UNIVERSITÉ DE MONTRÉAL

DÉVELOPPEMENT D’UN INDICATEUR D’EFFET ÉCOTOXICOLOGIQUE TERRESTRE

POUR LE CUIVRE BASÉ SUR L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE

ALLISON MEYSSONNIER

DÉPARTEMENT DE GÉNIE CHIMIQUE

ÉCOLE POLYTECHNIQUE DE MONTRÉAL

MÉMOIRE PRÉSENTÉ EN VUE DE L’OBTENTION

DU DIPLÔME DE MAÎTRISE ÈS SCIENCES APPLIQUÉES

(GÉNIE CHIMIQUE)

DÉCEMBRE 2016

© Allison Meyssonnier, 2016.

UNIVERSITÉ DE MONTRÉAL

ÉCOLE POLYTECHNIQUE DE MONTRÉAL

Ce mémoire intitulé :

DÉVELOPPEMENT D’UN INDICATEUR D’EFFET ÉCOTOXICOLOGIQUE TERRESTRE

POUR LE CUIVRE BASÉ SUR L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE

présenté par : MEYSSONNIER Allison

en vue de l’obtention du diplôme de : Maîtrise ès sciences appliquées

a été dûment accepté par le jury d’examen constitué de :

M. SAMSON Réjean, Ph. D., président

Mme DESCHÊNES Louise, Ph. D., membre et directrice de recherche

M. SAUVÉ Sébastien, Ph. D., membre et codirecteur de recherche

Mme BULLE Cécile, Ph. D., membre

iii

DÉDICACE

Je me souviens.

iv

REMERCIEMENTS

La complexité des sols c’est une chose mais celle des sentiments humains en est une autre. En

effet, j’avais hâte de tourner la page des études mais je dois au final les aimer puisque j’y suis

restée aussi longtemps. Et puis, ma soif de connaissances a été ma force mais aussi mon enfer…

« Heureux est l’ignorant »…

Je souhaite remercier du fond du cœur ma directrice, Louise Deschênes, tout d’abord pour la

disponibilité, la patience et la compréhension dont elle a fait preuve tout au long de mon projet et

son soutien indéfectible qui m’a permis de ne pas abandonner au moment où les forces m’ont

lâché. Merci à Réjean Samson, mon ancien directeur, qui a vu du potentiel en moi quand moi-

même je n’y croyais plus vraiment. Merci à Valérie Bécaert pour son soutien moral dans les

moments les plus durs et surtout Laurence Olinger pour ses précieux conseils et sa compassion.

Vous avez été mon rocher durant ces années et je vous en suis profondément reconnaissante.

Merci à Lucie Jean pour m’avoir beaucoup appris sur l’activité de laboratoire mais aussi sur moi-

même. Merci à Isabelle Lessard pour m’avoir aiguillé dans la bonne direction les jours de grande

détresse statistique. Et merci à Sébastien Sauvé et Cécile Bulle pour la correction de mon

mémoire

Merci à tous les étudiants du CIRAIG de ne pas m’avoir oublié même si j’étais en exil dans le fin

fond de poly, même si aujourd’hui il ne reste plus que les vieux de la vieille. Avec une place

toute particulière pour toi Hassana, un rayon de soleil même pendant les journées les plus

sombres. Merci à Constant, Gaël, Nathan, Julien et Catherine de m’avoir donné l’occasion

d’avoir des débats enflammés sur des sujets plus ou moins reliés au CIRAIG mais qui permettent

de s’échapper le temps d’une pause.

Papa, maman, je ne sais même pas si l’on peut rendre justice au soutien inconditionnel que vous

m’avez prodigué. Si j’en suis là, aujourd’hui, c’est parce que vous m’avez appris à être la

meilleure version de moi-même. Constant, tu as été mon phare durant toutes ses années d’études

supérieures, tu m’as donné l’envie de me dépasser.

Enfin une mention spéciale à Fauve sur qui j’ai pu compter par vents et marées. Je ne peux

malheureusement pas lister tous ceux qui m’ont soutenu des quatre coins du monde, mais je

pense fort à eux !

v

RÉSUMÉ

L’écotoxicité terrestre est une catégorie d’impact évaluée en analyse de cycle de vie (ACV)

permettant de caractériser la toxicité des substances chimiques sur les organismes vivants. Cette

catégorie d’impact utilise des données expérimentales tirées d’études scientifiques qui sont à ce

jour peu nombreuses compte tenu de la nature hétérogène du sol, par opposition à l’écotoxicité

aquatique dont les données expérimentales sont abondantes. C’est pour cette raison que des

facteurs de conversion arbitraires ont été déterminés afin d’extraire des données d’écotoxicité

terrestre à partir de l’écotoxicité aquatique. Malheureusement les relations utilisées en ACV pour

convertir les données d’effet aquatiques en données d’effet terrestres ne sont pas fiables. Ainsi les

différentes méthodes d’évaluation des impacts du cycle de vie (ÉICV) ne tiennent pas compte de

la spéciation et de la biodisponibilité des métaux et ainsi surestiment la toxicité des métaux en

n’évaluant que la forme totale du métal. L’impact modélisé à partir des modèles utilisés en ACV

est donc inadéquat et peu représentatif de la réalité. De ce fait, IMPACT WORLD+, une nouvelle

méthode d’ÉICV, a été développée afin d’inclure, dans le futur, des notions de spéciation,

spatialisation intégrant la notion d’écotoxicité terrestre. La collecte des données expérimentales

reste toujours un problème afin d’alimenter le modèle USEtox utilisé dans la nouvelle

méthodologie pour l’écotoxicité. Les données générées jusqu’à présent, couvrent surtout les

invertébrés du sol et la végétation alors que peu de données sont disponibles sur les micro-

organismes qui sont pourtant garants de la santé des sols et directement exposés à la

contamination métallique via le compartiment du sol.

Afin d’évaluer l’activité microbienne, l’activité enzymatique (AE) semble être l’indicateur

désigné, de par sa grande sensibilité à de fortes concentrations de Cu. L’invertase, l’uréase, la

protéase, l’arylsulfatase, la phosphatase et la β-glucosidase sont des enzymes couvrant tous les

cycles biogéochimiques du sol (azote, souffre, carbone et phosphore) et sont impliquées dans la

croissance des plantes et la décomposition des composés organiques en sous-unités assimilables.

Les enzymes du sol satisfont aux critères d’indicateur de choix quant à la mesure des effets d’une

contamination métallique sur les fonctions de la communauté microbienne puisqu’ils fournissent

une évaluation biochimique intégrée unique de l’état et du fonctionnement du sol. Les AE

vi

doivent être associées à des paramètres complémentaires, tels que la teneur en matière organique

(MO) ou le pH, pour être utiles comme indicateurs de la santé des sols.

L’hypothèse de ce projet de recherche est la suivante : l’évaluation de la toxicité du cuivre sur la

diversité enzymatique pour plusieurs types de sol permet de développer un indicateur

écotoxicologique terrestre global et ce indépendamment du pH et du contenu en matière

organique des sols étudiés. En effet, des enzymes tels que l’invertase, l’uréase, la protéase,

l’arylsulfatase, la phosphatase et la β-glucosidase couvrent plusieurs processus essentiels à la

santé des sols et sont donc tout indiqués dans le développement d’un indicateur global.

Les objectifs spécifiques sont de: 1) vérifier la méthodologie développée par Lessard et al. (2014)

pour le cuivre ; 2) obtenir des EC50 expérimentalement pour le cuivre pour un phyla peu couvert

par la littérature, les micro-organismes, pour des sols présentant une grande variabilité physico-

chimique et les agréger afin d’obtenir un indicateur unique ; 3) vérifier l’influence de la

variabilité des propriétés physico-chimiques sur la spéciation du cuivre et sa toxicité inhérente ;

4) renforcer les conclusions obtenues pour les 15 sols échantillonnés par une évaluation de la

toxicité du Cu sur l’activité enzymatique pour des sols de vignoble ayant des propriétés physico-

chimiques similaires.

Quinze sols ont donc été échantillonnés afin d’être divisés en paire : une des deux paires a été

contaminée au CuCl2 (sol contaminé), alors que l’autre paire a été amendée en CaCl2 (sol témoin)

afin de venir balancer la teneur en ions chlorures dans les deux sols, ce qui a permis de les

comparer. Les sols ont été lixiviés afin de reproduire des conditions de terrains. Les essais

enzymatiques pour l’invertase, l’uréase, la protéase, l’arylsulfatase, la phosphatase et β-

glucosidase ont ensuite été menés dans de l’eau déionisée afin de respecter le pH naturel du sol.

En parallèle, la caractérisation physico-chimique des sols a été effectuée, soit l’analyse de la

concentration en Cu total et en Cu soluble, la mesure du pH, de la COT, de la COD, de la CEC et

de la capacité tampon. Les résultats obtenus ont été traités statistiquement par le biais de tests de

« Student » appariés, d’ANOVA et de PCA afin d’obtenir des corrélations entre les activités

enzymatiques, la concentration en Cu soluble et les caractéristiques physico-chimique des sols.

Le rapport entre l’activité enzymatique mesurée dans le sol contaminé et celle mesurée dans le

sol témoin a permis de dégager des pourcentages d’activité enzymatique (% AE). Ces %AE ont

été tracés en fonction de la concentration en Cu soluble pour les sols dont les concentrations en

vii

produit (suite aux essais enzymatiques) étaient significativement différentes pour une même

paire. Le modèle hyperbolique d’inhibition partielle a été ajusté aux résultats puisqu’il semblait

être le plus adapté dans le cadre de ce projet.

Parce que les 15 paires de sol présentaient une grande variabilité physico-chimique, il n’a pas été

possible d’extraire un indicateur unique basé sur les EC50 qui auraient pu être obtenues pour

chaque enzyme. En effet, la seule enzyme pour laquelle il a été possible d’obtenir une EC50 est la

β-glucosidase (1,2 mg Cu soluble/ kg de sol sec) et ce pour seulement six paires de sols dont les

pH étaient similaires (pH entre 7,28 et 7,71 sauf pour le sol A à pH 5,01). Les concentrations en

Cu soluble et en Cu total n’était que très peu corrélées aux différentes activités enzymatiques,

tandis qu’on l’on a pu observer une forte influence des propriétés physico-chimiques, notamment

le pH et la MO, sur la distribution du Cu et sur les activités enzymatiques. Ce sont des variables

qui impactent grandement la toxicité du Cu et doivent être prises en compte lors de l’évaluation

de l’effet de celui-ci, ce qui expliquerait la difficulté d’extraire des données pour des sols

présentant autant de disparités au niveau de leurs propriétés. Ainsi, les sols de vignoble,

présentant des propriétés semblables ont permis de dégager une tendance similaire au niveau de

l’effet sur les six enzymes sauf pour l’arylsulfatase. Le nombre de données étant insuffisant pour

ajuster des courbes de tendance, il serait intéressant de pousser plus loin, soit en évaluant

l’activité enzymatique pour des sols strictement similaires au niveau des caractéristiques physico-

chimiques pour différentes concentrations de Cu ou extraire des EC50 pour le même sol à

différentes concentrations de Cu et ce pour plusieurs sols afin de comparer les EC50 entre elles et

de vérifier si l’on peut grouper les sols selon des archétypes.

En conclusion, l’extraction d’un indicateur global d’écotoxicité terrestre du Cu n’a pas été

possible dans le cadre de cette étude. Ainsi, il est recommandé d’utiliser une méthodologie

considérant la concentration totale en fonction des archétypes de sol, des caractéristiques

physico-chimiques et de la végétation environnante. L’évaluation du risque environnemental ne

devrait pas se faire seulement sur la base des indicateurs sans tenir compte des conditions dans

lesquelles ces indicateurs ont été obtenus. Beaucoup de paramètres physico-chimique ont un

double rôle ce qui rend la prédiction de la réponse toxique très complexe. Une autre avenue

intéressante serait d’évaluer la spéciation du Cu afin de voir quelle fraction serait la plus

représentative de l’effet toxique du Cu sur les enzymes.

viii

ABSTRACT

Terrestrial ecotoxicity is an impact category assessed in life cycle analysis (LCA) to characterize

the toxicity of chemicals to living organisms. This category of impact uses experimental data

from scarce scientific studies, due to the heterogeneous nature of the soil. Conversely, aquatic

ecotoxicity data is abundant. For this reason, arbitrary conversion factors have been determined

to convert terrestrial ecotoxicity data from aquatic ecotoxicity. Unfortunately, the relationships

used in LCA to convert aquatic effect data to terrestrial effect data are unreliable. Thus, the

various life cycle impact assessment (LCIA) methods do not take into account the speciation and

bioavailability of metals. Notably, they overestimate the toxicity of metals by evaluating only the

total fraction of the metal. The impacts predicted with LCA is therefore inadequate and not

representative of reality. As a result, IMPACT WORLD +, a new LCIA method, has been

developed to include, in the near future, notions of speciation, spatialization and terrestrial

ecotoxicity. Collecting experimental data is crucial to feed the USEtox model used in the new

methodology for ecotoxicity. The data generated so far mainly cover soil invertebrates and

vegetation. Unfortunately, little emphasis has been put on microorganisms, which are responsible

for soil health and are directly exposed to metal contamination via the soil compartment. In order

to evaluate microbial activity, enzymatic activity (EA) appears to be the designated indicator, due

to its high sensitivity to high concentrations of Cu. Invertase, urease, protease, arylsulfatase,

phosphatase and β-glucosidase are enzymes covering all soil biogeochemical cycles (nitrogen,

sulfur, carbon and phosphorus) and are involved in the growth of plants and the decomposition of

organic compounds into assimilable subunits. Soil enzymes meet the choice indicator criteria for

measuring the effects of metal contamination on microbial community functions. Indeed, they

provide a unique integrated biochemical assessment of soil condition and function. EAs must be

associated with additional parameters, such as organic matter (OM) or pH, to be valid indicators

of soil health.

This project is based on the premise that the evaluation of the toxicity of copper on the enzymatic

diversity for several types of soil allow developing a global terrestrial ecotoxicological indicator.

The latter would be independent of the pH and the organic matter content of the soils studied.

Invertase, urease, protease, arylsulfatase, phosphatase and β-glucosidase are enzymes covering

several processes essential to soil health and are therefore well suited to the development of a

ix

global indicator. The specific objectives are: 1) Verifying the methodology developed by Lessard

et al. (2014) for copper; 2) Obtaining EC50 experimentally for copper for a phyla little covered

by the literature, microorganisms, for soils with high physicochemical variability and aggregate

them in order to obtain a single indicator; 3) Verifying the influence of variability of physico-

chemical properties on copper speciation and its inherent toxicity; 4) Reinforcing the conclusions

obtained for the 15 soils sampled by an evaluation of the Cu toxicity on the enzyme activity for

vineyard soils with similar physicochemical properties.

Fifteen soils were sampled in order to be divided into pairs: one of the two pairs was

contaminated with CuCl2 (contaminated soil), while the other pair was amended in CaCl2 (control

soil) in order to balance the chloride ions in the two soils. This enables a meaningful comparison

between the two soils. Soils have been leached to reproduce field conditions. The enzymatic tests

for invertase, urease, protease, arylsulfatase, phosphatase and β-glucosidase were then carried out

in deionized water in order to maintain the natural pH of the soil. In parallel, physicochemical

characterization of the soils was undertaken: analysis of total Cu and soluble Cu concentration,

pH, TOC, COD, CEC and buffer capacity. The results were statistically analyzed by paired

"Student" tests, ANOVA and PCA in order to obtain correlations between enzymatic activities,

soluble Cu concentration and soil physicochemical characteristics. The ratio between the

enzymatic activity measured in the contaminated soil and the measured one in the control soil

made it possible to obtain percentages of enzymatic activity (%AE). These % EAs were plotted

as a function of the Cu soluble concentration for the soils which product concentrations

(following enzymatic tests) were significantly different for the same pair. The hyperbolic model

of partial inhibition was adjusted to the results since it appeared to be the most suitable for this

project.

Because soil pairs exhibited high physico-chemical variability, it was not possible to extract a

single indicator based on the EC50s that could have been obtained for each enzyme. Indeed, the

only enzyme for which it was possible to obtain an EC50 is β-glucosidase (1.2 mg soluble Cu / kg

dry soil) and this for only six pairs of soils with similar pH (pH between 7.28 and 7.71 except for

soil A at pH 5.01). The concentrations of soluble Cu and total Cu were slightly correlated with

the different enzymatic activities. Conversely, a strong influence of physicochemical properties,

especially pH and OM, on the distribution of Cu and on enzymatic activities is reported. These

variables greatly impact the toxicity of Cu and should be taken into account when evaluating the

x

effect of Cu. This explains the difficulty of extracting data for soils with so various properties.

Thus, vineyard soils with similar properties revealed a similar trend in the effect on the six

enzymes except for arylsulfatase. Since the data is insufficient to adjust trend curves, it would be

worthwhile going forward in two potential directions. The first one is evaluating the enzymatic

activity for soils that have identical physicochemical characteristics for different concentrations

of Cu. The second is extracting EC50 for the same soil at different concentrations of Cu, repeating

this for several soils and comparing the EC50 between one another to verify if one can gather the

soils with respect to archetypes.

In conclusion, the extraction of a global indicator for terrestrial ecotoxicity of Cu was not

possible in this study. Thus, it is recommended to use a methodology considering the total

concentration according to soil archetypes and physicochemical characteristics but also to take

into account the surrounding vegetation. The environmental risk assessment should not only

consider the indicators but also the conditions under which these indicators have been obtained.

Many physicochemical parameters have a dual role which makes the prediction of the toxic

response very complex. Another interesting road is the evaluation of the Cu speciation in order to

see which fraction would be most representative of the toxic effect of Cu on the enzymes.

xi

TABLE DES MATIÈRES

DÉDICACE ................................................................................................................................... III

REMERCIEMENTS ..................................................................................................................... IV

RÉSUMÉ ........................................................................................................................................ V

ABSTRACT ............................................................................................................................... VIII

TABLE DES MATIÈRES ............................................................................................................ XI

LISTE DES TABLEAUX ........................................................................................................... XV

LISTE DES FIGURES .............................................................................................................. XVII

LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONS ............................................................................. XIX

LISTE DES ANNEXES ............................................................................................................. XXI

CHAPITRE 1 INTRODUCTION ................................................................................................ 1

1.1 Mise en contexte .................................................................................................................. 1

1.2 Problématique ...................................................................................................................... 2

1.3 Hypothèse et objectifs ......................................................................................................... 3

1.3.1 Hypothèse ..................................................................................................................... 3

1.3.2 Objectifs ....................................................................................................................... 3

CHAPITRE 2 REVUE CRITIQUE DE LA LITTÉRATURE ..................................................... 4

2.1 L’écotoxicologie terrestre en ACV ..................................................................................... 4

2.1.1 Analyse du cycle de vie ................................................................................................ 4

2.1.2 Catégorie d’impact : écotoxicologie terrestre .............................................................. 5

2.1.3 Définition du facteur d’effet ......................................................................................... 6

2.1.4 Lacunes en ACV .......................................................................................................... 9

2.2 Le sort du cuivre dans les sols ........................................................................................... 11

2.2.1 Contexte du cuivre ..................................................................................................... 11

xii

2.2.2 Propriétés physicochimiques ...................................................................................... 12

2.2.3 Sources de contamination ........................................................................................... 13

2.2.4 Spéciation du cuivre en milieu terrestre ..................................................................... 16

2.2.5 Relation spéciation, biodisponibilité et toxicité ......................................................... 19

2.2.6 Vieillissement et persistance d’une contamination métallique .................................. 22

2.3 L’écotoxicité terrestre du cuivre ....................................................................................... 23

2.3.1 Propriétés physico-chimiques et biologiques du sol .................................................. 23

2.3.2 Fonctions et santé du sol ............................................................................................ 27

2.3.3 Effet du cuivre sur la communauté microbienne terrestre ......................................... 29

2.4 Effet du cuivre sur les enzymes du sol .............................................................................. 33

2.4.1 Généralités .................................................................................................................. 33

2.4.2 Enzymes affectées par le cuivre ................................................................................. 34

2.4.3 Conditions des essaies enzymatiques ......................................................................... 37

2.4.4 Limites des essais et mesures de précaution .............................................................. 38

CHAPITRE 3 MÉTHODOLOGIE ............................................................................................ 40

3.1 Échantillonnage et contamination ..................................................................................... 42

3.1.1 Échantillonnage .......................................................................................................... 42

3.1.2 Contamination ............................................................................................................ 43

3.2 Analyses physico-chimiques ............................................................................................. 45

3.2.1 Capacité de rétention au champ et granulométrie ...................................................... 45

3.2.2 Détermination du background chimique des sols et de la concentration total en

Cuivre .................................................................................................................................... 45

3.2.3 Détermination du pH et de la capacité tampon .......................................................... 46

3.2.4 Détermination de la CEC ........................................................................................... 46

3.2.5 Détermination de la COD ........................................................................................... 47

xiii

3.2.6 Détermination de la concentration en cuivre soluble ................................................. 47

3.2.7 Détermination de la COT ........................................................................................... 48

3.3 Essais enzymatiques .......................................................................................................... 48

3.4 Planification ...................................................................................................................... 50

3.5 Courbe de concentration-réponses pour l’extraction d’une EC50 ...................................... 51

3.6 Analyses statistiques ......................................................................................................... 52

CHAPITRE 4 ÉLABORATION D’UN INDICATEUR GLOBAL D’ÉCOTOXICOLOGIE

TERRESTRE ........................................................................................................................... 55

4.1 Caractérisation générale des sols étudiés .......................................................................... 55

4.1.1 Profil physico-chimique des sols échantillonnés pré-contamination ......................... 55

4.1.2 Profil physico-chimique des sols échantillonnés post-contamination ........................ 56

4.2 Distribution du cuivre dans les sols ................................................................................... 63

4.3 Activités enzymatiques dans les sols ................................................................................ 66

4.3.1 Invertase ..................................................................................................................... 67

4.3.2 Protéase ...................................................................................................................... 68

4.3.3 Arylsulfatase ............................................................................................................... 69

4.3.4 Phosphatase ................................................................................................................ 70

4.3.5 β-glucosidase .............................................................................................................. 71

4.3.6 Variabilité enzymatique ............................................................................................. 72

4.4 Effet du cuivre sur l’activité enzymatique et tentative d’extraction de données EC50 .... 73

CHAPITRE 5 EFFET DU CUIVRE SUR DES SOLS DE VIGNOBLE .................................. 79

5.1 Caractérisation générale des sols étudiés .......................................................................... 79

5.1.1 Profil physico-chimique des sols échantillonnés pré-contamination ......................... 79

5.1.2 Profil physico-chimique des sols échantillonnés post-contamination ........................ 80

5.2 Distribution du cuivre dans les sols ................................................................................... 85

xiv

5.3 Activités enzymatiques dans les sols ................................................................................ 87

5.3.1 Invertase ..................................................................................................................... 87

5.3.2 Protéase ...................................................................................................................... 88

5.3.3 Arylsulfatase ............................................................................................................... 89

5.3.4 Phosphatase ................................................................................................................ 90

5.3.5 β-glucosidase .............................................................................................................. 91

5.3.6 Variabilité enzymatique ............................................................................................. 92

5.4 Effet du cuivre sur l’activité enzymatique des sols de vignoble ....................................... 94

CHAPITRE 6 DISCUSSION ..................................................................................................... 96

6.1 Caractéristiques physico-chimiques des sols .................................................................... 96

6.2 Distribution du cuivre dans les sols en relation avec les propriétés physico-chimiques du

sol ........................................................................................................................................... 99

6.3 L’effet du cuivre sur les enzymes ................................................................................... 101

6.4 Discussion de la méthodologie ........................................................................................ 105

6.4.1 Protocoles ................................................................................................................. 105

6.4.2 Choix des sols ........................................................................................................... 106

6.4.3 Vieillissement des sols et chute de pH ..................................................................... 107

6.4.4 Distribution du Cu .................................................................................................... 107

CHAPITRE 7 CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS ................................................. 109

7.1 Conclusion ....................................................................................................................... 109

7.2 Recommandations et perspectives .................................................................................. 110

7.2.1 Recommandations .................................................................................................... 110

7.2.2 Perspectives .............................................................................................................. 111

BIBLIOGRAPHIE ...................................................................................................................... 112

ANNEXES .................................................................................................................................. 124

xv

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 2.1: Propriétés physicochimiques du Cu. Tiré de J.K Barbalace [30] .............................. 13

Tableau 2.2: Concentrations de cuivre total (CuT) retrouvées dans les échantillons de sol de

vignobles et vergers dans différents pays ............................................................................... 15

Tableau 2.3: Rôle des enzymes du sol ........................................................................................... 35

Tableau 3.1: Localisation des zones d’échantillonnage des 15 sols autour des structures

galvanisées et des 3 sols de vignoble ..................................................................................... 43

Tableau 3.2: Planification de la contamination des séries de sol ................................................... 44

Tableau 3.3: Planification des analyses physico-chimiques et des essais enzymatiques ............... 51

Tableau 4.1: Mesures du pH enregistrée dans les 15 sols échantillonnés ...................................... 56

Tableau 4.2: Informations statistiques principales des propriétés physico-chimiques des 15 paires

de sols (voir Annexe B2 pour plus de détails) ....................................................................... 58

Tableau 4.3: Coefficient de corrélation de Spearman entre les propriétés physico-chimiques des

15 sols contaminés et les activités enzymatiques ................................................................... 62

Tableau 4.4: Informations statistiques principales des activités enzymatiques des 15 paires de sols

(voir Annexe B5 pour plus de détails) ................................................................................... 66

Tableau 4.5: %AE des enzymes pour les 15 sols significativement différents .............................. 74

Tableau 4.6: coefficients a et b de l’ajustement du modèle hyperbolique d’inhibition partielle et

EC50 pour l’arylsulfatase, la phosphatase et la β-Glucosidase ............................................... 78

Tableau 5.1: Mesures du pH enregistrée dans les sols de vignobles .............................................. 80

Tableau 5.2: Informations statistiques principales des propriétés physico-chimiques des sols de

vignoble (voir Annexe B2 pour plus de détails) .................................................................... 82

Tableau 5.3 : Coefficient de corrélation de Spearman entre les propriétés physico-chimiques des

sols de vignoble contaminés et les activités enzymatiques .................................................... 84

Tableau 5.4: Informations statistiques principales des activités enzymatiques pour les sols de

vignoble (voir Annexe B5 pour plus de détails) .................................................................... 87

xvi

Tableau 5.5: %AE des enzymes pour les sols vignoble significativement différents .................... 94

xvii

LISTE DES FIGURES

Figure 2.1: Courbe concentration-réponse permettant d’extraire les indicateurs écotoxicologiques

pour une substance et une espèce donnée. Adapté de C. Walker [12] ..................................... 8

Figure 2.2: Courbe dose-réponse généralisée pour n’importe quel métal essentiel tel que le cuivre.

Modifié de W. Mertz [29] ...................................................................................................... 12

Figure 2.3: Sources, transport et interactions avec les organismes. Tiré de A. K. Shrivastava [33]

................................................................................................................................................ 14

Figure 2.4: Fractionnement du Cu dans le sol (MOD : matières organiques dissoutes. Modifié de

L. Anatole-Monnier [56] ........................................................................................................ 17

Figure 2.5: TBLM : Terrestrial Biotic Ligand Model. Adapté de C.R Janssen [75] et S.Thakali

[76] ......................................................................................................................................... 21

Figure 2.6: Triangle des textures selon l’USDA [91] .................................................................... 25

Figure 3.1: Approche méthodologique ........................................................................................... 40

Figure 4.1: Régression linéaire entre le carbone organique total et le carbone organique dissout

pour les 15 sols contaminés .................................................................................................... 60

Figure 4.2: Régression linéaire entre la concentration en cuivre total et la concentration en cuivre

soluble pour 15 sols contaminés ............................................................................................. 64

Figure 4.3: Graphique bidimensionnel des deux composantes principales illustrant les vecteurs de

les concentrations de Cu soluble et de Cu total et les vecteur des propriétés physico-

chimiques pour les 15 sols contaminés .................................................................................. 65

Figure 4.4: Activité enzymatique de l’invertase dans les 15 paires de sol ..................................... 67

Figure 4.5: Activité enzymatique de la protéase dans les 15 paires de sol .................................... 68

Figure 4.6: Activité enzymatique de l’arylsulfatase dans les 15 paires de sol ............................... 69

Figure 4.7: Activité enzymatique de la phosphatase dans les 15 paires de sol .............................. 70

Figure 4.8: Activité enzymatique de la β-glucosidase dans les 15 paires de sol ............................ 71

xviii

Figure 4.9: Graphique bidimensionnel des deux composantes principales illustrant la variabilité

enzymatique et physico-chimique pour les 15 sols contaminés ............................................. 73

Figure 4.10: Graphiques du %AE en fonction de la concentration de Cu soluble pour les sols

significativement différents .................................................................................................... 76

Figure 4.11: Courbes de concentration-réponse selon le modèle hyperbolique d’inhibition

partielle pour l’Arylsulfatase, la phosphatase et la β-Glucosidase pour les sols sélectionnés.

R2 étant le coefficient de détermination pour la régression non linéaire et AICC le poids

d’Akaike qui exprime la pertinence de la régression. « x » étant la concentration en Cu

soluble (ppm) et y le %AE ..................................................................................................... 77

Figure 5.1: Diagramme bidimensionnel des deux composantes principales illustrant les vecteurs

des concentration de Cu soluble et Cu total et les vecteur des propriétés physico-chimiques

pour les sols de vignoble contaminés ..................................................................................... 86

Figure 5.2: Activité enzymatique de l’invertase dans les sols de vignoble .................................... 88

Figure 5.3: Activité enzymatique de la protéase dans les sols de vignoble ................................... 89

Figure 5.4: Activité enzymatique de l’arylsulfatase dans les sols de vignoble .............................. 90

Figure 5.5: Activité enzymatique de la phosphatase dans les sols de vignoble ............................. 91

Figure 5.6: Activité enzymatique de la β-glucosidase dans les sols de vignoble ........................... 92

Figure 5.7: Graphique bidimensionnel des deux composantes principales illustrant la variabilité

enzymatique et physico-chimique des sols de vignoble ......................................................... 94

Figure 5.8: Graphiques du %AE en fonction de la concentration de Cu soluble pour les sols de

vignoble .................................................................................................................................. 95

xix

LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONS

La liste des sigles et abréviations présente, dans l’ordre alphabétique, les sigles et abréviations

utilisés dans le mémoire ou la thèse ainsi que leur signification.

ACF Facteur d’accessibilité

AE Activité enzymatique

ACV Analyse du cycle de vie

BF Facteur de biodisponibilité

CEC Capacité d’échange cationique

CLPP Community Level Physiological Profile

COD Carbone organique dissout

COT Carbone organique Total

CRC Capacité de rétention au champ

Cu Cuivre

EC Effect Concentration

EF Facteur d’effet

ÉICV Évaluation des impacts du cycle de vie

FAAS Flame Atomic Absortpion Spectrometry

FF Fate factor (facteur de devenir)

FIAM Free Ion Activity Model

GE Glucose équivalent

Kd Coefficient de partition sol-eau

LC Lethal Concentration

LD Lethal Dose

LOEC Lowest Observable Effect Concentration

xx

MO Matière organique

MOD Matière organique dissoute

MOT Matière organique totale

NOEC No Observed Effect Concentration

PAF Potentially Affected Fraction

PICT Pollution Induced Community Tolerance

PNP P-nitrophénol

SETAC Society of Environnemental Toxicology and Chemistry

SSD Species Sensitivity Distribution

TBLM Terrestrial Biotic Ligand Model

Tyr Tyrosine

USDA United State Department of Agriculture

xxi

LISTE DES ANNEXES

Annexe A1 - Échantillonnage de sols près de structures faites d’acier galvanisé ....................... 124

Annexe A2 - Échantillonnage de sols près de ceps de vigne dans des vignobles utilisant la

bouillie bordelaise comme pesticide dans le cadre du projet de contamination de sols au

cuivre pour des fins d’analyses physico-chimiques et écotoxiques ..................................... 143

Annexe A3 - Contamination de sol au cuivre à des fins d’essais enzymatiques ......................... 153

Annexe A4 – Capacité de rétention d’eau au champ d’un échantillon de sol .............................. 165

Annexe A5 – Digestion acide à l’eau régale pour quantifier la concentration totale de métaux

dans un échantillon de sol .................................................................................................... 169

Annexe A6 – Détermination du pH d’un sol ................................................................................ 176

Annexe A7 – Determination de la capacité tampon d’échantillon de sols contaminés

artificiellement ..................................................................................................................... 180

Annexe A8 – Méthode de détermination de la Capacité d’Echange Cationique (CEC) .............. 186

Annexe A9 – Extraction de la matière organique dissoute (DOC) dans des sols à l’eau déionisée

.............................................................................................................................................. 193

Annexe A10 – Extraction d’une solution de sol pour analyse du cuivre total en solution .......... 199

Annexe A11 – Mesure de l’activité de l’invertase dans un sol .................................................... 204

Annexe A12 – Mesure de l’activité de l’uréase dans un sol ........................................................ 213

Annexe A13 – Mesure de l’activité de la protéase dans un sol .................................................... 220

Annexe A14 – Mesure de l’activité de l’Arylsulfatase dans un sol ............................................. 229

Annexe A15 – Mesure de l’activité de la phosphatase dans un sol ............................................. 236

Annexe A16 – Mesure de l’activité de la β-glucosidase dans un sol ........................................... 244

Annexe B1 – Profil de concentrations métalliques background des sols ..................................... 251

Annexe B2 – Propriétés physico-chimiques des paires de sol ..................................................... 252

xxii

Annexe B3 – Rapport de connexion de lettres suite au test post hoc de tukey-HSD pour la CEC

.............................................................................................................................................. 255

Annexe B4 – Coefficient de corrélation de Spearman entre les propriétés physico-chimiques des

15 de sols témoins et les activités enzymatiques .................................................................. 256

Annexe B5 – Activité enzymatiques des paires de sols ............................................................... 257

Annexe B6 – Coefficient de corrélation de Spearman entre les propriétés physico-chimiques des

sols de vignoble témoins et les activités enzymatiques ........................................................ 260

1

CHAPITRE 1 INTRODUCTION

1.1 Mise en contexte

Lors des récents ateliers de l’UNEP/SETAC1 sur les pratiques et méthodologies actuelles de

l’ACV pour les métaux non ferreux, un consensus a été atteint quant aux problématiques à

résoudre afin d’intégrer leur toxicité de manière adéquate [1]. Il en est ressorti, entre autres, que

leur spéciation (déterminant la biodisponibilité et la toxicité du métal), leur persistance, leur

essentialité et leur biodisponibilité n’étaient pas correctement, ou pas du tout, considérées dans

les modèles disponibles, faussant ainsi l’évaluation de leurs effets. Ces différents aspects sont

influencés par des paramètres physico-chimiques et biologiques locaux, ce qui a pour

conséquence d’impacter le devenir, le transport et l’effet de la contamination métallique. Ceci est

d’autant plus pertinent dans un contexte de contamination métallique des sols, étant donné

l’utilisation répandue de pesticides au cuivre et l’augmentation de l’extraction minière répondant

à une demande mondiale croissante. Typiquement, des concentrations allant jusqu’à 1000 mg de

Cu total/ kg sol sec (ppm) ont été retrouvées dans les sols de vignobles en France dû à

l’accumulation de cuivre suite à une utilisation fréquente et prolongée de pesticides à base de

cuivre. Au Canada, le Québec, l’Ontario et la Colombie Britannique (Okanagan) développent de

plus en plus la culture du vin. Alors que certains pays comme la France ont déjà dépassé les

normes recommandées par le gouvernement suite à une utilisation de fongicides au cuivre en

viticulture sur plus de 100 ans, le Québec n’en est qu’à ses premiers balbutiements du

développement de son industrie viticole (1985) [2] .

Malgré le fait que le cuivre soit reconnu comme étant un micronutriment essentiel pour tous les

organismes vivants (constituant de plusieurs métallo-enzymes et protéines impliquées dans le

transport d’électrons, les réactions d’oxydo-réduction et plusieurs autres réactions importantes

[3]), il présente à certains seuils une toxicité pour les cellules microbiennes. Ceci est dû aux

interactions de la forme libre de l’ion (Cu2+) avec les acides nucléiques, les sites actifs des

1 http://www.lifecycleinitiative.org/wp-content/uploads/2013/01/Declaration_Apeldoorn_final.pdf

2

enzymes et les composants de la membrane [4]. Il est donc impératif de déterminer les effets de

telles concentrations sur l’activité de la communauté microbienne, garante de la santé du sol.

1.2 Problématique

Les données d’effet nécessaires pour l’évaluation, en analyse du cycle de vie (ACV), de la

catégorie d’impact « écotoxicité terrestre » sont à ce jour rares et découlent souvent de

l’écotoxicité aquatique selon des facteurs de conversion très souvent arbitraires. Ces données

restent théoriques et ne sont pas validées expérimentalement. En effet, peu de travaux portent sur

ce point. Tromson et al. (2016) ont montré que les relations utilisées en ACV pour convertir les

données d’effet aquatiques en données d’effet terrestres ne sont pas fiables [5] et Haye et al.

(2007) insistent sur l’importance d’obtenir des données expérimentales pour l’écotoxicité

terrestre plutôt que de les convertir depuis l’écotoxicité aquatique [6]. Il faut donc créer de

nouvelles données d’effet.

Le modèle USEtox modélise des facteurs de caractérisation « intérim » des métaux applicable à

l’écotoxicité terrestre. Ils tiennent compte de la forme totale du métal mais pas de sa spéciation et

sont dérivés de données d’effet aquatique car le modèle USEtox requiert l’utilisation de données

écotoxicologiques de trois niveaux trophiques ou phyla différents pour la réalisation de la

caractérisation de la catégorie d’impact écotoxicité. Ceci illustre le manque de données d’effet

terrestre pour l’utilisation de ce modèle.

Une méthodologie d’évaluation basée sur l’activité enzymatique comme indicateur a été

développée par Lessard et al. (2014 a,b) afin d’obtenir des données d’effet (EC50) sur le Zn. Les

enzymes du sol sont produites par la communauté microbienne du sol qui est un niveau trophique

peu étudié. Pourtant, celle-ci est directement affectée par l’effet toxique des métaux. En évaluant

la diversité fonctionnelle enzymatique du compartiment du sol, un indicateur pourrait être dégagé

pour le cuivre par le biais de l’activité individuelle de plusieurs enzymes. Les différentes

propriétés du sol, sa composition, jouent un rôle important quant à la spéciation du cuivre, de sa

mobilité et sa toxicité. Pour ce qui est du sort, Plouffe et al. (2014), ont montré que les facteurs

de sort (FF) varient significativement en fonction des propriétés des sols menant au calcul de FF

pour différents archétypes de sols. En est-il ainsi pour les facteurs d’effet (EF) ? Serait-il possible

3

de développer un indicateur écotoxicologique terrestre (EC50) global en utilisant plusieurs sols

présentant des propriétés physico-chimiques différentes ?

1.3 Hypothèse et objectifs

1.3.1 Hypothèse

L’évaluation de la toxicité du cuivre sur la diversité enzymatique pour plusieurs types de sol

permet de développer un indicateur écotoxicologique terrestre global et ce, indépendamment du

pH et du contenu en matière organique des sols étudiés. L’invertase, l’uréase, la protéase,

l’arylsulfatase, la phosphatase et la β-glucosidase sont des enzymes couvrant plusieurs processus

essentiels à la santé des sols et sont donc tout indiquées dans le développement d’un indicateur

global.

1.3.2 Objectifs

1. Vérifier la méthodologie développée par Lessard et al. (2014) pour le zinc appliquée au

cuivre ;

2. Obtenir des EC50 expérimentalement pour le cuivre pour un phyla peu couvert par la

littérature, les micro-organismes, pour des sols présentant une grande variabilité physico-

chimique et les agréger afin d’obtenir un indicateur unique ;

3. Vérifier l’impact de la variabilité des propriétés physico-chimiques sur la spéciation du cuivre

et sa toxicité inhérente ;

4. Renforcer les conclusions obtenues pour les 15 sols échantillonnés par une évaluation de la

toxicité du Cu sur l’activité enzymatique pour des sols de vignoble ayant des propriétés

physico-chimiques similaires.

4

CHAPITRE 2 REVUE CRITIQUE DE LA LITTÉRATURE

La première partie de ce chapitre se penche sur les concepts clés entourant l’évaluation des

impacts écotoxicologiques terrestre en ACV afin de mieux comprendre les besoins

expérimentaux de cette recherche qui traite de la problématique des métaux dans les sols, plus

spécifiquement le cuivre (Cu). La deuxième partie aborde le sort du Cu dans le sol mais aussi son

écotoxicité terrestre en fonction de sa spéciation et de sa biodisponibilité. Et enfin les deux

dernières parties portent sur l’effet du cuivre sur les micro-organismes du sol et comment en est

affectée l’activité enzymatique.

2.1 L’écotoxicologie terrestre en ACV

2.1.1 Analyse du cycle de vie

L’analyse du cycle de vie (ACV) est un outil systémique qui permet d’évaluer les impacts

environnementaux globaux ou locaux d’un produit ou d’un service tout au long de son cycle de

vie, c’est à dire de l’extraction des matières premières jusqu’à sa fin de vie. L’évaluation des

options (produits ou services) se fait sur la base d’une même unité fonctionnelle, soit la même

fonction pendant la même période. L’ACV permet de mettre en lumière les étapes ayant l’impact

le plus important, mais aussi les transferts des problématiques environnementales d’une étape à

l’autre.

Selon la norme ISO 140402, l’ACV s’organise autour de 4 étapes fondamentales : 1) Définition

des objectifs et du champ de l’étude, 2) Analyse de l’inventaire, 3) Évaluation des impacts du

cycle de vie (ÉICV), et 4) Interprétation des résultats [7].

Lors de l’étape d’évaluation des impacts, il faut choisir les catégories d’impacts pertinentes à

l’ACV en cours. On y retrouve les catégories orientées problèmes (midpoint), quantifiant les

effets des substances émises, telles que l’eutrophisation, l’acidification, l’utilisation des terres,

l’écotoxicologie aquatique (entre autres), dépendamment de la méthode ÉICV choisie (CML,

2 http://www.iso.org/iso/fr/catalogue_detail.htm?csnumber=23151

5

IMPACT 2002+, ECO-Indicator 99...). Alors que les catégories orientées dommages (endpoint)

estiment les dommages potentiels en agrégeant les impacts midpoint selon 4 catégories : Santé

humaine, Changements climatiques, Ressources et Qualité des écosystèmes.

2.1.2 Catégorie d’impact : écotoxicologie terrestre

L’écotoxicologie terrestre est une catégorie d’impact orientée problème. Agrégée avec les

catégories d’impact écotoxicologie aquatique et utilisation des terres, elle entre en compte lors de

l’évaluation des dommages potentiels de la catégorie endpoint « Qualité des écosystèmes » pour

la méthode d’évaluation des impacts la plus utilisée, IMPACT 2002+[8]. Dans cette catégorie

d’impact sont étudiés le comportement et les effets de substances polluantes sur les écosystèmes

provenant de sources anthropiques (relatives à l’activité humaine) ou naturelles émises dans les

sols. D’autres méthodes ÉICV adaptées à différentes régions, telle que CML et Eco-Indicator 99

évaluent l’écotoxicologie de façon différente.

Le score d’impact potentiel d’une substance i (Si) se définie comme suit :

𝑆𝑆𝑖𝑖𝑚𝑚𝑚𝑚 = 𝐶𝐶𝐶𝐶𝑖𝑖 × 𝑀𝑀𝑖𝑖𝑚𝑚 (1)

où CF est le facteur de caractérisation de la substance émise pour la catégorie d’impact choisie,

M sa masse totale (kg), m le compartiment émetteur et n le compartiment final.

La façon de calculer le facteur de caractérisation (CF) est différente selon les méthodes de

caractérisation (tel que vu ci-haut). Ces dernières diffèrent de par leur facteur de sort,

d’exposition et d’effet, c’est-à-dire respectivement, des mécanismes de transports, des différentes

voies d’exposition et de l’effet suite à l’exposition qu’une substance peut avoir sur un organisme.

Lors de l’ÉICV, les facteurs de caractérisation sont multipliés avec des données d'inventaire. Le

résultats obtenus sont exprimés en unité commune pour la même catégorie d’impact [9].

Faute de consensus, la Society of Environnemental Toxicology and Chemistry (SETAC) s’est

donc penchée sur le développement d’un outil permettant de combler l’hétérogénéité des

différentes méthodes d’ÉICV citées plus haut, qui évaluent les différentes catégories d’impacts

orientées problème de façon locale et différente. USEtox a ainsi été mis en place pour

uniformiser et améliorer les facteurs de caractérisation relatifs à la toxicité humaine et

l’écotoxicité mais seulement pour les composés organiques et non pour les métaux [10].

6

Pour venir parer à cette lacune, Owsianiak et al. (2013) [11] proposent un nouveau modèle afin

de calculer le facteur de caractérisation. Ce modèle, plus adapté à la problématique de

l’écotoxicité terrestre, comporte un facteur d’accessibilité (ACF) supplémentaire tenant compte

du rôle de la fraction réactive du métal dans le sol. Dans l’équation (2) ci-dessous, FF représente

le sort du métal selon ses caractéristiques physico-chimiques, l’exposition est prise en compte

dans le facteur d’effet (EF) et BF est le facteur de biodisponibilité convertissant la fraction

réactive du métal en fraction ionique libre. C’est l’effet qu’aura cette fraction ionique libre du

métal qui est évaluée dans le facteur d’effet (EF).

𝐶𝐶𝐶𝐶 = 𝐶𝐶𝐶𝐶 × 𝐴𝐴𝐶𝐶𝐶𝐶 × 𝐵𝐵𝐶𝐶 × 𝐸𝐸𝐶𝐶 = ∆𝐶𝐶𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡∗𝑉𝑉∗𝜌𝜌∆𝑚𝑚𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡

× ∆𝐶𝐶𝑟𝑟é𝑡𝑡𝑎𝑎𝑡𝑡𝑎𝑎𝑎𝑎

∆𝐶𝐶𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡× ∆𝐶𝐶𝑡𝑡𝑎𝑎𝑙𝑙𝑟𝑟𝑙𝑙∗𝜃𝜃

∆𝐶𝐶𝑟𝑟é𝑡𝑡𝑎𝑎𝑡𝑡𝑎𝑎𝑎𝑎∗𝜌𝜌× ∆𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃

∆𝐶𝐶𝑡𝑡𝑎𝑎𝑙𝑙𝑟𝑟𝑙𝑙�𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃∗𝑚𝑚

3∗𝑗𝑗𝑗𝑗𝑗𝑗𝑗𝑗𝑘𝑘𝑘𝑘

�

(2)

où 𝜌𝜌 est la densité du sol (kg/m3), 𝜃𝜃 est le contenu volumétrique sol-eau (m3/m3) et PAF est la

fraction potentiellement affectée.

Le facteur de biodisponibilité et le facteur d’accessibilité sont très importants dans le cadre de

l’écotoxicité terrestre des métaux puisqu’ils tiennent compte de leur spéciation et de leurs

caractéristiques physico-chimiques.

2.1.3 Définition du facteur d’effet

Tel que son nom l’indique, le facteur d’effet reflète le changement en terme d’effets néfastes

suite à une exposition des organismes récepteurs à une contamination, c’est-à-dire un apport

d’une substance connue toxique ou un apport excessif d’une substance reconnue non-toxique à

certains seuils mais toxique au-delà. Le facteur d’effet est spécifique à chaque paire de

contaminant/organisme et utilise des données générées par des tests écotoxicologiques. Ces

derniers mesurent la perte de fonctions biologiques d’un organisme exposé à plusieurs

concentrations (ou doses) différentes, afin de pouvoir extraire une panoplie d’indicateurs

agrégeant les différentes réponses aux concentrations (ou doses). Les effets peuvent varier, allant

de la variation de croissance, la perte de diversité, l’inhibition de l’activité, l’effet sur la

reproduction, etc…allant jusqu’à la mort.

7

Tel que mentionné, il existe plusieurs indicateurs possibles que l’on peut retrouver dans la

littérature ou dans les banques de données écotoxicologiques3. Parmi les indicateurs les plus

fréquents on retrouve :

1. - La ECx (Effect Concentration) ou LCx (Lethal Concentration) (mg/kg): c’est la

concentration d’une substance toxique qui provoque X% de la réponse maximale d’effet ou de

mortalité dans une population d’organismes exposée à ce dernier pendant une période de

temps fixe, généralement entre 24 et 96h pour les tests de toxicité aigue et de 96h à plusieurs

années pour les tests de toxicité chronique (longs et coûteux). La ECX/LCX est fonction du

temps puisque les effets d’un contaminants ou d’un stress sur les organisme dépendent de la

durée d’exposition et ainsi des propriétés de la substance toxique, des organismes, des

mécanismes d’actions, etc. Cette dépendance de temps entrave la comparaison de toxicité

entre les composés et entre les différents organismes.

2. - La EDX (Effect Dose) ou LDX (Lethal Dose) (mg/kg) : c’est la dose d’un produit toxique

injectée directement ou administrée via l’alimentation qui provoque l’effet ou la mort de X%

des organismes exposés au bout d’une période de temps fixe.

3. - La NOEC (No Observed Effect Concentration) : c’est la concentration maximale à

laquelle on n’observe aucun effet chez l’organisme ou la population d’organismes

statistiquement non différent du contrôle.

4. - La LOEC (Lowest Observable Effect Concentration) : c’est la concentration la plus

faible à laquelle un effet statistiquement différent du contrôle est observé.

Les ECX et EDX sont extraits d’une courbe concentration (dose)-réponse, tel que le montre la

figure 2.1, suite au tracé d’une régression au travers des données expérimentales issues des tests

écotoxicologiques pour un contaminant et un organisme (une population d’organismes) ciblés. En

revanche, les LOEC et NOEC correspondent à des points expérimentaux.

3 https://cfpub.epa.gov/ecotox/help.cfm?help_id=Endpoint&help_type=define&help_back=1

8

Figure 2.1: Courbe concentration-réponse permettant d’extraire les indicateurs

écotoxicologiques pour une substance et une espèce donnée. Adapté de C. Walker [12]

Le modèle USEtox adopte la méthode AMI (Assessment of the Median Impact)[13], des

approches dites moyennes. Cette méthode détermine son facteur d’effet à partir de la moyenne

géométrique des EC50 chroniques et aigues (suivant un facteur d’extrapolation lorsque les

données chroniques ne sont pas assez importantes) provenant d’au moins trois phyla différents

(afin d’assurer une représentation acceptable de la variabilité biologique) [6].

Le facteur d’effet est ici calculé selon une équation, ci-dessous, qui le lie de façon directement

proportionnelle à la valeur de référence, soit la HC50 :

𝐸𝐸𝐶𝐶 = 0,5𝐻𝐻𝐶𝐶50𝐸𝐸𝐸𝐸50

(3)

où HC50EC50 est la moyenne géométrique basée sur les EC50 chroniques.

9

2.1.4 Lacunes en ACV

Malgré les récentes avancée en ACV, l’écotoxicologie terrestre est une catégorie d’impact qui

présente beaucoup de lacunes pour plusieurs raisons.

La plus importante, dans le cadre de cette maîtrise, est que les modèle utilisés en ACV pour

caractériser le facteur d’effet, ne considèrent que l’écotoxicologie aquatique comme USEtox [14],

ou alors dérivent les facteurs d’effets d’écotoxicologie terrestre de l’écotoxicologie aquatique,

selon des critères plus ou moins arbitraires tels que la méthode IMPACT 2002+ [8]. Or,

Hauschild et al. (2013) recommandent d’utiliser des facteurs d’effets intérimaires lorsque les

données disponibles sont insuffisantes ou indisponibles pour émettre des recommandations sur le

calcul des facteurs de caractérisation en utilisant le modèle USEtox [9]. Ceci est le cas pour les

métaux et les composés métalliques.

