vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 1 Étude de la...

mardi 11 avril 2023 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 1

ÉÉtude de la sensibilité ou de la tude de la sensibilité ou de la résistance aux antibiotiquesrésistance aux antibiotiques

ÉÉtude de la sensibilité ou de la tude de la sensibilité ou de la résistance aux antibiotiquesrésistance aux antibiotiques

mardi 11 avril 2023

afficher masque des dias puis pied de page et modifier

2

1- Antibiotiques : 1- Antibiotiques : généralités généralités

1- Antibiotiques : 1- Antibiotiques : généralités généralités

mardi 11 avril 2023 afficher masque des dias puis pied de page et modifier

3

1-1- Définition


4

Penicillium

Staphylococcus aureus

Découverte…

L’antibiothérapie


5

Découverte (antibiothérapie)

Fleming recherchait des molécules inhibant les contaminants des cultures.

Un jour il ensemence une boîte avec du S. aureus et oublie la boite sur la paillasse.

Quelques jours plus tard, il constate l’apparition d’un champignon (Penicillium notatum). Il remarque une zone d’inhibition autour du Staphylococcus.

Il en déduit que le champignon produit une molécule inhibant (à distance) le Staphylocoque.

Staphylococcus aureus

Penicillium


6

Distinguer Antibiotiques et Antiseptiques

Les antiseptiques (comme l'eau de Javel) sont des molécules - toxiques pour les microorganismes, - aussi toxiques pour les cellules eucaryotes- toxiques à des doses importantes (de l'ordre du g ou du mg cm-3).

Au contraire les antibiotiques sont :- des molécules toxiques pour certains microorganismes et non pour

d'autres, ce qui signe une spécificité d'action absente chez les antiseptiques. - des molécules peu toxiques pour les cellules animales- des molécules toxiques pour leurs cibles à des concentrations faibles

(de l'ordre du µg cm-3)


7

Définition… (antibiothérapie)Un antibiotique est

• une molécule toxique (statique ou cide) pour un groupe cible de microorganismes (bactéries, champignons, virus, parasites eucaryotes …)• de mode d'action spécifique• active à des concentrations faibles de l'ordre du µg.cm-3

• généralement synthétisé par un microorganisme mais souvent modifié chimiquement ou même synthétisé entièrement par les Chimistes.• peu toxique pour les cellules eucaryotes supérieures en pratique donc utilisables par voie générale.

Existent des antibiotiques anti-fongiques, anti-bactériens, et à la limite anti-parasites.

Des antibiotiques anti-bactériens comme le métronidazole ou les sulfamides qui sont aussi actifs sur certains parasites eucaryotes … ce qui justifie une définition large du terme antibiotique !

Des antibiotiques toxiques existent mais ne sont évidemment pas utilisés en thérapeutique


8

Synthèse… (exemples de souches)type d'antibiotique nom micro-organisme et date de découverte

acide aminé Cyclosérine Streptomyces orchidaceus

aminocyclitol Spectinomycine Streptomyces spectabilis

aminoglycoside Gentamycine Micromonospora purpurea

aminoglycoside Kanamycine Streptomyces kanamyceticus

aminoglycoside Néomycine Streptomyces fradiae

aminoglycoside Paromomycine Streptomyces rimosus

aminoglycoside Streptomycine Streptomyces griseus (1947)

aminoglycoside Tobramycine Streptomyces tenebrarius

bétalactamine Pénicilline G Penicillium chrysogenum ou notatum (1928)

bétalactamine Acide clavulanique Streptomyces clavuligerus

céphalosporine Céphalosporine C Cephalosporium acremonium

divers Cycloheximide Streptomyces griseus

divers Mitomycine C Streptomyces caespitosus

divers Novobiocine Streptomyces niveus

divers Rifamycine Nocardia mediterranei

glycopeptide Vancomycine Streptomyces orientalis

macrolide Érythromycine Streptomyces erythreus (1952)

macrolide Josamycine Streptomyces narbonensis (1967)

macrolide Oléandomycine Streptomyces antibioticus (1954)

macrolide Spiramycine Streptomyces ambofaciens (1954)

peptide Bacitracine Bacillus subtilis (1945)

peptide Colistine Bacillus colistinus

peptide Gramicidine A Bacillus brevus (1939)

peptide Polymyxine B Bacillus polymyxa (1947)

peptide Tyrothricine Bacillus brevis (1939)

peptide Virginiamycine Streptomyces virginiae

phénicolés Chloramphénicol Streptomyces venezuelae (1947)

polyène Amphotéricine B Streptomyces nodosus

polyène Fungimycine Streptomyces coelicolor var aminophilus

spirolactone Griséofulvine Penicillium griseofulvum

stéroïde Acide fusidique Fusidium coelcineum

tétracyclines Chlortétracycline Streptomyces aureofaciens (1947)


