zougnazagmiline et galgouli au burkina faso

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Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017 MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU MASTER EN INGENIERIE DE L'EAU ET DE L'ENVIRONNEMENT OPTION : EAU ET ASSAINISSEMENT ------------------------------------------------------------------ Présenté et soutenu publiquement le [Date] par ALI OUMAROU BANOBA Khadidia Travaux dirigés par Dr Hela KAROUI, Enseignante Chercheure à 2iE Dr Harinaivo A. ANDRIANISA, Enseignant Chercheur à 2iE Mme Christine Lovasoa RAZANAMAHANDRY, Doctorante à 2iE Jury d’évaluation du stage : Président : Prénom NOM Membres et correcteurs : Prénom NOM Prénom NOM Prénom NOM Promotion [2016/2017 Isolation et caractérisation des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure : cas des sites d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli au Burkina Faso

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Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017

MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU

MASTER EN INGENIERIE DE L'EAU ET DE L'ENVIRONNEMENT

OPTION : EAU ET ASSAINISSEMENT

------------------------------------------------------------------

Présenté et soutenu publiquement le [Date] par

ALI OUMAROU BANOBA Khadidia

Travaux dirigés par

Dr Hela KAROUI, Enseignante Chercheure à 2iE

Dr Harinaivo A. ANDRIANISA, Enseignant Chercheur à 2iE

Mme Christine Lovasoa RAZANAMAHANDRY, Doctorante à 2iE

Jury d’évaluation du stage :

Président : Prénom NOM

Membres et correcteurs : Prénom NOM

Prénom NOM

Prénom NOM Promotion [2016/2017

Isolation et caractérisation des espèces bactériennes

dégradeurs du cyanure : cas des sites d’orpaillage de

Zougnazagmiline et Galgouli au Burkina Faso

Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

i ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017

CITATIONS

Celui qui aime la correction aime la science; celui qui hait la réprimande est stupide.

La maison ne repose pas sur la fondation, mais sur la femme.

Ne mesure le travail qu’une fois la journée terminée, et l’ouvrage accompli.

Ce que nous faisons pour nous même disparaît avec nous. Ce que nous faisons pour les autres

et le monde par les écrits est immortel et demeure.

A la fin, ce ne sont pas les années écoulées de notre vie qui comptent, mais la vie qui a

inondée ces années.

Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

ii ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017

DEDICACES

Je dédie ce travail

A mon père ALI OUMAROU BANOBA, ainsi qu’à ma mère Mme BANOBA

Rahamatou Souley, pour leur soutien illimité, leur confiance et pour tous les efforts qu’ils

ont fournis pour l’accomplissement de ce travail.

A mes frères et sœurs : Ibrahim, Banoba Abdoul Kabir, Ismaël, Mariama, Aïchatou et

Roumanatou qui n’ont cessé de m’encourager et de me témoigner leur amour.

A ma très chère marraine Cathérine Noyer pour son soutien et ses conseils.

A tous mes amis de 2iE, qui sont devenus ma famille et qui ont rendu mon séjour

agréable.

Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

iii ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017

REMERCIEMENTS

Ce travail a été réalisé au Laboratoire Eau, Dépollution, Ecosystème et Santé (LEDES) du 2iE

Je tiens à remercier tout particulièrement

➢ Pr. Hamma YACOUBA, Directeur de la recherche et Dr Yacouba KONATE,

Directeur du laboratoire Eau, Dépollution, Ecosystème et Santé (LEDES) pour

m’avoir permis d’intégrer l’équipe de recherche.

➢ Dr. Hela KAROUI, Enseignante-chercheure pour sa disponibilité, ses conseils, son

implication et son dévouement à la réussite de cette étude.

➢ Dr. Anderson ANDRIANISA, Enseignant-chercheur qui n’a ménagé aucun effort

pour m’appuyer à tous les niveaux pendant ma période de stage.

➢ Mme Christine RAZANAMAHANDRY, doctorante, pour sa disponibilité, son

encadrement et ses conseils.

➢ Messieurs Noel TINDOURE et Hema SOUHAMAI, pour leur appui technique au

LEDES.

➢ Mr Boukary SAWADOGO et Dr Seyram SOSSOU pour leur soutien et leurs

conseils.

➢ Abdoul Wahab NOUHOU MOUSSA et Haoua MAHAMANE ZAKARI pour leur

aide à la réalisation de ce document.

➢ A tous ceux qui m’ont soutenu de près ou de loin mais dont leurs noms ne figurent pas

sur cette liste.

Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

iv ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017

RESUME

Au Burkina Faso, le cyanure est abusivement utilisé dans l’orpaillage ; ce qui entraine une

détérioration de l’environnement. La bioremédiation se retrouve comme étant un moyen

efficace de dépolluer les sites contaminés. Des récentes études ont montré la présence d’un

consortium de bactéries, extrait des sites d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli,

capables de dégrader une concentration de cyanure de 60mg/l avec un abattement supérieur à

95%.

Le but de notre travail est d’identifier les espèces bactériennes qui composent ce consortium.

Ainsi, cinq formes de colonies ont été isolées à savoir les formes circulaire, irrégulière,

fusiforme, punctiforme et rhizoïde. Les méthodes d’identification microbiologiques ont

permis d’identifier au total quatre espèces dont Pseudomonas sp, Klebsiella pneumoniae,

Klebsiella oxytoca et Staphylococcus sp. La même espèce peut avoir plusieurs formes de

colonies. Les méthodes d’identification moléculaires ont permis de situer le poids moléculaire

des bactéries, qui est compris entre 250 et 500 paires de bases.

Mots Clés :

1 - bioremédiation

2 - cyanure

3 - bactéries

4 - isolation

5 – identification

Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

v ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017

ABSTRACT

In Burkina Faso, cyanide is abused in gold panning; this situation resultes in environmental

degradation. Bioremediation is an effective means of decontaminating contaminated sites.

Recent studies have shown the presence of a consortium’s bacteria extracted from the gold-

mining sites of Zougnazagmiline and Galgouli, capable to degrade a cyanide concentration of

60mg / L with an allowance of more than 95%.

the objective of our work is to identify the bacterial species that make up this consortium.

Thus, five forms of colonies were isolated, namely circular, irregular, fusiform, punctiform

and rhizoid. Microbiological identification methods identified a total of four species,

including Pseudomonas spp, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca and Staphylococcus

spp. The same species may have several forms of colonies. Molecular identification methods

allowed us to locate the molecular weight of the bacteria, which is between 250 and 500 base

pairs.

Key words:

1 - Bioremediation

2 - cyanide

3 - bacteria

4 - isolation

5 – identification

Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

vi ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017

LISTE DES ABREVIATIONS

ADN: acide désoxyribonucléique

Al(SO4)2,12H2O: Aluminium Sulfate Dodécahydrate

API: appareillage et procédés d’identification

ARN: acide ribonucléique

COSO4,7H2O: sulfate de Cobalt, heptahydraté

CuSO4: Sulfate de cuivre

Echn: échantillon

FeSO4,7H2O : Iron (II) Sulfate Heptahydrate

HCN: Cyanure d’Hydrogène (Acide cyanhydrique)

HCO3: hydrogéno-carbonate

H2O: molécule d’eau

KCN: Cyanure de Potassium

K2HPO4: Di-potassium Hydrogen Phosphate

KOH: hydroxyde de potassium

LEDES: Laboratoire Eau, Dépollution, Écosystème et Santé

mg/L: milligramme par litre

MgSO4,7H2O: sulfate de Magnésium, heptahydraté

mm: millimètre

mM: millimol

mn: minute

MnSO4,7H2O: Manganèse (II) Sulfate Monohydrate

MSM: Solution Minérale Minimale

NaCl: chlorure de sodium

NaCN: cyanure de sodium

NaH2PO4,H2O: Sodium Dihydrogen Orthophosphate Monohydrate

Na2MoO42-,2H2O: Sodium Molybdate Dihydrate

NaNO3: nitrate de sodium

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d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

vii ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017

NaOH: hydroxyde de sodium

NH3: ammoniac

NH4+ : ion ammonium

(NH4))2SO4: Ammonium Sulfate

O2: dioxygène

Pa: pascal

PCR: réaction de polymérisation en chaîne

pH: potentiel hydrogène

ppm: partie par million

S.P: saison pluvieuse

S.S: saison sèche

ZnSO4, 7H2O: Zinc Sulfate Heptahydrate

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d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

viii ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017

Sommaire

CITATIONS ......................................................................................................................... i

Dédicaces ......................................................................................................................... ii

REMERCIEMENTS ............................................................................................................. iii

Résumé ............................................................................................................................ iv

ABSTRACT ......................................................................................................................... v

liste des abréviations ........................................................................................................ vi

LISTE DES TABLEAUX ..........................................................................................................x

Liste des figures ................................................................................................................ xi

Introduction ..................................................................................................................... 1

I. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE .................................................................................... 2

I.1. Généralités du cyanure ....................................................................................................... 2

I.2. Les bactéries dégradeurs du cyanure ................................................................................... 3

I.2.2. Biodégradation du cyanure : cas des sites d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli .. 3

I.2.3. Différents types de bactéries dégradeurs du cyanure ........................................................ 4

I.2.4. Efficacité des bactéries ......................................................................................................... 5

I.3. Isolation des bactéries ........................................................................................................ 5

I.3.1. Définition .............................................................................................................................. 5

I.3.2. Méthodes d’isolation ............................................................................................................ 5

I.3.3. Avantages et limites ............................................................................................................. 6

I.4: Identification des bactéries ................................................................................................. 6

I.4.1. Définition .............................................................................................................................. 6

I.4.2. Méthodes d’identification .................................................................................................... 7

I.4.3. Avantages et limites ............................................................................................................. 9

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d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

ix ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017

II. MATERIEL ET METHODES ......................................................................................... 11

II.1. LOCALISATION ET ECHANTILLONNAGE ............................................................................. 11

II.2. ISOLATION DES BACTERIES ............................................................................................... 11

II.2.1. Préparation du milieu de culture ...................................................................................... 12

II.2.2. Ajustement du pH .............................................................................................................. 12

II.2.3. Ensemencement des bactéries .......................................................................................... 13

II.2.4. Repiquage des bactéries dans le milieu nutritif ............................................................... 13