Or, il manque énormément de données écotoxicologiques pour une variété de substances et

d’organismes vivants fautes de temps mais aussi de coûts. La collecte de données expérimentales

est un processus colossal au niveau de la représentativité de l’écosystème. Plus les années passent

et plus le bassin de substances, de source naturelle mais aussi anthropique, augmente. La

recherche en écotoxicité terrestre a ainsi beaucoup de retard par rapport à l’écotoxicité aquatique

étant donné la complexité de la matrice triphasique du sol (solide-liquide-gazeuse) en

comparaison avec la matrice diphasique eau (liquide- gazeuse) [15].

La plupart des EF en écotoxicologie terrestre sont à ce jour extrapolés des EF d’écotoxicité

aquatique pour la même substance, en utilisant la méthode du partage équilibré basé sur la valeur

des coefficients de partition sol-eau Kd (aussi appelé coefficient d’adsorption).

𝐾𝐾𝑑𝑑 = 𝑓𝑓𝑂𝑂𝐶𝐶 × 𝐾𝐾𝑂𝑂𝐶𝐶 (4)

où fOC est la fraction de carbone organique exprimé en kg CO / kg sol et KOC le coefficient de

partition entre la matière organique du sol et l’eau. Cette équation permet de comprendre le rôle

important de la matière organique en écotoxicité terrestre, mais nous y reviendrons plus tard

(section 2.2.5). Tromson et al. (2016) ont montré que les relations utilisées en ACV pour

convertir les données d’effet aquatiques en données d’effet terrestres ne sont pas fiables car elles

induisent trop d’erreur [5].

10

Aussi, les caractéristiques physicochimiques, la spéciation et la biodisponibilité des métaux, et

les propriétés de chaque métal (biodégradables ou non par exemple), ne permettent pas de les

grouper en classe comme c’est le cas pour les substances organiques. Ainsi les méthodes ÉICV

pour les substances organiques ne sont pas adaptées pour les métaux (trop d’incertitudes

substantielles) [16, 17]. Par exemple, IMPACT 2002+ ne considère ni la spéciation (seulement la

forme d’ion libre), ni la biodisponibilité des métaux [18]. La plupart de ces méthodes considèrent

que la totalité de l’émission métallique est toxique, or ce n’est pas le cas et cela dépend fortement

de sa spéciation et de sa biodisponibilité. Le premier cas est une approche fortement

conservatrice qui est trop éloignée de la réalité. D’un autre côté, tel que mentionné plus haut,

certaines méthodes considèrent plutôt la forme de l’ion libre, ce qui est aussi une surestimation

des impacts, étant donné les métaux ne sont pas nécessairement toxiques lorsqu’ils sont sous leur

forme ionique libre. Plusieurs auteurs se sont penchés sur la question, tel que Owsiniak et al.

(2013), afin d’apporter des amélioration au modèle théorique utilisé en ÉICV, tenant compte du

facteur d’accessibilité (ACF) et du facteur de biodisponibilité (BF) [11]. Le nouveau modèle

IMPACT World+4, développé récemment, a pour but dans le futur d’inclure des notions de

spéciation, spatialisation et d’intégrer la notion d’écotoxicité terrestre dans son entier.

Quant aux tests en laboratoire, il existe aussi des lacunes qui ont des répercussions sur la

modélisation des émissions métalliques. La reproductivité des conditions de terrains ex-situ, non

seulement au niveau de la contamination (réelle vs artificielle) mais aussi des espèces étudiées

(acclimatées vs ajoutées). De nombreuses études ne tiennent pas compte du vieillissement d’une

contamination métallique ou de temps d’adaptation d’une communauté d’organismes vivants.

Dans le premier cas, l’ajout de sels métalliques ou de mélanges de minéraux peut venir briser

l’équilibre établi du sol, soit en faisait chuter le pH (temporairement ou indéfiniment) qui est

étroitement lié à la spéciation métallique [19, 20]. Si la chute de pH est permanente, on peut

considérer que sur le terrain ou ex situ, on observerait des effets similaires. De plus, cela pourrait

s’apparenter à la première application de fongicides sur des terrains « vierges ». Dans le dernier

cas, il est difficile d’attribuer l’inhibition/activation biologique à la contamination ou au

changement de milieu [21].

4 http://www.impactworldplus.org/en/index.php

11

C’est pour toutes ces raisons qu’il est donc impératif de mettre à jour les bases de données

écotoxicologiques terrestre pour les métaux et ce par le biais de tests expérimentaux pour

différents phyla représentatifs pour le compartiment du sol.

2.2 Le sort du cuivre dans les sols

2.2.1 Contexte du cuivre

Le cuivre (Cu), communément appelé le métal rouge de par sa couleur ocre, est le plus ancien

métal utilisé par l’homme. Il y a plus de 10 000 ans, nos ancêtres ont découvert le cuivre et ses

propriétés extraordinaires pour la production d’armes, d’outils et d’ornements étant donné sa

malléabilité, son côté tranchant lorsque travaillé et sa résistance. Le Cu eu vite fait de remplacer

son prédécesseur, la pierre. Les premiers millénaires de l’extraction et la transformation du Cu

ont peu contribué à la pollution mondiale ou même locale [22]. Le passage à l’ère industrielle a

rapidement changé la donne et aujourd’hui le Cu, malgré son statut de nutriment essentiel,

représente une toxicité bien réelle pour les organismes vivants. En effet, l’utilisation accrue du

Cu a permis une plus grande circulation de celui-ci dans notre environnement quotidien.

Le Cu est naturellement présent dans la croûte terrestre sous forme métallique (Cu0) ou dans de

nombreux minéraux : la cuprite (Cu2O), la malachite (CuCO3 · Cu (OH) 2), l’azurite (2CuCO3 ·

Cu (OH) 2), la chalcopyrite (CuFeS2), la chalcocite (Cu2S) et la bornite (Cu5FeS4) [23]. En

moyenne, la croûte continentale contient environ 0,0058 pour cent cuivre [24], et les réserves

identifiées de Cu sont estimées à 2 100 millions de tonnes métriques (tM) et 3 500 tM encore à

découvrir (en 2013) sur les six continents [25]. Il est principalement extrait en Amérique, en

Russie et en Australie, mais proviendrait aussi, pour le cuivre raffiné, de matériaux recyclés. On

estime que le Cu recyclé représente environ 30 % de la consommation mondiale de Cu [26].

La valeur moyenne de concentration du Cu dans le sol dans le monde est de 30 mg/kg et la limite

de teneur de fond acceptable au Québec est de 40 mg/kg [27].

Il intervient dans le domaine de l’électricité (de part sa forte conductivité électrique) [26], de la

construction, dans la composition de nombreux alliages. Les sels de cuivre tels que le sulfate de

cuivre et l’hydroxyde de cuivre, sont grandement utilisés en tant que fongicides, algicides,

herbicides et insecticides, surtout en agriculture viticole.

12

Le Cu est un élément essentiel, dans une certaine mesure, à toute forme de vie. En effet, tel que le

présente la figure 2.3, la performance d’un organisme vivant, notamment les micro-organismes

terrestres, dépend en partie de la concentration en cuivre qui leur est disponible selon 3 cas de

figure : 1) une trop faible concentration totale (entre 2 et 5 mg/kg) crée une déficience et diminue

la performance fonctionnelle des organismes vivants pouvant aller jusqu’à la mort, 2) une plage

de concentration totale (entre 5 et 30 mg/kg) optimale pour les organismes vivants, et 3) une trop

forte concentration totale devenant toxique et entrainant potentiellement la mort au-delà de 20 à

100 mg/kg [28].

Figure 2.2: Courbe dose-réponse généralisée pour n’importe quel métal essentiel tel que le

cuivre. Modifié de W. Mertz [29]

2.2.2 Propriétés physicochimiques

Le cuivre est le premier élément du groupe IB du tableau périodique et se classe comme métal

noble puisqu’on le retrouve dans la nature sous forme élémentaire.

13

Ses propriétés physicochimiques uniques en font l’un des métaux les plus importants dans

l’industrie (voir tableau 2.1). Tel que vu dans la section 2.2.1, le Cu a une conductivité thermique

et électrique élevée, une forte malléabilité, une faible corrosion, et la capacité de s’allier à

d’autres métaux.

Tableau 2.1: Propriétés physicochimiques du Cu. Tiré de J.K Barbalace [30]

Propriétés Cuivre Masse atomique 63.546 g.mol -1 Densité 8.9 g.cm-3 à 20°C Point de fusion 1356.2 °K Pression de vapeur 0.0505 Pa à 1085 °C Solubilité dans l’eau Non soluble à 20 °C États d’oxydation 5 (0, +1, +2, +3 et +4)

Le cuivre a plusieurs états d’oxydation : Cu (O), Cu (I), Cu (II) et Cu (III). Beaucoup de métaux

sont insolubles dans le sol, mais peuvent être liés de façon réversible aux particules de sol. Une

partie est soluble et une portion des ions métalliques en solutions sont liés à des ligands (Cl-,

ligands organiques…). Le cuivre divalent Cu(II), Cu2+, est une des formes du cuivre les plus

biodisponibles [31], c’est la forme du cuivre qui est soluble. Cette petite fraction de Cu soluble, à

de faibles concentrations, a un effet bactériostatique et fongicide. Dans certaines applications,

cette propriété sert à prévenir le développement des germes et champignons (canalisations d'eau

sanitaire, culture de la vigne, coques de bateaux et boiseries...). Les propriétés fongicides du

cuivre sont reconnues depuis plus de 200 ans [32].

Quand du Cu est introduit dans le compartiment du sol, l'ion cuivrique se lie typiquement avec la

matière organique et inorganique, affinité qui dépend du pH, du potentiel d'oxydo-réduction dans

l'environnement local, et de la présence d’ions métalliques et d’anions inorganiques en

compétition.

2.2.3 Sources de contamination

Les sources de contaminations de Cu peuvent être soit naturelles, soit anthropiques (activités

humaines) tel que le montre la figure 2.4. Les décharges naturelles au sol, telles que les

poussières et les éruptions volcaniques, peuvent être importantes. La concentration moyenne de

14

cuivre dans le sol est comprise entre 5 et 70 mg / kg et est plus élevée dans les sols à proximité

des fonderies, des opérations minières, et des sources de combustion.

Figure 2.3: Sources, transport et interactions avec les organismes. Tiré de A. K.

Shrivastava [33]

La plus grande libération de cuivre à l'environnement par les activités humaines est de loin au sol.

Telle que l’indique la figure 2.4, les sources de contaminations sont nombreuses mais les

principales en viticulture sont les fongicides/fertilisants. La bouille bordelaise (CuSO4) ou

l’oxychlorure de cuivre sont des fongicides très largement utilisés dans l’industrie

agroalimentaire, notamment viticole, depuis la fin du 19e siècle. Tel que vu précédemment, le

cuivre est un oligoélément essentiel à la vie mais peut devenir néfaste en trop grande

concentration. Dans le cas des fongicides, le cuivre a un effet néfaste sur les enzymes dans les

spores des champignons et bloque ainsi leur germination. Malheureusement, l’usage répété de

fongicides au cuivre entraine une forte pollution des sols situés en-dessous des vignes. Le cuivre

ne se dégradant pas et obéissant à des mécanismes de transport (souvent liés aux propriétés des

sols), il présente ainsi une toxicité pour les micro-organismes dépendamment des seuils de

concentration [34].

15

Tableau 2.2: Concentrations de cuivre total (CuT) retrouvées dans les échantillons de sol de

vignobles et vergers dans différents pays

Aujourd’hui le modus operandi en agriculture est une augmentation de la production agricole, et

ainsi une utilisation accrue de fongicides/pesticides, causant ainsi une accumulation importante

de Cu dans les sols [53] mais aussi une pollution de terres « nouvelles ». Le tableau 2.1 fait état

des différentes concentrations retrouvées à travers le globe.

La législation québécoise veut que les niveaux de Cu ne dépassent pas les trois critères établis en

fonction de l’exploitation du sol [54] :

- Critère A : teneur de fond des sols au Québec : 40 mg de cuivre/kg de sol sec

- Critère B : limite maximale pour l’utilisation d’un terrain à des fins résidentielles, récréatives et

institutionnelles : 100 mg de cuivre/kg de sol sec.

Pays CuT (mg.kg-1) Profondeur (cm)

Référence

Australie 6-223 0-10 Wightwick et al.2008 [35] Brésil 37-3216 0-5 Mirlean et al. 2007 [36] Brésil 433-517 0-5 Mirlean et al. 2009 [37]

Croatie 105-553 0-20 Miko et al. 2007 [38] République Tchèque 20-168 0-20 Komàrek et al. 2008 [39]

Slovénie 87-120 0-20 Rusjan et al. 2007 [40] Espagne 38-63 0-20 Ramos 2006 [41] Espagne 368 0-5 Fernández-Calviño et al. 20013 [42] France 14-251 0-15 Brun et al. 1998, 2001 [34, 43] France 22-398 0-30 Chaignon et al. 2003 [44] Grèce <157 0-30 Vavoulidou et al. 2005 [45] Italie 220 0-10 Deluisa et al. 1996 [46] Italie 215-372 N.A Dell’Amico et al. 2008 [47]

Nouvelle-Zélande 4-259 0-0 Morgan et Taylor 2004 [48] Portugal 58-130 0-30 Magalhaes et al. 1985 [49] Suisse 58-4689 -- Celardin et al. 2004 [50]

Thaïlande 115-238 0-10 Joannon et al. 2001 [51] Chine (verger) 21-141 0-20 Q.-Y. Wang et al. 2009 [52]

16

- Critère C : limite maximale acceptable pour des terrains à vocation commerciale et industrielle :

500 mg de cuivre/kg de sol sec.

Le Québec n’est donc pas en reste au niveau de la contamination des sols au Cu, il est donc

impératif de mesurer les effets d’une concentration au delà des critères établis, notamment les

critères A et B, sur les sols québécois.

2.2.4 Spéciation du cuivre en milieu terrestre

La spéciation est une propriété très importante pour les métaux puisque cela va définir leur

mobilité, leur devenir environnemental, leur biodisponibilité et leur toxicité. La spéciation fait ici

référence au fractionnement, c’est-à-dire aux formes chimiques que peut prendre le Cu dans le sol

et la solution de sol [55]. La mobilité du Cu dépend de sa capacité à se complexer avec les

éléments présents dépendamment du type de sol, et donc de sa composition (minérale, organique)

et de ses propriétés physico-chimiques tel que le pH, la teneur en eau, la CEC (capacité

d’échange cationique), etc…On parle du phénomène d’adsorption/désorption surtout au niveau

de la MO du sol non dissoute et dissoute pour laquelle le Cu a des affinités particulières, mais il

existe aussi des mécanismes d’absorption, d’isomorphisme et d’échanges. Le sol a ainsi plusieurs

composantes qui lui permettent de tamponner la solubilité du Cu, ce qui a une forte influence sur

la toxicité de ce dernier à court terme et à long terme. Le phénomène d’adsorption se traduit par

la fixation d’une substance à la surface de la membrane, alors que l’absorption d’un métal est le

passage à travers la paroi membranaire d’un organisme (figure 2.5).

17

Figure 2.4: Fractionnement du Cu dans le sol (MOD : matières organiques dissoutes. Modifié de

L. Anatole-Monnier [56]

Les principales fractions sont :

1. Fraction dissoute dans la solution du sol : ion libre Cu 2+ ou complexe soluble; L’ion libre

du métal représente un petite fraction de la quantité totale en métal du système tel que le

montre la figure 2.5, est étroitement lié à la toxicité du métal dans le sol (section 2.2.5) et

est dépendant du pH [57]. Les réactions d’adsorption/désorption jouent un rôle crucial

dans la constitution/reconstitution de la réserve de métal dissout (associée à la MO

dissoute) et libre dans le sol (réserve labile par opposition à la réserve non labile, soit

« fixée »).

1. Fraction échangeable : le cuivre peut se lier par forces électrostatiques sur les éléments

portant des charges négatives tels que les argiles, la matière organique (MO) et les

matériaux amorphes. Le Cu est dans ce cas en compétition avec tous les cations présents

dans la solution tel que le proton (effet du pH étroitement lié) et le calcium (sol calcaire),

18

ce qui explique que la CEC (Capacité d’Échange Cationique : capacité à retenir les

cations sur des charges négatives) est étroitement liée à la spéciation du Cu. En effet, plus

la CEC d’un sol est importante, plus le Cu pourra se lier sur les éléments portants des

charges négatives [34]. Les cations pouvant entrer en compétition avec le Cu pour l’accès

aux sites sont classés ci après par ordre de préférence d’adsorption, basé sur le ratio

charge/rayon (prévalence du lien ionique) : Ni > Mg > Cu > Co > Zn > Cd > Sr > Pb [58].

D’autres cations peuvent entrer en compétition avec le métal pour l’accès à ces sites.

2. Fraction organique : 15 à 25 % du Cu total peut être complexé (adsorbé) par la MO

insoluble [32, 59], récemment synthétisée ou décomposée par l’activité microbienne.

L’adsorption des métaux sur la MO se fait sur les différents groupements fonctionnels de

cette dernière, en priorité les groupements carboxylique et phénolique. Le Cu présente la

meilleure affinité dans les sols acides par rapport aux autres métaux divalents. Ainsi la

MO solide retient le Cu dans la phase solide du sol, ce qui limite leur transport et qui les

rend moins bio-disponibles. Cependant plus la MOT (matière organique totale) est

importante, plus la MOD (matière organique dissoute) l’est aussi. L’association du Cu à

la MOD (mesurée par le carbone organique dissout : DOC), formant ainsi des complexes

organiques solubles, nuit aux mécanismes d’adsorption de celui-ci aux particules de sol

par compétition ou interférences physiques, augmentant ainsi sa biodisponibilité [55, 60,

61]. De plus, dans des conditions oxydantes, la matière organique peut être dégradée et

conduire à la solubilisation des métaux traces [62]. La MO du sol peut avoir un double

rôle antagoniste, elle peut augmenter la solubilité du Cu par la formation de complexes

mais elle peut aussi la diminuer en adsorbant le Cu [63].

3. Fraction inorganique : les minéraux argileux, carbonates, phosphates, oxydes de fer (Fe),

d’aluminium (Al) et de manganèse (Mn), peuvent adsorber le Cu. Les oxydes sont

d’excellents capteurs de métaux lourds et sont thermodynamiquement instables dans des

conditions anoxiques.

4. Fraction résiduelle : métaux séquestrés dans la matrice cristalline des minéraux du sol.

Cette fraction est peu mobile, dû au temps nécessaire à l’altération des roches.

On remarque que le pH a une grande influence sur les processus qui régissent la spéciation du

Cu [15] : précipitation/solubilisation des composés inorganiques, modification de la CEC du sol,

19

solubilisation de la matière organique, etc. Par exemple, à pH acide, la désorption du métal est

grandement favorisée et augmente la concentration des métaux en solution.

Les fractions solubles et échangeables sont considérées comme biodisponible, tandis que les

oxydes, les carbonates, la fraction organique peuvent être potentiellement disponibles. La fraction

résiduelle est essentiellement non disponible à court terme aux micro-organismes [64].

2.2.5 Relation spéciation, biodisponibilité et toxicité

La biodisponibilité d’un métal se définit comme la fraction d’une substance qui est

immédiatement disponible pour absorption par les organismes [65]. La bioaccessibilité est la

fraction d’une substance présente dans l’environnement et qui sera immédiatement disponible,

mais qui va également devenir avec le temps sujette à une absorption par les organismes. Cette

fraction comprend donc à la fois la fraction biodisponible immédiatement mais également la

fraction qui va devenir disponible dans le temps [66]. Enfin, la bioréactivité fait référence à la

quantité du métal absorbé qui aura réellement un effet toxique sur l’organisme.

La biodisponibilité des métaux se définie comme un compromis entre la composante physico-

chimique caractérisée par les processus d’adsorption/désorption, contrôlant la mobilité du métal

dans le sol [67], et entre la composante biologique caractérisée par le processus d'absorption

physiologique d'un indicateur biologique spécifique [68].

Comme on a pu le constater, la biodisponibilité et la toxicité des métaux dépendent de la

spéciation physique et chimique du métal dans la matrice, et, des propriétés du sol comme le pH

[69, 70] . Par exemple, plus le pH est faible, c’est-à-dire que l’on se retrouve dans des sols acides,

plus le cuivre est biodisponible. En effet, le pH est le facteur le plus influent sur kd [71].

Aujourd’hui les bases de données telles que US EPA utilisent encore la concentration totale de

Cu afin dans l’estimation des effets sur l’environnement, or cette approche est extrêmement

conservatrice. En effet, même si la concentration totale de cuivre est un indicateur utile de la

déficience/contamination dans le sol, il ne permet pas d’obtenir des informations quant à son

impact réel sur l’environnement du sol, tandis que la biodisponibilité du cuivre au biota (en tant

que nutriment ou toxine) et sa mobilité sont des facteurs importants. Puisque la biodisponibilité

du cuivre dépend de plusieurs facteurs environnementaux mais aussi des propriétés physico-

20

chimiques des sols, la corrélation entre cuivre total et cuivre biodisponible ne peut être prédite de

façon précise [32, 52].

Plusieurs modèles ont donc été élaborés afin de mieux prédire la toxicité du métal en fonction de

sa spéciation. Le modèle FIAM (Free Ion Activity Model), estime que la fraction de l’ion libre

métallique en solution est directement lié à la toxicité du métal dans un système à l’équilibre,

quels que soient les mécanismes de réaction [72]. Cependant, dans le sol, les différents

mécanismes de spéciation, les propriétés de la phase solide et la cinétique des réactions à

l’interface solide-liquide influencent considérablement la chimie des solutions de sol [55]. Ceci

rend la compréhension du lien entre la fraction de l’ion libre métallique et la toxicité beaucoup

plus difficile, et moins applicable que dans les systèmes aquatiques. Le TBLM (Terrestrial Biotic

Ligand Model) est une « extension » du FIAM dans le sens où il estime aussi une part de toxicité

associée à d’autres espèces du métal [72] (voir figure 2.6). Le TBLM est un modèle adapté de

celui pour l’écotoxicité aquatique qui lui même est une combinaison du concept GSIM

(Pagenkopf, 1983) [73] et le programme de spéciation géochimique WHAM (Tipping, 1994)

[74]. Comme on peut le constater dans la figure 2.6, le Cu passe de la phase sol à la phase

solution du sol via la formation de complexes avec le MO dissoute. Une fois dans la phase

solution du sol il se retrouvera soit sous sa forme ionique libre Cu2+ ou formera des complexes

avec les ligands dissouts, ce qui entraine une diminution de l'activité Cu2+. La concurrence au site

d’action toxique du ligand biotique entre le Cu et les cations entraine aussi une diminution de la

toxicité.

21

Figure 2.5: TBLM : Terrestrial Biotic Ligand Model. Adapté de C.R Janssen [75] et S.Thakali

[76]

La mesure de la toxicité via la concentration du Cu2+ suppose que l’équilibre a été atteint dans le

système sol/solution de sol. Or les phénomènes d’adsorption/désorption peuvent être plus ou

moins rapides, allant de quelques jours, surtout en ce qui concerne le Cu adsorbé aux particules

dissoutes, à des décennies [77]. Ainsi la biodisponibilité du Cu dépendrait davantage de la

fraction labile, c’est-à-dire la fraction du métal liée à des ligands dont la cinétique de

dissociation-association est rapide [78]. Selon, Merrington et al. (2002) dans un contexte de

contamination de Cu en milieu viticole, l’activité de l’ion libre n’est peut-être pas un indicateur

de réponse écotoxicologique assez sensible, surtout dans les sols acides [79]. En revanche, Giller

et al. (2009) estiment qu’il est plus probable que la fraction biodisponible ne soit pas limitée à la

fraction labile [80]. Il est donc plus judicieux de lier l’effet toxique de la contamination du Cu à

la fraction soluble-échangeable.

22

La fraction échangeable des métaux est souvent mesurée en utilisant des extracteurs tels que les

solutions salines faibles ou neutres non tamponnées. Elles permettent la mise en solution des

métaux par des processus d’échange cationique. Elles miment la fraction de l’élément à la fois

présent en solution et potentiellement mobilisable à partir de la phase solide, notamment la

fraction dite échangeable par simple modification de pH et échange cationique [81].

Sauvé et al. (1997) estiment que l’activité de l’ion libre Cu2+, peut être prédite en utilisant deux

caractéristique du sol : le pH et le cuivre total [31]. Or, selon Smith et al. (2015), le pH (l'ion H+)

joue un double rôle dans la toxicité des métaux. Tel que vu dans la section 2.2.4, il facilite la

liaison du Cu à divers ligands, particulièrement la matière organique, mais l’ion H+ peut aussi

entrer en compétition avec le Cu pour la liaison au ligand biotique. Ce qui explique les résultats

contradictoires rapportés dans la littérature [82].

Enfin, la diminution de la biodisponibilité et de la toxicité du Cu avec le temps [83] suggère que

la plupart des données de tests en laboratoire générées à partir de contamination artificielle

surestiment le risque présenté par une concentration en Cu total dans les sols [4]. Pour pallier à ce

problème, les sols artificiellement contaminés doivent être soumis à un processus de lixivation,

qui selon Smolders (2003) diminue les effets négatif du métal en comparaison à un sol ayant une

concentration équivalente non-lixivié [84, 85].

2.2.6 Vieillissement et persistance d’une contamination métallique

Le vieillissement d’une contamination métallique fait référence au processus par lequel la

mobilité et la biodisponibilité des métaux déclinent avec le temps [86, 87]. Les différentes

interactions physiques et chimiques entre le sol, la solution de sol et le métal, influent sur ce

vieillissement. Typiquement, lorsque le Cu est lié à la matière organique, dans des conditions

oxydantes, celle-ci peut être dégradée et conduire à la solubilisation des métaux.

La réaction de sorption initiale du Cu dans le sol a lieu très rapidement après l’addition du métal

(minutes à heures). S’en suivent alors les réactions plus lentes qui augmentent la disponibilité du

Cu sur le moyen terme (tel que vu ci-haut) mais aussi la diminuent sur le long terme (mois à

années) [65]. Le Cu reste ainsi actif pendant une longue période de temps et peut-être alors subir

une lixiviation et être transporté dans les couches profondes du sol [32]. Il faut aussi considérer

23

que les plantes peuvent altérer la mobilité chimique et ainsi la biodisponibilité des métaux

environnants [34].

Enfin, certains facteurs externes peuvent avoir une influence sur le vieillissement précoce de la

contamination du Cu, telle que les pratiques agricoles qui favorisent la minéralisation de la

matière organique et ainsi augmente le cuivre en solution ce qui a pour effet d’accroître les

risques de toxicité [53].

Le Cu, comme les autres métaux, ne se dégrade pas dans l’environnement mais est transféré de

compartiment en compartiment ou bioaccumulé dans les organismes, ce qui rend la

contamination métallique persistante. Par exemple, une des particularités du Cu est de s’absorber

à la matière organique dans le sol, permettant un accumulation du Cu dans les couches

superficielles du sol suite à une contamination directe (déversement) ou indirecte (écoulement

suite à une pulvérisation sur des vignes par exemple). Selon Wang et al. (2009) [52], les

concentrations de cuivre dans les sol de vergers ont tendance a accroitre avec l’utilisation répétée

au fils du temps de fongicides au cuivre passant de 21.8 mg.kg-1 a 141 mg.kg-1 sur 25 ans alors

que Li et al. (2005) observent un augmentation de la concentration de cuivre allant de 2.4 à

9.0 mg.kg-1 par an [88]. Dans, les sols acides, où la solubilité du Cu et son incorporation dans la

solution de sol sont accrues, le Cu accumulé dans les couches superficielles du sol peut migrer en

profondeur ou latéralement [89]. Le transfert aux zones de sédimentations est alors facilité par

l’érosion [59] et le Cu se retrouve ainsi dans l’eau souterraine et affecte potentiellement la faune

aquatique [53].

2.3 L’écotoxicité terrestre du cuivre

2.3.1 Propriétés physico-chimiques et biologiques du sol

Le sol est une matrice hétérogène et ses diverses propriétés physico-chimiques et biologiques la

rendent très complexe. S’ajoutent à cela des facteurs externes comme les conditions climatiques

et les cycles de la végétation, il n’y a donc pas deux sols pareils dans le monde. Ce qui explique

l’hétérogénéité des résultats dans la littérature.

24

Propriétés physiques :

Les propriétés physiques du sol sont nombreuses et variées, mais on en retient deux principales

qui seront essentielles dans le cadre de ce projet : sa texture et sa porosité. Ces deux propriétés

vont permettre de comprendre la spéciation du Cu dans le sol, la présence des sites de protection

des enzymes et les mécanismes de rétention de l’eau dans les sols.

La texture d'un sol correspond à la répartition des minéraux par classe de granulométrie

indépendamment de la nature et de la composition de ces minéraux. Selon l’USDA (United State

Department of Agriculture) il existe trois classes principales :

1. Texture sableuse (entre 2 mm et 50 μm) : sol bien aéré, facile à travailler, pauvre en réserve

d'eau, pauvre en éléments nutritifs, faible CEC.

2. Texture limoneuse (entre 50 μm et 2 μm) : l'excès de limon et l'insuffisance d'argile peuvent

provoquer la formation d'une structure massive, accompagnée de mauvaises propriétés

physiques. Cette tendance est corrigée par une teneur suffisante en humus et en calcium.

3. Texture argileuse (<2 μm) : sol chimiquement riche, mais à piètres propriétés physiques;

milieu imperméable et mal aéré, formant obstacle à la pénétration des racines ; travail du sol

difficile, en raison de la forte plasticité (état humide), ou de la compacité (sol sec). Une bonne

structure favorisée par l'humification corrige en partie ces propriétés défavorables.

Les blocs, les galets et les roches sont classés à part (>2 μm) [90] et la texture du sol ne tient pas

compte du calcaire et de la MO.

Les classes de granulométries peuvent s’entrecroiser afin de donner plusieurs sous catégories

telles que le montre la figure 2.7. Par exemple, une granulométrie favorable à la culture est : 15 à

25 % d'argile, 30 à 35 % de limons, 40 à 50 % de sables.

25

Figure 2.6: Triangle des textures selon l’USDA [91]

La texture d’un sol donne une idée de sa capacité à influencer la mobilité des nutriments et des

contaminants. Ils seront davantage retenus par un sol dont les particules ont un diamètre faible

(interactions électrostatiques fortes avec les autres composantes du sol) que par un sol dont les

particules ont un diamètre plus élevé. De plus, les particules fines (argiles) peuvent aussi servir de

sites de protection pour les enzymes du sol lorsqu’elles les adsorbent, leur offrant une protection

contre l’hydrolyse par exemple comme c’est le cas pour la protéase et l’uréase [92].

La porosité d’un sol est la capacité d’un sol à retenir l’eau, pour la rendre disponible à la faune et

à la flore du sol, communément mesurée par la capacité de rétention au champ (CRC). La

capacité de l'eau disponible est affectée par la texture du sol, la présence et l'abondance des

fragments de roche, et la profondeur du sol et de ses différentes couches. Plus les particules sont

fines, présentant des pores plus petites, plus la capacité de rétention d’eau augmente tel que dans

26

les sols argileux puisque les petites pores retiennent l’eau contre le drainage libre, alors que les

sables ont de plus grandes pores qui seront soumis à un drainage plus important. Par contre, les

sols à texture limoneuse qui ont une grande capacité d’agrégation, présentent une meilleure

capacité de rétention d’eau que les sols argileux qui ont un point de flétrissement permanant qui

augmente avec le temps.

La porosité à un rôle important puisqu’elle définit entre autre la capacité du sol à stocker l’eau,

élément limitant pour les micro-organismes du sol. Dans les zones où il pleut beaucoup et où

l’eau n’est pas facilement drainée, cela peut avoir un impact négatif sur la faune et la flore

environnante, cependant, dans les zones où l’eau est plus facilement éliminée par les plantes ou

dans les zones arides, la quantité d’eau retenue par le sol peut être critique dans le bon

fonctionnement des organismes. En gardant de l’eau en réserve de manière équilibrée, le sol

tamponne contre la potentielle déficience d’eau disponible aux plantes ou aux organismes [93].

D’un autre côté, les pores plus grosses offrent un meilleur habitat aux micro-organismes que les

pores plus petites même si leur rétention d’eau est plus grande. Il faut donc un équilibre entre les

deux propriétés.

Propriétés chimiques

Les paramètres chimiques ont déjà été discutés aux section 2.2.4 et 2.2.5 afin d’expliquer la

spéciation du Cu dans le sol. Mais rapidement, les propriétés chimiques du sol incluent : le pH, la

teneur en MO, la composition des minéraux, les propriétés des nutriments, la salinité les oxydes

métalliques et la teneur en éléments potentiellement toxiques. Toutes ces propriétés chimiques

sont à l’origine de la CEC, la capacité tampon, etc.

Le pH et la MO étant les deux principales composantes qui influencent la mobilité et la

biodisponibilité des métaux, mais aussi la composition du bassin des micro-organismes.

Propriétés biologiques

Les propriétés biologiques du sol sont directement reliées à la faune et à la flore de celui-ci, c’est-

à-dire les animaux, les micro-organismes et les plantes, sans lesquelles le sol ne pourrait

fonctionner correctement étant donné leur rôle de régulation. Les plantes ont un effet de

décontamination puisqu’elles capturent certaines fractions métalliques via leurs racines [94, 95].

Les micro-organismes quant à eux ont un rôle dans la dégradation des déchets organiques, de

27

production des nutriments, et de maintien d’un environnement sain. Un changement dans la

l’activité des micro-organismes peut avoir des effets néfastes sur l’équilibre fragile du sol et donc

sur sa santé. La quantité de micro-organismes contenue dans les sols est colossale, ce qui

explique la grande variété d’espèces découvertes jusqu’à ce jour, reflétant parfaitement

l’hétérogénéité des facteurs abiotiques.

Comme on peut le constater, le sol est une matrice hétérogène régit par un réseau d’interactions et

des associations très complexe, ce qui rend son comportement envers les contaminations

métalliques difficilement compréhensible. Par contre, cette complexité permet au sol de

tamponner facilement les perturbations naturelles ou anthropiques jusqu’à un certain niveau.

2.3.2 Fonctions et santé du sol

La santé du sol est la capacité du sol à assurer ses fonctions de système vivant vital qui permet de

soutenir la productivité et promouvoir la santé des plantes et des organismes, et, de servir de filtre

afin de maintenir ou améliorer la qualité de l’eau et de l’air [96]. L’évaluation de la santé du sol

(appelée aussi qualité du sol) est importante pour : la production d’aliments et de fibres, pour la

survie de la plupart des organismes terrestres (importants pour le maintien des plantes par le biais

des cycles de nutriments qui recyclant les résidus organiques et biologiques en matières

premières : dioxyde de carbone, nitrate, etc.), mais aussi pour la qualité de l’environnement local,

global et mondial [97]. Le sol n’est pas une ressource inépuisable et mal géré ou mal utilisé, cela

peut avoir de graves conséquences irréversibles sur la santé globale des organismes sans

possibilité de réhabilitation.

Kibblewhite et al. (2008) propose 4 fonctions principales du sol [98] :

1. La transformation du carbone à travers la décomposition des résidus de plantes et autre

matière organique. La décomposition, fonction essentielle de l’écosystème et moteur des

cycles des nutriments, est aussi un support pour la détoxification et le traitement des

déchets organiques et inorganiques du sol. La matière organique du sol quant à elle,

contribue au cycle des nutriments et au maintien de la structure du sol. La séquestration

du carbone dans le sol joue aussi un rôle dans la régulation des émissions des gaz à effet

de serre comme le méthane ou le dioxyde de carbone. Ainsi le sol permet de filtrer,

tamponner, immobiliser, dégrader et détoxifier les substances organiques et inorganiques.

28

2. Les cycles des nutriments (cycles biogéochimiques) tel que le cycle de l’azote, du

phosphore, du souffre, incluant la régulation des émissions de protoxyde d’azote.

3. Le maintien de la structure et du tissu du sol par agrégation et transport particulaire, et

formation de bio-structures et réseau de pores à travers plusieurs échelles spatiales. Cette

fonction permet le maintien de l’habitat terrestre, la régulation du cycle eau-sol et un

milieu d’enracinement favorable pour les plantes.

4. La régulation biologique des populations du sol incluant les organismes reconnus comme

nuisibles ainsi que les maladies touchant la faune et la flore terrestre.

Les processus biologiques énoncés ci-dessus sont possibles grâce aux différentes interventions et

interactions des organismes terrestres. D’où l’importance des micro-organismes du sol dans le

maintien de sa qualité, qui seront affectés par un changement de ses conditions physico-

chimiques. La qualité du sol et la santé de ses micro-organismes sont interdépendants.

Le concept de qualité ou santé des sols est difficile à établir étant donné l’hétérogénéité de celui-

ci. En effet, le sol est une matrice qui accumule autant les éléments naturels qu’anthropogéniques.

Par exemple, la présence de cuivre peut être considérée comme de la pollution à certaines

concentrations mais essentielle à d’autres dépendamment des caractéristiques physico-chimiques

du sol et de la diversité des plantes et animaux.

Afin de déterminer la qualité du sol, on a besoin d’indicateurs qui sont : bien corrélés avec les

fonctions bénéfiques du sol et donc utiles au sein de l’écosystème, non seulement au niveau des

processus mais aussi dans l’intégration des propriétés physiques, chimiques et biologiques;

sensibles aux variations climatiques et aux perturbations anthropogéniques; accessible aux

communautés scientifique mais également agricole et juridique (dans la mise en place de

règlementation concernant la qualité des sols par exemple), c’est-à-dire compréhensibles, rapides

et peu coûteux [99]. Les micro-organismes du sol répondent à beaucoup de critères mentionnés

ci-dessus et sont donc des indicateurs de choix [96, 98].

29

2.3.3 Effet du cuivre sur la communauté microbienne terrestre

Suite à une revue intensive de la littérature, Giller et al. (1998) suggère que les micro-organismes

sont beaucoup plus sensibles au stress des métaux que les animaux du sol ou les plantes qui

poussent sur ces mêmes sols [100].

Brooks (1995) et plusieurs autres auteurs estiment qu’il y a un nombre de critères de base à

remplir pour qu’une propriété microbiologique remplisse le rôle d’un indicateur de contrôle de la

pollution métallique du sol. Il est préférable que ces propriétés soient faciles et économiquement

mesurables, assez sensibles pour indiquer une pollution mais aussi robuste afin de ne pas sonner

de fausses alarmes et fortement corrélées avec les fonctions bénéfiques du sol [99, 101]. Cette

section permet de valider les critères énoncés plus haut en ce qui concerne le choix des micro-

organismes du sol comme des indicateurs dans l’analyse des effets d’une contamination

métallique, particulièrement pour le Cu.

La communauté microbienne représente plus de 90% de la biomasse terrestre, est indigène, est en

contact direct avec les sols et est exposée de façon constante aux métaux de ce compartiment. On

observe une diversité conséquente dans la communauté microbienne dans un même sol tels que

les bactéries, les champignons, les protozoaires et les algues etc., qui se divisent en catégories :

microbes hétérotrophes et autotrophes, aérobies et anaérobies, des microbes ayant des tolérances

différentes aux conditions ambiantes et extrêmes, etc. L’hétérogénéité de la flore microbienne

reflète l’hétérogénéité des facteurs physico-chimiques et biologiques du sol.

Les micro-organismes sont responsable de la durabilité à long terme de l’écosystème du sol

puisqu’ils sont impliqués dans beaucoup de processus écologiques fondamentaux essentiels à la

santé des écosystèmes tels que les cycles biogéochimiques ou la décomposition des plantes ou de

restants animaliers [102]. Ils ont des capacités exceptionnelles de dégradation via leur capacité

d’excréter une variété d'enzymes (uréases, invertases, déshydrogénases, cellulases, amylases,

phosphatases), et contrôlent la détérioration de la matière organique et ainsi les flux net et la

quantité de carbone du sol et de nutriments à travers la décomposition minérale et les processus

d’immobilisation [103]. En effet, ils produisent des polysaccharides qui aident les particules du

sol à adhérer les uns aux autres et aident le sol à résister à l'érosion qui peut diminuer la

productivité de l'agriculture [104].

30

Plusieurs études avec différentes méthodes ont montré que différents aspects de la présence

microbienne incluant leur nombre, leur masse, leur activité et leur composition peuvent être

affectés négativement par une forte concentration en cuivre [52, 105-107]. Les micro-organismes

terrestres sont très sensibles à l’accumulation du Cu, ce qui entraine parfois une diminution de la

masse microbienne et un taux de respiration spécifique élevé [79]. M. Díaz-Raviña et al (2007)

suggère que des concentrations supérieures à 100 mg de Cu total/kg de sol sec ont un effet négatif

sur le turnover de la matière organique du sol et l’activité microbiologique [108], or la MO du sol

est généralement la caractéristique principale qui influence la vie microbienne en façonnant sa

densité, son activité et sa diversité. Le Cu sous sa forme d'ion libre pénètre lentement les

organismes et interagit avec les acides nucléiques, les sites actifs des enzymes et les composants

de la membrane [4]. Aussi, sous certaines formes (organique ou inorganique), il devient

très lipophile ce qui lui permet de pénétrer les organismes et de s'accumuler dans les membranes

plasmiques [109].

La contamination métallique du sol à une influence directe sur la composition de la communauté

des micro-organismes en la modifiant soit par un enrichissement des populations adaptées ou par

une diminution de celles plus sensibles [100, 110]. De plus, la réaction de la communauté des

micro-organismes à une contamination métallique peut être en grande partie expliquée par la

diversité innée et la composition de la communauté indigène qui peut aussi varier selon le

sol [111, 112]. Cependant il est possible en écotoxicologie de réaliser des tests de toxicité en

mesurant la somme des activités des différentes espèces de la communauté.

Bécaert et al. (2006) font une revue de la littérature liant la santé du sol aux micro-organismes

qui le composent, faisant état des différentes approches de mesure des impacts sur ces derniers.

Selon eux, il n’y a pas de consensus quant aux propriétés du sol ou aux fonctions qui pourraient

être utilisés comme indicateurs universels mais que le choix dépend de l’utilisation du sol [113].

Dans un contexte viticole, par exemple, la production de la récolte, la décomposition biologique

et l’échange de matières sont des fonctions qui seront ciblées. Cela fait parti des critères énoncés

à la section 2.3.2 : « accessible à la communauté non seulement scientifique mais aussi

agricole ».

Plusieurs méthodes ont été développées afin de déterminer les différents effets du cuivre sur la

communauté microbienne :

31

La densité de la biomasse microbienne est un indicateur utile dans l’évaluation de la santé du

sol mais qui serait plus corrélé au contenu en MO du sol et aux autres indicateurs microbiens, et

qui n’est pas toujours influencée par une contamination métallique ou une perturbation physique

[114].

La diversité microbienne peut aussi être un indicateur intéressant dans la mesure où un déclin

dans la diversité des micro-organismes peut affecter la résistance du sol à des perturbations

extérieures. Sauf qu’il semblerait que les fonctions du sol peuvent être redondantes et qu’une

réduction de tout groupe d'espèces a peu d'effet sur l'ensemble des processus dans le sol puisque

d'autres micro-organismes peuvent assumer leurs fonctions [103]. En effet, il existe un tel niveau

significatif dans la diversité des micro-organismes terrestres qu’ils ne peuvent pas toujours jouer

pleinement leur rôle dans les fonctions des écosystèmes.

Il serait alors intéressant d’évaluer la diversité fonctionnelle qui consiste à évaluer les capacités

de la communauté microbienne à accomplir différentes fonctions. Plusieurs techniques existent,

(CLPP, PICT…), mais nécessitent des équipements et des techniciens spécialisés. La diversité

microbienne peut aussi se mesurer par l’agrégation de l’activité de plusieurs enzymes selon

Lessard et al. (2014) [115], faisant foi de la capacité de la communauté microbienne à accomplir

différentes fonctions. Ces auteurs estiment que dans le cas du zinc, les indices de biodiversité

traditionnels, tels que l'indice de Shannon-Weaver ou l'indice de Simpson, ne sont pas bien

adaptés aux écosystèmes microbiens [113]. Les méthodes de moyennes pondérées et

géométriques dans l’estimation de la EC50 l’agrégation des activités enzymatiques seraient plus

justes.

L’activité microbienne du sol conduit à la libération de nutriments disponibles pour les plantes

et les micro-organismes, mais aussi à la minéralisation et la mobilisation des polluants. Les

fonctions métaboliques des organismes vivants sont gouvernées par les enzymes, protéines

spécialisées produites par les cellules vivantes et catalysant les réactions intra ou extracellulaire.

Deux types de méthodes sont disponibles afin d’évaluer l’activité microbienne. Le premier type

implique, entre autre, la respiration, la minéralisation de l’azote et la minéralisation du carbone

qui exigent de longues périodes d’incubation, et qui sont des méthodes peu intéressantes

puisqu’elles dépendent plus de la MO que de la contamination métallique dans le cas des cycles

associés au carbone [116] ou sont insensibles face aux métaux dans le cas de la minéralisation de

32

l’azote [117]. Le deuxième type concerne les activités enzymatiques (AE), qui sont une mesure

de la cinétique enzymatique, c’est-à-dire la vitesse à laquelle un substrat spécifique à une enzyme

peut-être transformée en un produit. Les AE ont des périodes d’incubation plus courtes mais

couvrent tous les cycles biogéochimiques du sol (azote, souffre, carbone et phosphore) [103],

sont impliquées la croissance des plantes et la décomposition des composés organiques en sous-

unités assimilables. De plus, plusieurs études ont montré la grande sensibilité des enzymes à des

fortes concentrations de cuivre [105, 118]. L’inconvénient est que de plus courtes périodes

d’incubation impliquent une sensibilité plus accrue aux perturbations puisque les micro-

organismes n’ont pas le temps de s’adapter aux conditions expérimentales. Aussi, la source des

enzymes est souvent méconnues dans un sol où plantes, animaux du sol et micro-organismes se

côtoient, étant donné que les enzymes résultent tout aussi bien de l’activité métabolique des

plantes et des animaux du sol [119]. Il reste que les enzymes du sol satisfont aux critères

d’indicateur de choix quant à la mesure des effets d’une contamination métallique sur les

fonctions de la communauté microbienne puisqu’ils fournissent une évaluation biochimique

intégrée unique de l’état et du fonctionnement du sol.

Par contre, afin de bien représenter la communauté microbienne, il est important de sélectionner

plusieurs activités enzymatiques qui représentent de façon fiable l’écosystème du sol. Or les

enzymes au cœur des fonctions de la communauté microbienne sont celles impliquées dans les

cycles biogéochimiques de C, N, P et S. Enfin, les AE doivent être associés à des paramètres

complémentaires, tels que la teneur en MO, pour être utiles comme indicateurs de la santé des

sols. Il faut aussi savoir que les essais enzymatiques mesurent les activités potentielles et non pas

les activités in situ [114].

La stabilité fonctionnelle qui est la mesure du changement dans la capacité fonctionnelle des

micro-organismes après une perturbation du sol (augmentation de la température couplée à une

contamination au Cu par exemple [84]), mais qui d’après Lessard et al (2014) n’apporte pas

d’information supplémentaire quant à la toxicité enzymatique du zinc par rapport à l’agrégation

de la réponse de plusieurs enzymes sans perturbation [115].

33

2.4 Effet du cuivre sur les enzymes du sol

2.4.1 Généralités

Les enzymes sont des protéines capables de catalyser des réactions chimiques dans les cellules

des organismes vivants en abaissant l’énergie d’activation, ce qui a pour conséquence d’accroître

la vitesse de réaction par des facteurs allant à des millions. Elles sont donc essentielles dans les

mécanismes de dégradation du sol, et tous les cycles biogéochimiques qui maintiennent le sol en

santé.

Les enzymes sont constitués d’une ou plusieurs chaines polypeptidiques (chaine d’acides aminés)

repliées formant ainsi une structure tridimensionnelle dont les propriétés catalytiques sont

déterminées par la séquence en acides aminés. Seule une partie de l’enzyme, le site catalytique,

est directement impliquée dans la catalyse, formant avec les sites de liaison, le site actif. Le reste

de l’enzyme sert au maintien de la configuration du site actif et à la génération des conditions

optimales pour le déroulement de la réaction. Les enzymes sont très spécifiques au niveau du

substrat et des réactions qu’elles catalysent. On pourrait faire l’analogie d’une clé spécifique à

une serrure puisque le substrat va venir se lier au site actif de l’enzyme afin de l’activer.

Le mécanisme général de l’activité enzymatique est le suivant [120] :

𝐸𝐸 + 𝑆𝑆 ↔ 𝐸𝐸𝑆𝑆 → 𝐸𝐸 + 𝑃𝑃 (5)

L'enzyme (E) se lie à un substrat (S) avant de pouvoir catalyser toute réaction chimique et

produire un produit (P). L’activité enzymatique (ou cinétique enzymatique) permet de

comprendre la façon dont les enzymes se lient aux substrats et les transforment en produits. Les

tests en laboratoires permettant d’extraire ces informations sont appelés essais enzymatiques.

La vitesse de la réaction enzymatique dépend des conditions externes et de la concentration du

substrat, la vitesse maximum étant atteinte lorsque la concentration du substrat est à saturation.

Enfin, les enzymes du sol se divisent en deux catégories qui les différencient spatialement [114]:

1 Les enzymes biotiques, se situent dans le cytoplasme de cellules qui prolifèrent de façon

viable, l’espace péri-plasmique et au niveau des surfaces externes. Elles sont donc

intracellulaires et interviennent dans l’activité métabolique des cellules actives du sol.

34

2 Les enzymes abiontiques sont excrétées par les cellules vivantes et fixées aux débris de

cellules et aux cellules mortes. Elles sont donc extracellulaires et sont présentes dans la

solution du sol. De plus, elles peuvent être absorbées aux surfaces internes ou externes des

argiles ou complexées avec des colloïdes humiques par adsorption ou copolymérisation. Ces

enzymes permettent la compréhension de l’activité des micro-organismes et ainsi la capacité

du sol à les protéger et les stabiliser [119].

Les enzymes sont très sensibles aux contaminations métalliques [19] ce qui rend les essais

enzymatiques intéressants en tant qu’indicateurs écotoxicologiques. De plus, plusieurs études

démontrent les effets néfastes du cuivre sur l’activité enzymatique, ce qui contribuent fortement à

la dégradation rapide de la qualité des sols [105].

2.4.2 Enzymes affectées par le cuivre

Les ions métalliques sont connus pour être des cofacteurs très communs des enzymes, c’est-à-

dire que pour certaines enzymes, la fonction en tant que catalyseur ne peut pas être effectuée si

un ion métallique n’est pas disponible pour être liés au site actif. Or ce n’est pas le cas du Cu

pour aucune de enzymes citées ci-dessus.

Par contre, le Cu2+ à très haute concentration se présente comme un inhibiteur non compétitif de

l’activité enzymatique. En effet, l’ion métallique ne se rattache pas au site actif comme les

inhibiteurs compétitifs, mais se lie à un groupe latéral de l’enzyme ce qui affecte la structure de

cette dernière et la façon dont elle se replie, modifiant ainsi le site actif [121]. Cela s’ajoute à la

réduction indirecte de l’activité enzymatique suite à l’interaction de la partie toxique du Cu avec

les micro-organismes, affectant ainsi leur production enzymatique [122]. Aussi, les métaux

peuvent se complexer avec le substrat ou réagir avec le complexe enzyme-substrat [84, 123].

Tel que mentionné dans la section 2.3.3, il est important de sélectionner plusieurs enzymes afin

de représenter de façon fiable l’écosystème du sol en investiguant sur celles qui sont impliquées

dans les cycles biogéochimiques de C, N, P et S [115]. Les cycles biogéochimiques étant des

processus de transport et de transformation cyclique d'un élément ou composé chimique entre les

grands réservoirs que sont la géosphère, l'atmosphère, l'hydrosphère, dans lesquels se retrouve

la biosphère. Selon Alkorta et al. (2003), les enzymes hydrolytiques, principalement celles

impliquées dans les 4 cycles biogéochimiques, sont couramment utilisées comme indicateurs

35

biologiques [114]. En effet, les organismes responsables de la décomposition des résidus

organiques sont probablement les principaux contributeurs à l’activité enzymatique du sol.