9

1-2- Les divers antibiotiques : classification


10

Critères de classification utilisés :

- Origine

- Nature chimique

- Mécanisme d’action

- Spectre d’action


11

Classification…


12

Classification…


13

Classification… N

O

N

O

S

N

O

O

N

O N

O

S

COOH

Noyau lactame

Pénicillines

Noyau pénam dans pénicilline G ou oxacilline

Noyau carbapénème dans l’imipeneme

Noyau oxapénam dans l’acide clavulanique

Céphalosporines Il existe une autre catégorie monobactams (seul cycle le noyau bétalactame)

N

N

O

CH3

SO3H

H

O

NO

COOHH3C

CH3

SN

H2N

Noyau céphème


14

Classification… (antibiothérapie) N

N

O

S

O

CH3

CH3

COOH

H N

N

O

S

O

CH3

CH3

COOH

HNH2

N

N

O

S

COOH

OSO CH3

O

H N

N

O

S

COOH

OO CH3

O

HNO

CH3

N

S

H2N

Pénicilline G

Ampicilline G

Céfalotine (C1G)

Céfotaxime (C3G)

Exemples de bétalactamines


15

1-3- Mécanisme d’action


16

Mode d’action

Paroi

Membrane plasmique

Transcription

ReplicationTraduction

Métabolisme


17

Mode d’action… (antibiothérapie)


18

1-4- La résistance aux antibiotiques


19

Résistances…

Imperméabilité

Comment résistent les bactéries ?Comment résistent les bactéries ?

Efflux actif

Effet éponge (hyperproduction de la cible)

Perte ou modification de la cible

Production d’enzymes inactivatrices

Utilisation d’une voie détournée (de remplacement)


20

Résistances…

Comment les bactéries acquièrent-elles la résistance ? Comment les bactéries acquièrent-elles la résistance ?

Résistance naturelle ou acquise Résistance naturelle ou acquise

- - Résistances naturellesRésistances naturelles : résistances programmées sur le : résistances programmées sur le génome bactérien, donc fixes et constantes à l’intérieur du génome bactérien, donc fixes et constantes à l’intérieur du taxontaxon- - Résistances acquisesRésistances acquises : résistances consécutives à des : résistances consécutives à des modifications de l’équipement génétique :modifications de l’équipement génétique :

* mutations (spontanées, stables se transmettant * mutations (spontanées, stables se transmettant verticalement, spécifiques : 1 seul antibiotique à la fois, verticalement, spécifiques : 1 seul antibiotique à la fois, rare : taux entre 10rare : taux entre 10-7-7 et 10 et 10-8-8))

* résistances plasmidiques (fréquentes, se * résistances plasmidiques (fréquentes, se transmettant horizontalement entre bactéries cohabitant transmettant horizontalement entre bactéries cohabitant même d’espèces différentes, pouvant concerner plusieurs même d’espèces différentes, pouvant concerner plusieurs antibiotiques différents).antibiotiques différents).


21

1-4-1- Exemples de résistance par imperméabilité

- Résistance acquise par mutations de gènes codant pour des porines permettant le passage des molécules hydrophiles comme les pénicillines à large spectre, les céphalosporines, les aminosides, les phénicoles ou les tétracyclines

- Résistance acquise par inactivation du métabolisme oxydatif nécessaire au transport actif des aminosides

- Résistance naturelle au transport actif des aminosides des anaérobies strictes


22

1-4-2- Résistance par efflux actif

Mécanisme : Existence d’une pompe à efflux : système de transport dans la membrane plasmique nécessitant de l’énergie (pompe à efflux) pompant l’antibiotique de l’intérieur vers l’extérieur plus vite qu’il ne rentre

Conséquence : Réduction de la concentration intracellulaire de l’antibiotique

Antibiotiques concernés :tétracyclines, chloramphénicol, fluoroquinolones, macrolides, certaines bétalactamines


23

1-4-3- Résistance par modification de la cible

- Modification des PLP

- Modification de la cible ribosomale

- Modification de la cible au niveau de la synthèse des acides nucléiques


24

1-4-3-1- Modification des PLP (PBP) :PLP (protéine de liaison de la pénicilline) : enzyme intervenant

dans l’assemblage du peptidoglycane sur la paroi

* soit PLP dont l’affinité diminue

* soit augmentation de la production de PLP

* soit synthèse de nouvelles PLP de faible affinité

Résistance pouvant être :

* mutationnelle (Staphylococcus, Enterococcus)

* acquise par transformation (Streptococcus pneumoniae)

1-4-3-2- Modification de la cible ribosomale de l’antibiotique

Résistance acquise par mutation (résistance aux tétracyclines,aux macrolides, aux phénicoles, plus rarement aux aminosides)

* Résistance aux macrolides par méthylation d’une base du 23S

r RNA de la sous unité 50S du ribosome

* Résistance aux aminoglycosides par modification de la protéine cible sur la sous unité 30 S du ribosome


