tropisme du hiv physiopathologie & caractérisation jacques izopet
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Tropisme du HIV Physiopathologie & Caractérisation Jacques Izopet Laboratoire de Virologie & INSERM U563 CHU de Toulouse. SFLS Paris 10/12/2010. Entrée du HIV-1 : interaction entre gp120/CD4/corécepteur. HIV-1. CCR5 CXCR4. CD4. Cell membrane. Virus entry. Récepteur = CD4 - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Tropisme du HIV Physiopathologie & Caractérisation
Jacques IzopetLaboratoire de Virologie & INSERM U563
CHU de Toulouse
SFLSParis 10/12/2010
Entrée du HIV-1 : interaction entre gp120/CD4/corécepteur
Récepteur = CD4
Corécepteur = récepteur de chimiokine
HIV-1
Virus entry
Cell membrane
CCR5CXCR4
CD4
Structure cristallographique du complexe gp120/CD4
Pantophlet Annu Rev Immunol 06
NC V4
Outer domain
Innerdomain
Bridging
sheet
V1/V2stem
V3stem
CD4
CoR
20-212-3
Structure cristallographique de la boucle V3 de gp120
Sander PLoS Comput Biol 07
V3 loop
gp 120
Récepteurs de chimiokines & ligands
CCL3 (MIP-1)CCL4 (MIP-1)CCL5 (RANTES)
CCR5
CXCL12 (SDF1)
CXCR4
Expression de CCR5 & CXCR4
Lymphocytes T CD4+
CCR5 (%)
CXCR4 (%)
Naïves CD45 RA+ CCR7+
< 0,1
98
Mémoires centrales
CD45 RO+ CCR7+
2
22
Mémoires effectrices CD45 RO+ CCR7-
52
11
Monocytes, macrophages, cellules dendritiques CCR5 (%) > CXCR4 (%)
Sallusto Nature 99 ; Lee PNAS 99
CXCR4CCR5
Distribution en quasiespèces Populatio
nvirale
R5 X4
Pression sélectiveRéponse immune/Environnement
cellulaire/Drogues
anticorps HIV
CD4
ARN HIV
Primoinfection
Infectionsymptomatiqu
e
Infectionasymptomatiqu
e
Histoire naturelle
X4R5 R5X4
Pathogénicité accrue des virus X4
SHIVSF33A (X4)
SHIVSF162P3 (R5)
Pathogénicité accrue des virus X4
Primoinfection Madrid cohort (n = 67) Spanish hospitals (n = 296) Primo sous-type B (n = 390)
Infection chronique Homer cohorts (n = 979) Chelsea & Westminster cohort (n = 402) Merit (n = 1428)
R5
878384
828185
D/M
131716
181915
X4
---
< 1< 1< 1
Virus (%)
Poveda J Med Virol 07 ; de Mendoza JAC 07 ; Chaix JAC 09 ;
Brumme JID 05 ; Moyle JID 05 ; Coakley IWTHE 06
Prévalence des virus D/M & X4Patients non traités
Influence du tropisme du HIV sur la progression de la
maladie123 patients en primoinfection
Prévalence des virus D/M & X4 : 6,4 %
Lymphocytes TCD4 Initiation de traitement
Raymond AIDS 10
Marqueur de progression de la maladie sans
traitement
Koot Ann Intern Med 93;118:681-688
Kaplan-Meier plot of the cumulative progression to AIDS of 188 untreated men
(n=271)(n=47)
(n=197)(n=44)
(n=189)(n=46)
(n=319)(n=45)
134 135-257 258-365 >365
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 Non traités
Traités
%
T CD4+ lymphocytes
p<.001
p<.001
p=.001p=.005
Prévalence des virus D/M & X4
Hunt JID 06
Marqueur de progression de la maladie sous HAART
Weiser AIDS 08
R5X4/X4
R5
0 %
50 %
100 %
Pts avec virus R5
Pts avec virus X4
Jour 0 2,5 ans 5 ans
% patients
Emergence de virus X4 après 5 ans de traitement efficace
9
23
14
9
9
12
11
9
Izopet Virology 02 ; Delobel J AIDS 05
Compartimentation des variants HIV
Delobel AIDS 05
