utilisation de souris génétiquement modifiées dans les recherches sur les prions *

Utilisation de souris g&ktiquement modifiees dans les recherches sur les prions*

Charles Weissmanna, Alex J. Raeberb, Doron Schmerlinga, Antonio Cozzioa, Eckhard Flechsiga et Adrian0 Aguuib

Le rapport entre l’agent infectieux de la tremblante et PrP a d’abord kt4 ktabli au niveau biochimique [26, 51, 521.11 a &tG renforck par la suite par des arguments gkktiques [33,52,63,721. Cela a conduit i la prkdiction selon laquelle les animaux dkpourvus de 1’rP devraient Gtre rksistants A la tremblante expkrimentale et ne pas propager l’infection. Cette hypothke a M vkrifike expkimentalement et a ajoutk un argument en faveur de la << protkine seule 1).

’ Traduction : Pr Georges Cohen. i lnstitut fijr Molekularbiologie I, Universitat Ztirich, CH-8093 Ziirich. Suisse t lnstitut fiir Neuropathologie, Universittitspital, CH-8091, Ztirich. Suisse.

Production et propri&% des souris exemptes de PrP

W Production de souris PrP nulles

Trois lign6es de souris exemptes de PrF ant Ot6 g6nWes par recombi- naisoll homologue, au moyen de diff&ntes strat+ies. Biieler et al. IS] ont remplac6 les codons 4 ?I 187 de PrI’ (sur un total de 254 codons). soit environ 80 % de la s+uencc codan t pour la protkine mature (r& sidus .12 B 2301, par une cassette wn. Des s( w-is C57BL-129 CV homozy- gates pour le gene alt&6, dGsign6es dans r.tlt article par Prop”‘” Ziirich, expriment 1’ARNm raccourci, mais le fragment de PrP n’est pas detectable et les souris se dhveloppent norm,&ment. Manson et al. [42] ont pr6par6 une lign6e de souris Prl’ nulles (Pn1j7-/- Edinburgh) chez les- quell6 le gPne Prl’ &it alter& par insertion d’une cassette neo dans un site unique Kpnl (A la suite du codon 9’1) de la phase ouverte de lecture de PrP. Des souris 129/01a homozy,;otes pour I’allPle nul se sont 6gnlelnent dkveloppees normale- ment et on n’a detect6 ni 1’ARNm PrI’, rli une protbine du type PrI’ dans Ir cerveau. Une twisiPme lign6e de souris Prf nulle$. f-‘n1/~~1~ Nagasaki a 6tP pro- duite par Sakaguchi et al. 1611, chez lesqut~lles environ 1 kb du second intror, toute la Gquence codante et 452 pb de la sequence 3’ non codante ont tt& d@EtPs et remplacks par une cassette JZW. Dans ce cas, des swris 129/SV-C’57BL, homozygotes pour 1’allPle d616tP se sont d& velop pbes norma lement, mais on t Pt6 atteintes d’ataxir & une p&iodt!

J! UNALES DE L’INSTITUT PASTFUIZ / actualit& (199 -I 8. 4, W-304 (ii IIlsevier, P,lris

plus tardive de leur vie, comme d& crit plus loin.

W Le phtkotype des souris PrP nulles

La fonction normale de Prl’ est in- connue. Le gtine Pup et/au la pro- tPine PrP ont &t& trouvt% chez tous les vertilbr& examinks, y compris le poulet 1271 ct le saumon [28]. Au tours du dPveloppement embryon- naire de la souris, It gene PrP est exprimP dans It’ tissu nerveux pbri- ph&ique et central d& le milieu de la gestation. II continue b s’expri- mer tout au long du dkveloppe- ment dans un certain nombre de tissus non neuronaux, aussi bien dans l’embryon que dans les tissus extra-embryonnaires [41]. Le gene PrP est exprim6 ?I un niveau 6lev6 dans les neurones du cerveau adulte et a t@lement t%! detect6 dans les astrocytes et les oligoden- drocytes 1471. Des niveaux plus has d’ARNm Prl’ sont dktectables dans d’autres tissus tels que le cceur, le poumon et la rate 1501. La protbine I’rP elle-mime est presente d’une fac;on pr6dominante dans le tissu &&bra1 131. mais bgalement $ des niveaux relativement 6lev& dans le ceur et le muscle stri6, elle est g peine dktectable dans le foie 121. L,‘espoir qurt la production de souris I+!? nulles iaclairerait la fonction normale de I’rl’ n’a pas 6t6 pleine- ment rt;alisti. IL’analyse des croise- ments des souris _ h&&zygotes pour 1’allPlt~ PrI’ invalid6 a dorm6 une descendance d/environ un quart d’homozygotes, montrant clue le d&,c:loppement embryon- naire de ces souris n’avait pas et6 affect&. Lcs souris PrP nulles se sont d&relopp&,s et reproduites norma-

