Des anomalies affectant troisgènes, PMP22, P0 et Cx32,sont responsables de la plu-part des neuropathies péri-phériques myéliniques.

Elles sont transmises selon le modedominant et sont connues sous lesnoms de maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 1 (CMT1) (m/s n° 8,vol. 7, p. 868), de maladie de Charcot-Marie-Tooth liée au chromosome X(CMTX), de syndrome de Déjerine-Sottas (DSS), de neuropathie toma-culaire familiale (HNPP, hereditary

neuropathy with liability to pressure pal-sies) et enfin de l’hypomyélinisationcongénitale (HC). Le gène PMP22(peripheral myelin protein), responsablede la CMT1A et de la HNPP, codepour une protéine intégrale de lamembrane de 22 kDa (PMP22) dontla fonction reste mal comprise (m/sn° 5, vol. 10, p. 590). Le gène P0 (ouMPZ, pour myelin protein zero), impli-qué dans la CMT1B et le DSS, codepour une protéine d’adhérence, laprotéine zéro de la myéline (P0), quiserait responsable de l’accolement

1113

Trois gèneset quatre neuropathiespériphériques myéliniques :premières corrélationsgénotype/phénotype

Des anomalies des gènes codant pour PMP22, Cx32 et P0sont responsables de la grande majorité des neuropathiespériphériques myéliniques, formant un continuum neuropa-thologique : hypomyélinisation congénitale grave, syndromede Déjerine-Sottas, forme précoce et sévère, maladie deCharcot-Marie-Tooth de type 1 ou liée à l’X, deux formesmoins sévères, neuropathie héréditaire avec paralysies à lapression (HNPP) qui est la moins grave. La protéine P0 estune protéine d’adhérence cellulaire, impliquée dans la com-paction de la myéline ; PMP22 est une protéine intégralemembranaire, présente aussi dans la myéline compacte, à lafonction encore inconnue ; la connexine Cx32 entre dans laconstitution des jonctions communicantes qui permettent ladiffusion radiale des molécules métaboliques et de signalisa-tion au travers des couches de la myéline.

ADRESSESD. Pham-Dinh : chargée de recherche à l’Inserm.F. Blanquet-Grossard : doctorante, boursièreMRT. A. Dautigny : directeur de recherche auCnrs. Laboratoire de neurogénétique molé-culaire, Ura 1488 Cnrs, Institut des Neuros-ciences, Université de Paris VI, bâtiment B,3e étage, boîte courrier n° 12, 9, quai Saint-Bernard, 75252 Paris Cedex 05, France. C.Ressot : doctorante, boursière ELA. R. Bruz-zone : chargé de recherche à l’Institut Pasteur.Unité de neurovirologie et régénération dusystème nerveux, Institut Pasteur, 25, rue duDocteur-Roux, 75724 Paris Cedex 15,France.

TIRÉS À PARTD. Pham-Dinh.

SYNTHÈSEmédecine/sciences 1997 ; 13 : 1113-22

m/s n° 10, vol. 13, octobre 97

Danielle Pham-DinhFrançoise Blanquet-GrossardCatherine RessotRoberto BruzzoneAndré Dautigny

des faces extracellulaires des mem-branes de la myéline compacte (m/sn° 10, vol. 9, p. 1273). Le gène Cx32(ou GJB1, pour gap junction B1), res-ponsable de la CMTX, code pour laconnexine 32 (Cx32), membre de lafamille des protéines composant lescanaux intercellulaires des jonctionscommunicantes (m/s n° 2, vol. 10,p. 222). Des études récentes sur lastructure et la biologie de ces troisprotéines associées à l’homéostasiede la myéline du système nerveuxpériphérique ont permis de dévoilercertains des mécanismes conduisantà plusieurs types de neuropathiesdémyélinisantes, cliniquement et his-tologiquement différentes.

La myéline périphérique

Chez la majorité des vertébrés, denombreux axones du système ner-veux central et périphérique sontentourés d’une gaine isolante consti-tuée par l’enroulement en spiraled’une membrane particulière, lamyéline. Dans le système nerveuxpériphérique, une cellule gliale, lacellule de Schwann myélinisante,forme un seul segment de gaine demyéline (figure 1A). Les segments demyéline, ou internodes, sont séparéspar des régions où l’axone estexposé, appelées nœuds de Ranvier.Grâce à cette isolation par segmentset à la concentration élevée decanaux sodiques dans cette région del’axolemme, le potentiel d’actionproduit au nœud de Ranvier peut sepropager en sautant par bonds denœud en nœud : c’est la conductionsaltatoire. Cette conduction est engénéral très rapide, de l’ordre de50 mètres par seconde. Plus le dia-mètre de l’axone est large, plus ilcomporte de couches de myéline, etplus la conduction nerveuse estrapide et se propage fidèlement surune longue distance. Un potentield’action peut ainsi se propager de lamoelle épinière au bout de notrepied (une distance de plus d’unmètre chez l’adulte) en moins de25 millisecondes.Au microscope électronique, la gainede myéline compacte apparaît for-mée par l’alternance de « lignesdenses majeures » correspondant àl’accolement des faces cytoplas-miques de la membrane plasmique,

et de « doubles lignes intrapério-diques » correspondant à l’adhérencedes faces externes de deux couchesadjacentes (figure 1B). La myélinecomprend des régions contenantencore du cytoplasme, comme lesboucles paranodales et les incisuresde Schmidt-Lanterman (figures 1A et