25


26

1-4-3-3- Modification de la cible pour la synthèse des acides nucléiques ou synthèse additionnelle d’une cible alternative qui ne réagit pas avec l’antibiotique mais qui continue d’exercer la fonction de la cible originale- Mutation conduisant à une ADN gyrase n’ayant plus d’affinité pour les antibiotiques- Mutation conduisant à la production d’ARN polymérase n’ayant plus d’affinité pour les rifamycines- Modification ou synthèse d’un nouvelle DHPS (dihydrofolate synthétase) ou DHFR (dihydrofolate réductase) fixant moins bien les sulfamides, possibilité de synthèse normale par la bactérie d’acide tétrahydrofolique


27

1-4-4- Résistance par production d’enzymes inactivatrices

- Enzymes inactivant les lactamines- Enzymes inactivant les aminosides- Enzymes inactivant les phénicoles- Enzymes inhibant les MLS (macrolides,

lincosamides, streptogramines)


28

1-4-4-1- Les -lactamases

Monde des bétalactamases particulièrement complexe.

Evolution des bétalactamases :

- au fil de l’utilisation des bétalactamines

- du fait des progrès des bétalactamines par la pression de sélection.

Lecture de l’antibiogramme utile pour la détermination du type de bétalactamase.

Deux tableaux tentent de le faire, pour les Entérobactéries et les Pseudomonas.


29

Les Les lactamases lactamases* Les pénicillinases

- substrat préférentiel pénicilline G, aminopénicillines, carboxypénicilline

- autre substrat : les céphalosporines de 1ère génération* Les céphalosporinases

- substrat préférentiel les céphalosporines (pouvant toutefois agir sur les pénicillines)* Les BLSE ( lactamases à spectre étendu)

- substrat : toutes les lactamines


30

Attention : il existe des inhibiteurs des béta lactamases :- Acide clavulanique- Tazobactam…..

Conséquence : l’amoxicilline (pénicilline) associée à l’acide clavulinique (Augmentin) retrouve son activité sur les bactéries résistantes par production de béta lactamases.

Remarque : l’acide clavulanique est sans effet sur les céphalosporinases


31

Acide clavulanique : bétalactamine particulière

N

O

O

CH2OH

H

COOH


32

Différentes -lactamasesClasse

d'AMBLERGroupe Bush

site actif

naturelles de Gram + (Staphylococcus

Enterococus

Hydrolyse toutes les Pénicillines et C1G

Inhibées par les inhibiteurs de bétalactamases

2a

naturelles de Gram - (TEM-1, SHV-1)

Hydrolyse toutes les Pénicillines et C1G


2b

BLSE (SHV 2-9, TEM 23-29, Veb-1…)

Hydrolyse toutes les bétalactamines sauf carbapénèmes


2be

TRI (TEM30-41 résistantes aux inhibiteurs) non BLSE

Hydrolyse des Pénicillines seulement sauf carbapénèmes

Résistantes aux inhibiteurs de bétalactamases

2br

CTX-M appelées céfotaximases (BLSE)

Hydrolyse de nombreuses bétalactamines dont le céfotaxime et l'Aztréonam mais non le céfoxitine


?

CARB--1, 3, 4 (PSE…) (originellement de

Pseudomonas)

Hydrolyse des pénicillines y compris les carbénicillines


2c

Imi-1Hydrolyse des Pénicillines, ycompris carbapénème, des C1G, C2G


2f

BMétallo-bétalactamases

inhibées par EDTAImp-1/3, L1 (enzymes à Zn)Hydrolyse toutes les bétalactamines sauf monobactames


3a, 3b, 3c

ion (Zn)

Naturelles (AmpC)Hydrolyse pénicillines A, C1G, parfois C2G


1

Hyperproduites (AmpC)Hydrolyse toutes les bétalactamines sauf carbapénèmes


1

D Oxacillinases Oxacillinases (OXA 1-20) Hydrolyse de l'oxacilline et …Sensibilité variable (faible) aux inhibiteurs de bétalactamases

2d

pas de classe

Bétalactamasestoutes celles qui ne sont

pas classéesRésistantes aux inhibiteurs de bétalactamases

4

A

C

sérine

sérine

Céphalosporinases (chromosomiques)

Pénicillinases (bétalactamases

inhibées, en général par les inhibiteurs


33

Résistances…

Sélection des souches résistantes par l’antibiothérapie :

Quels problèmes posent la résistance ?Quels problèmes posent la résistance ?

• risque majeur d’ÉCHEC THÉRAPEUTIQUE chez le malade.

• risque de sélection dans la flore commensale d’un pathogène opportuniste déclenchant alors une maladie infectieuse (iatrogène).