2%

lement [8, 421. Les &udes du comportement des souris PrP nulles Ziirich n’ont r&61& aucune diff& rence significative avec les souris sauvages, que ce soit vis-&vis du test du labyrinthe & eau de Morris, du test de discrimination en You du test d’kvitement 6 deux voies [8]. Aucune diffkrence n’a &? trouv@e entre les muscles des souris de type sauvage et ceux des souris PrP nulles en ce qui concerne I’expression du r&epteur de l’acetylcholine [61. Des etudes klectrophysiologiques effectubes par Collinge et al. sur des souris PrnpO/o Ziirich ont montrk que l’inhibition rapide medike par le rkcepteur GABA-A ktait dimi- nuke, que la potentiation h long terme (LTP) ktait affectke 119, 751 et que les courants activ& par K+ btaient alt&& 1181. La r&ntroduc- tion d’un grand nombre de copies du @ne PrP humain dans des souris PrP nulles restaure la reponse LTP au niveau de celle observ& chez les souris sauvages contrhles [751. Chez les souris nulles Edin- burgh, une potentiation 6 court terme plutiit qu’h long terme a 6tO observke dans la rkgion CA1 de l’hippocampe [44]. En revanche, d’autres n’ont trouve aucune anomalie electrophysiologique dans I’hippocampe [40] ou dans le cervelet 1311 des souris nulles Ziirich. On a rapport6 des alterations des rythmes d’activitk circadiens et du sommeil chez des souris depour- vues de PrP [71] ; ces effets sont at- tribuks 2 l’absence de PrI< et non B quelque &&ement contingent, parce que deux differentes lignkes de souris PrP nulles ont exhibg des ph& noves similaires et que l’effet est aboh par des transg&es PrP [71]. Contrairement aux observations faites avec les souris nulles Ziirich et Edinburgh, les souris Prnp-I- Na- gasaki ont montrt! des signes pro- gressifs d’ataxie et une perte importante de cellules de Purkinje [621 2 1’8ge de 70 semaines environ. Comme de tels sympt6mes c&+bel- leux sont absents dans les l&&es nulles Ziirich et Edinburgh, ils ne sont peut-@tre pas dus & la d&l&ion de la partie qui code pour PrP, mais plut6t a la deletion partielle du se-

2%

cond intron, dont on pense qu’il contient un ou plusieurs enhancers sphcifiques des cellules de Purkinje, et qui pourrait influencer l’activitf? de g&es autres que PrP. Si cette hypothese est correcte, le phknotype des souris Nagasaki pourrait etre reversk en introduisant l’all&le Prnp o Ziirich qui contient le second intron complet, mais non la phase ouverte codant pour PrP (dans la mesure oti tout ou partie de la phase ouverte de lecture du brin PrP anti- sens n’est pas requise) 1301. EJI r&urn& l’ablation de PrP n’a d’effets discernables ni sur le d&e- loppement de la souris, ni sur sa capacitk d’apprentissage, ni meme sur sa capacite a accomplir des t% ches difficiles ; mais elle semble produire des effets mineurs sur le rythme circadien et sur le profil du sommeil ; la g&&alit& et la signifi- cation des changements klectrophysiologiques et de la dc?g&&escence des cellules de Purkinje chez les souris Prnp-I- Nagasaki restent h Gtablir. Le mode d’action de PrP au niveau molt!culaire demeure insai- s&able. On ignore si PrP est fonc- tionnellement redondant, mais si tel est le cas, il est improbable que la (ou les) prot&ne(s) qui compense- raient son absence possPdent une homologie de structure importante abet PrP, dans la mesure ob toutes les recherches qui ont && faites dans les banques de don&es n’ont pas r&&? de molGcules candidates.

Les souris PrP nulles histent B la tremblante

On a pratiquk une inoculation intra- &&brale d’environ lo7 unit& LD50 de l’isolat Chandler I161 de souris adapt&es aux prions sur des souris PrnpOl(’ Ziirich, sur des souris sauvages de la m@me portPe (toutes ayant un fond g&-&ique d&iv6 d’,mimaux 129/SV et C57BL/6J), ainsi que sur des souris contrales Swiss CD1 . Les souris CD1 ont de- veloppk des symptbmes neurologi- ques typiques i 140 + 6 jours (fiyzl- w 1) et sont mortes 2 153 t- 7 jours. La totalit des 37 souris Prrzp+/+ de fond g&&ique C57BL-129/SV ont mtmtre les sympt8mes h 158 + 11

jours !frXwL: 1) et sont mortes $ 172 f 11 jours. Contraste frappant, 23 des 25 souris Prnp”/o btaient vivan- tes et exemptes de symptBmes apr&s au moins 2 ans (figzlrc 11, tan- dis que les deux autres moururent de maladies intercurrentes autres que la tremblante. Aucune patholo- gie spkcifique de la tremblante n’ktait ,visible, m@me aprgs ‘7 semaines suivant l’inoculation d’ho- mogGnats de cerveau contenant des prions, et les souris ne se distin- guaient pas des souris Prp nulle:; ayant recu un homogenat de cerveau normal 56 semaines aupara- vant ; les souris Prnp+/+ pr&.en- taient, 23 2 25 semaines apres l’inoculation, une astrogliose pronon& et une vacuolisation sit&e princi- palement dans le cortex, l’hypotha- lamus et I’hippocampe, et dans quelques cas, une perte neuronale dans l’hippocampe et le thalamus. Des r&ultats semblables ont & rapport& avec des souris PmpO’” Ziirich elevees 2 San Francisco ino- c&es avec I’agent Chandler de la tremblante [541, avec des souris Prny!‘- Edinburgh 1431 inoculees avec la souche ME7 de l’agent de 121 tremblante et avec les souris Prny-1~ Nagasaki inoculees avec la souche Fukuoka d&-i&e de la maladie dc Creutzfeldt-Jakob 1611. La question suivante concerne la propagation de l’agent infectieux. Dans les experiences me&es avec les souris PrP nulles Ziirich, l’inoculation intracerkbrale avait &? effec- tube aver un extrait de cerveau in- f&P par I’agent de Chandler non chauffk ou chauffk & 80 “C pendant 20 minutes pour inactiver tout pa- thog&w autre que la tremblante, qui pourrait @tre accidtmtellement pr&ent. Les homogPnats de quatre cerveaux et quatre rates ont Gtt? res- pectivenitmt mis en commun ; leur infectiosite (I et& analysee par dilu- tion limite 2 des temps variables aprPs l’inoculation. Aucune infectiosite n’a @t& dbtectee dans les cerveaux de souris sauvages 2 4 et 14 iours apr+s l’inoculation, mais le titre a atteint 5,4 et 8 log unit&s LDso/mL a 8 semaines et 8 log uni- t& LDw / ml, lors de la maladie ter-