Les 6 enzymes étudiées par Lessard et al. (2014) pour le zinc dans le cadre du projet plus global

dont fait partie cette études seront reprises pour le Cu : l’invertase, l’uréase, la protéase,

l’arylsulfatase, la phosphatase et la β-glucosidase. Toutes ses enzymes font parties du groupe des

enzymes hydrolytiques (hydrolases) qui comprennent une fraction intracellulaire

métaboliquement viable et une fraction extracellulaire active et opportuniste. La taille de cette

composante extracellulaire est généralement inconnue et varie probablement d'une enzyme à

l’autre [121]. Ces 6 enzymes couvrent les 4 cycles biogéochimiques du sol soit à elle seule, soit

par deux comme le résume le tableau 2.3.

Tableau 2.3: Rôle des enzymes du sol

Enzyme Agit sur Produit final Fonction du sol

Invertase Sucrose Glucose Fructose Cycle du carbone

Uréase Azote (urée) Ammoniac (NH3) Dioxyde de carbone (CO2) Cycle de l’azote

Protéase Protéines du sol Peptides et acides aminés Cycle de l’azote Arylsulfatase Esters de sulfate Sulfate (SO4) Cycle du souffre Phosphatase Phosphore Phosphate (PO4) Cycle du phosphore β-Glucosidase Composés carbonés Glucose (sucre) Cycle du carbone

L’invertase est une enzyme ubiquitaire dans les sols [124] qui selon Belyaeva et al. (2005) serait

fortement inhibé par le Cu [123]. Elle catalyse la réaction d’hydrolyse du sucrose en glucose et

fructose.

L’uréase est l'enzyme qui catalyse l'hydrolyse de l'urée en CO2 et en ions NH4+, en agissant sur la

liaisons C:N non peptidique des amides linéaires [125]. Cette enzyme permet la transformation

de l'azote organique en azote minéral par hydrolyse de l'urée en ammoniac [124] qui est un

processus considéré comme vital dans la régulation de l’azote disponible aux plantes et aux

micro-organismes suite à un apport d’urée [126]. L’urée provient des engrais et est un constituant

majeur dans l'urine des animaux de pâturage. L’uréase est soumis à une forte inhibition par le Cu

[123] mais peut aussi être résistant à cette contamination métallique [127].

36

La protéase est une enzyme qui catalyse les processus impliqués dans les phases de

transformation du cycle de l’azote [126]. Elle est cinétiquement limitante pour le processus de

minéralisation de l’azote et en raison de l'abondance des protéines et des peptides dans le sol, la

protéase fournit probablement une grande partie de l’azote biodisponible [128]. Elle est peu

utilisée comme indicateur de la santé des sols à cause de sa complexité qui rend son analyse

difficile. Effron et al. (2004) notent quand même un bon potentiel comme indicateur pour les sols

contaminés aux métaux [129].

L’arylsulfatase est l’enzyme impliquée dans l’hydrolyse extracellulaire des esters de sulfates par

la fission du lien O:S ou par l’oxydation intracellulaire de la matière organique soluble absorbé

par les micro-organismes pour produire de l'énergie et du carbone [125, 126, 130]. Cette enzyme

permet la libération du sulfate organique pour la disponibilité aux plantes et aux micro-

organismes. Plusieurs auteurs affirment observer une diminution de l’activité de cette enzyme

dans les sols lorsque exposées à différentes concentration de Cu [129, 131].

La phosphatase hydrolyse les composés organiques du phosphore et les transforme en différents

composés inorganiques du phosphore qui sont ensuite assimilés par les plantes et les micro-

organismes [125]. Cette enzyme est un excellent indicateur de la fertilité du sol et joue un rôle

important dans l’écosystème terrestre [126]. La diminution de l’activité enzymatique suite à une

contamination au Cu est observée par plusieurs auteurs [123, 129, 131].

Enfin, la β-glucosidase est une enzyme catalysant l’hydrolyse et la biodégradation des différents

glucosides présents dans les débris végétaux en décomposition dans l'écosystème, produisant

ainsi du glucose [126]. Son importance est liée au fait qu’elle dégrade des hydrates de carbone et

assure l’approvisionnement en nutriments nécessaires pour la croissance des organismes

hétérotrophes des sols comme source d’énergie [130]. C’est une enzyme utile en tant

qu'indicateur de la qualité du sol et peut donner une idée de l'activité biologique passée et de la

capacité du sol à stabiliser la matière organique du sol. Pour certains auteurs, la β-glucosidase est

une enzyme qui est peu résistante à une contamination au Cu [131] alors que d’autres stipulent

qu’elle n’y est pas sensible [129].

En conclusion, les différents auteurs s’entendent pour dire que les enzymes citées ci-haut sont

plus ou moins affectées par le Cu. Cela dépend beaucoup du type de sol étudié et de leurs

caractéristiques physico-chimiques, et ainsi de la spéciation métallique. Il est donc essentiel

37

d’analyser leurs comportements face à une contamination au Cu selon ces caractéristiques,

notamment au niveau du pH et de la MO.

2.4.3 Conditions des essaies enzymatiques

Plusieurs conditions expérimentales sont nécessaires afin de déterminer un potentiel d’AE dans le

sol. Ces conditions doivent promouvoir une AE optimale sans pour autant modifier les

caractéristiques physico-chimiques du sol ou la spéciation du Cu sous peine de s’éloigner des

conditions in-situ.

Les conditions principales sont [132] :

- Les conditions et le temps d’entreposage peuvent affecter l’AE en augmentant l’activité de

certaines enzymes et en diminuant une autre [133]. Il est recommandé d’effectuer les essais

enzymatiques avec des échantillons frais.

- L’ajout de substrat en excès lors des essais enzymatiques afin d’obtenir un vitesse enzymatique

optimale. Bien que cela ne représente pas des apports réels, cela permet de comparer les

différentes AE les unes aux autres.

- Une température d’incubation optimale pour chaque enzyme, allant au-delà de 37°C et

permettant l’accélération des réactions. La chaleur augmente l’énergie cinétique de la réaction et

résulte à une augmentation des collisions entre le site actif des enzymes et le substrat. A basse

température, la réaction est donc plus lente. Dans la nature, les organismes ajustent les conditions

de leurs enzymes pour produire un taux optimal de la réaction. La sensibilité des enzymes à la

température peut varier selon la géolocalisation et selon la saison. Il est donc recommandé de

choisir des températures avoisinant celle de la période d’échantillonnage et de la saison.

- La mise en solution des échantillons de sol afin de faciliter le déplacement du substrat vers

l’enzyme, ainsi que pour certaines enzymes l’utilisation d’un mélangeur. Cela permet de briser

les particules et disperser les enzymes en évitant au maximum la lyse cellulaire et par

conséquence la libération d'enzymes intracellulaires. De plus, afin de veiller à ce que les essais

enzymatiques s’effectuent sur des fractions de sols consistantes, il est préalablement nécessaire

de passer les sols à travers un tamis de 2 mm.

38

- L’ajustement du temps d’incubation en fonction de la cinétique de production enzymatique.

Plus l’enzyme est incubée avec le substrat, plus la production de produit sera conséquente. Le

temps d’incubation et le temps des essais enzymatiques ne doivent être ni trop long, ni trop court.

En effet, toutes les toutes les protéines subissent une dénaturation, et donc une perte d'activité

catalytique avec le temps, résultant en une diminution du produit formé. Si le temps d’incubation

est trop long, l’activité mesurée pourrait être faible de manière erronée.

- L’ajustement du pH afin de maintenir l'activité d'une enzyme à son pH optimum. Le pH du sol

affecte l'activité des enzymes en raison de la sensibilité au pH des groupes fonctionnels d'acides

aminés. Cela altère les modifications conformationnelles et chimiques des acides aminés

essentiels pour la liaison et la catalyse [134]. Sans compter l’influence sur la concentration de

substrat en solution. Afin de palier à ce problème, l’utilisation de tampon ayant une valeur de pH

optimal pour la réaction enzyme-substrat est souvent préconisé dans la littérature. Cela permet

d’obtenir des réponses enzymatiques fortes [135]. Or, une variation de pH induite par l’utilisation

de tampon peut avoir une influence notable sur la spéciation du Cu en solution et sur les

caractéristiques physico-chimiques du sol.

Chaperon et al. 2007, ne tamponnent pas les échantillons pendant les essais enzymatique afin de

minimiser les effets sur la spéciation chimique des métaux et afin de mesure une réponse réel du

sol [19] tandis que Lessard et al. [136] notent que les AE dans l’eau déionisée ou dans un tampon

se comportent de manière similaire. Cela permettrait à l'échantillon de contrôler lui même le pH

de l'essai.

2.4.4 Limites des essais et mesures de précaution

L’écotoxicologie terrestre est souvent limitée par l’utilisation de sols contaminés artificiellement

[137]. En effet, les sols contaminés ex-situ ne subissent pas les différentes intempéries que

subissent les sols contaminés in-situ, les conditions optimales utilisées pour obtenir un potentiel

d’activité enzymatique sont rarement présentes dans les sols naturel. De plus, cela ne tient pas

non plus en compte les différentes relations entre les être vivants qui pourraient être de passage,

les mécanismes de transports subis par le cuivre dans une matrice beaucoup plus importante et

faisant partie d’un système écologique plus important (ex : la présence d’une rivière, la présence

39

de plantes...) et le vieillissement de la contamination. Toutefois, la difficulté lors de l’étude de

l’effet d’une contamination métallique en milieu viticole (ou agricole de manière général) est que

la plupart du temps, on est en présence d’une contamination multiple (e.g : contamination

organique à cause de l’épandage d’engrais), ce qui rend difficile l’interprétation des résultats et la

mise en relation de l’effet toxique à un contaminant en particulier. Un autre avantage de

l’utilisation de sols contaminés artificiellement est que chaque sol a subi le même traitement post

échantillonnage (même humidité, même quantité d’eau, même brassage...etc.), ce qui apporte une

certaine homogénéité expérimentale [7, 83].

Un autre aspect à considérer est la contamination artificielle à l’aide des sels métalliques solubles.

Par exemple l’utilisation du CuCl2 peut impacter les micro-organismes. En effet, une fois libéré

le chlore peut oxyder la matière organique inerte et donc avoir un impact sur les micro-

organismes. Cela à aussi pour effet d’augmenter la force ionique de la solution de sol et diminuer

le pH du sol affectant la biodisponibilité du métal et la réponse des micro-organismes. Afin de

pallier à ce problème, une lixiviation des sols est recommandée afin de se débarrasser du surplus

en chlore mais aussi en Cu tel que cela pourrait être le cas en conditions de terrain réelles [19].

La mesure de l’activité enzymatique reste une approche pragmatique c’est-à-dire que la

signification ne peut-être comprise qu’en connaissant le contexte du sol à l’étude [80]. En effet, à

cause de la complexité du sol, de ses propriétés physico-chimiques et des organismes vivants

qu’il abrite, il est difficile de connaître le mécanisme exact derrière la réponse mesurée. C’est

pour cela que l’approche basée sur le pourcentage d’activité enzymatique en fonction de la

concentration du Cu soluble se doit d’être couplée à une détermination des caractéristiques

physico-chimiques des sols étudiés. Cet outil permettrait d’intégrer l’hétérogénéité du sol dans

l’évaluation de la toxicité du Cu.

40

CHAPITRE 3 MÉTHODOLOGIE

Ce chapitre présente la méthodologie générale utilisée pour ce projet mais détaille aussi les

principales expériences nécessaires à la caractérisation physico-chimique des sols et aux essais

enzymatiques.

Les expériences s’articulent autour d’une méthodologie précédemment élaborée par Lessard et al.

(2014) pour le zinc [115, 138] mais appliquée au cas du Cu. Le but étant de tester la

méthodologie utilisée par ces auteurs pour le cas du Cu, qui est un métal divalent tel que le zinc.

Aussi les mêmes types de sols ont été échantillonnés (l’échantillonnage s’est effectué dans la

même zone géographique) et les mêmes 6 enzymes ont été sélectionnées. La figure 3.1 ci-dessous

fait état de l’approche méthodologique utilisée pour ce projet et les paragraphes suivants en font

une brève description.

Figure 3.1: Approche méthodologique

Génération des données EC50 pour le cuivre basées sur la diversité fonctionnelle enzymatique

Évaluation de l’impact des paramètres physico-chimiques des sols sur la distribution du Cu et sur l’activité enzymatique

Conduite des essais enzymatique en laboratoire

Contamination artificielle des sols au Cu

Échantillonnage des sols et caractérisation des propriétés physico-chimiques des sols

Échantillonnage des sols et caractérisation des propriétés physico

Validation des enzymes à utiliser lors des essais enzymatiques

41

Validation des enzymes à utiliser lors des essais enzymatiques

Une revue intensive de la littérature a été effectuée afin de vérifier si les 6 enzymes choisies par

Lessard et al. (2014) étaient aussi sensibles au Cu soit : l’invertase, l’uréase, la protéase,

l’arylsulfatase, la phosphatase et la β-glucosidase. Ces enzymes couvrent les cycles

biogéochimiques du sol et la plupart des ses fonctions importantes.

Échantillonnage des sols et caractérisation des propriétés physico-chimiques des sols

L’échantillonnage de 15 sols a été effectué selon des zones géographiques préétablies par

Lesssard et al. (2014) et récapitulées dans le tableau 3.1 ci-dessous (section 3.1.1). Les

caractéristiques physico-chimiques des sols telles que le pH, le profil métallique naturel du sol et

la capacité de rétention au champ ont été mesurées avant la contamination pour chaque sol. Trois

sols de vignoble ont été échantillonnés en parallèle afin de valider la méthodologie dans un

contexte viticole.

Contamination artificielle des sols au Cu

Les sols ont été préparés en paires : une partie contaminée artificiellement au Cu à l’aide de

chlorure de cuivre bi-hydraté (CuCl2H2O) et l’autre partie témoin à laquelle a été ajoutée la

quantité équivalente en chlore avec du chlorure du calcium bi-hydraté (CaCl2H2O) afin

d’obtenir la même concentration en ions chlorures que sa contrepartie contaminée au Cu. Les

concentrations de Cu ne sont pas les mêmes pour tous les sols. Cela permet d’obtenir un éventail

de concentration en Cu soluble. Les sols de vignobles ont été contaminés dans une plage de

concentration que l’on peut retrouver en moyenne dans les vignobles autour du globe (tableau

2.2).

Conduite des essais enzymatiques en laboratoire

Les essais enzymatiques ont été conduits de la même façon pour tous les sols dépendamment du

protocole spécifique à chaque enzyme énumérée plus haut. Les caractéristiques physico-

chimiques des sols mesurées à cette étape-ci sont beaucoup plus nombreuses : capacité tampon,

capacité d’échange cationique (CEC), carbone organique dissout (DOC), carbone organique total

(COT), mesure du pH, détermination de la concentration en Cu total et en Cu soluble. Ces

mesures permettront, entre autre, d’expliquer la spéciation du Cu mais aussi l’AE.

42

Évaluation de l’impact des paramètres physico-chimiques des sols sur la distribution du Cu

et sur l’activité enzymatique

Les paramètres physico-chimiques jouent un rôle essentiel sur la spéciation du Cu et sa toxicité

dans les sols. Cette évaluation est importante afin de bien comprendre les variables qui sont les

mieux corrélées à la concentration de Cu soluble dans le sol et à l’activité enzymatique. Cette

étape a permis de dégager les paramètres les plus influents.

Génération des données EC50 pour le cuivre basées sur la diversité fonctionnelle

enzymatique

La génération des EC50 se fait sur la base du pourcentage des AE mesurées entre le sol témoin et

le sol contaminé si une différence significative est observée et ce pour les enzymes s’y prêtant

bien. Les %AE seront tracés en fonction de la concentration de Cu soluble, afin d’en extraire

l’indicateur.

Les sections 3.1 à 3.4 font références aux Annexes A1 à A16 dans le même ordre que lesdites

sections.

3.1 Échantillonnage et contamination

3.1.1 Échantillonnage

Les 15 sols ont été sélectionnés afin de représenter les types de sols retrouvés dans les régions

tempérées du Québec (voir tableau 3.1), tel que l’indique Lessard et al. (2014). Les 15 paires

d’échantillons de sols ont été récoltées autour de pylônes électriques galvanisés situés dans la

grande région métropolitaine de Montréal. Chaque échantillon a été prélevé entre 0 et 10 cm de

profondeur après avoir enlevé la partie visible de la végétation. Le zinc dans le sol qui pourrait

provenir des structures galvanisées à tendance à rester sous la base des pylônes étant donné sa

faible mobilité. (Annexe A1)

En parallèle, l’échantillonnage de 3 sols de vignoble dans la région de l’Estrie a été effectué de

façon similaire. 3 échantillons ont été prélevés à la surface du sol (0-10cm) à 30 cm des vignes

dans 3 zones différentes de chaque vignoble. Les 3 échantillons ont ensuite été mélangés dans la

même proportion afin de donner un échantillon unique pour chacun des 3 vignobles. Cela permet

de prendre en compte l’hétérogénéité du sol des vignobles. (Annexe A2)

43

Tous les sols ont été entreposés dans des seaux en plastique dans un frigo à 4 degrés et les

traitements et analyses physico-chimiques menées dans un délai ne dépassant pas 8 mois.

Normalement, il est conseillé d’effectuer les analyses dans les 6 mois suivant l’échantillonnage

[139], mais il a fallut faire un compromis faute de limites de ressources (humaines et

temporelles). Chaque sol a été tamisé à l’aide d’un tamis de 2 mm.

Tableau 3.1: Localisation des zones d’échantillonnage des 15 sols autour des structures

galvanisées et des 3 sols de vignoble

Sols Localisation

AR Rapide Blanc

11R Mascouche 2 (campagne rte 125)

7R St-Jean

10R Ste-Julienne (Rawdon)

15R Châteauguay

6R St-Rémi

4R Mascouche 1 (Limoges)

9R Joliette

14R Montréal

3R Pointe-aux-trembles

8R Laprairie

24R Lac Henri

BR Rapide Blanc

5R Laval (Bertin, Tourigny)

22R Chomedey (Cléroux)

1M Vignoble Saint-Rémi (Saint-Rémi)

2M Vignoble Morou (Napierville)

3M Vignoble du marathonien (Havelock)

3.1.2 Contamination

Chaque sol a été séparé en deux catégories, soit les sols témoins et les sols contaminés au Cu.

Tous les sols ont été contaminés de la même façon mais à des concentrations différentes comme

le témoigne le tableau 3.2 ci-dessous (en ppm, soit mg de Cu par kg de sol sec) , considérant la

44

perte de Cu lors de la lixiviation. Les sols de la catégorie « contaminée » ont reçu 50 ml de

solution de CuCl2H2O dilué dans de l’eau déionisée, équivalent à la concentration visée de Cu.

Il en va de même pour les sols de la catégorie « témoin » mais avec une solution de CaCl2H2O

dilué dans de l’eau déionisée, équivalent à la concentration en ion chlorure de sa solution sœur de

la catégorie contaminée.

Tableau 3.2: Planification de la contamination des séries de sol

Une fois mélangé à l’aide d’une spatule en téflon, les sols sont transférés dans des bocaux en

verre et agités à l’aide d’un agitateur rotatif pendant 24h. Les sols ont été ensuite soumis à 3

cycles de mouillage/séchage afin de simuler le vieillissement de la contamination, amenant les

sols à 92% de leur capacité de rétention au champ (CRC) au début de chaque cycle. La lixiviation

permet de se débarrasser du surplus d’anions occasionné par la contamination [19], dans le cas

présent, l’anion en excès est le chlorure (Cl-), grâce à une quantité d’eau déionisée correspondant

à la CRC du sol en question. Les sols ont été placés dans des tubes en acier inoxydables dont

l’une des extrémités était fermée par une membrane géotextile afin de conserver le sol. Les

colonnes ainsi préparées ont ensuite été placées sur un lit de sable d’Ottawa, assez épais pour

éviter que l’eau qui s’écoule ne stagne dans le sol et soit complétement drainée. Les échantillons

ont été rééquilibrés à température pièce dans des pots en verre à 60% de leur CRC pendant une

semaine avant le début des analyses afin de stabiliser l'activité microbienne. Au total, le

processus de contamination suit un cycle de 30 jours. Les sols des deux catégories ont été traités

de la même manière par souci de d’analyse comparative entre les sols contaminés au Cu et les

sols témoins. (Annexe A3)

Série Sols concernés

Début contamination

Fin contamination

Concentration initiale

1 7, 11, A 14 janvier 2016 16 février 2016 750 ppm 2 6, 10, 15 03 mars 2016 05 avril 2016 750 ppm 3 4, 9, 14 17 mars 2016 19 avril 2016 650 ppm 4 3, 8, 24 31 mars 2016 03 mai 2016 900 ppm 5 5, 22, B 14 avril 2016 17 mai 2016 800 ppm 6 1M, 2M, 3M 28 avril 2016 31 mai 2016 300 ppm

45

3.2 Analyses physico-chimiques

Les analyses physico-chimiques telles que la CRC, la granulométrie, la détermination du pH et

du background chimique des sols, ont été effectuées avant le processus de contamination et ont

permis d’obtenir un portrait global de la composition initiale des sols. Seule la détermination du

pH a été effectuée aussi post contamination, le pH étant un élément clé dans la spéciation du Cu

et ainsi de la toxicité de ce dernier. Toutes les analyses ont été menées en triplicata et la verrerie

utilisée a été lavée préalablement au bain acide HNO3 10% et rincée 3 fois à l’eau distillée et 3

fois à l’eau déionisée avant chaque analyse. Cette procédure est importante car le trempage dans

un bain acide permet de se débarrasser de résidus métalliques qui pourraient venir fausser les

résultats.

3.2.1 Capacité de rétention au champ et granulométrie

La CRC permet de déterminer la capacité du dol à retenir l’eau, capacité étroitement reliée à la

taille des pores des particules présentes. Tel que mentionné dans la section 2.3.1, la porosité du

sol est un facteur déterminant pour le maintien de la santé des micro-organismes, un stockage

trop important ou trop faible peut entrainer un impact négatif. La CRC est mesurée après avoir

suspendu le sol en solution pendant 30 minutes puis filtré par gravité jusqu’à ce que visuellement

l’eau semble s’être totalement écoulée sans que le sol commence à sécher. La teneur en eau du

sol a été alors mesurée en prenant le poids humide vs le poids sec (séché à 105°C pendant

16h)[140]. (Annexe A4)

La texture (% de sable, % de limon, % d'argile) a été déterminée par analyse hydrométrique au

département de géologie de l’Université de Montréal.

3.2.2 Détermination du background chimique des sols et de la concentration

total en Cuivre

Les concentrations totales des éléments chimiques présents dans les sols ont été évaluées suivant

la méthode de digestion à l’eau régale (digestion acide) des sols afin de les mettre en solution et

de les analyser par ICP- MS. Le sol préalablement séché a été mélangé à un ratio 4 :10 d’acide

nitrique 50% et chlorhydrique 20%, chauffé à 95°C pendant 30 min puis filtré et jaugé à 100 ml

avec de l’eau déionisée [141]. Ont été mesurées les concentrations des éléments suivants :

46

Sodium (Na), Magnésium (Mg), Aluminium (Al), Potassium (K), Calcium (Ca), Manganèse

(Mn), Cobalt (Co), Nickel (Ni), Cuivre (Cu), Zinc (Zn), Rubidium (Rb), Strontium (Sr), Argent

(Ag), Cadmium (Cd), Baryum (Ba), Plomb (Pb), Chrome (Cr), Fer (Fe), Arsenic (As), Sélénium

(Se). (Annexe A5)

Les concentrations totales en Cu des séries de paires de sols contaminés/non contaminés ont été

déterminées en utilisant la méthode de digestion à l’eau régale mais analysées par spectrométrie

d’absorption atomique à flamme (FAAS : Flame Atomic Absortpion Spectrometry) au

département de la science des ressources naturelles de McGill.

3.2.3 Détermination du pH et de la capacité tampon

Le pH, facteur essentiel pour la conduite des essais enzymatiques et pour la spéciation du Cu

dans le sol, a été mesuré à deux reprises : avant le processus de contamination afin d’évaluer la

valeur du pH naturelle des sols et pendant la essais enzymatiques suite à la contamination. Cela

permet d’évaluer la potentielle chute de pH pour certains sols mais aussi d’expliquer le

concentration de Cu soluble pour d’autres. Le pH de la paire de sol témoin permet aussi de

témoigner de l’influence des ions chlorures sur la chute éventuelle de pH. 10 g de sol, séché à

l’air libre pendant la nuit, ont été mis en suspension dans 10 ml d’eau déionisée. La solution ainsi

préparée a été agitée pendant 1 minute à l’aide d’un agitateur VORTEX et laissée au repos

pendant une heure afin de permettre au aux particules de sol de se stabiliser. Le pH a été mesuré

avec un pH-mètre (Accumet, modèle 25, pH/ionmeter) et une électrode de verre. (Annexe A6)

La capacité tampon est la capacité du sol à résister au changement de pH, soit la quantité d'acide

que l'on doit ajouter à un sol pour que son pH diminue d'une unité par rapport à son pH initial.

Afin de la mesurer, 5 g de sol ont été placés dans un tube à centrifuger auquel sont ajoutés 10 ml

de solutions de concentrations croissantes d'acide nitrique (0.0200 M, 0.0500 M, 0.100 M,

0.200 M). Après avoir été agitées pendant 30 min et laissées reposer pendant 24 h, celle-ci a donc

été analysée par la mesure du pH [142]. (Annexe A7)

3.2.4 Détermination de la CEC

La CEC permet d’estimer la quantité de cations échangeables dans l’échantillon de sol, c’est à

dire la capacité du sol à retenir ou libérer le Cu. Après avoir inséré 4 g de sol dans un tube à

centrifuger, l’échantillon subit 3 lavages répétés 3 fois consécutivement [143] : un lavage à

47

l’acétate de sodium (NaOAc) afin d’enlever les cations échangeables adsorbés sur le sol et les

remplacer par le sodium (Na+) ; un lavage à l’alcool isopropylique pour enlever l’excès de

sodium ; et enfin, un lavage à d’acétate d’ammonium (NH4OAc), afin de récupérer le sodium en

le remplaçant par l’ion ammonium (NH4+). Le sodium qui a occupé les sites vacants des cations

échangeables est ensuite dosé par absorption atomique au département des génies Civil,

Géologique et des Mines (CGM) de l’École Polytechnique de Montréal. (Annexe A8)

3.2.5 Détermination de la COD

La matière organique dissoute (COD) est définie comme la matière organique en solution de

diamètre inférieur à 0,45 µm, et serait la fraction la plus active de la matière organique totale.

Elle joue un rôle important dans plusieurs processus clé du sol.

La DOC a été extraite à l’eau étant donné que l’appareil utilisé, un TOC-5000A de la marque

Shimadzu, est très sensible aux composés halogènes, ce qui ne permet pas d’utiliser des solutions

salines fortement ioniques. Ces dernières auraient permis d’extraire la matière organique présente

dans la solution de sol et une fraction additionnelle de matière organique désorbée et/ou dissoute.

Ces deux fractions représentent la matière organique facilement disponible aux hétérotrophes du

sol. Quoiqu’il en soit, une extraction à l’eau est une technique acceptable pour extraire la matière

organique en solution [144]. 3 g de sol et 30 ml d’eau déionisée ont été ajoutées dans un tube à

centrifuger, agités pendant 30 min à l’aide d’un agitateur WRIST ACTION, et centrifugés 10 min

à 3 000 g (Centrifugeuse Beckman, rotor model J2-21). La solution a été ensuite filtrée sur un

filtre en polycarbonate (Millipore, Filtre isopore, HTTP04700) préalablement conditionné en

passant 1 L d’eau déionisée à travers celui-ci. Le filtrat ainsi obtenu a été analysé avec un TOC-

5000A de la marque Shimadzu. (Annexe A9)

3.2.6 Détermination de la concentration en cuivre soluble

La détermination de la concentration en Cu soluble peut s’effectuer de deux manières différentes,

soit par extraction simple ou par extraction séquentielle. Cette dernière, bien qu’attrayante, n’est

pas une méthode très sélective [145] puisque après chaque séquence d’extraction, le métal se

redistribue entre les différentes composantes du sol et il n’est donc pas possible de corréler

chaque extraction à un bassin spécifique de partition du métal. Les extractions uniques à l’aide de

solutions salines neutres, par opposition à l’utilisation d’eau déionisée pure, permettent de

48

maintenir une force ionique minimale et constante afin d’utiliser une extraction plus

représentative des solutions de sol in situ qu’une extraction à l’eau. L’absence de « contre-ions »

dans l’eau déionisée produit des variations dans la désorption du métal et affecte la solubilité de

la MO ainsi que celles des complexes métalliques associés à la MOD[55].

Le Cu total a donc été extrait à l’aide d’une solution saline neutre (0,01 M KNO3) en plaçant

12,5 g de sol et 25 ml de KNO3 0,01 M dans un tube à centrifuger et agité pendant 16 h à l’aide

d’un agitateur WRIST ACTION [118]. Ensuite, la solution a été centrifugée à 10 000 g pendant

10 min et filtrée sur un filtre de 45 µm en PVDF, la filtration permet de séparer les particules de

sol des composantes dissoutes. La concentration en Cu soluble totale a été alors mesurée par

FAAS au département des génies Civil, Géologique et des Mines (CGM) de l’École

Polytechnique de Montréal. (Annexe A10)

3.2.7 Détermination de la COT

La valeur du COT (Carbone Organique Total) indique la teneur en composé organique, sans

aucune indication sur la nature des composés organiques. L'analyse du COT se fait suite à

l’élimination du CO2 des carbonates par un traitement à l'acide chlorhydrique et chauffage à

1 400°C de l’échantillon ainsi traité. Le carbone présent dans le sol est oxydé en dioxyde de

carbone. La quantité de gaz carbonique dégagée a été mesurée avec un analyseur de Carbone

LECO (détection infrarouge). Cette analyse a été effectuée au département des génies Civil,

Géologique et des Mines (CGM) de l’École Polytechnique de Montréal.

3.3 Essais enzymatiques

Tous les temps d’incubation des essais enzymatiques se limitent à 2 h afin d’uniformiser le temps

d’incubation et faciliter la conception expérimentale. Aussi chaque essai se fait en triplicata avec

deux contrôles (dans lesquels le substrat est ajouté après l’incubation). Certains essais sont plus

complexes que d’autres et nécessitent plus d’étapes, ce qui expliquera plus tard la variabilité

élevée de certains résultats.

L'activité d'invertase a été mesurée en mélangeant 1 g de sol avec 3 ml d'eau déionisée et 3 ml de

substrat, soit une solution de sucrose 1,2%. Après une incubation de 2 h à 50°C, les échantillons

ont été centrifugés à 15 000 g pendant 2 min. Par la suite, 250 µL de surnageant pour chaque

49

échantillon a été prélevé et dilué dans 9,75 ml d’eau déionisée. 1 ml de cette dilution a été traité

avec trois réactifs (cyanure de potassium, hexacyanoferrate de potassium (III) et sulfate

d'ammonium ferrique), afin de former un complexe bleu d'hexacyanoferrate de fer (II) et incubé

15 min dans un bain d’eau bouillante. L'absorbance a été lue à 690 nm avec un lecteur

multifonctions de microplaques (GENios, Tecan) contre le blanc et convertie en concentration de

glucose équivalent grâce à la courbe d’étalonnage des solutions standards (0 à 15 µg de glucose)

[146]. (Annexe A11)

L'activité de l’uréase a été mesurée en mélangeant 1 g de sol avec 4 ml d'eau déionisée et 500 µl

de substrat, soit une solution d’urée (720 mM). Après une incubation de 2 h à 37°C, 6 ml de

solution de chlorure de potassium 1 M a été ajoutée aux échantillons, suivi d’une agitation de

30 min sur un agitateur rotatif à 100 rpm. Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 15 000 g

pendant 2 min. Le surnageant a été transféré quantitativement dans une microplaque où les

réactifs (mélange de nitroferricyanure de sodium et dichloroisocyanurate de sodium) ont été

ajoutés pour colorer les échantillons. L'absorbance a été lue à 685 nm avec un lecteur

multifonctions de microplaques (GENios, Tecan) contre le blanc et convertie en concentration

d’ammonium grâce à la courbe d’étalonnage des solutions standards (0 à 25 µg NH4+ -N · ml-1)

[146]. Pour cette enzyme, la solution d’urée qui aurait du être préparée avec 1,08 g d’urée afin de

donner un concentration de 720 mM. Une erreur de frappe a fait que la solution d’urée a été

préparée avec 0,08 g d’urée à la place de 1,08 g. Il se peut que les résultats en soient affectés

puisque la vitesse enzymatique optimale dépend de la saturation en substrat. (Annexe A12)

L'activité de la protéase a été mesurée en mélangeant 1 g de sol avec 5 ml d'eau déionisée et 5 ml

de substrat, soit une solution de caséine (2% w/v). Après une incubation de 2 h à 50°C dans un

agitateur rotatif, 5 ml de solution de TCA 0,92 M ont été ajoutés aux échantillons. Les

échantillons ont ensuite été centrifugés à 15 000 g pendant 2 min. Le surnageant a été transféré

quantitativement dans une microplaque où les réactifs (mélange d’un complexe alcalin et de

phénol Folin Ciocalteu) ont été ajoutés pour colorer les échantillons. L'absorbance a été lue à

700 nm avec un lecteur multifonctions de microplaques (GENios, Tecan) contre le blanc et

convertie en concentration de tyrosine grâce à la courbe d’étalonnage des solutions standards (0 à

1500 µg de tyrosine) [146]. (Annexe A13)

50

L'activité de l’arylsulfatase a été mesurée en mélangeant 1 g de sol avec 4 ml d'eau déionisée,

équilibré pendant 30 min à 37°C. Puis 1 ml de substrat, soit une solution de potassium-p-

nitrophenylsulfate (0,02 M), a été ajoutée aux échantillons. Après une incubation de 2 h à 37°C,

la réaction a été stoppée en ajoutant 1 ml de solution de chlorure de calcium (0,92 M) et 10 ml de

NaOH (0,5 M). Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 15 000 g pendant 2 min. Le

surnageant a été transféré quantitativement dans une microplaque et l'absorbance a été lue à

420 nm avec un lecteur multifonctions de microplaques (GENios, Tecan) contre le blanc et

convertie en concentration de p-nitrophenol (pNP) grâce à la courbe d’étalonnage des solutions

standards (0 à 500 µg de pNP) [146]. (Annexe A14)

L'activité de la phosphatase et de la β-glucosidase ont été mesurées selon la même méthode : en

mélangeant 1 g de sol avec 4 ml d'eau déionisée et 1 ml de substrat, soit respectivement une

solution de disodium 4-nitrophény-phosphate (11,5 mM) et une solution de disodium p-

nitrophényl-β-D glucopiranoside (25 mM). Après une incubation de 2 h à 37°C, la réaction a été

stoppée en ajoutant 1 ml de solution de chlorure de calcium (0,92 M) et 4 ml de NaOH (0,5 M).

Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 15 000 g pendant 2 min. Le surnageant a été

transféré quantitativement dans une microplaque et l'absorbance a été lue à 420 nm avec un

lecteur multifonctions de microplaques (GENios, Tecan) contre le blanc et convertie en

concentration de p-nitrophenol (pNP) grâce à la courbe d’étalonnage des solutions standards (0 à

100 µg de pNP) [146]. (Annexe A15 et A16)

3.4 Planification

La planification des analyses physico-chimique et des essais enzymatiques s’étale sur 1 semaine

tel que le montre l’échéancier le tableau 3.3. La raison pour laquelle les analyses et les essais sont

aussi rapprochées temporellement vient du fait que l’on veut avoir un portrait de l’activité

enzymatique en lien avec les caractéristiques physico-chimiques sans que l’activité chimique

change au cours du temps. Comme cela n’était matériellement pas possible, il a fallut faire un

compromis entre le temps et la représentativité. Toutes les séries de sols ont suivi le même

échéancier.

51

Tableau 3.3: Planification des analyses physico-chimiques et des essais enzymatiques

Jour Expérience Protocole

Lundi Contamination de sol au cuivre à des fins d’essais enzymatiques PE72-B

4 semaines plus tard

Mercredi Détermination de la capacité́ tampon d'un sol PE72-C

Mesure de l’activité de l’invertase dans un sol PE72-D

Détermination du poids sec d’un sol PSO-A7

Jeudi Mesure de l’activité de l’uréase dans un sol PE72-E

Mesure de l’activité de la protéase dans un sol PE72-F

Vendredi Mesure de l’activité de l’arylsulfatase dans un sol PE72-G

Mesure de l’activité de la phosphatase dans un sol PE72-H

Mesure de l’activité de la B-glucosidase dans un sol PE72-I

Lundi Détermination de la Capacité d’Echange Cationique (CEC) PE72-J

Détermination du poids sec d’un sol PSO-A7

Mardi Digestion acide à l’eau régale pour quantifier la concentration

PE72-K

Extraction de la matière organique dissoute (DOC) dans des sols à l’eau

PE72-L

Mercredi

Digestion acide à l’eau régale pour quantifier la concentration

PE72-K

Détermination du pH d’un sol à l’aide d’un pH-mètre PSO-A5

Préparation des échantillons pour la COT -

Extraction d’une solution de sol pour analyse du cuivre total en

PE72-M

3.5 Courbe de concentration-réponses pour l’extraction d’une EC50

Afin d’obtenir les EC50 pour chaque enzyme, seules les paires sols présentant une différence

significative (test de Student appariés) entre la concentration moyenne de produit obtenu pour le

sol de référence et la concentration moyenne de produit obtenu pour le sol contaminé, ont été

retenus. Les pourcentages d’activité enzymatique nécessaires à l’obtention des EC50 ont été

obtenus à partir du rapport entre la concentration moyenne de produit dans le sol contaminé et

celle dans le sol de référence selon l’équation (6) ci-dessous :

52

%𝐴𝐴𝐸𝐸 = [𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝]𝐶𝐶/[𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝]𝑇𝑇 × 100 (6)

Les %AE de chaque sol ont été tracés en fonction de la fraction soluble du cuivre des sols

contaminés, et ce pour les enzymes qui s’y prêtent. Plusieurs modèles sont utilisés dans la

littérature en fonction de l’allure de la distribution des résultats : le modèle linéaire, le modèle

logistique [19], les modèles hyperboliques d’inhibition partielle ou d’inhibition totale (basé sur la

cinétique enzymatique) adaptés aux conditions hétérogènes du sol [115, 147], le modèle

sigmoïdal [148], le modèle quadratique [149-151], etc… Après plusieurs tests, le modèle

hyperbolique d’inhibition partielle semblerait être le plus adapté aux résultats obtenus dans le

cadre de ce projet. L’équation et la Ec50 de ce modèle sont décrits par les équations (7) et (8).

𝑦𝑦 = 𝑐𝑐∗(1+𝑎𝑎∙exp(𝑥𝑥))(1+𝑏𝑏∙exp(𝑥𝑥))

(7)

Où y est le pourcentage d’activité enzymatique (%AE) et x la concentration en cuivre soluble, et

la Ec50 s’obtient selon l’équation ci-dessous :

𝐸𝐸𝐶𝐶50 =(1−𝑎𝑎 𝑏𝑏� )

(𝑏𝑏−𝑎𝑎) (8)

Les coefficients a, b et c doivent être positifs et b >a.

Le coefficient de détermination R2 a été enregistré pour chaque enzyme viable de façon à

quantifié la force de la régression non linéaire et de vérifier si celle-ci est biologiquement

pertinente, c’est-à-dire que le coefficient de détermination R2 présente une valeur supérieure à

0,50 (Scherrer, 2009 : rapporté par Lessard et al., 2014)[138]. Le coefficient du critère

d’information d’Akaike (Akaike information criterion coefficient (AICC)) a permis de mesurer

statistiquement la qualité de l’ajustement du modèle et la normalité des résidus et l’homogénéité

des variance ont été testés en parallèle. Les courbes de concentration-réponse ont été crées avec

le logiciel JMP 12.2.0 de l’institue SAS Inc.

3.6 Analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du logiciel JMP 12.2.0 de l’institut SAS Inc.

La comparaison des résultats des propriétés physico-chimiques et des activités enzymatiques des

sols a été effectuée par paires (sol contaminé vs sol témoin) avec le test t de Student afin

d’évaluer les résultats de deux séries de mesures faites sur les mêmes unités statistiques. Ce test a

53

permis pour l’activité enzymatique d’écarter les sols dont la différence des réponses entre le sol

contaminé (C) et le sol témoin (T) n’était pas significative, et donc qu’un effet n’est pas

statistiquement observable.

Une analyse de régression a été utilisée pour déterminer la corrélation entre la concentration en

Cu soluble des différents sols et les différentes propriétés chimiques qui pourraient expliquer la

spéciation du cuivre en fonction des différents facteurs tels que le pH, la MO, etc… Aussi des

régressions ont été effectuées entre la concentration de Cu soluble et l’activité enzymatique.

Enfin les régressions ont aussi servi à corréler l’activité enzymatique aux différentes propriétés

physico-chimiques. Les données aberrantes ont été écartées des différentes régressions afin

d’améliorer l’ajustement. La valeur R2 obtenue fait foie de la qualité de l’ajustement des analyses

de régressions et est pertinente lorsque supérieure à 0,5. De plus, l’homogénéité des variances est

acceptée lorsque la probabilité des résultats assume l’hypothèse nulle H0 (la variation au sein

d’un groupe de moyenne est celle attendue) lorsque la p-value est inférieure à 0,05 et la normalité

des résidus est supposée lorsque la p-value est supérieure à 0,05 (confirme l’hypothèse nulle H0 :

les données proviennent d’une distribution normale). Les niveaux significatifs de α sont fixés à

*P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001. Lorsque des analyses de régressions bivariées ne sont plus

suffisantes pour expliquer les corrélations entre les variables des sols, des analyses mutlivariées

ont été effectuée.

Une fois que les postulats statistiques cités plus haut ont été validés, des analyses de variances

(ANOVA) et des tests de comparaisons pariées multiples Tukey-HSD ont été effectués afin de

déterminer les différences significatives entre les valeurs moyennes de Cu soluble, les propriétés

physico-chimiques et les activités enzymatiques en fonction des sols. Cela permet aussi

d’observer l’effet significatif de la dépendance de certaines variables par rapport à d’autres. Les

ANOVA sont effectués entre les sols contaminés et entre les sols témoins. Par la suite, une

analyse de composantes principales (ACP) a été réalisée afin de ressortir le nombre de

composantes principales (CP) qui expliquent la variance totale de l’ensemble des données et et

identifier les plus influentes. Le nombre de composantes principales correspond au nombre de

variables entrées dans l’ACP (pH, CEC, réponses enzymatiques…). Les composantes principales

sont une combinaison de coordonnées des variables d’entrée qui ont un poids, soit la corrélation

entre la variable et le facteur (la composante principale). Ces poids servent à interpréter le degré

de correspondance entre la variable et le facteur. Plus le poids est élevé, plus la variable est

54

représentative du facteur. Le coefficient de Cronbach α ne doit pas dépasser le seuil

d’acceptabilité de consistance interne de l’ensemble des données, soit α = 0,7.

55

CHAPITRE 4 ÉLABORATION D’UN INDICATEUR GLOBAL

D’ÉCOTOXICOLOGIE TERRESTRE

Le chapitre 4 présente les résultats obtenus pour les caractéristiques physico-chimiques des 15

paires de sols échantillonnés et pour les essais enzymatiques dans le but de développer des EC50

pour les différentes enzymes sélectionnées.

L’unité « ppm » pour les concentrations Cu total et le Cu soluble est utilisée dans le texte au lieu

de « mg de Cu par kg de sol sec » afin d’alléger la lecture. Aussi, le terme général phosphatase

est employé pour parler de la phosphatase acide.

4.1 Caractérisation générale des sols étudiés

4.1.1 Profil physico-chimique des sols échantillonnés pré-contamination

Le profil des concentrations bruit de fond métalliques du sol (voir Annexe B1) présente pour

presque tous les métaux des valeurs en deçà des seuils de concentrations A (concentration bruit

de fond) établies par la politique de protection des sols et de réhabilitation des terrains

contaminés du MDDELCC. Les exceptions concernent les concentrations faisant partie du seuil

B (seuil de concentration pour les terrains à vocation résidentielle, récréative ou institutionnelle),

tel que le sol 8 et le sol 14. La concentration en bruit de fond en Cu des sols varie entre 4 et 53

ppm, soit respectivement le sol B (sableux) et le sol 14 (argileux). Une autre particularité à retenir

est la concentration en calcium, indiquant si un sol est calcaire ou non. Les sols 5, 14, 8 et 6 ont,

par ordre décroissant, une concentration plus importante de calcaire que les autres sols alors que

le sol B, 10 et 24 ont les concentrations les plus faibles (de façon similaire). Les concentrations

en Cu des sols calcaires sont plus élevées que celles des sols non calcaires. De plus, les sols

calcaires exhibent des concentrations bruit de fond plus importantes. Le tableau (Annexe B1) fait

état des concentrations en nutriments (Na, K, Mg) qui corrèlent bien avec la nature calcaire des

sols.

Les pH des 15 sols mesurés avant la contamination sont reportés dans le tableau 4.1 afin

d’évaluer par la suite si la chute de pH est entièrement attribuée à l’addition de Cu ou si

l’addition de CaCl2 dans les sols témoins a aussi eu une influence. La plus petite valeur de pH est

56

mesurée dans le sol 11 et la plus grande dans le sol 5; ces sols sont ainsi le moins et le plus

calcaire, respectivement.

Tableau 4.1: Mesures du pH enregistrée dans les 15 sols échantillonnés

4.1.2 Profil physico-chimique des sols échantillonnés post-contamination

Tel que le montre le tableau en annexe (Annexe B2), on remarque que les sols témoins ont vu

leur concentration de Cu total chuter de quelques unités par rapport aux concentrations avant la

contamination, alors que pour d’autres c’est le contraire. Par exemple, le sol 11 a vu passer sa

concentration de 8 ppm à 0 ppm, cela est du en partie à cause de son pH faible qui augmente la

solubilité des métaux et leur mobilité. Le sol 11 est aussi un sol très sableux, qui retient donc

moins les métaux dans le sol et permet leur transition vers les couches plus profondes du terrain.

La concentration introduite étant 750 ppm, la concentration suite à la lixiviation de 666 ppm.

Dans les sols plus argileux ou présentant une teneur élevée en MO (matière organique) et en

calcaire, les concentrations de Cu sont prédictibles, tel que le sol 14 avec une concentration

introduite de 650 ppm et une concentration mesurée de 698 ppm (incluant les concentrations de

bruit de fond déjà présente) suite à la lixiviation. Avec un pH (7,74 ± 0,01) de départ assez élevée

ID pH

7 7,47 ± 0,05 11 5,07 ± 0,04 A 5,48 ± 0,03 6 7,7 ± 0,05 10 6,16 ± 0,24 15 6,3 ± 0,05 4 6,38 ± 0,07 9 7,64 ± 0,12 14 7,74 ± 0,01 3 7,17 ± 0,01 8 7,26 ± 0,05 24 6,13 ± 0,42 5 8,02 ± 0,11 22 7,74 ± 0,05 B 5,55 ± 0,01

57

et présentant les teneurs en MO et en calcium les plus élevées de tous les sols. Aussi, les sols

présentant une plus forte teneur en calcaire présentent des capacités tampon plus élevées que les

autres sols. On remarque que la chute de pH entre le sol initial et les sols amendés est plus faible

dans ces sols, sauf pour le sol 10 qui est un sol plus sableux. Tel qu’en témoigne le tableau 4.2 ci-

dessous, les paires de sols échantillonnés présentent une grande variabilité de propriétés physico-

chimiques.

58

Tableau 4.2: Informations statistiques principales des propriétés physico-chimiques des 15 paires de sols (voir Annexe B2 pour plus de

détails)

pH COT CEC Capacité tampon COD Granulométrie (%) Cu

Total Cu

Soluble

g/kg sol sec

CEC meq/100g de résidu

sec

cmol H+/kg sol sec par unité pH

mg C\L Sables Limons Argiles (ppm) (ppm)

Sols

témoins

(T) (n=15)

Moyenne 6,39 23,39 27,00 7,22 0,08 66,2 17,4 16,3 20 0,02

Écart-type 1,22 12,69 11,45 3,23 0,05 19,1 9,6 12,1 17 0,02

Maximum 7,71 54,90 50,84 14,24 0,20 96,3 34,4 42,1 59 0,06

Minimum 4,72 0,90 4,10 3,00 0,01 38,6 1,7 2,0 0 0,00

Sols

contaminés

(C) (n=15)

Moyenne 6,17 23,13 26,60 7,13 0,11 66,2 17,4 16,3 728 19,39

Écart-type 1,43 11,90 10,71 2,35 0,07 19,1 9,6 12,1 119 54,93

Maximum 7,87 51,20 47,89 12,33 0,24 96,3 34,4 42,1 945 221,90

Minimum 4,18 0,50 4,16 4,14 0,02 38,6 1,7 2,0 438 0,06

59

Les sols contaminés (C) et témoins (T) affichant des valeurs très similaires, seules les

caractéristiques des sols contaminés seront présentées. Le pH des sols varie de acide à neutre,

entre 4,18 et 7,87 avec une moyenne de 6,17. La capacité tampon varie entre 4,14 et 12,33 cmol

H+/kg sol sec par unité pH avec une moyenne de 7,13 cmol H+/kg sol sec par unité pH. La COT

varie entre 0,50 et 51,20 g/kg sol sec avec une moyenne de 23,313 g/kg sol sec témoignant d’une

large fourchette de MO qui permettra d’expliquer la spéciation du Cu. La texture varie

significativement et couvre toute les combinaisons possibles : argileux (1 sol), loam argileux (1

sol), loam (3 sols), loam sablo-argileux (1 sol), loam sableux (4 sols), sable (4 sols) et sable

loameux (1 sol). Le loam est un sol composé de moins de 52 % de sable, 28 à 50 % de limon et

de 7 à 27 % d'argile qui est très utile en agriculture, à la fois drainant et conservant bien

l’humidité. Selon les proportions on parle de loam sableux, limoneux ou argileux. On remarque

ici l’absence de sol loam limoneux. Rien qu’en se basant sur la texture des sols, on s’attend à ce

que les propriétés physico-chimiques diffèrent beaucoup d’un sol à l’autre, ne permettant pas de

les classer par catégorie. Tel que vu à la section 2.3.1, la texture du sol et la porosité (influencée

par la texture du sol) sont des propriétés du sol qui vont non seulement avoir une influence sur les

autres propriétés mais aussi sur la distribution et l’activité des micro-organismes dépendamment

du traitement que le sol subit.

Les propriétés physico-chimiques présentées en Annexe B2 démontrent la grande variabilité des

15 sols étudiés et vont permettre d’expliquer la spéciation chimique du Cu ainsi que la toxicité de

celui-ci sur l’activité enzymatique pour les 6 enzymes sélectionnées. On observe des différences

entre les caractéristiques physico-chimiques des sols contaminés et des sols témoins regroupés

par paires. Bien que significativement différentes pour la plupart, les valeurs restent

quantitativement assez semblables afin de pouvoir les comparer en paires. Les variations des

propriétés physico-chimiques peuvent être attribuable à l’hétérogénéité de la matrice du sol tel

qu’expliqué dans la section 2.3.1.

De manière générale, on remarque une chute de pH de 0,03 à 1,40 pour la plupart des sols par

rapport au pH initial (tableau 4.1) pour les sols témoins et une chute de pH plus importante pour

les sols contaminés (jusqu’à 2). La seule exception est le sol 14 dont le pH a légèrement

augmenté de 0,1 unité attribuable à une capacité tampon très élevé et une forte teneur en MO. Les

60

sols dont le pH a très peu chuté sont des sols donc la capacité tampon est généralement élevée et

une CEC forte. Certains sols ont une faible diminution de pH associée à une forte capacité

tampon mais une CEC plus faible.

