1 STL- JPF- LEGTA AURILLAC

TP : CHROMATOGRAPHIE Chromatographie d’acides aminés sur papier

But du TP : -mettre en oeuvre une chromatographie sur couche mince (CCM)

- séparer et identifier les constituants d’un mélange d’acides aminés

I- Principe de la technique La chromatographie est une technique qui permet de séparer et d’identifier les

constituants d’un mélange.

Les solutés (ici les solutions d’acides aminés) sont déposés sur une phase stationnaire (ici le

papier). Il s’établit des liaisons faibles entre les molécules et la surface du papier: on dit que

les molécules sont adsorbées et on parle de chromatographie d’adsorption. Suivant la

polarité des solutés, la fixation sera plus ou moins forte.

Dans un deuxième temps, un solvant (ou éluant), constituant la phase mobile, migre par

capillarité le long du papier : il décroche et entraîne les solutés en commençant par les moins

fixés. Les vitesses d’entraînement des solutés sont différentes, et on peut séparer les

constituants d’un mélange, à condition de bien choisir l’éluant.

II- Mode opératoire

ATTENTION : manipuler avec des gants pour ne pas déposer sur le papier des acides aminés

présents sur la peau.

Préparation du papier On utilise du papier Whatman n°1 sous forme de rectangles de dimensions 10 x 12 cm

Préparation de l’éluant On utilise un solvant contenant (en pourcentage volumique) :butan-1-ol : 40% /acide acétique pur :

10% /eau : 50%

-Verser de ce solvant dans le bécher sur une hauteur de 2-3 mm. Recouvrir le bécher.

Dépôts -Prendre le papier dans le sens vertical

-Tracer au crayon de papier une ligne de dépôt horizontale à environ 1 cm du bas

-Matérialiser 6 croix régulièrement espacées sur cette ligne (à 2 cm du bord).

-Réaliser à l’aide de capillaires ou de piques à apéritif en bois (sans appuyer et après avoir

légèrement écrasé la pointe), les dépôts d’acides aminés (solutions à 0,01 mol.L-1) :

- Alanine ALa /Glycine Gly /Leucine Leu / Lysine Lys /Proline Pro /Mélange M

Développement

-Plier le papier de chaque côté sur 1cm pour qu’il ne s’affaisse pas dans le bécher.Placer le papier

dans le bécher et laisser migrer l’éluant jusqu’à 2 cm du bord supérieur

Révélation Les solutés étant incolores, il faut les faire apparaître par une réaction chimique. On utilise pour

cela la ninhydrine qui donne une coloration violette après réaction avec les acides aminés (sauf

avec la proline : couleur jaune).

-Sortir le papier

-Matérialiser au crayon de papier la ligne de front du solvant.

-Sécher le papier, éventuellement à l’aide d’un sèche-cheveux.

-Pulvériser la ninhydrine sous la hotte.

-Placer la plaque à l’étuve à 80°C pendant quelques minutes.

-Analyser le chromatogramme obtenu, identifier les constituants du mélange et calculer le

rapport frontal de chaque tache de migration (Rf= distance parcourue par la substance (au centre

de la tache) / distance parcourue par le solvant).

Le rapport frontal Rf est caractéristique d’une substance donnée dans un solvant donné.