ANNALES DE L’INSTITUT I’ASTEUR / actualit& (lYY7) 8,4

--

80-

60- Pm-p +I+

CD-1

Pm-p o/o

90 140 190 240 290 480 500

Temps suivant I’inoculation (jours)

E&e 1. Rhisfance $ la frembhnfe de sourk donf /es g&es PrP onf kf6 oWoqu&. Des souris Prnp” ne pr&enfenf pas de sympf6mes cltniques apr& avoir &fk hoculkes avec des pnhns de fremblanfe de soulis. Les sour& Pm-&+ de la mkme poth4e ou les sourk CD- I monfrenf les sympfemes de la fremblanfe aux femps indiquk Fl&cbes : cinq sourk onf 6f6 sacnfi&es $ des femps variables. Aucune ne prkenfaif les sympf6mes de la fremblanfe. FQure mooWe daprh t3Oeler et al. /9/

minale autour de 23 & 25 semaines, respectivement. Dans la limite des erreurs c,xpQi- mentales, des Gsultats semblables ont ktk obtenus avec des inoculums chaufMs et non chauffks. Dans le cas des souris PrP nulles inocul&s avec des homogknats chauff&, aucune infectiositk n’a t% d&ectke dans le cerveau, except6 pour des traces 4 jours apres I’inoculation, dues vraisemblablement i I’inoculum rbsi- duel. Avec l’inoculum non chauffb, 1’Gchantillon des cerveaux mis en commun prelevP & 20 jours mon- trait un titre de 3,2 log unit& LD.so/mL, alors que les Pchantillons prkleves h 8, 12, 25, 33 et 48 semaines se sont montr& nt?ga tifs [ 91. Toute l’exp&ience a &! r+piltPe ; les analyses d’infectiosite ont et6 reali- &es 16, 78,20 et 22 semaines aprPs l’inoculation, sur quatre souris i chaque p&iode. Seul l’&hantillon de 20 semaines a donnk naissance 2 une tremblante chez l’une des huit souris indicatrices ; tous les autres Pchantillons ont donnP des Gsultats nkgatifs sur un total de 56 souris indicatrices [60]. Prusiner et <II. 1541 ont fait une expkrience similaire et

n’ont trouvk aucune infrctiositP dans les cerveaux de huit souris PrP nulltas testkes entre 120 et 315 jours apr& l’inoculation, mais une infec- tiositG limite a tit& d6tectke chez quatre des cinq souris examinbes 5 h 60 Iours aprPs l’inoculation. Des ‘expkriences d’inoculation me- &es par Sakaguchi et al. [ 611 sur les sourIs nulles Nagasaki ont montrb que dts niveaux faibles d’infectiosi- tG &lient observPs jusqu’B 29 semaines, chez tous les &hantillons examinks, sauf un (chaque &hantillon provenant de cinq cerveaux de souris mis en commun B diff& rcntes pkriodes) ; cette infectiositP diminuait ou ktait abolie par chauf- fage prPalable dcs echantillons. Les r@sultats avec les souris Edinburgh n’ont pas et6 rendus public,;. Now conciuons de ces r‘lpports qu’il n’y a aucunc preuve en faveur d’unc gtWration nette de prions chez les souris I’rI’ nulles, et nous

supposons que la faible infect&it0 occasionnelle d&&e dans Ies cer- veauk de ces souris aprtis inoculation intrac&kbralr> soit due A de 1’inoc:ulum r&duel ou, moins vrai- sembl,lblement, a une contamina-

ANNALES DE L’INSI’ITU’~ PASI‘EUII / actualit& ( I’W’) 8, 3 207

tion. 11 a &J toutefois avan& qu’en l’absence de I’rP, une forme de l’agent de la tremblante thermosen- sible ou labile aurait pu Gtre g&&&e pour une autre raison 117,611.