3B). La myéline contient 70 % delipides et 30 % de protéines, rapportinverse de celui rencontré dans lesautres membranes plasmiques ; cetterichesse en lipides participe à sa fonc-tion d’isolant. Les protéines de struc-ture majeures de la myéline périphé-rique compacte sont la protéine P0,

1114 m/s n° 10, vol. 13, octobre 97

Double ligne intrapériodique

Ligne dense majeure

MAGCx32P0 MBPPMP22

Inte

rfac

e ex

trac

ellu

laire

Inte

rfac

e cy

topl

asm

ique

C

Myéline compacte

Axone

Nœud de Ranvier Lame basale Cellule de Schwann

Languettes paranodales

Incisures de Schmidt-Lanterman

B

A

Figure 1. Ultrastructure de la myéline et topologie des principales protéines

myéliniques. A. Dans le système nerveux périphérique, la gaine de myélineest constituée par l’extension de la membrane plasmique de la cellule deSchwann myélinisante s’enroulant en spirale autour de l’axone pour formerun internode comprenant jusqu’à 50 couches de membrane compactée. Lesinternodes peuvent atteindre 2 mm de large et ils sont séparés par desrégions non myélinisées où l’axone est exposé, le nœud de Ranvier. Cer-taines régions de la gaine, les languettes paranodales, les incisures deSchmidt-Lanterman et la languette externe, contiennent encore du cyto-plasme. B. En microscopie électronique, la gaine de myéline compacte estvue comme une alternance de lignes claires et sombres. La « double ligneintrapériodique » correspond à l’apposition des faces extracellulaires de lamembrane, et la « ligne dense majeure » est formée par l’accolement desfaces cytoplasmiques de la membrane. C. Topologie par rapport à la mem-brane des principales protéines de la myéline périphérique. P0, MBP (myelinbasic protein), et PMP22 sont localisées dans la myéline compacte. Les pro-téines MAG et Cx32 sont présentes dans les régions non compactes, lan-guettes paranodales, incisures de Schmidt-Lanterman [1]. Les protéinesCx32, et PMP22 font partie d’une famille de protéines à quatre domainestransmembranaires, comme PLP/DM20, rMAL, plasmolipine, CD9, dont onvient de démontrer l’expression dans la myéline périphérique [2].

les MBP (myelin basic proteins) etPMP22 ; dans les régions non com-pactes, on trouve des protéines mino-ritaires comme la MAG (myelin asso-ciated glycoprotein) et la Cx32 [1, 2](figure 1C).

Historiquedes neuropathiesmyéliniques.Quelques dates

Après la description par Virchow,Friedreich et d’autres de cas sem-blables, Charcot et Marie, à l’hôpitalde la Salpêtrière, décrivirent en 1886une affection familiale comportantune atrophie musculaire touchantd’abord les muscles du pied ou de lajambe et, plus tardivement, desmains puis des avant-bras. Ils lui don-nèrent le nom d’« atrophie muscu-laire progressive » et ils pensaient quecette affection était due à uneatteinte de la moelle épinière. Lamême année, à Londres, Tooth pré-senta une thèse sur une affectionsemblable qu’il pensait être due àune atteinte des nerfs périphériques.On sait maintenant que les affectionsdésignées collectivement sous le nomde neuropathies héréditaires sensi-tivo-motrices de type 1 (NHSM1) oude maladie de Charcot-Marie-Toothde type 1 (CMT1) sont dues à uneatteinte de la myéline et de la cellulede Schwann myélinisante, par oppo-sition aux formes axonales, appeléesNHSM2 ou CMT2 selon la classifica-tion de Dyck [3]. En 1888, Herrin-gham, étudia une grande familledans laquelle les femmes présen-taient peu ou pas de symptômes,contrairement à leur père ou à leursfils atteints. C’est encore aujourd’huila définition de la CMT liée à l’X(CMTX). En 1893, Déjerine et Sottasidentifièrent une maladie plus graveet d’apparition plus précoce qu’ilsdistinguèrent de la CMT en raisond’une hypertrophie des nerfs péri-phériques. Ils l’appelèrent pour cetteraison « névrite interstitielle hypertro-phique et progressive de l’enfance ».Cependant, certains auteurs considé-raient déjà que cette affection, dési-gnée sous le nom éponyme de syn-drome de Déjerine-Sottas (DSS),était seulement une forme sévère deCMT, désignée plus tard sous le nomde CMT3. Cela illustre les difficultésà classer ces différentes maladies

comme une même entité ou aucontraire à les distinguer les unes desautres [3, 4].

Diagnosticet classificationdes neuropathiespériphériquesmyéliniques

Une étape importante dans le dia-gnostic des neuropathies démyélini-santes, maladies relativement fré-quentes (1 sur 2 500) [3-6], a toutd’abord été franchie à la fin desannées 1950, grâce à la mesure élec-trophysiologique de la vitesse deconduction nerveuse (VCN) dans lesnerfs périphériques moteurs et sensi-tifs. L’électromyographie (enregistre-ment de l’activité électrique des nerfset des muscles) permet en effet dedistinguer la forme « myélinique »CMT1 (70 % des cas de CMT), pré-sentant une diminution de la vitessede conduction nerveuse en dessousde 40-42 m/s, et la forme « axonale »CMT2 (30 % des cas), présentant unevitesse de conduction nerveuse prati-quement normale [6].L’examen clinique du malade, sonhistoire familiale, la mesure de lavitesse de conduction nerveuse, labiopsie de nerf, permettent au clini-cien d’évaluer la gravité et la nature(myélinique ou non) de la neuropa-thie [3-6]. L’atteinte de la myélinepeut être le résultat d’une absencede formation (dysmyélinisation),d’une dégénérescence (démyélinisa-tion), ou d’une combinaison desdeux processus. La CMT1 débutegénéralement pendant l’enfance oul’adolescence et son évolution estlente. La sévérité clinique estvariable, allant de la simple gêne à lamarche à la nécessité, rare, d’utiliserune chaise roulante ; certains sujetsatteints restent asymptomatiquestoute leur vie. La déformation despieds (pieds creux) est un signecaractéristique retrouvé chez la plu-part des malades CMT1. On observeune faiblesse et une atrophie muscu-laires, associées à des troubles sensi-tifs, touchant d’abord les extrémitésdistales des membres inférieurs puisdes membres supérieurs. A ces signesconstants, s’ajoutent parfois destroubles visuels ou respiratoires. LeDSS est une forme beaucoup plussévère de la CMT, débutant pendant