II.3. TEST DE BIODEGRADABILITE ............................................................................................ 14

II.4. IDENTIFICATION DES BACTERIES ....................................................................................... 14

II.4.1. Caractérisation morphologique ........................................................................................ 15

II.4.2. Caractérisation culturale ................................................................................................... 15

II.4.3. Caractérisation biochimique ............................................................................................. 16

II.4.4. Caractérisation moléculaire .............................................................................................. 20

III. RESULTATS ET DISCUSSION ...................................................................................... 23

III.1. ISOLATION DES BACTERIES .............................................................................................. 23

III.2. IDENTIFICATION DES BACTERIES ...................................................................................... 23

III.2.1. Caractérisation morphologique ....................................................................................... 23

III.2.2. Test de biodégradabilité ................................................................................................... 26

III.2.3. Caractérisation culturale .................................................................................................. 27

III.2.4. Caractèrisation biochimique ............................................................................................ 30

III.2.5. Caractérisation moléculaire ............................................................................................. 35

IV. CONCLUSION ....................................................................................................... 39

V. RECOMMANDATIONS /PERSPECTIVES ..................................................................... 40

Bibliographie .................................................................................................................. 41

Annexe : quelques matériel et appareils utilisés .............................................................. 44

Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

x ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017

LISTE DES TABLEAUX

TABLEAU 1: ECHANTILLONS ...................................................................................................... 11

TABLEAU 2: RESULTATS ATTENDUS DES DIFFERENTS TESTS ...................................................... 19

TABLEAU 3: RECAPITULATIF DES CARACTERISTIQUES MORPHOLOGIQUES ................................. 25

TABLEAU 4: ABATTEMENT DU CYANURE .................................................................................. 26

TABLEAU 5: CARACTERISATION CULTURALE ............................................................................. 28

TABLEAU 6: CARACTERISTIQUES CULTURALES ET BACTERIES CORRESPONDANTES ................... 29

TABLEAU 7: RESULTATS TESTS BIOCHIMIQUES .......................................................................... 32

TABLEAU 8: ESPECES PROBABLES AUX TESTS BIOCHIMIQUES .................................................... 33

TABLEAU 9: RECAPITULATIF DES DIFFERENTS TESTS D'IDENTIFICATIONS MICROBIOLOGIQUES .. 34

TABLEAU 10: RECAPITULATIF DES ESPECES BACTERIENNES DEGRADEURS DU CYANURE ........... 35

TABLEAU 11: COEFFICIENTS ADN/ARN ET ADN/PROTEINES .................................................. 37

Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

xi ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017

LISTE DES FIGURES

FIGURE 1: METHODE D'ISOLATION DES BACTERIES DEGRADEURS DU CYANURE ..................................................... 14

FIGURE 2: FORME DES COLONIES ............................................................................................................................ 23

FIGURE 3: FORME MICROSCOPIQUE DES BACTERIES ............................................................................................... 24

FIGURE 4: ASPECT TEST D'INDOLE .......................................................................................................................... 30

FIGURE 5: ASPECT TEST DE PHENYLALANINE ......................................................................................................... 30

FIGURE 6: ASPECT TEST D'UREASE ......................................................................................................................... 31

FIGURE 7: TEST DE CITRATE DE SIMMONS .............................................................................................................. 31

FIGURE 8: ASPECT ADN EXTRAIT .......................................................................................................................... 38

FIGURE 9: RESULTAT AMPLIFICATION .................................................................................................................... 38

FIGURE 10: ASPECT KIT D'EXTRACTION .................................................................................................................. 44

FIGURE 11: APPAREIL D'AMPLIFICATION PAR PCR ................................................................................................. 44

FIGURE 12: APPAREIL ELECTROPHORESE ............................................................................................................... 44

FIGURE 13: APPAREIL PHOTO DOC-PRINT X ........................................................................................................ 45

Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

1 ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017

INTRODUCTION

le cyanure est un composé chimique utilisé dans plusieurs activités dont entre autres

l’extraction de minerais, le traitement des métaux, les procédés photographiques, la

fabrication de caoutchouc synthétique, les synthèses chimiques, la fabrication de plastiques,

les procédés de laboratoire, etc….

Au Burkina Faso, le secteur aurifère occupe une place importante. On estime environ 800

sites d’orpaillage dont seulement 200 sites sont légaux. L’orpaillage constitue de ce fait un

secteur très important de l’économie nationale. Afin d’avoir une grande quantité des minerais

extraits, les orpailleurs utilisent des produits chimiques tels que le cyanure et le mercure.

Toutefois, le non-respect des doses de cyanure recommandées entraine beaucoup de

dommages aussi bien sur la santé des populations exposées que sur l’environnement,

notamment les ressources en eau et le sol. Le cyanure est un poison mortel pour les êtres

vivants et un polluant néfaste pour l’environnement (Botz et al, 2005). La pollution par le

cyanure est observée sur la majorité des sites d’orpaillage car il contamine aussi bien les

ressources en eaux que les sols des bassins versants de ces sites. Au Burkina Faso, les études

pour dépolluer les sols et les eaux cyanurés sont encore inexistantes (MMCE, 2011). Des

techniques de traitements chimiques existent mais elles ne sont pas à portée de main des pays

en voie de développement car elles sont très onéreuses (Botz et al, 2005). Plusieurs

microorganismes ont été étudiés ces dernières années et ont été classés comme bactéries

capables de dégrader le cyanure (Akcil et Mudder, 2003).

Peu d’études ont été menées sur les bactéries présentes in situ capables de dégrader le

cyanure. Une étude menée par Sawadogo N. (2015) a porté sur la biodégradation du cyanure

en utilisant des bactéries prélevées sur le site pour dégrader le cyanure. Par la suite, Ibrahima

Agoumo (2017) a travaillé sur les conditions optimales (pH, température et nutriments)

auxquelles ces bactéries dégradent le cyanure. Ces deux études, ont montré qu’un

consortium de bactéries est capable de dégrader le cyanure avec une bonne efficacité de 95%

au minimum, dans un milieu spécifique et à différents pH. C’est à la suite de ces travaux que

s’inscrit le notre qui a pour objectif général d’identifier les espèces bactériennes constituant ce

consortium. Il s’agit plus spécifiquement de :

❖ Isoler ce consortium issu des échantillons d’eau et du sol des sites d’orpaillage

❖ Identifier les différentes espèces bactériennes présentes dans ce consortium

Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

2 ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017

I. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

I.1. GENERALITES DU CYANURE

Le cyanure existe sous 3 formes: le cyanure libre, les cyanures simples et les cyanures

complexes.

D’après l’agence canadienne de protection de l’environnement (1991), le cyanure est

commercialement utilisé pour l’électroplaçage, l’extraction de minerais, le traitement des

métaux, les procédés photographiques, la fabrication de caoutchouc synthétique, les synthèses

chimiques, la fabrication de plastiques, le contrôle de pesticides, le débourrage des peaux, les

procédés de laboratoire et la fabrication de colorants et pigments.

Le cyanure est utilisé pour les gîtes d’or primaires. Le principe de cette technique repose sur

la propriété du cyanure de se complexer et de rendre soluble l’or (Moisan and Blanchard,

2013). En général, 0,3 à 0,5g de cyanure sont nécessaires pour une tonne de minerai, mais

dans la pratique, plus précisement sur les sites d’orpaillages de Zougnazagmiline au Burkina

Faso, les orpailleurs utilisent 300 à 2000g de cyanure par tonne de minerai pour une

extraction plus efficace (Roamba, 2014).

Cette utilisation abusive du cyanure représente des risques élevés sur la santé comme sur

l’environnement. En effet, plusieurs études menées ont montré que le cyanure peut être

introduit dans le corps humain par inhalation, ingestion et adsorption. Les doses mortelles

pour les adultes sont de 1 à 3 mg/kg de poids corporel si ingérées, de 100 à 300 mg/L si

inhalées et de 100 mg/kg de poids corporel si elles sont adsorbées.

((Agence française de sécurité sanitaire des produits de santé, 2010), Potivichayanon et

Kitleartpornpairoat (2010)).

Meech (1985) et Yeboah (2008) ont montré que le cyanure peut être toxique pour les

poissons et ont révélé que les activités minières ont entraîné une dégradation des terres

menant à la disponibilité de terres limitées pour la production alimentaire locale et d'autres

fins agricoles dans certaines localités.

Face à cette situation, plusieurs traitements sont envisagés en vue de diminuer la toxicité du

cyanure en le transformant en un autre composé moins toxique.

Les traitements physico-chimiques du cyanure fonctionnent sur le principe de conversion du

cyanure en composés moins toxiques par réaction d’oxydation. Cette dernière regroupe les

techniques telles que la destruction par chloration alcaline, par le péroxyde d’hydrogène, par

le charbon actif, le sulfure d’oxygène, l’oxydation par l’ozone et la catalyse par le peroxyde

Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

3 ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017

d’hydrogène (Moisan M. and Blanchard F., 2013). Cependant, les inconvénients majeurs de

ces traitements sont les coûts d'investissement élevés, le matériel spécialisé et des exigences

d’entretien; d’où le recours aux traitements biologiques (Bioremédiation) qui sont plus

économiques et plus efficaces.

Plusieurs auteurs ont défini la bioremédiation du cyanure comme étant la dégradation du

cyanure par les bactéries, les algues ou les champignons ((Vavasseur, 2014), Santos et al.

(2013))

La biodégradation bactérienne présente des avantages considérables, car les bactéries sont

plus facilement manipulables aux niveaux biochimique et génétique (Huertas et al., 2010).

I.2. LES BACTERIES DEGRADEURS DU CYANURE

I.2.1. Définition

Les bactéries ont besoin de nutriments pour croitre dont entre autres le carbone, l’oxygène,

l’azote, le souffre et le phosphore (Prescott et al., 2003).

Le traitement biologique du cyanure utilise la capacité naturelle des bactéries pour convertir

les cyanures libres et les complexes métalliques en bicarbonate et en ammonium.

Les bactéries ont pour principal rôle de dégrader le cyanure en l’utilisant uniquement le

carbone ou l’azote ou les deux à la fois et sont capables de produire l’ammonium comme

sous produit.

(Moisan M. and Blanchard F., 2013).