ProprkSs des souris Prnp’” hbmizygotes

I1 n’est pas surprenant quc les souris ne portant qu’un seul allf?Ie Prop (souris I’rlip o/+) n’exhibent pas de phknotype de comportement et de d&eloppement anormal [8,421. El- les pr&nirnt toutefois une r&istance accrue B la maladie causPe par les prions, qui se manifeste par un retard signlficatif dans le dPbut et la progression de la maladie clinique [IO]. AIors que les Iignees de souris sauvages (CD1 ou de la m2-me por- tPe que ICY+ souris nulles) ont des temps d’incubation de 130 a 158 jours, les souris Pr@‘l+ Ziirich ne deviennent malades qu’apres 290 jours (400 ,i 465 jours quand elles sont klevtes B San Francisco [54]), Ies hemizygotes Nagasaki apt& 259 jours. La raison de la diffkrcnce ob- sew&e entrr les mPmes souris Cble- &es 2 Ziirich et a San Francisco, toutes inocult?es avec la souche RML de prions de souris, n’tast pas Claire. Lcs I ritt’res de diagnostic de dkbut de Ia maladie clinique ont pu etre diff&w ts, et/au le fond g&&i- que des sour& a pu jouer un rC>le. Dans le cas des souris J’YH~)+~ Edin- burgh, les sympt6mes de la maladie sont apparus avec un retard de 80 g 150 jours par rapport aux souris sauvages 1431. Le dosage gknique semble affecter la chronologie de l’apparition de la maladie, mnis non sa pathologic finale [42, 431. Alors que chez 1~s animaux de type sauvage, l’accroissement du titre de prions et des niveaux de I’rl’sc est suivi ap& quelques semaines des sympt&nes de la tremblantc et par la mort, 1~5s souris P~r/7’~/ + Ziirich restent exemptes de sympti,mes pendant de nombreux mois, en de- pit de niveaux similaires d’infectio- sit6 et de I’rP (fiprrc 2). Ces r&u Ii ats suggPrent que les symptdmtas cliniques ne sont pas n@cessairrment corrbl& avec I’accumulation rie I-‘rP ; selon plusieurs

Temps suwant I’lnoculation (semaines)

Temps suivant I’inoculation (semalnes)

FXyre 21 Survie, fitre de prkns et de Prp” dans /es cerveaux de (3) sounds de &pe sauvage et @) sourrs Prnfl+ $ divers moments apt& inoculation de pnbns de SOULS [lo/r

rapports, la maladie cau&e par les prions conduit a la mort sans qu’il y ait d’accumulation substantielle ou m@me de niveaux dktectables de PrP [20,35,39,45, 701. De plus, le fait que des souris cliniquement sai- nes puissent heberger de hauts niveaux d’infectiositk pendant de longues pQiodes prksente un in@& pratique, car il suggere que des bovins ou des humains en apparente bonne sant6 peuvent Gtre porteurs de l’agent infectieux, dans le sys- t&me nerveux central, et que peut- Ptre les sympt8mes cliniques n’ap- paraitront pas durant le temps de vie qui leur est imparti. Cet argument est 5 prendre en compte quand des tissus sont utilises pour la prbparation de produits pharma- ceutiques ou lors de greffes.

Les transgknes PrP restaurent la susceptibilitk k la maladie caus6e par les prions et Ueur propagation

Quand un pht!notype donn6 est g& n&6 par une ablation de gPne - dans ce cas la rksistance h la tremblante - il est important de montrer que cela est la con&quence de l’in- tervention g&&tique cibl@e, et non de quelque 6vPnement fortuit, tel que l’oblit&ation d’un enhancer gouvernant un autre gPne ou la dis- ruption d’une phase de lecture non identifi6e. La maniere la plus effi- cace d’attribuer un phenotype a l’ablation d’une protkine spbcifique est d’introduire dans l’animal nul (kr~kozrt) un ADNc codant pour la prc Gine en question.

11 a 6t6 montr6 pr&demment que les souris de type sauvage transge- niskes par un cosmide murin contenant le gene PrP surexprimaient PrP 1741. -Cornme le gGne contient deux exons, dont l’un est d’environ 10 kb, nous avons compare l’effica- cit6 des constructions dans lesquel- les le grand intron (ic PVH;J semi-g& nomique ),) ou les deux introns ont &6 enlevks, avec celle du cosmide murin Z+rly complet. Comme obser- v& avec d’autres transgPnes [71, au- curie expression significative de PrP n’a et6 trouvke chez les souris trans- gPniques ayant recu la construction exempts d’introns, mGme quand plusieurs copies du g&ne avaient et6 int++es, alors qu’une surexpression significative 6tait observ& dvec la construction PwIFI semi-gt- nomique. A premiPre vue, le profil d’expression des deux sortes de souris transgeniques semblait Gtre le mGme, mais un examen ulterieur plus d&ail16 a r&,+1& que, contrairement aux souris de type sauvage ou aux souris transgeniques ayant recu le cosmide PrP, les cellules de Pur- kinje des transg6niques semi-g&o- miques n’expriment ni PrP, ni 1’ARNm correspondant & des niveaux dCltectables. Ainsi, la construction semi-gbnomique semble ne pas poss6der un enhancer sp&i- fique des cellules de Purkinje qui pourrait se situer dans le grand intron ou en aval, dans les I,6 kb de la r6gion 3’ non codante, ces deux r& gions &nt absentes de la construction semi-genomique [23]. Alors que la surexpression du g&e port6 par le cosmide conduit, au fur et a mesure que les souris vieillis- sent, 2 une myopathie n&rosante profonde du muscle strik, B une po- lyneuropathie demy6linisante et i une vacuolisation focale du sys- tPme nerveux central 1741, aucune anomalie n’a jamais Gt6 observke avec des souris transg&ides par la construction semi-gknomique, bien que l’expression de PrP soit 2 un niveau @gal (jusqu’a sept fois le niveau de PrP du type sauvage). I1 est possible clue diffkrents profils d’expression Glicitks par les deux constructions soient responsables des phenotypes differents.