la petite enfance, parfois dès la nais-sance. La paralysie des membres infé-rieurs et la diminution de la sensibi-lité cutanée sont rapidementcompliquées par la paralysie desmembres supérieurs, pouvant aboutirà une dépendance totale ; on observegénéralement une hypertrophie desnerfs périphériques. La CMTX secaractérise par une progression de lamaladie plus rapide et plus précocechez les hommes que chez lesfemmes de la même famille, cer-taines d’entre elles étant asymptoma-tiques.Au niveau électrophysiologique, lavitesse de conduction nerveuse quiest supérieure à 40 m/s chez le sujetnormal, est comprise entre 10 et40 m/s chez le sujet CMT1, est infé-rieure à 10-12 m/s chez les sujetsDSS, et varie de 25 à 40 m/s chez leshommes CMTX, les femmes ayantdes vitesses supérieures à 40 m/s. Auniveau histologique, la biopsie denerf montre un amincissement desgaines de myéline accompagné de laformation de « bulbes d’oignon »,structures résultant de la proliféra-tion anormale des cellules deSchwann restant immatures. Uneperte axonale secondaire progressiveest généralement observée, témoinde la perturbation des interactionscellule de Schwann/axone. L’hypo-myélinisation congénitale (HC) estune affection extrêmement sévère,parfois létale pendant la période néo-natale ou les premières années de lavie par insuffisance respiratoire chro-nique due à l’atteinte grave du nerfphrénique. Les malades qui surviventprésentent une invalidité très impor-tante, avec un retard considérable dela marche, quand celle-ci est acquise.Les vitesses de conduction nerveusesensitivo-motrices sont très abaissées,de l’ordre de 5 m/s, voire indéce-lables. Les caractéristiques de cettemaladie sont celles d’une dysmyélini-sation ; les axones sont entourésd’une gaine de myéline extrême-ment fine ou par le prolongementcytoplasmique non compacté de lacellule de Schwann et il n’y a prati-quement pas de bulbes d’oignon. Laneuropathie héréditaire avec paraly-sie nerveuse à la pression ou HNPP,se caractérise par des épisodes deparalysie transitoires et récurrentsdus à la présence d’une gaine demyéline anormalement fragile dont

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l’altération locale bloque la transmis-sion de l’influx nerveux entraînantune paralysie des muscles correspon-dants. Les processus de réparation dela myéline permettront la récupéra-tion de cette paralysie dans des délaisvariables, de quelques minutes à plu-sieurs semaines. Les vitesses deconduction nerveuse sensitivo-motrice sont parfois normales chezles patients, et chez les porteursasymptomatiques qui sont très fré-quents dans les familles HNPP, maisles latences distales sont constam-ment allongées. On observe un che-vauchement entre les tableaux cli-niques de la CMT1A et de l’HNPPdans certaines familles. La myélineanormale rencontrée dans l’HNPPest localement très abondante surcertaines fibres nerveuses, lui don-nant un aspect en chapelet de sau-cisses (en latin, tomacula) d’où lenom de neuropathie tomaculaire quilui est parfois donné.

Du gène à la protéine

Des études de liaison génétique réali-sées sur de grandes familles ont per-mis d’identifier en une quinzained’années les gènes impliqués dans90 % des neuropathies myéliniques[4, 5]. La transmission se fait le plusfréquemment selon le mode domi-nant, autosomique ou lié au chromo-some X. Au début des années 1980,on a mis en évidence une liaisonentre un gène responsable de laCMT1B et le locus du groupe san-guin Duffy, puis du gène FcγRIIA (quicode pour un récepteur de la partieFc des immunoglobulines), sur lechromosome 1. Cependant, en 1982,d’autres études montrèrent que,dans la plupart des familles CMT1, lamaladie n’était pas liée à ce locus.Deux locus furent identifiés : en1985, celui lié au chromosome X, leCMTX, et en 1989, celui lié au chro-mosome 17, le CMT1A représentantla forme la plus fréquente (70 % descas de CMT1) [4, 5]. En 1991, laduplication d’une partie du brascourt du chromosome 17 fut mise enévidence dans la plupart des cas deCMT1A (m/s n° 8, vol. 7, p. 868) [7].Le gène codant pour la protéine dela myéline périphérique PMP22 [8],fut isolé et localisé dans cette dupli-cation, le rendant candidat pour laCMT1A [9]. En 1993, on a découvert

dans l’HNPP la délétion réciproquede la région dupliquée dans laCMT1A, contenant le gène PMP22[10] (m/s n° 5, vol. 10, p. 590). En1992, dans la CMTX, plusieursétudes familiales avaient montré uneassociation avec le locus Xq13.1contenant le gène codant pour laCx32 [11]. En 1993, comme d’autreséquipes, nous avons cloné et localisésur le chromosome 1q21.3-q23, legène P0 humain codant pour la pro-téine majoritaire de la myéline péri-phérique, ce qui en faisait unmeilleur gène candidat pour laCMT1B que FcγRIIA [12, 13].

