thèse : développement d un protocole métrologique … · remerciements le travail que j’ai le...
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Université de Pau et des Pays de l’Adour Ecole Doctorale des Sciences Exactes et de leurs Applications
N°__________
THESE
pour obtenir le grade de
DOCTEUR
Spécialité : Environnement et Matériaux
présentée et soutenue le 6 mai 2009 par
Sébastien SANNAC
DEVELOPPEMENT D’UN PROTOCOLE METROLOGIQUE POUR
L’ANALYSE DE SPECIATION DU SELENIUM ET DU MERCURE D ANS
DES MATRICES ENVIRONNEMENTALES ET AGROALIMENTAIRES
PAR HPLC-ID-ICP-MS
Directrices de thèse : Pr. Martine POTIN-GAUTIER, Pr. Florence PANNIER
JURY
M J.I. Garcia-Alonso, Rapporteur Professeur (Université d’Oviedo, Espagne)
Mme M.F. Grenier-Loustalot, Rapporteur Directrice de recherche au CNRS (Valbonne-Sophia-Antipolis)
M O.F.X. Donard Directeur de recherche (Université de Pau et des Pays de
l’Adour)
M S. Wunderli Responsable de laboratoire (METAS, Suisse)
Mme P. Fisicaro Responsable du Département Biomédical et Chimie Inorganique
(LNE, Paris)
M G. Labarraque Docteur Ingénieur (LNE, Paris)
Mme F. Pannier Professeur (Université de Pau et des Pays de l’Adour)
Mme M. Potin-Gautier Professeur (Université de Pau et des Pays de l’Adour)
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Remerciements
Le travail que j’ai le plaisir de vous présenter au travers ce manuscrit est le fruit de nombreuses contributions. Il est délicat de réussir à démontrer la traçabilité de chaque participation individuelle, surtout en considérant l’incertitude associée à la mémoire humaine sur une période de trois années, cependant j’aimerai essayer. Tout d’abord, je tiens à remercier les personnes à l’origine de ce projet : Olivier Donard, Martine Potin-Gautier, Florence Pannier, Cédric Rivier et Guillaume Labarraque. Merci d’avoir créé l’opportunité de travailler sur un sujet aussi intéressant. La direction de ces travaux n’a pas toujours été facilitée au vu de la distance Pau-Paris, aussi j’aimerai souligné le sérieux et l’efficacité avec lesquels les recherches ont été encadrées, merci donc à Martine Potin-Gautier, Florence Pannier, Paola Fisicaro et Guillaume Labarraque pour cela. Merci aussi pour la confiance qu’ils ont placée en moi et surtout pour l’accompagnement qu’ils ont pu me fournir aux cours de ces trois années. Je n’oublierai pas de sitôt tout ce que vous avez pu m’apporter et j’en garderai une éternelle reconnaissance. De par leur fonction, certaines personnes ont contribué avec une plus grande distance à ces travaux. Cependant, leur importance n’en est pas atténuée, merci donc à Gilles Hervouet d’avoir contribué à la tenue de ses recherches au sein du LNE et merci à Sophie Vaslin-Reimann pour avoir pris le suivi en cours de route, tout en assurant que l’on arrive à bon port. Je voudrai également remercié les responsables du LCABIE, Olivier Donard et Martine Potin-Gautier, pour m’avoir offert la chance de travailler dans leur laboratoire. Mes remerciements vont aussi aux membres du jury qui ont accepté d’évaluer ce travail : Marie-Florence Grenier Loustalot, Jose-Ignacio Garcia-Alonso et Samuel Wunderli. Merci pour le temps consacré à la lecture de ce manuscrit et merci également de venir donner votre appréciation. En particular, querré agradecido Jose-Ignacio Garcia-Alonso para tener evaluar este trabajo escrito en francés. Au cours de ces trois années de thèse entre le LCABIE et le LNE, j’ai eu la chance de rencontrer un nombre considérable de personnes issues des deux laboratoires. Beaucoup m’ont permis d’avancer et de progresser aussi je tiens à les remercier également ici. J’espère qu’elles m’excuseront de ne pas les nommer, leur nombre et la peur d’un oubli m’ont fait renoncer à cet exercice. Je fait seulement une exception en la personne de Caroline Oster. Sa présence au LNE lors de mon arrivée sur Paris m’a été d’une grande aide pour mon intégration. Ces travaux n’aurait pas du tout eu la même valeur sans ses nombreux conseils, avis et coups de main. Et puis aussi merci pour la bonne humeur que tu peux apporter au sein d’une équipe. Je tenais aussi à remercier les amis palois (Alex, Christel, Béné, Julien, Xav, Tof, Ben, Fred, Sim…), toujours présents lors d’un retour au pays, mais également ceux de la capitale (Aymeric, Willy, Mathias, Thierry, Romain, Eve…) sans qui je n’aurais pas autant apprécié la vie parisienne. Je souhaitais également remercier ma Mère et l’ensemble de ma famille (de Porto à Londres, en passant par Pau, Paris, et tous les lieux où l’on puisse trouver un Sannac, un Cardoso ou apparenté). Ils ont tous contribué à faire de moi ce que je suis aujourd’hui et m’ont toujours soutenu pour me permettre d’accomplir ces travaux. Je voudrai simplement terminer en remerciant Sophie, d’abord pour avoir réussi à me supporter au cours de ces derniers mois, mais surtout pour avoir été à mes côtés dans cette étape. Merci à vous tous.
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Sommaire
Remerciements............................................................................................................................... 3
Sommaire ....................................................................................................................................... 5
Glossaire ........................................................................................................................................ 9
Introduction Générale ................................................................................................................... 15
Chapitre I : Définitions du contexte de l’étude ............................................................................... 21
1 La métrologie ..................................................................................................................... 23
1.1 Définition ..................................................................................................................... 23
1.2 Intérêts de la métrologie.............................................................................................. 25
1.3 Organisation de la métrologie...................................................................................... 26
1.4 Méthodes primaires pour la quantité de matière.......................................................... 31
1.5 Calcul de l’incertitude .................................................................................................. 34
2 L’analyse de spéciation ...................................................................................................... 37
2.1 Définition ..................................................................................................................... 37
2.2 Intérêts ........................................................................................................................ 37
2.3 Démarche ................................................................................................................... 38
3 Métrologie appliquée à l’analyse de spéciation................................................................... 40
Chapitre II : Synthèse bibliographique........................................................................................... 43
1 Le sélénium........................................................................................................................ 45
1.1 Généralités.................................................................................................................. 45
1.2 Occurrence dans l’environnement ............................................................................... 47
1.3 Effets sur la santé humaine ......................................................................................... 49
1.4 Supplémentation alimentaire en sélénium ................................................................... 51
1.5 Protocoles d’analyses ................................................................................................. 57
1.6 Bilan et choix analytiques ............................................................................................ 73
2 Le mercure......................................................................................................................... 74
2.1 Généralités.................................................................................................................. 74
2.2 Occurrence dans l’environnement ............................................................................... 77
2.3 Effet sur la santé humaine........................................................................................... 81
2.4 Evaluation du risque lié aux produits de la pêche........................................................ 82
2.5 Protocoles d’analyses ................................................................................................. 83
2.6 Bilan et choix analytiques ............................................................................................ 93
Chapitre III : Mise en place des méthodes .................................................................................... 97
1 Instrumentation .................................................................................................................. 99
1.1 Four à micro-ondes ..................................................................................................... 99
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1.2 HPLC .......................................................................................................................... 99
1.3 ICP-MS ..................................................................................................................... 100
2 Réactifs et étalons............................................................................................................ 102
3 Optimisation du couplage HPLC-ICP-MS ......................................................................... 104
3.1 Séparation des espèces séléniées ............................................................................ 104
3.2 Séparation des espèces mercurielles ........................................................................ 108
3.3 Détection................................................................................................................... 111
4 Double dilution isotopique ................................................................................................ 120
4.1 Principe ..................................................................................................................... 120
4.2 Spécificités................................................................................................................ 121
5 Calcul d’incertitude ........................................................................................................... 123
6 Traçabilité de l’analyse..................................................................................................... 127
Chapitre IV : Applications aux analyses de spéciation du sélénium ............................................ 129
1 Analyses des levures ....................................................................................................... 131
1.1 Optimisation de l’extraction sur LevTest .................................................................... 131
1.2 Analyses de la levure SELM-1 et de l’échantillon de CCQM-P86 .............................. 138
