de « surexpression » dès qu’une tumeur

présentait un taux d’expression du marqueur plus élevé que le seuil choisi par les auteurs. En

ce qui concerne nos travaux, pour c-erbB-2, nous avons décidé d’utiliser le seuil approuvé

dans le cancer du sein. Pour EGF-R, le seuil de 1 % a été utilisé. En effet, pour EGF-R, il n’y

a pas de seuil validé. De plus, 1% semblait être le seuil le plus adéquat lorsque nous avons

étudié différentes valeurs en utilisant des courbes ROC. Le terme de « surexpression » a dès

lors été utilisé pour les tumeurs présentant plus de 1% de cellules positives même si une

expression faible au niveau notamment des cellules basales de l’épithélium est normale.

Les résultats obtenus par FISH sont plus reproductibles. C’est une méthode sensible et

spécifique mais plus chère et plus longue. Nous avons utilisé le kit PathVysion (approuvé par la

FDA) qui s’est montré très reproductible entre laboratoires pour l’évaluation de Her-2/Neu

dans le cancer du sein (60). Malheureusement, il n’existe pas de critère uniforme pour définir

l’amplification; un rapport gène/chromosome > 2 est le plus souvent considéré comme

amplification (43;49;51) mais d’autres paramètres peuvent être utilisés (50;52). Le FISH

permet une évaluation numérique des gènes. Dès lors, d’autres techniques sont nécessaires pour

mieux comprendre les anomalies de ces protéines/gènes. Par northern blot, Reissman (36) a

73

observé que 13% des CBNPC surexprimaient l’ARNm d’EGF-R dont un tiers ne présentaient

pas d’amplification mais tous surexprimaient la protéine.

La présence d’anomalies quantitatives des gènes d’EGF-R ou de c-erbB-2 n’explique

donc pas tous les cas de surexpression de ces protéines.

4.2.2. Corrélation entre EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67

Nous avons également recherché sur des tumeurs réséquées d’éventuels liens entre les

expressions d’EGF-R et de c-erbB-2 (2 récepteurs de facteurs de croissance appartenant à la

même famille de tyrosines kinases) et entre leur expression et celle de Ki-67, témoins de la

prolifération tumorale. Aucune corrélation n’a été mise en évidence entre l’expression de ces

trois facteurs. Ceci suggère qu’il n’y a pas d’interaction directe entre EGF-R ou c-erbB-2 et la

prolifération cellulaire évaluée par Ki-67. Un biais potentiel doit cependant être envisagé: Ki-

67 est un index de la prolifération cellulaire mais cet index n’est pas le seul paramètre

déterminant la prolifération tumorale. En effet, la durée du cycle cellulaire et le taux de mort

cellulaire sont d’autres facteurs importants pour la croissance tumorale. Ki-67 évalue

uniquement la prolifération cellulaire intrinsèque. D’autres marqueurs évaluant la

prolifération, telle la thymidine kinase 1 (TK1), une enzyme clé impliquée dans la synthèse

des précurseurs de l’ADN, pourrait être un marqueur plus fiable (61). Dazzi (44) a, quant à lui,

observé que les tumeurs avec un index de prolifération bas (évalué par cytométrie de flux)

étaient plus souvent positives pour EGF-R. Par contre, EGF-R et le PCNA (un autre marqueur

de prolifération) se comportent de façon similaire dans les carcinomes épidermoïdes (62).

L’expression de Ki-67 ne semble donc pas refléter la prolifération liée à EGF-R. Ceci a

également été observé plus récemment par Niemiec (63). De plus, l’implication d’EGF-R dans

les cancers ne se limite pas à la prolifération cellulaire, il joue également un rôle dans

l’angiogenèse, la motilité cellulaire et l’invasion. Ces éléments ne sont pas évalué par Ki-67.

L’impact d’EGF-R sur la prolifération cellulaire pourrait être plus important dans les

premières étapes de la carcinogenèse.

L’absence de corrélation entre EGF-R et c-erbB-2 dans les tumeurs pulmonaires a déjà

été mise en évidence par d’autres auteurs (41;64-66). Pour certains les patients porteurs d’une

tumeur surexprimant les deux récepteurs auraient un moins bon pronostic (67) mais ceci n’a

pas été confirmé par d’autres (68). Au cours de notre travail, nous n’avons pas mis en

évidence de différence de survie pour les patients dont les tumeurs expriment EGF-R ou c-

erbB-2. Ceci peut être dû au petit nombre de patients et/ou au fait que le poids pronostique de

ces facteurs est probablement faible. Par contre, chez ces malades, l’expression de Ki-67 dans

74

la tumeur s’est avérée être un facteur de mauvais pronostic pour la survie. Ceci doit cependant

être interprété avec prudence, seulement 3% des patients n’exprimant pas Ki-67.

4.3. Etude de marqueurs biologiques sur des tumeurs plus avancées

4.3.1. Corrélation biopsies/tumeurs

Dans la plupart des études, les paramètres biologiques sont évalués par

immunohistochimie sur des tissus obtenus au moment de la résection chirurgicale de la tumeur

primitive, fixés au formol et conservés en paraffine et non pas sur des biopsies. Nous avons

comparé l’expression immunohistochimique d’EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67 sur des biopsies et

sur le tissu chirurgical correspondant afin d’évaluer si les résultats obtenus sont similaires.

Nous avons observé plus de 80 % de résultats concordants en comparant les biopsies et les

pièces chirurgicales réséquées chez les mêmes patients avec un faible taux de faux positifs et

négatifs et de bonnes valeurs prédictives positive et négative. Ceci indique que les biopsies

bronchiques fournissent de bonnes informations sur le statut de ces facteurs biologiques malgré

la faible quantité de tissu analysé. Nous avons observé un taux d’expression d’EGF-R plus bas

sur les pièces chirurgicales en comparaison avec les biopsies. Cette différence peut provenir

d’un échantillonnage différent et des diverses techniques utilisées pour obtenir le matériel mais

pourrait aussi être due à des variations de marquage d’EGF-R selon la localisation dans la

tumeur. Premièrement, il peut y avoir des différences en terme de fixation dans le formol entre

les petites biopsies (rapidement fixées) et les prélèvements chirurgicaux plus grands (plus

lentement fixés) étant donné le temps nécessaire à la pénétration du formol. Deuxièmement,

certaines tumeurs peuvent être trop nécrotiques pour marquer correctement EGF-R. Nous avons

également observé que la distribution d’EGF-R est hétérogène dans la tumeur or nous n’avons

pas analysé toute la tumeur. Malgré l’hétérogénéité de la tumeur et la présence de zones

nécrotiques, les résultats obtenus sur les biopsies et les prélèvements chirurgicaux sont

concordants dans la majorité des cas, montrant que les biopsies peuvent fournir des

renseignements corrects sur les caractéristiques des CBNPC.