298 ANNALES DE L’IhSTITUT I~ASTEUR / actualit& (1997) 8,4

Deux lignees de souris transgeniques pour la construction semi-genomique Pmp, exprimant PrP a des niveaux de 3 2 4 fois ou de 6 a7 fois celui des souris de type sauvage, ont ete inoculees avec des prions de souris. Cornme le montre la figure 3A, elles ont succombe a la tremblante plus rapidement que les souris de type sauvage CD-l, confirmant que les temps d’incubation sont inver- sement lies aux niveaux d’expression de PrP [63]. Du fait de son bref temps d’incubation, la lignee de souris &a20 a ete rendue homozy- gote et utilisee pour un test plus rapide de la mesure de temps d’incubation [5,24]. En resume, ces experiences confir- ment que le phenotype de resis- tance a la tremblante des souris PrP Zurich nulles est bien dti a l’ablation de PrP.

GCnCtique inverse : etudes des relations structure-fonction de PrP

n Reconstitution de souris PrP nulles avec des transghes PrP modifih

La capacite a restaurer la suscepti- bilite a la tremblante chez des souris c>xemptes de PrP par des transgenes PrP a ouvert la voie a une analyse ;les relations structure-fonction de #:ette proteine. Ll a ete precedemment montre que le traitement des preparations de nrions de la tremblante avec des .Jroteases clive environ 60 residus <lminoterminaux de PrPsc 1461 jus- (lu’au residu 88 de la proteine ma- I ure [32], mais n’elimine pas l’infec- t iosite de l’echantillon [461. Dans le ( adre de l’hypothese de la proteine :*eule et en supposant que la proteine infectieuse soit PrPsc, cela si- gnifie que PrPSC tronque est capable tie provoquer la conversion de PrPc tan PrP. Afin de s’assurer que le fragment raccourci du tote amino- terminal peut servir de substrat pour la conversion et Porte la sus- ceptibilite a la tremblantc chez la souris, nous avons genere une serie cle transgenes codant pour des mo- llicules de R-P qui conservent la se-

100 200

Temps suivant I’inoculation (semaines)

I * - I- , ,

Go0

iii 80 (0 Ei

E 60 2

2 sl 40

cn .- 5

20

g 0

+ P’mp+/O + Prnp+/O

a- Prnp a- Prnp oio/tgHaPrP OiO/tgHaPrP

- Prnp - Prnp +“/$HaPrP +“/$HaPrP

45 55 65 75 420 430 440

Temps suivant I’inoculation (jours)

&we 3 a. Des soun’s Pmd)‘O ant kt6 transgh$esparlesg&es Pmp. Les south @aI9/t prhentent 3 ri 4 fois la teneur normale en PrpC. Les sounis tgaZ0 /t ont 6 B 7 fois cette teneul: (Extrait de /24). b. Des sourk Pm@‘i0 et Pmd)” ayant reFu des transg&es de hamster sont observ&es g oM&rentes pkiodes apt& hocuhtth de prions de trembhnte de bamste/: Des groupes de 9 B I I sounk de cbaqueg&o&pe ont &te’ inoculks avec holat Sc237depnhs de trembhte de hamsfel: FlC;he : un animalest motispontankment sans symptlime de trembfante et un autre a &e’sacnfi6carlpoflait une tumeul: Modifik de Btieler et al/9J

quence signal, mais portent des de- Des souris I’rP nulles surexprimant l&ions s’etendant depuis le residu PrP deletees jusqu’aux positions 80 32 juscm’aux residus 80,93,106,121 [231 ou 93 [651 ont donne naissance ou 134 de la sequence mature. 2 des souris normales qui, apres in-

P NNALES DE L’INSTITUT PASTEUR j actualit& (199’) 8,4 2YY

f&w.. 4. Sect@ du cervelet de souni~ exprinant la prot&ne PrP tronqude 032- 134 ci des temps aW&ents, montrant la d&g&&escence progressive de la couche granulaire celfufaire.

jection intracerebrale de prions de tremblante, ont developpe la maladie, propage des prions et presente une proteine Pi-P tronquee resis- tante aux proteases. Ainsi, au moins 60 residus de la region aminotermi- nale de PrP ne sont pas indispensa- bles et incluent non seulement le segment de PrPsc clive par la protei- nase K, mais aussi la totalite de la region ocfarepeaf. (Voir l’article de S.B. Prusiner, dans ce numero). Ce resultat est remarquable car la pa- thogen&e de quelques cas de maladie de Creutzfeldt-Jakob familiale (MCJQ et de maladie de Gerstmann- Straussler-Scheinker (GSS) ont ete liees a l’augmentation du nombre