2 Analyses des farines de blé.............................................................................................. 156
2.1 Farine de Kamut........................................................................................................ 156
2.2 Echantillon de farine de la CCQM-K60 ...................................................................... 160
3 Conclusions sur l’analyse du sélénium............................................................................. 169
Chapitre V : Applications aux analyses de spéciation du mercure............................................... 173
1 Analyses des Matériaux de Références Certifiés lyophilisés ............................................ 175
1.1 Traitement de l’échantillon......................................................................................... 176
1.2 Mise en place des protocoles métrologiques ............................................................. 180
2 Analyses des Matériaux de Références Certifiés frais...................................................... 192
2.1 Traitement de l’échantillon......................................................................................... 192
2.2 Mise en place des protocoles métrologiques ............................................................. 194
3 Conclusions sur l’analyse du mercure .............................................................................. 199
Conclusion générale ................................................................................................................... 203
Références ................................................................................................................................. 209
Annexes...................................................................................................................................... 235
Annexe 1 : Revue bibliographique des séparations par HPLC-ICP-MS avec appariements d’ions
pour l’analyse des espèces de sélénium ................................................................................. 237
Annexe 2 : Revue bibliographique des séparations par HPLC-ICP-MS avec échange d’ions pour
l’analyse des espèces de sélénium ......................................................................................... 243
Annexe 3 : Revue bibliographique des séparations par HPLC-ICP-MS pour l’analyse des
espèces de mercure................................................................................................................ 253
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Annexe 4 : Exemple d’un calcul d’incertitude obtenu avec Wincert.......................................... 261
Annexe 5 : Equations de la déconvolution des profils isotopiques ........................................... 271
Annexe 6 : Publications et communications sur ces travaux de thèse ..................................... 279
Glossaire
Techniques analytiques :
AX : Anion eXchange ; chromatographie d’échange d’anions
CC : Chiral Chromatography ; chromatographie chirale
CX : Cation eXchange ; chromatographie d’échange de cations
DI : Dilution Isotopique
ESI : ElectroSpray Ionisation ; ionisation par électrospray
GC : Gaz Chromatography ; Chromatographie en phase gazeuse
HPLC : High Performance Liquid Chromatography ; Chromatographie Liquide Haute Performance
ICP-MS : Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry ; spectrométrie de masse à couplage
inductif du plasma
IP-RP : Ion Pair - Reverse Phase ; chromatographie de phase inverse avec appariement d’ions
IX : Ion eXchange ; chromatographie d’échange d’ions
LD : Limite de Détection
MS : Mass Spectrometry ; spectrométrie de masse
RP : Reverse Phase ; chromatographie de phase inverse
SEC : Size Exclusion Chromatography ; Chromatographie d’exclusion stérique
SS-ID : Species Specific Isotope Dilution ; dilution isotopique par espèce marquée
Composés chimiques :
Espèces séléniées :
DMeDSe : Diméthyl-diséléniure
DMeSe : Diméthyl-séléniure
γγγγ-glutamyl-CH 3SeCys : γ-glutamyl-Se-méthyl-sélénocystéine
GPx : Glutathiones peroxydases
GSSeSG : sélénodiglutathione
MeSeCys : Se-méthyl-sélénocystéine
Se : sélénium
SeCys : sélénocystéine
SeCys 2 : sélénocystine
SeEt : sélénoéthionine
SeIV : sélénite, SeO32-
SeMet : sélénométhionine
SeVI : séléniate, SeO42-
TMeSe+ : ion triméthylsélénonium
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Espèces mercurielles :
EtHg+ : éthylmercure
Hg : mercure
Hg0 : mercure élémentaire
MeHg+ : méthylmercure
Me2Hg : diméthylmercure
PhHg+ : phénylmercure
Autres :
1-BS : 1-butanesulfonate de sodium
2-ME : 2-mercaptoéthanol
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
ARN : Acide RiboNucléique
CHAPS : 3-[(3-cholamidopropyl)-diméthylammonio]-1-propane sulfonate
HFBA :Hepta-FluoroButyric Acid ; acide heptafluorobutyrique
L-Cys : L-cystéine
MeOH : méthanol
MeSA : Methyl Sulfonic Acid, acide méthane-sulfonique
PFPA : Penta-FluoroPropionic Acid, acide pentafluoropropionique
PS5 : pentane sulfonate de sodium
SDS : Sodium Dodecyl-Sulfate ; dodécylsulfate de sodium
TBAH : Tetra-Butyl Ammonium Hydroxide ; hydroxyde de tétra-butyl ammonium
TEAH : Tetra-Ethyl Ammonium Hydroxide ; hydroxyde de tétra-éthyl ammonium
TFA : Tri-Fluoroacetic Acid ; acide trifluoroacétique
TMAH : Tetra-Methyl Ammonium Hydroxide ; hydroxyde de tétra-méthyl ammonium
Tris : Tris-(hydroxyméthyl)aminométhane.
Agences, organismes ou comités :
AFSSA : Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments
AIT : Applied Isotope Technologies
ATSDR : Agency for Toxic Substance and Disease Registry ; agence d’enregistrement des
substances toxiques et des maladies
BIPM : Bureau International des Poids et Mesures
BIPEA : Bureau InterProfessionnel d'Etudes Analytiques
CCQM : Comité Consultatif pour la Quantité de Matière
CGPM : Conférence Générale des Poids et Mesures
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CIPM : Comité International des Poids et Mesures
EFSA : European Food Safety Authority ; autorité européenne de sécurité des aliments
FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations ; organisation des Nations Unies
pour l'alimentation et l'agriculture
IAEA : International Atomic Energy Agency ; agence internationale de l'énergie atomique
INERIS : Institut National de l'EnviRonnement industriel et des rISques
INM : Institut National de Métrologie
IUPAC : International Union of Pure and Applied Chemistry ; union internationale de chimie pure et
appliquée
MRA : Mutual Recognition Arrangement ; arrangement de reconnaissance mutuelle
NAS : National Academy of Sciences ; académie nationale américaine des sciences
NIST : National Institut of Standards and Technology ; institut national de métrologie américain
NRCC : National Research Council Canada ; conseil national de recherches Canada
SCF : Scientific Committee for Food ; comité scientifique pour les aliments de la commission
européenne
US-EPA : United States Environmental Protection Agency ; agence américaine pour la protection
de l’environnement
WHO : World Health Organisation ; organisation mondiale de la santé
Divers :
CMC : Calibration and Measurement Capability ; capacité de mesure et d’étalonnage
COMAR : COde d’indexation des MAtériaux de Référence
CRM : Certified Reference Material ; matériau de référence certifié
DHTP : Dose Hebdomadaire Tolérable Provisoire
GUM : Guide to the expression of Uncertainty in Measurement ; guide pour l’expression de
l’incertitude de mesure
HIV : Human Immunodeficiency Virus ; virus de l'immunodéficience humaine
PEEK : Poly-Ether-Ether-Ketone ; poly-éther-éther-cétone
REACH : Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals ; enregistrement,
évaluation et autorisation des substances chimiques
ROHS : Restriction of the use of certain Hazardous Substances in electrical and electronic
equipment ; restriction de l'utilisation de certaines substances dangereuses dans les équipements
électriques et électroniques
SI : Système International des unités
tR : temps de rétention
UV : rayonnement Ultra-Violet
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Notation :
(A)ech : abondance naturelle de l’isotope A dans l’échantillon
(A)eta : abondance naturelle de l’isotope A dans l’étalon
(A)sp : abondance de l’isotope A dans l’étalon marqué
(B)ech : abondance naturelle de l’isotope B dans l’échantillon
(B)eta : abondance naturelle de l’isotope B dans l’étalon
(B)sp : abondance de l’isotope B dans l’étalon marqué
Ci : fraction de masse de la forme i
Ccert : concentration certifiée de l’analyte dans un CRM
Céch : concentration de l’analyte dans l’échantillon
Ceta : concentration de la solution étalon
Csp : concentration de l’analyte dans l’étalon marqué
∆∆∆∆M i : différence entre la masse molaire de l’isotope i et la masse molaire de l’isotope de référence
EN : écart normalisé
f : équation mathématique de Cech
fSe : facteur de formation d’hydrures
h : humidité de l’échantillon
I corrigée : intensité corrigée
I mesurée : intensité mesurée iI : intensité mesurée par l’appareil à m/z=i
K : biais en masse
k : facteur d’élargissement
LD : Limite de détection
méch : prise d’essai de l’échantillon
meta : prise d’essai de la solution étalon
mSe : masse de sélénium
mspd : masse de l’étalon marqué pour la dilution directe
mspi : masse de l’étalon marqué pour la dilution inverse
p : pente
P(xi) : poids du paramèrte xi sur l’inceritude composée
R : rendement d’extraction
Rd : rapport isotopique pour la dilution isotopique directe
Ri : rapport isotopique pour la dilution isotopique inverse
Ricorr : rapport isotopique corrigé entre la masse i et la masse de l’isotope de référence
Riexp : rapport isotopique mesuré entre la masse i et la masse de l’isotope de référence
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Rs : rapport isotopique mesuré au sein de l’échantillon
Rstd : rapport isotopique issu de la mesure faîte sur une solution étalon
Rithéo : rapport isotopique théorique entre la masse i et la masse de l’isotope de référence,
s : écart-type iSe : intensité corrigée pour m/z=i.
[Se]tot : concentration en sélénium de l’échantillon
t : coefficient de Student
ττττ : temps mort du détecteur
U : incertitude élargie
u(Ccert) : incertitude-type de Ccert
u(Cech) : incertitude-type de Cech
unat : incertitude-type associée la variabilité naturelle des isotopes
us : incertitude-type associée à Rs
ustd : incertitude-type associée à Rstd
u(xi) : incertitude-type du paramètre xi
V(Cech) : variance de Cech
xi : paramètre i
zapp : charge apparente
zi : charge de la forme i
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Introduction Générale
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Le développement d’un organisme vivant est en grande partie influencé par les substances qu’il
puise dans son environnement. Leur présence et leur disponibilité sont corrélées aux cycles bio-
géochimiques établis au cours des lentes évolutions qu’a connues la Terre au fil des âges.
Cependant, l’augmentation des activités humaines depuis les premières révolutions industrielles a
perturbé ces équilibres par des rejets massifs de composés chimiques. En particulier, les éléments
traces modifient leurs effets sur les écosystèmes à partir de faibles variations de leur
concentration. Il est donc primordial de pouvoir étudier et élucider les mécanismes qui régissent
leur comportement pour pleinement appréhender les risques qui leur sont associés.
