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Olivier Plantard UMR INRA-Oniris « BioEpAR » "Biologie, Epidémiologie et Analyse de Risque en santé animale” Variabilité génétique des tiques : apports pour la lutte anti-vectorielle et la compréhension de l'épidémiologie des maladies à tiques Rennes, 25/02/2014

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Olivier Plantard

UMR INRA-Oniris « BioEpAR »"Biologie, Epidémiologie et Analyse de Risque en santé animale”

Variabilité génétique des tiques :apports pour la lutte anti-vectorielle

et la compréhension de l'épidémiologie des maladies à tiques

Rennes, 25/02/2014

Olivier Plantard

UMR INRA-Oniris « BioEpAR »"Biologie, Epidémiologie et Analyse de Risque en santé animale”

Variabilité génétique des tiques :apports pour la lutte anti-vectorielle

et la compréhension de l'épidémiologie des maladies à tiques

Rennes, 25/02/2014

3

Définition :Vecteur = arthropode hématophage qui assure la trans mission biologique

(ou mécanique) active d’un agent infectieux d’un vertébré à un autre vertébré

Vecteur

HôteAgent pathogène

4

Jones, Nature 2008

Les maladies vectorielles : impact majeur sur la santé humaine

5

Malaria : 1,2 millions de morts par an

http://vigilance-moustiques.com/10-ans-de-progression-du-moustique-tigre-en-france/

Source : OMS

6

Une exemple de maladie vectorielle en santé animale : le Virus de Schmallenberg

EID, 2011

Hexapodes : Insectes

Hématophagie chez 14 000 espèces d’insectes, issus de 5 ordres différents

Classification phylogénétique du vivant. Lecointre & Le Guyader 2001

Arachnides :Acariens :

Tiques

Hexapodes : Insectes

Hématophagie aussi chez des chélicérates

9

Ixodes ricinusIxodes scapularis

Rosa et al. 2005

Borrelia burgdorferi

« Lyme disease should be recognized as a virulent epidemic that is at least six times more common than HIV/AIDS. »

La principale maladie humaine transmise par les tiques : la maladie de Lyme

Janvier 2014

Ixodes ricinusIxodes scapularis

Distribution des vecteurs de la maladie de Lyme

La Borreliose : un complexe d’espèces bactériennes en cause

Borrelia spielmanii associée au lérot

Borrelia lusitaniae associée aux lézards

associations préférentielles entre espèces de Borrelia et espèces de vertébrés-hôtes

13

Borrelia burgdorferi : agent responsable d’une maladie décrite seulement en 1982mais le plus vieil agent pathogène connu associé à l’homme

© L. Malandrin

Babesia divergens

Un exemple de maladie animale transmise par les tiques : la piroplasmose bovine

Niu et al. 2013

Rhoptry-Associated Protein

Chauvin et al. 2009

Pédipalpes

Chélicères

Hypostome

Adaptations morphologiques des tiques

Organe de Haller

17

Niveau d’expression de différents gènes chezdes tiques non-infectées / tiques infectées par B. burgdorferi

Le niveau de transcription de certains gènes de tiques est manipulé par les bactéries Borrelia

Tick housekeeping gene

Bacteria housekeeping gene

Tick salivary gland gene

Tick salivary gland gene

Hovius et al. 2007Ramamoorhy et al. 2005

Les tiques : des géants parmi les acariens !

Poids x 100

larve

oeuf

femelle

mâle

nymphe

2ème

Cycle de vie à 3 stades et 3 repas sanguins sur 3 hôtes différents

Cycle durant 2 à 4 ans;dont seulement 5% sur un hôte

Les tiques hébergent de nombreux micro-organismes :

Alphaprotéo

Spirochaeta

Bactéries intracellulaires trouvées dans les tiques

Wolbachia

Collaboration avec

Claudio Bandi et Davide Sassera

Ixodiphagus hookeri

Midichloria mitochondrii

La présence de Wolbachia dans

Ixodes ricinus est liée à celle

d’un parasitoïde

Quelles conséquences de la présence de Midichloria sur la

fitness des tiques ?

présente dans 100% des femelles

d’I. ricinus sauvages

Plantard et al. 2012

2) Pour une meilleure compréhension de l’épidémiologie des maladies transmises par les tiques

- Connaissance des flux de gènes entre populations de tiques permettant d’estimer leur dispersion

Objectifs

1) Pour développer des méthodes de contrôle efficaces et durables contre ces vecteurs

Etude de la variabilité génétique des tiques à l’échelle inter- et intra-spécifique