• risque de sélection de bactéries résistantes qui peuvent être transmises à d’autres malades, ou, plus subtil, de sélection de souches commensales multirésistantes qui peuvent transmettre à des pathogènes cette multirésistance…


34

Effet iatrogène…

Effets toxiques de certains antibiotiques :

• aminosides : ototoxicité (atteinte de l'oreille conduisant à une

surdité) • tétracyclines : altèrent la minéralisation de l'os et des dents et les

colorent• chloramphénicol : perturbe l'hématopoïèse provoquant rarement une

aplasie.• allergies à de nombreux antibiotiques (-lactamines …)


35

1-6- Sensibilité aux antibiotiques et taxonomie


36

Antibiotiques et taxonomieIntérêt de l’ANTIBIOTYPE :

• pour comparer deux souches du même taxon, on peut comparer leurs antibiogrammes.

Identification et connaissance des résistances naturelles

• confronter les résultats de l’antibiogramme au nom du taxon identifié. S’il s’avère sensible à un Ab pour lequel il y a résistance naturelle, l’identification est à contrôler (l’inverse n’est pas vrai).

mardi 11 avril 2023


37

2- Etude de la 2- Etude de la sensibilité des sensibilité des

bactéries bactéries

2- Etude de la 2- Etude de la sensibilité des sensibilité des

bactéries bactéries


38

2-1- La CMI (concentration minimale inhibitrice)


39

2-1-1- Buts :

Déterminer les antibiotiques à utiliser pour soigner un malade atteint d’une maladie due à une bactérie ou un champignon.

Déterminer le profil de sensibilité aux antimicrobiens d’un microorganisme afin d’obtenir l’antibiotype permettant de préciser son identification.


40

2-1-2- Caractères d’une souche

Culture microbiennePas de culture

microbienne

Le paramètre de base est la CMI, concentration minimum inhibant toute culture visible de la souche.

O CMI

concentration


41

Caractères d’une souche

Concentrations critiques

La concentration critique inférieure, représentant la concentration minimum moyenne de l’Ab chez le malade ou la concentration à partir de laquelle le traitement est efficace pour un traitement « normal ».

MAIS pour savoir si l’antimicrobien peut ou non être utilisé en pratique pour soigner il ne suffit pas de connaître la CMI…

Il faut connaître la concentration de l’antibiotique chez le malade… qui dépend de nombreux paramètres, en particulier la quantité absorbée ou injectée… mais aussi de l’individu (enfant, femme, homme, maigre ou obèse, jeune ou âgé).

Pour chaque antibiotique, les études pharmacologiques ont permis de fixer deux paramètres de concentration permettant de déterminer la « sensibilité » du microorganisme :

La concentration critique supérieure, représentant la concentration moyenne maximale de l’Ab chez le malade dans le cas d’un traitement à haute dose ou la concentration à partir de laquelle le traitement est inefficace. Cette CCS peut aussi être la concentration à partir de laquelle l’Ab devient toxique.


42


Concentrations critiques

Définitions proposées très contestables car les paramètres ainsi déterminés sont avant tout déterminés par l’expérience.

CCs : parfois donnée comme une concentration toxique mais il ne faut pas négliger le fait que la concentration d’un produit dépend aussi des caractéristiques de son élimination : il existe forcément une concentration que l’on ne peut dépasser en raison de l’élimination.

D’autre part, ces paramètres dépendent évidemment de l’individu…

Enfin, les documents des fabricants montrent bien les grandes variations des concentrations en fonction du temps… que le formalisme de laboratoire ne prend pas toujours en compte.


43

Caractères d’une soucheConclusion possible en comparant la CMI et ces concentrations critiques :

Si la CMI est inférieure à la Concentration critique inférieure CCi

OCMI CCi

Chez le malade, la concentration est telle que la souche ne cultive pas.

La bactérie est dite SENSIBLE.

Le malade sera guéri par un traitement à dose normale.


44


Si la CMI est supérieure à la Concentration critique supérieure CCs

OCMICCs

Chez le malade, la concentration est telle que la souche cultive malgré un traitement à haute dose.

La bactérie est dite RÉSISTANTE.

Le malade ne pourra pas être guéri par un traitement à haute dose. Cet antibiotique est à rejeter.


45


Si la CMI est entre la Concentration critique supérieure CCs et inférieure CCi

OCMI CCs

Chez le malade, la concentration est telle que la souche n’est inhibée que si le traitement est à haute dose.

La bactérie est dite INTERMÉDIAIRE.

Le malade ne pourra être guéri QUE par un traitement à haute dose.

CCi


46

Caractères d’une soucheLes trois catégories :

O

CMICCs La bactérie est dite

INTERMÉDIAIRE.

Le malade ne pourra être guéri que par un traitement à haute dose.

CCi

OCMICCs

La bactérie est dite RÉSISTANTE.

Le malade ne pourra pas être guéri par un traitement à haute dose.