L’évaluation des marquages immunohistochimiques sur des échantillons biopsiques est

cliniquement important. Premièrement, une chimiothérapie néoadjuvante est actuellement

parfois administrée dans les CBNPC. Comme la chimiothérapie peut modifier les

caractéristiques biologiques d’une tumeur ou rendre cette tumeur trop nécrotique pour être

correctement évaluée, il peut être utile d’évaluer ces caractères biologiques avant résection

chirurgicale. De plus, les caractéristiques biologiques d’une tumeur obtenue avant chirurgie

pourraient aider dans le futur à identifier des sous-groupes de patients avec des tumeurs

résécables qui seraient le plus susceptibles de bénéficier d’un traitement (néo)adjuvant (69).

75

Deuxièmement, cette caractérisation pourrait aider à sélectionner des traitements pour les

cancers non opérables. Dans les tumeurs avancées, le seul matériel disponible se résume

souvent à de petites biopsies. Les inhibiteurs de fonction tyrosine kinase d’EGF-R (gefitinib,

erlotinib) semblent être d’un grand intérêt avec plus de 10 % de taux de réponse et 6 mois de

survie médiane dans les CBNPC avancés déjà traités par chimiothérapie. En Belgique, sur plus

de 500 patients atteints de CBNPC traités par gefitinib, le taux de réponse décrit est de 9% avec

une survie médiane de 5 mois (70). Le statut EGF-R d’une tumeur pourrait aider à sélectionner

des patients pour ces thérapeutiques ciblées. Comme la majorité des tumeurs n’a pas été

réséquée chirurgicalement, la seule manière de les évaluer est l’analyse des biopsies. Sur base

de l’étude BR21 qui a montré un avantage en terme de survie dans les CBNPC après une

première ou une deuxième ligne de chimiothérapie (71), l’erlotinib est actuellement enregistré

et remboursé en Belgique chez les patients atteints d’un cancer bronchique non à petites

cellules localement avancé ou métastatique progressant après une première ligne de

chimiothérapie et dont la tumeur exprime EGF-R dans plus de 10 % des cellules en

immunohistochimie. En effet, dans cette étude, en analyse multivariée la survie des patients

dont la tumeur surexprimait EGF-R était meilleure chez les patients traités par erlotinib que

chez les patients traités par placebo (72). Un traitement par inhibiteur de la tyrosine kinase

d’EGF-R est donc proposé comme thérapie de sauvetage dans les recommandations cliniques

(73;74). Il faut cependant noter, qu'à l'heure actuelle, il n'est pas certain que la surexpression

d'EGF-R (mise en évidence par immunohistochimie) puisse prédire la réponse aux inhibiteurs

des tyrosines kinases d'EGF-R, cette surexpression n’étant pas parfaitement corrélée à la

réponse observée avec les anti-EGF-R. Ainsi, dans les essais de phase 2 et 3 du gefitinib, de

remarquables réponses ont été obtenues dans les adénocarcinomes (particulièrement parmi les

bronchiolo-alvéolaires), où pourtant EGF-R est moins exprimé que dans les carcinomes

épidermoïdes. D’autres auteurs n’ont pas trouvé de corrélation entre l’expression protéique

d’EGF-R et la réponse au gefitinib (75). De nombreuses mutations du domaine tyrosine kinase

d’EGF-R ont été mises en évidence (76;77). Ces mutations hétérozygotes sont le plus souvent

de petites délétions ou des substitutions d’acides aminés dans les exons 21, 19, 20 ou 18. Elles

sont plus fréquentes chez les femmes, les non-fumeurs, les Asiatiques de l’Est et dans les

adénocarcinomes. Elles pourraient conférer au patient un avantage en termes de survie (78).

Certains auteurs ont observé que ces mutations expliquaient la majorité des réponses au

gefitinib (76;77;79-83) mais que la survie n’était pas influencée par l’existence de ces

mutations (82). Pour d’autres auteurs, les patients traités par gefitinib qui ont une mutation du

gène d’EGF-R auraient aussi une meilleure survie (83;84). En ce qui concerne l’erlotinib la

76

présence de mutations serait aussi un facteur prédictif de réponse mais pas d’une meilleure

survie (72). Selon Cappuzzo (85), bien que l’amplification /polysomie d’EGF-R, sa

surexpression protéique et l’existence de mutations soient prédictives d’une réponse au

gefitinib en analyse multivariée, seul un nombre élevé de copies du gène d’EGF-R (polysomie

ou amplification) mis en évidence par FISH serait prédictif d’une meilleure survie chez les

patients traités par cet inhibiteur d’EGF-R; ceci a été confirmé par Hirsh (86) dans les

carcinomes bronchioloalvéolaires. L’existence de mutations n’est cependant pas une condition

sine qua non pour avoir une réponse au gefitinib (87). Certaines molécules situées plus bas

dans la cascade d’activation d’EGF-R pourraient être importantes : les patients dont la tumeur

exprime p-AKT mais pas p-ERK auraient la meilleure réponse au gefitinib (80). De même,

ceux dont la tumeur exprime PIK3CA (qui régule positivement Akt) ou PTEN (qui le régule

négativement) en plus d’une mutation d’EGF-R ont une survie meilleure lorqu’ils sont traités

par gefitinib (88). Finalement, d’autres facteurs pourraient jouer un rôle dans la sensibilité aux

anti-EGF-R. Les mutations de K-ras seraient par contre un marqueur de résistance au gefitinib

(89). L’expression protéique de c-erbB-2 n’est pas prédictive de la réponse au gefitinib mais un

nombre élevé de copies de ce gène l’est chez les patients avec une tumeur EGF-R positive et

améliore leur survie (90). En résumé, certains facteurs biologiques pourraient donc aider à

cibler les patients les plus susceptibles de bénéficier d’une thérapie par un agent anti-EGF-R.