23 /45

- Connaissance de la variabilité des gènes de tiques (interactions avec les hôtes, les pathogènes…)

vaccins anti-tiques acaricides

Séquençage de 6 gènes :• 4 gènes « de ménage » : ¤ 2 gènes mitochondriaux : 16S (444 bp) – COI (1318 bp)

¤ 2 gènes nucléaires : 18S (1770 bp) - EF1-α (1001-1814 bp)• 2 gènes potentiellement impliqués dans la transmission de pathogènes :

Trospa (695 bp) - Defensin-2 (960 bp)Alignement de 6200-6800 bp

Local scale: Gâvre Forest [10 ha]

Regional scale [343 km]

Eurasian scale [827 km]

Western Palearctic scale [1014 km] (Eurasia +north-Africa)

+++

Phylogéographie d’ Ixodes ricinus

� Décrire la variabilité génétique de l’espèce (aire de répartition)� Existe-t-il un patron sud-nord de diversité traduisant l’existence d’un refuge glaciaire ?

24 /45

Noureddine et al. 2011

Neighbour-Joining, MCL

9/12

0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

0.010

0.012

0.014

0.016

0.018

0.020

Local scale Regional scale Distribution areascale with N-A

populations

Diversité nucléotidique(π de Nei)

Phylogéographie d’ Ixodes ricinus

TrospA gene

Noureddine et al. 2011

Neighbour-Joining, MCL

10/12

Noureddine et al. 2011

0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

0.010

0.012

0.014

0.016

0.018

0.020

Local scale Regional scale Distribution areascale with N-A

populations

Afrique du nord

Diversité nucléotidique(π de Nei)

Phylogéographie d’ Ixodes ricinus

TrospA geneNoureddine et al. 2011

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�Absence de structuration entre populations eurasiatiques :

Fort flux de gènes entre ces populations (rôle des oiseaux migrateurs ? des échanges commerciaux d’animaux ?...)

� Forte divergence génétique entre Eurasie/ Afrique du nord :

Différenciation génétique ancienne dans des populations relictuelles (montagnes…) ?

Phylogéographie d’ Ixodes ricinus

Conclusion

� Echantillonnage de populations de tiques de part et d’autre de barrière à la dispersion des

mammifères (grands fleuves)

20 km

Capacité de dispersion des hôtes :

< <

� Génotypage de 31 individus par population avec 6 marqueurs microsatellites

? ?� Rôle des fleuves comme barrières potentielles

aux flux de gènes entre populations de tiques

Contributions relatives des hôtes dans la dispersion des tiques :

larva

eggs

female

male

nymphe

1st blood meal

3rd

blood meal

2nd blood meal

Dispersion d’Ixodes ricinus à l’échelle régionale

Echantillonnage de populations de tiques par collecte « au drapeau » (printemps- été 2008) :

4 transects de 4 populations

Génotypage de 31 individus (nymphes) par population avec 6 marqueurs microsatellites (6000allèles

Loire

GaronneRhône

Rhin

Dispersion d’Ixodes ricinus à l’échelle régionale

Différenciation génétique entre 2 populations (Fst):

>

• Si la dispersion des tiques par les oiseaux est négligeable(ce sont les mammifères qui dispersent les tiques) :

FstFst

Fst

20 km

• Si la dispersion des tiques par les oiseaux est importante :

=FstFst

Fst

Dispersion d’Ixodes ricinus à l’échelle régionale

31

Conclusion

20 km� Les fleuves ne jouent pas un rôle de barrières

aux flux de gènes entre populations de tiques

� Les oiseaux jouent un rôle majeur dans la dispersion des tiquesà l’échelle régionale :

<

Dispersion d’Ixodes ricinus à l’échelle régionale

Les tiques et leurs hôtes ne vivent pasdans un environnement homogène

Outil de Simulation Cartographique à l’échelle du paysage Agricole du Risque acarologique

Agrobiosphère

� Il est nécessaire de prendre en comptel’hétérogénéité à l’echelle du paysage

32 /45

Dispersion d’Ixodes ricinus à l’échelle du paysage

Laboratoire porteur du projet

33 /45

� Habitats

� Densité de tiques

� Génotype de tiques

� Densité et mouvements des hôtes

� Prévalence de pathogènes dans les tiques(Borrelia, Anaplasma, Babesia)

� Hôtes utilisés par les tiques (repas sanguins)

Pour mesurer les flux de gènes à une échelle aussi fine, il faut des marqueurs génétiques résolutifs