de repetitions qui peut aller de 5 (nombre normal) a 9,10,11,12 ou 13 1291. Qui plus est, Riek et al. [59] ont montre par RMN que les premiers 98 residus de la proteine murine I’rPC forment une pelote statistique flexible ; ils ont propose que ce segment serait converti en feuillets B chez PrPsC. S’il en est ainsi, nos resultats montrent qu’au plus seulement 38 de ces residus, en commen- cant au residu 93, seraient essentiels a la conversion. En fait, un pcptide comportant les residus 106-126, contenu dans cette region, peut for- mer des structures en feuillets B ]49, 661 et est toxique pour des cultures primaires de neurones 1251. I1 est interessant de noter que les souris transgeniques qui surexpriment des proteines PrP avec des deletions s’etendant au-dela de la po- sition 106, jusqu’aux positions 121 et 134, developpent spontanement une ataxie a l’iige de 3 a 8 semaines. Dans la lignee de souris Fll portant la deletion 32-134, la couche granulaire du cervelet, qui semblait normale a l’age de 3 semaines, a prati- quement disyaru a l’age de 6 semaines (figuw 4), alors que les cellules de Purkinje avoisinantes et le cerveau en general ont une apparence normale. Le croisement entre un allele sauvage et des souris surexprimant les transgenes deleteres abolit completement les manifestations pathologiques, indiquant que la pa- thologie n’etait pas due 3 un effet toxique non spbcifique. La descendance depourvue de l’allele normal, obtenue en croisant les hetero- zygotes precedents avec des souris Prn/pO/” fait reapparaitre le phenotype pathologique. Cet effet est specifique de troncatures s’etendant aux positions 121 et 134 et peut-Ptre au-dela, car des souris surexprimant au m&me degre ou a un degre superieur le type sauvage de PrP ou des proteines 1%-P tronquees jusqu'aux positions 80 ou 93 restent en bonne Sante jusqu’au moins 2 ans, et dans le cas de la deletion D32-106, jusqu’au moins 8 mois (Shmerling et al., soumis pour publication). Prusiner et al. ont rendu compte d’un certain nombre de deletions

internes de PrP autres que celles que nous nvons d&rites et ont note que les souris portant des deletions de l’une quelconque des deux a-he- lices carboxy-proximales montrent des inclusions cytoplasmiques de depots provenant de PrP et developpent spontanement, entre 90 et 227 jours, des maladies fatales du systeme nerveux central semblables aux maladies de stockage neuronal [481. Ce phenotype est observe sur un fond genetique Pnzp sauvage et est clairement dQ a un mecanisme different de celui qui a ete decri t ulus haut. Comment! de tels effets causes par des transgenes peuvent-ils avoir lieu ? Une surexpression importante de I’rl’sauvage et mutant peut resulter en l’accumulation du pro- duit, interferer avec la synthese ou le metabolisme d’autres proteines, ou encore interferer ou Ptre en com- petition avec leur fonction ; un tel effet pourrait bien etre specifique de certaines cellules ou dc certains tis- SW. 11 est frappant que le phenotype pathologique cause par la surexpression des PrP tronques D-32-12 1 et D32-134 soit aboli par l’expression simiiltanee d’un seul allele sauvage de Prl? Une explication serait que Pi-P tronque rentrerait en com- petition a la fois avec Pi-Pet un autre homologue fonctionnel de PrP, encore inconnu, pour un ligand ou un recepttur commun, sans qu’il n’eli- cite toutefois la reponse physiologi- que appropriee. Cela expliquerait pourquoi l’absence de l’rl’ne donne pas naissance a un phenotype ca- racterise, mais que l’expression de certaines proteines PrP tronquees le font (LUI effet de dominance en Ivurrs), et pourquoi le type sauvage de PrI’, pourvu qu’il ait une plus grande affinite pour le recepteur, peut inverser le phenotype.

Les transg6mes et la barribre d’esphe

On a montre que l’introduction de transgenes PrP d’autres especes dans drs souris de type sauvage re- duit ou abolit la barritre dite d’espece (species barrier) pour les prions [9, 53, 631. Cet effet est encore PlUiS

300 ANNALES DE L’INSTITU’I- PASTEUR / actualit& (1997)&G

prononck si la souris rkceptrice est exempte de genes PrP endogenes, comme le montrent les temps d’incubation de souris Prnpol+ et PrnpO/O portant le m@me amas de genes PrP (figure 3b) [9]. Plus r&em- ment, il a &2 montre que des souris F’rP nulles sont sensibles aux prions humains, alors que les souris de tvpe sauvage contenant des trans- &nes Prnp humains ne le sont pas [~69]. De mGme, des souris contenant des gPnes PrP bovins sur un fond g&Gtique PrP nul ont un temps tl’incubation plus court si elles sont inoculkes avec l’agent de l’ESB, tomparkes & celles ayant un fond gk&tique sauvage [641. La sequence du g&ne PrP n’est toutefois pas le seul dgterminant implique dans la barrike d’espke; il a et& postulk qu’un composant appelk c( prot&ne X x> cod&ermine ce ph& nomPne [68,69].