Cependant, la technique la plus appropriée et surtout le ou les types d’anomalies biologiques à

rechercher ne sont pas encore clairement établis. Cette partie de la discussion nous a permis

d’insister sur les applications récemment introduites en pratique clinique réalisées à partir de

travaux sur la biologie du cancer.

4.3.2. EGF-R dans les stades III

Nous n’avons pas observé de différence significative en terme de survie entre les

patients ayant une tumeur qui surexprime EGF-R et ceux dont la tumeur ne le surexprime pas.

Dans notre méta-analyse, nous avons montré que l’impact d’EGF-R sur la survie est peu

important. En étudiant EGF-R dans un groupe plus homogène de patients tels que les stades III,

on élimine le facteur confondant du stade et on se met dans de meilleures conditions pour

essayer de détecter un impact de l’expression d’EGF-R. Toutefois, le nombre de patients inclus

dans cette étude est probablement trop faible pour démontrer un éventuel petit effet. D’autres

biais potentiels ont pu interférer avec nos résultats. Il s’agit d’une étude rétrospective et nous

n’avions pas assez de matériel pour étudier EGF-R chez certains patients. Comme déjà discuté,

la technique d’immunohistochimie et le seuil ne sont pas validés.

77

4.4. Lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces

Dans la dernière partie, nous avons étudié des lésions représentatives des différents

stades prénéoplasiques et des néoplasies précoces radiooccultes. Ces lésions ont été prélevées

lors d’examens endoscopiques de photodétection. Les échantillons obtenus sont de très petite

taille de par la nature des lésions. EGF-R, c-erbB-2, Ki-67 ainsi que le nombre des micro-

vaisseaux ont été étudiés par immunohistochimie dans ces différents stades de lésions

prénéoplasiques et néoplasiques précoces. Nous avons observé qu’EGF-R et Ki-67 sont

statistiquement plus exprimés dans les dysplasies sévères et les carcinomes in situ (lésions de

haut grade) que dans les lésions de grade moins élevé (dysplasie légère et modérée) suggérant

que, au moins pour ces deux marqueurs, les dysplasies sévères se rapprochent plus des

carcinomes in situ que des dysplasies légères. Alors que l’expression d’EGF-R est présente

dès le stade de dysplasie sévère, une augmentation du nombre des micro-vaisseaux n’est

présente qu’au stade de tumeurs microinvasives. C-erbB-2 n’est quant à lui pas exprimé dans

ces lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces.

4.4.1. EGF-R dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces

Nous avons observé qu’EGF-R est statistiquement plus exprimé dans les dysplasies

sévères et les carcinomes in situ (lésions de haut grade) que dans les lésions de grade moins

élevé.

D’autres auteurs ont également montré que l’expression d’EGF-R augmente avec la

sévérité des lésions de la muqueuse bronchique. Yoneda a montré que des cellules positives

pour EGF-R se retrouvaient de plus en plus vers la périphérie de l'épithélium (tout comme les

anomalies cytogénétiques) évoluant de la métaplasie aux dysplasies et finalement aux CIS

(dans lesquels la totalité de l'épaisseur de l'épithélium comprend des atypies cytologiques avec

des cellules immunopositives pour EGF-R) (62). Rusch (91) a trouvé que l'expression d'EGF-

R n'est pas associée à un type particulier de lésion préinvasive. Dans cette étude, le marquage

EGF-R existe aussi bien dans les métaplasies que dans les dysplasies et les CIS, bien qu’il soit

plus intense et implique plus les couches superficielles de l'épithélium dans les dysplasies et

les CIS. Piyathilake (92) a décrit, dans 46 hyperplasies et 60 métaplasies, un taux d'expression

plus élevé d'EGF-R que dans l'épithélium normal avec une expression plus importante dans

les cellules basales que dans les cellules les plus proches de la lumière bronchique et plus

particulièrement un marquage cytoplasmique. De plus, il a observé que l'expression d'EGF-R

était plus importante dans la membrane cellulaire dans 8 lésions dysplasiques et dans 60

cancers bronchiques, ce qui suggère un déplacement du cytoplasme à la membrane à partir du

stade de dysplasie. Finalement, Kurie (93), dans une étude évaluant l'effet d'un traitement par

78

l’acide 13-cis rétinoïque, a démontré que l'expression d'EGF-R était plus importante dans les

métaplasies que dans l'épithélium normal et qu’une diminution de l'expression d'EGF-R était

associée dans 50% des cas à une réversibilité de la métaplasie. Dans les lésions préinvasives

de la muqueuse cervico-faciale, Grandis (94) a trouvé des résultats similaires aux nôtres: le

niveau d'expression d'EGF-R était relativement faible dans les dysplasies légères et

augmentait dans les grades plus sévères. Il existe donc, dans les lésions du tractus respiratoire,

une augmentation liée à leur sévérité du taux d'EGF-R en terme de pourcentage de cellules

immunomarquées et/ou en terme de localisation des cellules positives.

Notre étude est la première à mettre en évidence une différence entre les différents

grades de dysplasies. Il est cependant difficile de comparer les résultats de tous ces auteurs

avec les nôtres: premièrement, parce qu'ils n'utilisent pas la dernière classification

OMS/IASLC et qu'ils ont groupé les différents grades de dysplasies; deuxièmement, le seuil

de positivité d'EGF-R était différent selon les études

Certaines limitations spécifiques à notre travail doivent cependant être notées.