3 sets de loci microsatellites (6, 17, 9) ont été développés mais ils présentent des difficultés de détermination des génotypes et montrent des patrons non-mendéliens de transmission des allèles

� Développement d’un nouveau type de marqueurs : les Single Nucleotide Polymorphisms (SNP)

� Pyroséquençage d’une partie réduite du génome (Reduced Representation Libraries)

• Pas de génome de référence disponible ("traces" d’ I. scapularis mais pas d’assemblage)• Génome de grande taille (2.1 Gb)

Isolement et mise au point de marqueurs SNPs à partir du génome d’Ixodes ricinus

Alshuler et al, 1998

34

Elsa Quillery

� Sélection de 1765 SNPs

Découpage des reads en k-mers

Analyse des graphes de De Bruijn pour repérer les SNPs

Filtrage des SNPs à partir de critères de qualité, profondeur de séquençage…

� Amorces dessinées pour 384 loci

� 1 400 000 reads

Taille moyenne des reads = 530 bp

En l’absence de génome de référence, utilisation d’une suite originale de logiciels, en collaboration avec des bioinformaticiens de l’INRIA (Rennes; Pierre Peterlongo et Olivier Quenez) : DiscoSNP (Uricaru et al. soumis)

Génotypage haut débit par la technologie Fluidigm

Volume : nanolitre (10-9L)

Puce de 96 x 96 = 9 216 réactions PCR

Quillery et al. 2013

Validation des marqueurs SNPs par génotypage

� 368/384 (96%) des loci ont montré la présence des deux allèles

- Préamplification de l’ADN de nymphes individuelles par « Whole Genome Amplification »

Echantillonnage de 3000 tiques par la « méthode du drap » dans 900 localités géoréférencées

Génotypage de 480 tiques par 384 loci

Quillery et al. in prep

36

Dispersion d’Ixodes ricinus à l’échelle du paysage

Quillery et al. in prep

� Absence d’isolement par la distance

v v

12

3

1 32

% d’assignation du génomeà chaque entité génétique

� Absence de structuration génétique à l’échelle du paysage

Fst / 1-Fst entre paire d’individus

Sélection de 371 individus , 128 SNPs

Assignation bayesienne (STRUCTURE; k=9)

Distance (m)

371 individus

Dispersion d’Ixodes ricinus à l’échelle du paysage

38

Conclusion

Absence de différenciation génétique et d’isolement par la distance à l ’échelle du paysage.

Hypothèses avancées :

- Taille importante des populations (150 nymphes / 10 m2) qui limite l’effet de la dérive génétique

Platt et al. PLOS Genetics 2010

« No natural breaks correspondingto classical notion of populations »

- Mouvements importants des hôtes à l’échelle du paysage (chevreuils, oiseaux…) occasionnant des flux de gènes entre populations de tiques

- Modification trop récente de la structure du paysage pour la mise en place d’une différentiation génétique

Arabidopsis thaliana149 SNPs

Dispersion d’Ixodes ricinus à l’échelle du paysage

Carte génétique Ixodes scapularis

Ullmann et al. Exp & Applied Acarol 2002 Ins Mol Biol 2003

Carte génétique Ixodes ricinus

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Perspectives

� Permettre la localisation de gènes sur les groupes de liaison

� Identifier des marqueurs liés aux chromosomes sexuels (XX/XY)

Int. J. for Parasitology 2007

N50= 2941 nucléotides

Trends in parasitology 2005

Le séquençage d’Ixodes scapularis : un projet débuté en 2004

40

360 000 scaffolds !!!

1 million de copies de l’élément Is6 (96 bp) soit 5% du génome

Objectifs :

- Identification de gènes de tiques impliqués dans des traits d’histoire de vie d’intérêt en épidémiologie des maladies vectorielles ou pour la lutte anti-vectorielle (vection d’agents pathogènes, interaction avec les hôtes, les symbiotes, dynamique des populations…)

- Génomique des populations (nombreux marqueurs distribués sur l’ensemble du génome; GenScan)

- Analyse de la variabilité populationnelle de gènes sous-sélection

- Comparaison du transcriptome entre espèces du genre Ixodes (taux d’évolution des gènes)

5,000 Insect and Other Arthropod Genome Initiative

41 /45

Projet Génomique Ixodes ricinus

(en collaboration avec Claude Rispe et des laboratoires partenaires français et européens)

- Séquençage complet du génome

Perspectives

Remerciements

Collègues impliqués dans le projet OSCAR :

Partenaires :

Financeurs :