OCMI CCi La bactérie est dite

SENSIBLE.

Le malade sera guéri par un traitement à dose normale.


47

2-2- Détermination de la CMI en milieu liquide


48


Cupule témoin sans Ab

La concentration la plus forte pour laquelle il y a culture (si le témoin est +) est strictement inférieure à la CMI. La concentration précédente (pas de culture) est supérieure ou égale à la CMI.

Donc la CMI est comprise entre ces deux valeurs.

Ici : 2 µg/mL ≥ CMI > 1 µg/mL souvent résumée à 2 µg/mL

Mesure t en microplaque ou en tube à hémolyse en réalisant des dilutions successives de l’antibiotique, en ajoutant un milieu de culture avec ou sans indicateur de pH, des bactéries, puis en lisant après l’incubation la présence ou non de culture.

1024 512 256 256128 64 32 16 8 24 1

0,5 0,25 0,125

Concentrations finalesde l’antibiotique (ou

antibactérien) en µg/mL

E. coli 37°C - 24 h


49


Cupule témoin sans Ab

La concentration la plus forte pour laquelle il y a virage (si le témoin est +) est strictement inférieure à la CMI. La concentration juste précédente (sans virage) est supérieure ou égale à la CMI.

Donc la CMI est comprise entre ces deux valeurs.

Ici : 1 µg/mL ≥ CMI > 0,5 µg/mL (résumée à 1 µg/mL)

Autre mesure à l’aide d’un indicateur de pH : le milieu est glucosé et du rouge de phénol a été ajouté.

La lecture utilisera donc le virage que le témoin doit confirmer.

1024 512 256 256128 64 32 16 8 24 1

0,5 0,25 0,125

Concentrations finalesde l’antibiotique (ou antibactérien)

en µg/mL

Salmonella 37°C - 24 h


50

2-3- ANTIBIOGRAMME STANDARD PAR LA MÉTHODE DES DISQUES


51

2-3-1- Principe du test

L’Ab passe immédiatement dans la gélose (dans un cylindre de même diamètre que le disque)

Sur la boîte de milieu, dépôt d’ un disque d’Ab (contenant une charge définie)


52

Principe du test

L’Ab diffuse autour du disque en créant un gradient de concentration.


53

Principe du test

Vu par dessus : L’Ab diffuse autour du disque en créant un gradient de concentration.


54

Détermination de la CMIOn peut représenter la diffusion de l’Ab de la façon suivante :

concentration de

l'antibiotique

distance au centre du disque distance au centre du disque

6 mm ou 6,35 mmGélose pour antibiogramme

(Mueller Hinton) décharge du disque dans la gélose

diffusion de l'antibiotiquediffusion de l'antibiotique 4 mm

La relation entre le diamètre (ou le rayon) d’inhibition et la concentration de l’Ab n’est pas de proportionnalité. Elle peut être représentée par une droite en coordonnées logarithmiques


55

Détermination de la CMILa relation est donc linéaire : Log(C) = k d + b.

Pour déterminer les valeurs des constantes, on dispose des valeurs de Cci,di et CCs,ds.

Les valeurs trouvées sont comprises dans certaines limites…

Il ne faut pas leur donner plus d’exactitude que nécessaire ! Un CV de 10 à 30 % est raisonnable !


56

Détermination de la CMI par antibiogramme

Nécessité que la technique soit standardisée pour être reproductible et comparer

- le diamètre obtenu avec la souche testée

- et le diamètre

* D (d Cci) correspondant à la Cci

* d (dCCs) correspondant à la CCs

Exigences de la standardisation :

- Milieu riche : milieu de Mueller Hinton (infusion de viande de bœuf, caséine, amidon de maïs, Mg2+ et Ca2+ avec possibilité d’addition de substances pour les bactéries exigeantes

- Milieu toujours de 4 mm d’épaisseur

- Technique standardisée (recommandation de la SFM).


57

Détermination de la CMI par antibiogramme : technique

Nécessité de suivre les recommandations fournies par la SFM à suivre afin de pouvoir interpréter les résultats


58

Détermination de la CMI par antibiogramme : technique

- Suspension en eau physiologique de trouble équivalent à 0,5 Mac Farland

- Dilution au 1/10 de cette suspension

- Etalement de la dilution à la surface de la gélose à l’aide d’un écouvillon stérile imbibé sans excès (croisement des passages sans oubli des bords)

- Dépôt des disques à l’aide d’un gabarit

- Incubation, boîte retournée

- Lecture : mesure du diamètre des zones d’inhibition.


59

Principe du test

On pourra donc placer les Concentrations critiques.

CCi

CCs

C < CCi

C > CCs

CCs<C < CCi


60

Principe du test

Si la souche est

SENSIBLE, elle cultivera de la façon suivante :

CCi

CCs

Concentration =CMI


61


62

2-3-3- Lecture du testPour la lecture il faut donc, pour chaque antibiotique :

• mesurer les diamètres de la zone d’inhibition (en mm),

• comparer aux diamètres critiques correspondant aux concentrations critiques,

• conclure.