Premièrement, le nombre de patients est réduit. De plus, le nombre de dysplasies modérées est

bas et nous avons dû les exclure de notre analyse statistique. Notre analyse ne peut donc pas

examiner si le seuil se trouve entre dysplasie légère et sévère ou entre dysplasie modérée et

sévère. Deuxièmement, nous avons utilisé l'immunohistochimie pour détecter l'expression

d'EGF-R et il n'y a, à l'heure actuelle, aucune standardisation ni validation de cette technique

pour la détection d'EGF-R. Dans une étude précédente, Rusch et collaborateurs (95) ont montré

que seul un immunomarquage uniforme et intense de tumeurs bronchiques était corrélé à une

surexpression de l’ARN. C'est pourquoi nous avons choisi un seuil de 5 pour le score global

d'EGF-R afin d’avoir un nombre de cellules marquées et une intensité de marquage suffisant.

Une comparaison avec des techniques de biologie moléculaire serait intéressante car elles

permettraient d'interpréter correctement les résultats obtenus et de développer un test de routine

reproductible et fiable. De plus, l'immunohistochimie présente de nombreux avantages: la

préservation de l'architecture tissulaire, la possibilité de localiser l'antigène sur une petite lésion

prénéoplasique conservée en paraffine, la facilité de la technique et son faible coût (comparé à

d’autres méthodes) pour une éventuelle application en routine.

Finalement, alors que l'intensité et la distribution d'EGF-R augmente de l'épithélium

bronchique normal aux tumeurs microinvasives, toutes les lésions d'un groupe ne se comportent

pas de la même manière. Une telle hétérogénéité d’expression d’EGF-R dans un même groupe

peut refléter le fait que EGF-R n'est pas uniquement lié au degré de différenciation et de

79

prolifération mais aussi à d'autres paramètres biologiques impliqués dans l'oncogenèse et la

progression tumorale comme l’angiogenèse.

L’originalité de notre étude est donc d’utiliser la classification OMS/IASLC et d’avoir

trouvé un seuil de surexpression d’EGF-R à partir des dysplasies sévères.

4.4.2. c-erbB-2 dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques

précoces

Nous n’avons pas observé dans notre étude de marquage pour c-erbB-2 dans les

lésions bronchiques prénéoplasiques à la différence d’autres auteurs. Piyathilake (92) a évalué

l’expression de c-erbB-2, EGF-R et TGF alpha dans des épithéliomas épidermoïdes, les

lésions précancéreuses associées ou non et dans l’épithélium bronchique normal. Il a observé

que l’expression de c-erbB-2 était significativement plus élevée dans les épithéliomas

épidermoïdes et dans les lésions précancéreuses associées aux cancers que dans l’épithélium

bronchique normal et que dans les lésions précancéreuses non associées à des tumeurs

invasives. Hirsch (96) cite dans un article de revue que c-erbB-2 est exprimé dans 70 % des

lésions bronchiques prénéoplasiques sans différence entre les lésions de bas et de haut grade

mais il ne donne pas le détail de ses résultats.

Les techniques d’IHC utilisées peuvent en partie expliquer les différences observées.

Nous avons utilisé le clone CB11 de Novocastra alors que Piyathilake (92) a utilisé les

anticorps d’Oncogene Products. Hirsch (96) ne mentionne pas l’anticorps utilisé. Les

techniques de démasquage de l’antigène peuvent également faire varier les résultats. La

méthode employée pour définir la positivité d’un échantillon est également différente et peut

entraîner des différences de résultats entre les études. Piyathilake (92) a considéré les

marquages membranaire et cytoplasmique alors que Hirsch (96) ne définit pas son marquage.

Comme recommandé dans l’HercepTest®, nous avons considéré uniquement le marquage

membranaire.

Finalement, le rôle de c-erbB-2 pourrait être plus important dans le développement des

adénocarcinomes que dans celui des épithéliomas épidermoïdes. Nos lésions étant des

précurseurs des épithéliomas épidermoïdes, ceci peut contribuer à expliquer pourquoi c-erbB-

2 n’est pas exprimé.

4.4.3. Ki-67 dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces

L'activité proliférative augmente dans la muqueuse prénéoplasique en parallèle avec le

grade de dysplasie. Ceci est un phénomène connu décrit dans différents organes comme le col

utérin, la vessie et le colon. Cette augmentation de la prolifération selon la gravité des lésions

80

a également été observée dans le poumon. Les investigations les plus anciennes évaluant la

prolifération ont utilisé le PCNA, une protéine nucléaire associée avec la polymérase delta de

l’ADN (97). Une augmentation significative de l’expression de PCNA est présente à partir du

stade de dysplasie (98). Cette augmentation significative dans le nombre de noyaux positifs

pour le PCNA a été observée par Pendleton (23) dans les dysplasies modérées et sévères mais

pas dans les dysplasies légères. De plus, un déplacement dans l'expression de l'antigène vers

la partie suprabasale de la muqueuse pour les lésions les plus sévères a été observé (23). A

cause de sa relative longue demi-vie, le PCNA peut persister dans des cellules non

proliférantes. Pour cette raison, le PCNA n'est pas très spécifique. Au contraire, Ki-67 est une

protéine nucléaire et nucléolaire exprimée spécifiquement au cours de tout le cycle cellulaire

des cellules proliférantes à l'exception de la phase G0 où son expression est absente. La

fonction exacte de cette protéine est inconnue mais elle serait un facteur important pour la

progression dans le cycle de division cellulaire. En utilisant l'anticorps MIB-1 dirigé contre

l'épitope plus spécifique Ki-67, Boers et collaborateurs (25) ont observé une augmentation

significative de l'activité proliférative dans l'épithélium “métaplasique” en comparaison avec

le groupe contrôle de muqueuse normale. Cependant, dans l'épithélium métaplasique, le

marquage MIB-1 était très hétérogène et des pourcentages similaires de marquage ont été

observés dans les dysplasies de grade I, II et III classifiées selon les critères de l'OMS de

1982. La distribution spatiale des noyaux positifs pour Ki-67 n'a pas été évaluée. Les auteurs

concluent que, bien qu'une augmentation de la prolifération puisse être une étape précoce dans

la carcinogenèse bronchique, elle n'est pas corrélée au grade de dysplasie et ne peut être

utilisée pour prédire l'existence d'un carcinome bronchique. Inversement, Tan et

collaborateurs (99) ont montré une augmentation progressive du pourcentage de cellules

positives et de l'intensité du marquage pour Ki-67 entre la muqueuse bronchique normale, la

métaplasie et la dysplasie. Une diminution du marquage de la dysplasie au CIS a été observée

mais le nombre de cas n'était pas assez élevé pour évaluer sa signification et pour en tirer des

conclusions. Dans cette étude, le grade des dysplasies n’était pas précisé. Une augmentation

significative du taux de Ki-67 dans les dysplasies par rapport aux métaplasies a aussi été mis

en évidence par Soini (100) mais là encore les différents grades de dyplasies n’étaient pas

comparés.