La compréhension de l’impact d’un élément dans l’environnement passe par le développement
d’analyses capables de détecter et de quantifier sa présence. La détermination de sa
concentration totale est la première étape de l’analyse. Cependant, cette grandeur n’est pas
suffisante pour clairement élucider les mécanismes d’action. L’étude de la répartition de ses
formes chimiques, définie par l’Union Internationale de Chimie Pure et Appliquée (IUPAC) sous le
terme d’« analyse de spéciation », permet d’améliorer la connaissance de son impact et de son
devenir. En effet, les dispositifs d’accumulation, d’incorporation, d’expulsion ou de stockage d’un
élément au sein d’un organisme sont dépendants des espèces chimiques mises en jeu. Pour ces
raisons, leurs identification et la mesure de leur quantité sont devenues des besoins essentiels
dans les études environnementales, agroalimentaires ou de santé publique.
Les analyses de spéciation font appel à une procédure complexe avant d’aboutir à un résultat.
Leur démarche peut se résumer en quatre étapes essentielles :
i) l’échantillonnage et le prélèvement d’une fraction représentative de la cible de l’étude ;
ii) le traitement de l’échantillon pour permettre l’extraction des analytes sous leur forme
originelle et les obtenir dans un état compatible avec la technique analytique retenue ;
iii) la séparation et l’isolement de chaque espèce issue de l’échantillon ;
iv) l’identification et ou la mesure de la quantité d’analyte.
Ces différentes phases demandent l’application de nombreux traitements sur l’échantillon ou sur
son extrait. De plus, chaque étape doit être quantitative, ne pas apporter de contamination et ne
pas modifier les équilibres des espèces et leur spéciation originelle. Dès lors, il est possible
qu’apparaissent des biais inhérents aux techniques et méthodes utilisées et, au final, des
questions quant à la justesse des résultats peuvent être soulevées.
Avec l’évolution de la législation européenne (règlement REACH, directive RoHS…), la notion de
la spéciation des métaux et des métalloïdes commence à être prise en compte par les pouvoirs
publics et des besoins en métrologie légale devraient apparaître au cours des prochaines années.
La bonne application de ces nouveaux règlements et directives dépend avant tout de la fiabilité
des mesures et des contrôles qu’ils imposent. En effet, les prises de décisions dans ces contextes
sont souvent suivies d’impacts lourds, qu’ils soient sociétaux avec des conséquences sur la santé
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et la sécurité publique ou qu’ils soient économiques avec des répercutions pour les entreprises. Il
est donc nécessaire d’assurer la fiabilité des expertises requises par la législation pour permettre
une prise de décision correcte en toute connaissance de cause.
Les principaux outils à la disposition des laboratoires d’analyses et de contrôles pour démontrer la
qualité des mesures sont les matériaux de références certifiés (CRMs) et la participation à des
intercomparaisons. Cependant, ces dispositifs manquent bien souvent eux-mêmes de validation et
leur traçabilité au Système International des unités (SI) n’est pas toujours assurée. Pour pallier ces
difficultés, des méthodes de mesures dites « primaires » doivent être développées afin de disposer
de valeurs de références directement reliées au SI. Dans l’organisation actuelle du maintien de la
stabilité des unités, à travers le Bureau International des Poids et Mesures (BIPM), il est du ressort
des Instituts Nationaux de Métrologie (INMs) de développer des méthodes primaires de mesure et
de les utiliser pour la dissémination de la traçabilité jusqu’aux utilisateurs.
Le Laboratoire National de Métrologie et d’Essais (LNE) assure le pilotage de la métrologie
française. Dans le cadre de la quantité de matière, le LNE a décidé de mettre en place des
méthodes primaires appliquées à l’étude de la spéciation des métaux et métalloïdes dans des
matrices environnementales et agroalimentaires. Bien que depuis plusieurs années des méthodes
soient développées dans ce laboratoire pour l’analyse en concentrations totales des métaux et
celles des composés organiques (pesticides, hydrocarbures aromatiques polycycliques…), le LNE
ne disposait pas des techniques et de la méthodologie nécessaires pour mener des analyses de
spéciation. Ce projet a donc été conduit en collaboration avec le Laboratoire de Chimie Analytique,
Bio-Inorganique et Environnement (LCABIE) de l’Université de Pau et des Pays de l’Adour,
reconnu pour ses compétences dans le domaine des analyses de spéciation.
La première étape du travail de thèse a donc consisté à mettre en œuvre au sein du LNE les
techniques pour réaliser des analyses de spéciation. Une fois mise en place et maîtrisée, la
méthode a été premièrement appliquée au sélénium. Du fait de ses propriétés bénéfiques
supposées, cet élément entre dans la composition de plusieurs types de compléments
alimentaires commercialisés en Europe. La directive européenne N°2002/46/CE fait état des
substances pouvant être utilisées lors de leur fabrication. De par les procédés employés pour la
fabrication de certains compléments, les espèces initiales se retrouvent rarement dans le produit
fini et de nouvelles formes peuvent être rencontrées en sortie de fabrication. Il est donc essentiel
de disposer d’une méthode pouvant caractériser des espèces de sélénium dans ce type
d’échantillons sachant que selon leur concentration, certaines peuvent se révéler bénéfiques ou
nocives et impacter la santé humaine.
Le second élément pris en considération dans la suite de l’étude a été le mercure. Ce métal, sous
la forme de méthylmercure, se révèle être un perturbateur du développement cérébral chez le
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nourrisson et peut provoquer des troubles neurologiques chez l’adulte. Dans le cadre du règlement
européen N°466/2001, un seuil maximal de contaminat ion des produits de la pêche, qui
représentent une des voies principales de l’exposition des populations, a été fixé en concentration
totale de cet élément. Afin d’anticiper une évolution de la législation vers une prise en compte la
forme méthylée du mercure, l’analyse de cette espèce a été réalisée dans ce type de matrices.
Pour chacun de ces éléments, l’objectif final de l’étude était de disposer, au sein du LNE, de
procédures de mesures de référence pour leur analyse de spéciation. Ces procédures se devaient
d’être dûment validées et évaluées pour permettre d’assurer le raccordement du résultat avec le
Système International des unités. Une fois ces méthodes développées, le LNE sera en mesure de
fournir des valeurs de références traçables au SI pour ces analytes lors d’intercomparaisons ou
dans le cadre de la certification de matériaux.
Le document de thèse s’articule autour de cinq chapitres. Le premier pose les définitions des deux
notions clés du sujet : métrologie et analyse de spéciation. Dans un premier temps l’apport de la
science de la mesure dans les systèmes d’estimation des grandeurs, son organisation à travers la
Convention du Mètre et sa mise en pratique au sein du BIPM et des Instituts Nationaux de
Métrologie sont présentés. La méthode primaire relative à la mesure de la quantité de matière des
éléments traces, la dilution isotopique, est également exposée puis discutée. Dans un second
temps, l’analyse de spéciation est détaillée pour démontrer de l’intérêt croissant porté par les
laboratoires de recherches sur ce domaine.
Le deuxième chapitre regroupe une revue bibliographique portant sur les propriétés générales des
éléments de l’étude et des méthodes spécifiques utilisées par les laboratoires de recherche. La
présentation des choix analytiques effectués pour chaque élément est également exposée.
Le troisième chapitre porte sur la mise en place du couplage HPLC-ICP-MS pour réaliser l’analyse
de spéciation des deux éléments. Il présente en les justifiant les méthodes analytiques
employées : séparation des espèces sur des étalons, détection dans l’optique de mener une
dilution isotopique, mise en place d’un protocole métrologique et termine par le calcul des
incertitudes de mesure.
Les deux derniers chapitres sont consacrés respectivement à chacun des deux éléments de
l’étude. Ils regroupent les développements spécifiques pour les échantillons étudiés. Une fois tous
les protocoles analytiques établis, la mise en pratique s’est effectuée sur des matrices certifiées,
représentatives d’échantillons réels. L’apport métrologique est aussi présenté pour chaque
élément par le calcul des différentes incertitudes de mesures, la validation de méthode et la
démonstration de leur traçabilité au SI.
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Chapitre I : Définitions du contexte de
l’étude
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1 La métrologie
1.1 Définition
De tout temps, les Hommes ont cherché des moyens pour évaluer et comprendre leur
environnement. Une solution a été de comparer les éléments entre eux : rapportant, confrontant et
quantifiant les propriétés d’un phénomène avec des références qu’ils connaissaient.
Ce besoin de mesurer se situe à la base de la pratique de toute démarche scientifique puisque
pour comprendre un phénomène il est important avant tout de pouvoir le quantifier, lui ou ses
effets. Cependant, pour permettre l’interprétation à travers des mesures, il faut pouvoir donner une
information quantitative des événements en reliant ces indications aux mêmes références pour
obtenir des résultats comparables. L’étude et la recherche de la comparabilité des données
définissent les raisons de la métrologie.
Dans la normalisation du vocabulaire (ISO 2007), la métrologie découle du concept de
« mesurage », ou plus familièrement de la « mesure ». Cette notion se rattache à l’action de
mesurer qui elle-même est définie comme le processus visant à obtenir expérimentalement une
valeur qu’il est raisonnable d’attribuer à un phénomène ; ce phénomène possédant bien sûr la
propriété d’être quantifiable. L’étude des mécanismes et des moyens utilisés pour effectuer une
mesure se définit comme étant la métrologie. Elle comprend donc tous les aspects théoriques et
pratiques des mesurages quel que soit le domaine d’application. Son but final est de pouvoir
assurer la comparabilité des résultats entre eux en les reliant à une même et unique référence ; en
d’autre termes d’assurer leur traçabilité métrologique.