La protéine PMP22

C’est une glycoprotéine comportantquatre domaines transmembranaires(figure 1C) qui constitue 2 % à 5 % desprotéines de la myéline périphé-rique ; on la trouve également enfaibles quantités dans d’autres tissus.Cette molécule a une analogie struc-turale avec une protéine impliquéedans l’arrêt de la prolifération cellu-laire [14]. La première mutation,Gly150Asp, a été identifiée chez lasouris Trembler dont le phénotype,chez l’animal hétérozygote, res-semble à celui de la CMT1A. La sou-ris homozygote, viable, pratiquementdépourvue de myéline périphérique,est plus sévèrement affectée et doncplus proche du DSS. Chez le mutantallélique Trembler-J, la mutationLeu16Pro conduit à un phénotypesévère, proche du DSS chez la sourishétérozygote, létal chez l’homozy-gote, alors que la même mutation estresponsable de signes cliniques peusévères dans une famille CMT1A [5].Cet exemple illustre les limites desmodèles animaux dans l’analyse desmaladies génétiques humaines.La duplication d’une région de1,5 Mb contenant le gène PMP22, estresponsable de 70 % des cas deCMT1A (m/s n° 8, vol. 7, p. 868) ; lesmutations ponctuelles du gènePMP22 sont très rares [4, 5, 15]. Lemécanisme génétique probablementen cause est expliqué dans la figure 2,l’existence d’un point chaud derecombinaison dans les séquenceshomologues (CMT1A-rep) flanquantla région remaniée a été démontrée[16-18].Différents modèles animaux, transgé-niques et knock-out, reproduisent

assez fidèlement les différents phéno-types observés dans les neuropathieshumaines. Ainsi, chez la souris dontle gène PMP22 a été délété [19], onobserve les caractéristiques phénoty-piques et morphologiques del’HNPP, tomacula et hypermyélinisa-tion, alors que les souris et les ratstransgéniques surexprimant le gènePMP22 [20, 21] présentent des phé-notypes mimant la CMT1A et le DSS.Par quel mécanisme ces anomaliesde dosage génique (1 ou 3 copies dugène au lieu de 2) conduisent-elles àdifférents troubles de la myéline péri-phérique ? Tout d’abord, des étudesd’immunocytochimie quantitative,réalisées sur des biopsies nerveusesde plusieurs patients, indiquent quel’excès ou le déficit de l’expressionde PMP22 est bien corrélé aunombre de copies du gène [22], sug-gérant, respectivement, un rôledirect du dosage génique dans lapathogénie de la CMT1A ou del’HNPP. La fonction de PMP22 ainsique les mécanismes responsables deseffets délétères des anomalies dedosage de cette protéine sur la myéli-nogenèse sont encore hypothétiqueset controversés [23]. Certains auteurssupposent que PMP22 jouerait unrôle bifonctionnel : (1) dans le déve-loppement, en réglant la différencia-tion ou l’apoptose des cellules deSchwann [5, 19, 20] ; (2) structural,dans le maintien de la stabilité de lamyéline. Par ailleurs, l’expressivitévariable de la maladie observée chezles patients CMT1A porteurs de laduplication (homozygotes ou hétéro-zygotes) [24, 25], ou de la délétion[26], comme la variabilité phénoty-pique observée dans la lignée de ratssurexprimant PMP22 [21], suggèrentfortement l’existence de facteursenvironnementaux, épigénétiques oustochastiques [6, 21] contribuant à lamodulation de la pénétrance et del’expression de cette maladie mono-génique.On peut faire un parallèle [5, 19, 20,23, 26, 27] entre les anomalies affec-tant le gène PMP22 et celles touchantle gène PLP codant pour les protéoli-pides majeurs de la myéline du sys-tème nerveux central (PLP etDM20). En effet, comme pourPMP22 dans le système nerveux péri-phérique, des mutations ponctuelles,délétions ou duplications du gènePLP sont responsables de maladies

1116 m/s n° 10, vol. 13, octobre 97

de la myéline du système nerveuxcentral, allant de la dysmyélinisationlétale chez le jeune enfant, à unedémyélinisation modérée, d’appari-tion tardive et peu symptomatique[27, 28] (m/s n° 4, vol. 10, p. 487). Lefait que des anomalies du dosagegénique produisent des effets compa-rables à ceux provoqués par desmutations ponctuelles, est un phéno-mène inattendu dont les mécanismesmoléculaires ne sont pas encore com-pris. Cet effet de dosage géniqueévoque la possibilité d’une oligoméri-sation de PMP22, comme de PLP etde DM20, ou d’interactions avecd’autres protéines et donc la néces-sité du respect de la stœchiométriede leur synthèse (m/s n° 12, vol. 12,p. 1439).