Notre travail est, à notre connaissance, le premier à évaluer l'activité proliférative des

lésions bronchiques prénéoplasiques en se basant sur le marqueur de prolifération Ki-67 et sur

la nouvelle classification OMS/IASLC. Les résultats du marquage immunohistochimique par

le MIB-1 ont été exprimés en fonction du pourcentage de cellules marquées mais aussi par

81

deux autres méthodes: l'une combinant la fréquence de cellules positives avec l'intensité de

leur marquage et l'autre évaluant la distribution spatiale des cellules positives dans la

muqueuse bronchique. En effet, la large distribution des pourcentages de cellules positives

pour Ki-67 ne nous a pas permis pas de faire la différence entre les DL, DM, DS et les CIS.

Des études plus récentes réalisées dans les métaplasies du col utérin (101) et dans les lésions

bronchiques prénéoplasiques (23) ont montré une association entre les grades de dysplasies et

l'expression du PCNA dans les couches les plus superficielles de l'épithélium. Un

comportement similaire a été décrit en utilisant un marquage immunohistochimique pour Ki-

67 dans les dysplasies de la cavité buccale (102) et dans les dysplasies apparentées à la

rectocolite ulcéro-hémorragique (103). Plus récemment, la positivité pour Ki-67 a été évaluée

dans les lésions intraépithéliales de bas grade du col utérin en utilisant le seuil d’amas d'au

moins deux noyaux de cellules épithéliales adjacentes fortement marquées pour Ki-67 (26).

Lorsque nos échantillons sont évalués pour la présence d'un ou plusieurs amas de cellules

superficielles positives pour Ki-67, une différence significative a été observée entre le groupe

des dysplasies légères et modérées par rapport à celui des dysplasies sévères et des CIS. Dans

le même but d'améliorer la précision de nos mesures, nous avons considéré l'intensité et la

fréquence du marquage pour Ki-67, en utilisant le schéma de gradation adopté pour des

mesures similaires pour les récepteurs aux stéroïdes dans le cancer du sein (27). Dans notre

série, le seuil de 4 correspond à au moins 10 % de cellules positives pour Ki-67 et une

intensité de marquage modérée ou forte. Les cas avec un marquage modéré ou fort avaient

toujours plus de 10 % de cellules positives et la plupart des études dans le cancer bronchique

utilisent un seuil d'au moins 10 % de cellules positives pour Ki-67 pour considérer la tumeur

comme positive (104;105). Les 2 méthodes d'évaluation donnent des résultats concordants et

montrent une augmentation de positivité de Ki-67 dans les dysplasies sévères et les CIS. Une

différence statistiquement significative a été observée entre ces lésions et le groupe des

dysplasies légères et modérées. Dans le nouveau système de classification de l'OMS/IASLC

des lésions bronchiques prénéoplasiques, les dysplasies sévères et les CIS doivent avoir (à la

différence des dysplasies légères et modérées) des atypies nucléaires significatives, une

chromatine condensée et une activité mitotique étendue dans les couches supérieures de la

muqueuse. D'un autre côté, les lésions de bas grade sont caractérisées par une chromatine

finement granuleuse et une activité mitotique plus faible, confinée au tiers inférieur de la

muqueuse. En utilisant l'immunomarquage pour Ki-67, nous n'avons pas trouvé de différence

statistiquement significative entre les dysplasies légères et modérées d’une part ni entre les

82

dysplasies sévères et les CIS d’autre part. Ceci nous a permis de conclure que l'activité

proliférative permet de séparer les lésions prénéoplasiques en deux grands groupes distincts .

La classification histologique de routine et l'évaluation immunohistochimique des

lésions prénéoplasiques et des carcinomes in situ de la muqueuse bronchique peuvent se

révéler difficiles sur de petites biopsies qui sont souvent fragmentées et peuvent être affectées

par des artéfacts de coupe tangentielle avec une perte de la partie superficielle de la

muqueuse. Dans les CIS, l'épaisseur de la muqueuse peut ne pas être augmentée; l'évaluation

de la maturation/orientation requise par la classification de l'OMS/IASLC est plus difficile

dans les épithéliums fins. De plus, des niveaux variables de dysplasies peuvent coexister dans

la même biopsie. Des cellules inflammatoires intraépithéliales positives pour Ki-67 peuvent

compliquer l'évaluation immunohistochimique. Pour minimiser les variations diagnostiques,

nous avons discuté collégialement les interprétations divergentes. Malgré cela, 3 cas (5,5 %)

ont dû être exclus de notre étude à cause de l'absence d'accord diagnostique suite à des

artefacts techniques ou de l'inflammation.

En conclusion, un marquage positif pour Ki-67, défini par un amas d'au moins deux

noyaux de cellules fortement marquées dans le tiers supérieur de l'épithélium ou par un score

global pour Ki-67 plus grand que 4, est associé à des lésions bronchiques de haut grade

(dysplasies sévères et CIS). Ces résultats suggèrent que les dysplasies sévères et les CIS ont

un comportement prolifératif similaire et que l'immunomarquage Ki-67 peut être un test

supplémentaire pour classifier correctement les lésions bronchiques prénéoplasiques et

néoplasiques précoces en lésions de bas et de haut grades.