La métrologie se divise en trois catégories d’applications ayant chacune ses spécificités en termes
de complexité et d’exactitude.
Le qualificatif de « fondamentale » ou de « scientifique » est employé lorsque sa mission s’attache
à développer, faire reconnaître et améliorer les unités du Système International (SI). Le SI
s’articule autour de sept unités fondamentales (Tableau 1). De celles ci découle les unités dérivées
qui s’expriment en produit de puissances des unités de base. Le développement d’étalons de
références permet le maintien et le transfert aux utilisateurs de ces unités.
La métrologie « industrielle » a pour rôle d’assurer un fonctionnement adéquat des instruments de
mesures utilisés dans les entreprises. Le raccordement de ces appareils à des étalons,
l’étalonnage, améliore la maîtrise des procédés de fabrication et la garantie de la qualité des
produits.
24
La métrologie « légale » recouvre l'ensemble des dispositions réglementaires mises en place par
les pouvoirs publics pour garantir la qualité des instruments de mesure et des méthodes utilisées.
Elle est appliquée aux domaines la de santé, du risque public ou des transactions économiques.
Tableau 1: Unités de base du système international (BIPM 2006)
Mètre (m) Le mètre est la longueur du trajet parcouru dans le vide par la lumière pendant
une durée de 1/299 792 458 de seconde.
Kilogramme (kg)
Le kilogramme est la masse du prototype en platine iridié qui a été sanctionné
par la Conférence Générale des Poids et Mesures tenue à Paris en 1889 et qui
est déposé au Bureau International des Poids et Mesures.
Seconde (s)
La seconde est la durée de 9 192 631 770 périodes de la radiation
correspondant à la transition entre les deux niveaux hyperfins de l'état
fondamental de l'atome de césium 133.
Ampère (A)
L'ampère est l'intensité d'un courant électrique constant qui, maintenu dans deux
conducteurs parallèles, rectilignes, de longueur infinie, de section circulaire
négligeable et placés à une distance de un mètre l'un de l'autre dans le vide,
produirait entre ces conducteurs une force de 2.10-7 newton par mètre de
longueur.
Kelvin (K) Le kelvin est la fraction 1/273,16 de la température thermodynamique du point
triple de l'eau
Candela (cd)
La candela est l'intensité lumineuse, dans une direction donnée, d'une source
qui émet un rayonnement monochromatique de fréquence 540.1012 hertz et dont
l'intensité énergétique dans cette direction est 1/683 watt par stéradian.
Mole (mol)
La mole est la quantité de matière d'un système contenant autant d'entités
élémentaires qu'il y a d'atomes dans 0,012 kilogramme de carbone 12.
Lorsqu’on emploie la mole, les entités élémentaires doivent être spécifiées et
peuvent être des atomes, des molécules, des ions, des électrons, d’autres
particules ou des groupements spécifiés de telles particules.
Concrètement, la mise en pratique de la métrologie s’articule autour de deux notions
fondamentales pour permettre in fine la comparabilité des mesures. La première est la
détermination d’une indication quantitative sur la qualité d’un mesurage. Celle ci s’effectue par la
caractérisation de la dispersion des valeurs attribuées à un mesurande, c’est à dire le calcul de
l’incertitude de mesure (ISO 2007).
L’une de ses première définition faisait état d’une erreur associée au résultat (NF X 07-001 1970).
Ce n’est qu’à partir de 1984 (NF X 07-001 1984) que l’incertitude est devenue un « intervalle
contenant la valeur vraie » et n’a plus traduit une erreur de mesure, qui elle se définit comme « la
25
différence entre la valeur mesurée d’une grandeur et une valeur de référence » (ISO 2007). Ceci
explique pourquoi, encore de nos jours, il est fréquent de voir l’association des termes incertitude
et erreur (Drosg 2007).
La seconde notion propre à toute démarche en métrologie est la traçabilité. Elle s’effectue à
travers le raccordement d’une mesure à une référence via une chaîne ininterrompue d’étalonnages
dont chacun contribue à l’incertitude de mesure (ISO 2007). Contrairement à l’incertitude qui doit
être calculée, la traçabilité est une propriété du résultat qui se démontre (Quevauviller 2004).
Ces deux notions sont complémentaires car pour assurer la traçabilité d’une valeur, il est
nécessaire de calculer son incertitude, et pour comparer des résultats au moyen de leur incertitude
il faut que ces résultats soient traçables à la même référence.
1.2 Intérêts de la métrologie
Pour comprendre l’intérêt de la métrologie, il faut s’interroger sur les occasions qui demandent
qu’un mesurage soit réalisé. Celles ci sont multiples ; que ce soit en science, dans les échanges
économiques, ou dans la vie au quotidien, il est difficile d’imaginer une circonstance qui ne fasse
pas appel à une mesure. Ceci se traduit dans les économies européennes où la valeur marchande
des mesures réalisées atteint 6% de la somme des Produits Nationaux Bruts (Euramet 2008). Il
est ainsi compréhensible qu’une simple mesure ne soit pas suffisante et que sa traçabilité à des
références connues soit une condition indispensable.
En observant la métrologie suivant ses trois catégories, il est possible de dégager leur intérêt
propre :
- la métrologie fondamentale accroît la connaissance : elle permet de concevoir les conditions
d'observation d'un phénomène, de construire et qualifier les instruments de son observation, et
d'établir si les résultats obtenus sont significatifs,
- la métrologie industrielle améliore la compétitivité des entreprises : celle ci passe par la qualité
d'un produit, qui est son aptitude à satisfaire les besoins des consommateurs et utilisateurs.
Cette qualité peut être démontrée aux clients au moyen de la certification. De plus la
compétitivité suppose que l'industrie mesure et maîtrise finement les volumes et les
performances de l'appareil de production, tout en minimisant les coûts des rebuts et retouches,
- la métrologie légale protège les personnes (sécurité alimentaire, routière, protection de
l'environnement…) et régit les transactions (essence à la pompe ou sur oléoduc, pesage au
détail ou à la cargaison...).
Dans le domaine de la chimie, la métrologie permet également de valider des méthodes
d’analyses. En effet dans ce domaine particulier, les mesures à réaliser ne sont pas directement
accessibles et, le plus souvent, de nombreux traitements doivent être appliqués sur l’échantillon
26
pour libérer l’analyte. Des biais peuvent ainsi affecter la justesse de la mesure. Il est donc
essentiel en chimie analytique d’utiliser la métrologie pour s’assurer de la validation des protocoles
d’analyse. La Figure 1 illustre cette nécessité de validation des méthodes avec les résultats d’une
comparaison de mesures réalisées par plusieurs laboratoires sur la concentration en sélénium
total dans un même échantillon d’eau. Les résultats montrent une grande dispersion et de
l’analyse statistique des résultats il ressort une grande plage de concentrations tolérées pour la
valeur réelle (allant du simple au double).
Eau d'alimentation (BIPEA)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 10 20 30 40 50 60Laboratoire
Se
µg/l
Figure 1 : Résultats d'une intercomparaison organis ée par le Bureau InterProfessionnel d'Etudes
Analytiques (BIPEA) sur le dosage du sélénium dans une eau d’alimentation – les barres
horizontales représentent les tolérances issues de l’analyse statistique des données
1.3 Organisation de la métrologie
Pour permettre une comparabilité des données, il est nécessaire d’utiliser des références uniques
à travers le monde. Une organisation internationale fut érigée afin de garantir le développement et
le maintien des références : le Bureau International des Poids et Mesures (BIPM).
1.3.1 Bref historique
Les premières unités trouvaient leur origine en référence avec le corps humain ou la nature (pied,
coudée, grain …). Elles étaient souvent complexes à utiliser de par le manque de relation simple
entre subdivisions d’une grandeur et ne permettaient aucune comparaison de par un défaut
d’homogénéité dans les références (de Talleyrand 1790, BNM 2004).
Les premières réflexions sur une réforme et l’universalité d’un système de mesure sont apparues
dès le début du XVIIIe siècle dans plusieurs pays d’Europe. En France, la loi du 1er août 1793 a
27
instauré les bases d’un système décimal pour les subdivisions des unités. Cependant,
l'établissement véritable du système métrique décimal a été promulgué par la loi du 7 avril 1795
avec la création du mètre étalon en platine et l’édition de la nouvelle nomenclature des unités
comprenant le gramme, le mètre et leur préfixe associés. En raison des instabilités politiques de
l’époque, ce n’est que le 1er janvier 1840 que l’application du système métrique est effective. Entre
temps, d’autres nations ont déjà instauré et établi le système métrique.
Les échanges commerciaux entre pays commençant à se multiplier avec la première révolution
industrielle, le nouveau système métrique décimal continue à de se diffuser. De 1870 à 1875, les
différentes conférences internationales organisées furent un lieu de réflexion pour l’ébauche d’un
pilotage du système métrique. Celles ci ont débouché sur un traité diplomatique signé le 20 mai
1875 et réunissant 17 pays signataires de la « Convention du mètre ». Cet accord conduit à
l’instauration du Comité International des Poids et Mesures (CIPM) et son entité scientifique : le
Bureau International des Poids et Mesures (BIPM).
