tropisme du hiv physiopathologie & caractérisation jacques izopet

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Tropisme du HIV Physiopathologie & Caractérisation Jacques Izopet Laboratoire de Virologie & INSERM U563 CHU de Toulouse SFLS Paris 10/12/2010

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Tropisme du HIV Physiopathologie & Caractérisation Jacques Izopet Laboratoire de Virologie & INSERM U563 CHU de Toulouse. SFLS Paris 10/12/2010. Entrée du HIV-1 : interaction entre gp120/CD4/corécepteur. HIV-1. CCR5 CXCR4. CD4. Cell membrane. Virus entry. Récepteur = CD4 - PowerPoint PPT Presentation

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Page 1: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Tropisme du HIV Physiopathologie & Caractérisation

Jacques IzopetLaboratoire de Virologie & INSERM U563

CHU de Toulouse

SFLSParis 10/12/2010

Page 2: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Entrée du HIV-1 : interaction entre gp120/CD4/corécepteur

Récepteur = CD4

Corécepteur = récepteur de chimiokine

HIV-1

Virus entry

Cell membrane

CCR5CXCR4

CD4

Page 3: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Structure cristallographique du complexe gp120/CD4

Pantophlet Annu Rev Immunol 06

NC V4

Outer domain

Innerdomain

Bridging

sheet

V1/V2stem

V3stem

CD4

CoR

20-212-3

Page 4: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Structure cristallographique de la boucle V3 de gp120

Sander PLoS Comput Biol 07

V3 loop

gp 120

Page 5: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Récepteurs de chimiokines & ligands

CCL3 (MIP-1)CCL4 (MIP-1)CCL5 (RANTES)

CCR5

CXCL12 (SDF1)

CXCR4

Page 6: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Expression de CCR5 & CXCR4

Lymphocytes T CD4+

CCR5 (%)

CXCR4 (%)

Naïves CD45 RA+ CCR7+

< 0,1

98

Mémoires centrales

CD45 RO+ CCR7+

2

22

Mémoires effectrices CD45 RO+ CCR7-

52

11

Monocytes, macrophages, cellules dendritiques CCR5 (%) > CXCR4 (%)

Sallusto Nature 99 ; Lee PNAS 99

Page 7: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

CXCR4CCR5

Page 8: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Distribution en quasiespèces Populatio

nvirale

R5 X4

Pression sélectiveRéponse immune/Environnement

cellulaire/Drogues

Page 9: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

anticorps HIV

CD4

ARN HIV

Primoinfection

Infectionsymptomatiqu

e

Infectionasymptomatiqu

e

Histoire naturelle

X4R5 R5X4

Page 10: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Pathogénicité accrue des virus X4

Page 11: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

SHIVSF33A (X4)

SHIVSF162P3 (R5)

Pathogénicité accrue des virus X4

Page 12: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Primoinfection Madrid cohort (n = 67) Spanish hospitals (n = 296) Primo sous-type B (n = 390)

Infection chronique Homer cohorts (n = 979) Chelsea & Westminster cohort (n = 402) Merit (n = 1428)

R5

878384

828185

D/M

131716

181915

X4

---

< 1< 1< 1

Virus (%)

Poveda J Med Virol 07 ; de Mendoza JAC 07 ; Chaix JAC 09 ;

Brumme JID 05 ; Moyle JID 05 ; Coakley IWTHE 06

Prévalence des virus D/M & X4Patients non traités

Page 13: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Influence du tropisme du HIV sur la progression de la

maladie123 patients en primoinfection

Prévalence des virus D/M & X4 : 6,4 %

Lymphocytes TCD4 Initiation de traitement

Raymond AIDS 10

Page 14: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Marqueur de progression de la maladie sans

traitement

Koot Ann Intern Med 93;118:681-688

Kaplan-Meier plot of the cumulative progression to AIDS of 188 untreated men

Page 15: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

(n=271)(n=47)

(n=197)(n=44)

(n=189)(n=46)

(n=319)(n=45)

134 135-257 258-365 >365

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100 Non traités

Traités

%

T CD4+ lymphocytes

p<.001

p<.001

p=.001p=.005

Prévalence des virus D/M & X4

Hunt JID 06

Page 16: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Marqueur de progression de la maladie sous HAART

Weiser AIDS 08

R5X4/X4

R5

Page 17: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

0 %

50 %

100 %

Pts avec virus R5

Pts avec virus X4

Jour 0 2,5 ans 5 ans

% patients

Emergence de virus X4 après 5 ans de traitement efficace

9

23

14

9

9

12

11

9

Izopet Virology 02 ; Delobel J AIDS 05

Page 18: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Compartimentation des variants HIV