Ces résultats peuvent avoir une implication clinique potentielle. Le concept de lésions

bronchiques prénéoplasiques de haut et de bas grades a déjà été introduit dans la littérature

(106) et a été utilisé pour trier les patients afin de sélectionner au mieux les procédures de

suivi. Bota (106) a montré qu’en l'absence de traitement, 3,5 % des dysplasies de bas grade

(légères et modérées) progressaient en lésions de haut grade à la différence des dysplasies

sévères et des CIS qui persistaient ou récidivaient à la même place après une régression

transitoire dans respectivement 37 et 87 % des cas. De plus, la progression d'une lésion de bas

grade apparaît seulement chez les patients présentant une lésion de haut grade dans un autre

site. Sur base de ces données, Bota recommande un suivi seul pour les lésions de bas grade

sans lésion de haut grade associée et un traitement immédiat pour les CIS et les dysplasies

sévères si les lésions persistent à 3 mois. En considérant cela, la détermination de l’expression

de Ki-67 et d’EGF-R peut aider à mieux discriminer les lésions bronchiques de haut et de bas

grade et donc à sélectionner la prise en charge la plus appropriée. Bien entendu, le

83

comportement biologique des dysplasies, y compris des formes sévères, est influencé par de

nombreux facteurs. D'autres études sont donc nécessaires afin d'élucider les mécanismes à la

base de la progression ou de la régression des lésions prénéoplasiques de la muqueuse

bronchique.

4.4.4. Nombre de micro-vaisseaux dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et

néoplasiques précoces

Nous avons observé que le pattern de néoangiogenèse était différent entre les lésions

bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces avec une expression différente des

micro-vaisseaux et d’EGF-R. EGF-R voit son expression s’accentuer de l’épithélium normal au

cancer micro-invasif essentiellement à partir du stade de la dysplasie sévère alors qu’une

augmentation significative du nombre de micro-vaisseaux n’apparaît qu’au stade du carcinome

micro-invasif. La micropapillomatose est un cas particulier.

D’autres études évaluant le nombre des micro-vaisseaux dans les lésions bronchiques

ont rapporté des résultats un peu différents. Fisseler (107) a observé que l’augmentation de la

néovascularisation (évaluée par le facteur VIII) était corrélée à une augmentation du degré de

dysplasie (n=11). Fontanini (108) a montré que le NMV (évalué par CD34) était bas dans les

lésions de métaplasie/hyperplasie (n=7) mais que les dysplasies à partir du stade modéré

(n=4) et, de façon encore plus significative, les CIS (n=8) avaient un NMV plus élevé. Nous

n’avons observé de différence statistiquement significative qu’entre les carcinomes micro-

invasifs et tous les autres sous-groupes. Notre étude suggère que la formation de micro-

vaisseaux est un phénomène tardif dans l’oncogenèse bronchique. Les micropapillomatoses se

comportent différemment avec un haut taux de micro-vaisseaux en l’absence d’atypies et

d’augmentation d’expression d’ EGF-R. Certaines différences entre ces études pourraient être

expliquées par la sélection des cas et le système de classification utilisé. La méthode

employée pour compter les micro-vaisseaux variait. Comme Fontanini, nous avons utilisé une

technique similaire à celle décrite par Weidner alors que Fissler a utilisé un système d’analyse

automatique d’images. Les protocoles d’IHC étaient également différents. Trois anticorps ont

été utilisés pour évaluer le NMV: CD31, CD34 et le facteur VIII. Selon certains auteurs,

CD31 semble être le marqueur le plus sensible et marquerait plus de vaisseaux que le facteur

8 (109). Un consensus international sur la méthodologie et les critères d’évaluation de la

néoangiogenèse propose que l’anticorps anti-CD31 soit le standard (110). Cependant, d’autres

auteurs ont suggéré qu’il pourrait être utile de combiner CD34 et CD31 (111). Offersen (112)

a comparé dans des cancers bronchiques, les NMV obtenus par les 3 marqueurs: il a observé

que CD34 donnait le meilleur marquage des cellules endothéliales sans bruit de fond. Yano

84

(113) a montré que la corrélation entre le facteur VIII et le CD34 n’était pas très bonne et que

seul CD34 était corrélé à la survie des patients atteints d’adénocarcinomes. Nous avons choisi

d’utiliser CD34 car nous avons observé que CD34 marquait plus de vaisseaux sur les tissus

conservés en paraffine.

Nos constatations suggèrent que si EGF-R est nécessaire au développement de néo-

vaisseaux, ce phénomène est précoce et débute au stade de dysplasie. Il existe différents

arguments dans la littérature pouvant soutenir notre hypothèse. L’action oncogénique d’EGF-R

pourrait être partiellement la conséquence de la promotion de l’angiogenèse elle-même due à

VEGF. Une activation des voies de signalisation d’EGF-R augmente la production de

molécules angiogéniques dans de nombreuses cellules tumorales. Dans le cancer du sein, il

existe une association entre EGF-R et l’angiogenèse particulièrement dans les tumeurs de

moins de 2 cm (114). De plus, un blocage de la voie de signalisation d’EGF-R peut résulter en

une suppression partielle de l’angiogenèse (115;116), notamment par inhibition de VEGF

(117). Ciardiello (118) a observé que l’adjonction de gefitinib, entraîne une diminution de la

croissance cellulaire et de la production de VEGF. Dans cette même étude, le nombre de micro-

vaisseaux et VEGF sont également réduits dans des xénogreffes traitées par gefitinib.

4.4.5. Autres anomalies des lésions bronchiques prénéoplasiques décrites dans la

littérature

Nos travaux s’inscrivent dans le cadre de l’identification des anomalies biologiques

survenant au cours du développement des lésions prénéoplasiques et néoplasiques précoces

des épithéliomas épidermoïdes bronchiques. Nous avons délibérément mis de côté certains

marqueurs qui sont quasiment pathognomoniques de lésions cancéreuses et précancéreuses

d’autres sous-types histologiques de cancers bronchiques que les épithélioma épidermoïdes

(par exemple Ras pour les adénocarcinomes).