1.3.2 La Convention du Mètre
La Convention du Mètre a permis la mise en place d’une structure permanente, en la présence du
BIPM, permettant aux états membres d’avoir une action commune sur toutes les questions se
rapportant aux unités de mesure (BIPM 1995).
Tous les quatre ans, la Conférence Générale des Poids et Mesures (CGPM) réunit les états
membres (au nombre de 51 plus 27 nations associées au mois d’avril 2008) pour débattre de
l’amélioration du système métrique en relation avec les nouveaux besoins et les progrès
scientifiques réalisés. La CGPM définit ainsi l’organisation et le développement du BIPM. La
supervision et la direction des travaux du BIPM s’effectuent par le CIPM. De plus, ce comité
soumet un programme de travail lors des conférences générales CGPM pour permettre de
redéfinir les objectifs du BIPM à la lumière des avancées scientifiques. Ainsi, le Système
International des unités (SI) est institué au cours de la 10ème CGPM de 1960 avec l’apparition de
nouvelles unités. Puis lors de la 14ème CGPM de 1971, la mole fut introduite dans le SI. Pour
assister le CIPM, des groupes de travail appelés Comités Consultatifs et réunissant les experts de
chaque domaine ont été créés. Ils permettent d’étudier les progrès réalisés qui peuvent avoir une
influence sur la métrologie. Les Comités Consultatifs sont également responsables d’organiser les
intercomparaisons internationales entre Instituts Nationaux de Métrologie. Actuellement, ils sont au
nombre de 9, dont le Comité Consultatif pour la Quantité de Matière (CCQM) dans le domaine de
la chimie. Les Instituts Nationaux de Métrologie prennent le relais du BIPM au niveau national pour
l’assister dans le pilotage et la dissémination de la métrologie.
La Figure 2 illustre l’organisation de la métrologie au travers de la Convention du Mètre.
28
Figure 2 : Organigramme de la métrologie selon la C onvention du Mètre (BIPM 1995)
1.3.3 Les Instituts Nationaux de Métrologie
Les Instituts Nationaux de Métrologie (INMs) ont pour mission d’assurer la diffusion du SI au sein
de leur état. A travers l’arrangement de reconnaissance mutuelle (MRA) du 14 octobre 1999 (BIPM
2003), les INMs signataires adhèrent à un système permettant les reconnaissances mutuelles de
leur capacité de mesure. Cet accord a pour objectifs i) d’établir des degrés d’équivalence entre les
étalons nationaux de mesure conservés par les INMs, ii) de pourvoir à la reconnaissance mutuelle
des certificats d'étalonnage et de mesurage émis par les INMs et iii) de fournir ainsi aux
gouvernements et aux autres parties un fondement technique solide à d'autres accords plus
étendus liés au commerce international, au négoce et aux activités de réglementation (BIPM
2003).
Les moyens mis en œuvre sont :
- l’utilisation de comparaisons internationales de mesurages, désignées comparaisons clés
(dénommée K, de l’anglais Key) et qui servent à faire reconnaître les capacités de mesures
des INMs,
29
- l’utilisation de comparaisons internationales de mesurages supplémentaires (dénommée P, de
l’anglais Pilot study) qui sont utilisées pour établir un état de l’art et démontrer des capacités
actuelles de mesures ; des laboratoires experts dans leur domaine peuvent être invités à y
participer,
- l’établissement par les INMs de systèmes de qualité et de démonstration de leurs
compétences.
Suite à leur participation aux intercomparaisons, les INMs peuvent déclarer des aptitudes en
matière de mesures et d’étalonnage (CMC), inscrites dans la base de données gérée par le BIPM
et accessible sur internet. Par leur mission, les Comités Consultatifs sont chargés de préparer et
d’organiser les intercomparaisons internationales en fonction de l’identification des besoins
émergents auprès des utilisateurs.
En particulier dans le cadre de la quantité de matière, la réalisation d’un étalon primaire
représentatif de la mole n’est pas réalisable pour la mise en pratique du SI (Milton 2001). Des
étalons primaires de chaque analyte peuvent être fabriqués mais leur simple utilisation ne sert qu’à
permettre l’étalonnage des appareils de mesure et ne s’avère pas suffisante pour assurer la
relation de la mesure dans un échantillon réel avec le SI. La raison provient du fait que les
mesurandes ne sont pas directement accessibles et que des traitements de l’échantillon
complexes sont à effectuer avant de réaliser une mesure. De plus, des effets de matrice peuvent
modifier la réponse des appareils lors de mesures effectuées sur un échantillon par rapport à la
mesure sur un étalon.
Pour ces raisons, ce sont les méthodes d’analyses qui sont à évaluer et qui doivent assurer la
relation au SI. Les INMs développent donc des méthodes de référence dites « primaires ». Elles se
définissent comme des procédures permettant d’obtenir un résultat de mesure sans relation avec
un étalon d’une grandeur de même nature (ISO 2007). L’établissement des méthodes primaires
permet de mettre en pratique la réalisation de la traçabilité au SI dans le domaine de la quantité de
matière (Milton 2001). Le désavantage de cette démarche est que pour chaque analyte et pour
chaque matrice il est nécessaire de développer une methode primaire.
1.3.4 Dissémination de la traçabilité
Après le développement d’une méthode primaire et la reconnaissance de ses capacités de
mesures via la participation à une intercomparaison internationale entre INMs, il est du ressort des
Instituts Nationaux de Métrologie de diffuser le raccordement des utilisateurs au SI.
Au niveau de la chimie, la dissémination passe par l’application de ces méthodes primaires pour
fournir des valeurs traçables au SI. Ces mesures peuvent être utilisées dans le cadre de la
30
certification d’un matériau de référence (Rivier 2007) ou comme valeur de référence pour des
essais d’aptitudes (Fisicaro 2007 et 2008b).
Les matériaux de référence certifiés (CRMs) sont des outils quasi-indispensables dans la
validation de méthodes. Ils sont définis comme des matériaux suffisamment homogènes et stables
dont une ou plusieurs valeurs de leurs propriétés sont spécifiées avec leurs incertitudes et leurs
traçabilités associées (ISO 2007). Deux types de CRMs peuvent être rencontrés. Il peut s’agir
d’étalons de haute pureté qui ne contiennent que l’analyte d’intérêt ; ces CRMs servent à étalonner
les systèmes de mesure (Rivier 2007). D’autres CRMs sont des échantillons représentatifs d’un
type de matrice et pour lesquels la concentration d’au moins un analyte est certifiée. L’étude de
ces CRMs par les laboratoires d’analyses leur permet de s’assurer de la justesse de la méthode
utilisée. Si les résultats obtenus sont compatibles avec le certificat, l’analyse du CRM permet alors
de prétendre à la traçabilité des mesures effectuées par la méthode du laboratoire à condition que
le certificat atteste formellement du raccordement du matériau au SI et qu’il inclue des incertitudes
de mesure. La limite de l’utilisation des CRMs provient du fait qu’ils ne sont valables que pour un
type d’échantillon, un unique analyte le plus souvent et dans une seule gamme de concentration.
Leur développement est long et onéreux ce qui restreint leur nombre. Ainsi, la banque de données
COMAR recense plus de 20 000 CRMs mais qui ne couvrent que 10% des besoins des utilisateurs
(Fisicaro 2007).
Une seconde voie pour la validation de méthode repose sur la participation à des exercices
d’intercomparaison. Chaque laboratoire participant fournit son résultat suite à l’application de sa
méthode sur un même échantillon inconnu. De ces essais d’aptitudes découle une valeur
consensuelle issue de l’analyse statistique de l’ensemble des mesures. Même si une justesse
relative peut être obtenue par chaque participant avec la comparaison des résultats et de la valeur
consensuelle, aucune traçabilité n’est accordée à cette valeur. Il est donc nécessaire d’impliquer
une méthode primaire pour fournir une valeur de référence raccordée au SI. Comme pour les
CRMs, la limitation de tels schémas provient du coût de mise en pratique. De plus, chaque
intercomparaison ne peut s’appliquer que pour un analyte, une gamme de concentrations et une
matrice.
La Figure 3 schématise la mise en place de la métrologie. Il en ressort que l’établissement et le
développement de la métrologie est un processus souvent long et impliquant plusieurs acteurs aux
diverses fonctions. Seule leur action coordonnée peut permettre une amélioration de la traçabilité
des mesures.
31
Figure 3 : Implication des différents acteurs dans le développement de la métrologie
1.4 Méthodes primaires pour la quantité de matière
Une méthode est définie primaire par le CCQM si elle ne fait pas référence à la mesure d’un étalon
de même nature pour la détermination de la quantité de l’analyte dans un échantillon (ISO 2007).
Au niveau de la chimie analytique, plusieurs méthodes primaires sont disponibles pour permettre
d’atteindre cet objectif (Kaarls 1997, Richter 1997, Stumpf 2003) :
- La gravimétrie : l’analyte d’intérêt est séparé de l’échantillon sous une forme pouvant être
pesée. Cette méthode est également employée pour la préparation de solutions d’étalon à
partir d’un analyte de haute pureté.
- La titrimétrie : la quantité de matière est déterminée à partir du volume d’une solution titrante
utilisée pour réagir avec l’analyte de façon stœchiométrique.
- La coulométrie : la quantité d’analyte s’obtient par la mesure du courant et du temps
d’application lors d’une réaction électrochimique.