Lors du traitement de l’analyse statistique, le coefficient de détermination R2 a été obtenu lors des

régressions linéaires entre les propriétés physico-chimiques afin de quantifier la force de

régression et d'identifier lesquelles sont biologiquement pertinentes (R2> 0,50). Les seuls

coefficients de détermination observées selon ce critère sont la teneur en sable en fonction du pH

(R2=0,61), la teneur en limon en fonction du pH (R2=0,77) et le carbone organique total en

fonction du carbone organique dissout (R2=0,75) avec ***p < 0,001 (figure 4.1). Les résidus

suivent une distribution normale, répondant ainsi au test de Shapiro-Wilk.

Figure 4.1: Régression linéaire entre le carbone organique total et le carbone organique dissout

pour les 15 sols contaminés

La matière organique dissoute (COD) est la matière organique en solution de diamètre inférieur à

0.45 µm, et la fraction la plus active de la matière organique totale. Il est donc normal d’obtenir

une régression biologique pertinente entre la COD et la COT qui indique la teneur en composé

organique. Ces deux mesures sont importantes car elles pourraient expliquer, entre autres, la

y = 0.0048x - 0.0008R² = 0.7623

0.0

0.1

0.1

0.2

0.2

0.3

0.3

0 10 20 30 40 50 60

COD

(m

g C/

L)

COT (g/kg de sol sec)

61

spéciation du Cu (section 4.1.2) et sa toxicité sur les micro-organismes (inhibition de l’activité

enzymatique : section 4.1.3).

Dans le cadre de ce projet, voici les plus fortes corrélations significatives observées à travers

l’ensemble des 15 sols contaminés. Les données de chaque propriété physico-chimique ne

respectent pas les hypothèses de la corrélation de Pearson, c’est-à-dire qu’elles ne suivent pas,

pour la plupart, une loi de distribution normale ou ne respectent pas l’homoscédasticité). Par

conséquent une corrélation non paramétrique devra être utilisée, soit la corrélation de Spearman.

Selon le tableau 4.3, le pH est corrélé à la texture du sol soit négativement pour le sable (r = -

0.678, p***<0,001), positivement pour l’argile (r = 0.616, p***<0,001), le limon (r = 0.860,

p***<0,001) et la capacité tampon, sans surprise (r = 0.609, p***<0,001). La COT est fortement

corrélée à la CEC (r = 0.739, p***<0,001) et à la COD (r = 0.789, p***<0,001) et enfin la COD

est corrélé à la CEC (r = 0.611, p***<0,001).

Les corrélations significatives pour les 15 sols témoins ne diffèrent pas beaucoup de celles des

sols contaminés (voir Annexe B4), rendant possible la comparaison de l’influence de la toxicité

du Cu sur les enzymes. Le pH est corrélé à la texture du sol soit négativement au sable (r = -

0.712, p***<0,001), positivement à l’argile (r = 0.625, p***<0,001), au limon (r = 0.884,

p***<0,001) et à la capacité tampon (r = 0.827, p***<0,001). La texture du sol étant un bon

indicateur de la relation entre les différentes caractéristiques physico-chimiques mais aussi de la

contamination métallique (section 4.2). Par contre la texture du sol (sable, limon et argile) est

cette fois très fortement corrélée à la capacité tampon alors que pour les sols contaminés, seul le

limon était positivement corrélé à la capacité tampon (r = 0.743, p***<0,001). La COT et la COD

sont fortement corrélées ensemble (r = 0.703, p***<0,001) et la CEC est corrélée à la COT (r =

0.573, p***<0,001) et la COD (r = 0.574, p***<0,001).

Les ANOVA ont montré que les sols avaient des propriétés significativement différentes les unes

des autres mais les tests post hoc de Tukey-HSD n’ont pas permis de grouper les sols en

fonctions des propriétés physico-chimiques. Ce qu’on observe en Annexe B3 pour la CEC, c’est

que les sols peuvent appartenir à plusieurs groupes différents. Ainsi essayer de grouper les sols

pour les analyses sur la base d’un même type semble compromis. Plusieurs combinaisons de sols

ont été testées afin d’extraire de bonnes régressions linéaires pour différents types de sols, mais

sans succès.

62

Tableau 4.3: Coefficient de corrélation de Spearman entre les propriétés physico-chimiques des 15 sols contaminés et les activités

enzymatiques

Cu sol Cu Tot Inv Uréase Prot Aryl Phos β-Glu Sables Lim. Argiles pH CEC CT COT COD

Cu sol 1 -0,474** 0,159 -0,369* -0,581*** 0,194 0,386** 0,187 0,870*** -0,774*** -0,843*** -0,760*** -0,130 -0,369* 0,054 -0,185

Cu Tot - 1 0,390** 0,076 0,278 0,077 -0,109 0,209 -0,348* 0,460** 0,343* 0,316* 0,135 0,329* 0,284 0,138

Inv - - 1 0,147 -0,188 0,560*** 0,468** 0,760*** 0,124 -0,106 -0,06 -0,283 0,439** 0,051 0,765*** 0,440**

Uréase - - - 1 0,313* 0,256 -0,081 0,253 -0,478** 0,101 0,554*** 0,225 0,503** -0,136 0,425** 0,626***

Prot - - - - 1 -0,403** -0,440** -0,106 -0,507** 0,636*** 0,515** 0,781*** 0,046 0,490** 0,180 0,365*

Aryl - - - - - 1 0,707*** 0,716*** 0,057 -0,369* 0,063 -0,456** 0,558*** -0,270 0,530** 0,331*

Phos - - - - - - 1 0,590*** 0,219 -0,263 -0,214 -0,427** 0,426** 0,0900 0,395** 0,162

β-Glu - - - - - - - 1 0,032 -0,190 0,123 -0,359* 0,437** -0,149 0,698*** 0,610***

Sables - - - - - - - - 1 -0,775*** -0,954*** -0,678*** -0,192 -0,240 0,016 -0,295*

Lim. - - - - - - - - - 1 0,689*** 0,860*** -0,017 0,602*** -0,043 0,139

Argiles - - - - - - - - - - 1 0,616*** 0,217 0,1067 0,088 0,448**

pH - - - - - - - - - - - 1 0,043 0,608*** -0,013 0,239

CEC - - - - - - - - - - - - 1 0,273 0,739*** 0,611***

CT - - - - - - - - - - - - - 1 0,198 0,026

COT - - - - - - - - - - - - - - 1 0,789***

COD - - - - - - - - - - - - - - - 1

Niveau de significativité: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 ; Cu sol = Cu soluble ; Cu Tot = Cu total ; Inv = Invertase; Prot = Protéase ; Aryl =

Arylsulfatase ; Phos = Phosphatase ; β-Glu = β-Glucosidase ; Lim. = Limons ; CEC = Capacité d’échange cationique ; CT = Capacité tampon ;

COT = Carbone organique total ; COD Carbone organique dissout.

63

4.2 Distribution du cuivre dans les sols

Selon le tableau 4.3, la concentration de Cu soluble serait faiblement corrélée négativement avec

le Cu total (r = -0.474, p**<0,01), fortement corrélé négativement avec le limon (r = -0.774,

p***<0,001), l’argile (r = -0.843, p***<0,001), le pH (r = -0.760, p***<0,001) et fortement

corrélé avec le sable (r = 0.870, p***<0,001). Étonnement, il ne l’est pas avec la MO (soit le

COD ou la COT) et la CEC contrairement à ce qui est attendu.

On remarque que la concentration en Cu total n’est pas corrélée aux autres paramètres physico-

chimiques pour les sols contaminés. Cela n’est pas étonnant vu que le Cu se distribue en

différentes fractions, ne permettant pas d’associer les paramètres physico-chimiques à une

fraction totale du Cu. La concentration en Cu soluble est mieux corrélée aux variables physico-

chimiques. La fraction dissoute des métaux est de toute façon connue pour mieux intégrer la

variabilité physico-chimique des sols que la concentration totale du métal. Les micro-organismes

étant de tout façon exposés aux métaux par la phase aqueuse du sol [19]. Sauvé (1997) montre

que le Cu soluble est proportionnel au contenu en Cu total [31], ce qui dans note cas est dans une

moindre mesure le cas si l’on regarde la figure 4.2 de la régression de la concentration en Cu

soluble en fonction de la concentration en Cu total (R2 = 0,43), sauf que si on enlève le sol B, le

coefficient de régression R2 tombe en dessous de 0,01. Dans le cas de Sauvé (1997) on parle

d’une contamination stable depuis plus de 10 ans, alors que dans ce cas-ci la contamination est

inférieure à 1 mois et malgré le processus de vieillissement/lixiviation et la période de

stabilisation, les résultats diffèrent.

Par contre dans les sols témoins, on observe seulement une faible corrélation entre la

concentration en Cu soluble, la COD (r = 0.501, p**<0,01), et la CEC (r = 0.552, p***<0,001) et

aucune avec la texture des sols comme pour les sols contaminés, ni avec le pH. Dans les sols

témoins, la concentration en Cu total a une forte corrélation négative avec le sable (r = -0.781,

p***<0,001), et fortement positive avec l’argile (r = 0.782, p***<0,001) et le limon (r = 0.707,

p***<0,001). Enfin, la concentration en Cu total est aussi corrélée avec le pH (r = 0.682,

p***<0,001) et la capacité tampon dans ce cas-ci (r = 0.516, p***<0,001). On observe ainsi

l’inverse des corrélations obtenues pour les sols contaminés. Il se peut que l’addition du CaCl2 ait

influencé les différences observées, mais ces dernières sont principalement dues à l’addition du

Cu dans les sols contaminés.

64

Figure 4.2: Régression linéaire entre la concentration en cuivre total et la concentration en cuivre

soluble pour 15 sols contaminés

Une analyse des composantes principales a été effectuée afin de définir la relation entre la

concentration de Cu total, la concentration de Cu soluble et les propriétés physico-chimiques en

enlevant toute information redondante pour les 15 sols contaminés. Les trois premières

composantes, dont les valeurs propres sont au-dessus de 1 selon le critère de Kaiser-Guttman,

expliquent 80,4% de la variance totale. De manière générale, le premier facteur extrait est celui

qui explique le plus de variance et est donc la meilleure combinaison possible de variables. Les

autres facteurs ont moins de variance résiduelle à expliquer. Par conséquent, ils représentent des

combinaisons de moins en moins optimales, jusqu’à extinction de la variance à expliquer. Ainsi

la PC1 explique 46,9% de la variance et est associée à la texture des sols (sable, limon et argile)

et au pH. La PC2 (21,8%) est associée à la concentration de Cu soluble, à la CEC, la COT, et la

y = -0,3043x + 240,95R² = 0,43145

0

50

100

150

200

250

400 500 600 700 800 900 1000 1100

[Cu

solu

ble]

(ppm

)

[Cu Total] (ppm)

65

COD. Enfin la PC3 (12,57%) est associée à la capacité tampon et au Cu total. La figure 4.3

montre que le limon et le pH sont positivement corrélés entre eux et inversement corrélés au

sable. La COT, la COD et la CEC sont aussi positivement corrélés étant donné que leurs vecteurs

sont parallèles, ont le même sens et sont quasiment de la même longueur. Ces variables sont

partiellement inversement corrélées à la concentration en Cu soluble et non corrélées à la capacité

tampon, au pH et à la texture du sol (perpendiculaire). Le vecteur de la capacité tampon est plus

petit que les autres ce qui veut dire qu’il explique moins la variance des deux composantes

principales (PC1 et PC2). Cette analyse visuelle et quantitative permet de venir renforcer les

conclusions des corrélations observées dans la tableau 4.3.

Figure 4.3: Graphique bidimensionnel des deux composantes principales illustrant les vecteurs de

les concentrations de Cu soluble et de Cu total et les vecteur des propriétés physico-chimiques

pour les 15 sols contaminés

66

4.3 Activités enzymatiques dans les sols

L’uréase a été mise de côté puisque la concentration de substrat n’a pas permis d’atteindre la

vitesse enzymatique optimale. Les résultats démontrent une activité enzymatique très faible dans

les sols (tableau 4.4).

Les principales informations pour les activités enzymatiques sont compilées dans les tableaux 4.3

et 4.4, les annexes B4 et B5. Le sol B a été exclu pour toutes les enzymes puisqu’il ne montre

aucune différence significative entre le sol témoin et le sol contaminé. Aussi son activité

enzymatique est fortement inhibée par rapport aux autres sols puisqu’il présente les plus petites

concentrations de produit mesurées pour le sol contaminé et le sol témoin, dû à sa forte

concentration en Cu soluble (221,9 ppm), mais aussi à sa texture sableuse, son acidité et sa faible

teneur en MO comme on peut le constater par sa faible activité pour toutes les enzymes dans le

sol témoin. De par ses caractéristiques physico-chimiques, ce sol est peu propice aux

communautés microbiennes. Pour des raisons de compréhension, tous les sols seront présentés

sur les graphiques indépendamment de leur significativité.

Tableau 4.4: Informations statistiques principales des activités enzymatiques des 15 paires de sols

(voir Annexe B5 pour plus de détails)

Invertase Uréase Protéase Arylsulfatase Phosphatase β-Glucosidase

[GE] (μg/g sol sec/2h)

[AMM] (μg/g sol sec/2h)

[tyr] (μg/g sol sec/2h)

[PNP] (μg/g sol sec/2h)

[PNP] (μg/g sol sec/2h)

[PNP] (μg/g sol sec/2h)

Sols témoins

(T) (n=15)

Moyenne 1180 19 240 82 646 342

Écart-type 820 21 220 69 495 300

Maximum 2633 85 768 260 1659 1308

Minimum 1 0 0 0 29 0

Sols contaminés (C) (n=15)

Moyenne 898 4 176 35 349 245

Écart-type 791 5 138 34 334 185

Maximum 2763 15 442 114 1268 647

Minimum 78 0 0 0 27 0

67

4.3.1 Invertase

L’activité de l’invertase dans les sols témoins varie de 78 à 2763 en concentration de glucose

équivalent [GE] .. g/g sol sec/2h) pour une moyenne de 898 g/g sol sec/2h) et de 1 à 2633

g/g sol sec/2h) avec une moyenne de 1180 g/g sol sec/2h) pour les sols

contaminés. Sept sols peuvent être utilisés dans l’évaluation du %AE : les sols 7, 11, 15, 4, 14, 8

et 22. Comme on peut le constater sur la figure 4.4, les sols témoins 3, 8, 14 et 4 ont les activités

enzymatiques les plus importantes par ordre décroissant. Le pH de ces sols est relativement

neutre sauf pour le sol 4 et le teneur en MO est relativement élevée pour tous (corrélée à une

texture argileuse). Les sols témoins 7, 6 et 9 présentent les activités les plus faibles et une teneur

en MO relativement faible par rapport aux autres sols. On remarque aussi que certains sols

subissent une activation et non une inhibition suite à la contamination comme le sol 3 et 11. Pour

les sols témoins, l’invertase est corrélée à la CEC (r = 0.541, p***<0,001) et fortement corrélée à

la COT (r = 0.801, p***<0,001) et dans les sols contaminés, l’invertase est positivement corrélée

avec la COT (r = 0.765, p***<0,001).

Figure 4.4: Activité enzymatique de l’invertase dans les 15 paires de sol

68

4.3.2 Protéase

L’activité de la protéase dans les sols témoins varie de 0 à 768 en concentration de tyrosine [tyr]

g/g sol sec/2h) pour une moyenne de 240 [tyr g/g sol sec/2h) et de 0 à 442 [tyr g/g sol

sec/2h) avec une moyenne de 176 [tyr g/g sol sec/2h) pour les sols contaminés. Six sols

peuvent être utilisés dans l’évaluation du %AE : les sols 6, 10, 15, 3, 8 et 5. Comme on peut le

constater sur la figure 4.5, les sols témoins 4, 14, 22 et 8 ont les activités enzymatiques les plus

importantes par ordre décroissant. Exactement comme pour l’invertase, le pH de ces sols est

relativement neutre sauf pour le sol 4, et la teneur en MO est relativement élevée sauf pour le sol

22. Les sols témoins 10, 6 et A présentent les activités les plus faibles et une teneur en MO

relativement faible par rapport aux autres sols. On remarque aussi que certains sols subissent une

activation et non une inhibition suite à la contamination comme les sols 7, 6, 9 et 24. Pour les sols

témoins, la protéase est corrélée à l’argile (r = 0.516, p**<0,01) et à la COD (r = 0.542,

p***<0,01) et dans les sols contaminés, elle est corrélée à la texture du sol soit le sable (r = -

0.507, p**<0,01), le limon (r = 0.636, p***<0,001) et l’argile (r = 0.515, p***<0,001) et

fortement corrélée au pH (r = 0.781, p***<0,001). C’est aussi la seule enzyme à être corrélée au

Cu soluble quoique négativement (r = - 0.581, p***<0,001).

Figure 4.5: Activité enzymatique de la protéase dans les 15 paires de sol

69

4.3.3 Arylsulfatase

L’activité de l’arylsulfatase dans les sols témoins varie de 0 à 260 en concentration de p-

nitrophénol [PNP g/g sol sec/2h) pour une moyenne de 82 [PNP g/g sol sec/2h) et de 0 à

114 [PNP g/g sol sec/2h) avec une moyenne de 35 [PNP g/g sol sec/2h) pour les sols

contaminés. Treize sols peuvent être utilisés dans l’évaluation du %AE : les sols 7, 11, A, 6, 10,

15, 4, 9, 14, 3, 8, 5 et 22. La figure 4.6 montre que les sols témoins 4, 3, 11 et 8 ont les activités

enzymatiques les plus importantes par ordre décroissant. Le pH de ces sols est acide à neutre et la

teneur en MO est relativement élevée pour tous avec une texture plus sableuse pour le sol 11. Les

sols témoins 9, 22 et 5 présentent les activités les plus faibles et une teneur en MO relativement

faible par rapport aux autres sols. Pour les sols témoins, l’arylsulfatase est corrélée à la CEC (r =

0.677, p***<0,001), à la COT (r = 0.603, p***<0,001) et à la COD (r = 0.597, p***<0,001) et

dans les sols contaminés elle est corrélée à la CEC (r = 0.558, p***<0,001), le limon (r = 0.530,

p***<0,001).

Figure 4.6: Activité enzymatique de l’arylsulfatase dans les 15 paires de sol

70

4.3.4 Phosphatase

L’activité de la phosphatase dans les sols témoins varie de 29 à 1659 [PNP g/g sol sec/2h)

pour une moyenne de 646 [PNP g/g sol sec/2h) et de 27 à 1268 [PNP g/g sol sec/2h) avec

une moyenne de 349 [PNP g/g sol sec/2h) pour les sols contaminés. Treize sols peuvent être

utilisés dans l’évaluation du %AE : les sols 11, A, 6, 10, 15, 4, 9, 14, 3, 8, 24, 5 et 22. Comme on

peut le constater sur la figure 4.7, les sols témoins 11, 4, 10 et A ont les activités enzymatiques

les plus importantes par ordre décroissant. Le pH de ces sols est acide et le teneur en MO est

plutôt faible pour tous avec une texture plus sableuse. Les sols témoins 5, 22 et 9 présentent les

activités les plus faibles et une teneur en MO relativement faible. Pour les sols témoins, la

phosphatase est corrélée à la COT (r = 0.503, p**<0,01) mais n’est corrélée à aucune variable

physico-chimique pour les sols contaminés.

Figure 4.7: Activité enzymatique de la phosphatase dans les 15 paires de sol

71

4.3.5 β-glucosidase

L’activité de la β-glucosidase dans les sols témoins varie de 0 à 1308 [PNP g/g sol sec/2h)

pour une moyenne de 342 [PNP g/g sol sec/2h) et de 0 à 647 [PNP g/g sol sec/2h) avec une

moyenne de 245 [PNP g/g sol sec/2h) pour les sols contaminés. Dix sols peuvent être utilisés

dans l’évaluation du %AE : les sols 7, 11, A, 6, 15, 9, 14, 24, 5 et 22. Comme on peut le constater

sur la figure 4.8, les sols témoins A, 14, 7 et 8 ont les activités enzymatiques les plus importantes

par ordre décroissant. Le pH de ces sols est neutre sauf pour le sol A qui est acide et la teneur en

MO est relativement élevée pour le sol 8 et 14 mais pas pour le sol A et 7. Les sols témoins 10,

22 et 9 présentent les activités les plus faibles et sans distinction particulière par rapport aux sols

témoins. On remarque aussi que certains sols subissent une activation et non une inhibition suite

à la contamination comme le sol 11 et 24. Pour les sols témoins, la β-glucosidase est corrélée à la

CEC (r = 0.509, p***<0,001) et à la COD (r = 0.683, p***<0,001) et dans les sols contaminés

elle est corrélée à la COT (r = 0.698, p***<0,001) et la COD (r = 0.610, p***<0,001).

Figure 4.8 β-glucosidase dans les 15 paires de sol

72

4.3.6 Variabilité enzymatique

Dans les sols témoins, l’invertase est corrélée à l’arylsulfatase (r = 0.790, p***<0,001), et à la

phosphatase (r = 0.508, p***<0,001). L’arylsulfatase est fortement corrélée à la phosphatase (r =

0.821, p***<0,001), et corrélée à la β-glucosidase (r = 0.580, p***<0,001). La protéase ne

corrélant avec aucune autre enzyme. Dans les sols contaminés, une corrélation positive est

observée entre l’invertase et l’arylsulfatase (r = 0.560, p***<0,001), l’invertase et la β-

glucosidase (r = 0.760, p***<0,001), l’arylsulfatase et la phosphatase (r = 0.707, p***<0,001),

l’arylsulfatase et la β-glucosidase (r = 0.716, p***<0,001), et, la phosphatase et la β-

glucosidase(r = 0.590, p***<0,001). La protéase étant encore une fois la seule enzyme qui ne

corrèle avec aucune autre.

Une analyse des composantes principales a été effectuée afin de définir la relation entre les

activités enzymatiques et les propriétés physico-chimiques en enlevant toute information

redondante pour les 15 sols contaminés. Il en ressort 5 composantes principales importantes, ce

qui dénote la très grande variabilité de l’ensemble des données, expliquant 90,1% de la

variabilité. La PC1 explique 35,5% de la variance et est associée à la texture des sols (sable,

limon et argile) et au pH. La PC2 (28%) est associée à la protéase, à l’arylsulfatase et à la

capacité tampon. On dénote aussi une influence non négligeable du limon et du pH sur la PC2.

La PC3 (10,8%) est associée à l’invertase, la β-glucosidase, la COT et la COD. La PC4 (8,9%)

corrèle avec l’a phosphatase, la CEC et légèrement avec l’arylsulfatase. Et enfin, la PC5 (6,9%)

est associée à la concentration de Cu total et à l’invertase. La concentration de Cu soluble n’est

corrélée avec aucune des PC. La figure 4.9 montre que les activités enzymatiques ne sont pas

corrélées à la concentration de Cu soluble, ni à la concentration de Cu total. Elles corrèlent plus

ou moins faiblement pour certaines avec la MO, et pour d’autres avec le pH et la capacité tampon

(protéase).

73

Figure 4.9: Graphique bidimensionnel des deux composantes principales illustrant la variabilité

enzymatique et physico-chimique pour les 15 sols contaminés

4.4 Effet du cuivre sur l’activité enzymatique et tentative

d’extraction de données EC50

L’effet du Cu sur l’activité enzymatique n’est pas facilement analysable à partir des graphiques

4.4 à 4.8 puisque les sols présentent une variabilité physico-chimique trop importante. L’annexe

B5 permet de vérifier si les différences entre les activités enzymatiques des sols témoins et

contaminés sont statistiquement significatives entre les sols témoins et les sols contaminés pour

chaque paire suite au test de « Student » apparié. Les sols significativement différents pourront

être utilisés dans l’évaluation du pourcentage d’activité enzymatique (%AE) (tableau 4.5) inhibé

ou activé contrairement aux autres sols dont les écart-types se chevauchent pour une même paire.

74

Tableau 4.5: %AE des enzymes pour les 15 sols significativement différents

Sol Cu soluble

(ppm) Invertase Uréase Protéase Arylsulfatase Phosphatase β-Glucosidase

7 0,06 46% - 193% 24% - 41%

11 8,41 154% - 46% 51% 189%

A 11,16 - - - 46% 73% 19%

6 0,17 - 8% 1833% 37% 68% 66%

10 6,06 - 13% 100% 62% 89% -

15 1,52 62% 11% - 60% 39% 92%

4 0,88 27% - 17% 44% 41% 86%

9 0,65 - - 187% 14% 45% 37%

14 1,09 56% - 80% 14% 40% 41%

3 0,25 - 33% - 43% 14% -

8 0,40 60% 8% - 18% 43% -

24 37,78 - - - - 51% 446%

5 0,20 - 0% - 0% 57% 35%

22 0,33 12% - - 23% 52% 53%

Pour l’invertase, le %AE le plus faible est observé dans le sol 4 (inhibition), et le plus élevé

(activation) dans le sol 11. Pour la protéase le %AE le plus faible est encore une fois observée

dans le sol 4 (inhibition) et le plus élevé dans le sol 6 (activation trop importante car l’activité

enzymatique était trop faible dans le sol témoin, < 1 d’où le pourcentage très élevé). Pour

l’arylsulfatase c’est l’activité enzymatique dans le sol 5 qui est fortement inhibée et la moins

inhibée dans le sol 10. Pour la phosphatase c’est le sol 3 qui voit son activité enzymatique la plus

inhibée et le sol 10 pour la moins inhibée. Enfin, pour la β-Glucosidase, le sol A présente

l’activité enzymatique la plus inhibée et le sol 24 la plus activée (pourcentage très élevé dû à une

activité en dessous de 1 dans le sol témoin).

Les graphiques ci-dessous (figure 4.10) représentent les %AE en fonction de la concentration de

Cu soluble pour les sols sélectionnés selon le tableau 4.5. On constate beaucoup de dispersion

dans les résultats. Il n’est donc pas possible d’ajuster un modèle prévu pour les courbes dose-

75

réponse. Par contre, on remarque que pour l’arylsulfatase, la phosphatase et la β-Glucosidase, une

plage de données pourrait être ajustée au modèle hyperbolique d’inhibition partielle. Pour ce

faire, des combinaisons de différents sols ont été testées pour ces trois enzymes sur des plages de

concentrations de Cu soluble allant de 0,06 à 11,16 ppm. Le sol 24 a été écarté puisqu’il présente

une concentration en Cu soluble beaucoup trop éloignée des autres et peut être considéré comme

une donnée statistiquement aberrante. Les combinaisons retenues présentent les meilleurs

coefficients de régression R2 et d’Akaike pour la pertinence de l’ajustement du modèle. Ainsi,

pour l’arylsulfatase on retient les sols 7, 6, 9, 14, 8 et 22 ; pour la phosphatase, les sols 6, 4, 15, 9,

14, 8, 5 et 22 ; et pour la β-Glucosidase, les sols 7, A, 6, 9, 14 et 22. On remarque que les sols 6,

9, 14 et 22 sont communs aux 3 enzymes. La plupart de ces sols (contaminés) ont un pH neutre à

faiblement alcalin (entre 7,28 et 7,71) sauf pour les sols A, 4 et 15 qui expriment un pH plus

acide (entre 5,01 et 5,98). La figure 4.11 représente les courbes de concentration-réponse pour

ces trois enzymes et les sols sélectionnés.

76

Figure 4.10: Graphiques du %AE en fonction de la concentration de Cu soluble pour les sols significativement différents

77

Figure 4.11: Courbes de concentration-réponse selon le modèle hyperbolique d’inhibition partielle pour l’Arylsulfatase, la phosphatase

et la β-Glucosidase pour les sols sélectionnés. R2 étant le coefficient de détermination pour la régression non linéaire et AICC le poids

d’Akaike qui exprime la pertinence de la régression. « x » étant la concentration en Cu soluble (ppm) et y le %AE

Arylsulfatase Phosphatase

β-Glucosidase

R2 = 0,75 AICC = 0,50

R2 = 0,84 AICC = 0,65

R2 = 0,81 AICC = 0,57

78

Les coefficients a, b et c obtenus pour les courbes de concentration-réponse de la figure 4.11,

ainsi que la EC50 qui en est dérivée pour chaque enzyme sont compilés dans le tableau 4.6 ci-

dessous.

Tableau 4.6: coefficients a et b de l’ajustement du modèle hyperbolique d’inhibition partielle et

EC50 pour l’arylsulfatase, la phosphatase et la β-Glucosidase

Enzyme a b EC50

(ppm)

Arylsulfatase 5,31.10-2 5,06.105 1,98.10-6

Phosphatase 7,11.10-1 1,5.107 6,67.10-8

β-Glucosidase 1,53.10-1 6,17.10-1 1,62

Les EC50 n’ont pas pu être déduites à partir des résultats des essais enzymatiques pour l’ensemble

des 15 sols compte tenu de la trop grande variabilité de la spéciation du Cu soluble et des

paramètres physico-chimiques de chaque sol. De plus, même si une EC50 peut être extraite pour

la β-Glucosidase (1,62 ppm), on observe que le seul paramètre pouvant grouper les 6 sols utilisés

est leur pH plus ou moins neutre, sauf pour le sol A, les textures des sols étant significativement

différentes. L’obtention d’une EC50 unique par l’agrégation des EC50 de chaque enzyme n’est

donc pas possible. De plus, les activités enzymatiques ne sont que très peu corrélées à la

concentration de Cu soluble ou Cu total, mais fortement avec les différentes propriétés physico-

chimiques dépendamment du sol. Les activités enzymatiques ne peuvent s’expliquer sans ces

paramètres. Aurait-on fait le même constat pour un sol contaminé à des concentrations différentes

ou pour des sols présentant de fortes similarités au niveau de leurs propriétés physico-chimiques?

79

CHAPITRE 5 EFFET DU CUIVRE SUR DES SOLS DE VIGNOBLE

Ce chapitre présente les résultats des analyses physico-chimiques et des essais enzymatiques pour

les sols de vignoble. Ces sols présentent des similarités au niveau de leurs propriétés mais ont

subis des traitements agricoles différents. L’obtention d’EC50 pour chaque enzyme n’étant pas

possible compte tenu de la petite taille du nombre d’échantillons, il est intéressant ici de voir si

les propriétés physico-chimiques de ces sols pourraient permettre de les grouper pour tirer des

conclusions quant à l’influence de la concentration de Cu soluble sur l’activité enzymatique.

L’objectif étant de valider si le développement d’un indicateur unique pourrait être possible sur

des sols du même type malgré des traitements différents (ici inconnus).

5.1 Caractérisation générale des sols étudiés

5.1.1 Profil physico-chimique des sols échantillonnés pré-contamination

Le profil des concentrations métalliques bruit de fond du sol (voir Annexe B1) présente des

valeurs pour tous les métaux en dessous des seuils de concentrations A (concentration bruit de

fond) établies par la politique de protection des sols et de réhabilitation des terrains contaminés

du MDDELCC pour les sols 1M et 2M, alors qu’on observe des concentrations répondant au

critère B pour certains métaux dans le cas du sol 3M. La concentration bruit de fond en Cu des

sols varie entre 9 et 17 ppm. Les 3 vignobles échantillonnés n’utilisent pas de pesticides au Cu.

La concentration en calcium est plus importante dans le sol 3M (8130 ppm) et moins importante

dans le sol 2M (2587 ppm). Les concentrations en Cu des sols calcaires étant les plus élevées

alors que les concentrations en Cu des sols les moins calcaires sont les plus faibles. De manière

générale, les sols calcaires exhibent des concentrations bruit de fond plus importantes que les sols

non calcaires. Le tableau fait aussi état des concentrations en nutriments (Na, K, Mg) qui

corrèlent moins bien avec la nature calcaire des sols. Ceci peut-être imputable à l’utilisation

d’engrais différente pour chaque vignoble.

Les pH mesurés avant la contamination sont reportés dans le tableau 5.1, la plus petite valeur de

pH est mesurée dans le sol 3M et la plus grande dans le sol 1M. Le fait que les vignobles utilisent

d’autres produits qui n’ont pas été ici mesurés a une influence non négligeable sur les différences

80

de pH. Celles-ci ne peuvent donc pas être expliquées seulement pas la texture du sol ou ses

caractéristiques.

Tableau 5.1: Mesures du pH enregistrée dans les sols de vignobles

5.1.2 Profil physico-chimique des sols échantillonnés post-contamination

Contrairement aux 15 paires de sols du chapitre précédent, la concentration en Cu total n’a pas

chuté pour les sols de vignoble. Au contraire, elle a augmenté par rapport à la concentration

introduite, tout en prenant en compte la concentration bruit de fond. En effet, la concentration

utilisée pour contaminer les sols est de 300 ppm, et remarque que le sol 1M affiche une

concentration de Cu total de 340 ppm suite à la contamination et le processus de lixiviation (voir

Annexe B2). Sa concentration bruit de fond mesurée étant de 10 ppm, même si on ne comptait

aucune perte lors du processus de vieillissement artificiel, la concentration devrait se situer autour

de 310 ppm et non 340 ppm. La seule explication possible est une erreur de manipulation et de

lecture expérimentale, car le Cu n’est pas un élément que l’on peut produire à partir d’autres

composés. Les concentrations de Cu total mesurées dans le sol 2M (302 ppm) et 3M (310 ppm)

sont plus logiques bien que les concentrations n’aient pas chuté significativement en fonction à la

concentration introduite. Pourtant, les sols ne présentent pas une texture particulièrement propice

à la rétention du Cu, soit loam sableux pour le sol 1M et sable loameux pour les sol 2M et 3M.

On observe que les concentrations en Cu total des sols témoins n’ont pas chuté drastiquement, le

sol 1M étant le sol qui a retenu le plus de Cu par rapport à sa concentration bruit de fond initiale

(passant de 10 ppm à 9 ppm). La texture de ce sol étant plus limoneuse que les autres, cela a pu

avoir une influence.

Le tableau 5.2 ci-dessous permet d’observer une certaine similarité entre les sols de vignoble. Le

pH des sols varie de faiblement acide à neutre, entre 5,99 et 7,71 et une moyenne de 6,49. La

capacité tampon varie entre 3,02 et 4,37 cmol H+/kg sol sec par unité pH avec une moyenne de

ID pH

1M 7,28 ± 0,02 2M 6,3 ± 0,03 3M 5,99 ± 0,05

81

3,77 cmol H+/kg sol sec par unité pH, soit une capacité tampon plutôt faible. La COT varie entre

11,60 et 16,10 g/kg sol sec avec une moyenne de 13,33 g/kg sol sec, les sols de vignoble étant

pauvres en MO La texture des sols est similaire entre loam sableux et sable loameux.

82

Tableau 5.2: Informations statistiques principales des propriétés physico-chimiques des sols de vignoble (voir Annexe B2 pour plus de

détails)

pH COT CEC Capacité tampon COD Granulométrie (%) Cu

Total Cu

Soluble

g/kg sol sec

CEC meq/100g de résidu

sec

cmol H+/kg sol sec par unité pH

mg C\L Sables Limons Argiles (ppm) (ppm)

Sols

témoins

(T) (n=3)

Moyenne 6,60 14,10 18,83 3,69 0,07 77,6 14,0 8,4 8 0,03

Écart-type 0,78 1,91 4,80 0,66 0,03 6,7 5,6 1,5 2 0,03

Maximum 7,50 15,90 22,19 4,23 0,11 82,8 20,4 9,6 9 0,06

Minimum 6,09 12,10 13,32 2,96 0,04 70,0 10,5 6,7 6 0,00

Sols

contaminés

(C) (n=3)

Moyenne 6,49 13,33 19,36 3,77 0,09 77,6 14,0 8,4 317 0,37

Écart-type 0,83 2,42 4,61 0,69 0,03 6,7 5,6 1,5 20 0,27

Maximum 7,45 16,10 22,60 4,37 0,12 82,8 20,4 9,6 340 0,68

Minimum 5,99 11,60 14,08 3,02 0,07 70,0 10,5 6,7 302 0,16

83

On observe peu de différence entre les caractéristiques physico-chimiques des sols contaminés et

des sols témoins regroupés par paires (Annexe B2), ce qui facilite la comparaison. De manière

générale, la chute de pH n’est pas très importante. Au contraire le sol 1M voit son pH augmenter

de 0,2 unités, malgré une capacité tampon faible.

Lors du traitement de l’analyse statistique, le coefficient de détermination R2 a été obtenu lors des

régressions linéaires entre les propriétés physico-chimiques afin de quantifier la force de

régression et d'identifier les régressions biologiquement pertinentes (R2> 0,50). Le sable (R2 =

0,98***), le limon (R2 = 0,99***) et la COT (R2 = 0,98***), semble avoir une forte régression

linaire avec le pH alors que la capacité tampon présente un coefficient de régression plus faible la

capacité tampon (R2 = 0,52*). Le sable (R2 = 0,99***) et le limon (R2 = 0,99***) en fonction de

la COT présente de forte régression linéaire, alors que celle de l’argile est plus faible (R2 =

0,58*). Les résidus sont conformes au test de Shapiro-Wilk, c’est à dire qu’ils suivent une

distribution normale. Les corrélations significatives observées à travers l’ensemble des sols de

vignobles contaminés sont, selon les coefficients de Spearman, (l’ensemble des données ne

respectent pas les hypothèses de la corrélation de Pearson) différente de ce qui a pu être observé

pour les 15 paires de sol. D’après le tableau 5.3, le pH est fortement corrélé à la COT, l’argile et

le limon (r = 0.791, p*<0,05) et négativement à la COD et au sable (r = -0.791, p*<0,05). La

COT est fortement corrélée à l’argile au limon (r = 1, p***<0,001) et négativement à la COD (r =

-0.791, p*<0,05) et au sable (r = -1, p***<0,001). La COD est fortement corrélée à la texture des

sols, soit négativement avec le sable (r = -0.791, p*<0,05) et positivement à l’argile (r = 0.791,

p*<0,05) et au limon (r = 0.791, p*<0,05). Bien entendu, le sable, le limon et l’argile sont

mutuellement corrélés (r = 1 ou -1, p***<0,001) et le pH est corrélé à la COT (r = 0.791,

p*<0,05) et la COD (r = -0.791, p*<0,05). Pour les sols témoins, le sable, le limon et l’argile sont

fortement corrélés entre eux (r = 1 ou -1, p***<0,001), le pH est très fortement corrélé avec la

texture du sol : sable (r = -0.896, p**<0,01), argile (r = 0.896, p**<0,01) et limon (r = 0.896,

p**<0,01). La COD est très fortement corrélée à la CEC (r = 0.933, p***<0,001).

84

Tableau 5.3 : Coefficient de corrélation de Spearman entre les propriétés physico-chimiques des sols de vignoble contaminés et les

activités enzymatiques

Cu sol Cu Tot Inv Uréase Prot Aryl Phos β-Glu Sables Lim. Argiles pH CEC CT COT COD

Cu sol 1 -0,700* 0,917*** -0,458 0,450 0,533 0,233 -0,200 0,474 -0,474 -0,474 -0,733* -0,617 -0,904*** -0,474 0,083

Cu Tot - 1 -0,867** 0,102 0,100 -0,133 -0,233 0,400 -0,633 0,633 0,633 0,533 0,067 0,879** 0,633 -0,483

Inv - - 1 -0,424 0,267 0,417 0,150 -0,200 0,474 -0,474 -0,474 -0,550 -0,483 -0,996*** -0,474 0,100

Uréase - - - 1 -0,559 -0,949*** 0,627 -0,593 0,483 -0,483 -0,483 -0,119 0,814** 0,443 -0,483 0,576

Prot - - - - 1 0,600 0,100 0,217 -0,211 0,211 0,211 -0,017 -0,733* -0,251 0,211 -0,483

Aryl - - - - - 1 -0,500 0,433 -0,369 0,369 0,369 -0,067 -0,833** -0,435 0,369 -0,433

Phos - - - - - - 1 -0,750* 0,791* -0,791* -0,791* -0,550 0,300 -0,134 -0,791* 0,550

β-Glu - - - - - - - 1 -0,843** 0,843** 0,843** 0,567 -0,233 0,193 0,843** -0,667*

Sables - - - - - - - - 1 -1*** -1*** -0,791* 0,264 -0,476 -1*** 0,791*

Lim. - - - - - - - - - 1 1*** 0,791* -0,264 0,476 1*** -0,791*

Argiles - - - - - - - - - - 1 0,791* -0,264 0,476 1*** -0,791*

pH - - - - - - - - - - - 1 0,133 0,536 0,791* -0,550

CEC - - - - - - - - - - - - 1 0,460 -0,264 0,617

CT - - - - - - - - - - - - - 1 0,480 -0,127

COT - - - - - - - - - - - - - - 1 -0,791*

COD - - - - - - - - - - - - - - - 1

Niveau de significativité: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 ; Cu sol = Cu soluble ; Cu Tot = Cu total ; Inv = Invertase; Prot = Protéase ; Aryl =

Arylsulfatase ; Phos = Phosphatase ; β-Glu = β-Glucosidase ; Lim. = Limons ; CEC = Capacité d’échange cationique ; CT = Capacité tampon ;

COT = Carbone organique total ; COD Carbone organique dissout.

85

5.2 Distribution du cuivre dans les sols

Selon le tableau 5.3, la concentration en Cu soluble serait corrélée négativement avec la

concentration en Cu total (r = -0.700, p*<0,05), et fortement corrélée négativement avec le pH (r

= -0.733, p*<0,05) et la capacité tampon (r = -0.904, p***<0,001). On remarque encore un fois

qu’il ne l’est pas avec la MO (soit le COD ou la COT) et la CEC, ni avec la texture du sol. La

concentration de Cu total est seulement fortement corrélé avec la capacité tampon. La régression

linéaire de la concentration de Cu soluble en fonction de la concentration de Cu total donne un

coefficient de régression R2 meilleur que pour les 15 paires de sols mais seulement sur 3 valeurs

(R2 = 0,66). Dans les sols témoins (Annexe B6), la concentration de Cu soluble a une forte

corrélation négative avec le sable, et fortement positive avec l’argile et le limon (p***<0,001).

Enfin, la concentration de Cu total est aussi fortement corrélé avec la COT (p***<0,001). On

observe ainsi l’inverse des corrélations obtenues pour les sols contaminés. Il se peut que

l’addition du CaCl2 ait eu une influence sur les différences observées, mais ces dernières sont

principalement expliquées par l’addition du Cu dans les sols contaminés.

L’analyse de composantes principales pour les sols de vignobles contaminés a permis de

confirmer visuellement les conclusions présentées ci-haut. Les deux premières composantes, dont

les valeurs propres sont au-delà de 1 selon le critère de Kaiser-Guttman, expliquent 93,7% de la

variance totale. La PC1 explique 64,3% de la variance et est associée à la texture des sols (sable,

limon et argile), à la MO (COT et COD), au pH et à la concentration de Cu total. La PC2 (30,3%)

est associée au Cu soluble, à la CEC et à la capacité tampon. La figure 5.2 montre que le limon,

la COT, la concentration de Cu total et le pH sont positivement corrélés entre eux et inversement

corrélés au sable. La COT et la COD sont très faiblement corrélés puisque leurs vecteurs sont

presque perpendiculaires l’un à l’autre. La capacité tampon est fortement inversement corrélée à

la concentration de Cu soluble. Enfin, l’argile est inversement corrélée à la COD.

86

Figure 5.1: Diagramme bidimensionnel des deux composantes principales illustrant les vecteurs

des concentration de Cu soluble et Cu total et les vecteur des propriétés physico-chimiques pour

les sols de vignoble contaminés

87

5.3 Activités enzymatiques dans les sols

Les principales informations pour les activités enzymatiques sont compilées dans le tableau 5.3 et

5.4, l’annexe B5 et B6.

Tableau 5.4: Informations statistiques principales des activités enzymatiques pour les sols de

vignoble (voir Annexe B5 pour plus de détails)

5.3.1 Invertase

L’activité de l’invertase dans les sols témoins varie de 571 à 1334 [GE] (μg/g sol sec/2h) pour

une moyenne de 874 [GE] (μg/g sol sec/2h) et de 457 à 1117 [GE] (μg/g sol sec/2h) avec une

moyenne de 749 [GE] (μg/g sol sec/2h) pour les sols contaminés. Seul le sol 2 est

significativement différent pour l’évaluation du %AE. Comme on peut le constater sur la figure

5.2, l’activité enzymatique est plus importante dans le sol témoin 2M alors que c’est le sol ayant

la plus faible teneur en MO contrairement au sol témoin 1M qui a la plus forte teneur en MO. La

concentration de Cu total est la moins importante pour le sol témoin 2M et la plus importante

pour le sol témoin 1M, ce qui pourrait avoir un lien avec l’activité enzymatique observée alors

que la concentration de Cu soluble ne semble pas suivre cette logique. La chute de l’activité

enzymatique entre le sol témoin et le sol contaminé est plus importante pour le sol 2M qui la plus

Invertase Uréase Protéase Arylsulfatase Phosphatase β-Glucosidase

[GE] (μg/g sol sec/2h)

[AMM] (μg/g sol sec/2h)

[tyr] (μg/g sol sec/2h)

[PNP] (μg/g sol sec/2h)

[PNP] (μg/g sol sec/2h)

[PNP] (μg/g sol sec/2h)

Sols témoins

(T) (n=15)

Moyenne 874 7 146 19 317 128

Écart-type 405 7 74 11 106 45

Maximum 1334 13 190 26 437 155

Minimum 571 0 61 6 238 77

Sols contaminés (C) (n=15)

Moyenne 749 4 200 76 175 104

Écart-type 337 4 49 116 33 21

Maximum 1117 8 250 210 213 126

Minimum 457 0 153 7 152 84

88

forte concentration en Cu soluble. Pour les sols témoins, l’invertase est corrélée à la

concentration de Cu total (r = -0,788, p*<0,05), à la capacité tampon (r = 0.775, p*<0,05) et

fortement corrélée à la COT (r = 0.835, p***<0,01) et dans les sols contaminés, l’invertase est

fortement négativement corrélée avec la capacité tampon (r = - 0.996, p***<0,001) et à la

concentration de Cu total (r = -0.867, p***<0,001) mais fortement positivement corrélée à la

concentration de Cu soluble (r = 0.917, p***<0,001).

Figure 5.2: Activité enzymatique de l’invertase dans les sols de vignoble

5.3.2 Protéase

L’activité de la protéase dans les sols témoins varie de 61 à 190 [ g/g sol sec/2h) pour

une moyenne de 146 g/g sol sec/2h) et de 153 à 250 [ g/g sol sec/2h) avec une

moyenne de 200 g/g sol sec/2h) pour les sols contaminés. Seul le sol 2M est

significativement différent pour l’évaluation du %AE. Comme on peut le constater sur la figure

5.3, l’activité enzymatique est plus importante dans le sol témoin 1M ayant le plus forte teneur en

MO et le pH le plus élevé contrairement au sol témoin 3M qui a l’activité enzymatique la plus

89

faible et le pH le plus faible. L’activité enzymatique est ici activée pour tous les sols contaminés

par rapport aux sols témoins, le COD étant plus important des les sols contaminés. Pour les sols

témoins, la protéase est positivement corrélée au limon (r = 0,685, p*<0,05), à l’argile (r = 0.685,

p*<0,05) et négativement corrélée au sable (r = -0.685, p*<0,05), à la CEC (r = -0.750, p*<0,05)

et à la COD (r = -0.783, p*<0,05). Dans les sols contaminés, la protéase est négativement

corrélée à la CEC (r = -0,733, p***<0,001).

Figure 5.3: Activité enzymatique de la protéase dans les sols de vignoble

5.3.3 Arylsulfatase

L’activité de l’arylsulfatase dans les sols témoins varie de 6 à 26 [ g/g sol sec/2h) pour

une moyenne de 19 g/g sol sec/2h) et de 7 à 210 [ g/g sol sec/2h) avec une

moyenne de 76 g/g sol sec/2h) pour les sols contaminés. Le sol 1M et 2M sont

significativement différents pour l’évaluation du %AE. Comme on peut le constater sur la figure

5.4, l’activité enzymatique est plus importante dans le sol témoin 1M ayant la plus forte teneur en

MO et le pH le plus élevé contrairement au sol témoin 3M qui a l’activité enzymatique la plus

90

faible et le pH le plus faible. L’activité enzymatique est activée pour le sol 1M et inhibée pour le

sol 2M. Pour les sols témoins, l’arylsulfatase est positivement corrélée au pH (r = 0,683,

p*<0,05) et négativement corrélée à la COD (r = -0.667, p*<0,05). Dans les sols contaminés,

l’arylsulfatase est négativement corrélée à la CEC (r = -0,833, p***<0,001).

Figure 5.4: Activité enzymatique de l’arylsulfatase dans les sols de vignoble

5.3.4 Phosphatase

L’activité de la phosphatase dans les sols témoins varie de 238 à 437 [ g/g sol sec/2h)

pour une moyenne de 317 g/g sol sec/2h) et de 152 à 213 [ g/g sol sec/2h) avec

une moyenne de 175 g/g sol sec/2h) pour les sols contaminés. Le sol 1M et 2M sont

significativement différents pour l’évaluation du %AE. Comme on peut le constater sur la figure

5.5, l’activité enzymatique est plus importante dans le sol témoin 2M alors que c’est le sol ayant

la plus faible teneur en MO contrairement au sol témoin 1M qui a la plus forte teneur en MO. La

concentration de Cu total est la moins importante pour le sol témoin 2M et la plus importante

pour le sol témoin 1M, ce qui pourrait avoir un lien avec l’activité enzymatique observée alors

91

que la concentration de Cu soluble ne semble pas suivre cette logique. La chute de l’activité

enzymatique entre le sol témoin et le sol contaminé est plus importante pour le sol 2M qui la plus

forte concentration en Cu soluble. L’activité enzymatique est inhibée pour tous les sols. Pour les

sols témoins, la phosphatase est négativement corrélée à la concentration de Cu total (r = -0,775,

p*<0,05), à la capacité tampon (r = -0,733, p*<0,05), à la COT (r = -0.791, p*<0,05). Dans les

sols contaminés, la phosphatase est négativement corrélée au limon (r = -0.791, p*<0,05), à

l’argile (r = -0,791, p*<0,05) et à la COT (r = -0791, p*<0,05) mais positivement corrélée au

sable (r = 0.791, p*<0,05).

Figure 5.5: Activité enzymatique de la phosphatase dans les sols de vignoble

5.3.5 β-glucosidase

L’activité de la β-glucosidase dans les sols témoins varie de 77 à 1308 [ g/g sol sec/2h)

g/g sol sec/2h) et de 0 à 647 [ g/g sol sec/2h) avec une

g/g sol sec/2h) pour les sols contaminés. Seul le sol 2M est

significativement différent pour l’évaluation du %AE. Comme on peut le constater sur la figure

92

5.6, l’activité enzymatique est plus importante dans les sols témoins 1M et 2M et moins

importante dans le sol témoin 3M. L’activité enzymatique est inhibée dans les sols 1M et 2M

mais pas 3M. Pour les sols témoins, la β-glucosidase est négativement corrélée au sable (r = -

0.685, p*<0,05) et positivement corrélée au limon (r = 0.685, p*<0,05) et à l’argile (r = 0.685,

p*<0,05). Dans les sols contaminés, la β-glucosidase est négativement corrélée au sable (r = -

0.843, p*<0,05) et à la COD (r = -0.667, p*<0,05) et positivement corrélée au limon (r = 0.843,

p*<0,05), à l’argile (r = 0.843, p*<0,05) et à la COT (r = 0.843, p**<0,01).

Figure 5.6 β-glucosidase dans les sols de vignoble

5.3.6 Variabilité enzymatique

Dans les sols témoins, l’invertase est corrélée à la phosphatase (r = -0.788, p*<0,05).

L’arylsulfatase est fortement corrélée à la β-glucosidase (r = 0.883, p***<0,001). La protéase et

la phosphatase ne corrèlent avec aucune autre enzyme. Dans les sols contaminés, seule une

corrélation négative est observée entre la phosphatase et la β-glucosidase (r = -0.750, p*<0,05).