Cci = 4 µg/mL

CCs = 8 µg/mL

Diamètre = 19 mm

di = 16 mm

ds = 14 mm


63

2-3-3- Lecture du test

Observer et conclure :

CCi

CCs

Disque decéfotaxime

30 µg


64

2-3-4- Rendu des résultats

Nom de l’antibiotique

Sigle Diamètre d’inhibition en mm

Valeur de la CCs

en g/mL

Diamètre correspondant à la CCs

en mm

Valeur de la Cci en g/mL

Diamètre correspondant à la CCs

Résultat R/I/S

Valeur approchée de la CMI

en g/mL

Ampicilline AM

Acide fusidique

FA


65

Abaque de lecture (disparu)

Diagnostics Pasteur éditait des abaques pour la lecture de l’antibiogramme (voir Dictionnaire des techniques).

lire sur l'abaque la valeur de la CMI ou les limites dans laquelle elle se situe et le caractère de la souche.

diamètre du cercle

Abaque Pasteursensible intermédiaire résistant

valeurs des concentrations


66

Abaque de lecture

concentrations

diamètres


67

2-4- ANTIBIOGRAMME PAR LA MÉTHODE en deux Concentrations

critiques


68

Méthode ATB

Conclusion :

S’il y a culture c’est que l’Ab à la concentration de la cupule n’est pas actif, et inversement.

CCs pour les cupules de la colonne de droite

Cci pour les cupules de lacolonne

Témoin (pas d’Ab)

Amoxicilline

Chaque cupule contient :• L’antibiotique à CC• Le milieu de Mueller Hinton additionné des bactéries.


69

CCi CCs

Méthode ATB

Dans certaines galeries, seule une CC est testée. Il s’agit de la Cci. On ne pourra conclure que Sensible ou Résistant.

Pas de culture : souche SENSIBLE

Culture aux deux concentrations : souche RÉSISTANTE

Culture uniquement avec la Ccisouche INTERMÉDIAIRE

Culture uniquement avec le CCs :théoriquement IMPOSSIBLE

Les témoins de culture étant conformes,


70

Méthode ATB : exemple

Résistance à TIC et MEC

Sensibilité à CFM

Intermédiaire à CFT

Une seule CC : donc Sensible à CTX et sensible à CAZ

Les témoins de culture étant conformes,


71

2-5- Le E test


72

Existence d’autres méthodes dont certaines semi-automatiques depuis une vingatine d'années.

E-test : Gradient de concentrations d‘un antibiotique donné dans

une bandelette plastifiée (une bandelette par antibiotique) Dépôt de l'une de celle-ci à la surface d'une boite de Pétri

ensemencée par la suspension de la bactérie à tester Incubation à 37°C Lecture directe de la valeur de la CMI au niveau de la

zone à lire.


73

3- Approfondissement 3- Approfondissement apporté par apporté par

l’observation précise l’observation précise des antibiogrammesdes antibiogrammes

3- Approfondissement 3- Approfondissement apporté par apporté par

l’observation précise l’observation précise des antibiogrammesdes antibiogrammes

mardi 11 avril 2023


74


75

Quelques exemples d’antibiogrammes

Stenotrophomonas maltophilia

Bactérie multirésistante même aux bétalactamines de choc (CTX : céfotaxine, AMC : amoxicilline + acide clavulanique, IPM : imipénème)!

Mais sensible aux aminosides ( GM : gentamycine, AN 30 : amikacine) et quinolones de 2e génération (OFX : ofloxacine)


76


Streptococcus agalactiae (B)

Sur milieu de Mueller Hinton au sang frais.

E : erythromycine

VA : vancomycine

*CF : céfalotine

AM : ampicilline

P : pénicilline

Te : tétracycline


77


Hafnia alvei

Bien observer, en particulier les zones non circulaires autour des disques : deux Ab peuvent voir leurs effets se contredire ou au contraire s’ajouter.

ObserverL’antagonisme

La souche est sensible à CTX (céfotaxine).

La souche est R à AMC : la BL n’est pas inhibée ou peu inhibée par AC ou un autre mécanisme est mis en jeu.

Mais l’antagonisme montre une R étonnante : on peut penser que la bétalactamase agissant sur CTX apparaît sous l’action de l’acide clavulanique qui agirait comme inducteur de la synthèse.


78

3-1- Association d’antibiotiques Buts :

L’idée d’un bi ou trithérapie est évidente face à une infection grave : on imagine facilement que deux Ab seront plus efficaces qu’un seul .

MAIS ce n’est pas forcément obligatoire ! Deux molécules peuvent se « contredire ».

On doit donc tester, dans des cas particuliers, des associations d’antibiotiques.