Fréquence importante de virus X4 chez les mauvais répondeurs
immunologiques
Delobel J Virol 06
Evolution génétique du virus
Mavigner PLoS One 09
6/12 pts sous HAART
2 catégories de tests de tropisme : tests phénotypiques tests génotypiques
Objectifs : sélectionner le traitement le plus
approprié documenter un échec sous
antagoniste de CCR5
Outils virologiques
Cellules exprimant uniquement CXCR4Identification de virus inducteurs de syncytiums SI (X4 et D/M)
Tests phénotypiquesCulture sur la lignée MT2
LimitesNécessité de lymphocytes viablesLourdeur technique
Schuitemaker J Virol 91
Amplification par PCR du gène env à partir de l’ARN HIV plasmatique
Production de virus recombinants compétent ou non pour la réplication
Infection de lignées cellulaires indicatrices
CD4+ CCR5+
CD4+ CXCR4+
Tests phénotypiquesRVA
TrofileTM – Monogram Biosciences
++ ++
HIV Env gp160 expression vector
2500 bpHIV genomic-luc
vector
293 T Transfection
Infection
Replication-defectiverecombinant virus
U87CD4-CXCR4
+/- anti-CXCR4
U87CD4-CCR5
+/- anti-CCR5
Luminescence
measure
+ +
+ +
R5 X4 D/M
Whitcomb AAC 07
pNL43-env-Luc vector
Homologous recombination
Nhel linearization
Transfection293T cells
Recombinants virus
Infection of indicator cells
Luminescence
+/- anti-CCR5 +/- anti-CXCR4
TTT - Toulouse Tropism Test
COFRAC ISO 15189 Raymond JCV 10
Mean Luciferase
activity (log RLU)
0
1
2
3
4
5
6
7
8 U87 CD4+ CXCR4+ cells
No antagonistAnti-CXCR4
mock 0:100 0.5:99.5 1:99 5:95 10:90 15:85 20:80X4:R5 ratio Sensibilité pour X4 ou D/M :
0,5 %
Sensibilité du TTT pour la détection de virus X4 ou D/M
98.2163166>10000
98 50 511000-10000
100 5 5500-1000
100 4 440-500
% SuccessNo. of amplifications
No. of samples
HIV-1 RNA load (copies/mL)
Amplification env des sous-type B selon la charge virale plasmatique
100 9 9Other CRF
94.1112119CRF02
86.7 13 15CRF01
86.7 13 15G
100 10 10F
100 15 15D
100 56 56C
98.5260264B
96.6 28 29A
% SuccessNo. of phenotypes
No. of amplifications
HIV-1 subtype
Taux de succès du TTT
% SuccessNo. of amplifications
No. of samplesHIV-1 subtype
75 3 4CRF06,CRF09,CRF27
64.75585CRF02
90.91011G
88.9 8 9F
100 6 6D
90.32831B
72.71622A
Amplification env à partir de l’ADN
00 5 10 15 20 25 30 35 40
6
7
8
9 X4-HXB2
U87 CD4+ CCR4+
U87 CD4+ CCR5+
6
7
8
9R5-Bal
00 5 10 15 20 25 30 35 40
mean = 7.3 logcv = 3.4 %
Reproductibilité du TTT
mean = 7.5 logcv = 6.2 %
15045105Total
38317D/M & X4
1121498R5
Total
D/M & X4R5TTT
Trofile™ standard
TTT vs Trofile™ standard
Concordance 86 %
24618Total
651R5X4/X4
18117R5
Total
R5X4/X4R5TTT
Trofile™ ES
TTT vs Trofile™ ES
Concordance 92 %
HIV-1
Entrée du virus
Cell membrane
CCR5CXCR4
CD4
Interaction gp120/CD4/coreceptor
Séquençage env V3
5 20 30 ....|....|....|....|....|....|....| CTRPNNNTRKSIHIGPGRAFYTTGEIIGDIRQAHC
11 25
Acides aminés et charge nette globale
Virus X4 11R/K et/ou 25K 25R et charge nette +5 Charge nette +6
Tests génotypiques
Delobel JCM 07 ; Raymond AIDS 07 ; Raymond JAC 10
Multiples algorithmes dérivés de bases de données génotypes-phénotypes :
Geno2pheno – FP 5 % or 10 % PSSMSI/NSI
PSSMX4/R5