Delobel AIDS 05

Page 19: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet
Page 20: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Fréquence importante de virus X4 chez les mauvais répondeurs

immunologiques

Delobel J Virol 06

Page 21: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Evolution génétique du virus

Mavigner PLoS One 09

6/12 pts sous HAART

Page 22: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

2 catégories de tests de tropisme : tests phénotypiques tests génotypiques

Objectifs : sélectionner le traitement le plus

approprié documenter un échec sous

antagoniste de CCR5

Outils virologiques

Page 23: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Cellules exprimant uniquement CXCR4Identification de virus inducteurs de syncytiums SI (X4 et D/M)

Tests phénotypiquesCulture sur la lignée MT2

LimitesNécessité de lymphocytes viablesLourdeur technique

Schuitemaker J Virol 91

Page 24: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Amplification par PCR du gène env à partir de l’ARN HIV plasmatique

Production de virus recombinants compétent ou non pour la réplication

Infection de lignées cellulaires indicatrices

CD4+ CCR5+

CD4+ CXCR4+

Tests phénotypiquesRVA

Page 25: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

TrofileTM – Monogram Biosciences

++ ++

HIV Env gp160 expression vector

2500 bpHIV genomic-luc

vector

293 T Transfection

Infection

Replication-defectiverecombinant virus

U87CD4-CXCR4

+/- anti-CXCR4

U87CD4-CCR5

+/- anti-CCR5

Luminescence

measure

+ +

+ +

R5 X4 D/M

Whitcomb AAC 07

Page 26: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

pNL43-env-Luc vector

Homologous recombination

Nhel linearization

Transfection293T cells

Recombinants virus

Infection of indicator cells

Luminescence

+/- anti-CCR5 +/- anti-CXCR4

TTT - Toulouse Tropism Test

COFRAC ISO 15189 Raymond JCV 10

Page 27: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Mean Luciferase

activity (log RLU)

0

1

2

3

4

5

6

7

8 U87 CD4+ CXCR4+ cells

No antagonistAnti-CXCR4

mock 0:100 0.5:99.5 1:99 5:95 10:90 15:85 20:80X4:R5 ratio Sensibilité pour X4 ou D/M :

0,5 %

Sensibilité du TTT pour la détection de virus X4 ou D/M

Page 28: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

98.2163166>10000

98 50 511000-10000

100 5 5500-1000

100 4 440-500

% SuccessNo. of amplifications

No. of samples

HIV-1 RNA load (copies/mL)

Amplification env des sous-type B selon la charge virale plasmatique

Page 29: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet
Page 30: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

100 9 9Other CRF

94.1112119CRF02

86.7 13 15CRF01

86.7 13 15G

100 10 10F

100 15 15D

100 56 56C

98.5260264B

96.6 28 29A

% SuccessNo. of phenotypes

No. of amplifications

HIV-1 subtype

Taux de succès du TTT

Page 31: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

% SuccessNo. of amplifications

No. of samplesHIV-1 subtype

75 3 4CRF06,CRF09,CRF27

64.75585CRF02

90.91011G

88.9 8 9F

100 6 6D

90.32831B

72.71622A

Amplification env à partir de l’ADN

Page 32: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

00 5 10 15 20 25 30 35 40

6

7

8

9 X4-HXB2

U87 CD4+ CCR4+

U87 CD4+ CCR5+

6

7

8

9R5-Bal

00 5 10 15 20 25 30 35 40

mean = 7.3 logcv = 3.4 %

Reproductibilité du TTT

mean = 7.5 logcv = 6.2 %

Page 33: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

15045105Total

38317D/M & X4

1121498R5

Total

D/M & X4R5TTT

Trofile™ standard

TTT vs Trofile™ standard

Concordance 86 %

Page 34: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

24618Total

651R5X4/X4

18117R5

Total

R5X4/X4R5TTT

Trofile™ ES

TTT vs Trofile™ ES

Concordance 92 %

Page 35: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

HIV-1

Entrée du virus

Cell membrane

CCR5CXCR4

CD4

Interaction gp120/CD4/coreceptor

Séquençage env V3

5 20 30 ....|....|....|....|....|....|....| CTRPNNNTRKSIHIGPGRAFYTTGEIIGDIRQAHC

11 25

Acides aminés et charge nette globale

Virus X4 11R/K et/ou 25K 25R et charge nette +5 Charge nette +6

Tests génotypiques

Delobel JCM 07 ; Raymond AIDS 07 ; Raymond JAC 10

Page 36: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Multiples algorithmes dérivés de bases de données génotypes-phénotypes :