79

Associations (méthodes des bandes)

La souche est ensemencée par inondation.

On dépose deux bandes de papier imprégnée d’Ab (on peut aussi utiliser une série de disques)

Examiner l’effet de l’association au niveau de la zone où les deux Ab sont présents.

Indifférence Addition Antagonisme Synergie


80

Associations (méthodes des bandes)

Dans cet exemple réel, aucun effet n’est observé


81

Associations (observation des boîtes)

En observant de façon attentive les boîtes, il est possible de détecter l’effet d’associations. C’est en particulier le cas avec AMC (Amoxicilline + Acide clavulanique) mais peut se produire pour d’autres Ab.

Souche de Pseudomonas aeruginosa.

Observer ici les cercles d’inhibition qui ne sont justement pas circulaires…

On voit donc ici des antagonismes.

CAZ = ceftazidile (C3G)

AMC = amoxicilline +Acide clavulanique

FOX = Fosfomycine


82








FOX = Fosfomycine


83








FOX = Fosfomycine


84

Associations Hafnia alvei

Noter que la souche est S à AM (ampicilline) et R à AMC (amoxicilline + acide clavulanique) : c’est surprenant !

Elle est aussi sensible à CTX (céfotaxine) MAIS de plus une zone d’antagonisme apparaît entre AMC et CTX et entre AMC et TIC (ticarcilline), entre AMC et MA (céfamandole) et entre IPM(imipénème) et AM.

La souche devient donc résistante : une enzyme inductible a du être produite, enzyme induite par l’acide clavulanique et l’l’imipénème.

Ainsi s’explique la R à l’AMC alors que la souche est S à AM…


85

Associations Klebsiella pneumoniae

Noter que la souche est R à AM (amoxicilline) et S à AMC : une bétalactamase sensible à l’acide clavulanique (AC) est présente.

Elle est aussi sensible à CTX (céfotaxine) MAIS de plus une zone de synergie apparaît entre AMC et CTX et entre AMC et MA (céfamandole).

L’acide clavulanique inhibe manifestement, à faible concentration, les enzymes agissant sur MA et CTX.

Cela signe une bétalactamase à spectre élargi, une BLSE. qui va conduire in vivo à une résistance à toutes les bétalactamines

Ces enzymes hydrolysent toutes les bétalactamines mais sont sensibles aux inhibiteurs de bétalactamase.

Elles ne sont détectées que par la synergie (ou l’amplification génique)


86

Cas particulier : Serratia


87

Serratia marcescens et colistine

Autour du disque de Colistine ou Colimycine, un aspect en COCARDE peut être trouvé pour Serratia en particulier


88

Cas particulier : Staphylococcus aureus


89

Résistance hétérogène des Staphylococcus

Les Staphylococcus, et en particulier aureus, présentent une stabilité génétique limitée.

On peut le voir en macroscopie dans un isolement réalisé à partir d’une colonie :

Observer les tailles variées des colonies ainsi que les variations de pigmentation.


90


L’inoculum est à forte concentration en Staphylococcus.

Il est étalé sur des milieux contenant de la vancomycine qui va donc sélectionner les R.

Noter le nombre de R en fonction de la C en vancomycine…

On peut donc voir que, dans la population initiale, issue d’un clone, toutes les bactéries ne possèdent pas la même CMI vis-à-vis de la vancomycine : la population est hétérogène.


91


Dans le cas particulier des bétalactamines, on retrouve le même problème : certains souches sont HÉTÉROGÈNES et présentent donc à partir d’un même clone :

• des colonies sensibles

• des colonies résistants

Ils ne sont visibles que dans des conditions particulières :

• culture à 30°C

• culture en milieu hypersalé

Et uniquement pour la méticilline (qui n’existe plus) ou l’oxacilline (Pénicillines M).

La résistance peut évidemment être homogène.


92

Cas particulier : Streptococcus, Enterococcus


93

Haut niveau de résistance des Streptococcus et Enterococcus

Les Streptococcus et les Enterococcus sont naturellement résistants aux AMINOSIDES par défaut de pénétration, la chaîne respiratoire, absente, étant probablement le transporteur transmembranaire.

En présence de bétalactamines, les aminosides peuvent toutefois pénétrer dans les bactéries. Mais leur activité va dépendre de la CIBLE, une protéine du ribosome : l’antibiotique peut ou non être actif.

Quand la cible est résistante on parle de haut niveau de résistance.

Quand la cible est sensible, on parle de bas niveau de résistance : la souche reste R à l’aminoside mais devient S en cas d’association aminoside-bétalactamine.

La technique de mise en évidence va utiliser des disques À HAUTE CHARGE provoquant la pénétration forcée de l’antibiotique dans la bactérie.