Hétérogénéité des performances : sensibilité 22-50 % Low AIDS 05 sensibilité 60-90 % Poveda AIDS 07 ; Raymond AIDS 08 ; Seclen JAC
10 ; Recordon-Pinson AAC 10 ; Raymond JAC 10
Tests génotypiques & algorithmes
Sens (%)
77
88
69
77
Spe (%)
96
87
97
94
Genotypic algorithm
11/25 & net charge
Geno2pheno – 10 %
PSSMX4/R5
PSSMSI/NSI
Performance pour la prédiction de virus X4 et D/M
Raymond AIDS 08
Panel of 98 HIV-1 (85 % subtype B)
B
70
100
50
30
90
90
100
90
Non-B
30
46
23
23
30
53
38
61
B
92
80
96
100
80
92
84
88
Non-B
92
85
88
94
92
88
93
73
Sensitivity (%)
Specificity (%)Methods
Charge rule
Wetcat
C4.5
C4.5 only with p8-p12
PART
PSSMX4/R5
PSSMSI/NSI
Geno2pheno Garrido JCM 08
Prédiction génotypique
non-B (n = 115) & B HIV-1 (n = 35)
Prediction des virus X4 et D/M
Sous-type HIV-1 AG
Se %
70
40
80
70
Sp %
98
90
76
90
Genotypic algorithm
11/25 & net charge
Geno2pheno 10
PSSMX4/R5
PSSMSI/NSI
Panel of 52 HIV-1 CRF02-AC
Raymond JCM 09
Prediction des virus X4 et D/M
Sous-type HIV-1 C
Se %
93
87
93
Sp %
96
91
82
Genotypic algorithm
11/25 & net charge
Geno2pheno 10
PSSMSI/NSI subtype C
Panel of 73 HIV-1 C
Raymond JAIDS 10
Tests phénotypiques
Laboratoires de référence
Structure P3
Coût
Tests génotypiques
Pas de distinction entre X4 et D/M
Pas de détection de variants X4
et D/M < 10-20 %
Limites des tests de tropisme
Combinaison d’algorithmes ?Recordon-Pinson AAC 10
Utilisation de déterminants en dehors de V3 ?V2 : gain de sensibilité de 5 %, Thielen JID 10V1-V2 : pas de gain, Delobel JCM 07
Amplification et séquençage en triplicate ?sensibilité (67 %) non supérieure à PCR en duplicate
Peut-on améliorer la sensibilité
des tests génotypiques ?
Ultradeepsequencing
Day 1 Day 11
Archer AIDS 2009
R5
X4
10-30 % X4
Weeks
< 10 % X4
> 30 % X4
-3
-2.5
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0 2 4 6 8 10 12
Swenson CROI 09 # 680Harrigan CROI 09 # 124
Essai 1029 : patients avec virus non-R5 traités par
maraviroc
Ultradeepsequencing
Survenue quand la réplication n’est pas complètement inhibée
2 mécanismes principaux : résistance avec switch de tropisme présence de virus X4
minoritaires avant traitement
résistance avec virus R5
Résistance aux antagonistes de CCR5
Modèle compétitifAffinité accrue pour le corécepteur
Modèle non-compétitif Utilisation du récepteur lié à
l’inhibiteur%
inhibition%
inhibition
Log concentration anti-CCR5 Log concentration anti-CCR5
PMI
IC50
Résistance avec virus R5
A
B
0
20
40
60
80
100
Sensitive clone (M8) Resistant clone (M13)
Maraviroc concentration
Résistance avec virus R5 & modèle compétitif
Delobel AIDS 10
Le tropisme du HIV est crucial pour l’utilisation des antagonistes de CCR5 et les études physiopathologiques
Le séquençage V3 constitue une approche simple et efficace pour déterminer le tropisme du HIV en pratique courante
Synthèse (1)
Le séquençage à haut débit offre une meilleure sensibilité mais la pertinence clinique des virus X4 minoritaires reste à évaluer
La résistance aux antagonistes de CCR5 doit être caractérisée par des approches phénotypiques et génotypiques
Synthèse (2)