Travaux Pratiques de Culture Cellulaire – BTS Bioanalyses et contrôles

Estimation du choc oxydatif par le test MTT

1. Le choc oxydatif

Le stress oxydant ou choc oxydatif est engendré par la

présence de radicaux libres oxygénés. Expérimentalement,

il est induit par une exposition de 20 minutes à des

dilutions au ½ d’une solution de H2O2.

2. Protocole :

Par binôme, vous disposez d’une microplaque, dans laquelle

ont été déposés dans les puits 1 à 11, environ 5.103 cellules

(Lignée de cellules Véro en culture dans du milieu DMEM+2%

SVF).

Ces cellules ont été exposées à des concentrations

décroissantes de H2O2 tel qu’indiqué dans le tableau ci-

dessous.

La microplaque à 96 puits comporte 8 lignes (A à H), utiliser 2

lignes par personne.

Colonne 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Cellules +

milieu 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL

Milieu - - - - - - - - - - - 100 µL

Dilution

H2O2 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 0

H2O2 µM

final 0

Incubation 20 minutes à l’étuve à 37°C sous 5% de CO2

Remplacer par 100 µL de milieu neuf et incuber 24H à l’étuve à 37°C sous 5% de CO2

MTT

(A540-A690)

La solution d’H2O2 est une dilution au 1/100 de la solution

commerciale donnée à 11 volumes (c'est-à-dire que 1 litre de

cette solution libère 11 litres d’O2 dans les conditions

normales).

Calculer la concentration réelle en H2O2 dans chaque

puits.

Donnée : 2H2O2 = 2H2O + O2

Témoins : pour chaque ligne, le puits 12 est le blanc réactif. Il

ne contient pas de cellules mais 100 µL de milieu de culture ; le

puits 11 ne contient pas la substance à tester et correspondra à

la viabilité 100 %.

3. Numération cellulaire

Chaque puits a été inoculé à partir d’une dilution d’une

suspension de cellules Véro.

A partir de cette suspension, dénombrer en cellule de

Malassez le nombre de cellules totales et de cellules

viables par mL en présence d’éosine Y (dilution au 1/2)

Calculer la dilution à effectuer sur cette suspension

pour avoir 5.103 cellules dans les 100 µL déposés

dans chaque puits.

4. Test de viabilité au MTT

Traditionnellement, la détermination in vitro des effets toxiques de composés inconnus a été réalisée par comptage cellulaire après colorations vitale. Les méthodes alternatives utilisées comprennent la mesure de l’incorporation d’un radio-isotope afin d’estimer la synthèse d’ADN, le dénombrement

par des automates ainsi que des méthodes colorimétriques qui permettent d’évaluer l’activité cellulaire. Le MTT (bromure de 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-

diphenyltetrazolium) est un substrat chromogène réduit par

les déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes.

Introduire dans chaque puits 1/10 volume de MTT à 5

mg/mL et incuber les plaques pendant 1H à 1H30

(contrôler régulièrement l’accumulation du colorant

dans les cellules au microscope inversé).

Eliminer le surnageant et remplacer par 180 µL de DMSO pour solubiliser les cristaux de formazan, homogénéiser.

Mesurer l’absorbance à 540-570 nm (et éventuellement soustraire l’absorbance du bruit de fond mesurée à 690 nm).

Résultats :

- Compléter le tableau de travail

- Tracer : %viabilité= f(CH2O2),

- En déduire la CI50% de H2O2 vis-à-vis des cellules Véro.

- Conclure - A partir de recherches sur Internet, vous présenterez

l’origine et le devenir des radicaux libres dans les cellules en précisant le rôle de la SOD et de la peroxydase.

Résultats 27 et 29-01-2010 Dénombrement de la suspension cellulaire initiale : 3 mL de Trypsine pour reprendre une boîte à confluence de 75 cm², dilution au ½ en DMEM complet – distribution de 3 mL par groupe. Numération : dilution au ½ en éosine Y à 0,2 % (Bien remettre en suspension car les cellules s’agrègent)

cell/puits 447 895 1342 1790 2237 4474 4474

A 540 MTT

0,0365 0,0425 0,07 0,0715 0,083 0,1395 0,1785

A 540 Rouge neutre

0,059 0,1005 0,172 0,183 0,192

0,344

Matière d’œuvre Bio2

TP BCM – Culture cellulaire – test MTT

Une microplaque pour culture cellulaire par binôme ensemencée la veille avec des cellules Véro à partir d’une suspension cellulaire à environ 10

5 cellules / mL (Lignée de cellules Véro en culture dans du milieu DMEM+2% SVF) :

Cupule Volume de cellules en µL Volume de milieu en µL

1 10 90

2 20 80

3 30 70

4 40 60

5 50 50

6 100 0

7 100 0

Pour chaque plaque, ensemencer les lignes A, B, D et E.

Pour le groupe : 5 mL de suspension cellulaire en milieu complet (possibilité de trypsiner la veille et de garder les cellules au frigo)

Réactifs : o éosine Y à 0.2% en PBS 1 mL / étudiant o Solution de MTT à 5 mg/mL 250 µL / étudiant o DMSO 5 mL / étudiant o H2O2 à 11 volumes (3%) 1 mL / étudiant

Matériel : o Hématimètres de Malassez + lamelles planées + bassine avec Javel o Lecteur ELISA