La protéine Cx32

Cette connexine de 32 kDa, est loca-lisée dans les régions de la gaine demyéline périphérique contenant ducytoplasme, comme les incisures deSchmidt-Lanterman et les bouclesparanodales [29, 30]. La Cx32 n’estpas spécifique de la myéline périphé-rique, on la trouve aussi dans le foie,le rein, le pancréas, la glande mam-maire [31, 32], ainsi que dans les oli-godendrocytes [30], cellules produc-trices de myéline dans le systèmenerveux central. Les connexiness’assemblent sous forme d’oligo-mères de six sous-unités, appelésconnexons, qui s’apparient avec lastructure homologue localisée dansla membrane d’une cellule voisine

pour constituer un canal intercellu-laire faisant communiquer le cyto-plasme de ces deux cellules (m/s n° 2,vol. 10, p. 218) (figure 3A). L’ensemblede ces canaux constitue une plaquede jonctions communicantes, oujonction gap, permettant le passagede molécules de moins de ~ 1 kDa(seconds messagers, ions et métabo-lites), selon l’identité de laconnexine synthétisée. Cependant, lalocalisation de Cx32 dans les cellulesde Schwann n’est pas compatibleavec la formation de canaux intercel-lulaires orthodoxes. Sa présence dansles régions où la myéline est moinscompactée (régions paranodales etincisures de Schmidt-Lanterman)suggère, en revanche, la formationde canaux « intracellulaires » entreles différentes couches de myéline,permettant ainsi de raccourcir le che-min à parcourir pour le transfertd’ions et de nutriments à partir ducorps cellulaire de la cellule deSchwann à travers l’épaisseur etautour de la gaine de myéline [33].La voie radiale (transversale) à tra-vers la gaine de myéline la plus large(4 µm d’épaisseur chez les mammi-fères), est 1 000 fois plus courte quele chemin progressant le long de laspirale de myéline (4 mm de long)(figure 3B).En 1993, Bergoffen et al. [29] ontidentifié des mutations du gène Cx32chez plusieurs patients CMTX (m/sn° 2, vol. 10, p. 222). Depuis cettedate, plus de 70 mutations diffé-rentes touchant indifféremmenttoutes les régions de la molécule, ontété rapportées [15, 33-35]. Certainesmutations non-sens, localisées prèsde l’extrémité amino-terminale de laprotéine, correspondent à un allèlenul et donc à une absence totale deCx32 chez les sujets masculinsatteints, ceux ci étant hémizygotes ;chez les femmes atteintes, l’inactiva-tion au hasard de l’un des chromo-somes X, fait qu’une expression detype hétérozygote, correspondant àun mosaïcisme cellulaire concernantl’expression de Cx32, devrait êtreobservée : chaque chromosome Xportant un allèle différent, des cel-lules de Schwann « normales » et« mutées » devraient coexister au seindes nerfs périphériques. Paradoxale-ment, chez les sujets atteints, l’effetdélétère des mutations de la Cx32 estobservé uniquement dans la myéline

1117m/s n° 10, vol. 13, octobre 97

Chromosome 17 maternel

Chromosome 17 paternel

repPMP22

rep

1,5 Mb

+

Délétion HNPP

Duplication CMT1A

Figure 2. Représentation schématique des mécanismes génétiques à l’ori-

gine des recombinaisons dans la région contenant le gène PMP22. Un cros-sing-over inégal peut se produire à la suite d’un mauvais alignement desséquences répétées (rep) espacées de 1,5 Mb de part et d’autre du gènePMP22 sur le chromosome 17p11.2 [6]. Cet événement de recombinaison seproduit généralement pendant la méiose (le plus souvent la méiose mâle).L’échange inégal se produit entre des séquences répétées, rep, qui flanquentle monomère de duplication CMT1A de 1,5 Mb (taille la plus fréquente), cequi conduit à un chromosome contenant la duplication de cette région (phé-notype CMT1A), et à un chromosome comportant la délétion réciproque(phénotype HNPP). Étant donné la rareté de l’événement de recombinaison,on ne trouve jamais les deux types de maladie dans la même famille.

périphérique, alors que chez la sourisdépourvue de Cx32, les anomaliessont observées essentiellement auniveau du foie où l’absence de Cx32perturbe la transmission du signal dunerf sympathique à travers le lobehépatique entraînant une diminu-tion de la mobilisation du glucose[36]. Ces mêmes souris développentpar la suite des altérations de la myé-line périphérique, telles que desbulbes d’oignon détectables chez desanimaux âgés de 9-12 mois, mais quine sont pas associées à des manifesta-tions cliniques (U. Suter, ETH-Zurich, communication person-nelle).Quelles sont les conséquences fonc-tionnelles des mutations de Cx32détectées chez les patients CMTX ?Les effets fonctionnels de ces muta-tions peuvent être analysés en utili-sant des paires d’ovocytes de xénopecomme système d’expression(figure 3C) [37, 38]. Nous avons mon-tré que deux mutations ponctuelles,Arg142Trp et Glu186Lys, provoquentla perte complète de leur fonction(figure 3D). En outre, la mutationArg142Trp possède un effet domi-nant négatif, puisqu’elle inhibe defaçon sélective la capacité fonction-nelle d’une autre connexine [39].Cette perte fonctionnelle et la pré-sence d’effets dominants négatifs ontété confirmées pour d’autres muta-tions, en utilisant un systèmed’expression de cellules de mammi-fères [40]. En revanche, une pro-téine tronquée par une mutationstop provoquant la délétion dudomaine carboxy-terminal à partir del’acide aminé en position 220, per-met la formation de canaux intercel-lulaires fonctionnels [40, 41]. Sur labase de ces données, nous pouvonsfaire l’hypothèse que les mutationslocalisées dans les régions qui jouentun rôle essentiel dans l’assemblagedu canal et la formation du pore(domaines transmembranaires,deuxième boucle extracellulaire)pourraient être associées à une pertetotale de fonction. En revanche, noussupposons que certaines mutations,localisées dans les domaines quijouent un rôle prépondérant dans lesmécanismes de régulation dyna-mique de la perméabilité des canauxcytoplasmiques (régions cytoplas-miques, première boucle extracellu-laire), n’empêcheraient pas la forma-