2KCN + 4H2O + O2 → 2K+ + 2HCO3- + 2NH3

I.2.2. Biodégradation du cyanure : cas des sites d’orpaillage de

Zougnazagmiline et Galgouli

Des études au sein du Laboratoire Eau, Dépollution, Ecosystème et Santé (LEDES) ont déjà

porté sur la dégradation du cyanure par les bactéries prélevées sur les sites d’orpaillage.

La première étude est celle de Sawadogo N. (2015). Elle a pu isoler un consortium de

bactéries aussi bien des échantillons d’eau que de sol capables de dégrader le cyanure en

l’utilisant comme seule source de carbone et d’azote. Le test de biodégradation a montré une

efficacité de 98% à un pH=9.5 et à une concentration de cyanure de 60mg/L quelque soit les

nutriments. Elle a également montré que la dose létale pour ces bactéries était de 100mg/L.

Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

4 ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017

La seconde étude fut celle de Ibrahima Agoumo (2017) qui a isolée le même consortium de

bactéries et a montré qu’à différentes valeurs du pH (5 ; 7,5 ; 9,5 ; 10,5), il y avait une

biodégradation du cyanure avec un taux d’abattement minimal de 95,5% ; Le pH optimal de

dégradation du cyanure (jusqu’à 98%) était 9,5. Elle a aussi montré qu’en présence comme en

l’absence de nutriments, la dégradation du cyanure était efficace. Le glucose et l’ammonium

étaient les deux nutriments pour lesquels la dégradation était optimale, avec un abattement de

100 % et 99,8% respectivement.

I.2.3. Différents types de bactéries dégradeurs du cyanure

Certaines bactéries sont capables d’utiliser le cyanure à plusieurs fins.

L’Agrobacterium tumefaciens SUTS 1 est une bactérie qui dégrade non seulement le cyanure

libre et total, mais l’utilise comme source de carbone. (Potivichayanon et Kitleartpornpairoat,

2010).

Plusieurs bactéries sont capables d’utiliser le cyanure comme seule source de carbone et

d’azote. C’est le cas des espèces comme Pseudomonas, Brucella et Ochrobacterum. (Parmar.

P et al., 2012).

Une étude menée par Huertas et al. (2010) a montré que des bactéries comme Alcaligenes

spp., Arthrobacter spp., Burkhoderia cepacia, Bacillus pumilus, Pseudomonas aeruginosa,

Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344

sont responsables de la dégradation du cyanure, avec l’ammonium comme sous produits.

Les bactéries peuvent également être utilisées pour la biodégradation sur membrane. D’après

Kowalska et al. (1998), les bactéries comme Agrobacterium radiobacter, Staphylococcus

seiuri et Pseudomonas diminuta ont donné un résultat positif sur la biodégradation du cyanure

sur membrane d’ultrafiltration.

Chien-Sao et al. (1996), Daniel et Olapaggan (1989) ont étudié la dégradation du cyanure par

les bactéries Pseudomonas fluorescens et ont prouvé que ces bactéries étaient capables de

croître en milieu cyanuré en produisant du dioxyde de carbone et de l’ammonium.

Dix souches bactériennes ont fait l’objet d’une étude par Silva-Avalos et al. (1990). Toutes les

souches ont pu croître dans des échantillons de sols, d’eaux usées et de boues de vidange

contenant du cyanure. De ces dix (10) souches, sept (7) étaient des Pseudomonas et les trois

Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

5 ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017

(3) autres des Klebsiella.

L’espèce bactérienne Bacillus sp a également été rapportée comme une bactérie présentant

des bonnes capacités à dégrader le cyanure contenu dans des eaux usées (Chou-Fei et al.,

2014).

Les espèces bactériennes comme Bacillus pumilus, Pseudomonas fluorescens et

Pseudomonas stutzeri ont une bonne efficacité de dégradation du cyanure (Meyer, 2010).

Les espèces comme Klebsiella spp, Acidovorax spp et Achromobacter xylosoxidans sont

aussi capables de dégrader le cyanure (Quan zhe xue et al., 2005).

I.2.4. Efficacité des bactéries

Les espéces Pseudomonas sont plus efficaces que les Brucella et Ochrobacterum quant à la

dégradation du cyanure (Parmar et al., 2012).

L’efficience des bactéries sur la biodégradation sur membrane est fortement liée à la pression.

Avec une pression optimum de 105Pa, on a obtenu une dégradation du cyanure par les

Agrobacterium radiobacter, Staphylococcus seiuri et Pseudomonas diminuta avec un taux de

20.3% (Kowalska et al., 1998).

Les bactéries comme Bacillus sp sont capables de dégrader jusqu’à 200mg/L d’une

concentration de cyanure à un pH optimum de 10.3 avec une efficacité de 96.69% pendant

une durée de 72heures (Chou-Fei Wu et al., 2014).

Pseudomonas fluorescens est capable de dégrader jusqu’à 79% de 400mg/l d’une solution

cyanurée à un pH acide égal à 5 (Meyer, 2010).

I.3. ISOLATION DES BACTERIES

I.3.1. Définition

L’isolation est utilisée en microbiologie comme première phase de classification des

bactéries. Afin de connaitre une information sur la taxonomie des bactéries, il suffit de les

cultiver dans un milieu spécifique. Le type du milieu détermine la présence ou non du type de

bactérie recherché. Il permet d’avoir des cultures pures d’une espèce bactérienne (Prescott et

al., 2003).

I.3.2. Méthodes d’isolation

Il existe plusieurs méthodes d’isolation des bactéries. Keynaud et Franche (1986), Amer et al.

Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

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(2013) ont travaillé sur l’isolation des cyanobactéries. Ils ont montré qu’on peut isoler les

cyanobactéries dans le milieu BG-11, constitué de plusieurs nutriments dont le sulfate de

cuivre, le nitrate de sodium, le sulfate de magnésium, solidifié avec de l’Agar en cas de

nécessité.

François et al. (2011) ont également montré que des bactéries dégradeurs du mercure et de

l’arsenic peuvent être isolées par la méthode de dilutions successives, suivie de la fixation sur

la gélose.

Quant à Parmar et al. (2012), ils ont étudié les bactéries dégradeurs du cyanure dans des

échantillons de sols. La méthode d’isolation utilisée consiste à inoculer les bactéries par la

méthode des stries sur un milieu de gélose Bushnell-Haas, où le cyanure de potassium (KCN),

à une concentration de 23mg/L, est la principale source de carbone et d’azote pour les

bactéries.

Une autre méthode, utilisée par (Meyer, 2010), le milieu “Luria-Bertani” ou milieu “LB”

consiste à inoculer les bactéries dans un milieu composé de plusieurs nutriments, dont 4 à 10

mM de cyanure de sodium (NaCN) comme seule source de carbone et d’azote pour les

bactéries.

I.3.3. Avantages et limites

L’isolation, si elle est bien réalisée, permet d’obtenir des colonies isolées, donc des cultures

pures d’une espèce bactérienne. Ce qui représente une facilité pour la phase de

caractérisation.

En outre, cette technique est limitée car elle exige l’utilisation des milieux de culture, hors

que environ 90% des bactéries ne sont pas cultivables. (Pina et Raynaud, 2003) et (Prescott et

al., 2003)

I.4: CARACTERISATION DES BACTERIES

I.4.1. Définition

La microbiologie permet l’identification et la classification des microorganismes afin

d’appréhender leur diversité. Elle repose sur des techniques appelées “techniques de

recherche” basées sur l’identification et la classification des microorganismes, éventuellement

inconnus.

L’identification consiste à placer un individu particulier dans un taxon connu. La souche

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inconnue est comparée à des espèces déjà décrites (souches types) et le nom de l’espèce la

plus similaire est proposé. La définition actuelle de l’identification ne comprend plus la

comparaison de propriétés biochimiques mais prend en compte l’identification globale de

l’ADN avec une homologie supérieure à 70%. (Pina et Raynaud, 2003).

L’identification est le côté pratique de la taxinomie; elle consiste à déterminer qu’un isolat

particulier appartient à un taxon connu (Prescott et al., 2003).

I.4.2. Méthodes d’identification

Les techniques d’identification mises à la dispositions des microbiologistes ne cessent de

croître.

a) L’Agence Allemande de Protection de l’Environnement (AAPE)

L'Agence allemande de protection de l'environnement a approuvé deux méthodes

d’identification des bactéries E.coli et coliformes pour l’eau potable:

La méthode ISO 9308-1 dans laquelle on a la formation d’acide à partir du lactose.

Elle constitue la méthode de référence de l’ordonnance allemande sur l’eau

potable de 2001.

Le système Colilert-18 ou la méthode du nombre le plus probable basée sur les

substrats o-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside (ONPG) et 4-methylumbelliferyl-

b-glucuronide (MUG). cette méthode est capable de fournir les résultats de E-coli

dans l’eau potable dans une durée de 18h.

b) Le système API ou Appareillage et Procédé d’Identification:

Le système API est une version miniaturisée et standardisée des techniques biochimiques

conventionnelles pour l’identification des bactéries. Lorqu’une suspension bactérienne de

densité convenable est répartie dans les différentes alvéoles qui composent la microgalerie

(contenant de substrats déshydratés), les métabolites produits durant la période d’incubation

se traduisent par des changements de couleur spontanés ou révélés par addition de réactifs.

Elle permet l’identification d’une centaine de bacilles à Gram négatif dont les

Entérobactéries. Elle comprend 20 tests biochimiques (Kampfer et al., 2008).

c) Méthodes microbiologiques et moléculaires

Selon Prescott et al. (2003), il existe deux méthodes d’identification des bactéries, à savoir la

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méthode microbiologique (morphologie, culturale et biochimique) et la méthode génétique ou

moléculaire, basée sur l’ADN.

(1) Les méthodes microbiologiques

Les caractéristiques morphologiques donnent les caractères

microscopiques des bactéries. Le microscope optique est un outil très important qui

permet d’avoir la forme, la couleur, la mobilité et le mode de regroupement des

bactéries.

Les caractéristiques biochimiques et culturales sont très utiles car elles sont

directement en relation avec la nature et l’activité des enzymes microbiennes et des

protéines de transport. Elles donnent une comparaison indirecte des génomes. On

distingue une multitude de tests biochimiques dont le test d’indole, le test de

phénylalanine, le test d’uréase, le test de citrate de simmons, etc…

Pour la caractérisation culturale, plusieurs milieux de culture peuvent être utilisés

comme le Cetrimide Agar, le MacConkey’s Agar, le Nutrient Agar, le Blood Agar,

etc…

Ces méthodes ont également été utilisées par Parmar et al. (2012), afin d’identifier l’espèce

bactérienne capable de dégrader le cyanure.