93

Une analyse des composantes principales a été effectuée afin de définir la relation entre les

activités enzymatiques et les propriétés physico-chimiques en enlevant toute information

redondante. Il en ressort 3 composantes principales importantes, expliquant 95,1% de la

variabilité. La PC1 explique 52,8% de la variance et est associée à la concentration de Cu total, la

concentration de Cu soluble, à l’invertase, l’arylsulfatase, la CEC et la capacité tampon. La PC2

β-

glucosidase, à la COT et à la COD. La PC3 (8,7%) est associée à la protéase, mais aussi à la

concentration de Cu total et à la COD. La figure 5.7 montre que les activités enzymatiques sont

sensiblement corrélées à la concentration de Cu soluble, mais non corrélées à la MO. β-

glucosidase semble corrélée dans une certaine mesure à la COT et inversement corrélée au sable.

Comme on peut le constater, les activités enzymatiques sont éclatées les une des autres avec

quelques corrélations faibles pour certaines come l’Arylsulfatase et l’invertase ou inversement

β-glucosidase.

94

Figure 5.7: Graphique bidimensionnel des deux composantes principales illustrant la variabilité

enzymatique et physico-chimique des sols de vignoble

5.4 Effet du cuivre sur l’activité enzymatique des sols de vignoble

Le tableau 5.5 ci-dessous présente les différente %AE pour les sols de vignoble dont les activités

sont significativement différentes entre le sol témoin et le sol contaminé. Comme on peut le

constater, la moitié des %AE ne pourront pas être utilisées et aucun effet ne pourra être isolé

puisqu’aucune enzyme ne présente des %AE fiable pour les 3 sols.

Tableau 5.5: %AE des enzymes pour les sols vignoble significativement différents

Sol Cu soluble

(ppm) Invertase Uréase Protéase Arylsulfatase Phosphatase β-Glucosidase

7 0,06 (80%) 33% (105%) 51% 64% (82%)

11 8,41 84% 0% 132% 800% 37% 66%

A 11,16 (94%) 200% (251%) (107%) (77%) (110%)

Les pourcentages mis entre parenthèse sont à titre informatif car ils sont tirés des résultats des sols non

significativement différents.

Bien que l’on ne puisse tirer des conclusions, les graphiques ci-dessous (figure 5.8) montrent un

profil en cloche pour toutes les enzymes sauf l’arylsulfatase. On peut donc émettre l’hypothèse

qu’à une concentration de Cu soluble entre 0,16 et 0,68 ppm, on observe une courbe

concentration-réponse ressemblant à la courbe d’essentialité des métaux présentée dans la section

2.2.1. Il n’y a cependant pas assez de données pour dégager une courbe de tendance qui

modéliserait le phénomène observé. Les sols de vignoble semblent bien se prêter à l’évaluation

d’un EC50 pour chaque enzyme et éventuellement une agrégation pour l’obtention d’un indicateur

unique. Par contre les activités enzymatiques sont peu souvent corrélées à la concentration de Cu

soluble ou total mais plutôt aux différents paramètres physico-chimiques, dépendamment du type

d’enzyme. Il est donc difficile de répondre au postulat énoncé au chapitre 4 précédent sur

l’évaluation de la relation entre la spéciation du Cu et les activité enzymatiques. Les sols de

vignobles présentent un profil physico-chimique très similaire mais le peu de données empêche

de tirer des conclusions robustes.

95

Figure 5.8: Graphiques du %AE en fonction de la concentration de Cu soluble pour les sols de vignoble

96

CHAPITRE 6 DISCUSSION

6.1 Caractéristiques physico-chimiques des sols

Le profil des concentrations métalliques bruit de fond des sols (Annexe B1) permet d’observer

que seuls les sols 8 et 14 dépassent les concentrations bruit de fond établies par le MDDELCC

pour les principaux métaux que l’on s’attend à retrouver dans un sol. Il est recommandé pour les

terrains à vocation agricole de se fonder sur le critère A5. En plus des métaux tels que

l’aluminium (Al), le cobalt (Co), le nickel (Ni), le zinc (Zn), le Cadmium (Cd), on retrouve les

concentrations de sodium (Na), calcium (Ca), magnésium (Mg) et potassium (K) qui sont des

nutriments essentiels au maintien de la santé des sols et de leurs êtres vivants. Par exemple, pour

le potassium dans l’industrie agroalimentaire, il est conseillé de maintenir des concentrations au

dessus de 100 ppm afin d’obtenir de bons rendements6. La plupart des sols ne sont pas utilisés à

des fins agricoles sauf les sols 1M, 2M et 3M qui sont des sols de vignobles qui présenteraient un

profil riche en potassium. Les valeurs de pH des sols présentées dans le tableau 4.1 montre une

grande variabilité des sols échantillonnés puisqu’il est étroitement lié à la caractéristique physico-

chimiques des sols tels que la CEC, la texture, la capacité tampon et la MO Plus le pH est faible,

plus le Cu sera facilement solubilisé. En dessous d’un certain seuil de pH (~6), le sol est trop

acide, ce qui limite l’activité biologique et ainsi influence l’assimilation des nutriments par les

plantes. Cela permet aussi la désorption des métaux, les rendant plus solubles et affecte ainsi la

santé du sol. La nature calcaire des sols riches en argile, tels que les sols 5, 14, 6 et 8, est

étroitement lié à un pH plus élevé (entre 8,02 et 7,26) par opposition aux sols B, 24 et 10 qui

présentent une forte teneur en sable et un pH plus faible (entre 5,55 et 6,16). La capacité de

rétention du Cu total dans les sols plus calcaire est ainsi à prévoir, tel que le sol 14 ayant la plus

grande concentration en calcium et la plus forte concentration bruit de fond de Cu ([Ca] =

56154 ppm pour [Cu] = 53 ppm) contrairement au sol B ([Ca] = 732 ppm pour [Cu] = 4 ppm).

5 http://www.mddelcc.gouv.qc.ca/sol/terrains/politique/annexe_2.htm

6 http://www.soilquality.org.au/factsheets/potassium

97

Les sols ont été lixiviés afin de reproduire des conditions que l’on peut retrouver sur le terrain

mais aussi pour diminuer la force ionique induite par l’ajout de CuCl2 et la concentration en ion

chlorure qui peut impacter l’activité enzymatique [19, 152]. L’ajout artificiel de métal a aussi un

plus grand impact sur les processus microbiologiques du sol lorsque la lixiviation n’a pas eu lieu

[153]. La chute de pH observée entre le pH initial des sols et les sols amendé en CaCl2 (sols

témoins et en CuCl2 (sols contaminés) peut être attribuable au processus de lixiviation [56]. En

effet, les cations basiques tels que calcium (Ca+), le magnésium (Mg2+), le sodium (Na+) et le

potassium (K+) ont été en partie lixiviés7 lors de l’ajout d’un volume équivalent à 100% de la

CRC des sols pendant le processus de contamination. L’ion Cu2+ peut être en compétition avec

d’autres cations présentant la meilleure affinité dans les sols acides : Cu2+ > Ni2+ > Pb2+ > Ca2+ >

Zn2+ > Mn2+ > Mg2+. Ainsi un excès de cuivre dans le sol peut gêner la fixation d’autres cations

sur la matière organique [129] et ainsi favoriser leur lixiviation. Une valeur de CEC importante

indique que le sol à une plus grande capacité à retenir les cations. Lorsqu’une CEC est élevée, le

sol offre une plus grande réserve de nutriment qui seront accessibles aux micro-organismes tandis

qu’un sol présentant une CEC faible offre moins de nutriments et sera beaucoup plus sujet à la

lixiviation des nutriments. Plus la CEC est élevée, plus la charge négative est élevée et plus les

cations peuvent être retenus. Les cations qui sont retenus par l’argile et les particules de MO

peuvent être remplacés par d’autres cations puisqu’ils sont échangeables. La capacité d’échange

cationique (CEC) d’un sol, est une propriété intégratrice dépendant du pH, de l’argile et de la

matière organique [21]. On remarque que les sols présentant une plus forte CEC ont retenus plus

de Cu total. Lorsque la CEC est élevée mais à une saturation en cations basiques faible, le sol

devient plus résistant aux changements de pH et est essentiellement constitué d’ion H+, qui ont

priorités en terme de d’affinité avec la matrice du sol par rapport aux cations basiques. Le

processus de lixiviation entraînent les ions basiques et laisse essentiellement des ions H+, ce qui

explique que le sol 10, malgré son faible pH, présente une CEC élevée et une capacité tampon

plus grande que les sols aux pH similaires. La chute de pH est d’autant plus importante dans les

sols présentant une forte teneur en sable. Normalement, un sol moins argileux présente une CEC

beaucoup plus faible, et aura plus de difficulté à retenir les cations dans sa matrice. Ainsi, il aura

tendance à libérer les ions hydrogène responsable de l’augmentation de pH. Ce processus ne

7 http://landresources.montana.edu/nm/documents/NM8.pdf

98

semble pas respecté pour tous les sols, tel que vu avec le sol 10, alors que le sol 7 semble le

suivre. On observe aussi une différence de pH entre le sol témoin et le sol contaminé. Plusieurs

études semblent indiquer que l’ajout de métaux sous forme de sel dans le sol peut avoir un effet

sur le pH avec des diminutions allant jusqu’à 2 unités de pH [153]. Il faut aussi comprendre que

l’ajout de chlorure de calcium et de chlorure de cuivre en excès vient grandement affecter les

processus chimiques et biologiques du sol. L’ajout d’ion Ca+ par le biais du CaCl2 vient amender

les sols témoins, les rendant plus calcaires et donc moins propices à une chute de pH par rapport

aux sols contaminés qui subissent aussi un apport en Cu plus important. A titre de comparaison,

les sols de vignoble ont reçu une quantité de produit deux fois moins importante, maintenant le

pH mesuré avant la contamination. La CEC dans le cas des sols de vignoble semble aussi suivre

une tendance plus logique que pour les autres sols, de part leur CEC faible reflétant une texture

très sableuse. La relation entre les différentes propriétés physico-chimiques une à une s’explique

très bien dans peu de cas, comme le sol B, sol extrêmement sableux ayant une teneur en MO, une

CEC et une capacité tampon très faible qui s’explique par une teneur en sable de 96,9% et une

faible teneur en MO. Ainsi il est plus judicieux de comparer le modèle dans son ensemble à l’aide

des corrélations dégagées dans les chapitres 4 et 5.

Certains auteurs se heurtent à des problèmes de corrélation tel que Kuperman et al. (1997) [154],

même lorsqu’il s’agit de sols ayant sensiblement les mêmes caractéristiques physico-chimiques

tel que recommandé par la SETAC en 1995 [155]. Oorts et al (2006) observent que parmi les 19

paires de sols testés, les corrélations entre les propriétés physico-chimiques sont trop faibles [83].

D’autres arrivent à corréler seulement certaines propriétés qui varient selon les études et estiment

que la comparaison entre ces dites études pour un même métal n’est pas possible [155]. Alors que

l’on observe de fortes corrélations pour les sols contaminés entre le pH et la texture mais aussi la

capacité tampon, la MO (COT et COD) semble être corrélée à la CEC. Cette dernière

constatation va dans le sens des conclusions de Daoust et al. (2006) quant à la corrélation entre la

CEC et la MO [156]. La CEC dépendrait du type et de la quantité de la MO et de l’argile [157].

La forte corrélation entre la COT et la COD confirme que la MO est la principale variable

influençant la COD, alors que la faible corrélation de la COD avec le pH invalide l’influence du

pH sur la solubilisation de la MO. Les corrélations pour les 15 sols témoins ne diffèrent pas

beaucoup de celles des sols contaminés (voir Annexe B4), validant la possibilité de comparaison

de l’influence de la toxicité du Cu sur les enzymes.

99

6.2 Distribution du cuivre dans les sols en relation avec les

propriétés physico-chimiques du sol

Selon le tableau en Annexe B2, les sols ayant une forte teneur en sable ont vu leur concentration

en Cu total diminuer de façon plus conséquente que pour les sols à plus forte teneur en argile

suite au processus de lixiviation. Heidary-Monfared et al. (2001) observent que les sols argileux

ont de manière générale une plus forte concentration en Cu total [158]. La matière organique

peut complexer de 15 à 52 % du cuivre total du sol [59] et serait responsable entre autre de

l’immobilisation du Cu. De tous les métaux lourds, le cuivre est connu pour être le plus

largement complexé par les matériaux humiques dans les sols. Le degré de complexion augmente

avec le pH [106]. La chute de concentration du sol 10 est moins importante qu’attendu en raison

de sa plus forte teneur en MO malgré une texture plutôt sableuse.

Brun et al. (2001) estiment que la fraction soluble diminue avec une augmentation de pH, et ne

dépasse pas 0,25% de la concentration en cuivre total si pH>6,4 [34], ce qui est observé pour tous

les sols. A pH faible, le Cu soluble est beaucoup plus important qu’à pH plus élevé surtout dans

les sols à forte teneur en sable. En effet, la biodisponibilité du Cu serait fonction du pH, de la

CEC, de la texture du sol et de la MO [44]. L’effet de la lixiviation permet dans les sols acides

(pH<6) de réduire la labilité du métal lorsque contaminés artificiellement. Un autre aspect à

prendre en compte est l’effet de l’addition de sel métallique pour la contamination artificielle au

Cu. L’augmentation de la salinité peut augmenter la biodisponibilité du métal puisque les ions

salins peuvent rentrer en compétition avec les sites d’adsorption du sol [153, 159]. De fait, on

s’attend à une toxicité plus importante dans les sols acides. D’un autre côté, la texture et la MO

peuvent venir atténuer cet effet. Dans les sols plus sableux et présentant une faible teneur en MO,

la solubilité du métal est augmentée, associée à une baisse de pH tel que le sol B. La toxicité du

cuivre est observée dans des sols acides et ayant une CEC basse et un pH faible [36, 43]. Les sols

présentant une forte teneur en MO permettent d’adsorber le Cu, qui est aussi fonction de la CEC.

Le cuivre peut se lier par forces électrostatiques sur les éléments portant des charges négatives

tels que les argiles, la matière organique (MO) et les matériaux amorphes. Le Cu est dans ce cas-

ci en compétition avec tous les cations présents dans la solution tel que le proton (effet du pH

étroitement lié) et le calcium (sol calcaire), ce qui explique que la CEC (capacité à retenir ou à

libérer le Cu2+, qui va venir entrer en compétition avec les ions H+) est étroitement liée à la

100

spéciation du Cu. À pH acide, on observe ainsi une désorption/solubilisation des métaux. En

effet, plus la CEC d’un sol est importante, plus le Cu pourra se lier sur les éléments portants des

charges négatives [34]. Les sols de vignobles pourtant très sableux, avec une faible CEC et faible

teneur en MO, ne semblent pas suivre ces constatations. Il semble qu’en raison d’un pH élevé, le

Cu n’a pas été solubilisé. Les sols de vignoble ont aussi été deux fois moins amendés en Cu que

les 15 autres sols. Il aurait donc été intéressant d’évaluer les autres fractions de Cu afin d’obtenir

un portrait complet de la spéciation du Cu et de comprendre pourquoi les sols de vignoble se

comportent contre intuitivement. Ces sols ont aussi reçu une quantité de composés chimiques

divers et variés tels que des pesticides et fertilisants organiques. Y a-t-il des effets antagonistes ou

additifs ?

Un autre aspect étonnant est l’absence de corrélation entre le Cu soluble et la MO (soit le COD

ou la COT), et, la CEC contrairement à ce qui est attendu. Chaignon et al. (2003) ne semblent pas

observer d’effets de la CEC et de l’argile sur la biodisponibilité du Cu, et Mondaca et al. (2015)

observent une influence du Cu total et de la MO sur le Cu soluble mais pas d’influence du pH,

contrairement à Sauvé et al. (2000). On remarque pour le sol 11 que la MO est plus importante

que dans les autres sols et ce malgré son pH faible et son Cu soluble élevé. Il se peut que la

contamination au cuivre ait diminué la décomposition de la matière organique augmentant ainsi

sa teneur tel qu’observé par Sauvé (1997) [31]. En conclusion, la spéciation du cuivre est

fonction du pH et de la texture du sol mais est très peu corrélé aux autres paramètres physico-

chimiques. Mondaca et al. (2015) observent une influence du Cu total et de la MO sur Cu soluble

mais pas d’influence du pH ce qui est contraire à Sauvé et al. (2000). La MO peut avoir des effets

opposés sur la solubilité du Cu à cause de la différence du pH dans les sols selon McBride (1994)

(rapporté par Mondaca et al. (2015)) : solubilité des métaux diminue avec l’augmentation de pH

(4 à 7) mais augmente au delà parce que la solubilité de la MO est augmenté à pH>7, qui a son

tour augmente le Cu soluble par la formation de complexes organique dissous avec le Cu. Dans

les sols alcalins, la COD, dérivé de la solubilisation de la MO, augmente la solubilité du Cu par

formation de complexe. Mais la MO adsorbe le Cu et réduit sa solubilité (sauvé 1997), la MO a

donc un rôle dual. Lorsque le Cu en solution est complexé par la COD, les facteurs influençant la

solubilité de la MO, comme le pH, influencent aussi la solubilité du métal. Mais le pH n’est pas

une variable significative pour expliquer la solubilité du Cu et sa spéciation pour Mondaca, 2015

[63]. Selon Smith et al. (2015), le pH (l'ion H+) joue un double rôle dans la toxicité des métaux.

101

Tel que vu dans la section 2.2.4, il facilite la liaison du Cu à divers ligands, particulièrement la

matière organique, mais l’ion H+ peut aussi entrer en compétition avec le Cu pour la liaison au

ligand biotique. Ce qui explique les résultats contradictoires rapportés par la littérature [82].

L’étude menée par Lock et al. (2003) n’a pas permis de prédire la distribution du Cu sur la base

du pH, de la CEC et de la MO, et la COD n’a pas permis non plus d’expliquer le phénomène

[86]. En revanche, Sauvé et al. (2006) corrèlent la MO avec les niveaux de Cu [137].

6.3 L’effet du cuivre sur les enzymes

Les 6 enzymes étudiées dans le cadre de ce projet ont été choisies pour plusieurs raisons :

reproductibilité du projet de Lessard et al. (2014) dans le cadre d’un projet plus global de la

caractérisation des métaux dans un contexte d’ACV, retirer un indicateur global qui couvre les

cycles biogéochimiques les plus importants et pour la simplicité des essais enzymatiques [115].

En effet, le nombre d’étapes et la complexité d’un protocole engendrent une plus grande

variabilité dans les résultats entre les réplicas.

Les sols témoins dont les activités enzymatiques sont les plus fortes, peu importe l’enzyme, sont

les sols 4, 8 et 14. Ce sont des sols moins sableux à texture argileuse, dont la CEC et le contenu

en MO sont plus importants que les autres sols. Ce sont des conditions plus propices au maintien

de la santé des micro-organismes [52]. Une haute teneur en MO peut soutenir l’activité

enzymatique puisque cela signifie une augmentation de l’énergie et des nutriments disponibles

[160], la CEC faisant foi du bassin de nutriments disponible à la communauté microbienne. Les

sols témoins 9 et 22 sont les sols dont les activités enzymatiques les plus faibles ont été

enregistrées et dont la COD est la plus faible. De manière générale, l’activité de toutes les

enzymes dans les sols témoins est corrélée fortement à la MO (soit la COT ou la COD) et à la

CEC, surtout pour l’invertase et la β-glucosidase, deux enzymes associées au cycle du carbone. À

l’inverse, dans les sols contaminés, on observe une corrélation des enzymes beaucoup moins

évidente avec la MO mais plus avec la texture des sols. Les activités enzymatiques ne sont pas

corrélées au Cu soluble, sauf négativement pour la protéase, à cause de types de sol présentant

une variabilité physico-chimique trop importante. Ce qui influe sur l’activité enzymatique pour

un sol n’influera pas forcément de la même manière pour un autre. Enfin, le fait d’avoir des

corrélations entre les enzymes des différents cycles souligne l'interdépendance des activités

associées aux cycles biochimiques du carbone (β-glucosidase), du phosphore (phosphatase) et de

102

l’azote N (protéase), en particulier pour les cycles C et P puisque la protéase n’est pas vraiment

corrélée aux autres enzymes. Fernández-Calviño et al. (2010) observent un corrélation entre la

phosphatase et la β-glucosidase [105]. Selon eux, la phosphatase serait l’enzyme qui corrèle le

mieux avec les autres enzymes. Dans le cas de la présente étude, l’arylsulfatase serait l’enzyme

qui corrèle le mieux avec les autres enzymes.

Au niveau de la comparaison des activités enzymatiques entre les sols témoins et les sols

contaminés par paire, on observe une baisse de l’activité enzymatique pour les sols contaminés

tel que le montre le tableau 4.4. Les enzymes sont donc toutes sensibles à une toxicité au Cu

même si pour certains sols on remarque une activation de l’activité enzymatique, notamment

pour l’invertase et la protéase. Ces enzymes fonctionnent à un pH optimal de 4,5 pour l’invertase

[161] et 8,0 pour la protéase [162]. Or, on remarque une activation de l’activité de l’invertase

dans les sols contaminés dont le pH a chuté proche de 4,5 comme le sol 11 et le sol 24 et dont la

MO a augmenté entre le sol témoin et le sol contaminé pour le sol 3 et 11. L’augmentation de la

MO dans les sols ayant subi une contamination au Cu n’est pas un phénomène contre-intuitif. Au

contraire, Sauvé (1997) émet l’hypothèse qu’une contamination au Cu peut diminuer la

décomposition de la MO [31]. Avec le temps, on observerait peut-être une chute de l’activité, les

enzymes n’ayant plus accès au carbone, une fois le bassin de nutriments épuisé. Dans le cas de la

protéase, on remarque une activation de l’activité enzymatique entre le sol témoin et le sol

contaminé pour les sols 9 et 6 dont le pH du sol contaminé se rapproche sensiblement de la zone

optimal de pH de la protéase par rapport au sol témoin. Quant au sol 7, c’est l’augmentation de la

teneur en MO qui pourrait expliquer son activation. Et enfin, pour le sol 24, on n’observe aucune

explication possible quant à son activation pour la protéase. Ce sol réagit de manière contre-

intuitive étant donné sa haute concentration en Cu soluble; des analyses plus poussées auraient

été pertinentes afin de dégager une explication plausible quant à son comportement très différent

des autres sols, pour lesquels on peut au moins attribuer une caractéristique physico-chimique à

leur réponse enzymatique. Les autres enzymes (arylsulfatase, phosphatase et β-glucosidase), sont

moins sensibles au changement de pH et présentent essentiellement une inhibition de leur activité

dans les sols contaminés par rapport aux sols témoins. Pour l’arylsulfatase, qui opère à un pH

optimal de 5,8 [163], on ne peut relier une caractéristique physico-chimique particulière aux sols

dont l’activité est la plus importante (sol 4, 3, 8 et 10). Cette enzyme est reliée au cycle du

souffre, et il aurait été intéressant de différencier les sols par leur contenu en souffre pour étudier

103

son activité. En effet, elle hydrolyse les esters de souffre en souffre [125, 126, 130]. Le même

constat est observé pour la phosphatase acide (pH optimal de 6,5 [163]) quant à l’activation de

l’activité enzymatique dans les sols contaminés pour les sols 11, 10, 4 et A. Les sols contaminés

11 et 4 présentent tout de même une plus forte teneur en MO. Enfin, la β-glucosidase dont le pH

optimal est 6,0 [163], se voit activé de manière plus importante dans les sols contaminés 11, 24 et

3 (dont le pH chute de 7,03 à 6,66), avec une augmentation de la MO dans les sols 11 et le 3.

Aussi, on remarque que l’activité enzymatique est en général plus importante dans les sols avec

une teneur en carbone (MO) plus élevée comme le sol 14 et 8. Or, sans parler du rôle de la

matière organique en tant que nutriment pour les micro-organismes, la β-glucosidase est associée

au cycle du carbone, cela n’a donc rien d’étonnant. Le pH n’a pas un effet déterminant pour les

trois dernières enzymes citées ci-haut qui seraient ainsi moins sensibles au changement de pH.

Pourtant, Wuana et al. (2011) observent une forte corrélation du pH et de la MO avec les activités

enzymatiques, la dernière constatation étant alignée avec les conclusions tirées plus haut. Selon la

littérature, le pH et la MO seraient les facteurs les plus importants qui influent sur la dissolution

du métal et donc sur sa biodisponibilité. Le pH influe aussi sur la vitesse de la réaction de

l’enzyme-substrat, c’est pour cette raison que certaines études utilisent des tampons à la place de

l’eau déionisée. Cependant, cela peut avoir un impact sur la spéciation métallique et sur certaines

communautés microbiennes qui seraient affectées par un changement soudain de pH. Les

corrélations positives entre les enzymes et la MO et d’autres propriétés du sol seraient reliés à la

disponibilité des nutriments (CEC et pH) et une corrélation négative avec la teneur en Cu a été

observée par plusieurs auteurs (Fernández-Calviño et al., 2010 ; Kuperman et al., 1997 ; Li et al.,

2009 ; Wang et al., 2009) suggérant que les activité enzymatiques du sol sont principalement

limitées par des facteurs édaphiques comme le pH ou la disponibilité du carbone (MO) et la

présence de Cu toxique [52, 105, 122, 154]. Smolder et al. (2009) estiment de leur côté que le pH

du sol n’explique pas la toxicité observée pour la plupart des sols de leur étude [152]. Oorts et al.

(2006) relient quant à eux la toxicité du Cu sur les processus microbiens à la CEC, l’argile, et le

carbone organique (COT) [83]. L’augmentation de cations salins dans les sols peut aussi avoir un

effet inhibitoire sur la toxicité du Cu puisqu’ils sont en compétition avec la fraction dissoute du

métal pour le site actif des micro-organismes. Et l’utilisation de contre ions tel que le Cl- peut

aussi avoir une influence sur les réponses toxiques observées tel que rapporté par Schwertfeger et

al. (2013) [153]. Un autre aspect à considérer dans l’augmentation de l’activité enzymatique entre

104

les sols témoins et les sols contaminés est la possibilité d’une carence en Cu dans les sols

concernés. Il ne faut pas oublier que le Cu est un métal essentiel au développement et à la survie

des micro-organismes. Pour évaluer ce paramètre, il aurait fallut contaminer chaque sol à des

concentrations de Cu différentes.

Kandeler et al. (1996) estiment que l’activité des enzymes du cycle du carbone (invertase et β-

glucosidase) sont moins sensibles que celle des enzymes des cycles de l’azote, du phosphore et

du souffre (respectivement, la protéase, la phosphatase et l’arylsulfatase) [164]. Cela ne semble

pas être le cas de la présente étude, où les enzymes sont sensibles de manière différente mais sans

aucune distinction de sensibilité accrue ou non. Fernández-calviño et al. (2010) estiment que la

phosphatase et la β-glucosidase répondent de façon similaire à une addition de Cu par le biais de

pesticides au Cu avec une sensibilité prononcée pour la phosphatase [105], tandis que Kuperman

et al. (1997) observent l’inverse [154]. Les divergences de conclusion entre les différentes études

et cette étude peuvent être dues aux différences entre les structures des communautés

microbiennes des sols qui varient sensiblement à une contamination métallique [157] surtout en

présence d’une aussi grande variabilité de pH. Le pH est connu pour son effet déterminant sur les

communautés microbiennes puisque des espèces complètement différentes peuvent être

prédominantes à des pH différents. Ces modifications de la flore microbienne induites par le pH

devraient être reflétées sur le niveau de l’activité enzymatique [164]. Aussi, le pH est étroitement

lié à la spéciation du Cu et à la toxicité de l’ion Cu2+ de part son rôle dual (dissout le Cu mais les

ions H+ peuvent rentrer en compétition avec les ions Cu2+ pour la liaison au niveau du ligand

biotique) [105].

Pour les sols de vignoble, on observe une plage de concentration de produit suite à l’activité

enzymatique plus restreinte, en raison de la plus petite fourchette de concentration en Cu soluble

et de leurs caractéristiques physico-chimiques semblables. Le classement des sols en terme de

force de l’activité enzymatique est différent pour chaque enzyme, les communautés microbiennes

peuvent être différentes entre les sols et l’utilisation de différents produits tels que les engrais et

les pesticides (qui ne sont pas les mêmes dépendamment du sol) peuvent avoir eu une influence

sur ce classement. Selon les corrélations observées pour ces sols, la MO semble être une variable

influente sur l’activité enzymatique, ce qui vient renforcer les constatations établies pour les 15

paires de sols. Il est surprenant de n’observer aucune corrélation avec le Cu soluble dans ce cas-

ci, mettant l’emphase sur l’utilité de la contamination d’un même sol pour plusieurs

105

concentrations dans l’évaluation de l’effet du Cu. L’ébauche des courbes concentration-réponse

supporte cette constatation.

Enfin, seule la β-Glucosidase fournit une EC50 viable et sensée pour les 15 paires de sols, soit une

concentration en Cu soluble de 1,62 ppm. Les données pour les courbes de concentration-réponse

de l’arylsulfatase et de la phosphatase s’ajustent moins au modèle, ne permettant pas d’obtenir

des EC50 fiables. Malheureusement, la littérature n’offre pas beaucoup de points de comparaison

pour l’effet de la concentration du Cu soluble sur l’activité de la β-Glucosidase, d’où

l’importance d’obtenir des données expérimentales afin de venir combler ce manque. Dans le

cadre de ce projet il n’a donc pas été possible de développer un indicateur unique agrégeant la

réponse des 6 enzymes pour les 15 paires de sols. Les propriétés physico-chimiques trop

variables ont interféré avec la possibilité d’observer une tendance. En effet, les concentrations de

Cu soluble et de Cu total ne sont que très peu corrélées aux différentes activités enzymatiques,

tandis qu’on l’on observe une forte influence des propriétés physico-chimiques, notamment le pH

et la MO. Les sols de vignoble, présentant des caractéristiques physico-chimiques similaires ont

permis d’observer une tendance similaire d’inhibition pour toutes les enzymes sauf

l’arylsulfatase. Le nombre de données étant insuffisant pour ajuster des courbes de tendance, il

serait intéressant de poursuivre l’étude en évaluant l’activité enzymatique pour des sols aux

caractéristiques physico-chimiques identiques, et ce pour différentes concentrations de Cu.

Alternativement, extraire des EC50 pour le même sol à différentes concentrations de Cu et ce

pour plusieurs sols permettrait de comparer les EC50 entre elles et de vérifier si l’on peut grouper

les sols selon des archétypes.

6.4 Discussion de la méthodologie

6.4.1 Protocoles

Lors de la mesure de la capacité de rétention au champ, il faut attendre que la dernière goutte

passante tombe avant de pouvoir prélever les 3 portions de sol nécessaires à l’analyse. Ce test est

106

visuel et ne se base sur aucun seuil défini mis à part l’évaluation arbitraire de la personne en

charge de l’expérience. Cette expérience est difficilement reproductible de façon fiable d’une

mesure à une autre. Or la CRC est une mesure qui influe sur pratiquement toutes les autres

mesures puisque les résultats obtenus sont ramenés en terme de sol sec, la CRC permettant

d’évaluer le pourcentage d’humidité dans les sols. Est-ce que ce biais aurait pu avoir une

influence notable sur les résultats finaux ? Afin de parer à ce genre de problème, il aurait fallu

effectuer l’expérience trois fois avec trois réplicas pour chaque expérience. La même constatation

est faite pour toutes les expériences. Malheureusement un coût financier et temporel est associé à

ce genre de pratique. La décision d’aller de l’avant avec une expérience et 3 réplicas a quand

même permis d’obtenir des résultats similaires sans observer un trop grand écart type pour la

plupart.

Aussi, certains essais enzymatiques présentent beaucoup d’étapes, ce qui accroit la possibilité

d’erreurs expérimentales. Les enzymes tel que l’invertase et la protéase en font parties et tel que

l’on a pu l’observer, peu de sols sont significativement différents pour une même paire entre le

sol témoins et le sol contaminé. Des écart-types plus élevés ont été rapportés pour ces deux

enzymes, contrairement à l’arylsulfatase, la phosphatase et la β-glucosidase qui présentent moins

d’étapes dans leur protocole. Afin de mitiger cette variabilité expérimentale, il aurait fallu répéter

l’expérience plusieurs fois. Sauf que dans le cadre de ce projet, il existait une contrainte non

négligeable : la planification serrée dans le temps des analyses physico-chimiques et des essais

enzymatiques. Afin d’obtenir plus de données, il aurait fallu étaler les essais enzymatiques sur

une plus grande période de temps. Or le défi était de mener les expériences dans un laps de temps

restreint puisque l’activité enzymatique, la spéciation du Cu et les propriétés physico-chimiques

tendent à changer avec le temps. La comparaison entre les enzymes n’aurait donc pas été

possible.

6.4.2 Choix des sols

L’idée derrière la sélection de sols présentant des propriétés physico-chimiques différentes était

de pouvoir par la suite extraire un indicateur global indépendamment du type de sol comme

Lessard et al. (2014) dans le cas du zinc [115]. Force est de constater que les sols sélectionnés

dans le cas du zinc n’étaient peut-être pas les sols propices à l’évaluation de la toxicité du Cu.

D’autant plus que les sols choisis par ces auteurs présentait déjà une contamination « naturelle »

107

au zinc, alors que dans le cas de cette étude, la contamination au Cu a été induite artificiellement.

De plus, dans les sols de terrains, on observe souvent une contamination déjà présente pour

d’autres métaux ou d’autres composés organiques, ce qui rend l’interprétation des résultats plus

ardue. Une manière de pallier à ce problème serait d’utiliser des sols exempts de toute autre

contamination métallique, écartant ainsi la possibilité de l’effet d’un autre métal divalent tel que

le plomb ou le cobalt sur l’activité enzymatique. La réalité fait que ce genre de sol est peu

disponible et ne représente pas des conditions de terrains générale [100]. Les indicateurs extraits

de ce genre de sol trop épurés ne seraient pas représentatifs des conditions observées dans les sols

de manière générale. Les échanges entre les différents compartiments (sol, air, eau et sédiments)

étant un paramètre non négligeable.

6.4.3 Vieillissement des sols et chute de pH

Même si le processus de vieillissement artificiel des sols a été éprouvé par plusieurs auteurs [19,

84], dans le cadre de cet étude beaucoup de sols ont vu leur pH chuter plus ou moins

drastiquement (jusqu’à 1,4 unité de pH) après le processus de contamination au CuCl2 pour les

sols contaminés et au CaCl2 pour les sols témoins. Or le pH est une caractéristique physico-

chimique qui à une forte influence sur la spéciation du Cu et sur la flore microbienne. Il faudrait

donc suivre une procédure de lixiviation plus rigoureuse et ce plusieurs fois car bien que dans

certains cas les auteurs n’aient pas observé de différence dans le pH du sol après la lixiviation,

certains l’ont fait [153]. Il existe des méthodes permettant de réduire considérablement l’excès en

cations salins. Ce sont des méthodes requérant des étapes répétées de lixiviation qui sont

beaucoup plus longues. Aussi, la concentration de Cu total entre des sols fraîchements

contaminés, des sols lixiviés et des sols vieillis ne semble pas différente dans l’étude de Ooorts et

al. (2005). Par contre la concentration en Cu soluble diffère d’un sol à l’autre allant de plus

concentrée dans les sols fraîchements contaminés à moins concentrée dans les sols vieillis [83].

La variable de temporalité étant importante pour l’évaluation de la toxicité du Cu.

6.4.4 Distribution du Cu

Tel que vu dans la revue critique de la littérature et dans le cadre de cette étude, la concentration

en Cu total est définitivement non corrélée à la toxicité du Cu. Cependant, un dernier aspect à

considérer est qu’il y a une possibilité que la fraction de Cu soluble ne soit pas totalement

108

représentative de la toxicité d’où l’importance de prendre en compte la distribution du Cu dans le

sol. Certains auteurs estiment que l’activité de l’ion libre n’est peut-être pas un indicateur de

réponse écotoxicologique assez sensible, surtout dans les sols acides [79] et qu’il est plus

probable que la fraction biodisponible inclue plus que la fraction labile [80]. Sauf qu’une partie

du Cu dans la fraction soluble peut-être adsorbée par la MOD ce qui rend difficile de lier les

effets de cette fraction sur une période de temps et fait plutôt état de sa toxicité à un temps t.

109

CHAPITRE 7 CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS

7.1 Conclusion

Dans le cadre d’une contamination au Cu de 15 paires de sols, nous avons pu observer que les

propriétés physico-chimiques des sols ont une grande influence sur la spéciation du Cu mais aussi

sur l’activité enzymatique, en particulier la MO et le pH, ce qui va dans le même sens que

beaucoup d’auteurs. L’évaluation de l’effet toxique du Cu ne peut se faire sans prendre en

compte ces paramètres qui jouent un rôle crucial pour les micro-organismes du sol, notamment

pour les communautés qui régissent les cycle du carbone et de l’azote par le biais de l’invertase et

de la protéase.

Bien qu’il n’ait pas été possible d’extraire des données EC50 pour chaque enzyme pour les 15 sols

échantillonnés, une tendance positive a été dégagée. En effet, pour la β-glucosidase pour des sols

dont les pH neutres été similaires (sauf pour le sol A dont le pH été plus acide) et dont la

concentration en Cu soluble couvrait une plage de 0,06 à 11,16 mg Cu soluble/kg sol sec (sol A,

le pH plus acide fait en sorte de solubiliser le Cu), la EC50 a été obtenue en traçant les %AE en

fonction de la concentration de Cu soluble est de 1,2 mg Cu soluble/kg sol sec. La possibilité de

comparaison avec la littérature est non existante puisque beaucoup d’articles s’intéressent aux

plantes et aux invertébrés du sol ou utilisent la concentration de Cu total. Aussi, l’influence du

pH nuit à la comparaison de résultats provenant de sols dont les propriétés chimiques diffèrent.

Son rôle dans la spéciation du Cu et la compétition entre l’ion H+ et Cu2+ au ligand biotique font

qu’il est difficile de découpler se deux effets afin d’expliquer la toxicité du Cu sur les micro-

organismes sans prendre en compte ce paramètre crucial. Quant à la MO, une contamination au

Cu peut augmenter sa teneur dans les sols, ce qui augmente de manière temporaire l’activité

enzymatique.

Finalement, l’évaluation de la toxicité du Cu dans les sols de vignoble aux caractéristiques

physico-chimiques semblables a permis de déceler une certaine similarité du comportement des

sols par rapport à une contamination au Cu. Les courbes concentrations-réponses présentent des

tendances identiques pour toutes les enzymes sauf pour l’arylsulfatase, soit l’esquisse d’une

forme de cloche qui se rapprocherait de la courbe d’essentialité du Cu. Cela met de l’avant la

110

nécessité d’étudier des sols dont les caractéristiques physico-chimiques sont semblables et

d’extraire des EC50 sur la base d’archétypes.

7.2 Recommandations et perspectives

7.2.1 Recommandations

Cette étude permet de dégager des recommandations d’amélioration méthodologique afin

d’obtenir des EC50 qui pourront être intégrées dans les bases de données d’écotoxicologie :

- Mise en place d’une nouvelle méthodologie afin de considérer la concentration totale en

fonction des archétypes de sol, le pH, la teneur en MO, etc… mais aussi de tenir compte de la

végétation environnante. L’évaluation du risque environnemental ne devrait pas se faire

seulement sur la base des indicateurs sans tenir compte des conditions dans lesquelles ces

indicateurs ont été obtenus. Beaucoup de paramètres physico-chimique ont un double rôle ce qui

rend la prédiction de la réponse toxique très complexe. Ce qui est applicable à un sol, ne le sera

pas pour un autre.

- Évaluer la spéciation totale du Cu (Cu organique, échangeable, soluble et labile) afin de voir

quelle fraction de l’effet toxique serait la plus représentative lors l’obtention de données EC50

(Quelle fraction permettrait d’obtenir les régressions les plus fortes significativement).

- Obtenir des échantillons de sols mono-contaminés et multi-contaminés afin de comparer les

EC50 et de développer des facteurs de conversion qui permettraient d’intégrer la contamination

d’autres métaux.

- Tester le vieillissement de la toxicité du Cu sur les micro-organismes afin de tirer un indicateur

qui serait fonction du temps, dans la mesure où une contamination tend à vieillir et présente donc

des risques différents au cours du temps. Dans la même optique, certains sols reçoivent des

quantités de Cu sur une base régulière. Il serait intéressant d’évaluer la stabilité enzymatique pour

une contamination quotidienne et récurrente car les enzymes finissent par construire une

résistance au Cu. Certaines communautés disparaitront mais d’autres survivront : quelle sera alors

la santé du sol, quels cycles en seront affectés ?

- Suivre une procédure de lixiviation plus rigoureuse et ce plusieurs fois car même si Oorts et al.

(2006) n’ont pas observé de différence dans le pH du sol [83], Lock et al. (2003) observent le

111

contraire [86] et c’est d’ailleurs le cas pour le présent projet. Les méthodes demandant plus de

cycle de lixiviation, sont plus longues mais permettrait de se rapprocher du vieillissement observé

sur le terrain [153].

- Augmenter le nombre d’expériences. La matrice du sol est très complexe et ce qui est vrai pour

un sol peut ne pas être vrai pour d’autre. Dans un même sol, on peut tomber sur des échantillons

différents de par la nature hétérogène de celui-ci. Par exemple, dans les sols très argileux nous

pouvons nous retrouver avec des agrégats qui n’ont pas les mêmes valeurs physico-chimiques,

quoique proches. De ce fait les expériences sur les sols se doivent d’être beaucoup plus

nombreuses dans la répétition afin de pouvoir utiliser des méthodes de simulation (e.g :

simulation de Monte-Carlo) pour obtenir un portrait plus précis.

7.2.2 Perspectives

Beaucoup d’auteurs insistent sur la nécessité d’obtenir des données expérimentales pour

l’écotoxicité terrestre plutôt que de les convertir depuis l’écotoxicité aquatique (Haye et al.,

2007 ; Hauschild et al., 2013). Ces données pourront non seulement venir alimenter les

différentes bases de données écotoxicologique mais aussi être utilisées dans les méthodes

d’évaluation en ACV tel qu’IMPACT World+ qui intègre la variabilité régionale des

contaminations métalliques mais aussi la spéciation.

De plus ce projet participe au développement de méthodes plus rigoureuses pour l’évaluation de

l’écotoxicité terrestre qui n’est pas chose facile compte tenu de la nature hétérogène des sols. Il

reste encore bien du chemin à faire avant de pouvoir considérer l’écotoxicité terrestre comme un

impact aussi bien compris que l’écotoxicité aquatique.

112

BIBLIOGRAPHIE

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[124] G. F. Antonious, "Impact of Soil Management and Two Botanical Insecticides on Urease and Invertase Activity," Journal of Environmental Science and Health, Part B, vol. 38, pp. 479-488, 2003/06/01 2003.

[125] G. Renella, A. L. R. Ortigoza, L. Landi, and P. Nannipieri, "Additive effects of copper and zinc on cadmium toxicity on phosphatase activities and ATP content of soil as estimated by the ecological dose (ED50)," Soil Biology and Biochemistry, vol. 35, pp. 1203-1210, 9// 2003.

[126] J. H. Makoi and P. A. Ndakidemi, "Selected soil enzymes: examples of their potential roles in the ecosystem," African Journal of Biotechnology, vol. 7, 2008.

[127] J. Wyszkowska, M. Kucharski, J. Kucharski, and A. Borowik, "Activity of dehydrogenases, catalase and urease in copper polluted soil," Journal of Elementology, vol. 14, pp. 605-617, 2009.

121

[128] D. Geisseler and W. R. Horwath, "Regulation of extracellular protease activity in soil in response to different sources and concentrations of nitrogen and carbon," Soil Biology and Biochemistry, vol. 40, pp. 3040-3048, 12// 2008.

[129] D. Effron, A. M. de la Horra, R. L. Defrieri, V. Fontanive, and R. M. Palma, "Effect of Cadmium, Copper, and Lead on Different Enzyme Activities in a Native Forest Soil," Communications in Soil Science and Plant Analysis, vol. 35, pp. 1309-1321, 2004/12/31 2004.

[130] S. Das and A. Varma, "Role of Enzymes in Maintaining Soil Health," in Soil Enzymology. vol. 22, G. Shukla and A. Varma, Eds., ed: Springer Berlin Heidelberg, 2011, pp. 25-42.

[131] J. Wyszkowska, M. a. Kucharski, and J. Kucharski, "Activity of beta-glucosidase, arylsulfatase and phosphatases in soil contaminated with copper," Journal of Elementology, vol. 15, pp. 213-226, 2010.

[132] D. P. German, M. N. Weintraub, A. S. Grandy, C. L. Lauber, Z. L. Rinkes, and S. D. Allison, "Optimization of hydrolytic and oxidative enzyme methods for ecosystem studies," Soil Biology and Biochemistry, vol. 43, pp. 1387-1397, 7// 2011.

[133] I.-S. Lee, O. K. Kim, Y.-Y. Chang, B. Bae, H. H. Kim, and K. H. Baek, "Heavy metal concentrations and enzyme activities in soil from a contaminated Korean shooting range," Journal of Bioscience and Bioengineering, vol. 94, pp. 406-411, // 2002.

[134] W. Dick, L. Cheng, and P. Wang, "Soil acid and alkaline phosphatase activity as pH adjustment indicators," Soil Biology and Biochemistry, vol. 32, pp. 1915-1919, 2000.

[135] Methods in Soil Biology: Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1996.

[136] I. Lessard, G. Renella, S. Sauvé, and L. Deschênes, "Metal toxicity assessment in soils using enzymatic activity: Can water be used as a surrogate buffer?," Soil Biology and Biochemistry, vol. 57, pp. 256-263, 2013.

[137] S. Sauvé, "Copper inhibition of soil organic matter decomposition in a seventy-year field exposure," Environmental Toxicology and Chemistry, vol. 25, pp. 854-857, 2006.

[138] I. Lessard, S. Sauvé, and L. Deschênes, "Enzymatic functional stability of Zn-contaminated field-collected soils: An ecotoxicological perspective," Science of The Total Environment, vol. 484, pp. 1-9, 6/15/ 2014.

[139] M. Csuros and C. Csuros, Environmental sampling and analysis for metals: CRC Press, 2016.

[140] M. R. Carter, Soil sampling and methods of analysis: CRC Press, 1993.

[141] T. D. Martin, J. T. Creed, and S. Long, "Sample preparation procedure for spectrochimical determination of total recoverable elements," Methods for the Determination of Metals in Environmental Samples. BOCA RATON: CK SMOLEY, pp. 15-24, 1992.

[142] G. J. Zagury, Étude d'un traitement par biolixiviation au moyen de la microflore indigène ferrooxydante des sols contaminés aux métaux lourds (Zn, Cu, Mn): Université de Sherbrooke, 1997.

122

[143] H. Chapman, "Cation-exchange capacity," Methods of soil analysis. Part 2. Chemical and microbiological properties, pp. 891-901, 1965.

[144] M. R. Carter and E. G. Gregorich, Eds., Soil Sampling and Methods of Analysis. Boca Raton: CRC Press, Taylor and Francis Group, 2008, p.^pp. Pages.

[145] S. Sauvé, A. Dumestre, M. McBride, and W. Hendershot, "Derivation of soil quality criteria using predicted chemical speciation of Pb2+ and Cu2+," Environmental Toxicology and Chemistry, vol. 17, pp. 1481-1489, 1998.

[146] R. Öhlinger, F. Schinner, E. Kandeler, and R. Margesin, "Methods in soil biology," Methods in soil biology, 1996.

[147] T. W. Speir, H. A. Kettles, A. Parshotam, P. L. Searle, and L. N. C. Vlaar, "A simple kinetic approach to derive the ecological dose value, ED50, for the assessment of Cr(VI) toxicity to soil biological properties," Soil Biology and Biochemistry, vol. 27, pp. 801-810, 1995/06/01 1995.

[148] L. Haanstra, P. Doelman, and J. H. O. Voshaar, "The use of sigmoidal dose response curves in soil ecotoxicological research," Plant and Soil, vol. 84, pp. 293-297, 1985// 1985.

[149] J. A. Lima, E. Nahas, and A. C. Gomes, "Microbial populations and activities in sewage sludge and phosphate fertilizer-amended soil," Applied Soil Ecology, vol. 4, pp. 75-82, 1996/07/01 1996.

[150] A. J. Bailer and J. T. Oris, "Estimating inhibition concentrations for different response scales using generalized linear models," Environmental Toxicology and Chemistry, vol. 16, pp. 1554-1559, 1997.

[151] A. J. Bailer, M. R. Hughes, D. L. Denton, and J. T. Oris, "An empirical comparison of effective concentration estimators for evaluating aquatic toxicity test responses," Environmental toxicology and chemistry, vol. 19, pp. 141-150, 2000.

[152] E. Smolders, K. Oorts, P. Van Sprang, I. Schoeters, C. R. Janssen, S. P. McGrath, et al., "Toxicity of Trace Metals in Soil as Affected by Soil Type and Aging After Contamination: Using Calibrated Bioavailability Models to Set Ecological Soil Standards," Environmental Toxicology and Chemistry, vol. 28, pp. 1633-1642, 2009.

[153] D. M. Schwertfeger and W. H. Hendershot, "Spike/Leach Procedure to Prepare Soil Samples for Trace Metal Ecotoxicity Testing: Method Development Using Copper," Communications in Soil Science and Plant Analysis, vol. 44, pp. 1570-1587, 2013/05/31 2013.

[154] R. G. Kuperman and M. M. Carreiro, "Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem," Soil Biology and Biochemistry, vol. 29, pp. 179-190, 2// 1997.

[155] G. Carbonell, M. V. Pablos, P. Garcı́a, C. Ramos, P. Sánchez, C. Fernández, et al., "Rapid and cost-effective multiparameter toxicity tests for soil microorganisms," Science of The Total Environment, vol. 247, pp. 143-150, 2000.

123

[156] C. M. Daoust, C. Bastien, and L. Deschênes, "Influence of soil properties and aging on the toxicity of copper on compost worm and barley," Journal of environmental quality, vol. 35, pp. 558-567, 2006.

[157] R. Kızılkaya, T. Aşkın, B. Bayraklı, and M. Sağlam, "Microbiological characteristics of soils contaminated with heavy metals," European Journal of Soil Biology, vol. 40, pp. 95-102, 4// 2004.

[158] S. Heidary-Monfared, "Community Garden Heavy Metal Study," 2011.

[159] L. Gianfreda and P. Ruggiero, "Enzyme Activities in Soil," in Nucleic Acids and Proteins in Soil, P. Nannipieri and K. Smalla, Eds., ed Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 2006, pp. 257-311.

[160] G. M. Chaer, D. D. Myrold, and P. J. Bottomley, "A soil quality index based on the equilibrium between soil organic matter and biochemical properties of undisturbed coniferous forest soils of the Pacific Northwest," Soil Biology and Biochemistry, vol. 41, pp. 822-830, 4// 2009.

[161] L. Du, H. Pang, Z. Wang, J. Lu, Y. Wei, and R. Huang, "Characterization of an invertase with pH tolerance and truncation of its N-terminal to shift optimum activity toward neutral pH," PloS one, vol. 8, p. e62306, 2013.

[162] K. Rejsek, P. Formanek, and M. Pavelka, "Estimation of protease activity in soils at low temperatures by casein amendment and with substitution of buffer by demineralized water," Amino acids, vol. 35, pp. 411-417, 2008.

[163] V. Acosta-Martínez and M. A. Tabatabai, "Enzyme activities in a limed agricultural soil," Biology and Fertility of Soils, vol. 31, pp. 85-91, 2000.

[164] F. Kandeler, C. Kampichler, and O. Horak, "Influence of heavy metals on the functional diversity of soil microbial communities," Biology and Fertility of Soils, vol. 23, pp. 299-306, 1996/10/01 1996.

Tejada, M., Hernandez, M. T., & Garcia, C. (2006). Application of Two Organic Amendments on Soil Restoration: Effects on the Soil Biological Properties. J Environ Qual, 35(4), 1010-1017.

124

ANNEXES

ANNEXE A1 - ÉCHANTILLONNAGE DE SOLS PRÈS DE STRUCTURES FAITES

D’ACIER GALVANISÉ

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL

Protocole # :PE73-A Nombre de pages : 20

Version :2 Date : 6 janvier 2016

Auteur(s): Geneviève Plouffe

Isabelle Lessard

Approuvé par :

Lucie Jean

Louise Deschênes

Signatures : Date :

Titre : Échantillonnage de sols près de structures faites d’acier galvanisé dans le

cadre du projet de contamination de sols au nickel pour des fins d’analyses physico-

chimiques et écotoxiques, faisant suite à un projet de contamination de sols au zinc

125

Mots clés : Échantillons, pylônes électriques, sols, métaux, propriétés texturales,

pH, matière organique.