- La double dilution isotopique : le profil isotopique de l’analyte est modifié avec un étalon dont la
signature isotopique est différente de la naturelle (appelé étalon marqué). Le mélange étalon
marqué + échantillon subit la totalité du protocole d’analyse. La lecture du rapport entre
isotopes avec la connaissance de la quantité d’étalon ajoutée permet de déterminer la quantité
d’analyte dans l’échantillon.
D’autres méthodes peuvent potentiellement réunir les critères d’une méthode primaire, comme la
spectrophotométrie qui repose sur la lecture de l’absorbance d’un liquide pour déterminer sa
concentration en utilisant la loi de Beer-Lambert (Richter 1997). L’activation neutronique suscite le
32
plus d’intérêt ces dernières années de la part du CCQM (Chajduk 2008). Cette technique consiste
à irradier l’échantillon dans un flux de neutrons et à identifier les isotopes radioactifs créés. Dans la
majorité des cas, les réactions mises en jeu sont celles produites par un flux de neutrons
thermiques (faible énergie) conduisant à un radio-isotope comprenant un neutron de plus que
l’isotope de l’élément recherché dans l’échantillon. Cette réaction s’accompagne d’une émission
de rayonnements gamma dont l’énergie est caractéristique de l’isotope étudié. Les limites d’une
telle technique résident dans la nécessité de disposer d’un réacteur nucléaire pour la source de
neutrons.
Dans le cadre de l’étude des éléments traces (≤ mg·kg-1), la méthode primaire de choix est la
dilution isotopique. Elle se révèle être une méthode de haute sensibilité, idéale pour les faibles
concentrations des analytes dans les échantillons.
Historiquement, l’invention du principe de la dilution isotopique (DI) est attribuée aux zoologistes
qui l’utilisaient pour réaliser le comptage des espèces animales (Vogl 2007, Meija 2008). Son
mode opératoire repose sur la modification d’une population par l’introduction d’une seconde
population portant un signe distinctif. Si le mélange entre les deux populations est atteint et que le
nombre d’espèces marquées est connu alors la mesure de la proportion entre les deux populations
permet d’obtenir le nombre d’individus non marqués initiaux (Meija 2008). Ce principe peut
s’appliquer indifféremment pour la zoologie ou la quantité de matière. Dans le domaine de la
chimie analytique, le marquage de l’élément s’opère sur ses isotopes, le mélange de l’étalon
marqué avec l’analyte à doser modifie le profil isotopique et la lecture de la nouvelle signature
isotopique permet d’obtenir la concentration initiale de l’élément (de Bièvre 1994). L’étalon marqué
joue alors le rôle d’un étalon interne idéal : une fois en équilibre avec l’échantillon, il réagit de la
même façon que l’analyte sans risque de modification des rapports isotopiques qui sont les seules
mesures à réaliser pour obtenir la concentration.
La Figure 4 illustre le principe de la dilution isotopique.
Figure 4 : Principe de la dilution isotopique –
application sur deux isotopes du sélénium ; R(78/76 ) représente les rapports isotopiques
33
La dilution isotopique présente plusieurs avantages (de Bièvre 1994, Sargent 2002, Stumpf 2003,
Rodriguez-Gonzalez 2005, Vogl 2007) :
- Caractère absolu de la méthode car ne nécessitant pas d’étalonnage préalable du détecteur,
- Non besoin de quantitativité sur le traitement de l’échantillon à condition que l’équilibre avec
l’étalon marqué soit atteint,
- Indépendance de l’évolution de l’analyte à condition que l’équilibre soit atteint,
- Indépendance de la réponse du spectromètre de masse ; la mesure des rapports isotopiques
n’est que peu affectée par les effets dus à la matrice ou à la dérive du détecteur,
- Sensibilité de la détection obtenue grâce aux spectromètres de masse,
- Sélectivité des mesures car elles ne sont basées que sur les isotopes d’un élément,
- Grande plage d’application ; des fractions de masse du niveau d’ultratraces (ng·kg-1) jusqu’à la
composition au niveau du pourcentage peuvent être déterminées.
Tous ces avantages font de la DI une méthode robuste permettant d’obtenir des résultats
réunissant justesse et fidélité. Cependant comme pour chaque méthode analytique, il existe des
limites et des exigences liées à son utilisation (de Bièvre 1994, Sargent 2002, Rodriguez-Gonzalez
2005, Vogl 2007) :
- Au moins deux isotopes de l’élément doivent être disponibles à l’état naturel ou des radio-
isotopes doivent être synthétisables avec une période de demi-vie suffisamment longue,
- L’étalon marqué doit être commercialement disponible ou facilement synthétisable,
- Les isotopes suivis doivent être libres de toutes interférences pour ne pas apporter de biais,
- L’équilibre entre l’analyte et l’élément marqué est primordial pour garantir le résultat, en
particulier aucune perte ne doit intervenir avant l’équilibre,
- L’utilisation d’éléments marqués et de spectromètres de masses est coûteuse,
- La DI est une analyse destructive.
La DI est applicable pour l’analyse d’environ 75 éléments du tableau périodique de Mendeleïev (de
Bièvre 1994).
Il peut être également remarqué que la dilution isotopique est basée sur l’utilisation d’un étalon
pour la détermination de la concentration de l’échantillon. Pour autant, son emploi n’invalide pas la
DI en tant que méthode primaire pour plusieurs raisons. D’abord, ce n’est pas une mesure sur une
quantité de matière issue de l’étalon qui est utilisée mais une mesure sur un rapport d’abondances
isotopiques issu du mélange échantillon/étalon marqué. De plus, la concentration de l’étalon de
référence est obtenue à partir d’une autre méthode primaire (la gravimétrie) et celle de l’échantillon
est connue grâce à une équation explicitement connue à partir de la concentration de l’étalon
(Richter 1997).
34
Au final, la DI peut donc être considérée comme une méthode primaire de mesure, à conditions i)
d’associer un calcul d’incertitudes sur la concentration finale et ii) de démontrer la traçabilité de
l’analyse au SI.
1.5 Calcul de l’incertitude
Dans le cadre d’une mesure de quantité de matière, plusieurs approches sont disponibles pour
réaliser le calcul de l’incertitude du résultat. Leur classification repose sur deux modes distincts
d’évaluation : l’approche menée par un laboratoire seul (intralaboratoire) et celle basée sur des
études issues de plusieurs laboratoires au cours de collaborations (interlaboratoire) (Désenfant
2007, Eurolab 2007, Fisicaro 2008a).
L’approche intralaboratoire repose, par définition, sur l’utilisation de données internes au
laboratoire. Si un modèle mathématique peut être associé au résultat du processus de mesure,
alors l’approche décrite par le guide GUM (Guide to the expression of Uncertainty in Measurement,
ISO/IEC 1995) est utilisée. Si aucun modèle ne peut décrire le processus de mesure, il est alors
nécessaire de répéter les mesures en faisant varier tous les facteurs influents. De cette répétition
des mesures découle l’estimation de la reproductibilité du processus d’analyse. L’association de
cette valeur à d’autres paramètres influents, comme l’estimation de la justesse, permet une
évaluation de l’incertitude du résultat.
L’approche interlaboratoire repose sur les résultats d’un essai d’intercomparaison mené pour
évaluer une méthode et dont les résultats ont été statistiquement analysés selon la norme NF ISO
5725 pour fournir les écarts-types de répétabilité et reproductibilité (données publiées). Dans ce
cas de figure, il est aussi important d’évaluer la justesse de la méthode pour pleinement estimer
l’incertitude de mesure. Une seconde alternative est possible, via la participation du laboratoire à
un essai d’aptitude : l’exploitation des dispersions des résultats entre laboratoires peut être un
indicateur de l’incertitude de mesure.
La Figure 5 représente les différentes approches pour la détermination des incertitudes.
35
Figure 5 : Approches pour l'évaluation de l'incerti tude de mesure (Désenfant 2007, Eurolab 2007,
Fisicaro 2008a)
La méthode préconisée par le GUM permet d’estimer les incertitudes de mesures sans la
participation à des intercomparaisons et tout en limitant le nombre d’essai à réaliser. De plus, elle
autorise l’identification des paramètres les plus influents sur le résultat final. Pour ces raisons, elle
est l’une des méthodes les plus utilisées dans la détermination des incertitudes de mesures.
Le GUM a été établi suite aux recommandations éditées par le BIPM pour l’expression de
l’incertitude expérimentale. Ces recommandations font suite à une volonté de créer un consensus
international sur l’évaluation de l’incertitude et avaient pour objectifs de i) contribuer à une
complète information sur la manière dont est exprimée l’incertitude et ii) fournir une base pour la
comparaison des résultats de mesure (ISO/IEC 1995).
La démarche associée à la méthode GUM peut être décrite en quatre étapes :
i. exprimer mathématiquement la relation entre le mesurande et les grandeurs d’entrée
ii. évaluer l’incertitude-type de chaque grandeur d’entrée
iii. déterminer l’incertitude-type composée du mesurande via la propagation des
incertitudes-types des grandeurs d’entrée
iv. donner le résultat accompagné de son incertitude élargie.