II Le ciblage de mutations dans le g&ne PrP endogke par recombinaison homologue

IJintroduction de transgenes par le ]Jro&df? habitue1 d’injection dans le noyau r&&e en l’intkgration d’un nombre non contrcile de copies (ha- bituellement des concatkmkes) en -,m lieu alkatoire du genome. Cela .Iboutit ?I des niveaux d’expression Ju transgkne qui varient d’une sou- i-is transgknique $I l’autre ; de plus, Id sp&ificitk tissulaire peut &e in- huencPe par les sequences d’ ADN I?n amont et en aval du site d’inM- gration. 0n a contour& ces difficult& en I:iblant directement les mutations dans le g&e cible. Dans le prockdk ilit de double recombinaison, la r& ,jon entiPre codant pour un alkle #de PrP dans une lignee embrJ,on- naire de cellules-souches dilficien- tes en HPRT est remplacke par recombinaison homologue par un mi- nigkne HPRT contenant un gPne HSV-TK. Au tours d’une deuxieme Ctape, le minigPne HPRT est rem- pIa& par un PrP mutt? Les crllules ES recombinantes sont &lection- &es par leur r&istance a la h-thio- guanine (car elles ont perdu le g&e !fSV-7X) et utiliskes pour produire

des souris par les pro&d& standard (Moore et a1.,1995). Le g&e Sine est le gPne principal qui contr8le le temps de survie de souris inocul&s avec l’agent de la tremblante [12,21] (voir l’article de Moira Bruce, dans ce num&o des Annal( Les animaux homozygotes pour les alleles de Sine s7 et Sine p7 ont des formes allkliques du gPne PrP et la question s’est poke de savoir si Sine et PrP sont con- gruents [12,13,36]. L’allGle PrPavec les aminoacides 108 Leu et 189 Thr est associe a des pkriodes d’incubation courtes (Prnp a), alors que l’al- 1Ple avec 108 Phe et 189 Val (Prnp b) est associk h de longues pkriodes d’incubation. Avec la technique de ciblage de g&e par double remplacement, les rilsidus 108 et 189 des cellules souches embryonnaires murines provenant d’une souris Sine s7 ont &k changes en 108 Phe et 189 Val, r&idus associes aux souris Sine p7 : ces souris ont acquis les temps d’incubation caract&istiques de Sil~c p7, ce qui prouve que Sine et Prnp sont une seule et m&me en- tit6 (Manson et al., sous presse).

I Les mutations PrP et la maladie neurodCg&Grative spontanbe

Une mutation du codon 102, resul- tant du remplacement d’une pro- line par une leucine, est like 2 la maladie de Gerstmann-Strtiussler- Scheinker chez I’homme 1331. On a utilisrs des methodes standard de transgenese pour produire des souris (contenant des g&nes PrP de type sauvage) qui expriment de hauts niveaux d’un g&e PrP chim&ique hamster-souris portant une mutation dans le codon murin corres- pondnnt 001). On a montrk yue ces souris transg&iques dkveloppent spontan&ne& (et tardivement) une neurodt5gPn&-escence, des changements spongiformes du cerveau et de l’astrogliose [34]. Un travail ult4 rieur a montr(i que le mCrme amas de gt’nex PrP mu& plac& dans une souris nulle Pi-P provoque l,i maladie plus pr&ocement, de facon plus marquke et avec une neuropathologie plus s&&e. Des extraits c&f?-

ANNALES DE L’INSTITUT PASTEL I? / actualit& (lW7;) 8, 4

braux de ces souris spontantment malades transmettent la maladie B des souris transgeniques exprimant la m@me mutation 101 du gPne PrP B un niveau plus bas (qui ne cause pas en soi de maladie spontanke), mais ne la transmettent pas ,?I des souris de type sauvage [70]. Une explication de ces resultats est que la mutation (101)102P + L peut faciliter la conversion spontanhe occasionnelle de PrF en PrP” (ou I?@). Cet &knement peut &re suf- fisamment rare pour survenir au tours de la vie d’un @tre humain, mais non d’une souris, 2 moins qu’il y ait une surproduction considera- ble de la proteine. 11 faut en outre supposer que PrP” n’est pas patho- gPne pour une souris de type sauvage, parce que la mutation ponc- tuelle constitue une barriitre d’es- p&e ; il est toutefois curieux que cette barriPre ne fonctionne que dans un sens, les souris portant le I’rnp mutk pouvant @tre infect&es par un agent de la tremblante provenant d’une souris de type sauvage.

fixpressmri eclopique de FW

Dans la plupart des modPles de tremblante chez la souris, l’infectio- sit& apparait dans la rate quelques jours aprPs I’inoculation intracP& brale et augmente lentement ou reste constante durant toute la vie de la souris, alors que I’infectiositk dans le cerveau debute quelques semaines api-tis 1’inoculation et atteint des titres de deux ordres de gran- deur supQieurs h ceux de la rate 19, 22, ,771. La cinetique de ces @v&e- ments depend de la souche de prion et aussi du @notype de la souris. R-P est g&-i& dans les neurones et les astrocytes mais le type cellulaire dans lequel l’agent infectieux est g& n&G n’est pas dvident. Dans la rate, la protkine PrP est p&sente a la surface des cellulcs B et T, et ceci h des taux trPs faibles 1141 ; apr&s l’infection, PrF est trouve principale- ment dans lrs cellules dendritiques folliculaires [3X]. La question de savoir si I’agent infectieux trouvP dans la rate! est g&-&e dans cet organe ou rcwp&+ soit & partir de