1. OBJECTIF

Ce protocole explique la méthodologie utilisée pour échantillonner des sols de référence

près des structures métalliques galvanisées dans le but de procéder à leur contamination

au nickel et d’en analyser les propriétés physico-chimiques et écotoxiques. Ce projet fait

suite à un projet d’analyses de sols contaminés au zinc et vise à échantillonner les

mêmes sols de référence que ceux déterminés dans le projet initial sur le zinc.

Dans le cadre de ce projet, une quinzaine de pylônes seront sélectionnés. Pour chacun

des pylônes ciblés, un échantillon de sol de référence (blanc de terrain, non-contaminé)

sera récolté à quelques mètres du pylône. La figure A présente la localisation générale

des zones de référence.

Le choix des échantillons repose sur la variété des types de sols retrouvés dans les

régions habitées du Québec. La plupart des échantillons proviendront de la grande

région métropolitaine de Montréal (Lanaudière, Laurentides, Montérégie, Île de

Montréal, Laval) et deux paires d’échantillons proviendront de la forêt boréale, où les

sols sont habituellement plus acides.

D’un point de vue logistique, environ cinq paires d’échantillons peuvent être prélevées

par jour; il faut donc prévoir un minimum de 3 jours d’échantillonnage sans compter les

échantillons des forêts boréales et mixtes.

2. MATÉRIEL

À emporter lors de la campagne d’échantillonnage

126

• Pelles (grosse, petites), de préférence en acier inoxydable

• Ustensiles de plastique (cuillères, râteau)

• Chaudières en plastique de 5L pour la conservation des échantillons (2 par

pylône)

• Ruban de mesure 30 m

• Règle rigide de 30 cm

• Boussole, appareil photo

• 2 chaudières vides de 20L pour les déchets de rinçages

• 1 chaudière de 10L contenant de l’acide nitrique ~10% pour le trempage (1 L

d’acide nitrique 70% qualité ACS + 6 L d’eau du robinet)

• 2 chaudières contenant ~10L d’eau purifiée (nanopure), préalablement rincées à

l’acide acide nitrique 10% (pour le rinçage) + un contenant pour transvider lors

du rinçage

• 2 chaudières de 20L d’eau du robinet avec un petit gobelet pour mouiller et

rincer.

• Savon Sparkleen en solution, brosses à poils doux, poudre Sparkleen

• Papier pH

• Contenants en plastique de 50 mL avec bouchon remplis de 40 mL d’eau

distillée

• Sacs Ziploc larges, sac à déchets

• Papier essuie-tout Bounty ou guenilles sans charpie

• Cahier de laboratoire, crayon

• Combinaisons de terrain, gants néoprène (noir) ou Vitex (vert)

• Lunettes de sécurité

127

• Gants de labo bleus

• Bottes de construction ou bottes d’hiver

• Imperméables et vêtements chauds ou crème solaire

• Cartes routières

3. MÉTHODOLOGIE

3.1 Localisation des échantillons

Afin d’estimer les paramètres de la population des sols de façon diffuse dans les régions

tempérées du Québec, 15 paires d’échantillons de sols seront récoltées à proximité de

pylônes électriques situés dans la grande région métropolitaine de Montréal.

3.1.1 Île de Montréal et Laval

L’Île de Montréal et l’Île Jésus sont reconnues pour leurs sols argileux à pH plutôt

neutre. Quatre à cinq pylônes seront choisis de façon aléatoire sur des lignes de

transmission différentes. La figure B en annexe présente le réseau de lignes électriques

et les principales routes sur les îles de la région métropolitaine; les lignes de

transmission sont principalement localisées à Laval (Fabreville, St-François, Vimont) et

à la pointe est de l’Île de Montréal (Pointe-aux-Trembles, Rivière-des-Prairies).

3.1.2 Laurentides et Lanaudière

La figure C, la figure D et la figure E en annexe présentent les lignes de transmission et

le réseau routier des régions Laurentides et Lanaudière. Quatre à cinq paires

d’échantillons y seront récoltées de façon aléatoire, en prenant soin d’en cibler une paire

dans les environs de Mirabel, où les sols sont connus pour être majoritairement

sablonneux.

3.1.3 Montérégie

128

La figure F, la figure G et la figure H en annexe présentent les lignes de transmission et

le réseau routier de la région montérégienne. Quatre à cinq paires d’échantillons y seront

récoltées de façon aléatoire, en prenant soin d’échantillonner dans les environs de St-

Rémi (sol organique) et de Delson (sol argileux). La ligne de transmission entre St-

Basile-le-Grand et St-Césaire et celle entre Chambly et St-Césaire ont été presque

entièrement reconstruites suite à la tempête du verglas de 1998, et des échantillons

devraient y être prélevés (voir Figure ).

3.1.4 Autres régions

Deux échantillons seront prélevés sur une ligne de transmission située dans la forêt

boréale, entre la ville de La Tuque et le Lac St-Jean (voir figure I). Tel que mentionné

en introduction, les sols des forêts de conifères sont intéressants puisqu’ils sont

habituellement acides.

3.2 Lavage des équipements d’échantillonnage

Quelques jours avant l’échantillonnage et avant chaque prélèvement, procéder à la

première et à la deuxième étape de décontamination (voir§0 et §0) de tous les

équipements utilisés lors de l’échantillonnage (pelles, ustensiles en plastique, etc.).

L’efficacité du nettoyage repose sur le soin qu’apporte le préleveur à chacune des étapes

de la décontamination. Un rinçage adéquat consiste à mettre en contact une quantité

suffisante de solvant avec les surfaces de l’équipement d’échantillonnage qui entrera en

contact avec le sol. La propreté des outils utilisés pour l’échantillonnage est considérée

comme un des éléments de toute première importance et une attention spéciale et

constante doit être accordée à cet aspect afin de s’assurer d’éliminer tout risque de

contamination croisée.

3.2.1 Première étape

1. Rincer à l’eau du robinet pour enlever les résidus majeurs à l’aide du contenant 4 L;

129

2. Brosser les surfaces avec une brosse à poils doux, de l’eau du robinet et un détergent sans

phosphate (Sparkleen);

3. Rincer à l’eau du robinet pour enlever le détergent à l’aide du contenant 4 L;

4. Rincer à l’eau purifiée (nanopure), égoutter le surplus.

3.2.2 Deuxième étape

1. Tremper à l’acide HNO3 10% pendant 3 minutes les ustensiles de plastique;

2. Rincer à l’acide les pelles sans les laisser tremper (l’acide attaque l’acier);

3. Rincer deux fois à l’eau purifiée de façon à enlever toute trace d’acide et égoutter le

surplus.

3.4 Prélèvement des échantillons selon la position et la dénivellation du pylône

Un échantillon de sol devra être pris pour chaque pylône ciblé :

l’échantillon de référence dont la concentration en nickel est près de la teneur

naturelle du sol (critère générique A, i.e. 50 ppm, ou entre A-B, non contaminé).

3.4.1 Reconnaissance de terrain

Pour chacun des pylônes sélectionnés, on débute d’abord par une reconnaissance de

terrain pour cibler le pylône idéal et localiser les zones d’égouttement de ce pylône. Le

pylône idéal se situe sur un terrain qui n’a pas reçu d’amendement organique ou

chimique et qui n’a pas été contaminé; les pylônes dans les champs agricoles

(amendement) et en bordure des routes (sol remblayé et contamination multiple à

l’huile, essence, sel, etc.) ne sont pas de bons candidats.

3.4.2 Échantillon de référence

1. À un minimum de 10 m de la base du pylône, en partant du milieu d’une

transversale entre 2 pieds du pylône, délimiter un carré d’environ 0.5 à 1 m2. Si le

130

pylône est situé sur un terrain en pente, il est plus sûr d’échantillonner le sol de

référence à au moins 10 m de la transversale créée par les deux pieds les plus élevés

du pylône; ainsi, on réduit le risque de prélever un échantillon de sol contaminé au

zinc suite à la percolation ou au ruissèlement des eaux de pluie.

2. Enlever la partie visible de la végétation (pelouse, graminées) à l’aide des mains ou

d’un instrument tranchant si nécessaire (ustensiles en plastique ou pelle recouverte

d’un sac Ziploc); secouer les racines de la végétation arrachée sur l’aire de

prélèvement afin de conserver au maximum le sol de surface;

3. Prélever le sol de surface directement dans la chaudière en ne récoltant que la

couche située à moins de 10 cm de profondeur; utiliser une règle pour vérifier la

profondeur;

3.5 Identification des lieux, de la municipalité et des échantillons

1. Pour chaque pylône, remplir une nouvelle feuille de route qui sera agrafée dans le

cahier de laboratoire (voir cette feuille à la fin de la section Annexe):

Identifier chaque pylône par un numéro ID unique;

Noter la date et l’adresse : municipalité, route(s) d’accès;

Transcrire les inscriptions visibles sur le pylône si possible (numéro

d’identification du pylône, date d’installation, etc.);

Prendre une photo et noter au cahier le numéro de la pose;

Faire un schéma ou un croquis de la position du pylône dans son environnement :

position et distance des pieds, routes, dénivellation (l’indiquer par une flèche dont la

pointe montre le sens de ruissellement), infrastructures environnantes;

Inscrire les observations et commentaires complémentaires.

2. Inscrire les principales informations sur la chaudière : numéro ID et ville

131

Notes et recommandations

En général, le zinc du sol provenant de la corrosion de matériaux galvanisés

n’est pas très mobile et reste sous la base du pylône [2].

Ne pas oublier que l’échantillonnage est destructeur du point d’échantillonnage;

il ne sera donc pas possible de ré-échantillonner une deuxième fois au même

endroit.

Ne pas remplir les trous créés lors de l’échantillonnage.

Les échantillons de sols doivent être entreposés à 4°C jusqu’à analyse; il est

fortement recommandé de faire les analyses dans les 6 mois suivant

l’échantillonnage [1]

4. RÉFÉRENCE(S)

[1] Csuros, M. and C. Csuros (2002). Environmental Sampling and Analysis for Metals. Florida, U.S.A., CRC Press LLC.

[2] Fava, G., R. Fratesi, M. L. Ruello and D. Sani (2002). "Soil zinc contamination from corrosion of galvanized structures." Chemistry and Ecology 18: 3-4.

132

5. ANNEXE(S)

Figure A : Localisation du prélèvement de l’échantillon de référence (R) dans le cas où

le pylône est installé sur un terrain en pente

133

Figure B : Lignes de transmission (rouge) et réseau routier (orange et kaki) de la région

métropolitaine

134

Figure C : Lignes de transmission (rouge) et réseau routier (orange et kaki) de la région

laurentienne (Secteur Lachute, Mirabel)

135

Figure D : Lignes de transmission (rouge) et réseau routier (orange et kaki) de la région

de Lanaudière (Secteur Mascouche, L’Assomption)

136

Figure E : Lignes de transmission (rouge) et réseau routier (orange et kaki) de la région

de Lanaudière (Secteur Joliette, St-Côme)

137

Figure F : Lignes de transmission (rouge) et réseau routier (orange et kaki) de la

Montérégie (St-Rémi, Chambly)

138

Figure G : Lignes de transmission (rouge) et réseau routier (orange et kaki) de la

Montérégie (St-Césaire)

139

Figure H : Lignes de transmission (rouge) et réseau routier (orange et kaki) de la

Montérégie (Beloeil)

140

Figure I : Lignes de transmission (rouge) et réseau routier (orange et kaki) de la

Mauricie (La Tuque, Rapide-Blanc

141

Pylône ID :

Croquis: Indiquer la position et la distance entre les pieds, les routes à proximité, la

dénivellation, du terrain les infrastructures environnantes. Marquer par une lettre

encerclée les endroits échantillonnés : C (contaminé) ou R (référence). Positionner

le nord magnétique.

Date :

Ville :

Route(s) d'accès :

Photo :

Dénivellation :

Si oui, l'indiquer d'une flèche en

pointant vers le sens de l'écoulementOui Non

Inscriptions sur le pylône :

142

Autres observations :

143

ANNEXE A2 - ÉCHANTILLONNAGE DE SOLS PRÈS DE CEPS DE VIGNE DANS

DES VIGNOBLES UTILISANT LA BOUILLIE BORDELAISE COMME PESTICIDE

DANS LE CADRE DU PROJET DE CONTAMINATION DE SOLS AU CUIVRE POUR

DES FINS D’ANALYSES PHYSICO-CHIMIQUES ET ÉCOTOXIQUES

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL

Protocole # :PE-72A Nombre de pages :8

Version :1 Date :31 juillet 2015

Auteur(s): Allison Meyssonnier

Approuvé par :

Lucie Jean

Signatures : Date :

31 juillet 2015

Titre : Échantillonnage de sols près de ceps de vigne dans des vignobles utilisant la

bouillie bordelaise comme pesticide dans le cadre du projet de contamination de sols au

cuivre pour des fins d’analyses physico-chimiques et écotoxiques.

144

Mots clés : Échantillons, vigne, cuivre, métaux, propriétés texturales, pH, matière

organique.

1. OBJECTIF

L’objectif de ce protocole est d’encadrer une campagne d’échantillonnage près de ceps

de vignes étant traités avec la bouillie bordelaise afin d’évaluer la spéciation, les

propriétés physico-chimiques et la toxicité du cuivre dans les sols. La bouillie bordelaise

est une substance composé de sulfate de cuivre neutralisé par de la chaux éteinte. Ce

sont les ions Cu2+qui vont affecter les enzymes dans les spores des champignons

parasites, empêchant ainsi leur germination.

Suite au transport des ions Cu2+ vers le sol, ceux-ci vont aussi affecter les

microorganismes terrestres qui sont essentiels à la santé des sols.

Il est important d’effectuer l’échantillonnage sur des sites ayant un historique de

contamination de plus de 10 ans. En effet, cela permet de couvrir l’effet de

bioaccumulation du cuivre dans les sols, mais aussi de permettre au sol et aux

microorganismes de trouver un équilibre sur le long terme, qui n’est pas forcément

atteint sur le court-terme.

2. MATÉRIEL

À emporter lors de la campagne d’échantillonnage

Pelles (grosse, petites), de préférence en acier inoxydable ;

Tamis en acier d’ouverture 2 mm ;

Ustensiles de plastique (cuillères, râteau) ;

Chaudières en plastique de 5L pour la conservation des échantillons (10 par site)

145

Ruban de mesure 30 m ;

Règle rigide de 30 cm ;

Boussole, appareil photo ;

2 chaudières vides de 20L pour les déchets de rinçages ;

1 chaudière de 10L contenant de l’acide nitrique ~10% pour le trempage (1 L

d’acide nitrique 70% qualité ACS + 6 L d’eau purifiée) ;

2 chaudières contenant ~10L d’eau purifiée (nanopure), préalablement rincées à

l’acide acide nitrique 10% (pour le rinçage) + un contenant pour transvider lors

du rinçage ;

2 chaudières de 20L d’eau purifiée avec un petit gobelet pour mouiller et

rincer. ;

Savon Sparkleen en solution, brosses à poils doux, poudre Sparkleen ;

Papier pH ;

Contenants en plastique de 50 mL avec bouchon remplis de 40 mL d’eau

distillée ;

Sacs Ziploc larges, sac à déchets ;

Papier essuie-tout Bounty ou guenilles sans charpie ;

Étiquettes autocollantes et crayons à encre indélébile ;

Glacières et contenants réfrigérants ou glace en quantité suffisante

Formulaires (échantillonnage, demande d'analyse, etc.) ;

Cahier de laboratoire, crayon ;

Combinaisons de terrain, gants néoprène (noir) ou Vitex (vert) ;

Lunettes de sécurité ;

Gants nitriles ;

Bottes de construction ;

Imperméables et vêtements chauds ou crème solaire ;

Trousse de premier soin ;

Cartes routières.

146

3. MÉTHODOLOGIE

3.1 Choix des sites

Dans le cahier de laboratoire :

1. Numérotation du site ;

2. Adresse (route, municipalité, propriétaire), schéma ou croquis (ceps de vigne,

points cardinaux, infrastructures environnantes) ;

3. Photos, noter au cahier le numéro de la pose ;

4. Observations et commentaires complémentaires : âge du vignoble, quantité de

bouillie bordelaise utilisée par an, historique du terrain (ex : champ, terrain

vague…), toute information supplémentaire pertinente au projet, etc… ;

5. Quadriller le site du vignoble sur une carte afin de définir les 9 points

d’échantillonnage définis à la section 3.4.2.

3.2 Lavage des équipements d’échantillonnage

Quelques jours avant l’échantillonnage et avant chaque prélèvement, il est important de

procéder avec soin et de façon efficace à la décontamination de tous les équipements

utilisés lors de l’échantillonnage (métal, plastique, contenants). Un rinçage adéquat

consiste à mettre en contact une quantité suffisante de solvant avec les surfaces de

l’équipement d’échantillonnage qui entrera en contact avec le sol. La propreté des outils

utilisés pour l’échantillonnage est considérée comme un des éléments de toute première

importance et une attention spéciale et constante doit être accordée à cet aspect afin de

s’assurer d’éliminer tout risque de contamination croisée.

Première étape

1. Rincer à l’eau du robinet pour enlever les résidus majeurs à l’aide du contenant 4

L;

2. Brosser les surfaces avec une brosse à poils doux, de l’eau du robinet et un

détergent sans phosphate (Sparkleen);

147

3. Rincer à l’eau du robinet pour enlever le détergent à l’aide du contenant 4 L;

4. Rincer à l’eau purifiée (nanopure), égoutter le surplus.

Deuxième étape

1. Tremper à l’acide HNO3 10% pendant 3 minutes les ustensiles de plastique;

2. Rincer à l’acide les pelles et tamis sans les laisser tremper (l’acide attaque

l’acier);

3. Rincer trois fois à l’eau distillée et trois fois à l’eau purifiée de façon à enlever

toute trace d’acide et égoutter le surplus.

3.3 Prélèvement des échantillons

Dix échantillons de sol devront être pris pour chaque vignoble ciblé :

� Neufs échantillons contenant du cuivre à une concentration supérieure au critère

générique B (contaminé, i.e. au delà de 100 ppm).

� Un échantillon de référence dont la concentration en cuivre est près de la teneur

naturelle du sol (critère générique A, i.e. 40 ppm, ou entre A-B, non contaminé).

3.4 Échantillonnage

3.4.1 Échantillon de référence

L’échantillon de référence doit être prélevé dans un lieu de végétation

« sauvage » non loin du vignoble (à une distance maximum de 10km) n’ayant subi

aucune contamination au cuivre. Cet échantillon permet de donner des informations

quant à la teneur naturelle en cuivre de la région.

Pour ce faire :

1. Délimiter un carré d’environ 0.5 à 1m2 ;

148

2. Enlever la partie visible de la végétation (pelouse, graminées) à l’aide des mains

ou d’un instrument tranchant si nécessaire (ustensiles en plastique ou pelle

recouverte d’un sac Ziploc); secouer les racines de la végétation arrachée sur

l’aire de prélèvement afin de conserver au maximum le sol de surface;

3. Prélever et tamiser (2 mm) le sol de surface directement dans la chaudière en ne

récoltant que la couche située à moins de 10 cm de profondeur; utiliser une règle

pour vérifier la profondeur;

4. Si la chaudière n’est pas pleine et que tout le sol de surface situé sur l’aire

délimitée a été ramassé, refaire les étapes 1 à 3 en se déplaçant de façon parallèle

aux ceps de vigne. Répéter jusqu’à ce que la chaudière soit remplie de sol

compacté. Mélanger minutieusement l’échantillon composite dans la chaudière

jusqu’à homogénéité.

3.4.2 Échantillons contaminés

L’échantillonnage doit se faire sur plusieurs rangées dans le vignoble afin de tenir

compte de l’hétérogénéité du sol (Wightwick et al., 2008) : une des rangées au milieu du

vignoble, une au quart du vignoble et une aux trois quarts.

Pour chaque rangée échantillonnée, trois échantillons devront être pris, soit au quart, à la

moitié et aux trois quarts de la rangée.

Pour chaque prélèvement d’échantillon, il faut suivre les étapes suivantes :

1. S’assurer d’être à moins de 30 cm des ceps de vigne à l’aide d’un ruban de

mesure ;

2. Délimiter un carré d’environ 0.5 à 1 m2 ;

3. Enlever la partie visible de la végétation (pelouse, graminées) à l’aide des mains

ou d’un instrument tranchant si nécessaire (ustensiles en plastique ou pelle

recouverte d’un sac Ziploc); secouer les racines de la végétation arrachée sur

l’aire de prélèvement afin de conserver au maximum le sol de surface;

149

4. Prélever et tamiser (2 mm) le sol de surface directement dans la chaudière en ne

récoltant que la couche située à moins de 10 cm de profondeur; utiliser une règle

pour vérifier la profondeur;

5. Si la chaudière n’est pas pleine et que tout le sol de surface situé sur l’aire

délimitée a été ramassé, refaire les étapes 1 à 3 en se déplaçant de façon parallèle

aux ceps de vigne. Répéter jusqu’à ce que la chaudière soit remplie de sol

compacté. Mélanger minutieusement l’échantillon composite dans la chaudière

jusqu’à homogénéité.

6. Une fois l’échantillon contaminé prélevé, creuser encore un peu plus jusqu’à 18

cm de profondeur que l’on mesure avec une règle et selon une aire de 16-36 cm2.

Il faut alors prélever le bloc de sol de 18 cm à 22 cm (16-36 cm2), le tamiser (2

mm) et le mettre dans un sac ziploc pour des fins de granulométrie.

Au besoin, on retire les grosses roches à la main. De manière générale, on essaiera

d’éviter de prélever des roches de plus de 1 cm. Lorsqu’il y présence d’une grosse roche

empêchant le prélèvement d’un échantillon, on change l’axe d’échantillonnage sans

changer de distance radiale.

3.4.3 Identification des échantillons

Le numéro correspond à un emplacement (point d’échantillonnage) précis sur le terrain,

autant en plan qu’en profondeur.

1. Numéro du site ;

2. Numérotation des points d’échantillonnage du site selon la règle

d’échantillonnage prévue à la section 3.4.2 : 1 à 10 (cf. Figure 1 ci-dessous). 10

étant l’échantillon de référence.

3. Distance radiale (0= adjacent au ceps, 15 = 15cm, 30 = 30cm)

4. Profondeur (0 = surface 0cm, 10 = 10 cm de la surface, 22 = 22 cm de la

surface)

150

5. Ex. 1-1-30-10 : échantillon provenant du site numéro 2 à la position tel que

défini par la grille d’échantillonnage du site, à 30 cm du ceps, à 10 centimètres

de profondeur.

Figure 1. Exemple d’échantillonnage sur un vignoble.

4. SANTÉ ET SECURITÉ

• Il est essentiel de porter les équipements de sécurité en tout temps sur le terrain,

à savoir : combinaison de terrain, gant en néoprène, lunettes de sécurité et

bottes de construction.

• Si jamais pendant le lavage des équipements, l’acide rentre en contact avec la

peau ou les muqueuse, suivre les procédures d’urgence définies par le

SIMDUT.

5. RÉFÉRENCE(S)

V. Chaignon, D. Di Malta, and P. Hinsinger, "Fe-deficiency increases Cu acquisition

by wheat cropped in a Cu-contaminated vineyard soil," New Phytologist, vol. 154, pp.

121-130, 2002.

151

Schinner F, Öhlinger R, Kandeler E & Margesin DR (1996) Methods in Soil Biology,

Springer, Heidelberg, 426 p.

A. M. Wightwick, M. R. Mollah, D. L. Partington, and G. Allinson, "Copper

Fungicide Residues in Australian Vineyard Soils," Journal of Agricultural and Food

Chemistry, vol. 56, pp. 2457-2464, 2008/04/01 2008.

Csuros, M. and C. Csuros (2002). Environmental Sampling and Analysis for

Metals. Florida, U.S.A., CRC Press LLC. 372 p.

MEF (1995). Guide d’échantillonnage à des fins d’analyses environnementales,

Cahier 5, Échantillonnage des sols.

MEF (1999). Guide d’échantillonnage à des fins d’analyses environnementales,

Cahier 1, Généralités. Protocole PE32 (1998) Pré-échantillonnage et échantillonnage

de six sites dans le cadre du projet pour fin d’analyse des métaux (CCA).

ProtocolePE70A (2007) Échantillonnage de sols près de structures faites

d’acier galvanisé dans le cadre du projet de contamination de sols au zinc pour des fins

d’analyses physico-chimiques et écotoxiques.

6. RECOMMANDATION(S)

• Il n’est pas nécessaire de décontaminer l’équipement lorsqu’on prélève un

échantillon composite pour le même point d’échantillonnage.

• Les chaudières en plastique utilisées pour recueillir l’échantillon proviennent

directement du fournisseur et n’ont jamais été utilisées; il n’est donc pas

nécessaire de les laver avant usage.

• Ne pas oublier que l’échantillonnage est destructeur du point

d’échantillonnage; il ne sera donc pas possible de ré-échantillonner une

deuxième fois au même endroit.

• Si le sol est impossible à tamiser sur place (ex : un sol argileux), il sera traiter

directement en laboratoire.

152

• Ne pas remplir les trous créés lors de l’échantillonnage.

• Les échantillons de sols doivent être entreposés à 4°C jusqu’ à l’analyse si

celles si sont effectuées dans le mois qui suit, sinon les échantillons devront

être congelés (Schinner et al. 1996) ; il est fortement recommandé de faire les

analyses dans les 6 mois suivant l’échantillonnage (Csuros and Csuros 2002).

153

ANNEXE A3 - CONTAMINATION DE SOL AU CUIVRE À DES FINS D’ESSAIS

ENZYMATIQUES

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL

Protocole # : PE72-B Nombre de pages : 9

Version : 1 Date : 1 décembre 2015

Auteur(s): Allison Meyssonnier

Marylène Dussault

Approuvé par :

Signatures : Date :

Titre : Contamination de sol au cuivre à des fins d’essais enzymatiques

Mots clés : Cuivre, contamination, CuCl2, cycle séchage/mouillage, lixiviation.

154

1. OBJECTIF

L’objectif de ce protocole est de contaminer un sol en essayant de reproduire

l’équilibration des contaminants qui a lieu dans un sol de contamination âgé. Le

protocole qui suit est basé sur la méthodologie de contamination métallique des sols

employés par le groupe Sauvé de l’Université de Montréal.

2. MATÉRIEL

2 ballons jaugées de 250 ml ;

CuCl2·2H2O (Acros organics AC206345000, FW : 170,49 g/mol) ;

CaCl2·2H2O (Fisher C79-500, FW 147.01) ;

Eau Mili-pore (Mili-Q ou eau déionisée) ;

6 microcosmes (pots) en verre avec leur bouchon ;

6 plats en Pyrex ;

6 spatules en telfon ;

6 tubes d’ABS de 7’’ de diamètres ;

Membrane géotextile ;

12 tie-wrap ;

Pipettes ;

Savon Sparkleen ;

Bains acide HNO3 10% ;

Eau déionisée (eau nanopure, résistivité ≥ 18.2 MΩ.cm) ;

Sable d’Ottawa.

155

3. MÉTHODOLOGIE

Pour chaque paire de sol, l’une sera contaminée avec une solution CuCl2 et l’autre avec

une solution de CaCl2. Les concentrations seront déterminées au fur et à mesure que

l’on obtient les résultats pour les premières séries de sols (voir Annexe 1.) afin de

réajuster la concentration si on obtient une réponse enzymatique trop faible ou trop forte

pendant les essais enzymatique (voir calendrier de contamination). La première

concentration choisie est 750 ppm, Chaperon et al. (2007) suggère de considérer 25% de

perte de cuivre lors de la lixiviation [1]. Ce qui signifie environ 500 ppm soit la limite

autorisée par le critère C, soit la limite maximale acceptable dans une zone commerciale

ou industrielle [2]. La solution de CaCl2 permet de normaliser la concentration de

l’anion chlorure dans le sol non contaminé au cuivre de la paire de sol par soucis

comparaison.

3.1 Préparation

3.1.1 Vaisselle

1. Laver les plats de Pyrex, les microcosmes (avec bouchon), les spatules, les ballons

(avec bouchon) au lave-vaisselle ou avec du savon Sparkleen ;

2. Tremper la vaisselle propre dans le bain d’acide nitrique 10% pendant 24h (au

moins 2h) afin d’éliminer toute contamination métallique étrangère ;

3. Rincer à l’eau distillée 3 fois puis à l’eau déionisée 3 fois ;

4. Identifier toute la vaisselle selon la série de contamination.

3.1.2 Teneur en eau et capacité de rétention au champ des sols à contaminés

1. Suivre le protocole PSO A7 afin de déterminer la teneur en eau des sols à

contaminer et ainsi d’obtenir le poids sec de chaque sol au moment de la

contamination ;

156

2. Suive le protocole PSO A23 afin de déterminer la capacité de rétention au champ

des sols à contaminer.

3.1.3 Préparation des solutions

Exemple de calcul pour la première série de 3 paires de sols :

Lors de la contamination chaque paire de sol se verra ajouter 50 ml de solution de CuCl2

ou CaCl2 qui devra contenir 750 ppm (750 mg de Cu / kg de sol sec) de cuivre et/ou

418 ppm de Cl (on veut la même concentration en ions chlorures dans les deux

solutions). Ainsi :

Solution de CuCl2 à 750 ppm de cuivre

- MM Cu = 63,546 g/mol ;

- MM CuCl2 = 170,483 g/mol ;

- Il y a 1 kg de sol sec par Pyrex, donc 750 mg de Cu par Pyrex ;

- On veut 750 mg de Cu dans 50 ml (volume de contamination) et donc 5*750 mg =

3750 mg de Cu dans 250 ml ;

- Sachant que dans la molécule CuCl2·2H2O la masse molaire du Cu représente 37,37

% :

Donc la quantité de CuCl2·2H2O à peser dans le ballon de 250 ml est :

- Soit peser exactement environ 10,0617 g de CuCl2·2H2O ;

- Dissoudre et ajuster avec de l’eau déionisée dans un ballon de 250 ml.

157

Solution de CaCl2 à 418 ppm de Cl

- Peser exactement environ 8,6756 g de CaCl2·2H2O ;

- Dissoudre et ajuster avec de l’eau déionisée dans un ballon de 250 ml.

3.1.4 Introduction de 1 kg de sol sec par microcosme

Peser exactement possible la masse de sol humide correspondant à 1 kg de sol sec (selon

la teneur en eau déterminée grâce au PSO A7) dans un plat en Pyrex.

3.2 Contamination

La contamination se fait de façon assez simple. Avant de passer à l’ajout de solution du

cuivre ou de chlorure de calcium. Il faut calculer le poids de CuCl2·2H2O et

CaCl2·2H2O à dissoudre dans des ballons de 250 ml chacun afin d’atteindre les

concentrations souhaitées en fonction de la masse de sol sec dans chaque plat en Pyrex.

1. Ajouter 50 ml de solution de CuCl2·2H2O associé à un des sols de la paire de sol

choisie à l’aide d’une pipette jaugée en dispersant le plus uniformément possible les

gouttes de solution à travers le sol dans le plat en Pyrex. Mélanger à l’aide d’une

spatule et transférer le sol dans un microcosme en verre ;

2. Ajouter 50 ml de solution de CaCl2·2H2O associé à l’autre sol de la paire de sol

choisie à l’aide d’une pipette jaugée en dispersant le plus uniformément possible les

gouttes de solution à travers le sol dans le plat en Pyrex. Mélanger à l’aide d’une

spatule et transférer le sol dans un microcosme en verre ;

3. Homogénéiser pendant 24 h sur le rotateur mécanique ;

4. Passer immédiatement à l’étape 1 de la section 3.3 Cycles séchage-mouillage.

158

3.3 Cycles séchage-mouillage

Après la contamination et l’homogénéisation des sols de chaque série, ceux-ci sont alors

transférer dans des Pyrex (style plat à lasagne) pour effectuer des cycles

mouillages/séchage.

1. Remplir les Pyrex identifiés avec le contenu du pot de l’échantillon approprié.

(s’assurer dans la mesure du possible que l’épaisseur de la couche de sol dans le

plat n’excède pas 3 cm) ;

2. En connaissant la masse de sol sec contenue de les Pyrex, ajouter l’eau déionisée

nécessaire pour atteindre 92% de la capacité de rétention au champ (considérer les

volumes de solution ajouter à la section 3.2).

3. Peser et noter la masse des Pyrex contenant le sol contaminé et humidifié à 92% de

sa CRC ;

4. Laisser reposer à la température pièces 3 jours. ;

5. Mélanger un peu les sols afin d’améliorer l’oxygénation des échantillons et mettre à

l’étuve à 37°C pendant 24 h.

6. Laisser reposer à la température de la pièce un autre 3 jours ;

7. Ré-humidifier en pesant le Pyrex et en rajoutant de l’eau déionisée jusqu’à la masse

notée au point 2 afin que les mouillages soit de taux d’humidité constant ;

8. Répéter les étapes 2 à 6 deux autres fois, pour un total de 3 cycles

mouillage/séchage et une durée de 3 semaines. Voir en annexe (Annexe 2.) le

calendrier pour la planification temporelle de cette manipulation.

3.1 Lixiviation

La lixiviation permet de se débarrasser du surplus d’anions occasionné par la

contamination. Dans le cas présent, l’anion en excès est le chlorure (Cl-). La lixiviation

159

à lieu après 3 cycles séchage/mouillage soit 3 semaines après le début de la

manipulation. La manipulation se fera en deux étapes comme indiqué au calendrier.

1. Fixer à une extrémité d’un tube en plastique un morceau de membrane géotextile à

l’aide de tie wrap ;

2. Installer le tube dans un lit de sable (extrémité bouchée par la membrane dans le

sable) ;

3. Introduire le sol dans le tube ;

4. Lixivier avec de l’eau déionisée en considérant 100% de la CRC;

5. Une fois toute l’eau écoulée, mettre le sol lixivié dans son plat de Pyrex et mettre à

l’étuve à 37ºC pendant 24 h ;

6. Une fois sorti de l’étuve, couvrir le plat en Pyrex avec du papier d’aluminium et

évaluer la teneur en eau du sol selon le PSO A7 ;

7. En connaissant la masse de sol sec contenue dans le microcosme, ajouter l’eau

déionisée nécessaire pour atteindre 60% de la capacité de rétention au champ ;

8. Transférer le sol dans un microcosme propre (lavé au bain acide) et poser le

bouchon sans le viser au pot en laissant passer un peu d’air pendant au moins 1

semaine avant d’initier les premières analyses.

4. SANTÉ ET SECURITÉ

Le port du sarrau et des lunettes de sécurité est obligatoire. Les solutions doivent être

préparée sous la hotte ainsi que la contamination des sols. Le port de gants de

caoutchouc et d’une visière protectrice est nécessaire lors des manipulations

impliquant le bain d’acide (lavage des pyrex).

160

5. RÉFÉRENCE(S)

[1] S. Chaperon and S. Sauvé, "Toxicity interaction of metals (Ag, Cu, Hg, Zn) to urease and dehydrogenase activities in soils," Soil Biology and Biochemistry, vol. 39, pp. 2329-2338, 2007.

[2] E. e. L. c. l. c. c. Ministère du développement durable. (1998, 11 novembre 2015). Politique de protection des sols et de réhabilitation des terrains contaminés

Annexe 2 : Les critères génériques pour les sols et pour les eaux souterraines. Available: http://www.mddelcc.gouv.qc.ca/sol/terrains/politique/annexe_2_tableau_1.htm

6. RECOMMANDATION(S)

Cycle mouillage/séchage : il est important d’être rigoureux dans les manipulations et

de s’assurer que chacun des échantillons subissent un traitement identique. Ainsi, étant

donné que les manipulations se font sur plusieurs séries, prendre soin d’uniformiser les

temps de repos et d’étuve. Par exemple, le repos de trois jours à température pièce

devrait toujours commencer à la même heure et terminer à la même heure. De cette

façon, si le temps de repos à la température de la pièce est de 70 heures au lieu de 72

heures qu’il en soit ainsi pour tous les échantillons pour tous les cycles séchages

mouillages.

161

7. ANNEXE(S)

Annexe 1. : Séries de sols à contaminer

Série Sols

concernés

Début

contamination

Fin

contamination

Concentration

initiale

1 7, 11, A 14 janvier 2016 16 février 2016 750 ppm

2 6, 10, 15 03 mars 2016 05 avril 2016 750 ppm

3 4, 9, 14 17 mars 2016 19 avril 2016 650 ppm

4 3, 8, 24 31 mars 2016 03 mai 2016 900 ppm

5 5, 22, B 14 avril 2016 17 mai 2016 800 ppm

6 1M, 2M, 3M 28 avril 2016 31 mai 2016 300 ppm

162

Annexe 2. : Exemple de planification temporelle de contamination pour la série 1

Jour Date Action

Lundi 11-janv-16 Peser les coupelle et les mette au four pendant 24h

Mardi 12-janv-16 Peser les sols dans les coupelles préalablement conditionnées

pour la teneur en eau (matin) et mettre au four à 105ºC

Mercredi 13-janv-16 Préparer le matériel pour la contamination : mettre plats et pots

à dans la bain acide ;

Préparer les solutions de contamination ;

Sortir les sols secs du four et les peser pour la teneur en eau.

Jeudi 14-janv-16 Contaminer les sols (matin) et placer sur le mélanger pour 24h

(ex.10h à 10h)

Vendredi 15-janv-16 Mouillage des sols à 92% de la CRC (10h-11h) Repos jour 1

(11h-xxx)

Samedi 16-janv-16 Repos jour 2

Dimanche 17-janv-16 Repos jour 3

Lundi 18-janv-16 Fin repos à 11h00 - Mélange à 11h et étuve pour 24h (à 11h30)

Mardi 19-janv-16 Sortie de l'étuve (11h30) et repos jour 4 (11h30-xxx)

Mercredi 20-janv-16 Repos jour 5

Jeudi 21-janv-16 Repos jour 6

Vendredi 22-janv-16 Fin repos à 11h30 - Remouillage des sols à 92% de la CRC

(11h30-12h30) et repos jour 1 (12h30-xxx)

163

Samedi 23-janv-16 Repos jour 2

Dimanche 24-janv-16 Repos jour 3

Lundi 25-janv-16 Fin repos à 12h30 - Mélange à 12h30 et étuve pour 24h (à 13h)

Mardi 26-janv-16 Sortie de l'étuve (13h00) et repos jour 4 (13h00)

Mercredi 27-janv-16 Repos jour 5

Jeudi 28-janv-16 Repos jour 6

Vendredi 29-janv-16 Fin repos à 13h00 - Remouillage des sols à 92% de la CRC

13h00-14h00) et repos jour 1 (14h-xxx)

Samedi 30-janv-16 Repos jour 2

Dimanche 31-janv-16 Repos jour 3

Lundi 01-févr-16 Fin repos à 14h00 - Mélange à 14h et étuve pour 24h (à 14h30)

Mardi 02-févr-16 Sortie de l'étuve (14h30) et repos jour 4 (14h30)

Mercredi 03-févr-16 Repos jour 5

Jeudi 04-févr-16 Repos jour 6

Vendredi 05-févr-16 Fin repos à 14h30 et lixiviation - écoulement dans la nuit

Samedi 06-févr-16 Mettre sol lixivié dans un plat en Pyrex et sécher 48h à l'air

libre (ex. 15h-xxx)

Dimanche 07-févr-16 Premier 24h (15h)

Lundi 08-févr-16 2e 24h (15h) mettre à l'étuve pour 24h

164

Mardi 09-févr-16 Sortie de l'étuve à 15h

Évaluer teneur en eau

Mercredi 10-févr-16 Mouillage des sols à 60% de la CRC (8h-9h) – Incubation 1

semaine

Jeudi 11-févr-16 Incubation

Vendredi 12-févr-16 Incubation

Samedi 13-févr-16 Incubation

Dimanche 14-févr-16 Incubation

Lundi 15-févr-16 Incubation

Mardi 16-févr-16 Incubation

Mercredi 17-févr-16 Fin incubation à 9h, début des analyses

165

ANNEXE A4 – CAPACITÉ DE RÉTENTION D’EAU AU CHAMP D’UN

ÉCHANTILLON DE SOL

166

167

168

169

ANNEXE A5 – DIGESTION ACIDE À L’EAU RÉGALE POUR QUANTIFIER LA

CONCENTRATION TOTALE DE MÉTAUX DANS UN ÉCHANTILLON DE SOL

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL

Protocole # : PE72-J Nombre de pages : 6

Version : 1 Date : 10 février 2016

Auteur(s): Allison Meyssonnier

Isabelle Lessard

Approuvé par :

Signatures : Date :

Titre : Digestion acide à l’eau régale pour quantifier la concentration totale de

métaux dans un échantillon de sol

Mots clés : digestion, métal, ICP-MS, eau régale

170

1. OBJECTIF

La détermination de la concentration totale des métaux dans un sol est réalisée par

digestion acide. Une digestion acide consiste à extraire quantitativement les métaux

d’un sol par chauffage avec des acides concentrés. Le digestat filtré est ensuite analysé

par une méthode analytique comme le spectromètre de masse à source ionisante au

plasma d’argon (ICP-MS) ou le spectromètre à absorption atomique (AAS). Il existe

plusieurs méthodes de digestion acide en littérature qui récupèrent à différents niveaux

les métaux du sol. La méthode qui récupère tous les métaux utilise de l’acide

fluorhydrique, un produit très dangereux. D’autres méthodes utilisent de l’acide nitrique

concentré mélangé ou non à d’autres acides et quantifient les métaux totaux

récupérables correspondant à la quasi-totalité des métaux du sol. Celle retenue pour ce

projet est une digestion acide avec eau régale, un mélange d’acide nitrique et

chlorhydrique dont le digestat dilué peut être analysé au ICP-MS pour un métal ou un

balayage de différents métaux. La méthode est basée sur la méthode 200.2 de l’EPA

(Martin, Creed et al. 1994) et la méthode MA200Met1.2 du CEAEQ (CEAEQ 2003).

2. MATÉRIEL

Balance ± 0.0001 (Mettler Toledo) ;

Étuve (Fisher Scientific, modèle Isotemp Prenium Ovens 700 series) ;

Ballons de 100 ml, 250 ml et 500 ml ;

Bain d’acide nitrique à 10% ;

Mortier et pilon inerte en agate ;

Pipette en plastique graduée de 5 ml ;

Pipette en plastique graduée de 10 ml ;

Béchers en téflon ;

Béchers de 50 ml ;

171

Verres de montre ;

Spatules en téflon ;

Montage de filtration sous vide par échantillon (entonnoir Buchner et erlenmeyer

250ml avec bras à vide) ;

3 tubes bleus de 50 ml en polypropylène par sol (06-443-20, Fisher) ;

Plaques chauffantes ;

Filtre de 47 mm de diamètre en microfibre de verre (Whatman GFF, 1825-047,

porosité 0,7μm) ;

Pince métallique pour filtre ;

Thermomètre ;

Sol contaminé certifié (SCP Science, SS-2) ;

Acide nitrique concentré grade environnemental (Anachemia, 62764-460, 70%) ;

Acide chlorhydrique concentré grade environnemental (Anachemia, 46396-460,

37%) ;

Eau déionisée (eau nanopure, résistivité ≥ 18.2 MΩ.cm) ;

Spectromètre d’adsorption atomique à la flamme FAAS (Manon Leduc,

Laboratoire CGM, Polytechnique).

172

3. MÉTHODOLOGIE

3.1 Préparation du matériel

Avant de débuter l’expérience, bien laver tout le matériel en plastique et en verre à

l’acide nitrique (HNO3) 10% (v/v) (entonnoirs Buchner pour montage à filtration sous

vide, erlenmeyers 250 ml avec bras à vide, verres de montre, tubes bleus de 50 ml,

spatules en téflon, béchers en téflon, verrerie de préparation des solutions, etc.). Pour ce

faire, laver tout d’abord la vaisselle à l’aide d’un détergent doux et d’eau distillée puis

rincer à l’eau déionisée. À l’aide de gants en nitrile, déposer ensuite le matériel propre

dans le bac de lavage à l’acide nitrique 10% (v/v) pour la nuit. Laisser tremper au moins

2 heures, idéalement 24h, sortir la vaisselle du bac à l’aide des gants et d’un bac à

vaisselle propre et rincer trois fois à l’eau distillée et trois fois à l’eau déionisée. Laisser

sécher à l’air.

Pour les mortiers et pilons, laisser tremper seulement 30 secondes au bain acide !

3.2 Préparation des échantillons de sols

1. Sécher environ 5 g de sol dans un bécher de 50 ml à l’étuve à 60ºC pour 24h.

2. Tamiser le sol séché à 2 mm s’il n’a pas été tamisé sur le terrain lors de

l’échantillonnage.

3. Broyer le sol à l’aide du mortier et du pilon afin de l’homogénéiser. Laisser tremper

le mortier et pilon au moins 2h dans le bain d’acide entre le broyage des différents

échantillons de sols.

3.3 Solution d’acide nitrique 50% (v/v)

1. Dans une fiole jaugée de 250 ml contenant préalablement 60 ml d’eau déionisée,

ajouter graduellement 178 ml d’acide nitrique concentré avec une pipette jetable de

100 ml.

173

Attention : Toujours ajouter l’acide dans l’eau

2. Laisser refroidir et compléter au trait de jauge.

3.4 Solution d’acide chlorhydrique 20% (v/v)

1. Dans une fiole jaugée de 500 ml contenant préalablement 200 ml d’eau déionisée,

ajouter graduellement 270 ml d’acide chlorhydrique concentré avec une pipette

jetable de 100 ml.

Attention : Toujours ajouter l’acide dans l’eau

2. Laisser refroidir et compléter au trait de jauge.

3.5 Digestion des sols

1. Peser précisément environ 1,0000 g de sol (0,3000 g à 0,5000 g pour les sols noirs

riches en matières organiques afin d’éviter le bouillonnement et la formation

d’écume du mélange acide-sol lors de la digestion) directement dans un bécher en

téflon. Identifier les échantillons et noter le poids.

2. Réaliser les manipulations en triplicata pour chaque sol.

3. Préparer un blanc de méthode et un échantillon de sol certifié pour chaque série de

12 échantillons de sol.

4. Ajouter 4 ml d’acide nitrique 50% à l’aide d’une pipette graduée de 5 ml.

5. Ajouter 10 ml d’acide chlorhydrique 20% à l’aide d’une pipette graduée de 10 ml.

6. Couvrir le bécher avec un verre de montre et chauffer 30 minutes sur plaque

chauffante à 95ºC ou jusqu’à observer une légère ébullition, c’est-à-dire jusqu’à ce

que de petites bulles remontent à la surface. Ne pas mettre plus de 3 gros ou 4 petits

bécher en téflon par plaque.

7. Note : Pour obtenir une bonne température d’ébullition, faire chauffer environ

15 ml d’eau dans un bécher en téflon non couvert jusqu’à 85ºC; une fois que le

174

bécher est couvert avec le verre de montre, la température de l’acide s’élèvera à

95ºC.

8. Pendant ce temps, identifier le matériel pour la filtration selon le numéro inscrit sur

le bécher en téflon.

9. Laisser refroidir le mélange 10 minutes.

10. Filtrer le digestat sous vide avec un montage Buchner muni d’un filtre dans un

erlenmeyer de 250 ml en s’assurant de bien rincer le matériel (verre de montre,

bécher en téflon, entonnoir Buchner) avec de l’eau déionisée pour recueillir tout le

métal digéré.

11. Transférer le filtrat dans un ballon jaugé de 10 ml à l’aide de la partie inférieure de

l’entonnoir Buchner.

12. Laisser refroidir complètement avant de jauger le volume à 100 ml avec de l’eau

déionisée.

13. Transférer dans un tube bleu de 50 ml préalablement lavé à l’acide, prendre soin de

bien le fermer et l’identifier.

14. Faire un blanc de solution en transférant 4 ml d’acide nitrique 50% et 10 ml d’acide

chlorhydrique 20% dans un tube bleu de 50 ml préalablement lavé à l’acide.

15. Conserver les échantillons à 4°C pour un maximum de 6 mois.

16. Analyser les échantillons au FAAS pour le cuivre total en solution au Laboratoire

de Géochimie Analytique local B-647 Département des génies Civil, Géologique et

des Mines (CGM) de l’École Polytechnique de Montréal.

4. RÉFÉRENCE(S)

CEAEQ (2003). Détermination des métaux et du phosphore dans les sédiments: méthode

par spectrométrie d'émission au plasma d'argon après minéralisation acide, Ministère de

l'Environnement du Québec. MA.205-Mét/P 1.0,: 18 p.

175

Martin, T. D., J. T. Creed, et al. (1994). Method 200.2 Sample preparation procédure for

spectrochemical determination of total recoverable elements. O. o. R. a. Development.

Cincinnati, U.S. Environmental Protection Agency (EPA).

176

ANNEXE A6 – DÉTERMINATION DU PH D’UN SOL

177

178

179

180

ANNEXE A7 – DETERMINATION DE LA CAPACITÉ TAMPON D’ÉCHANTILLON

DE SOLS CONTAMINÉS ARTIFICIELLEMENT

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL

Protocole # : PE-72C Nombre de pages : 6

Version : 1 Date : 03 mars 2016

Auteur(s): Allison Meyssonnier

Jean-Philippe Bertrand

Approuvé par :

Signatures : Date :

Titre : Détermination de la capacité tampon d’échantillon de sols contaminés

artificiellement

Mots clés : Capacité tampon, pH, sol

181

1. OBJECTIF

L’objectif de ce protocole est de déduire une indication de la résistance d’un sol à une

variation de pH administrée artificiellement. Ce protocole est élaboré pour 6 sols en

réplicas de 3.

2. MATÉRIEL

95 tubes à centrifuger de 50 ml (pour 6 sols) en plastique et leurs bouchons ;

1 ballon de 500 ml ;

4 ballons de 250 ml ;

1 bécher de 2 L ;

4 béchers de 150 ml ;

1 pipette de 50 ml ;

1 pipette de 10 ml ;

Micropipette P 1000, P10 ml avec embouts ;

Spatules en téflon ;

Support pour tubes ;

Balance ±0,0001 (Mettler Toledo) ;

Agitateur de type Wrist action ;

pH-mètre (Accumet, modèle 25, pH/ionmeter );

Acide nitrique concentré Trace metal grade (Fisher A509-P212, FW 63.01) ;

Eau déionisée (eau nanopure, résistivité ≥ 18.2 MΩ.cm).

182

3. MÉTHODOLOGIE

3.1 Préparation des solutions d’Acide nitrique (HNO3) (les solutions sont

préparées pour 6 sols en réplicas de 3 et 1 blanc de méthode par

concentration)

La préparation des solutions acides requiert certaines précautions. Il faut travailler sous

la hotte en tout temps, porter sarrau et lunettes de sécurité. Le port des gants protecteurs

non sensibles a l'acide est recommandé. De plus, il ne faut JAMAIS VERSER DE

L'EAU DANS UN ACIDE. Toujours verser de l'acide dans l'eau.

3.1.1 Préparation du matériel

1. Laisser tremper les ballons, les béchers, les spatules en téflon et tubes à centrifuger

(s’ils ne sont pas neufs) pendant au moins 2h dans l’acide nitrique 10%

(préférablement une journée).

2. Rincer ce matériel 3 fois à l’eau distillée et trois fois à l’eau déionisée.

3.1.2 Préparation de l’eau déionisée

1. Standardiser le pH mètre (PSO A19).

2. Prendre le pH de 1.5 L d'eau déionisée dans un bécher de 2 L (PSO A20).

3. Si le pH est inférieur a 6, buller avec de l'air pendant une période d'au moins 20

min.

4. Prendre de nouveau le pH de l'eau.

5. Répéter les étapes 3 et 4, si le pH de l'eau déionisée n'est toujours pas compris entre

pH 6 et 7.