1118 m/s n° 10, vol. 13, octobre 97

Double ligne intrapériodique

Monomères Cx32

Connexons Ligne intrapériodique

Ligne dense majeureIncisures de Schmidt-Lanterman

A B

Deux ovocytes sont appariés, les électrodes permettent de

mesurer le courant jonctionnel traversant les canaux

intermédiaires formés parles connexons

MicroélectrodesMicropipette

Injection d'ARN Cx32 normal ou

muté

Témoin

25

20

15

10

5

0

hCx3

2

Arg14

Trp

Glu186

Lys

Conductance jonctionnelle (µS)C D

Figure 3. Étude fonctionnelle des canaux intercellulaires. A. Les connexiness’assemblent par groupes de six molécules pour former des structurescreuses, appelées connexons. L’alignement bout à bout d’un connexond’une cellule avec celui de la cellule voisine forme un canal jonctionnel etle regroupement de plusieurs canaux constitue une jonction communicante(gap junction). B. La Cx32 pourrait former des canaux non orthodoxes,« intracellulaires », entre les différentes couches de myéline, dans lesrégions où celle-ci n’est pas compactée, comme ici dans les incisures deSchmidt-Lanterman, permettant ainsi de raccourcir le chemin à parcourirpour le transfert d’ions et de nutriments à partir du corps cellulaire de lacellule de Schwann à travers l’épaisseur de la gaine de myéline [33]. C.Représentation schématique des différentes étapes permettant l’étudefonctionnelle des connexines dans le système des ovocytes de xénopeappariés [37, 38]. La région codante d’un ADNc de connexine est sous-clo-née dans le vecteur d’expression SP64T, l’ARN synthétique est ensuite pro-duit in vitro, purifié puis injecté dans le pôle végétal d’un ovocyte défolli-culé de stade V-VI. Après enlèvement de la membrane vitelline, deuxovocytes sont appariés manuellement au niveau des pôles végétaux. Lespropriétés fonctionnelles des canaux intercellulaires peuvent être analyséesgrâce à un double potentiel imposé qui permet de quantifier la conduc-tance jonctionnelle. D. Les conductances jonctionnelles ont été mesuréesdans des paires d’ovocytes exprimant des mutations CMTX de Cx32. Laprotéine Cx32 de type normal (hCx32) forme des canaux intercellulaires quidéveloppent une conductance équivalente, dans cette série d’expériences,à environ 200 000 canaux fonctionnels. En revanche, deux mutations tes-tées, Arg142Trp et Glu186Lys, n’induisent pas de conductance jonctionnellemesurable, comme les paires d’ovocytes témoins injectés avec de l’eau.Adapté d’après [39].

tion de canaux actifs. En effet, nousavons récemment identifié troisautres mutations dans ces domaines,qui maintiennent une activité fonc-tionnelle, et leur analyse physiolo-gique est en cours [42]. Il est pos-sible que ces mutations soientassociées à des modifications sélec-tives de la perméabilité ou de la sen-sibilité à différentes voies de régula-tion, tels que le potentiel, le pH, lecalcium ou d’autres messagers intra-cellulaires, ce qui aurait pour consé-quence un déficit fonctionnel. Cesrésultats traduisent les différencesque l’on peut observer entre un sys-tème d’expression in vitro, isolé ducontexte physiologique et temporel,et la myélinogenèse. Actuellement,nous ne connaissons pas la séquencemoléculaire des étapes qui, à partir

des mutations du gène Cx32, condui-sent à la dégénérescence progressivede la gaine myélinique périphérique.Nous pouvons faire l’hypothèse queles mutations de la Cx32 condui-raient à la formation de connexonsanormaux entraînant la rupture dutrafic intracellulaire de messagers àtravers la voie radiale traversant lagaine de myéline, perturbant ainsi leséchanges métaboliques entre le corpscellulaire, les régions compactes dela myéline et la région péri-axonalede la cellule de Schwann.

La protéine P0

Elle représente plus de 50 % des pro-téines de la myéline périphérique.C’est une protéine transmembranairede 30 kDa composée d’un domaine

extracellulaire (P0-ex) de type immu-noglobuline (Ig-like), glycosylé, suivid’un domaine transmembranaire etd’une région intracellulaire conte-nant un grand nombre de résidusbasiques. Des études in vitro ont mon-tré que le domaine extracellulaire deP0 glycosylé peut être impliqué dansdes interactions homotypiques res-ponsables des fonctions d’adhérence[43] des faces externes de la mem-brane qui forment la double ligneintrapériodique.Il n’existe pas de mutants naturels dugène P0 chez la souris. L’inactivationdu gène a montré que la souris hété-rozygote P0+/– présente des troublesmodérés, comparables à la CMT1B,alors que la souris homozygote P0–/–

constitue un modèle du syndromeplus sévère du DSS (Tableau I) [44].