101

l’inoculum soit a partir du cerveau. Quel que soit le cas, si la r&up&-a- tion a partir de l’inoculum et le stockage dans la rate &aient impli- ques, le processus dependrait de PrP, car chez les animaux PrP nuls aucune infectiosite n’est decelable dans la rate deux semaines apres l’inoculation, alors que la rate d’animaux de type sauvage a un titre de 6.2 log unites LDso/mL 191. A cet egard, une question importante se pose : la presence de PrP dans une cellule suffit-elle pour permettre la propagation des prions ? Afin d’examiner ce pro- b&me, le gene PrP a ete place sous le contriile d’une variete de promo- teurs tissu-sp&ifiques. 11 n’est pas surprenant que le PrP de hamster sous le controle du promoteur NSE, considere comme &ant specifique des neurones, ait rendu les souris transg&iques susceptibles aux prions de hamster [561. Si on ajoute qu’une lignee cellulaire d&ivee de neurones, N2a, peut assurer la r& plication des prions [4, 11, 551, on peut supposer avec assurance que les neurones sont capables de propager les prions. L’expression de PrP de hamster chez des souris PrP nulles sous la direction du promoteur specifique des astrocytes de la proteine gliale fibrillaire acide (GFAP) rend les animaux susceptibles aux prions de hamster et conduit a la maladie clinique et a la propagation des prions. Parce qu’aucune expression de PrP dans les neurones n’est detectable (dans la limite de la sensibilite de I’analyse immunohistochimique), il semblerait que les astrocytes soient capables de propager les prions. 11 est interessant de constater que la neuropathologie de ces souris transgeniques est trPs semblable a celle des souris de type sauvage in- fectees par la tremblante [58]. Les souris transgeniques exprimant PrP sous le controle commun d’un enhancer Ey et d’un promoteur IRF-11761 surexpriment PrP dans la rate, a la fois dans les cellules B et T. On trouve aussi de faibles nixreaux d’expression de PrP dans le cerveau, le poumon, l’intestin, le coeur et le foie, dus vraisemblablement en

partie a la presence de cellules lym- pho‘ides. L’infectiosite apparait dans la rate 2 semaines apres l’inoculation a un niveau du meme or- dre que celui observe chez les souris de type sauvage et n’est pas detectable dans le cerveau 6 mois aprtis l’inoculation. Le fractionnement des cellules spl&niques, a l’aide d’anticorps specifiques anti-T et anti-B, montre que la plus grande partie de l’infectiosite est associee aux cellules B, et un peu aux cellules T, mais que, curieusement, elle est absente des lymphocytes circulants 1571. Aucune relation n’a pu etre etablie avec les cellules dendritiques folliculaires, car les efforts pour les purifier se sont sold&es par un echec. On trouve des taux eleves de PrP dans les cellules T dans le thymus et la rate de souris transgeniques surexprimant PrP sous le controle du promoteur lck specifique des cellules T [15]. Ces mGmes souris ont des taux eleves d’ARNm PrP dans le rein, et de faibles taux de ce messager dans le cerveau et le poumon. L’inoculation ne conduit a aucun symptome clinique et au- curie infectiosite n’a kte detectee dans la rate, le thymus ou le cerveau m@me un an apres I’inoculation. Vu que chew ces souris, les cellules T expriment au moins dix fois plus de PrP que chez celles qui l’expriment sous le controle de Ep/IRFl, il semblerait que les cellules T seules soient incapables de generer l’infectiosite, mais puissent la r&up&-er a partir d’autres sources (A.R. et C.W.). On peut conclure de ces experiences que la pr&ence de PrP a la surface cellulaire est insuffisante pour assurer la replication des prions; il est possible que sa localisation dans une region particuliere de la membrane plasmique soit requise 1671 et/au que d’autres composants soient necessai- res, comme la proteine X post&e 1691 ou un r&epteur. Ainsi, le fait remarquable que les souris exemptes de PrP soient via- bles et en bonne Sante a permis un certain nombre de d&eloppements importants. On a pu montrer que ces souris sont resistantes a la tremblante et sont incapables de repli- quer l’agent infectieux de cette ma-

ladie. De plus, il est devenu possible d’analyser la relation entre la strut ture de la proteine PrP et sa capaciti, a restaurer la susceptibilitg a la tremblante. La barriere d’espece est plus facilement franchie chez les souris I’rP nulles ayant recu le transgene PrP de l’autre espece. L’expression ectopique de PrP chez les souris PrP nulles a permis la de- monstration selon laquelle les fac- teurs autres que PrP sont requis pour la replication de l’agent de la tremblante. Enfin, comme nous l’avons decrit ailleurs [ 11, des souris nulles ayant recu un greffon de cerveau exprimant Pi-P ont ete utilisees pour elucider les modalites du transfert de l’agent de la tremblante de la pbripherie vers le cerveau.

Remerciements

Le groupe prion de Zurich est rede- vable a M. Aguet, T. Blsttler, H. Bluethmann (Hoffmann La Ro- the, Bale), H.R. Biieler, S. Brandner, M. Fischer, I. Hegyi., M.A. Klein, Y. Kobayashi, H.I? Lipp (Institut d’anatomie, universitk de Zurich), E Montrasio, T. Riilicke (Labora- toire central de biologie, hopital universitaire de Zurich), A. Sailer, S. Sakaguchi, S. Marino et T. Voigtliinder pour leurs precieu- ses contributions.

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