183

6. Reprendre la préparation de l'eau déionisée lorsque toute la quantité préparée est

épuisée (ne pas préparer une trop grande quantité d'eau déionisée pour éviter la

dissolution du CO2 au contact de l'eau a l'air ambiant).

3.1.3 Préparation de la solution mère d’acide nitrique (HNO3) 1 M

1. Verser environ 250 ml d'eau déionisée dans un ballon jaugé de 500 ml.

2. Mesurer à l'aide d'une pipette graduée (50 ml) 31,44 ml d'acide nitrique (HNO3)

concentré et transvaser dans le ballon jaugé de 500 ml.

3. Compléter au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

3.1.3 Préparation des solutions filles d’acide nitrique (HNO3) dilué

1. Préparer les solutions d'acide nitrique (HNO3) dilué dans des ballons jaugés de

250 m1 (contenant préalablement environ 100 ml d'eau déionisée) et en utilisant les

instruments de mesure indiqués dans le Tableau 1. suivant :

Tableau 1. : Préparation des standards d’acide nitrique (HNO3)

Molarité de l’acide nitrique concentré (M) 15,9

Concentration (M) Solution mère Volume de solution mère

(ml)

Pipette à

utiliser

1,000 Acide nitrique concentré 31,44 1 + 3

0,2000 Acide nitrique 1M 50,00 1

0,1000 Acide nitrique 1M 25,00 1

0,0500 Acide nitrique 1M 12,50 2

0,0200 Acide nitrique 1M 5,00 2

184

Pipette 1 : 50 ml

Pipette 2 : 10 ml

Pipette 3 : micropipette P1000

2. Compléter au trait de jauge des ballons avec de l’eau déionisée.

3.2 Procédure de dosage (le protocole pour le dosage est donné pour un seul

échantillon)

3.2.1 Mesure de la capacité tampon (blanc)

1. Numéroter cinq (5) tubes à centrifugeuse de 50 ml en plastique.

2. Placer 10 ml d'eau déionisée dans le premier tube a centrifugeuse a l'aide de la

micropipette de 10 ml.

3. Placer dans 4 autres tubes a centrifugeuse de 50 ml en plastique 10 ml de chacune

des solutions acides préparées soit : 1 M, 0.2 M, 0.1 M, 0.05 M, et 0.02 M à l'aide

de la micropipette de 10 ml.

4. Mettre les bouchons et agiter vigoureusement tous les tubes à l'aide de l'agitateur

Wrist action pour une période de 30 min.

5. Laisser reposer 24 heures (±1 heure) puis prendre le pH (PSO A20).

3.2.2 Mesure de la capacité tampon (échantillons)

1. Numéroter cinq (5) tubes à centrifugeuse de 50 ml en plastique par réplicas de sol.

2. Peser dans les 5 (5) tubes à centrifugeuse en plastique précisément environ 5 g de

sol à analyser.

3. Placer 10 ml d'eau déionisée dans le premier tube a centrifugeuse a l'aide de la

micropipette de 10 ml.

185

4. Placer dans 4 autres tubes a centrifugeuse de 50 ml en plastique 10 ml de chacune

des solutions acides préparées soit : 1 M, 0.2 M, 0.1 M, 0.05 M, et 0.02 M à l'aide

de la micropipette de 10 ml.

5. Mettre les bouchons et agiter vigoureusement tous les tubes à l'aide de l'agitateur

Wrist action pour une période de 30 min.

6. Laisser reposer 24 heures (±1 heure) puis prendre le pH (PSO A20).

4. CALCULS

La capacité tampon d'un sol (β) s'exprime en mol d'acide par kg de sol sec. Il faut, pour

y parvenir, tracer un graphique du pH en fonction de la quantité d'acide ajoutée en mol

H+/ kg sol. On peut utiliser la masse de sol humide ou la masse de sol sec pour le

calcul des points du graphique mais en utilisant la masse de sol sec, on obtient

directement la capacité tampon du sol. Autrement, il y a une correction à faire. La

capacité tampon est, par convention, la quantité d'acide que l'on doit ajouter a un sol

pour que son pH diminue d'une unité par rapport a son pH initial. Cette quantité d'acide

se traduit par la pente de la droite au début de la courbe, lorsque le pH chute d'une

unité.

5. RÉFÉRENCE(S)

Zagury, G.J:, et al, 1997, Stabi1isation de résidus acides miniers par des résidus alcalins

d'usines de pates et papiers, Environmental technology, vol.18, pp 959-973.

Zagury, G.J., 1997, Etude d'un traitement par bio1ixiviation au moyen de la microflore

indigène ferrooxydante des sols contamines aux métaux lourd (Zn, Cu, Mn), Thèse de

doctorat, Université de Sherbrooke, Québec, 176p.

186

ANNEXE A8 – MÉTHODE DE DÉTERMINATION DE LA CAPACITÉ D’ECHANGE

CATIONIQUE (CEC)

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL

Protocole # : PE72-J Nombre de pages : 6

Version : 1 Date : 10 mars 2016

Auteur(s): Allison Meyssonnier

Kahina Oudjehani

Approuvé par :

Signatures : Date :

Titre : Méthode de détermination de la Capacité d’Echange Cationique (CEC).

Mots clés : CEC, NaOAc, NH4OAc, cations, métaux, absorption atomique.

187

1. OBJECTIF

L’objectif principal de la CEC est d’estimer la quantité de cations échangeables dans le

résidu minier. Celle ci nous permettra par la suite de connaître sa capacité de rétention

ou de relargage des métaux lourds

La méthode de détermination de la CEC est simple, elle s’effectue en trois étapes. La

première étape consiste à enlever les cations échangeables adsorbés sur le résidu et les

remplacer par le sodium (Na+) et cela par un premier lavage avec la solution d’acétate

de sodium (NaOAc). La deuxième étape est un lavage successif du résidu avec l’alcool

isopropylique pour enlever l’excès de sodium. Enfin, la troisième étape est un dernier

lavage qui consiste cette fois ci à récupérer le sodium en le remplaçant par l’ion

ammonium (NH4+) contenu dans la solution d’acétate d’ammonium (NH4OAc). Le

sodium qui a occupé les sites vacants des cations échangeables est ensuite dosé par

absorption atomique.

2. MATÉRIEL

3 tubes bleus à centrifuger de 50 ml en polypropylène par sol (06-443-20,

Fisher) ;

2 béchers de 50 ml ;

3 béchers de 150 ml ;

2 béchers de 2 L ;

2 ballons de 2 L ;

3 bouteilles en verre de 2 L ;

Spatules en téflon ;

Agitateur magnétique ;

2 barreaux magnétiques ;

Dispensette graduée de 20ml ;

188

Pipette automatique de 10 ml avec embouts ;

Pipetman 1 ml ;

Agitateur magnétique ;

Balance ± 0.0001 (Mettler Toledo) ;

Centrifugeuse Beckman modèle J2-21 avec rotor (Palo Alto, Californie) ;

Agitateur Wrist Action ( Burrell, Pittsburgh, CA) ;

pH-mètre (Accumet, modèle 25, pH/ionmeter) ;

Spectromètre d’adsorption atomique à la flamme FAAS (Manon Leduc,

Laboratoire CGM, Polytechnique).

Acétate de sodium anhydre CH3COONa (Fisher, S210-2, FW 82.03) ;

Acétate d’ammonium CH3COONH4 (Fisher, A637-3, FW 77.0825) ;

Acide acétique glacial (EMD, AX0073-9, 99.5%) ;

Eau purifiée (eau nanopure, résistivité ≥ 18.2 MΩ.cm) ;

Solution de NaOH, 10 N (Fisher, S3118-3) ;

Alcool isopropylique 99% (Fisher, A416-4, FW 60.1) ;

Acide nitrique 10% (HNO3).

189

3. MÉTHODOLOGIE

3.1 Préparation du matériel

3.1.1 Préparation de du matériel d’extraction

1. Laisser tremper tout le matériel pendant au moins 2h dans l’acide nitrique 10%

(préférablement une journée).

2. Rincer ce matériel 3 fois à l’eau distillée et trois (3) fois à l’eau déionisée.

3.2 Préparation des solutions

3.2.1 Acétate de sodium (NaOAc), 1 N

1. Peser 136 g de CH3COONa.3H2O ou bien 82 g d’acétate de sodium anhydre

(CH3COONa) dans un bécher de 2000 ml.

2. Dissoudre avec 1 L d'eau déionsiée, puis agiter la solution sur l'agitateur

magnétique pendant 15 min, mettre le chauffage à 4 (ceci va permettre d'accélérer

la dissolution des cristaux).

3. Une fois que la solution est bien homogène, compléter jusqu’à 1900 ml.

4. Le pH de cette solution doit être 8.2. Au besoin, ajouter quelques gouttes d’acide

acétique ou bien d’une solution de NaOH (selon le cas) pour ramener la solution

d’acétate de sodium à pH=8.2.

5. Lorsque le pH devient égal à 8.2, transvider dans un ballon de 2000 ml compléter

au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

3.2.2 Acétate d’ammonium (NH4OAc) 1 N

1. Peser 77.08 g de CH3COONH4 dans un bécher de 2000 ml.

2. Dissoudre avec 1900 ml d'eau déionisée et lire le pH de la solution résultante.

190

3. Le pH de cette solution doit être 7.0. Au besoin, ajouter quelques gouttes d’acide

acétique ou bien d’une solution de NH4OH (selon le cas) pour ramener la solution

d’acétate de sodium à pH=7.0.

4. Lorsque le pH devient égal à 7.0, transvider dans un ballon de 2000 ml compléter

au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

3.3 Procédure de dosage

1. Peser 4 g de sol dans un tube à centrifuger de 50 ml. Noter le poids et réaliser les

manipulations en triplicata pour chaque sol.

2. Mesurer 33 ml de la solution NaOAc 1 N à l’aide de la dispensette graduée de

20 ml, et les ajouter dans le tube à centrifugeuse. Fermer bien le tube puis agiter

pendant 5 min dans l'agitateur Wrist action à vitesse 5.

3. Centrifuger à 10 000 rpm jusqu’à ce que le surnageant soit clair

(approximativement 10 min).

4. Pipetter le surnageant à l'aide des pipettes 10 ml et s’en défaire en évitant de

prendre des particules de sols (prendre des pipettes neuves pour chaque

échantillon). NB : pour pipetter le fond du tube utiliser le pipetman 1 ml.

5. Répéter les étapes 2, 3 et 4 deux autres fois.

6. Mesurer maintenant 33 ml d’alcool isopropylique 99% à l’aide de la dispensette

graduée de 20 ml, et ajouter les dans le tube à centrifugeuse. Fermer bien le tube

puis agiter pendant 10 min dans l’agitateur Wrist action à vitesse 5.

7. Faire exactement les étapes 3 et 4.

8. Refaire les étapes 6 et 7 deux autres fois.

9. Ajouter maintenant 33 ml de NH4OAc 1 N, fermer bien le tube puis agiter pendant

5 min dans l'agitateur Wrist action à vitesse 5.

10. Centrifuger à 10 000 rpm jusqu’à ce que le surnageant soit clair

(approximativement 10 min).

191

11. Retirer à l’aide des pipettes 10 ml le surnageant et le récupérer dans un ballon

volumétrique de 100 ml (prendre des pipettes neuves pour chaque échantillon).

12. Répéter les étapes 9, 10 et 11 deux autres fois en additionnant les surnageants de

l’étape 11 dans le même ballon de 100 ml.

13. Diluer la solution récupérée dans le ballon jusqu’au volume exact de 100 ml avec la

solution de NH4OAc 1N, (car le volume total récupéré sera inférieur à 100 ml).

17. Le sodium Na est dosé par absorption atomique au Laboratoire de Géochimie

Analytique local B-647 Département des génies Civil, Géologique et des Mines

(CGM) de l’École Polytechnique de Montréal.

4. CALCULS

Où,

a = Concentration de sodium (mg/l);

b = Masse du résidu sec (g).

Remarques

- Ne pas laisser les solutions de sodium dans les ballons volumétriques une fois

l’expérience finie, entreposer les dans des bouteilles en HDPE ou en PE à 4 ºC et doser

les à l’absorption atomique le plutôt possible.

- On peut réaliser l’expérience de la CEC pour 4 échantillons en duplicata en même

temps, mais pas plus, car on ne peut utiliser que 8 tubes à centrifugeuse à la fois.

192

5. RÉFÉRENCE(S)

Chapman, H.D. 1965. Cation exchange capacity. Methods of soil analysis, part 2.

Chemical and microbiological properties, 891-901.

Bower, C.A., Reitmeir, R.F., and Fireman, M. 1952. Exchangeable cation analysis of

saline and alkali soils. Soil Science. A : 63-79.

6. RECOMMANDATION(S)

• La détermination de la CEC est une expérience délicate à réaliser. Pour ce faire, il

faut toujours s’assurer qu’au moment de pipetter le surnageant, les particules de

résidu ne soient pas prises.

• Il est recommandé de réaliser cette expérience en duplicata ou en triplicata pour

pouvoir comparer vos résultats. Pour réaliser cette expérience en triplicata vous ne

pouvez l’effectuer que sur 2 échantillons à la fois, car l’espace dans la centrifugeuse

est disponible uniquement pour 8 tubes. Par contre vous pouvez l’effectuer sur 4

échantillons si vous décidez de la faire en duplicata.

• Il est à conseiller d’envoyer avec les échantillons pour le dosage du sodium un

blanc (juste de l’eau purifiée), et une solution dont la concentration en Na est

connue (préparée avec du NaCl).

• Si vous avez plusieurs échantillons à faire en même temps, utilisez des pipettes

propres (jetables) pour chacun des échantillons et pour chacun des réplicas.

193

ANNEXE A9 – EXTRACTION DE LA MATIÈRE ORGANIQUE DISSOUTE (DOC)

DANS DES SOLS À L’EAU DÉIONISÉE

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL

Protocole # : PE72-K Nombre de pages : 6

Version : 1 Date : 10 mars 2016

Auteur(s): Allison Meyssonnier

Isabelle Lessard

Approuvé par : Signatures : Date :

Titre : Extraction de la matière organique dissoute (DOC) dans des sols à l’eau

déionisée

Mots clés : DOC, sol, extraction

194

1. OBJECTIF

La matière organique dissoute (DOC) est définie comme la matière organique en

solution de diamètre inférieur à 0.45 µm. Elle est considérée comme la fraction la plus

active de la matière organique totale et joue un rôle important dans plusieurs processus

clé du sol.

Il existe plusieurs techniques d’extraction de DOC. La collecte in situ de solution de sol

peut être faite grâce à l’utilisation de lysimètre (Soil Solution Organic Matter, SSOM).

Lorsque la collecte in situ est impossible, l’extraction à l’eau ou à l’aide de solution

saline faible s’avère être une technique-substitue acceptable pour extraire la matière

organique en solution (Water-Extractable Organic Matter, WEOM).

L’extraction DOC peut aussi utilisée une matrice saline fortement ionique (Salt-

Extractable Organic Matter, SEOM); l’extrait contient alors la matière organique

présente dans la solution de sol et une fraction additionnelle de matière organique

désorbée et/ou dissoute. Cette fraction supplémentaire semble être plus biodégradable

que la fraction organique présente seulement dans la solution de sol collectée in situ.

Elle ne peut donc pas être considérée comme une technique-substitue de SSOM ou

WEOM, mais elle est souvent utilisée pour estimer la matière organique facilement

disponible aux hétérotrophes du sol.

Dans le cadre de ce projet lié aux cycles biogéochimiques des sols, il aurait été

intéressant d’extraire le DOC du sol avec une solution fortement ionique. Cependant, le

catalyseur au Pt de l’appareil utilisé, un TOC-5000A de la marque Shimadzu, est très

sensible aux composés halogènes. Il faut donc se limiter à une extraction à l’eau ou à

une solution faiblement saline.

195

2. MATÉRIEL

19 tubes à centrifuger de 60 ml en polypropylène (3119-0050, Nalgène) ;

20 vials en verre de 50 ml avec leurs bouchons (+septum);

1 bécher de 2 L ;

Montage de filtration sous vide par échantillon (entonnoir Milipore et

erlenmeyer 250 ml avec bras à vide) ;

1 erlenmeyer de 1 L ;

Dispensette de 100 ml ;

Bouteille en verre de 2 L ;

Spatules en téflon ;

Pipette automatique de 10 ml avec embouts ;

Filtres en polycarbonate (Millipore, Filtre isopore, HTTP04700) ;

Centrifugeuse Beckman modèle J2-21 avec rotor (Palo Alto, Californie) ;

Agitateur Wrist Action ( Burrell, Pittsburgh, CA) ;

Eau déionisée (eau nanopure, résistivité ≥ 18.2 MΩ.cm) ;

Analyseur DOC (TOC-5000A, Shimadzu, au laboratoire CREDEAU,

Département CGM, Polytechnique).

196

3. MÉTHODOLOGIE

3.1 Préparation du matériel

3.1.1 Préparation de du matériel d’extraction

3. Rincer ce matériel 3 fois à l’eau distillée et sept (7) fois à l’eau déionisée

(l’entonnoir Milipore aussi) avant utilisation afin d’enlever la matière organique

s’ayant potentiellement déposée sur le matériel d’extraction ;

3.1.2 Préparation de des vials d’analyse

1. Couvrir l’ouverture des vials avec du papier d’aluminium.

2. Conditionner les vials au four à 500ºC pendant 4 h.

3. Rincer les bouchons 7 fois à l’eau déionisée.

3.2 Procédure de dosage

6. Peser exactement 3,0000 g de sol (1,5000 g pour les sols contenant >8% COT)

directement dans un tube à centrifuger de 60 ml (tube blanc en polypropylène).

Noter le poids et réaliser les manipulations en triplicata pour chaque sol.

7. Ajouter 30 ml d’eau déionisée à l’aide d’une dispensette de 100 ml préalablement

calibrée. Noter le poids de l’eau ajoutée.

8. Dans un tube vide, ajouter aussi 30 ml d’eau déionisée (blanc) et noter le poids. En

faire au moins 1 par 25 échantillons.

9. Mettre les bouchons et agiter vigoureusement tous les tubes à l'aide de l'agitateur

Wrist action pour une période de 30 min.

10. Centrifuger les échantillons à 3 000 g pour 10 min.

11. Conditionner le filtrer en polycarbonate (1 filtre par échantillon) en filtrant 1 L

d’eau déionisée à travers le filtre dans l’erlenmeyer de 1 L.

197

12. Filtrer le surnageant sous vide avec le filtre conditionné et transférer le filtrat dans

une vial en verre. Si le sol est trop suspendu, pipeter le surnageant à l’aide d’une

pipette jetable de 10 ml pour éviter que le filtrat ne soit trouble.

13. Entre chaque échantillon, rincer la base, le cône et l’erlenmeyer six fois à l’eau

déionisée ;

14. Ajouter environ 30 ml d’eau déionisée dans une vial en verre.

15. Conserver les échantillons à 4°C jusqu’à analyse (moins d’une semaine). Pour une

conservation plus longue, acidifier avec 2 gouttes H2PO4 concentré (pH2).

16. Analyser les échantillons avec un TOC-5000 (Shimadzu) pour le DOC en

solution au Laboratoire du CREADEAU, Département CGM, Polytechnique.

4. RÉFÉRENCE(S)

Carter, M. R. and E. G. Gregorich, Eds. (2008). Soil Sampling and Methods of

Analysis. Boca Raton, CRC Press, Taylor and Francis Group.

Stephan, C. H., F. Courchesne, et al. (2008). "Speciation of zinc in contaminated soils."

Environmental Pollution 155(2): 208-216.

5. RECOMMANDATION(S)

• Le temps et le type d’agitation influence la quantité de DOC extraite.

Habituellement, pour obtenir un substitut acceptable d’une solution de sol collectée

in situ, l’échantillon dans l’eau doit être agité le plus doucement possible (agitation

à l’aide d’une tige de verre 3 à 4 fois pendant 1 minute). Cependant, l’agitation

choisie dans cette procédure (Wrist Action 30 min) est beaucoup plus agressive. Ce

choix repose sur le fait qu’une quantité plus importante de DOC sera extraite et que

198

cette fraction correspondra davantage à la fraction facilement biodisponible extraite

par une solution fortement ionique (SEOM) (Carter and Gregorich 2008).

• Des ratios sol-solution de 1 :10 pour les échantillons minéraux ou 1 :20 pour les

échantillons organiques (>8%COT) donnent des concentrations de DOC

généralement comprises entre 1 et 20 mg/L pour des échantillons de sols naturels

(Stephan, Courchesne et al. 2008).

199

ANNEXE A10 – EXTRACTION D’UNE SOLUTION DE SOL POUR ANALYSE DU

CUIVRE TOTAL EN SOLUTION

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL

Protocole # : PE72-L Nombre de pages : 6

Version : 1 Date : 15 mars 2016

Auteur(s):Allison Meyssonnier

Isabelle Lessard

Approuvé par :

Signatures : Date :

Titre : Extraction d’une solution de sol pour analyse du cuivre total en solution.

Mots clés : Spéciation, cuivre, solution de sol, FAAS

200

1. OBJECTIF

Ce protocole explique les étapes à suivre pour extraire une solution de sol représentative

des solutions de sol dans la nature. L’extraction se fait avec une solution faiblement

saline de nitrate de potassium. Cette solution a été choisie afin de maintenir une force

ionique minimale et constante afin d’utiliser une extraction plus représentative des

solutions de sol in situ qu’une extraction à l’eau.

2. MATÉRIEL

3 tubes blancs de 50 ml (42 ml réel) en polypropylène par sol (05-529-1D,

Nalgène, Fisher) ;

3 tubes bleus de 50 ml en polypropylène par sol (06-443-20, Fisher) ;

Spatules en téflon ;

Dispensette de 100 ml ;

Ballon jaugé de 2 ml ;

Ballon jaugé de 250 ml ;

2 ballons jaugés de 100 ml ;

Ballon jaugé de 50 ml ;

Filtre de 45 µm en PVDF (SLHV033NK, Millipore, Millex HV) ;

Seringue de 5 ml jetable (14-283-35, Ref309650, BD Fisher) ;

Seringue Hamilton de 1 ml et 5 ml ;

Pipettes automatiques P200 et P1000 ;

Balance précision 0,0001 g (Mettler toledo, AB204, Suisse) ;

Spectromètre d’adsorption atomique à la flamme FAAS (Manon Leduc,

Laboratoire CGM, Polytechnique) ;

Centrifugeuse Beckman, rotor modèle J2-21 (Palo Alto, Californie) ;

Agitateur Wrist Action ( Burrell, Pittsburgh, CA) ;

201

KNO3 grade extra pure (12648, Riedel-deHaën, Fluka, FW=101.10g/mol) ;

Solution standard Cu 1000 μg/mL (PLZN2-2Y, SPEX, CAS Zn 7440-66-6, CAS

HNO3 7697-37-2) ;

Eau déionisée (eau nanopure, résistivité ≥ 18.2 MΩ.cm) ;

202

3. MÉTHODOLOGIE

3.1 Préparation du matériel

1. Laisser tremper les tubes à centrifuger blancs et bleus, les spatules en téflon et les

ballons jaugés pendant au moins 2h dans l’acide nitrique 10% (préférablement une

journée).

2. Rincer ce matériel 3 fois à l’eau distillée et trois fois à l’eau déionisée.

3.2 Préparation de la solution de KNO3 0.01M

1. Peser 2.0220g de nitrate de potassium et transférer dans un ballon jaugé de 2L.

2. Compléter le volume au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

3.3 Extraction du zinc total en solution

1. Peser exactement 12,50 g de sol directement dans un tube à centrifuger de 50mL

(tube blanc en polypropylène) préalablement lavé à l’acide. Noter le poids et

réaliser les manipulations en triplicata pour chaque sol.

2. Ajouter 25 ml de KNO3 0,01 M à l’aide d’une dispensette de 100 ml préalablement

calibrée. Noter le poids de la solution ajoutée.

3. Dans un tube vide, ajouter aussi 25 ml de KNO3 0,01 M (blanc).

4. Fermer les tubes et les agiter pendant 16h à l’aide d’un agitateur de type Wrist

Action.

5. Centrifuger à 10 000 g pour 10 min.

6. Prélever le surnageant à l’aide d’une seringue de 5 ml (une seringue par sol), visser

un filtre de 0,45 μm et filtrer 25 ml du surnageant dans un tube bleu à centrifuger de

50 ml préalablement lavé à l’acide. Changer de filtre et rincer la seringue entre

chaque échantillon.

203

7. Analyser les échantillons au FAAS pour le cuivre total en solution au Laboratoire

de Géochimie Analytique local B-647 Département des génies Civil, Géologique et

des Mines (CGM) de l’École Polytechnique de Montréal.

4. RÉFÉRENCE(S)

C. H. Stephan, F. Courchesne, W. H. Hendershot, S. P. McGrath, A. M. Chaudri, V.

Sappin-Didier, et al., "Speciation of zinc in contaminated soils," Environmental

Pollution, vol. 155, pp. 208-216, September 2008 2008.

5. RECOMMANDATION(S)

• [Cu total dissous] = [Cu inorganique] + [complexe dissous organique-Cu]

Où [Cu labile] est associé à [Cu inorganique]

• Paire inorganique principales : carbonate, hydroxyde, nitrate et sulfate

204

ANNEXE A11 – MESURE DE L’ACTIVITÉ DE L’INVERTASE DANS UN SOL

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL

Protocole # : PE72-D Nombre de pages : 7

Version : 1 Date : 11 février 2016

Auteur(s): Allison Meyssonnier

Isabelle Lessard

Approuvé par : Signatures : Date :

Titre : Mesure de l’activité de l’invertase dans un sol.

Mots clés : Invertase, enzymes, activité enzymatique, contamination métallique

205

1. OBJECTIF

Ce protocole a pour objectif de mesurer le potentiel d’activité enzymatique de

l’invertase dans un sol contaminé par un métal. Cette enzyme est liée au cycle du

carbone. L’invertase hydrolyse en monosaccharides le sucrose, un disaccharide de

glucose-fructose présent dans les plantes et plus facilement hydrolysable que les autres

disaccharides. L’invertase est produite par plusieurs microorganismes du sol incluant les

bactéries, les fungi et les levures. L’essai de l’invertase est le seul protocole

enzymatique lié au cycle du carbone utilisant un substrat naturellement présent dans le

sol.

Puisqu’il est très difficile d’extraire et de mesurer les enzymes contenues dans les sols,

ce protocole mesure un potentiel d’activité enzymatique; on introduit dans un

échantillon de sol le substrat ciblé par l’enzyme testé et on mesure après une période

d’incubation les produits de la transformation enzymatique. De l’eau déionisée est

utilisée pour la préparation de toutes les solutions puisque le projet est réalisé dans le

contexte d’une contamination métallique et qu’il est important d’utiliser des solutions

exemptes de métaux. Ce protocole permet l’analyse de l’activité enzymatique sans

tampon, correspondant à l’activité enzymatique ‘réelle’ du sol.

2. Invertase

2.1 Matériel

5 erlenmeyers de 50 ml (avec bouchon de caoutchouc) par sol + 6 erlenmeyers

de 50 ml pour la calibration ;

10 éprouvettes de 15 ml par sol + 6 éprouvettes de 15 ml pour les standards ;

1 bécher de 2 L ;

1 bécher de 150 ml ;

1 bécher de 50 ml ;

206

5 béchers de 25 ml ;

1 ballons de 2 L ;

1 ballons de 1 L ;

2 ballons de 500 ml ;

1 ballon de 100 ml ;

1 ballon de 50 ml ;

1 bouteille ambrée ;

5 tubes eppendorf de 2 ml par sol ;

Pipettes P200, P1000, P5000 et multicanaux (model 8800, Nichityo) ;

Embouts à pipettes ;

Spatules ;

Dispensettes de 10 ml et de 100 ml et dispensette automatique ;

1 thermomètre ;

Barreau magnétique ;

Plaque chauffant agitatrice;

Incubateur tempéré à 50°C ;

Centrifugeuse sur table (Sigma 1-16 157955) ;

Balance ± 0.0001 (Mettler Toledo) ;

Microplaque à fond plat transparente (Costar 96wells, Fisher) ;

Lecteur microplaque (GENios, Tecan) ;

Acide sulfurique (Anachemia, 88366-460, FW 98.08) ;

Sucrose (Fisher 55-500, M=342,3) ;

D-glucose anhydre (dextrose) (Sigma G-7528, FW 180.16) ;

Carbonate de sodium anhydre (Fisher S263-500, FW105.99) ;

Cyanure de potassium (Fisher P223I-100, FW 65.12) ;

Hexacyanoferrate (III) de potassium (Sigma-Aldrich 244023-5G, FW 329.24) ;

Sulfate d’ammonium ferrique dodécahydraté (Anachemia, 40710-300, FW

482.19) ;

207

Sulfate de sodium dodécyl (Anachemia, BG-3950, FW 288.38) ;

Eau déionisée (eau nanopure, résistivité ≥ 18.2 MΩ.cm).

208

2.2 Préparation des solutions

2.2.1 Solution de sucrose 1,2%

1. Peser 1,2 g de sucrose dans un bécher de 150 ml et ajouter 90 ml d’eau déionisée.

2. Mélanger 2 h à 45°C.

3. Laisser refroidir et transvider dans un ballon de 100 ml.

4. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

5. Préparer ces solutions le jour même.

2.2.2 Réactif A

1. Peser 8 g de carbonate de sodium anhydre et 0,45 g de cyanure de potassium dans

des béchers de 50 ml et 25 ml respectivement.

2. Dissoudre dans un ballon de 500 ml contenant environ 300 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

2.2.3 Réactif B

1. Peser 0,25 g de hexacyanoferrate (III) de potassium dans un bécher de 25 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 500 ml contenant environ 300 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

4. Conserver cette solution dans une bouteille ambrée.

2.2.4 Réactif C

1. Peser 3 g de sulfate d’ammonium ferrique et 2 g de sulfate de sodium dodecyl dans

des béchers de 25 ml.

2. Dissoudre dans 1800 ml d’eau déionisée et 8,4 ml de H2SO4 concentré dans un

bécher de 2L.

3. Chauffer à 50°C pour dissoudre.

4. Laisser refroidir.

5. Transférer dans un ballon de 2 L.

209

6. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

2.2.5 Standard stock de glucose (250µ g glucose/ ml)

1. Peser 0,25 g de glucose anhydre dans un bécher de 25 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 1 L contenant environ 700 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

2.2.6 Standard de travail pour une courbe de calibration (25 µ g glucose/ ml)

1. Pipeter 5 ml avec une pipette P5000 de la solution stock dans un ballon de 50 ml.

2. Ajuster le volume au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

2.3 Méthode

Les mesures sont effectuées en 4 étapes : 1) Préparer le sol avec le substrat et l’incuber,

2) Centrifuger le surnageant 3) Ajouter les réactifs, 4) Préparer la courbe de calibration

et mesurer l’absorbance des échantillons centrifugés.

2.3.1 Préparation du sol et incubation avec substrat

1. Peser 1,00 g ± 0,05 g de sol humide dans 5 erlenmeyers de 50 ml.

2. Avec une dispensette automatique de 5 ml, ajouter 3 ml d’eau déionisée dans les 5

erlenmeyers.

3. Avec une dispensette automatique de 5 ml, ajouter 3 ml de la solution de substrat

dans 3 des 5 erlenmeyers seulement (échantillons). Les 2 autres erlenmeyers sans

substrat serviront de contrôle.

4. Agiter brièvement, sceller et incuber pour 2 h à 50oC.

2.3.2 Préparation du filtrat après incubation

1. Avec une dispensette automatique de 5 ml, ajouter 3 ml de substrat dans les 2

contrôles.

210

2. Transférer le surnageant dans des tubes Eppendorf de 2 ml.

3. Centrifuger à 15 000 rpm pendant 2 min.

4. Pipeter 250 µL de surnageant pour chaque échantillon dans une éprouvette de 15 ml,

ajouter 9,75 ml d’eau déionisée, sceller et agiter.

5. Transférer 1 ml de l’échantillon dilué à l’aide d’une P1000 dans une autre éprouvette

de 15 ml.

6. Ajouter 1 ml du réactif A et 1 ml du réactif B avec une dispensette automatique,

sceller, agiter et incuber 15 min dans un bain d’eau bouillante.

7. Refroidir les échantillons 5 min.

8. Ajouter 5 ml de réactif C, sceller, agiter et laisser reposer 60 min pour permettre le

développement de la couleur.

2.3.3 Standard de calibration :

1. Pipeter avec la pipette P1000 (blanc) 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 et 0.6 ml du standard de

travail dans des tubes de 15 ml.

2. Ajuster les volumes à 1 ml avec de l’eau millipore avec une pipette P1000 (1, 0.9,

0.8 ml…).

3. Les standards de calibration contiennent 0, 2.5, 5, 7.5, 10 et 15 µg de glucose.

4. Traiter les standards comme les échantillons : ajouter 1 ml du réactif A et 1 ml du

réactif B, sceller, agiter et incuber 15 min dans un bain d’eau bouillante. Refroidir les

standards 5min et ajouter 5 ml de réactif C, sceller, agiter et laisser reposer 60 min

pour permettre le développement de la couleur.

2.3.4 Analyses photométriques des échantillons et des standards de calibration

1. À l’aide d’une pipette P200, pipeter 200 µL d’échantillons et des standards dans les

puits de la microplaque. Attention à éviter la formation de bulles à tout prix !

2. Mesurer l’extinction à 690 nm avec le fluoromètre contre le blanc.

211

2.4 Calculs

Calculer les concentrations de glucose équivalent (GE) à partir des courbes de

calibration.

(S-C)*V*D = µ g GE ⋅g-1 sol sec ⋅2h-1

PS

S valeur moyenne des échantillons (µ g GE/ ml)

C valeur moyenne des contrôles (µ g GE/ ml)

V volume de solution d’incubation= 6 ml

(3 ml substrat + 3 ml eau déionisée)

D Facteur de dilution D=40

PS poids sec de l’échantillon (g sol sec)

3. NOTES

• La présence d’acides, de sels, d’ions ammonium, de zinc, d’argent, de

manganèse, d’hydroxide, de fluorides et/ou une force ionique élevée ralentit le

développement de la couleur. Il faut donc absolument analyser des échantillons

dilués pour l’analyse photométrique de l’activité de cette enzyme.

• La couleur est stable seulement 30 minutes. Il faut donc faire la lecture

rapidement après le développement de la couleur.

• Les solutions contenant du cyanure peuvent être inactivés par oxydation au

peroxyde en milieu alcalin

• Le filtre disponible est à 660 nm. Des scans ont démontré qu’une lecture à cette

longueur d’onde est quasi-optimale (voir p.91 cahier 167 pour copies des scans).

212

4. RÉFÉRENCES

Kandeler, E. and R. Öhlinger (1996). Enzymes Involved in Nitrogen Metabolism.

Methods in Soil Biology. mF. Schinner, R. Öhlinger, E. Kandeler and R. Margesin.

Berlin, Springer: 162-184.

Stuczynski, T. I., G. W. McCarty, et al. (2003). "Response of Soil Microbiological

Activities to Cadmium, Lead, and Zinc Salt Amendments." Journal of Environmental

Quality 32: 1346-1355.

213

ANNEXE A12 – MESURE DE L’ACTIVITÉ DE L’URÉASE DANS UN SOL

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL

Protocole # : PE72-E Nombre de pages : 7

Version : 1 Date : 12 février 2016

Auteur(s): Allison Meyssonnier

Isabelle Lessard

Valérie Bécaert

Approuvé par :

Signatures : Date :

Titre : Mesure de l’activité de l’uréase dans un sol

Mots clés : uréase, sol, activité enzymatique, contamination métallique

214

1. OBJECTIF

Ce protocole a pour objectif de mesurer le potentiel d’activité enzymatique dans un sol.

L’enzyme testé est un représentant du cycle de l’azote et hydrolyse l’urée dont la source

est supposée d’être principalement d’origine microbienne. De l’eau déionisée est utilisée

pour la préparation de toutes les solutions puisque le projet est réalisé dans le contexte

d’une contamination métallique et qu’il est important d’utiliser des solutions exemptes

de métaux. Puisqu’il est très difficile d’extraire et de mesurer les enzymes contenus dans

les sols, le principe sur lequel repose le protocole proposé est la mesure du potentiel

d’activité enzymatique : on introduit dans un échantillon de sol un substrat ciblé par

l’enzyme testé puis on mesure, après une période d’incubation à une température

donnée, les produits de la transformation enzymatique. Ce protocole permet l’analyse de

l’activité enzymatique sans tampon, correspondant à l’activité enzymatique ‘réelle’ du

sol.

2. URÉASE

2.1 Matériel

5 erlenmeyers de 50 ml (avec bouchon de caoutchouc) par sol + 6 erlenmeyers

de 50 ml pour la calibration ;

1 bécher de 2 L :

1 bécher de 500 ml ;

1 bécher de 100 ml ;

2 béchers de 50 ml ;

2 béchers de 25 ml ;

1 ballon de 2 L ;

3 ballons de 1 L ;

6 ballons de 50 ml ;

215

3 ballons de 25 ml ;

5 tubes eppendorf de 2 ml par sol ;

Pipettes P20, P1000, P5000 et multicanaux (model 8800, Nichityo) ;

Embouts à pipettes ;

Spatules ;

4 pipettes graduées de 25 ml ;

1 thermomètre ;

1 seringue de 5 ml (pour percer les bulles) ;

Incubateur tempéré à 37°C ;

Centrifugeuse sur table (Sigma 1-16 157955) ;

Balance ±0,0001 (Mettler Toledo) ;

Agitateur rotatif ;

Microplaque à fond plat transparente (Costar 96wells, Fisher) ;

Lecteur microplaque (GENios, Tecan) ;

HCl 1M (Fisher, RDCA0430-500, FW 36.46) ;

NaOH (Fisher S318-3, FW 39.997) ;

NH4Cl (Fisher, P217-500, FW 53.49) ;

Urée (Anachemia, AC-9700, FW 60.06) ;

KCl (Anachemia, 72830-380, FW 74.55) ;

Salicylate de sodium (JT Baker, 3872-01, FW 160.10) ;

Sodium nitro-prusside (sodium nitrofericyanide) (Sigma, 431451, FW 297.95) ;

Dichloroisocyanurate de sodium (attention peut brûler, à manipuler avec

ventilation, tenir loin du feu) (Sigma, D2536, FW 219.90) ;

Eau déionisée (eau nanopure, résistivité ≥ 18.2 MΩ.cm).

216

2.2 Préparation des solutions

2.2.1 NaOH (0,3 M)

4. Peser 12 g de NaOH dans un bécher de 500 ml.

5. Dissoudre dans un ballon de 1 L contenant environ 700 ml d’eau déionisée.

6. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

2.2.2 Solution de substrat dans de l’eau déionisée (720 mM), pour 30 échantillons

1. Peser 0,08 g d’urée dans un bécher de 25 ml (NOTE : le poids devait être de 1,08g

d’urée) ;

2. Dissoudre dans un ballon de 25 ml contenant environ 10 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

4. Préparer ce réactif le jour même.

2.2.3 HCl (1 M)

1. Pipeter 82,5 ml de HCl concentré dans un ballon de 1 L contenant 500 ml d’eau

déionisée.

2. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée

2.2.4 Solution de chlorure de potassium KCl (1 M)

1. Peser 149,2 g de KCl dans un bécher de 2 L contenant 500 ml d’eau déionisée.

2. À l’aide d’une pipette graduée de 25 ml, ajouter 20 ml d’HCl 1 M.

3. Transférer dans un ballon de 2 L.

4. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

5. Garder cette solution quelques semaines seulement.

2.2.5 Solution de Salicylate de sodium pour une analyse et une c. c. (1,06 M)

1. Peser 4,25 g de salicylate de sodium dans un bécher de 50 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 25 ml contenant 10 ml d’eau déionisée.

3. Ajouter 30 mg de sodium nitro-prusside.

217

4. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

5. Préparer ce réactif juste avant l’analyse.

2.2.6 Réactif A (à préparer pendant l’incubation)

1. Dans un bécher de 100 ml, mélanger :

- 25 ml de NaOH 0,3 M ;

- 25 ml de solution de salicylate de sodium ;

- 25 ml d’eau déionisée.

2. Préparer ce réactif juste avant l’analyse.

2.2.7 Réactif B : Solution de dichloroisocyanurate pour une analyse et une c. c.

(4.5 mM), à préparer pendant l’incubation

1. Peser 25 mg de dichloroisocyanurate de sodium dans un bécher de 25 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 25 ml contenant 10 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

4. Préparer ce réactif le jour même.

2.2.8 Solution standard stock (1000 µg NH4+-N ml-1)

1. Peser 3,8207 g de NH4Cl dans un bécher de 50 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 1 L contenant 700 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

4. Garder cette solution à 4oC.

2.2.9 Standards de calibration

1. Avec une P5000, pipeter 0 (blanc), 0.5, 0.75, 1 et 1.25 ml de solution stock dans des

ballons de 50 ml

2. Ajuster le volume au trait de jauge avec la solution de chlorure de potassium.

3. Les standards contiennent 0, 10, 15, 20 et 25 µg NH4+-N ml-1.

218

2.3 Méthodologie

Les mesures sont effectuées en 4 étapes : 1) Il faut préparer le sol avec le substrat et

l’incuber, 2) Préparation du filtrat qui contient le produit de l’activité de l’uréase, 3)

Traiter le filtrat avec un réactif coloré pour mesure photométrique, 4) Préparation de la

courbe de calibration pour effectuer les calculs.

2.3.1 Préparation du sol et incubation avec substrat

1. Peser 1,00 g ± 0,05 g de sol humide dans 5 erlenmeyers de 50 ml (3 échantillons et

2 contrôles).

2. Avec une dispensette de 10 ml, ajouter 4 ml d’eau déionisée dans tous les

erlenmeyers.

3. Avec une pipette de 1 ml, ajouter 500 µL de la solution de substrat dans trois

erlenmeyers (échantillons).

4. Agiter brièvement, sceller et incuber pour 2 h à 37oC.

2.3.2 Préparation du filtrat après incubation

1. Ajouter 6 ml de solution de chlorure de potassium dans tous les erlenmeyers et

mélanger pendant 30 minutes sur un agitateur rotatif à une vitesse de 100 rpm.

2. Après agitation, ajouter à l’aide d’une pipette P1000, 500 µL de substrat dans les

contrôles.

3. Transférer le surnageant dans des tubes Eppendorf de 2 ml.

4. Centrifuger à 15 000 rpm pendant 5 min.

2.3.3 Analyses photométriques des échantillons et des standards de calibration

1. Traiter les échantillons et les standards de calibration de la même manière :

pipeter, à l’aide d’une pipette P20, 20 µL d’échantillons et des standards dans les

puits de la microplaque.

2. Ajouter, à l’aide d’une pipette multicanaux, 180 µL d’eau déionisée dans les puits.

3. Ajouter, à l’aide d’une pipette multicanaux, 100 µL du réactif A dans les puits.

219

4. Ajouter, à l’aide d’une pipette multicanaux, 40 µL de réactif B (solution de

dichloroisocyanurate) dans les puits. Attention à éviter la formation de bulles à

tout prix !

5. Laisser décanter pendant 30 minutes à la température ambiante.

6. Lecture à 685 nm.

2.4 Calcul

Calculer les concentrations à partir de la courbe de calibration

(S-C)⋅V = µg NH4+-N ⋅g-1⋅2h-1

PS

S valeur moyenne des échantillons (µg NH4+-N ml-1)

C valeur moyenne des contrôles (µg NH4+-N ml-1)

V volume de solution d’incubation = 10,5 ml

(4 ml eau déionisée +0,5 ml substrat+6 ml KCl)

PS poids sec du sol (g)

3. NOTES

- Si nécessaire les filtrats peuvent être entreposés pendant une nuit à 4oC

- La courbe de calibration est linéaire jusqu’à 3.5 µg N⋅ml-1. Si l’intensité de la couleur des filtrats n’est pas dans cette limite, ils doivent être dilués avec de l’eau déionisée.

- Le complexe coloré est stable pendant 8 heures.

4. RÉFÉRENCES

Kandeler, E. and R. Öhlinger (1996). Enzymes Involved in Nitrogen Metabolism.

Methods in Soil Biology. F. Schinner, R. Öhlinger, E. Kandeler and R. Margesin.

Berlin, Springer: 162-184.

220

ANNEXE A13 – MESURE DE L’ACTIVITÉ DE LA PROTÉASE DANS UN SOL

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL

Protocole # : PE72-F Nombre de pages : 7

Version : 1 Date 12 février 2016

Auteur(s): Allison Meyssonnier

Lucie Jean

Valérie Bécaert

Approuvé par : Signatures : Date :

Titre : Mesure de l’activité de la protéase dans un sol

Mots clés : protéase, activité enzymatique, enzyme, sol, contamination métallique

221

1. OBJECTIF

Ce protocole a pour objectif de mesurer le potentiel d’activité enzymatique dans un sol.

L’enzyme testée, la protéase, décompose les protéines du sol pour former des

oligopeptides (chaîne de moins d’une dizaine d’acides aminés) qui seront

éventuellement assimilés par les micro-organismes du sol comme source d’énergie ou

comme molécules utiles pour la synthèse de nouvelles protéines. De l’eau millipore est

utilisée pour la préparation de toutes les solutions puisque le projet est réalisé dans le

contexte d’une contamination métallique et qu’il est important d’utiliser des solutions

exemptes de métaux. Puisqu’il est très difficile d’extraire et de mesurer les enzymes

contenus dans les sols, le principe sur lequel repose chacun des protocoles proposés est

la mesure du potentiel d’activité enzymatique : on introduit dans un échantillon de sol

un substrat ciblé par l’enzyme testé et on mesure après une période d’incubation les

produits de la transformation enzymatique. Ce protocole permet l’analyse de l’activité

enzymatique sans tampon, correspondant à l’activité enzymatique ‘réelle’ du sol.

2. PROTÉASE

2.1 Matériel

5 erlenmeyers de 25 ml (avec bouchon de caoutchouc) par sol + 6 erlenmeyers

de 25 ml pour la calibration ;

1 bécher de 1 L ;

1 bécher de 500 ml ;

2 béchers de 250 ml ;

3 béchers de 25 ml ;

1 ballon de 1L ;

1 ballon de 2L ;

222

4 ballons de 100 ml ;

1 ballons de 500 ml ;

1 ballons de 250 ml ;

1 ballon de 200 ml ;

Pipettes de 1 ml ;

Pipettes de 5 ml ;

Pipettes de 10 ml ;

Pipettes de 50 ml ;

5 tubes eppendorf de 2 ml par sol ;

Micropipette P200 et P5000 ;

Embouts à pipettes ;

Dispensette multichannel (Nichiryo,model 8800) ;

Spatules ;

Barreau magnétique ;

Plaque chauffant agitatrice;

Incubator shaker (New Brunswick scientific, Innova 4000, U.S.A) ;

Centrifugeuse sur table (Sigma 1-16 157955) ;

Balance ±0,0001 (Mettler Toledo) ;

Agitateur rotatif tempéré;

Microplaque à fond plat transparente (Costar 96wells, Fisher) ;

Lecteur microplaque (GENios, Tecan) ;

NaOH (Fisher S318-3) ;

Caséine (sodium-salt, Sigma C-8654-500G) ;

CCl3 COOH (TCA) (Fisher 322-500, FW 163.39) ;

Carbonate de sodium anhydre (Fisher S263, FW 105.99) ;

Copper(II)sulfate pentahydrate (Anachemia 28842-300, FW 249.68) ;

Sodium potassium tartate (C4H4KNaO6⋅4H2O, Anachemia AC-7738) ;

223

Folin Ciocalteu’s phenol reagent (Sigma F-9252) ;

Tyrosine (Aldrich T9040-9, FW 181.19) ;

Eau déionisée (eau nanopure, résistivité ≥ 18.2 MΩ.cm).

224

2.2 Préparation des solutions

2.2.1 Solution de substrat (2% w/v)

3. Dans un bécher de 250 ml, peser 10 g de caséine et ajouter de l’eau déionisée.

4. Ajouter un barreau magnétique puis agiter à l’aide d’une plaque chauffante agitatrice.

5. Mélanger la suspension à 50oC jusqu’à ce que la caséine soit dissoute.

6. Transférer dans un ballon de 200 ml et compléter au trait de jauge avec de l’eau

déionisée.

7. Préparer, ce réactif la journée même.

NOTE : le poids initial devait être 5 g de caséine dans 250 ml d’eau déionisée.

2.2.2 Solution d’acide trichloroacétique (TCA, 0,92 M)

1. Peser 300 g de CCl3 COOH (TCA) dans un bécher de 1 L.

2. Dissoudre dans un ballon de 2 L contenant environ 1 L.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

2.2.3 Solution d’hydroxyde de sodium (NaOH 0,1 M)

1. Peser 5 g d’hydroxyde de sodium dans un bécher de 250 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 1 L contenant environ 700 ml.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

2.2.4 Réactif A

1. Peser 25 g de carbonate de sodium dans un bécher de 250 ml.

2. Transvider dans un ballon de 500 ml.

3. Ajouter 30 ml de NaOH 0,1 M.

4. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

5. Garder la solution à 4oC au maximum 3 semaines.

2.2.5 Réactif B

225

1. Peser 0,5 g de copper(II)sulfate pentahydrate dans un bécher de 25 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 100 ml contenant environ 50 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

4. Garder à 4oC au maximum 3 semaines.

2.2.6 Réactif C

1. Peser 1 g de sodium potassium tartate (C4H4KNaO6⋅4H2O) dans un bécher de

25 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 100 ml contenant environ 50 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

4. Garder à 4oC pour 1 semaine.

2.2.7 Réactif alcali (solution de travail)

1. Dans un bécher de 100 ml, mélanger :

- 50 ml de réactif A ;

- 1 ml de réactif B ;

- 1 ml de réactif C.

2. Préparer cette solution le jour même.

2.2.8 Réactif de phénol Folin-Ciocalteu

1. Pipeter 10 ml de Folin Ciocalteu’s phenol reagent dans un ballon de 100 ml.

2. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

2.2.9 Solution standard stock pour une courbe (500 µg de tyrosine/ml)

1. Peser 50 mg de tyrosine dans un bécher de 25 ml.

2. Si nécessaire, chauffer pour dissolution complète.

3. Dissoudre dans un ballon de 100 ml contenant environ 50 ml d’eau déionisée.

4. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

226

5. Garder la solution à 4oC pour 1 semaine.

2.2.10 Standard de calibration

1. Avec une P5000, pipeter 0 (blanc), 0.2, 0.5, 1, 2 et 3 ml de la solution stock dans

six erlenmeyers de 25 ml.

2. Ajuster les volumes à 5 ml avec de l’eau déionisée, (ajouter dans le même ordre que

précédemment : 5, 4.8, 4.5, 4, 3, 2 ml).

3. Les standards de calibration contiennent 0 (blanc), 100, 250, 500, 1000 et 1500 µg

de tyrosine.

4. Ajouter 5 ml de solution de substrat et 5 ml de solution TCA.

5. Agiter brièvement, transférer dans des tubes Eppendorf 2 ml et centrifuger à

15 000 rpm pendant 2 min.

2.3 Méthode

Les mesures sont effectuées en 4 étapes : 1) Il faut préparer le sol avec le substrat et

l’incuber, 2) Préparation du filtrat qui contient le produit de l’activité de la protéase, 3)

Traiter le filtrat avec un réactif coloré pour mesure photométrique, 4) Préparation de la

courbe de calibration pour effectuer les calculs.

2.3.1 Préparation du sol et incubation avec substrat

1. Peser 1,00 g ± 0,05 de sol humide dans cinq erlenmeyers de 25 ml (3 échantillons et

2 contrôles).

2. Ajouter 5 ml de solution substrat et 5 ml d’eau déionisée dans trois erlenmeyers

(échantillons).

3. Pipeter seulement 5 ml d’eau déionisée dans les deux autres (contrôles).

227

4. Agiter les flacons brièvement, sceller avec des « rubber stoppers » et incuber pour

2 h à 50oC sur un agitateur rotatif.