36
Pour déterminer l’incertitude-type composée, plusieurs méthodes sont disponibles : l’utilisation des
dérivées partielles du modèle mathématique avec la loi de propagation des incertitudes,
l’estimation expérimentale de l’effet de la variation d’un seul paramètre ou, plus récemment
proposée, la simulation numérique avec l’application de la méthode Monte-Carlo (ISO/IEC 1995,
JCGM 2008). Le guide Eurachem pour la quantification de l’incertitude de mesure, basé sur le
GUM mais en application pour la quantité de matière, fait également référence à autre méthode
numérique : la méthode de Kragten (Eurachem 2000). Contrairement à l’utilisation de la loi de
propagation des incertitudes, aucune dérivée partielle n’est à déterminer, leur valeur étant obtenue
par un calcul numérique (Kragten 1994, Désenfant 2007).
37
2 L’analyse de spéciation
Suite à l’augmentation des études menées par les laboratoires de recherche dans le domaine des
analyses de spéciation, le Comité Consultatif pour la Quantité de Matière (CCQM) a identifié ce
domaine comme un axe important du développement de la chimie analytique et a fortiori de la
métrologie. Des études ont donc commencé, dès 2002, pour permettre aux Instituts Nationaux de
Métrologie de comparer leur possibilité de mesure par l’application de leur méthode primaire à
l’analyse de spéciation (Sturgeon 2002).
2.1 Définition
Les éléments traces peuvent avoir plusieurs effets sur l’environnement : des propriétés
bénéfiques, une essentialité, une innocuité ou une toxicité. Pour permettre d’évaluer leur impact,
les études ont toujours portées sur une notion clé : la concentration d’exposition. Cependant,
depuis plusieurs années, un second concept est associé à cette information pour améliorer la
compréhension de l’influence des éléments traces sur l’environnement : l’espèce chimique
d’exposition. Les nouvelles études portent dorénavant sur la caractérisation et la détermination des
quantités des formes des éléments et associent ces nouvelles informations à l’observation des
effets (WHO 2006).
L’Union Internationale de Chimie Pure et Appliquée (IUPAC) a défini en 2000 les termes relatifs à
la spéciation des éléments (Templeton 2000, Seby 2007) :
- L’espèce chimique est la forme spécifique d’un élément définie par sa composition isotopique,
sa structure électronique ou son état d’oxydation, sa présence sous forme de complexe et/ou
sa structure moléculaire.
- L’analyse de spéciation représente l’activité de chimie analytique qui permet l’identification
d’une ou plusieurs espèces et/ou la détermination de leur quantité.
- La spéciation d’un élément correspond à sa distribution entre ses différentes espèces dans un
système donné.
2.2 Intérêts
Dans toute science ayant trait aux éléments inorganiques (métaux et métalloïdes) il peut être
intéressant de mener une analyse de spéciation. En effet, les effets des éléments sont avant tout
intrinsèquement liés à leur capacité à être absorbés, transportés ou excrétés et ces mêmes
phénomènes ne sont pas seulement dépendants de l’élément mais aussi de la réactivité et de
l’arrangement spatial des espèces présentes. Pour ces raisons, il est difficilement envisageable de
réaliser des analyses dans le domaine de l’environnement, du bio-médical ou de l’agroalimentaire
sans avoir recours à la spéciation des éléments. Dans le domaine industriel, il est également
38
crucial de clairement élucider les procédés de fabrication mis en place. La spéciation est dans ce
cadre un outil supplémentaire pour répondre à la compréhension qui précède toute optimisation
des systèmes de production.
Les analyses de spéciation ont également un intérêt dans la mise en place d’une réglementation et
du contrôle des risques. L’étude de toxicité d’un élément menée avec une espèce faiblement
toxique sous-estime le risque associé s’il peut être présent sous une forme à plus fort impact
sanitaire. Inversement, une étude menée sur un élément avec une espèce hautement toxique mais
dont l’espèce d’exposition de l’élément est faiblement toxique sur-estime le risque et peut
engendrer un impact économique non négligeable.
Il est donc essentiel de clairement identifier les espèces d’exposition pour pleinement évaluer les
risques associés à chaque élément.
2.3 Démarche
Le développement des analyses de spéciation représente un pont entre les deux grands domaines
de la chimie analytique : l’inorganique et l’organique. En effet, pour permettre l’étude des espèces
d’un élément, les techniques jusqu’alors utilisées dans l’analyse de composés organiques ont été
adaptées afin de satisfaire les nouveaux besoins du domaine inorganique. Cette appropriation de
savoir-faire est surtout réalisée au niveau des traitements appliqués à l’échantillon avant son
analyse par le détecteur.
La première modification majeure se rencontre au niveau du protocole de mise en solution des
analytes contenus dans l’échantillon avant leur analyse. Dans le cas d’une détermination de la
concentration totale d’un élément, la mise en solution doit être réalisée avec des digestions
agressives utilisant des acides et des oxydants pour permettre de solubiliser la matrice de
l’échantillon et libérer l’élément. En analyse de spéciation, l’étape d’extraction se limite à une
solubilisation des analytes, leur intégrité devant être préservée pour conserver l’information sur la
spéciation originelle. Cette extraction « douce » doit cependant rester quantitative pour assurer la
justesse du résultat final.
Une fois cette étape de mise en solution réalisée, l’analyte de principal intérêt doit être séparé de
la matrice résiduelle de l’échantillon mais aussi des autres espèces de l’élément. La séparation de
composés se déroule dès lors en utilisant des techniques comme la chromatographie ou
l’électrophorèse.
Les autres étapes constitutives de l’analyse de spéciation sont également rencontrées dans le
cadre d’analyse en mode total : échantillonnage et détection de l’analyte. La Figure 6 résume la
démarche générale de l’analyse de spéciation. Il est à noter que d’autres étapes peuvent
compléter cette figure, comme le stockage des échantillons et de ses extraits ou des traitements
additionnels pour modifier l’état des analytes (comme la dérivation des espèces pour leur analyse
en chromatographie en phase gazeuse) (Monperrus 2004).
39
Figure 6 : Démarche générale de l'analyse de spécia tion
L’accumulation des différentes étapes conduisant au résultat final pose la question de la fiabilité de
la méthode. Ainsi, il est utile de démontrer que la méthode employée est valide. Cette validation
doit non seulement permettre de s’assurer de la fiabilité du résultat mais également démontrer qu’il
est traçable au SI et préciser avec quelle fidélité (grâce au calcul de l’incertitude du résultat). Une
fois cette étape réalisée, le résultat est comparable et peut être interprété.
40
3 Métrologie appliquée à l’analyse de spéciation
Depuis plusieurs années, il est devenu primordial que la métrologie prenne en compte les
analyses de spéciation pour améliorer la traçabilité des analyses. Des besoins en particulier ont
été notés pour l’évaluation des méthodes au travers du développement de i) CRMs (Larsen 1998,
Quevauviller 1999a, de Guillebon 2001, le Bouil 2007) et ii) des essais d’aptitudes (Quevauviller
1999b, Adams 2000). Néanmoins comme cela a déjà été souligné, ces outils ne permettent une
traçabilité au SI qu’à condition qu’une méthode primaire de mesure soit employée pour la
caractérisation des échantillons. En conséquence, le premier développement à réaliser de la part
des INMs est la mise en place d’une méthode primaire qui pourra être par la suite appliquée aux
échantillons en vue d’une certification ou destinés aux intercomparaisons.
La méthode primaire applicable aux analyses de spéciation des éléments traces est la dilution
isotopique (DI). Son utilisation dans ce domaine fait apparaître de nouveaux besoins.
En premier lieu, l’ajout de l’étalon marqué et son équilibre avec l’échantillon deviennent des étapes
essentielles et beaucoup plus difficiles à atteindre par rapport aux analyses de l’élément total. En
effet, l’utilisation de systèmes fermés pour minéraliser l’échantillon limitait les différences de
comportement entre analyte et étalon marqué en obtenant une mise en solution quantitative. Dans
le cas d’une analyse de spéciation, il est essentiel pour conserver l’information sur la spéciation
originelle d’extraire en douceur les analytes. Il doit donc être démontré que l’élément ou l’espèce à
mesurer soit extrait de façon quantitative pour assurer la justesse du résultat (Meija 2008).
La mise en pratique de la DI dans les analyses de spéciation conditionne également le choix des
techniques à mettre en œuvre pour la détection. Les facultés (nouvelles et anciennes) dont il est
nécessaire de disposer sont :
- autoriser le couplage en ligne avec la technique séparative,
- être capable de suivre plusieurs isotopes issus de signaux transitoires sans discrimination,
- être sensible,
- être spécifique.
Plusieurs techniques de spectrométrie de masse sont disponibles pour atteindre ces objectifs. Le
type d’ionisation utilisé conditionne en grande partie les différentes alternatives avec soit une
ionisation « douce » qui se réalise au niveau moléculaire comme avec l’électrospray (ESI-MS) ou
soit une atomisation de la molécule comme lors de la spectrométrie de masse à couplage inductif
du plasma (ICP-MS). L’avantage de méthodes telles que l’ESI-MS repose sur un plus grand choix
de marquage de l’étalon marqué impliqué dans la DI : sur un hydrogène (deutérium), sur
éventuellement un atome d’azote (15N), sur un carbone (13C) ou sur l’élément (Meija 2008).
Cependant cette technique souffre d’effets de matrices plus important entre isotopes (surtout pour
un marquage au deutérium) et de limites de détection supérieures à l’ICP-MS (Meija 2008, Ogra
41
2008). L’utilisation d’une technique qui réduit la molécule à l’état d’atome procure plusieurs
avantages. Outre une meilleure sensibilité, ce type d’ionisation est moins affecté par les effets de
matrices entre isotopes et procure une plus grande spécificité des mesures. Par contre, cette
technique d’ionisation souffre également de biais sur la transmission des isotopes jusqu’à
l’analyseur (fractionnement isotopique). De plus, l’ICP-MS limite l’utilisation de la DI aux espèces
marquées sur l’élément et non plus sur les composants de la matière organique (N, H ou C).