Geno2pheno – FP 5 % or 10 % PSSMSI/NSI

PSSMX4/R5

Hétérogénéité des performances : sensibilité 22-50 % Low AIDS 05 sensibilité 60-90 % Poveda AIDS 07 ; Raymond AIDS 08 ; Seclen JAC

10 ; Recordon-Pinson AAC 10 ; Raymond JAC 10

Tests génotypiques & algorithmes

Page 37: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Sens (%)

77

88

69

77

Spe (%)

96

87

97

94

Genotypic algorithm

11/25 & net charge

Geno2pheno – 10 %

PSSMX4/R5

PSSMSI/NSI

Performance pour la prédiction de virus X4 et D/M

Raymond AIDS 08

Panel of 98 HIV-1 (85 % subtype B)

Page 38: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

B

70

100

50

30

90

90

100

90

Non-B

30

46

23

23

30

53

38

61

B

92

80

96

100

80

92

84

88

Non-B

92

85

88

94

92

88

93

73

Sensitivity (%)

Specificity (%)Methods

Charge rule

Wetcat

C4.5

C4.5 only with p8-p12

PART

PSSMX4/R5

PSSMSI/NSI

Geno2pheno Garrido JCM 08

Prédiction génotypique

non-B (n = 115) & B HIV-1 (n = 35)

Page 39: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Prediction des virus X4 et D/M

Sous-type HIV-1 AG

Se %

70

40

80

70

Sp %

98

90

76

90

Genotypic algorithm

11/25 & net charge

Geno2pheno 10

PSSMX4/R5

PSSMSI/NSI

Panel of 52 HIV-1 CRF02-AC

Raymond JCM 09

Page 40: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Prediction des virus X4 et D/M

Sous-type HIV-1 C

Se %

93

87

93

Sp %

96

91

82

Genotypic algorithm

11/25 & net charge

Geno2pheno 10

PSSMSI/NSI subtype C

Panel of 73 HIV-1 C

Raymond JAIDS 10

Page 41: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Tests phénotypiques

Laboratoires de référence

Structure P3

Coût

Tests génotypiques

Pas de distinction entre X4 et D/M

Pas de détection de variants X4

et D/M < 10-20 %

Limites des tests de tropisme

Page 42: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Combinaison d’algorithmes ?Recordon-Pinson AAC 10

Utilisation de déterminants en dehors de V3 ?V2 : gain de sensibilité de 5 %, Thielen JID 10V1-V2 : pas de gain, Delobel JCM 07

Amplification et séquençage en triplicate ?sensibilité (67 %) non supérieure à PCR en duplicate

Peut-on améliorer la sensibilité

des tests génotypiques ?

Page 43: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Ultradeepsequencing

Day 1 Day 11

Archer AIDS 2009

R5

X4

Page 44: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

10-30 % X4

Weeks

< 10 % X4

> 30 % X4

-3

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0 2 4 6 8 10 12

Swenson CROI 09 # 680Harrigan CROI 09 # 124

Essai 1029 : patients avec virus non-R5 traités par

maraviroc

Ultradeepsequencing

Page 45: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Survenue quand la réplication n’est pas complètement inhibée

2 mécanismes principaux : résistance avec switch de tropisme présence de virus X4

minoritaires avant traitement

résistance avec virus R5

Résistance aux antagonistes de CCR5

Page 46: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Modèle compétitifAffinité accrue pour le corécepteur

Modèle non-compétitif Utilisation du récepteur lié à

l’inhibiteur%

inhibition%

inhibition

Log concentration anti-CCR5 Log concentration anti-CCR5

PMI

IC50

Résistance avec virus R5

Page 47: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

A

B

0

20

40

60

80

100

Sensitive clone (M8) Resistant clone (M13)

Maraviroc concentration

Résistance avec virus R5 & modèle compétitif

Delobel AIDS 10

Page 48: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Le tropisme du HIV est crucial pour l’utilisation des antagonistes de CCR5 et les études physiopathologiques

Le séquençage V3 constitue une approche simple et efficace pour déterminer le tropisme du HIV en pratique courante

Synthèse (1)

Page 49: Tropisme du HIV  Physiopathologie & Caractérisation  Jacques Izopet

Le séquençage à haut débit offre une meilleure sensibilité mais la pertinence clinique des virus X4 minoritaires reste à évaluer

La résistance aux antagonistes de CCR5 doit être caractérisée par des approches phénotypiques et génotypiques

Synthèse (2)