(2) Les méthodes de biologie moléculaire

Elle se base sur l’étude des protéines et des acides nucléiques. La comparaison de ces derniers

fournit une information considérable sur les parentés véritables.

Elle comprend au minimum trois phases à savoir la phase d’extraction de l’ADN, la phase de

vérification de la pureté de l’ADN et la phase d’amplification ou PCR.

La phase d’extraction

Elle consiste à extraire l’ADN de la bactérie dans une solution donnée. Elle se fait le plus

souvent à l’aide de kit commercial. Plusieurs auteurs dont Ouédraogo (2013), Djigma (2011),

Doumbia et al. (2013), Quan zhe xue et al., (2005) ont utilisé des kits commerciaux comme «

DNA-Sorb-B » de SACACE biotechnologie ® » et « INSTANT Virus DNA Kit »

d’analytkjena® bio, The Promega Cat # A1125 DNA purification kit solutions, “Fast DNA

Spin Kit for Soil” pour faire une extraction d’ADN. Le protocole d’extraction est fourni par le

fabriquant. Les avantages et limites des kits dépendent des fournisseurs, mais la majorité des

kits permettent une extraction rapide de l’ADN et prêt pour la PCR.

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La phase de purification

Après la phase d’extraction, un contrôle de pureté de l’ADN s’avère nécessaire.

C’est ainsi que Kersanté (2004) a utilisé le Biophotomètre Eppendorf afin de vérifier l’ADN

extrait des échantillons de sol. Les rapports ADN/ARN, ADN/Protéines et la concentrations

de l’ADN sont fournis.

La phase PCR ( Réaction de polymérisation en chaine):

Elle est basée sur l’amplification de l’ADN bactérienne.

Le principe de ce test est basé sur l’amplification de l’ADN à l’aide du thermocycleur. Il

comprend 96 puits, ce qui permet de lancer plusieurs échantillons en même temps. Il est

constitué d’une suite de plus de 30 cycles généralement. A la fin de l’amplification, le résultat

est lu par électrophorèse sur gel d’agarose (Djigma, 2011) et (Béré, 2010).

Meyer (2010) a montré que l’espèce Bacillus sp, capable de dégrader le cyanure peut avoir

jusqu’à huit (8) familles différentes, qu’on peut distinguer en fonction du nombre de paire de

bases. Bacillus thuringiensis possède le plus grand nombre qui est de 5.2 Méga paires de

bases.

Ouédraogo (2013) a travaillé sur les virus impliqués dans les infections congénitales et a

montré que la méthode par PCR permettait d’identifier et caractériser les dits virus.

La méthode d’identification par PCR a également été utilisée par Doumbia et al. (2013), afin

de caractériser le virus de l’hépatite B.

Quan Zhe Xue et al. (2005) a utilisé aussi la méthode d’identification par PCR afin de

caractériser les bactéries capables de biodégrader le cyanure libre et totale dans des eaux

usées.

I.4.3. Avantages et limites

a. Les galéries API

Là où les techniques classiques nécessitaient une à trois semaines, les gammes miniaturisées

des API permettent l’obtention des résultats sous 18 à 72 heures. Elles permettent, en outre,

l’identification d’environ 800 bactéries et levures, ce qui couvre pratiquement l’ensemble des

micro-organismes pathogènes de ce type (Kampfer et al., 2008).

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Les galeries API, miniaturisées et standardisées, ont l’avantage de standardiser les caractères

biochimiques recherchés pour améliorer la reproductibilité interlaboratoire en éliminant le

choix subjectif des tests « importants » pour la caractérisation, elles limitent la variabilité

technique (utilisation de système de distribution possible). Leur utilisation est simple.

Comme inconvénients, les galeries API ont une probabilité d'obtention d'un code ne

correspondant à aucune référence suite aux tests miniaturisés. D’une manière générale, le taux

d’erreur des galeries varie entre 5 et 20% selon les galeries considérées, comprenant les

identifications incorrectes (1-15%) ou les identifications non concluantes (3-5%).

(Pina and Raynaud, 2003)

b. Les méthodes microbiologiques ou méthodes classiques

Elles donnent les caractéres utiles à la classification et l’identification des bactéries. la

morphologie est facile à étudier et à analyser. Ainsi, une similitude morphologique est une

bonne indication d’une parenté phylogénique. Mais, le microscope optique a une limite de

résolution d’environ 0.2m, ce qui réduit son utilité en ce qui concerne les structures et les

micro-organismes plus pétits.

Les caractéres microbiologiques présentent des fois une insuffisance sur la caractérisation

d’une espèce microbienne.

((Pina et Raynaud, 2003), ( Prescott et al., 2003), (Parmar et al., 2012))

c. Les techniques de biologie moléculaire

Elles ont bouleversé l’identification des bactéries, notamment par leur capacité de détection

des bactéries dont la culture au laboratoire est impossible, fastidieuse ou lente.

L’avènement de la biologie moléculaire permet une approche génotypique rapide et

complémentaire pour l’identification bactérienne. il est souvent préférable de réaliser une

PCR universelle à partir de colonies isolées sur milieux de culture pour identifier avec

certitude le germe.

Les limites de la PCR est qu’elle est réservée à quelques souches seulement car elle

représente un investissement non négligeable en matériel et réactifs.

(Pina et Raynaud, 2003)

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II. MATERIEL ET METHODES

II.1. LOCALISATION ET ECHANTILLONNAGE

Le travail a été effectué sur des échantillons provenant de deux sites d’orpaillage à savoir

Galgouli au Sud et Zougnazagmiline au Nord du Burkina Faso. Ces sites ont été identifiés par

Roamba (2014) et Kouassi (2015).

Pendant la durée de mon stage (Novembre 2016-Mai 2017), il n’y a pas eu de campagne

d’échantillonnage. Pour ce travail, nous avons donc utilisé des échantillons des deux sites

provenant des campagnes d’échantillonnage précédentes, notamment celles de Sawadogo N.

qui a eu lieu en 2015 et celle de Ibrahima Agoumo qui a eu lieu en 2016. Le tableau 1 nous

montre les différents échantillons sur lesquels nous avons travaillé.

Tableau 1: échantillons

Site saison Nature échantillon campagne

Zougna

zagmiline

pluvieuse sol 2016

sèche sol 2016

eau 2016

Galgouli pluvieuse sol 2015

sèche sol 2016

eau 2016

II.2. ISOLATION DES BACTERIES

Des analyses ont été faites sur des échantillons d’eaux et de sols provenant des sites

d’orpaillage afin d’en isoler les bactéries dégradeurs du cyanure. Ainsi un milieu de culture,

spécifique à ce type de bactéries, composé d’agar noble, de sels minéraux et de cyanure

comme seule source de carbone et d’azote, a été préparé (Razanamahandry et al., 2016).

La concentration de cyanure était de 23 mg/L car cette concentration se situe dans la

fourchette de valeur (23 à 50 mg/L) qu’une bactérie doit pouvoir dégrader pour que la

biodégradation du cyanure soit efficace (INERIS, 2011). En vue d’isoler le maximum de

familles de bactéries dégradeurs du cyanure, la concentration du cyanure utilisée a été

minimalisée à 23mg/L. Le milieu ainsi composé, est autoclavé à 121°C pour la préparation et

la stérilisation. Le pH est ensuite ajusté à 9,5 pour éviter la volatilisation du cyanure sous

forme de HCN. Ce milieu est ensuite coulé dans des boites de pétris dans lesquelles seront

ensemencées les échantillons. Cette étape est appelée ensemencement. (IBRAHIMA

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AGOUMO, 2017)

On peut récapituler le processus de cette isolation en cinq (5) étapes qui sont la préparation du

milieu de culture, l’ajustement du pH l’ensemencement des bactéries, la préparation du

bouillon nutritif et le repiquage des bactéries dans le milieu nutritif.

II.2.1. Préparation du milieu de culture

Un milieu tampon de deux différents mélanges à base de sels minéraux MSMA et MSMB a été

utilisé pour la culture des bactéries dégradeurs du cyanure. En effet, le MSMA est un milieu

comprenant des sources d’azote, de phosphore et des oligo-éléments alors que le MSMB

contient les métaux traces. Les deux milieux constituant le MSM (Solution Minérale

Minimale) sont le plus souvent utilisés en assainissement et gestion de site (Howard, 1995).

Notons que l’eau utilisée pour la préparation du milieu de culture était l’eau ultra-pure.

Dans des fioles de 100 mL, différentes quantités des composés permettant d’obtenir le

MSMA, milieu sélectif avec les sels suivants ont été utilisés: 0,88 g (NaH2PO4, H2O), 2,26 g

(K2HPO4), 2,05 g [(NH4)2SO4], 0,052 g (MgSO4, 7H2O) et 1 g (NaNO3).

Le MSMB, constitué de métaux traces a été par contre préparé dans une fiole unique de 100

mL. Il a été fait de: 29,03 mg (CoSO4, 7H2O), 47,43 mg [Al(SO4)2, 12H2O], 15,96 mg

(CuSO4), 28,75 mg (ZnSO4, 7H2O), 278,01 mg (FeSO4, 7H2O), 169,02 mg (MnSO4, H2O) et

48,39 mg (Na2MoO42-, 2H2O).

Dans une fiole de 1 L d’eau ultra-pure, les volumes des sels du MSMA utilisés étaient: 9,6 mL

(NaH2PO4, H2O) +19,49 mL (K2HPO4) +12,49 mL [(NH4)2SO4] +0,59 mL (MgSO4,

7H2O)+17,69 mL (NaNO3). Ce mélange a été complété avec 1 mL du MSMB et 20 g d’Agar-

agar technique puis agité et homogénéisé pendant 4-5 minutes sur une plaque chauffante. Une

fois homogénéisé, le milieu sera autoclavé à 121°C pendant au moins 3 h puis refroidi à une

température d’environ 50 °C avant l’ajustement de son pH.