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A

Epace extracellulaire

Double ligne intrapériodique

Ligne dense majeureCytoplasme

Cytoplasme Ligne dense majeure

45 A

B

Figure 4. Schéma de la topologie de P0-ex dans la double ligne intrapériodique. A : vue en coupe transversale. B :

vue de dessus. Que nous apprennent la modélisation et la cristallisation sur la topologie et les interactions des molé-cules de P0 dans la myéline? Chaque monomère présente un domaine extracellulaire (P0-ex), symbolisé ici par un« ballon » ovale, maintenu dans la bicouche lipidique par ses domaines transmembranaire et intracellulaire. Lesmonomères de P0-ex s’assemblent sous forme de tétramères (chacun d’eux peut être imaginé comme une poignéede ballons attachés dans la membrane par leur ficelle). Une deuxième interaction s’établit entre tétramères « plan-tés » de part et d’autre des faces extracellulaires se faisant face (en trans). Ces interdigitations et interactions sontresponsables de l’adhérence des couches externes de la myéline. Cependant, la région extracellulaire juxtamembra-naire du domaine P0-ex est composée de résidus « désordonnés » formant une structure flexible qui ne permettraitpas de maintenir à distance fixe les faces externes des membranes de la myéline ; pour remplir cette fonction, unetroisième interaction s’établirait entre les lipides de la membrane opposée et le résidu hydrophobe tryptophane 28pointant vers l’extérieur de l’extrémité amino-terminale de P0-ex (symbolisé par un carré rouge). Grâce à ces troisinteractions, les molécules de P0-ex formeraient une sorte de velcro maintenant fermement, mais avec une certainesouplesse, les faces extracellulaires des membranes de myéline à la distance de 45 Angströms observée en micro-scopie électronique. Ce modèle schématique ne prend pas en compte les interactions possibles de P0 avec d’autresprotéines de la myéline, comme PMP22 et Cx32, qui, lorsqu’elles sont mutées, conduisent à des phénotypes cli-niques divers mais comparables de neuropathies périphériques. (Adapté d’après [52 et 55].)

Une quarantaine de mutations ponc-tuelles dominantes du gène P0 ontété rapportées à ce jour chez despatients présentant différentesformes de neuropathies myéliniques[15, 45-52]. Sur ces mutations, 22sont localisées en 16 positions diffé-

rentes du domaine P0-ex, soulignantl’importance fonctionnelle de cedomaine. Certaines mutations de P0conduisent à la CMT1B, d’autres auDSS ou à l’HC (Tableau I). Le recen-sement de ces mutations [15, 48, 52]et l’étude clinique des malades mon-

trent que la variabilité des phéno-types est fonction de la nature et dela position de ces mutations par rap-port à la structure tertiaire et quater-naire de la protéine (figure 4), récem-ment établie par cristallisation dudomaine Ig [53]. Par exemple, lasubstitution par une cystéine de lasérine 34, de l’arginine 69, ou dutryptophane 72, exposés vers l’exté-rieur de la molécule selon les don-nées cristallographiques, entraîne unDSS ou une forme grave et précocede CMT1B. Dans ce type de substitu-tion, la formation d’un pont disul-fure ectopique aboutirait à la forma-tion de tétramères anormaux. Enrevanche, lorsque la sérine 34 estdélétée ou remplacée par une phény-lalanine, ou quand l’arginine 69 estremplacée par une sérine ou une his-tidine, la perturbation de l’assem-blage des tétramères serait moinsimportante et conduirait à un phéno-type CMT1B moins sévère. Parailleurs, alors que des expériencesd’expression du gène P0 dans descellules eucaryotes suggèrent que laglycosylation jouerait un rôle essen-tiel dans la fonction d’adhérence deP0-ex [43], la mutation Asn93Ser, ausite unique de glycosylation, conduità une forme tardive et cliniquementmodérée de CMT1B [50].Une autre approche permettantd’établir une corrélation géno-type/phénotype, consiste à analyserl’impact des mutations in situ, sur lastructure de la myéline. Cette étude,réalisée sur la biopsie de nerf depatients CMT1B ou DSS [54], a mon-tré que certaines mutations provo-quent une non-compaction de lamyéline dans la plupart des fibresencore myélinisées, alors qued’autres mutations entraînent, dansle même internode, un amincisse-ment et une hypermyélinisationlocale (tomacula), la myéline rési-duelle étant elle-même compacte. Endehors d’un effet pathogène généralcommun à toutes les mutations P0(démyélinisation, bulbes d’oignon,perte axonale secondaire), ces résul-tats montrent que chaque mutationP0 présente un impact particulier surla structure de la myéline.En conclusion, ce travail de caractéri-sation des défauts génétiques respon-sables des neuropathies myéliniquespose maintenant le problème de leurclassement. Certaines neuropathies,

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Des mutations ponctuelles, la délétion ou la duplication de gènes exprimés dans la cellule deSchwann, conduisent à des neuropathies myéliniques de sévérité clinique très variable. Ces ano-malies définissent un continuum neuropathologique qui va de l’absence congénitale totale de myé-line (hypomyélinisation congénitale, HC), passe par une forme précoce et sévère, le syndrome deDéjerine-Sottas (DSS), puis par la forme plus modérée de maladie de Charcot-Marie-Tooth de type1 (CMT1) A ou B, ou de CMTX, débutant tardivement chez le jeune adulte, une forme moins délé-tère et cliniquement différente étant la paralysie tomaculaire récidivante (HNPP). Il existe un che-vauchement entre les phénotypes, et il n’y a pas de corrélation directe entre la vitesse de conduc-tion nerveuse dont la « pénétrance » est totale et la sévérité du phénotype clinique dont lavariabilité est grande, y compris parmi les membres atteints d’une même famille [6, 24, 25]. Le gène Cx32 étant localisé sur l’X, les hommes, hémizygotes (Cx32y/mutation), sont plus sévèrementatteints que les femmes hérérozygotes (Cx32+/mutation). La vitesse de conduction nerveuse est plusbasse chez les hommes (31 ± 6 m/s) que chez les femmes (45 ± 9 m/s) où elle est dite « intermé-diaire » [5]. La duplication du gène PMP22 à l’état hétérozygote (trois copies du gène) est symbolisée parPMP22+/++, à l’état homozygote (quatre copies) par PMP22++/++. L’hétérozygotie, chez les sourisknock-out (KO), est symbolisée par K0+/–, l’homozygotie par K0–/–. Les souris ou les rats transgé-niques sont symbolisés par Tg et chez ces animaux le nombre de copies varie selon la lignée ;l’effet du transgène se manifeste dès l’état hétérozygote en fonction de son taux d’expression dansla cellule de Schwann. Mutation nulle, signifie soit une mutation stop, soit un décalage de cadre delecture, aboutissant à l’absence de protéine ou à une protéine non fonctionnelle, par oppositionaux mutations faux-sens (mutation), qui ne modifient qu’un acide aminé. Adapté d’après [27].