94


Voici un test réalisé avec 3 aminosides :

• Streptomycine (S),

• Kanamycine (K)

• et Gentamycine (G)

Avec :

- disques normaux d’antibiotiques (charge normale de 15 µg)

- disques à haute charge (500 ou 1000 µg) notés HC

Il s’agit ici d’une souche sauvage : elle est R aux aminosides à charge normale et « S » aux aminosides très chargés.

SS

SHCSHCGHCGHC

KHCKHC

GG KK


95


Cas B

Il s’agit ici d’une souche naturellement R aux aminosides à charge normale et

- à Haut niveau de R à S

- à bas niveau de R à G et K

SS

SHCSHCGHCGHC

KHCKHC

GG KK


96


Cas D


- à haut niveau de R à G et K

- à bas niveau de R à S

SS

SHCSHCGHCGHC

KHCKHC

GG KK


97


Cas E


- à haut niveau de R à tous ces aminosides.

SS

SHCSHCGHCGHC

KHCKHC

GG KK


98

3-2- Détection des résistances aux antibiotiques

Les différentes techniques abordées sont :

• le test de GOTS

• le test à la céphalosporine chromogène

• l’observation de l’antibiogramme


99

Test de GOTS

Le test de GOTS permet de rechercher le mécanisme de résistance d’une souche à un antibiotique, plus précisément l’existence de synthèse d’enzyme de destruction ou d’inactivation de l’antibiotique.

Il utilise :

- une souche sensible

- les souches résistantes à tester

- et l’antibiotique correspondant pour lequel on recherche la résistance.

Les souches testées sont caractérisées par leur capacité de LEVÉE DE L’INHIBITION DE LA CULTURE DE LA SOUCHE SENSIBLE.


100

Test de GOTS : technique

Une gélose pour antibiogramme est ensemencée avec la souche sensible, par inondation ou mieux par incorporation.

Sur la gélose ensemencée est placé le disque d’antibiotique pour lequel la souche est sensible et pour lequel la résistance est recherchée.

Ab

Chaque souche testée est placée sur la gélose par une strie partant près du disque et se dirigeant vers le bord de la boite.

AbAbAb

La boite est incubée à 37°C (en général).

37°C


101

Ab

Test de GOTS : technique

Une fois incubée, voici les résultats obtenus.

Constater la

présence de culture

Constater l’effet de

l’antibiotique sur la

souche En toute

logique les souches tests

doivent cultiver près du disque !

Observer l’effet de la souche testée sur la souche sensible :

constater une culture paradoxale

ici.

Dans ce cas, remarquer l’absence d’interférence : pas

de culture paradoxale ici.


102

Test de GOTS : exemples

Disque d’érythromycine.

A : témoin positif

D : témoin négatif

B et C souches essai.


103

Test Céphalosporine chromogène

Le test à la céphalosporine chromogène utilise une céphalosporine couplée à un chromogène. Cette molécule est incolore.

Les bactéries sont alors ajoutées à partir d’une gélose.

Si une bétalactamase est présente dans les bactéries, la céphalosporine chromogène est hydrolysée provoquant l’apparition du chromogène libéré rose.

ATTENTION :

• soit l’enzyme est CONSTITUTIVE et la bactérie la possède toujours,

• soit elle est INDUITE et la bactérie doit être prélevée sur un milieu avec inducteur (bétalactamine).


104

Test Céphalosporine chromogène

Un test à la céphalosporine chromogène est commercialisé par biomérieux sous le nom de Cefinase®. Il est imprégné d’eau puis les bactéries sont déposées à la pipette Pasteur.

En voici un résultat

(souche d’Haemophilus influenzae)


105

OBSERVATION DE L’ANTIBIOGRAMME


106

1. AMX(amoxicilline) /AMC (amoxicilline + acide clavulanique)


107

Observation AM/AMC

L’acide clavulanique est une bétalactamine particulière :

Il inhibe les bétalactamases (du moins un certain nombre).

N

O

O

CH2OH

H

COOH


108

Observation AM/AMC

Si une souche possède une bétalactamase, elle devient R à l’Ampicilline (AM) ou à l’Amoxicilline (AMX).

Si cette bétalactamase est sensible à l’acide clavulanique (AC), et si la bactérie est sensible à AM ou AMX, alors elle devient S à AMC (=AMX + AC).

Voici un exemple montrant la Sensibilité à AMC et la Résistance à AM.

(souche d’Haemophilus influenzae sur gélose Chocolat enrichie)

Cette souche montre, dans le test Cefinase ,une bétalactamase.


109

2. Colonies « squatters »


110

Observation autour d’une bétalactamine

On peut observer les colonies en limite de zone d'inhibition autour d ‘un disque de bétalactamine :

Des colonies débordant légèrement signent la présence probable d’une bétalactamase.

Colonies « squatters »

vendredi 10 janvier 2014 afficher masque des dias puis pied de page et modifier 1 Étude de la...

Documents