II.2.2. Ajustement du pH

L’ajustement du pH se fait en milieu stérile sous la hotte ventilée « Telstar Bio II A». Il

consiste à noter le pH initial du milieu de culture, ajouter des gouttes de NaOH de

concentration 10N pour l’élever à 8,5 puis ajouter 100mL d’une solution de cyanure de

potassium KCN de concentration 23 mg/L pour le rehausser à 8,7. Enfin les gouttes de NaOH

seront une fois de plus ajoutées pour amener le pH final à 9,5. Il est à noter que l’ajout des

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gouttes de NaOH permet de stabiliser le cyanure et éviter sa volatilisation.

Dans le cadre de notre expérience, le pH initial de notre milieu de culture est égal à 6,97.

Après ajout des gouttes de NaOH à l’aide d’un embout de 100 μL, le pH est passé à 8,40 et

s’est élevé à 8,44 quand le cyanure de potassium de concentration C = 23 mg/L a été ajouté au

milieu. Enfin, les gouttes de NaOH ont porté le pH à 9,12 et le milieu a été coulé dans des

boites de Pétri qui seront ensemencées 24h plus tard.

II.2.3. Ensemencement des bactéries

Pour l’ensemencement, on a procédé à la température ambiante, en milieu stérile sous la hotte

« Flow Fast V ». Les ances de platine, préalablement stérilisées dans le stérilisateur « Stéri

Max, WLD-TEC » à très haute température, sont refroidies quelques minutes, avant

d’effectuer l’ensemencement sur les boites de pétri en faisant des stries serrés sur la première

moitié de la boite, et des stries larges sur la seconde moitié.

Après ensemencement, les boites de pétri sont induites pour incubation dans l’étuve

« MEMMERT » à 28°C pendant quinze (15) jours. Cela nous donne plusieurs colonies de

forme différente, pouvant correspondre à des espèces bactériennes.

II.2.4. Repiquage des bactéries dans le milieu nutritif

Du bouillon nutritif, « Nutrient Broth » a été préparé avec de l’eau distillée, et stérilisé à

121°C pendant 15min à l’autoclave. Après refroidissement, ce bouillon est reparti dans des

tubes à essai stériles (2/3 du volume) puis à l’aide des pipettes Pasteur, il faut racler chaque

colonie selon la forme obtenue sur la boite de pétri après ensemencement, puis agiter dans le

tube à essai contenant le bouillon nutritif. Les tubes sont ensuite incubés à 30°C pendant 24h.

Un fond trouble indique un bon développement des bactéries. Les tubes sont conservés à 4°C.

C’est ce bouillon contenant les bactéries qui sera utilisé dans la suite des manipulations.

Les différentes étapes sont résumées dans la figure 1 Ci-dessous

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Figure 1: méthode d'isolation des bactéries dégradeurs du cyanure

II.3. TEST DE BIODEGRADATION

Ce test a pour but de percevoir la capacité des bactéries à dégrader une concentration de 60

mg/L de cyanure en 24 heures. Pour cela, on a mesuré la concentration de cyanure à un temps

initial t0=0 et à un temps final tf=24h.

La concentration du cyanure a été mesurée grâce au multi paramètre, possédant une électrode

spécifique pour l’ion cyanure, qui a été préalablement calibrée avec 3 solutions étalons de

cyanure de concentrations respectives 10, 50, et 100 mg/L.

L’abattement du cyanure a été déterminé avec la formule :

Formule abattement

η= ((Ci-Cf)/Ci)*100

Ci=concentration initiale du cyanure =60mg/L

Cf=concentration finale du cyanure

II.4. CARACTERISATION DES BACTERIES

Elle consiste à identifier les familles auxquelles appartiennent les bactéries isolées.

Les méthodes microbiologiques recommandent plusieurs tests pour l’identification des

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bactéries. Mais en raison de la non-disponibilité de certains réactifs, on n’a pas pu effectuer

tous les tests.

Il faut noter que c’est la première fois, au LEDES, dans le cadre de notre étude que ces

différentes techniques d’identification ont été effectuées.

II.4.1. Caractérisation morphologique

La forme des colonies a été déterminée à l’œil nu sur la boite de pétri des bactéries isolées.

Le microscope optique a permis d’observer la forme (coque ou bacille), le mode de

regroupement (en bicoques ou en chainette), la couleur et la mobilité des bactéries.

Le test de gram est surtout utilisé dans la taxonomie. Il permet avec la reconnaissance de la

morphologie et le mode de regroupement des bactéries, de renseigner sur l’ordre dont fait

partie les bactéries étudiées. Les bactéries présentent toutes une paroi, constituée de

substance, la muréine ou peptidoglycane. Chez les bactéries Gram-, il n’y a qu’une seule ou

au plus deux couches de peptidoglycane tandis que les bactéries Gram+ en possèdent

plusieurs.

Pour ce faire, on racle une colonie bactérienne à l’aide d’une pipette Pasteur qu’on dépose sur

une lame. On y ajoute quelques gouttes de solution d’hydroxyde de potassium (KOH) 3%.

Après mélange, l’aspect gluant indique que les bactéries sont à Gram-.

II.4.2. Caractérisation culturale

Elle permet d’identifier les souches bactériennes capables de se développer dans certains

milieux spécifiques. Au total, six milieux de cultures ont fait l’objet de test sur les bactéries.

✓ Mac Conkey Agar: c’est un milieu sélectif pour les bactéries Gram-. Il permet de

différencier les bactéries capables de fermenter le lactose, par rapport à celles qui ne le

sont pas. Il permet aussi de détecter les membres de la famille des enterobacteriaceae et

les Pseudomonas Spp.

Les colonies sont de couleur rose ou rouge brique pour les bactéries positives au test, et de

couleur claire ou incolore pour celles qui sont négatives.

Les bactéries capables de fermenter ou pas le lactose sont consignées dans le Tableau 2

✓ Cetrimide Agar: Il est principalement utilisé pour l'isolement sélectif et l'identification

présomptive de Pseudomonas aeruginosa.

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Il est également utilisé pour déterminer la capacité d'un organisme à produire de la

fluorescéine et de la pyocyanine

✓ Blood Agar: La gélose au sang se compose d'une base contenant une source de protéines

(par exemple le tryptone), de la digestion des protéines de soja, du chlorure de sodium

(NaCl), de l'agar et du sang de mouton à 5%.

Blood Agar (BA) est un milieu enrichi utilisé pour cultiver les bactéries qui ne poussent pas

facilement. Ces bactéries sont appelées «fastidieuses» comme ils exigent un environnement

nutritionnel spécial, enrichi par rapport aux bactéries de routine. C'est aussi un milieu

différentiel permettant la détection d'hémolyse (destruction des RBC) par des toxines

cytolytiques sécrétées par certaines bactéries, telles que certaines souches de Bacillus,

Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus et Aerococcus.

Après le test, les résultats attendus sont consignés dans le tableau 2.

✓ Deoxycholat Agar: c’est un milieu sélectif pour l’isolement de Salmonella Spp et de

Shigella Spp. En outre, le milieu a été formulé pour augmenter la fréquence de croissance

des pathogènes les plus fastidieuse, qui dans d'autres formulations ont souvent échoué à

croître en raison de l'inclusion d'inhibiteurs trop toxiques.

✓ Pseudomonas Selective Agar: c’est un milieu qui permet d’identifier la présence des

Pseudomonas Spp.

✓ Nutrient Agar: c’est un milieu nutritif à usage général utilisé pour la culture et la

croissance d'une large gamme de bactéries non fastidieuses. Il contient de nombreux

nutriments nécessaires à la croissance bactérienne.

Il est fréquemment utilisé pour l'isolement et la purification des cultures.

II.4.3. Caractérisation biochimique

Les méthodes microbiologiques d’identification recommandent plusieurs tests. Mais vu la

non-disponibilité de certains réactifs, nous avons pu effectuer les cinq tests suivants:

a. Test de sucre

Trois sucres dont le glucose, le maltose et le sucrose ont fait l’objet de test sur les bactéries.

Ces sucres permettent de connaître la capacité des bactéries à assimiler d’autres nutriments.

Sont qualifiées de hétérotrophes, les bactéries capables d’utiliser ces sucres comme source de

carbone et d’azote.

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b. Test d’indole

Il permet d’évaluer la capacité des bactéries à transformer l'acide aminé tryptophane en indole

et l'acide pyruvique en utilisant la tryptophanase comme enzyme. Les réactifs utilisés sont le

bouillon tryptone et le Kovac.

La bactérie à tester est inoculée dans un bouillon typtone avant d’être incubée pendant une

nuit à 37°C. On ajoute quelques gouttes de réactif de Kovac. Ne pas secouer le tube et

observer le résultat.

L’apparition d’un anneau rouge indique un résultat positif, et l’incolore indique le résultat

négatif.

Le tableau 2 indique les résultats attendus à l’issu du test.

c. Test de phénylalanine

Il permet d’identifier les espèces capables de produire de l’acide pyruvique à partir de la

désamination de la phénylalanine par activité enzymatique.

Il faut inoculer la bactérie à tester dans le milieu « phénylalanine agar », et incuber à 37°C

pendant 24 heures. On ajoute après 4 à 5 gouttes d’une solution de chlorure ferrique (FeCl3)

10%. L’apparition immédiate d’une intense couleur verte indique la présence de l’acide

phénylpyruvique.

Les résultats attendus sont dans le tableau 2 ci-contre.

d) Test d’uréase

Il est effectué afin d’évaluer la capacité des bactéries à hydrolyser l’urée, avec comme

enzyme l’uréase. Le milieu est composé de 20g d’urée, 5g de chlorure de sodium, 2g de

phosphate de monopotassium, 1g de peptone, 1g de dextrose, 0.012g de rouge de phénol et

15g de Agar. Pour préparer le milieu, il faut dissoudre tous les ingrédients dans 1litre (1L)

d’eau distillée et porter à l’ébullition sur une plaque chauffante, sous agitation. Répartir

ensuite le milieu ainsi préparé dans des boites de pétri. Une fois le milieu solidifié, inoculer

les bactéries sur le milieu et incuber à 35°C pendant une semaine. La coloration du milieu en

rose indique un test positif. Un résultat négatif se traduit par une couleur incolore du milieu.

Les bactéries capables d’hydrolyser l’urée ou pas sont listées dans le tableau 2.