2.3.2 Préparation du filtrat après incubation

1. Mélanger brièvement.

2. Pipeter 5 ml (avec une P5000) de substrat dans les deux contrôles.

3. Ajouter 5 ml (avec une P5000) de TCA dans les cinq erlenmeyers.

4. Agiter brièvement, transférer dans des tubes Eppendorf 2 ml et centrifuger à

15 000 rpm pendant 2 min.

2.3.3 Analyses photométriques des échantillons et des standards de calibration

7. Traiter les échantillons et les standards de calibration de la même manière :

pipeter, à l’aide d’une pipette P200, 50 µL d’échantillons et des standards dans les

puits de la microplaque.

1. Ajouter 75 µL (avec une dispensette multichannel) de réactif alcali dans les puits de

la microplaque et bien mélanger doucement.

2. Ajouter 50 µL (avec une dispensette multichannel) de Folin Ciocalteu’s phenol

reagent, mélanger doucement encore.

3. Laisser reposer 90 min à la température de la pièce pour le développement de la

couleur.

4. Dans les prochaines 90 min mesurer l’extinction des standards, des échantillons et

des contrôles contre le blanc à 700 nm.

228

2.4 Calculs

L’activité de la protéase est exprimée en µg de tyrosine équivalent (tyr) par gramme de

matière sèche et temps d’incubation. L’équivalent tyrosine est calculé à partir de la

courbe de calibration.

S valeur moyenne des échantillons (µg tyr/ ml)

C valeur moyenne des contrôles (µg tyr/ ml)

PS poids du sol sec (g)

3. NOTE

- Le TCA est utilisé pour faire précipiter le restant de substrat après incubation.

- Il est possible de garder les filtrats à 4oC pendant 5h

- Si la concentration en tyrosine dépasse la courbe de calibration, réduire le temps d’incubation à 1h.

4. RÉFÉRENCES

Ladd JN, Butler JHA (1972) Short-term assay of soil proteolytic enzyme activities using proteins and dipeptide derivates as substrates. Soil Biology and Biochemestry, 4: 19-39.Tiré de Schinner et al. 1997. Kandeler, E. and R. Öhlinger (1996). Enzymes Involved in Nitrogen Metabolism. Methods in Soil Biology. F. Schinner, R. Öhlinger, E. Kandeler and R. Margesin. Berlin, Springer: 162-184. Schinner, F., Öhlinger, R., Kandeler, E., & Margesin, R. (1996). Methods in Soil Biology. Germany: Springer.

229

ANNEXE A14 – MESURE DE L’ACTIVITÉ DE L’ARYLSULFATASE DANS UN SOL

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL

Protocole # : PE72-G Nombre de pages : 6

Version : 1 Date : 10 février 2016

Auteur(s): Allison Meyssonnier

Lucie Jean

Approuvé par : Signatures : Date :

Titre : Mesure de l’activité de l’arylsulfatase dans un sol

Mots clés : arylsulfatase, sol, activité enzymatique, contamination métallique

230

1. OBJECTIFS

Ce protocole a pour objectif de mesurer le potentiel d’activité enzymatique dans un sol

selon la procédure de Kandeler et al (1996). L’enzyme testé est un représentant du cycle

du soufre. Les sulfatases sont principalement d’origine microbienne et sont fortement

corrélées à la matière organique du sol. De l’eau millipore est utilisée pour la

préparation de toutes les solutions puisque le projet est réalisé dans le contexte d’une

contamination métallique et qu’il est important d’utiliser des solutions exemptes de

métaux. Puisqu’il est très difficile d’extraire et de mesurer les enzymes contenus dans

les sols, le principe sur lequel repose ce protocole est la mesure du potentiel d’activité

enzymatique : on introduit dans un échantillon de sol un substrat ciblé par l’enzyme

testé puis on mesure, après une période d’incubation à une température donnée, les

produits de la transformation enzymatique. Ce protocole permet l’analyse de l’activité

enzymatique sans tampon, correspondant à l’activité enzymatique ‘réelle’ du sol.

2. ARYLSULFATASE

2.1 Matériel

5 erlenmeyers de 50 ml par sol (avec bouchon de caoutchouc) + 6 erlenmeyers

de 50 ml pour la calibration ;

2 béchers de 250 ml ;

1 bécher de 100 ml ;

1 bécher de 50 ml ;

1 bécher de 25 ml ;

2 ballons de 1 L ;

1 ballon de 500 ml ;

2 ballons de 50 ml ;

231

2 bouteilles ambrées ;

1 cylindre gradué de 250 ml ;

5 tubes eppendorf de 2 ml par sol ;

Pipettes P200, P1000, P5000 et multicanaux (model 8800, Nichityo) ;

Embouts à pipettes ;

Spatules ;

Dispensettes de 2 ml, 10 ml et de 100 ml et dispensette automatique ;

Spatules ;

Incubateur tempéré à 37°C ;

Centrifugeuse sur table (Sigma 1-16 157955) ;

Balance ± 0.0001 (Mettler Toledo) ;

Microplaque à fond plat transparente (Costar 96wells, Fisher) ;

Lecteur microplaque (GENios, Tecan) ;

Potassium-p-nitrophenylsulfate (Sigma, N-3877, FW 257.27) ;

NaOH (Fisher S318-3) ;

Chlorure de calcium dihydrate (Fisher C79-500, FW 147.01) ;

p-nitrophenol (Sigma 104-8, 63802-100, FW 139.11) ;

Eau déionisée (eau nanopure, résistivité ≥ 18.2 MΩ.cm).

232

2.2 Préparation des solutions

2.2.1 Solution de substrat dans de l’eau déionisée (0,02 M) pour 30 échantillons

1. Peser 257,6 mg de potassium-p-nitrophenylsulfate dans un bécher 50 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 50 ml contenant environ 30 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster le volume au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

4. Préparer la solution le jour même et mettre à l’abri de la lumière.

Attention! Le substrat est sensible à la lumière et à la température.

2.2.2 Solution de Chlorure de calcium CaCl2 (0,5 M)

1. Peser 36,74 g de CaCl2 dihydrate dans un bécher de 250 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 500 ml contenant environ 300 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

Attention! Du chlore se libère lors de l’ajout de l’eau, faire la solution sous la hotte.

2.2.3 Solution d’hydroxyde de sodium (0.5 M)

1. Peser 20 g de NaOH dans un bécher de 250 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 1 L contenant environ 700 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

2.2.4 Solution standard stock (1 mg p-nitrophenol x ml-1)

1. Peser 1 g de p-nitrophenol dans un bécher de 25 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 1 L contenant environ 700 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

4. Garder cette solution à 4ºC dans un contenant ambré.

2.2.5 Standard de travail pour une courbe de calibration (0,1 mg p-nitrophenol⋅x

ml-1)

233

1. Pipeter 5 ml avec une micropipette P5000 de la solution stock dans un ballon de

50 ml.

2. Ajuster le volume au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

3. Transvider dans un bécher 50 ml.

4. Préparer la solution le jour même.

2.2.6 Standard de calibration

1. Pipeter avec la pipette P5000 (blanc) 0, 1, 2, 3, 4, 5 ml du standard de travail dans

des erlenmeyers de 50 ml.

2. Ajuster les volumes à 5 ml avec de l’eau déionisée en pipetant dans le même ordre

qu’au point précédent 5, 4, 3, 2, 1 et 0 ml avec une P5000.

3. Les standards de calibration contiennent 0, 100, 200, 300, 400 et 500

µg p-nitrophenol.

4. Avec la dispensette de 2 ml, ajouter 1 ml de chlorure de calcium (0,5 M) dans tous

les erlenmeyers. Attention il est très important d’ajouter le CaCl2 avant le

NaOH.

5. Avec la dispensette de 10 ml, ajouter 10 ml de NaOH (0,5 M) dans tous les

erlenmeyers.

6. Transférer dans les tubes Eppendorf de 2 ml et centrifuger à 15 000 rpm pendant

2 min.

2.3 Méthode

Les mesures sont effectuées en quatre étapes :

1) Préparer les échantillons de sol avec le substrat et les incuber durant 2 heures à 37°C

2) Préparer le filtrat qui contient le produit de l’activité de l’arylsulfatase, 3) Traiter le

filtrat avec un réactif coloré pour mesure photométrique, 4) Préparer la courbe de

calibration pour effectuer les calculs.

234

2.3.1 Préparation du sol et incubation avec substrat

1. Peser 1,00 g ± 0,05 g de sol humide dans cinq erlenmeyers de 50 ml.

2. Avec une dispensette de 10 ml, ajouter 4 ml d’eau déionisée dans chaque erlenmeyer.

3. Agiter brièvement et équilibrer les échantillons pendant 30 minutes en les plaçant

dans l’incubateur à 37°C.

4. Avec une pipette P1000, ajouter 1 ml de la solution de substrat dans les trois

premiers erlenmeyers.

5. Remettre les échantillons dans l’incubateur et incuber pendant 2 h à 37°C.

2.3.2 Préparation du filtrat après incubation

1. Avec la dispensette de 2 ml, ajouter 1 ml de chlorure de calcium (0,5 M) dans tous

les erlenmeyers. Attention il est très important d’ajouter le CaCl2 avant le

NaOH.

2. Avec la dispensette de 10 ml, ajouter 10 ml de NaOH (0,5 M) dans tous les

erlenmeyers.

3. Avec une P1000, ajouter 1 ml de solution substrat correspondant dans les contrôles.

4. Agiter les erlenmeyer.

5. Transférer dans les tubes Eppendorf de 2 ml et centrifuger à 15 000 rpm pendant

2 min.

2.3.4 Analyses photométrique du filtrat Analyses photométrique du filtrat

1. À l’aide d’une pipette P1000, pipeter 250 µL d’échantillons et des standards dans les

puits de la microplaque. Attention à éviter la formation de bulles à tout prix !

2. Mesurer l’extinction en absorbance à 420nm avec un lecteur microplaque contre le

blanc.

235

2.4 Calculs

Calculer les concentrations de p-nitrophenol (pNP) à partir des courbes de calibration.

S valeur moyenne des échantillons ( µg pNP/ ml)

C valeur moyenne des contrôles (µg pNP/ ml)

PS poids du sol sec (g)

3. NOTES

- Le substrat est sensible à la chaleur et à la lumière, les flacons doivent être recouverts d’aluminium.

- Mesurer l’extinction dans les 6 premières heures.

- La courbe de calibration est linéaire jusqu’à 120 µg p-nitrophenol.

4. RÉFÉRENCES

E. Kandeler and R. Öhlinger, "Enzymes Involved in Nitrogen Metabolism," in Methods in

Soil Biology, F. Schinner, R. Öhlinger, E. Kandeler, and R. Margesin, Eds., ed Berlin:

Springer, 1996, pp. 162-184.

Tejada, M., Hernandez, M. T., & Garcia, C. (2006). Application of Two Organic

Amendments on Soil Restoration: Effects on the Soil Biological Properties. J Environ

Qual, 35(4), 1010-1017.

236

ANNEXE A15 – MESURE DE L’ACTIVITÉ DE LA PHOSPHATASE DANS UN SOL

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL

Protocole # : PE72-H Nombre de pages : 7

Version : 1 Date : 13 février 2016

Auteur(s): Allison Meyssonnier

Isabelle Lessard

Valérie Bécaert

Approuvé par :

Signatures : Date :

Titre : Mesure de l’activité de la phosphatase dans un sol.

Mots clés : phosphatase, enzymes, activité enzymatique, contamination

237

1. OBJECTIF

Ce protocole a pour objectif de mesurer le potentiel d’activité enzymatique de la

phosphatase dans un sol contaminé par un métal. Cette enzyme est liée au cycle du

phosphore. La phosphatase est importante pour la nutrition des plantes. La

phosphomonoestérase (autre nom de la phosphatase) peut avoir 2 pH optimum, mais ce

protocole ne présente que la phosphatase acide. De l’eau déionisée est utilisée pour la

préparation de toutes les solutions puisque le projet est réalisé dans le contexte d’une

contamination métallique et qu’il est important d’utiliser des solutions exemptes de

métaux. Puisqu’il est très difficile d’extraire et de mesurer les enzymes contenues dans

les sols, ce protocole mesure un potentiel d’activité enzymatique; on introduit dans un

échantillon de sol le substrat ciblé par l’enzyme testé et on mesure après une période

d’incubation les produits de la transformation enzymatique. Ce protocole permet

l’analyse de l’activité enzymatique sans tampon, correspondant à l’activité enzymatique

‘réelle’ du sol.

2. PHOSPHATASE

2.1 Matériel

5 erlenmeyers de 100 ml (avec bouchon de caoutchouc) par sol + 6 erlenmeyers

de 100 ml pour la calibration ;

2 ballons de 1 L ;

1 ballons de 500 ml ;

1 ballon de 50 ml ;

1 ballon de 2 ml ;

Bouteille ambrée ;

Béchers pour peser des produits solides ;

Spatules ;

238

5 tubes eppendorf de 2 ml par sol ;

Pipettes P20, P1000, P5000 et multicanaux (model 8800, Nichityo) ;

Dispensette de 10 ml et de 100 ml ;

Microplaque à fond plat transparente (Costar 96wells, Fisher) ;

Lecteur microplaque (GENios, Tecan) ;

Incubateur tempéré à 37°C ;

Balance ± 0.0001 (Mettler Toledo) ;

Centrifugeuse sur table (Sigma 1-16 157955) ;

4-nitrophenyl-phosphate (ou p-nitrophenyl-phosphate), disodium salt

hexahydrate (Sigma, N4645-5G, FW 371.14) ;

ATTENTION : Entreposer à -20oC dans un dessicateur. Manipuler avec

ventilation et sensible à la lumière

Chlorure de calcium dihydrate (Fisher C79-500, FW 147.01) ;

NaOH (Fisher S318-3) ;

p-nitrophenol (Sigma 104-8, 63802-100, FW 139.11) ;

Eau déionisée (eau nanopure, résistivité ≥ 18.2 MΩ.cm).

239

2.2 Préparation des solutions

2.2.1 Solution de substrat pour une analyse (11,5mM) dans de l’eau, pour 30

échantillons

1. Peser 213,4 mg de disodium 4-nitrophény-phosphate dans un bécher 50 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 50 ml contenant environ 30 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster le volume au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

4. Préparer la solution le jour même et mettre à l’abri de la lumière.

Attention! Le substrat est sensible à la lumière et à la température.

2.2.2 Solution de Chlorure de calcium CaCl2 (0,5 M) (même que pour

arylsulfatase)

1. Peser 36,74 g de CaCl2 dihydrate dans un bécher de 250 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 500 ml contenant environ 300 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

Attention! Du chlore se libère lors de l’ajout de l’eau, faire la solution sous la hotte.

2.2.3 Solution d’hydroxyde de sodium (0.5 M) (même que pour arylsulfatase)

1. Peser 20 g de NaOH dans un bécher de 250 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 1 L contenant environ 700 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

2.2.4 Solution standard stock (1 mg p-nitrophenol x ml-1) (même que pour

arylsulfatase)

1. Peser 1 g de p-nitrophenol dans un bécher de 25 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 1 L contenant environ 700 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

4. Garder cette solution à 4ºC dans un contenant ambré.

240

2.2.5 Standard de travail pour une courbe de calibration (20 µg p-nitrophenol⋅x

ml-1)

1. Pipeter 1 ml avec une micropipette P1000 de la solution stock dans un ballon de

50 ml.

2. Ajuster le volume au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

3. Transvider dans un bécher 50 ml.

4. Préparer la solution le jour même.

2.2.6 Standard de calibration

1. Pipeter avec la pipette P5000 (blanc) 0, 1, 2, 3, 4, 5 ml du standard de travail

dans des erlenmeyers de 50 ml.

2. Ajuster les volumes à 5 ml avec de l’eau déionisée en pipetant dans le même ordre

qu’au point précédent 5, 4, 3, 2, 1 et 0 ml avec une P5000.

3. Les standards de calibration contiennent 0, 20, 40, 60, 80 et 100 µg p-nitrophenol.

4. Avec une dispensette de 2 ml, ajouter 1 ml de CaCl2 (0,5 M). Attention il est très

important d’ajouter le CaCl2 avant le NaOH.

5. Avec une dispensette de 10 ml, ajouter 4 ml de NaOH (0,5 M).

6. Transférer le surnageant dans des tubes Eppendorf de 2 ml et centrifuger à

15 000 rpm pendant 5 min.

2.3 Méthode

Les mesures sont effectuées en 4 étapes : 1) Préparer le sol avec le substrat et l’incuber,

2) Ajouter les réactifs, 3) Centrifuger le surnageant, 4) Préparer la courbe de calibration

et mesurer l’absorbance photométrique des échantillons centrifugés.

2.3.1 Préparation du sol et incubation avec substrat

1. Peser 1,00 g ± 0,05 de sol humide dans 5 erlenmeyers de 100 ml.

241

2. Avec une dispensette de 10 ml, ajouter 4 ml d’eau déionisée dans les 5 erlenmeyers.

3. Avec une P1000, ajouter 1 ml de la solution de substrat dans 3 des 5 erlenmeyers

seulement (échantillons). Les 2 autres erlenmeyers sans substrat serviront de

contrôle.

4. Agiter brièvement, sceller et incuber pour 2 h à 37oC.

2.3.2 Préparation du filtrat après incubation

1. Avec une dispensette de 2 ml, ajouter 1 ml de CaCl2 (0,5 M) dans les 5 erlenmeyers.

Attention il est très important d’ajouter le CaCl2 avant le NaOH.

2. Avec une dispensette de 10 ml, ajouter 4 ml de NaOH (0,5 M) dans les 5

erlenmeyers.

3. Avec une P1000, ajouter 1 ml de solution de substrat dans les contrôles.

4. À l’aide d’une dispensette de 100 ml, ajouter 90 ml d’eau déionisée dans les 5

erlenmeyers

5. Agiter les erlenmeyers.

6. Transférer le surnageant dans des tubes Eppendorf de 2 ml et centrifuger à

15 000 rpm pendant 5 min.

2.3.3 Analyses photométrique du filtrat Analyses photométrique du filtrat

1. Pipeter 250 µL des échantillons centrifugés avec une pipette P1000 dans les puits de

la microplaque.

2. Mesurer l’extinction à 420 nm avec un spectrophotomètre contre le blanc.

242

2.4 Calculs

Calculer les concentrations de p-nitrophenol (pNP) à partir des courbes de calibration.

S valeur moyenne des échantillons (µg pNP/ ml)

C valeur moyenne des contrôles (µg pNP/ ml)

D Facteur de dilution D=10 car on a ajouté 90 ml d’eau dans la solution

d’incubation (10 ml)

PS poids sec de l’échantillon (g sol sec)

3. NOTES

- Le substrat est sensible à la chaleur et à la lumière, les flacons doivent être recouverts

d’aluminium.

- Mesurer l’extinction dans les 6 premières heures.

- La courbe de calibration est linéaire jusqu’à 120 µg p-nitrophenol

- L’ajustement du pH devrait se faire à 37oC puisque c’est la To d’incubation

- Utiliser plus ou moins de sol si l’activité sort de la courbe de calibration, ou est trop

faible.

- Le CaCl2 est ajouté afin d’éviter l’interférence que créent les substances humiques

qui se dissolvent. Il prévient aussi la dispersion de l’argile. Un précipité blanchâtre

se forme lorsque le NaOH est ajouté au CaCl2

- Une corrélation négative entre l’activité de la phosphatase et le P disponible a été

observée dans des sables (Nannipieri et al, 1978) et dans des sols de forêts.

243

4. REFERENCES

E. Kandeler and R. Öhlinger, "Enzymes Involved in Nitrogen Metabolism," in Methods

in Soil Biology, F. Schinner, R. Öhlinger, E. Kandeler, and R. Margesin, Eds., ed

Berlin: Springer, 1996, pp. 162-184.

244

ANNEXE A16 – MESURE DE L’ACTIVITÉ DE LA Β-GLUCOSIDASE DANS UN SOL

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL

Protocole # : PE72-I Nombre de pages : 6

Version : 1 Date : 10 février 2016

Auteur(s): Allison Meyssonnier

Lucie Jean

Valérie Bécaert

Approuvé par : Signatures : Date :

Titre : β-glucosidase dans un sol.

Mots clés : Glucosidase, enzymes, activité enzymatique, contamination

métallique

245

1. OBJECTIF

Ce protocole a pour objectif de mesurer le potentiel d’activité enzymatique dans un sol. Les

enzymes testés sont des représentants des cycles du carbone, azote, soufre et phosphore. Puisqu’il

est très difficile d’extraire et de mesurer les enzymes contenus dans les sols, le principe sur lequel

repose chacun des protocoles proposés est la mesure du potentiel d’activité enzymatique. C’est à

dire, que l’on va introduire dans un échantillon de sol un substrat ciblé par l’enzyme testé et l’on

mesure après une période d’incubation les produits de la transformation enzymatique. La β-

glucosidase est l'enzyme limitant la dégradation microbienne de la cellulose au glucose. La β-

glucosidase a été détectée chez les microorganismes, les cellules de plantes et d'animaux. Elle est

inactivée à des températures dépassant 70oC et démontre une corrélation importante avec le

contenu en matière organique.

Ce protocole permet l’analyse de l’activité enzymatique sans tampon, correspondant à l’activité

enzymatique ‘réelle’ du sol.

2. β-GLUCOSIDASE

2.1 Matériel

5 erlenmeyers de 50 ml (avec bouchon de caoutchouc) par sol + 6 erlenmeyers de 50 ml

pour la calibration ;

2 béchers de 250 ml ;

1 bécher de 100 ml ;

1 bécher de 25 ml ;

2 ballons de 1 L ;

1 ballon de 500 ml ;

2 ballons de 50 ml ;

2 bouteilles ambrées ;

1 cylindre gradué de 250 ml ;

5 tubes eppendorf de 2 ml par sol ;

Pipettes P200, P1000, P5000 et multicanaux (model 8800, Nichityo) ;

Embouts à pipettes ;

Spatules ;

246

Dispensettes de 2 ml, 10 ml et de 100 ml et dispensette automatique ;

Spatules ;

Incubateur tempéré à 37°C ;

Centrifugeuse sur table (Sigma 1-16 157955) ;

Balance ± 0.0001 (Mettler Toledo) ;

Microplaque à fond plat transparente (Costar 96wells, Fisher) ;

Lecteur microplaque (GENios, Tecan) ;

Disodium p-nitrophenyl-β-D glucopiranoside (Sigma, N7006) ;

ATTENTION : Entreposer à -20oC dans un dessiccateur. Manipuler avec ventilation et

sensible à la lumière

NaOH (Fisher S318-3) ;

Chlorure de calcium dihydrate (Fisher C79-500, FW 147.01) ;

p-nitrophenol (Sigma 104-8, 63802-100, FW 139.11) ;

Eau déionisée (eau nanopure, résistivité ≥ 18.2 MΩ.cm).

247

2.2 Préparation des solutions

2.2.1 Solution de disodium p-nitrophényl (25 mM), pour 30 échantillons

1. Peser 0,47 g de disodium p-nitrophényl-β-D glucopiranoside dans un bécher de 25 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 50 ml contenant environ 30 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

4. Préparer la solution le jour même et mettre à l’abri de la lumière.

Attention! Le substrat est sensible à la lumière et à la température.

2.2.2 Solution de Chlorure de calcium CaCl2 (0,5 M) (même que pour arylsulfatase)

1. Peser 36,74 g de CaCl2 dihydrate dans un bécher de 250 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 500 ml contenant environ 300 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

Attention! Du chlore se libère lors de l’ajout de l’eau, faire la solution sous la hotte.

2.2.3 Solution d’hydroxyde de sodium (0.5 M) (même que pour arylsulfatase)

1. Peser 20 g de NaOH dans un bécher de 250 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 1 L contenant environ 700 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

2.2.4 Solution standard stock ( 1 mg p-nitrophenol x ml-1) (même que pour arylsulfatase)

1. Peser 1 g de p-nitrophenol dans un bécher de 25 ml.

2. Dissoudre dans un ballon de 1 L contenant environ 700 ml d’eau déionisée.

3. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

4. Garder cette solution à 4ºC dans un contenant ambré.

2.2.5 Standard de travail pour une courbe de calibration (20 µg p-nitrophenol⋅x ml-1) :

1. Pipeter 1 ml avec une micropipette P1000 de la solution stock dans un ballon de 50 ml.

2. Ajuster le volume au trait de jauge avec de l’eau déionisée.

3. Transvider dans un bécher 50 ml.

4. Préparer la solution le jour même.

248

2.2.6 Standards de calibration

1. Pipeter avec la pipette P5000 (blanc) 0, 1, 2, 3, 4, 5 ml du standard de travail dans des

erlenmeyer de 50 ml.

2. Ajuster les volumes à 5 ml avec de l’eau déionisée en pipetant dans le même ordre qu’au

point précédent 5, 4, 3, 2, 1 et 0 ml avec une P5000 ou une pipette automatique.

3. Les standards de calibration contiennent 0, 20, 40, 60, 80 et 100 µg de p-nitrophenol.

4. Avec une dispensette de 2 ml, ajouter 1 ml de CaCl2 (0,5 M). Attention il est très important

d’ajouter le CaCl2 avant le NaOH.

5. Avec une dispensette de 10 ml, ajouter 4 ml de NaOH (0,5 M).

6. Transférer le surnageant dans des tubes Eppendorf de 2 ml et centrifuger à 15 000 rpm

pendant 5 min.

7. Les standards de calibration contiennent 0, 20, 40, 60, 80 et 100 µg de p-nitrophenol.

2.3 Méthode

Les mesures sont effectuées en 4 étapes : 1) Préparer le sol avec le substrat et l’incuber, 2)

Ajouter les réactifs, 3) Centrifuger le surnageant, 4) Préparer la courbe de calibration et mesurer

l’absorbance photométrique des échantillons centrifugés.

2.3.1 Préparation du sol et incubation avec substrat

1. Peser 1,00 g ± 0,05 de sol humide dans 5 erlenmeyers de 50 ml.

2. Avec une dispensette de 10 ml, ajouter 4 ml d’eau déionisée dans les 5 erlenmeyers.

3. Avec une P1000, ajouter 1 ml de la solution de substrat dans 3 des 5 erlenmeyers seulement

(échantillons). Les 2 autres erlenmeyers sans substrat serviront de contrôle.

4. Agiter brièvement, sceller et incuber pour 1 h à 37ºC.

2.3.2 Préparation du filtrat après incubation

1. Traiter les échantillons et les standards de calibration de la même manière : avec une

dispensette de 2 ml, ajouter 1 ml de CaCl2 (0,5 M) dans les 5 erlenmeyers. Attention il est

très important d’ajouter le CaCl2 avant le NaOH.

2. Avec une dispensette de 10 ml, ajouter 4 ml de NaOH (0,5 M) dans les 5 erlenmeyers.

3. Avec une P1000, ajouter 1 ml de solution de substrat dans les contrôles.

249

4. À l’aide d’une dispensette de 100 ml, ajouter 20 ml d’eau distillée dans les 5 erlenmeyers

5. Agiter les erlenmeyers.

6. Transférer le surnageant dans des tubes Eppendorf de 2 ml.

7. Centrifuger à 15 000 rpm pendant 5 min.

2.3.3 Analyses photométriques des échantillons et des standards de calibration

1. Pipeter 250 µL des échantillons et des standards centrifugés avec une pipette P1000 dans les

puits de la microplaque. Attention à éviter la formation de bulles à tout prix !

2. Mesurer l’extinction à 420 nm avec un spectrophotomètre contre le blanc.

2.4 Calculs

Calculer les concentrations de p-nitrophenol (pNP) à partir des courbes de calibration.

(S-C)⋅D. 100 = µg pNP ⋅g-1 sol sec ⋅h-1

% sol sec

S valeur moyenne des échantillons (µg pNP/ ml)

C valeur moyenne des contrôles (µg pNP/ ml)

D Facteur de dilution D=3 car on a ajouté 20 ml d’eau dans la solution d’incubation

(10 ml)

100 / % ms facteur pour matière sèche.

3. NOTES

- Le substrat est sensible à la chaleur et à la lumière, les flacons doivent être recouverts d’aluminium.

- Mesurer l’extinction dans les 6 premières heures.

- La courbe de calibration est linéaire jusqu’à 120 µg p-nitrophenol

- L’ajustement du pH devrait se faire à 37oC puisque c’est la To d’incubation

- Utiliser plus ou moins de sol si l’activité sort de la courbe de calibration, ou est trop faible.

250

- Le CaCl2 est ajouté afin d’éviter l’interférence que créent les substances humiques qui se

dissolvent. Il prévient aussi la dispersion de l’argile. Un précipité blanchâtre se forme lorsque

le NaOH est ajouté au CaCl2.

4. REFERENCES

Eivazi, F.Tabatabai, M.A., 1990. Factors affecting glucosidase and galactosidase activities in

soils. Soil Biology and Biochemistry 22, 891-897.

Strobl, W.Traunmüller, M. , 1996b. B-glucosidase activity. In: Schinner, F.et al. (Eds.). Methods

in soil biology. Berlin, Springer, pp. 198-200.

251

ANNEXE B1 – PROFIL DE CONCENTRATIONS MÉTALLIQUES BACKGROUND DES SOLS

Sol Na Mg Al K Ca Mn Co Ni Cu Zn Rb Sr Ag Cd Ba Pb Cr Fe As Se

ID ppm

7 330 10129 24882 4392 6207 689 18 44 32 95 32 55 0,06 0,25 165 11 78 >10000 3,10 0,12 11 46 1500 4801 355 1537 96 3 6 8 32 4 10 0,02 0,11 14 10 13 9604 1,72 0,13 A 65 2117 6209 520 2061 224 5 8 14 31 5 10 0,07 0,09 47 7 12 >10000 1,29 0,16 6 153 6383 14462 1445 11109 490 9 21 21 73 11 96 0,03 0,23 101 18 25 >10000 6,36 0,25

10 56 692 19143 161 739 99 2 5 6 37 1 6 0,03 0,13 15 6 8 10729 0,91 0,46 15 77 2992 8895 892 3628 246 5 13 17 70 7 23 0,05 0,29 83 12 25 >10000 2,31 0,36 4 374 11205 30784 4612 5572 843 24 53 40 108 32 48 0,06 0,27 195 11 93 >10000 2,88 0,24 9 181 3732 6293 1395 6331 152 5 9 10 51 8 24 0,01 0,12 48 8 11 >10000 1,90 0,10

14 350 8241 10196 2215 56154 495 12 40 53 358 14 278 0,41 0,81 191 211 41 >10000 9,46 0,55 3 269 7664 21079 4461 6121 612 15 39 43 145 31 48 0,14 0,42 271 20 55 >10000 5,43 0,39 8 291 5307 14869 1984 12278 464 10 20 24 173 18 56 0,05 0,33 245 275 27 >10000 6,55 0,26

24 29 939 4953 331 786 204 2 4 5 30 6 8 0,07 0,08 32 13 10 8399 1,66 0,35 5 188 9580 6020 1362 113487 454 8 19 19 58 9 526 0,03 0,20 79 11 12 >10000 6,44 0,15

22 127 5523 9184 1696 72029 793 10 22 25 55 12 212 0,02 0,21 56 9 18 >10000 6,54 0,15 B 0 1141 2604 381 732 174 5 4 5 17 3 4 0,01 0,04 36 1 6 9756 0,37 0,06

1M 64 3039 9183 808 4835 345 6 12 10 47 7 37 0,02 0,20 52 8 15 >10000 3,06 0,19 2M 26 1685 5015 822 2587 107 3 7 9 46 6 16 0,01 0,16 29 9 9 8025 2,08 0,11 3M 10 1736 6285 1018 8130 1274 6 11 17 174 15 144 0,05 0,66 216 87 8 >10000 19,41 0,33

252

ANNEXE B2 – PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES DES PAIRES DE SOL

ID

pH COT CEC Capacité tampon COD Granulométrie (%) Cu Total Cu soluble

g C /kg sol sec

meq/100g de résidu sec

cmol H+/kg sol sec par unité pH

mg C\L Sables Limons Argiles ppm ppm

7T 7,47 ± 0,04 16,4 44,48 ± 2,37 6,41 ± 0,31 0,09 ± 0,01 38,6 23,8 37,6

19 ± 4 0,03 ± 0

7C 7,28 ± 0,05 19,5 43,54 ± 0,57 7,28 ± 0,07 0,13 ± 0,01 720 ± 10 0,06 ± 0,06

t-test ** NA NS ** * NA *** NS

11T 4,74 ± 0,03 32,9 29,41 ± 1,02 5,44 ± 0,24 0,14 ± 0,02 90,7 4,3 5

0 ± 0 0,03 ± 0

11C 4,32 ± 0,03 36,7 30,15 ± 0,17 6,53 ± 0,08 0,18 ± 0,01 666 ± 54 8,41 ± 0,13

t-test *** NA NS ** * NA *** ***

AT 5,01 ± 0,01 15,6 24,02 ± 0,23 4,29 ± 0,41 0,07 ± 0,02 79,9 14,8 5,3

2 ± 2 0,03 ± 0

AC 4,67 ± 0,04 14,9 22,97 ± 0,4 5,76 ± 0,19 0,05 ± 0 665 ± 21 11,16 ± 1,78

t-test *** NA * ** NS NA *** ***

6T 7,58 ± 0,04 16,2 17,49 ± 1,61 10 ± 0,29 0,04 ± 0 47,6 29,4 23

23 ± 1 0,03 ± 0

6C 7,62 ± 0,06 14,9 18,3 ± 3,89 8,39 ± 0,32 0,06 ± 0 686 ± 15 0,17 ± 0

t-test NS NA NS ** *** NA *** ***

10T 4,99 ± 0,04 24,8 50,84 ± 3,22 6,97 ± 0,28 0,03 ± 0 87,4 9,3 3,3

5 ± 2 0,03 ± 0

10C 4,6 ± 0,04 24,7 47,89 ± 1,16 9,47 ± 0,51 0,04 ± 0 716 ± 62 6,06 ± 0,07

t-test *** NA NS ** *** NA *** ***

15T 5,88 ± 0,02 25,4 25,7 ± 0,74 4,54 ± 0,03 0,07 ± 0,02 78,8 10,2 11

17 ± 1 0,06 ± 0,04

15C 5,42 ± 0,09 23,3 25,87 ± 1,02 4,71 ± 0,04 0,12 ± 0,01 772 ± 4 1,52 ± 0,04

t-test *** NA NS ** * NA *** ***

4T 5,98 ± 0,03 21,8 33,58 ± 4,62 5,56 ± 0,1 0,14 ± 0,02 43,2 14,7 42,1

41 ± 1 0,03 ± 0

4C 5,69 ± 0,07 23,6 31,1 ± 6,4 4,76 ± 0,06 0,18 ± 0,03 655 ± 4 0,88 ± 0,01

t-test ** NA NS *** NS NA *** ***

253

9T 7,43 ± 0,05 16,8 20,39 ± 7,2 6,74 ± 0,22 0,06 ± 0,01 74,5 13,5 12

9 ± 1 0,02 ± 0

9C 7,57 ± 0,02 17,2 21,07 ± 6,03 5,52 ± 0,05 0,10 ± 0 624 ± 35 0,65 ± 0

t-test * NA NS *** *** NA *** ***

14T 7,71 ± 0,05 54,9 36,42 ± 1,32 14,24 ± 0,07 0,2 ± 0 59,2 28 12,7

59 ± 4 0,06 ± 0

14C 7,87 ± 0,02 51,2 35,56 ± 0,76 12,33 ± 0,21 0,24 ± 0,01 698 ± 10 1,09 ± 0,03

t-test ** NA NS *** ** NA *** ***

3T 7,03 ± 0,02 27 25,61 ± 0,96 4,84 ± 0,42 0,07 ± 0,01 51,1 20,4 28,45

49 ± 1 0 ± 0

3C 6,66 ± 0,09 30 28,73 ± 0,41 4,82 ± 0,07 0,14 ± 0,01 945 ± 58 0,25 ± 0,12

t-test ** NA ** NS *** NA *** *

8T 7,17 ± 0,06 43,6 33,73 ± 3,72 8,03 ± 0,26 0,14 ± 0,03 52,3 25,9 21,8

24 ± 1 0,02 ± 0,01

8C 7,1 ± 0,1 37,6 30,89 ± 4,39 7,19 ± 0,09 0,21 ± 0,03 852 ± 38 0,4 ± 0,05

t-test NS NA NS ** * NA *** ***

24T 4,74 ± 0,04 26 21,74 ± 0,37 4,56 ± 0,09 0,07 ± 0 88,4 7,1 4,5

4 ± 1 0,02 ± 0,01

24C 4,22 ± 0,01 24,3 22,24 ± 0,99 6,15 ± 0,13 0,09 ± 0 766 ± 40 37,78 ± 2,99

t-test *** NA NS *** *** NA *** ***

5T 7,67 ± 0,06 11,3 12,68 ± 0,5 10,75 ± 0,32 0,01 ± 0 44,9 34,4 20,6

21 ± 2 0 ± 0

5C 7,59 ± 0,01 9,8 12,38 ± 1,05 9,32 ± 0,05 0,03 ± 0 868 ± 34 0,2 ± 0,01

t-test NS NA NS ** ** NA *** ***

22T 7,66 ± 0,01 17,3 24,77 ± 1,76 13 ± 0,49 0,06 ± 0,01 60,5 24 15,4

18 ± 1 0 ± 0

22C 7,81 ± 0,07 18,8 24,09 ± 0,69 10,61 ± 0,28 0,09 ± 0,01 850 ± 6 0,33 ± 0,02

t-test * NA NS ** * NA *** ***

BT 4,72 ± 0,03 0,9 4,1 ± 0,12 3 ± 0,06 0,01 ± 0 96,3 1,7 2

3 ± 0 0 ± 0

BC 4,18 ± 0,01 0,5 4,16 ± 0,15 4,14 ± 0,08 0,02 ± 0 438 ± 36 221,9 ± 1,9

t-test *** NA NS *** *** NA *** ***

1MT 7,5 ± 0,04 15,9 20,97 ± 0,66 4,23 ± 0,04 0,06 ± 0,01 70 20,4 9,6

9 ± 1 0,06 ± 0,01

1MC 7,45 ± 0,06 16,1 21,4 ± 1,06 4,37 ± 0,06 0,07 ± 0,01 340 ± 4 0,16 ± 0,03

t-test NS NA NS * NS NA *** **

254

2MT 6,21 ± 0,05 12,1 13,32 ± 0,6 2,96 ± 0,06 0,04 ± 0 79,9 11,1 9

6 ± 1 0,02 ± 0,01

2MC 6,04 ± 0,07 12,3 14,08 ± 1,1 3,02 ± 0,03 0,08 ± 0,01 302 ± 5 0,68 ± 0,02

t-test * NA NS NS *** NA *** ***

3MT 6,09 ± 0,1 14,3 22,19 ± 0,4 3,89 ± 0,02 0,11 ± 0,01 82,8 10,5 6,7

8 ± 1 0 ± 0

3MC 5,99 ± 0,07 11,6 22,6 ± 1,43 3,92 ± 0,04 0,12 ± 0,02 310 ± 32 0,28 ± 0,04

t-test NS NA NS NS NS NA *** ***

Niveau de significativité tiré des test de Student appariés : *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 ; NS = non significatif ; NA = non-applicable.

255

ANNEXE B3 – RAPPORT DE CONNEXION DE LETTRES SUITE AU

TEST POST HOC DE TUKEY-HSD POUR LA CEC

Sol Groupes Moyenne

10 A 47,893333

7 A B 43,543333

14 B C 35,563333

4 C D 31,096667

8 C D 30,886667

11 C D E 30,153333

3 C D E F 28,733333

15 D E F G 25,873333

22 D E F G 24,093333

A D E F G 22,970000

24 E F G 22,236667

9 F G 21,066667

6 G H 18,300000

5 H I 12,380000

B I 4,153333

256

ANNEXE B4 – COEFFICIENT DE CORRÉLATION DE SPEARMAN ENTRE LES PROPRIÉTÉS

PHYSICO-CHIMIQUES DES 15 DE SOLS TÉMOINS ET LES ACTIVITÉS ENZYMATIQUES

Cu sol

Cu Tot Inv Uréase Prot Aryl Phos β-Glu Sables Lim. Argiles pH CEC CT COT COD

Cu sol 1 0,081 0,229 0,228 -0,052 0,410** 0,508** 0,491** -0,045 -0,005 0,016 -0,017 0,552*** 0,078 0,327* 0,501**

Cu Tot - 1 0,400** 0,575*** 0,590*** 0,198 -0,147 0,372* -0,781*** 0,707*** 0,782*** 0,682*** 0,235 0,516*** 0,308* 0,338*

Inv - - 1 0,662*** 0,431** 0,790*** 0,661*** 0,584*** -0,099 0,065 0,200 -0,089 0,541** 0,031 0,801*** 0,634***

Uréase - - - 1 0,460** 0,576*** 0,375* 0,406** -0,329* 0,254 0,401** 0,183 0,355* 0,205 0,611*** 0,522**

Prot - - - - 1 0,185 0,021 0,318* -0,462** 0,410** 0,516** 0,489** 0,181 0,407** 0,404** 0,542**

Aryl - - - - - 1 0,821*** 0,580*** -0,132 -0,149 0,270 -0,300* 0,677*** -0,2 0,603*** 0,597***

Phos - - - - - - 1 0,407** 0,191 -0,310* -0,109 -0,484** 0,490** -0,248 0,503** 0,43**

β-Glu - - - - - - - 1 -0,425** 0,414** 0,463** 0,204 0,509** 0,105 0,342* 0,683***

Sables - - - - - - - - 1 -0,775*** -0,954*** -0,712*** -0,206 -0,48*** 0,082 -0,212

Lim. - - - - - - - - - 1 0,689*** 0,884*** 0,005 0,743*** -0,050 0,088

Argiles - - - - - - - - - - 1 0,625*** 0,219 0,377* 0,043 0,346*

pH - - - - - - - - - - - 1 0,036 0,827*** -0,038 0,066

CEC - - - - - - - - - - - - 1 0,22 0,573*** 0,574***

CT - - - - - - - - - - - - - 1 -0,198 -0,031

COT - - - - - - - - - - - - - - 1 0,703***

COD - - - - - - - - - - - - - - - 1

Niveau de significativité: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 ; Cu sol = Cu soluble ; Cu Tot = Cu total ; Inv = Invertase; Prot = Protéase ; Aryl =

Arylsulfatase ; Phos = Phosphatase ; β-Glu = β-Glucosidase ; Lim. = Limons ; CEC = Capacité d’échange cationique ; CT = Capacité tampon ;

COT = Carbone organique total ; COD Carbone organique dissout.

257

ANNEXE B5 – ACTIVITÉ ENZYMATIQUES DES PAIRES DE SOLS

Cu Total Cu soluble Invertase Uréase Protéase Arylsulfatase Phosphatase β-Glucosidase

ID ppm ppm [GE] (μg/g

sol sec/2h)

[AMM]

(μg/g sol

sec/2h)

[tyr] (μg/g sol

sec/2h)

[PNP] (μg/g sol

sec/2h)

[PNP] (μg/g sol

sec/2h)

[PNP] (μg/g sol

sec/2h)

7T 19 ± 4 0,03 ± 0 576 ± 100 4 ± 11 130 ± 44 56 ± 9 213 ± 53 474 ± 13

7C 720 ± 10 0,06 ± 0,06 266 ± 75 11 ± 6 250 ± 47 13 ± 3 168 ± 50 193 ± 28

t-test *** NS ** NS * ** NS ***

11T 0 ± 0 0,03 ± 0 1450 ± 155 13 ± 7 147 ± 89 137 ± 24 1659 ± 124 342 ± 14

11C 666 ± 54 8,41 ± 0,13 2232 ± 275 0 ± 11 15 ± 45 64 ± 3 849 ± 26 647 ± 62

t-test *** *** ** NS NS ** *** **

AT 2 ± 2 0,03 ± 0 1069 ± 220 5 ± 7 46 ± 81 89 ± 15 845 ± 47 1308 ± 84

AC 665 ± 21 11,16 ± 1,78 660 ± 309 0 ± 4 0 ± 76 41 ± 18 615 ± 6 245 ± 9

t-test *** *** NS NS NS * *** ***

6T 23 ± 1 0,03 ± 0 245 ± 120 12 ± 2 15 ± 106 28 ± 7 302 ± 42 182 ± 26

6C 686 ± 15 0,17 ± 0 106 ± 47 1 ± 3 282 ± 63 10 ± 4 206 ± 16 120 ± 8

t-test *** *** NS *** ** ** * *

10T 5 ± 2 0,03 ± 0 1430 ± 212 12 ± 1 0 ± 213 130 ± 14 1427 ± 73 159 ± 20

10C 716 ± 62 6,06 ± 0,07 1277 ± 118 2 ± 3 0 ± 75 80 ± 11 1268 ± 63 160 ± 15

t-test *** *** NS *** NS ** * NS

15T 17 ± 1 0,06 ± 0,04 1005 ± 87 14 ± 8 163 ± 38 96 ± 9 775 ± 58 239 ± 11

15C 772 ± 4 1,52 ± 0,04 625 ± 51 2 ± 1 33 ± 37 57 ± 10 302 ± 13 219 ± 18

t-test *** *** ** * * ** *** *

258

4T 41 ± 1 0,03 ± 0 1954 ± 138 27 ± 10 768 ± 41 260 ± 13 1434 ± 114 426 ± 41

4C 655 ± 4 0,88 ± 0,01 521 ± 261 15 ± 4 128 ± 16 114 ± 4 586 ± 58 365 ± 28

t-test *** *** ** NS *** *** *** NS

9T 9 ± 1 0,02 ± 0 67 ± 104 13 ± 6 151 ± 34 23 ± 2 152 ± 24 98 ± 20

9C 624 ± 35 0,65 ± 0 109 ± 79 12 ± 27 283 ± 67 3 ± 1 69 ± 13 36 ± 6

t-test *** *** NS NS * *** *** **

14T 59 ± 4 0,06 ± 0 2053 ± 168 42 ± 36 555 ± 73 48 ± 7 462 ± 14 537 ± 42

14C 698 ± 10 1,09 ± 0,03 1151 ± 192 5 ± 8 442 ± 76 6 ± 3 184 ± 19 218 ± 56

t-test *** *** ** NS * *** *** **

3T 49 ± 1 0 ± 0 2591 ± 416 32 ± 5 203 ± 72 155 ± 9 591 ± 111 380 ± 66

3C 945 ± 58 0,25 ± 0,12 2763 ± 407 11 ± 6 198 ± 83 67 ± 5 80 ± 73 385 ± 42

t-test *** * NS ** NS *** ** NS

8T 24 ± 1 0,02 ± 0,01 2633 ± 514 85 ± 5 376 ± 47 137 ± 18 697 ± 13 477 ± 60

8C 852 ± 38 0,4 ± 0,05 1568 ± 206 6 ± 9 271 ± 168 25 ± 3 298 ± 55 330 ± 77

t-test *** *** * *** NS *** *** NS

24T 4 ± 1 0,02 ± 0,01 1318 ± 171 7 ± 8 145 ± 32 41 ± 6 699 ± 28 134 ± 6

24C 766 ± 40 37,78 ± 2,99 1328 ± 92 0 ± 5 199 ± 63 42 ± 10 358 ± 22 599 ± 58

t-test *** *** NS NS NS NS *** ***

5T 21 ± 2 0 ± 0 649 ± 60 12 ± 2 374 ± 232 10 ± 3 210 ± 16 212 ± 19

5C 868 ± 34 0,2 ± 0,01 695 ± 104 0 ± 7 173 ± 146 0 ± 1 119 ± 8 73 ± 20

t-test *** *** NS *** NS ** *** ***

22T 18 ± 1 0 ± 0 663 ± 51 1 ± 11 504 ± 208 24 ± 1 197 ± 20 161 ± 10

22C 850 ± 6 0,33 ± 0,02 78 ± 28 0 ± 8 366 ± 85 6 ± 1 102 ± 5 85 ± 14

t-test *** *** *** NS NS *** ** **

BT 3 ± 0 0 ± 0 1 ± 62 0 ± 2 17 ± 23 0 ± 1 29 ± 4 0 ± 3

BC 438 ± 36 221,9 ± 1,9 98 ± 108 0 ± 1 0 ± 16 0 ± 2 27 ± 9 0 ± 1

t-test *** *** NS NS NS NS NS NS

259

1MT 9 ± 1 0,06 ± 0,01 571 ± 38 13 ± 1 189 ± 33 24 ± 5 238 ± 40 153 ± 28

1MC 340 ± 4 0,16 ± 0,03 457 ± 100 4 ± 2 199 ± 74 12 ± 3 152 ± 17 126 ± 28

t-test *** ** NS ** NS ** * NS

2MT 6 ± 1 0,02 ± 0,01 1334 ± 84 7 ± 3 190 ± 15 26 ± 2 437 ± 29 155 ± 21

2MC 302 ± 5 0,68 ± 0,02 1117 ± 115 0 ± 1 250 ± 32 210 ± 15 160 ± 12 103 ± 6

t-test *** *** * ** * *** *** *

3MT 8 ± 1 0 ± 0 716 ± 36 0 ± 5 61 ± 81 6 ± 6 276 ± 65 77 ± 10

3MC 310 ± 32 0,28 ± 0,04 672 ± 87 8 ± 2 153 ± 68 7 ± 5 213 ± 35 84 ± 6

t-test *** *** NS ** NS NS NS NS

Niveau de significativité tiré des test de Student appariés : *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 ; NS = non significatif ; NA = non-applicable.

260

ANNEXE B6 – COEFFICIENT DE CORRÉLATION DE SPEARMAN ENTRE LES PROPRIÉTÉS

PHYSICO-CHIMIQUES DES SOLS DE VIGNOBLE TÉMOINS ET LES ACTIVITÉS ENZYMATIQUES

Cu sol Cu Tot Inv Uréase Prot Aryl Phos β-Glu Sables Lim. Argiles pH CEC CT COT COD

Cu sol 1 0,368 -0,580 0,896** 0,483 0,633 -0,158 0,615 -0,917*** 0,917*** 0,917*** 0,949*** -0,237 0,501 0,583 -0,343

Cu Tot - 1 -0,783* 0,238 -0,315 -0,221 -0,775* -0,06 -0,215 0,215 0,215 0,307 0,587 0,775* 0,835** 0,630

Inv - - 1 -0,383 0,200 0,033 0,667* -0,017 0,474 -0,474 -0,474 -0,533 -0,467 -0,95*** -0,949*** -0,483

Uréase - - - 1 0,717* 0,533 -0,233 0,583 -0,949*** 0,949*** 0,949*** 0,883** -0,467 0,417 0,474 -0,500

Prot - - - - 1 0,417 0,100 0,533 -0,685* 0,685* 0,685* 0,417 -0,750* -0,15 -0,053 -0,783*

Aryl - - - - - 1 0,583 0,883** -0,633 0,633 0,633 0,683* -0,633 -0,117 -0,158 -0,667*

Phos - - - - - - 1 0,367 0,158 -0,158 -0,158 -0,067 -0,450 -0,733* -0,791* -0,533

β-Glu - - - - - - - 1 -0,685* 0,685* 0,685* 0,600 -0,617 -0,017 -0,053 -0,567

Sables - - - - - - - - 1 -1*** -1*** -0,896** 0,474 -0,474 -0,500 0,474

Lim. - - - - - - - - - 1 1*** 0,896** -0,474 0,474 0,500 -0,474

Argiles - - - - - - - - - - 1 0,896** -0,474 0,474 0,500 -0,474

pH - - - - - - - - - - - 1 -0,267 0,517 0,527 -0,333

CEC - - - - - - - - - - - - 1 0,433 0,474 0,933***

CT - - - - - - - - - - - - - 1 0,949*** 0,517

COT - - - - - - - - - - - - - - 1 0,474

COD - - - - - - - - - - - - - - - 1

Niveau de significativité: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 ; Cu sol = Cu soluble ; Cu Tot = Cu total ; Inv = Invertase; Prot = Protéase ; Aryl =

Arylsulfatase ; Phos = Phosphatase ; β-Glu = β-Glucosidase ; Lim. = Limons ; CEC = Capacité d’échange cationique ; CT = Capacité tampon ;

COT = Carbone organique total ; COD Carbone organique dissout.