Bien que la littérature soit abondante dans les cancers bronchiques avérés, l’étude de

facteurs biologiques dans les lésions plus précoces est nettement moins étoffée. Outre les

pertes d’hétérozygotie (3p, 9p, 17p, 11p), l’aneuploïdie et les altérations des microsatellites

(119), seule une trentaine de facteurs ont été étudiés dont 7 notamment par notre équipe :

EGF-R (21), c-erbB-2 (22), Ki-67 (28), le NMV (30), p53 (120), CA IX (121) et cox-2 (122).

Si on considère les études ayant évalué de façon systématique les différents stades de lésions

prénéoplasiques, on peut retenir des anomalies aux niveaux d’oncogènes (EGF-R, c-erbB-2,

bcl-2, Ras, cox-2…), de gènes suppresseurs de tumeurs (p53, FHIT, cycline D1, Rb,…), de

85

facteurs liés à l’angiogenèse (VEGF, NMV), de facteurs liés à la prolifération (Ki-67, PCNA,

MCM2, CA IX,…), de protéines liées à l’invasion et à la sénescence (télomérases).

Ces altérations ont été observées, comme dans nos études, sur des biopsies prélevées

par bronchoscopie ou sur des pièces chirurgicales (moins fréquemment sur des prélèvements

cytologiques). L’immunohistochimie est la technique de détection des altérations biologiques

la plus souvent utilisée mais d’autres méthodes (PCR…) sont parfois employées. Il est

difficile de comparer les résultats de toutes ces études avec les nôtres: souvent la dernière

classification OMS/IASLC n’est pas utilisée, les différents grades de dysplasies ont été

regroupés, la technique d’immunohistochimie et le seuil de positivité utilisés ne sont pas les

mêmes. Il est donc malaisé de tirer des conclusions définitives.

L’apparition de ces anomalies dans la dynamique de progression des cancers

bronchiques est très variable selon le type de marqueur étudié (figure 12).

Figure 12 : Principales anomalies biologiques décrites selon les stade des lésions : En rouge : facteurs faisant l’objet de cette thèse En vert : autres facteurs étudiés par notre équipe En noir : autres facteurs discutés dans la littérature

Dans l’épithélium bronchique « normal » de fumeur, des délétions de certains gènes

sont déjà présentes (3p, 9p…) tout comme dans l’hyperplasie (11p, 5q).

Des anomalies moléculaires précises apparaissent dès le stade de métaplasie.

L’activité télomérase et l’expression d’ARN messager de hTERT (sous-unité catalytique de

télomérase) sont statistiquement plus élevées dans les biopsies métaplasiques ou dysplasiques

que dans l’épithélium bronchique normal mais moindres que dans les cancers invasifs

(123;124). Aucune expression de télomérases n’a cependant été retrouvée dans des

3p 9p 17p

11p 5q

P53 EGF-R Ki-67 PCNA BAX/bcl-2 FHIT Cox-2

CA IX c-erbB-2 NMV Rb

Télomérase P21WAF C-JUN CD44 Hyaluronan

Hyperplasie Epithélium bronchique normal de fumeur

Métaplasie Dysplasie CIS Tumeur

86

prélèvements cytologiques correspondant à de la métaplasie/dysplasie (125). Des anomalies

de p21WAF-1 (126), c-JUN (127) et de certaines molécules d’adhérence telles que CD44, un

récepteur à l’hyaluronan (128;129) ont été rapportées de façon ponctuelle dans la littérature.

Bien que parfois présentes plus tôt dans l’évolution des lésions, les anomalies

biologiques peuvent fortement varier selon le grade de dysplasie. Malheureusement, dans

beaucoup d’études, toutes les dysplasies (légères, modérées, sévères) sont regroupées en une

seule catégorie ou définies de manière peu claire.

Pour les anomalies les plus fréquement décrites, la situation pourrait être résumée

comme suit :

1) p53 : est plus exprimé à partir du stade de dysplasie (n=17) et de CIS (n=5) (98). Un travail

réalisé par notre équipe a montré que l’expression de p53, déjà présente dans les métaplasies

(n=14), était plus nette dans les dysplasies sévères (n=14) (120). Ceci a également été

retrouvé dans une étude japonaise : à l’absence d’expression de p53 dans 14 dysplasies de bas

grade succède une expression à partir des dysplasies de haut grade (130). Dans une étude

anglaise, l’expression de p53 était plus élevée dans les dysplasies sévères (n=7) que dans les

modérées (n=12) et les légères (n=41) (131). Dans une étude finlandaise, son expression était

plus importante dans les dysplasies sévères et les CIS (n=11) que dans les dysplasies légères

et modérées (n=6) (132). Cette différence d’expression de p53 entre les différents groupes de

51 dysplasies de « grades » différents n’a cependant pas été retrouvée par d’autres auteurs

(25). Dans les lésions adjacentes à des cancers invasifs, une expression concomitante de p53

dans les dysplasies sévères et les CIS (n=31) est beaucoup plus fréquente que dans les

dysplasies légères (n=10) (133). Tout comme p53, les cyclines D1 et E sont plus souvent

exprimées dans les dysplasies de haut grade que dans celles de bas grade (134).

2) EGF-R : nous avons observé qu’EGF-R est statistiquement plus exprimé dans les

dysplasies sévères et les carcinomes in situ que dans les lésions de grade moins élevé

dysplasies légères (21). Rappelons qu’à l'opposé, Rusch (91) a trouvé que l'expression d'EGF-

R n'était pas associée à un type particulier de lésion préinvasive.

3) Ki-67 : nous avons observé une expression plus importante dans les dysplasies sévères et

les CIS versus les dysplasies légères et les modérées (28). Une expression plus importante de

Ki-67 dans les dysplasies a également été rapportée par d’autres auteurs (99;100). Une

augmentation significative a aussi été observée dans les dysplasies modérées et sévères mais

pas dans les dysplasies légères (23) pour un autre facteur de prolifération (le PCNA). Une

étude va à l’encontre de ces résultats, avec l’observation de pourcentages similaires de

87

marquage Ki-67 dans les dysplasies de grade I, II et III classifiées selon les critères de l'OMS

de 1982 (25).