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e) Test de citrate de Simmons

Il permet de tester la capacité des bactéries à utiliser le citrate comme seule source de

carbone. Le milieu est composé de 5g de chlorure de sodium (NaCl), 2g de citrate de sodium

dihydraté, 1g de phosphate dihydrogène ammonium, 1g de dipotassium phosphate, 0,2g de

sulfate de magnésium heptahydraté, 0.08g de bleu de bromothymol et 15g d’agar technique.

Tous ces éléments sont à dissoudre dans un litre (1L) d’eau distillée, puis laisser sous

agitation sur une plaque chauffante jusqu’à ébullition du milieu. Répartir ensuite le milieu

ainsi préparé dans des boites de pétri. Une fois le milieu solidifié, inoculer les bactéries sur le

milieu et incuber à 35°C pendant 24 heures. Le changement de couleur du vert au bleu

indique un test positif. Le non-changement de couleur indique un test négatif.

Le tableau 2 indique résultats attendus au test de citrate de Simmons

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Tableau 2: résultats attendus des différents tests

Test/milieu Résultat Bactéries correspondantes

MacConkey Agar positif Citrobacter spp. Klebsiella spp Escherichia coli Serratia spp.

négatif Proteus spp Shigella spp Salmonella spp Edwardsiella spp, Hafnia spp., Morganella

spp., Providencia spp.

Blood Agar positif Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae et Neisseria spp, Bacillus, Streptococcus,

Enterococcus, Staphylococcus et Aerococcus

négatif -

Deoxycholat agar positif Salmonella spp, shigella spp

négatif -

Pseudomonas Agar positif Pseudomonas spp

négatif -

Cetrimide Agar positif Pseudomonas aeruginosa

négatif -

Glucose, maltose,

sucrose

positif Bactéries hétérotrophes

négatif Bactéries autotrophes

indole positif Klebsiella oxytoca, Citrobacter koseri, E. Coli, P. vulgaris, M. morganii et Providenica spp,

proteus spp sauf proteus mirabilis,

négatif Proteus mirabilis, Klebssiella pneumoniae, Citrobacter freundii,

phénylalanine Positif Proteus spp, Providencia spp

Négatif Escherichia coli, enterobacter aerogenes

Uréase Positif Proteus spp, Cryptococcus spp, Corynebacterium spp, Helicobacter pylori, Yersinia spp, Brucella spp,

Klebsiella spp, citrobacter spp

Négatif Providencia spp, Escherichia, Shigella, Salmonella

Citrate de Simmons Positif Salmonella enteritidis, Acidovorax delafieldii , Leminorella grimontii, Yokenella regensburgei, Proteus

rettger, Klebsiella spp, Serratia proteamaculans, Enterobacter spp, Citrobacter spp, Proteus spp,

Providencia spp

Négatif Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, Salmonella pullorum and Salmonella gallinarum,

Escherichia coli, Shigella spp, Edwardsiella spp, Yersinia pseudotuberculosis, Morganella morganii

Hafnia alvei, Leminorella richardii, Acidovorax facilis, Acidovorax temperans, klebsiella

rhinoscleromatis

(www.microbiologyinfo.com)

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II.4.4. Caractérisation moléculaire

Cette méthode est basée sur la biologie moléculaire. Il s’agit plus spécifiquement de

manipuler l’ADN des bactéries. Elle comprend quatre (4) étapes à savoir l’extraction de

l’ADN, le contrôle de la pureté, l’amplification par PCR, et l’électrophorèse.

Cette méthode permet d’identifier chaque espèce bactérienne en fonction du comportement du

matériel génétique.

a) Extraction de l’ADN

Le kit d’extraction d’ADN GENOMIC WIZARD a été utilisé en raison de sa simplicité. La

procédure d’extraction est fournie avec le Kit par le fournisseur.

Le protocole est fonction de la coloration en Gram des bactéries, selon qu’elle soit positive ou

négative.

Pour notre cas, les bactéries sont Gram négatives; les différentes étapes de l’extraction sont:

Introduire 1ml d’une solution de culture bactérienne dans un tube de 1.5mL de

microcentrifugation. Centrifuger ensuite à 13000-16000xg pendant 2 minutes pour sédimenter

les cellules. Retirer le surnageant.

On ajoute ensuite 600L de Nuclei Lysis Solution avant de pipeter doucement jusqu’à ce que

les cellules soient remises en suspension.

Nous avons par la suite incubé à 80°C dans un bain-marie pendant 5minutes pour lyser les

cellules avant de laisser refroidir à la température ambiante.

Il faut ajouter 3L de la solution de RNase au lysat cellulaire et inverser le tube 2-5 fois pour

mélanger.

On incube une seconde fois dans un bain-marie à 37°C pendant 15-60 minutes et faire

refroidir l’échantillon à la température ambiante.

Ajouter 200L de la solution de précipitation des protéines au lysat cellulaire traité par la

RNase. Vortexer vigoureusement à haute vitesse pendant 20 secondes pour mélanger la

solution de précipitation des protéines au lysat cellulaire.

Incuber l’échantillon sur la glace pendant 5 minutes et centrifuger à 13000-16000xg pendant

3 minutes.

Transférer le surnageant contenant l’ADN dans un tube de 1.5mL de microcentrifugation

propre contenant 600L d’isopropanol

Remarque: certains surnageant peut rester dans le tube d’origine contenant le culot de

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protéine. Laisser ce liquide résiduel dans le tube pour éviter de contaminer la solution d’ADN

avec la protéine précipitée.

Mélanger doucement par inversion jusqu’à ce que les brins d’ADN filiformes forment une

masse visible.

Centrifuger à 13000-16000xg pendant 2 minutes.

Verser délicatement le surnageant et vider le tube sur du papier absorbant propre. Ajouter

600L de 70% d’éthanol et inverser doucement plusieurs fois pour laver le culot d’ADN.

Centrifuger à 13000-16000xg pendant 2 minutes. Aspirer soigneusement l’éthanol.

Egoutter le tube sur du papier absorbant propre et laisser le culot sécher à l’air libre pendant

10-15 minutes.

Ajouter 100L de la solution de réhydratation d’ADN dans le tube et réhydrater l’ADN par

incubation à 65°C pendant 1 heure

Conserver l’ADN à 2-8°C

b) Contrôle de la pureté

Après extraction de l’ADN, un contrôle s’avère nécessaire pour vérifier sa pureté. Le

Biophotométre « eppendorf plus » a permis de vérifier la pureté. Pour cela, une dilution a été

effectuée; 5L d’ADN + 195L de la solution de réhydratation. Un blanc constitué

uniquement de la solution de réhydratation doit être effectué avant de commencer les

mesures. A la longieur d’onde de 160nm, l’appareil donne la concentration de l’ADN en

g/ml; il donne également les coefficients A230, A260, A280, A340, représentant respectivement

les coefficients de l’ARN, de l’ADN, des protéines et des oligo-éléments. Les rapports

ADN/protéines et ADN/ARN sont fournis par l’appareil. En biologie moléculaire, ces

rapports doivent être dans l’intervalle 1,5-2 afin de qualifier l’ADN de pure.

c) Amplification par PCR

L’amplification en chaîne par polymérase ou réaction en chaîne par polymérase (PCR)

consiste à dupliquer en grand nombre les brins d’ADN. Pour cela, un thermocycleur

« TECHNE TC-5000 » a été utilisé.

Avant d’introduire les échantillons dans le thermocycleur, on doit utiliser un micro-tube

stérile de 300 L par échantillon dans lequel on ajoute 12,5L de Master mix + 12,5L de

primer + 3L de l’ADN amplifié. C’est cet échantillon qui sera introduit dans le

thermocycleur pour amplification.

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Pour le primer, nous avons utilisé le primer universel. Son rôle permet de situer le poids

moléculaire des bactéries, et si tel est le cas, alors le primer est adapté aux bactéries. Il a deux

caractéristiques : le sens (F) est caractérisé par 1387 paires de bases et le anti-sens (R) par 930

paires de bases. La différence entre ces deux caractéristiques nous donne une idée du poids

moléculaire des bactéries.

La PCR a été paramétrée pour une dénaturation initiale de 2 mn à 94°C, suivie de 30 cycles

de 1mn à 94°C, 2mn à 50°C et à 4mn à 72°C avec une extension finale de 4mn à 72°C.

N.B: après amplification par PCR, un séquençage des brins d’ADN serait judicieux afin

de spécifier avec précision chaque espèce. Mais en raison du manque de matériel

adéquat à notre disposition, nous n’avons pas pu effectuer cette manipulation.

d) Electrophorèse sur gel d’agarose

Après amplification, l’échantillon est soumis à une électrophorèse à 15mA, sur gel d’agarose.

Ce dernier est préparé à 1% dans 0.5* TBE buffer, auquel on ajoute 5L de bromure de

titium. Cette électrophorèse permet la migration des brins d’ADN en fonction de leur poids

moléculaire à travers un champ électrique.

On a utilisé un indicateur de poids moléculaire. Il permet de lire le nombre de paires de bases

de l’ADN extrait. Nous avons également utilisé l’ADN des bactéries E-coli comme témoin

positif, afin de savoir si il y a eu amplification de l’ADN et de l’eau distillée comme témoin

négatif qui permet de détecter l’absence d’ADN.

L’appareil DOC-PRINT VX2 permet de visualiser les résultats de la migration.

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III. RESULTATS ET DISCUSSION

III.1. ISOLATION DES BACTERIES

Les résultats de nos analyses ont montré la présence des espèces bactériennes capables de

dégrader le cyanure. En effet, la présence des bactéries capables de croitre en milieu cyanuré

a été observée. Cette présence se traduit par la formation des colonies bactériennes de

plusieurs formes à savoir les formes circulaire, fusiforme, irrégulière, punctiforme et rhizoïde.

A travers ces formes, nous avons pu isolées 20 échantillons. Ces résultats complètent ceux de

Sawadogo N. (2015) qui s’est limitée à la couleur blanchâtre, luminescentes et la taille

variable des bactéries.

III.2. CARACTERISATION DES BACTERIES

III.2.1. Caractérisation morphologique

La forme des colonies a été observée à l’œil nu. Au total, Cinq (5) formes ont été observées à

savoir les formes circulaire, rhizoïde, irrégulière, punctiforme et fusiforme. La figure 2

suivante nous montre les différentes formes observées.