Tableau I

COMPARAISON ENTRE LES PHÉNOTYPES DES NEUROPATHIESMYÉLINIQUES HUMAINES ET LES MODÈLES ANIMAUX

CORRESPONDANTS

Vitesse deconduction 0 à 12 12 à 38 < 38-40nerveuse en m/s

Neuropathies périphériques myéliniques

Maladie DSS CMT1A HNPP

Génotype PMP22 PMP22++/++ PMP22+/++ PMP22+/–

PMP22+/mutation PMP22+/mutation PMP22+/mutation

nulle

Maladie CMTX CMTX

génotype Cx32 Cx32Y/mutation Cx32+/mutation

Cx32+/mutation

Maladie HC et DSS CMT1B

génotype P0 P0+/mutation P0+/mutation

Modèles animaux

Phénotype sévère, moyen modéré à normaltype DSS type CMT1 type HNPP

génotype PMP22 PM22Trembler/Trembler PMP22+/Trembler KO PMP22+/–

PMP22+/Trembler-J

KO PMP22–/–

Tg PMP22

génotype Cx32 KO Cx32–/– KO Cx32–/–

génotype P0 KO P0–/– KO P0+/– KO P0+/–

autrefois regroupées sur la base de cri-tères cliniques et neuropathologiquessimilaires, se sont révélées être généti-quement hétérogènes. D’autres, clini-quement très différentes, ont pourorigine des mutations alléliques dumême gène. Un grand nombre deneuropathies ne sont pas encore défi-nies au niveau moléculaire. Il existed’autres locus, en particulier deslocus récessifs, associés à la CMT1 ouà la CMTX dont les gènes n’ont pasencore été identifiés [56]. Différentsmodèles animaux suggèrent que desfacteurs de transcription, Krox-20(m/s n° 1, vol. 11, p. 142) ou SCIP,pourraient être impliqués dans desaffections démyélinisantes [2, 20]. Denouvelles protéines ont aussi étédécouvertes dans la myéline, commerMAL (rat myelin and lymphocyte pro-tein), CD9, et la plasmolipine [2], oudans les régions paranodales, commela E-cadhérine, des canaux sodiqueset potassiques, des composants ducytosquelette comme l’actine F, laspectrine, l’ankyrine et des caténines[1]. Finalement, les neuropathiesdémyélinisantes pourraient être duesà l’altération de mécanismes agissantà différentes étapes : prolifération,différenciation et viabilité de la cel-lule de Schwann, interactions cellulede Schwann/axone, formation etmaintien de la myéline [1, 2] ■

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Remerciements

Les auteurs remercient D. Rodriguez etG. Pitiot pour la revue critique de ce manus-crit. A. Dautigny remercie le CNRS, le GREGet le MRE (contrat Biomed et ACCV), R. Bruz-zone remercie l’Institut Pasteur et l’AFM, pourleur soutien financier.

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1122 m/s n° 10, vol. 13, octobre 97

SummaryThree genes, four demyelinating peripheral neuropathies : first genotype/phenotype correlations

In most vertebrates, axons areusually ensheathed by myelin, amulti-lamellar structure that ensuresthe fidelity of nerve transmission andincreases considerably nerve conduc-tion velocity along the fibers. In theperipheral nervous system (PNS),myelin is formed by the extension ofthe plasma membrane of Schwanncells that wrap in spiral as many as50 layers of double membrane struc-tures around the axon. The myelinsheaths consist mostly of compactmyelin that expresses a distinct set ofstructural proteins, namely myelinprotein zero (P0), which is the mostabundant component, peripheralmyelin protein 22 (PMP22) and mye-

lin basic protein. PNS compact mye-lin is interrupted by regions filledwith cytoplasm, the incisures ofSchmidt-Lanterman. These and theparanodal regions of Schwann cellsexpress a distinct set of proteins thatinclude myelin-associated glycopro-tein and connexin 32 (Cx32). It hasnow been demonstrated that geneticabnormalities in the genes encodingPMP22, P0 and Cx32, are respon-sible for the vast majority of demyeli-nating peripheral neuropathies,known as Charcot-Marie-Toothdisease type 1, X-linked Charcot-Marie-Tooth, Déjerine-Sottas syn-drome, hereditary neuropathy withliability to pressure palsies and

congenital hypomyelination. PMP22is an integral membrane proteinwhose function is still poorly unders-tood. P0 is a cell adhesion proteinthat contributes a sort of adhesivetape that holds together the extracel-lular leaflets of compact myelin.Cx32 is a channel-forming proteinthat is thought to provide the basisfor a radial diffusional pathway ofsignaling molecules and metabolitesacross the myelin layers. Recent stu-dies on the molecular structure andcell biology of these three pivotalproteins for myelin homeostasis havebegun to shed light on some of thepathophysiological mechanisms thatare specific to each syndrome.