4) BAX/bcl-2 : dans une étude incluant 12 dysplasies légères, 9 modérées et 9 sévères, une

inversion du rapport BAX/Bcl-2 (normalement >1) est plus fréquente dans les dysplasies de

haut grade (134). Cette inversion du rapport pourrait être principalement liée à une

augmentation de Bcl-2 (126;131) sans réel changement en terme d’expression de BAX (135).

5) Cox-2 : cette cyclo-oxygénase n’est exprimée qu’à partir de la dysplasie sévère. Une

différence (statistiquement significative) a également été retrouvée entre les lésions

dysplasiques de bas grade (n=28) et celles de haut grade (n=12) dans une étude de notre

équipe (122).

6) FHIT : bien que déjà présente dès la métaplasie (136), une perte progressive de FHIT

semble également survenir entre les dysplasies légères (n=1), modérées (n=5) et sévères

(n=14) (137).

Une étude de notre équipe a montré que l’expression de CA IX, n’est présente qu’au

stade de CIS et pas dans les lésions de plus bas grade (121).

Certaines anomalies n’apparaissent qu’au stade invasif. Selon notre étude et comme

discuté auparavant, contrairement à ce qu’a observé Piyathilake (92), c-erbB-2 ne serait

exprimé que dans les lésions invasives (22). Au contraire d’autres équipes (107;108), nous

avons montré qu’une augmentation significative du nombre des micro-vaisseaux, témoins de

la néoangiogenèse, n’apparaît qu’au stade du carcinome micro-invasif. La perte d’expression

de Rb n’est présente que dans les cancers invasifs alors que les lésions bronchiques

prénéoplasiques (y compris les CIS) sont toutes positives pour son expression (138).

La difficulté majeure de l’étude de ces lésions réside dans leur rareté et dans leur petite

taille, imposant d’être très économe dans leur utilisation en recherche et expliquant le faible

nombre d’études publiées souvent avec un nombre relativement restreint de cas. Si on

considère le nombre de marqueurs étudiés convenablement, on en retient actuellement moins

de 20. Dans toutes les études évaluant les anomalies biologiques des lésions prénéoplasiques,

le nombre de lésions étudiées est faible (parfois 1 ou 2 , le plus souvent moins de 15 lésions

par grade).

88

5. Conclusions Par l’étude de différents aspects biologiques du cancer bronchique non à petites

cellules, nous avons pu montrer que le processus de carcinogenèse dans l’épithélium

bronchique est complexe et fait intervenir différents mécanismes à des stades variables.

Premièrement, grâce aux méta-analyses de la littérature, nous avons observé qu’EGF-

R, c-erbB-2, Ki-67 et le nombre des micro-vaisseaux s’avèrent des facteurs de mauvais

pronostic dans les CBNPC. Ceci pourrait être cliniquement important pour mieux sélectionner

les patients devant bénéficier d’une chimiothérapie adjuvante.

Deuxièmement, nous avons montré que la surexpression d’EGF-R et de c-erbB-2 dans

les cancers réséqués résulte très rarement d’une amplification génique et nous n’avons pas

trouvé dans ces tumeurs de corrélation entre EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67. Comme dans nos

méta-analyses, nous avons observé que les patients dont la tumeur surexprime EGF-R et/ou c-

erbB-2 et/ou présente une anomalie de ces gènes avaient une survie plus courte. Ces

différences n’étaient cependant pas statistiquement significatives. L’expression de Ki-67 dans

la tumeur s’est avérée être un facteur significatif de mauvais pronostic pour la survie.

Nous avons aussi montré que l’évaluation des marqueurs biologiques sur biopsie ne différait

pas de celle réalisée sur des tumeurs réséquées.

Finalement, nos travaux ont surtout permis de montrer que l’expression de certains

marqueurs (EGF-R et Ki-67) apparaît précocement dans le processus de carcinogenèse

bronchique dès les stades prénéoplasiques, avec un seuil se situant entre les lésions

bronchiques de bas et de haut grade. La néoangiogénèse s’observe, plus tardivement, à partir

des cancers micro-invasifs tandis que c-erbB-2 n’apparaît qu’au stade de tumeur clinique.

Ces observations peuvent avoir une implication clinique : les lésions de haut grade ont

une évolution spontanée très fréquement défavorable et il est recommandé un simple suivi

pour les lésions de bas grades et un traitement immédiat pour les CIS et les dysplasies sévères

si les lésions persistent à 3 mois (106). Dans ces conditions, la détermination de l’expression

de Ki-67 et d’EGF-R peut aider à mieux discriminer les lésions bronchiques de haut et de bas

grade et donc à sélectionner la prise en charge la plus appropriée.

6. Perspectives La compréhension des mécanismes sous-jacents à l’initiation de la carcinogenèse

bronchique mérite d’autres d’investigations. D’autres marqueurs (tels que c-erbB-3, un autre

membre de la famille d’EGF-R et TGFα, un des ligands principaux d’EGF-R) sont en cours

89

d’évaluation dans notre laboratoire. Les modifications de la matrice extracellulaire,

nécessaires à l’invasion, seront investigués ultérieurement, de même que les mécanismes

d’apoptose.

L’utilisation à large échelle des nouvelles techniques d’analyse des facteurs

biologiques devrait nous renseigner sur les mécanismes des voies métaboliques impliquées

dans l’évolution tumorale. Ces nouvelles techniques prometteuses sont l’hybridation

génomique comparative (ou CHG) qui étudie l’ADN, les microdamiers à ADNc qui étudient

ARN et la protéomique pour l’étude des protéines. Des premiers résultats intéressants ont été

décrits en protéomique. Deux études ont déjà permis d’observer, sur de petits échantillons de

lésions, des différences protéiques entre les métaplasies (n=8) et les dysplasies (n=8) et entre

les dysplasies et les cancers invasifs (n=8) (139) et des profils d’expression différents entre les

lésions de bas et de haut grade (n=20) (140). Actuellement, dans notre laboratoire, les

techniques d’extraction d’ARN sont en fin de mise au point. Les méthodes actuellement

employées telles que l’immunohistochimie continueront à être utilisées pour la

compréhension ultérieure des anomalies détectées par ces nouvelles technologies.

90

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« analyse et méta-analyse des niveaux d’expression d’egf-r

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