Nous avons pu avoir au total 20

Figure 2: forme des colonies

Après observation microscopique, les bactéries présentent sur les deux sites ont deux

formes : la forme bacille et la forme coque. Celles qui sont sous forme de coque sont

regroupées en bicoque et chaînette, et sont mobiles.

La figure 3 nous montre les observations au microscope.

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Figure 3: forme microscopique des bactéries

L’ensemble des résultats morphologiques sont consignés dans le tableau 3.

Ce tableau nous donne la forme des colonies bactériennes, la forme des bactéries après

observation microscopique, leur mode de regroupement, leur mobilité et les résultats du test

de Gram.

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Tableau 3: récapitulatif des caractéristiques morphologiques

Site Saison Nature

échantillon

Forme colonie Forme

bactérienne

Mode de regroupement Mobilité

des

bactéries

Test de

Gram

Zo

ug

na

zag

milin

e

S.P Sol circulaire Coque

Bacille

bicoque chainette + -

Rhizoïde -

S.S Sol Circulaire Coque

Bacille

Bicoque

Chainette

+ -

punctiforme

Irrégulière

fusiforme -

Eau Circulaire Coque

Bacille

Bicoque

Chainette

+ -

irrégulière

punctiforme

fusiforme

rhizoïde -

GA

LG

OU

LI

S.P Sol Circulaire Coque

Bacille

Bicoque

Chainette

+ -

fusiforme

Irrégulière -

S.S Sol Circulaire Coque

Bacille

Bicoque

Chainette

+ -

Fusiforme

Irrégulière

Punctiforme -

Eau Circulaire Coque

Bacille

Bicoque

Chainette

+ -

Punctiforme -

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III.2.2. Test de biodégradation

Chaque type de bactérie a été isolé selon la forme de la colonie. Sur nos vingt (20)

échantillons isolées, un test de biodégradabilité a été effectué pendant 24h (à un temps initial

t0 et à un temps final tf=24h). Les différents résultats consignés dans le tableau 4 nous

montre un abattement de cyanure supérieur à 99%.

On conclut que toutes les bactéries formant plusieurs colonies sont effectivement capables de

dégrader le cyanure. Ce qui confirme les travaux de SAWADOGO N. (2015).

Tableau 4: Abattement du cyanure

site saison Nature échantillon Forme colonie Abattement cyanure η

ZO

UG

NA

ZA

GM

ILIN

E

S.P Sol Circulaire 99.96

Rhizoïde 99.96

S.S Sol Circulaire 99.88

punctiforme 99.87

irrégulière 99.87

fusiforme 99.95

Eau circulaire 99.90

irrégulière 99.93

punctiforme 99.91

fusiforme 99.89

Rhizoïde 99.89

GA

LG

OU

LI

S.P Sol circulaire 99.88

fusiforme 99.87

irrégulière 99.87

S.S Sol circulaire 99.95

fusiforme 99.80

irrégulière 99.96

punctiforme 99.95

Eau circulaire 99.84

punctiforme 99.92

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III.2.3. Caractérisation culturale

Après incubation dans les six milieux de culture à savoir MacConkey agar, Nutrient agar,

Blood agar, Deoxycholat agar, Cetrimide agar et Pseudomonas selective agar, la présence des

colonies a été observée. Le résultat positif (+) indique la présence des colonies, et le résultat

négatif (-) indique l’absence des colonies. Les résultats sont consignés dans le tableau 5.

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Tableau 5: caractérisation culturale

A chaque test sur milieu de culture, correspond des espèces bactériennes selon que le

test soit positif ou négatif. En faisant le croisement des résultats du tableau 2, nous

sommes abouti aux différentes espèces susceptibles d’être présentes sur le site. Les

résultats sont consignés dans le tableau 6 ci-dessous.

site

saison Nature

échantillon

Forme

colonie

MacConkey

agar

Nutrient

agar

Blood

agar

Deoxycholat

agar

Cetrimide

agar

Pseudomonas

agar

ZO

UG

NA

ZA

GM

ILIN

E

S.P Sol Circulaire + + + + - -

Rhizoïde + + + + + +

S.S Sol Circulaire + + + + + +

Punctiforme + + + + + +

Irrégulière + + + + + +

Fusiforme + + + + + +

Eau Circulaire + + + + + +

Irrégulière + + + + + +

Punctiforme + + + + + +

Fusiforme + + + + - +

Rhizoïde + + + + + +

GA

LG

OU

LI

S.P Sol Circulaire + + + + + +

Fusiforme + + + + + +

Irrégulière + + + + + +

S.S Sol Circulaire + + + + - +

Fusiforme + - + + + +

Irrégulière + + + + + +

Punctiforme + - + + + +

Eau Circulaire + + + + + +

Punctiforme + + + + + +

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Tableau 6: caractéristiques culturales et bactéries correspondantes

site saison Nature

échantillon

Forme colonie espèces susceptibles d’être présentes

ZO

UG

NA

ZA

GM

ILIN

E

S.P Sol Circulaire Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,

staphylococcus, aerococcus,shigella, salmonella

Rhizoïde Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,

staphylococcus, aerococcus,shigella, salmonella, Pseudomonas

dont P.aeruginosa

S.S Sol Circulaire Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,

staphylococcus, aerococcus,shigella, salmonella, Pseudomonas

dont P. aeruginosa

punctiforme

irrégulière

fusiforme

Eau circulaire Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,

staphylococcus, aerococcus,shigella, salmonella, Pseudomonas

dont P. aeruginosa

irrégulière

punctiforme

fusiforme Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,

staphylococcus, aerococcus,shigella, salmonella, Pseudomonas

Rhizoïde Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,

staphylococcus, aerococcus,shigella, salmonella, Pseudomonas

dont P. aeruginosa

GA

LG

OU

LI

S.P Sol circulaire Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,

staphylococcus, aerococcus,shigella, salmonella, Pseudomonas

dont P. aeruginosa

fusiforme

irrégulière

S.S Sol circulaire Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,

staphylococcus, aerococcus,shigella, salmonella, Pseudomonas

fusiforme Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,

staphylococcus, aerococcus,shigella, salmonella, Pseudomonas

dont P. aeruginosa

irrégulière

punctiforme

Eau

circulaire Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,

aerococus staphylococcus, shigella, salmonella, Pseudomonas

dont P.aeruginosa

punctiforme

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30

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III.2.4. Caractèrisation biochimique

a) Test de sucre

Toutes les bactéries ont été capables de croître dans les 3 milieux sucrés à savoir le

glucose, le sucrose et le maltose. On conclut que les bactéries sont donc capables

d’utiliser d’autres sources de carbone que le dioxyde de carbone (CO2). Ce sont donc

des bactéries hétérétrophes.

b) Test d’indole

Lorsqu’il est positif, un anneau rouge se forme au sommet du tube à essai après

introduction du réactif de Kovac. Une couleur incolore s’observe lorsque le test est

négatif. La figure 4 nous montre l’aspect positif et négatif du test.

Figure 4: aspect test d'indole

c) Test de phénylalanine

Lorsqu’on ajoute quatre (4) à cinq (5) gouttes de 10% de chlorure ferrique sur une

colonie bactérienne, elle se colore en vert si le test est positif.par contre, elle reste

incolore lorsque le test est négatif. La figure 5 ci-dessous nous montre l’aspect des

résultats.

Figure 5: aspect test de phénylalanine

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31

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d) Test d’uréase

Lorsqu’il est positif, le milieu se colore en rose. Et si le test est négatif, la couleur du

milieu reste inchangée; le milieu reste beige. La figure 6 suivante nous montre

l’aspecdes résultats.

Figure 6: aspect test d'uréase

e) Test de citrate de Simmons

Les bactéries présentes sur les deux sites sont toutes capables d’utiliser le citrate comme

unique source de carbone. La figure 7 suivante nous montre l’aspect de ce test

Figure 7: test de citrate de Simmons

Le tableau 7 ci-dessous nous donne le résultat des différents tests biochimiques.

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32

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Tableau 7: résultats tests biochimiques

site saison Nature

échantillon

Forme

colonie

indole phénylalanine uréase Citrate de

Simmons

ZO

UG

NA

ZA

GM

ILIN

E

S.P Sol Circulaire + + + +

Rhizoïde + + - +

S.S Sol Circulaire + - - +

punctiforme + - - +

irrégulière - + + +

fusiforme + + + +

Eau circulaire + - + +

irrégulière + - + +

punctiforme + + + +

fusiforme - - + +

Rhizoïde + + + +

GA

LG

OU

LI

S.P Sol circulaire + + + +

fusiforme - + - +

irrégulière + + + +

S.S Sol circulaire + + + +

fusiforme + + + +

irrégulière + + + +

punctiforme + + - +

Eau circulaire + + + +

punctiforme + + + +

A chaque résultat de test biochimique, correspond une espèce bactérienne. Les résultats

du croisement effectué entre ces résultats et le tableau 2, des différentes espèces

bactériennes pouvant correspondre aux tests biochimiques sont consignés dans le

tableau 8.

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33

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Tableau 8: espèces probables aux tests biochimiques

Site saison Nature

échantillon

Forme

colonie

Espèces probables

ZO

UG

NA

ZA

GM

ILIN

E

S.P Sol Circulaire Proteus, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri

Rhizoïde Providencia, citrobacter, klebsiella,

S.S Sol Circulaire Klebsiella oxytoca, morganella, providencia,

punctiforme Klebsiella oxytoca, morganella, providencia,

irrégulière Proteus, klebsiella pneumoniae, citrobacter koseri

fusiforme Proteus, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri

Eau circulaire morganella, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri

irrégulière morganella, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri

punctiforme Proteus, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri

fusiforme Klebsiella pneumoniae, proteus mirabilis, citrobacter

freundi, morganella

Rhizoïde Proteus, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri

GA

LG

OU

LI

S.P Sol circulaire Proteus, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri

fusiforme Providencia, citrobacter, klebsiella pneumoniae

irrégulière Proteus, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri

S.S Sol circulaire Proteus, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri

fusiforme

irrégulière

punctiforme Providencia, citrobacter, klebsiella

Eau circulaire Proteus, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri

punctiforme

En combinant les résultats des tests morphologiques, culturaux et biochimiques,

plusieurs espèces peuvent donner la même forme de colonie ; de même, la même espèce

peut se regrouper en colonie de forme différente. A partir du tableau 2, nous avons

effectué un croisement des résultats de tous les tests à savoir les tests sur milieux de

culture (tableau 6), les tests biochimiques (tableau 8). La combinaison de ce croisement

et des caractérisations morphologiques (tableau 3) nous a permis d’identifier certaines

espèces bactériennes. (voir tableau 9)

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Tableau 9: récapitulatif des différents tests d'identifications microbiologiques

site saison Nature

échantillon

Espèces probables

ZO

UG

NA

ZA

GM

ILIN

E

S.P Sol Klebsiella oxytoca, staphylococcus Sp, Pseudomonas Sp

S.S Sol Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas

Sp, Staphylococcus Sp

Eau Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, pseudomonas

spp, staphylococcus Sp

GA

LG

OU

LI

S.P Sol Klebsiella oxytoca, klebsiella pneumoniae, pseudomonas

Sp, staphylococcus Sp

S.S Sol Klebsiella oxytoca, pseudomonas Sp, staphylococcus Sp

Eau Klebsiella oxytoca, pseudomonas Sp, staphylococcus Sp

Ces différents résultats nous montre que nous avons les mêmes espèces bactériennes

aussi bien dans les échantillons des sols que dans les eaux. Cela confirme les résultats

de Sawadogo N.(2015) qui a tirée les mêmes conclusions.

En effet, la bibliographie a montré que ces espèces identifiées et formant le consortium

de bactéries extraites des sites d’orpaillage étaient toutes capables de dégrader le

cyanure.

Klebsiella oxytoca a été montré comme bactérie capable de dégrader le cyanure contenu

dans des échantillons d’eaux usées et de sol pollué des industries minières, en présence

du glucose comme nutriment. le meilleur taux de dégradation d’une concentration de

280mg/L d’une solution de cyanure de potassium était de 50%, obtenu à un pH

optimum=7 (Avalos et al., 1990).

L’espèce klebsiella pneumoniae est une espèce très efficace dans la dégradation du

cyanure. En effet, Ingvorsen et al (1991) a travaillé sur des échantillons d’eau et de sol

industriels contaminé par le cyanure de sodium à une concentration de 245mg/l. Il a

montré que l’espèce Klebsiella pneumoniae, à un pH optimum de 7,8 dégradait jusqu’à

99% de la concentration.

L’espèce Pseudomonas est reconnue pour son pouvoir épurateur de cyanure. En effet,

Parmar et al (2012) a travaillé sur des sites industriels en Inde pollués par le cyanure ; il

a montré qu’à pH optimal =8,5, les bactéries arrivent à dégrader 80% d’une

concentration de 100mg/L de cyanure de potassium. Il a ensuite effectué les différents

tests d’identification qui ont montré que ces bactéries étaient des espèces Pseudomonas.

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35

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Meyer (2010) a utilisé aussi les pseudomonas dans des conditions acides avec une

concentration de 400 mg/L de cyanure. Il a obtenu une rendement de dégradation de

79%, à un pH optimum=5.

L’espèce staphylococcus est également une bactérie capable de dégrader le cyanure. En

effectuant la biodégradation sur membrane d’ultrafiltration, Kowalska (1996) a obtenu

un taux d’abattement de 20,3% lorsque le pH est optimisé à 7,5.

Le tableau 10 nous donne un récapitulatif de toutes ces espèces

Tableau 10: récapitulatif des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure

Espèce pHoptimum Abattement (%) Référence

Klebsiella oxytoca 7 50

99

Avalos (1990)

Ingvorsen et al (1991) Klebsiella pneumoniae 7.8

Pseudomonas spp 8.5

5

80

79

Parmar et al (2012)

Meyer (2010)

Staphylococcus spp 7.5 20.3 Kowalska (1996)

Toutes ces études ont montré que le pH optimum pour chaque espèce formant le

consortium est fixé et varie du milieu acide pH=5 au milieu basique pH=8,5. Ces

résultsts expliquent ceux de Ibrahima Agoumo (2017) qui a montré qu’à plusieurs

valeurs du pH (5 ; 7 ; 9,5 ; 10,5), nous avons un taux d’abattement minimal de 95%.

Après ces résultats microbiologiques, nous passons aux résultats obtenus par la biologie

moléculaire

III.2.5. Caractérisation moléculaire

a) Extraction de l’ADN

Pour tous les échantillons extraits, on a obtenu l’ADN sous forme de brins filiformes,

formant une masse blanche visible. La figure 8 ci-contre nous montre l’aspect de l’ADN

extrait.

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36

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b) Vérification de la pureté d’ADN

Le biophotomètre a donné des coefficients A260/A230 et A260/A280 représentant

respectivement les rapports ADN/ARN et ADN/Protéines, ainsi que la concentration de

l’ADN

Pour l’ensemble des échantillons, l’ADN extrait a des valeurs ADN/ARN et

ADN/Protéines comprises entre 1.5 et 2 comme le montre le tableau 10. On conclut que

l’extraction a été bien faite puisque les différents coefficients respectent les normes de

biologie moléculaire qui exige que ces valeurs soient comprises entre 1,5 et 2.

Figure 8: aspect ADN extrait

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37

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Tableau 11: coefficients ADN/ARN et ADN/Protéines

site Saison Forme

colonies

A260/A230 A260/A280 Concentration

μg/mL

ZO

UG

NA

ZA

GM

ILIN

E

Pluvieuse

sol

Circulaire 1.65 1.79 562.2

Rhizoïde 1.49 1.53 546.1

Sèche-

sol

Circulaire 1.75 1.89 253.7

punctiforme 1.53 1.67 374.5

irrégulière 1.57 1.72 285.6

fusiforme 1.68 1.71 148.3

Sèche-

eau

circulaire 1.68 1.71 148.3

irrégulière 1.53 1.73 815.7

punctiforme 1.72 1.81 828.1

fusiforme 1.68 1.73 594.4

Rhizoïde 1.66 1.77 336.4

GA

LG

OU

LI

Pluvieuse

sol

circulaire 1.65 1.79 951.4

fusiforme 1.73 1.84 634.6

irrégulière 1.54 1.69 620.2

Sèche-sol circulaire 1.61 1.69 789.7

fusiforme 1.70 1.87 735.7

irrégulière 1.83 1.82 668.1

punctiforme 1.98 1.86 188.1

Sèche-

eau

circulaire 1.68 1.66 298.4

punctiforme 1.69 1.77 367.6

c) Amplification et électrophorèse

Après amplification et électrophorèse, on a observé les résultats de la migration.

La figure 9 suivante nous montre les résultats de cette migration.

Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

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Figure 9: résultat amplification

La flèche + (verte) ou numero 8 indique le contrôle positif et la flèche – (rouge) ou

numero 7 indique le contrôle négatif. Le numéro 1 indique le marqueur de poids

moléculaire. Les traces obtenues pour nos différents échantillons ont montré un

resultat similaire à la plage positif. Cela signifie que l’amplification a bien eu lieu dans

tous les échantillons.

le marqueur de poids moléculaire a pour rôle d’indiquer le poids de l’ADN. Son échelle

est donné par le fournisseur. Dans notre cas, il nous montre que l’ADN extrait de nos

bactéries a le même nombre de paire de bases, situé entre 250 et 500. Nous remarquons

que le poids pour nos bactéries est autour des 500.

Pour les caractéristiques du primer, la différence a donné 457 paires de bases. Ce qui

nous permet de conclure que le poids moléculaire des bactéries est bien situé entre 250

et 500 paires de bases, et que le primer est adapté à nos bactéries.

Vu la non possibilité d’accès aux banques de données génomiques des différentes

bactéries, nous n’avons pas pu approfondir l’interprétation de nos résultats.

Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

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IV. CONCLUSION

La croissance de l’orpaillage au Burkina Faso entraine des dommages collatéraux sur

l’environnement comme la pollution des ressources en eaux et du sol. Des procédés

biologiques de traitement présentent une bonne alternative pour la réhabilitation par

rapport aux procédés chimiques qui sont plus couteux. Mais pour cela, il est nécessaire

de connaître les bactéries qui interviennent dans la bioremédiation.

Notre étude s’est focalisée sur l’isolation et l’identification des bactéries présentes sur

les sites capables de dégrader le cyanure.

Les bactéries contenues dans les échantillons provenant des eaux et du sol des deux

sites ont été isolées dans un milieu spécifique aux bactéries capables de dégrader le

cyanure. Plusieurs formes de colonies ont été obtenues à savoir fusiforme, circulaire,

irrégulière, punctiforme et rhizoïde. L’identification à travers les méthodes

microbiologiques et biologiques ont permis d’identifier trois familles bactériennes à

savoir les pseudomonas spp, les klebsiella spp et les staphylococcus spp.

La particularité de cette étude réside dans le fait que le consortium de bactéries capables

de dégrader le cyanure a été isolé et par la suite identifiée par rapport à la forme des

colonies. Nous avons effectué le test de biodégradabilité ; tous les 20 échantillons ont

été capables de dégrader jusqu’à 99,8% de 60 mg/L de cyanure. Les différentes

méthodes d’identification ont limité le nombre de bactéries à quatre espèces. La

bibliographie a montré le pouvoir épurateur de ces espèces.

Ces résultats pourront être utilisés par la suite, pour le séquençage de l’ADN.

Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

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V. RECOMMANDATIONS /PERSPECTIVES

Afin de compléter cette étude, il faut identifier l’espèce la plus potentielle qui mérite

d’être favorisée pour la bioremédiation des deux sites. Cela permettrait de savoir

l’espèce qui se trouve majoritairement sur chaque site, de prédire son comportement et

de contrôler le nombre afin de respecter l’équilibre microbiologique du milieu.

De plus, une carte représentant la dispersion des bactéries est nécessaire pour

comprendre leur comportement vis-à-vis du cyanure. Pour se faire, un maillage de 100 à

250 mètres doit être effectué afin d’obtenir des résultats fiables.

Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites

d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli

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Annexe : quelques matériel et appareils utilisés

Figure 10: aspect kit d'extraction

Figure 11: appareil d'amplification par PCR

Figure 12: appareil électrophorèse

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Figure 13: appareil photo DOC-PRINT X