Cependant, l’utilisation du marquage sur l’élément ajoute également un avantage avec la
possibilité d’élucider des transformations inter-espèces et d’en corriger les résultats (Hintelmann
2002, Rodriguez 2005).
Dans le cadre de ces travaux de thèse, il est donc proposé de mettre en place des méthodes dites
primaires pour permettre d’assurer la traçabilité des mesures d’analyses de spéciation.
L’application de la dilution isotopique a été réalisée pour le sélénium et le mercure en raison de
l’intérêt croissant de la législation pour ces deux éléments. Les études ont porté particulièrement
sur les traitements à apporter aux échantillons pour s’assurer d’une extraction quantitative des
espèces de principaux intérêts, garante d’un résultat juste en DI. Les techniques séparatives ont
été mises au point pour assurer une isolation efficace des espèces tout en étant compatibles avec
l’ICP-MS. La détection par ce spectromètre de masse a aussi été optimisée pour limiter les biais
inhérents à cette technique. Suite à la mise en place des techniques analytiques, l’apport
métrologique a été étudié par le calcul des incertitudes finales, via l’utilisation de la méthode du
GUM, et la démonstration de la traçabilité des résultats au SI.
Une fois l’ensemble du protocole métrologique mis en place, il a été validé par l’analyse de CRMs
et la participation à une intercomparaison entre Instituts Nationaux de Métrologie.
42
Chapitre II : Synthèse bibliographique
44
45
1 Le sélénium
1.1 Généralités
1.1.1 Propriétés physico-chimiques
Le sélénium (Se) est un des éléments les plus rares avec une abondance dans la croûte terrestre
le situant à la 70ème place sur les 88 corps naturellement présents (Reilly 2006). Il a été isolé pour
la première fois par le suédois Jöns Jakob Berzélius en 1817. Cependant dès le treizième siècle,
l’italien Arnold de Villanova décrit un « soufre rouge » dont il est probable que ce soit la première
évocation du sélénium (Reilly 2006).
En 1943, le risque cancérigène de Se est évoqué suite à une exposition de populations de rat à du
séléniure de potassium (K2Se), du sélénium présent dans du blé ou du maïs (Nelson 1943). Cette
étude a été à l’origine de la mauvaise réputation de l’élément. Ce n’est qu’en 1957 que son
importance pour la santé a été mise en évidence par les travaux de Schwarz et Foltz ; démontrant
son rôle en tant qu’oligo-élément et suggérant qu’il prend part à des réactions d’oxydoréduction du
métabolisme (Schwarz 1957). Depuis plusieurs études ont confirmé son rôle essentiel pour les
organismes vivants et plus particulièrement sur la santé humaine (Rayman 2000, Hatfield 2006).
Le sélénium appartient à la classe des métalloïdes, ou semi-métalliques, ce qui lui confère des
propriétés intermédiaires à celles d’un métal et qui explique ses diverses applications industrielles.
En particulier, sa faculté de semi-conducteur explique ses nombreux usages dans l’électronique.
Les principales caractéristiques de cet élément sont regroupées dans le Tableau 2.
Tableau 2 : Propriétés physico-chimique générales d e Se (WHO 1987 ; IUPAC 2003 ; Reilly 2006)
Numéro atomique 34
Période / groupe 4 / 16 (VIa) chalcogène
Structure électronique [Ar] 3d10 4s2 4p4
-II 0 +IV +VI Degré d’oxydation à l’état naturel
séléniure sélénium sélénite séléniate
Masse molaire 78.96 ± 0.03 g·mol-1
A l’état naturel, le sélénium est composé de six isotopes stables (Tableau 3). Des isotopes
radioactifs peuvent être rencontrés comme 75Se à la période de demi-vie de 120.4 jours et utilisé
comme traceur dans des études biologique (Reilly 2006) ou 79Se issu de la fission de l’uranium 235
dans les réacteurs nucléaires au temps de demi-vie de 3.77.105 ans (Bienvenu 2007).
46
Tableau 3 : Composition isotopique du sélénium à l’ état naturel (IUPAC, 2003)
Isotope 74 76 77 78 80 82
Répartition (%) 0.89 ± 0.04 9.37 ± 0.29 7.63 ± 0.16 23.77 ± 0.28 49.61 ± 0.41 8.73 ± 0.22
1.1.2 Espèces séléniées
Le sélénium a des propriétés chimiques analogues avec le soufre et avec le tellure, ce qui explique
la similitude rencontrée entre leurs composés et ceux de Se (Reilly 2006). Ainsi tout comme le
soufre, Se à la possibilité de former de nombreuses espèces organiques principalement issues du
métabolisme des êtres vivants (Barceloux 1999). Plus particulièrement, la découverte en 1973 de
séléno-protéines (Rotruck 1973), protéines nécessitant Se pour être fonctionnelles, a été le point
de départ de recherches sur la biochimie du sélénium afin d’élucider les processus mis en place
dans le métabolisme des êtres vivants (Hatfield 2006). Depuis de nombreuses espèces
organiques ont pu depuis être mises en évidence (Casiot 1999b, McSheehy 2002) et grâce aux
avancées technologiques, il est toujours possible d’aller plus loin dans l’identification de ces
composés (Tastet 2008). Le Tableau 4 répertorie quelques exemples d’espèces rencontrées dans
les organismes vivants.
Tableau 4 : Exemples d’espèces de sélénium rencontré es dans l’environnement (Barceloux 1999,
Reilly 2006, Dumont 2006)
Composé Espèce
Sélénométhionine, SeMet
Sélénocystéine, SeCys
Se-méthyle-sélénocystéine, MeSeCys
Ion triméthylsélénonium, TMeSe+
Diméthyle-diséléniure (DMeDSe) H3C-Se-Se-CH3
Diméthyle-séléniure (DMeSe) H3C-Se-CH3
Méthane sélénol (MeSeH) H3C-SeH
47
1.2 Occurrence dans l’environnement
1.2.1 Sols
Le sélénium est largement réparti à travers les différents compartiments environnementaux mais
de manière hétérogène. Les concentrations sous lesquelles il est rencontré sont fortement
dépendantes de la localisation géographique des sols (Dumont 2006, INERIS 2008). Ainsi des
zones séléniprives ont pu être identifiées en Nouvelle-zélande avec des taux de 0.1 mg·kg-1 et des
zones sélénifères comme en Irlande avec une valeur maximale de 1200 mg·kg-1 (WHO 1987,
Barceloux 1999). L’apport du sélénium dans les sols provient essentiellement de l’érosion de la
roche mère où le sélénium se retrouve sous forme de sélénites (SeIV) et séléniures associés à
des minéraux sulfurés et à des fractions de masse inférieures à 1 mg·kg-1 (WHO 1987, Barceloux
1999). Une fois dans les sols, Se est rencontré sous forme de sélénium élémentaire, de sels de
séléniates, de complexes insolubles de sélénite ferrique ou de composés organiques issus de la
dégradation d’organismes vivants (Barceloux 1999, Reilly 2006).
1.2.2 Air
L’atmosphère joue un rôle important dans le cycle bio-géochimique du sélénium, influant sur son
transport et sa transformation. Comme pour beaucoup d’éléments, sa présence est liée aux
activités naturelles (érosion des sols, volcanisme, feux de forêt, biosphère…) et anthropiques
(combustion d’énergies fossiles, incinération d’ordures ménagères…) (WHO 1987, Wen 2007).
Les concentrations en Se sont généralement estimées à moins de 10 ng·m-3 (WHO 1987). De par
leur différence de comportements dans l’atmosphère, trois catégories de sélénium y sont
répertoriées :
- Les composés organiques volatils : DMeSe, DMeDSe, méthane sélénol (MeSeH)…
- Les composés inorganiques volatils : sélénium élémentaire, séléniure de dihydrogène (H2Se),
dioxyde de sélénium (SeO2)
- Le sélénium particulaire : Se0 lié à des cendres ou des particules (Wen 2007).
1.2.3 Eaux
Dans les eaux, le sélénium est peu présent et provient de dépôts issus de l’atmosphère ou par
drainage des sols et sous-sols. Les concentrations les plus souvent rencontrées sont les
suivantes (Barceloux 1999) :
- entre 0.06 et 400 µg·kg-1 pour les eaux de surface et souterraine
- entre 0.04 et 0.12 µg·kg-1 dans l’eau de mer
- inférieures à 10 µg·kg-1 dans l’eau potable, cette concentration représente la valeur limite
recommandée par l’organisation mondiale de la santé et celle en application dans la législation
européenne (INERIS 2008).
48
Occasionnellement, des concentrations plus élevées peuvent être rencontrées dans des puits de
zones riches en sélénium ou suite à la contamination des eaux par ruissellement sur des sols
sélénifères (Reilly 2006).
Dans les eaux, le sélénium est retrouvé sous forme de sels des acides sélénique (H2SeO4) ou
sélénieux (H2SeO3) (Barceloux 1999) et la présence d’organismes aquatiques peut entraîner la
métabolisation du sélénium sous des formes organiques (acide séléno-aminés, Se méthylé)
(INERIS 2008). Cependant, ces espèces sont rapidement dégradées via les bactéries ce qui limite
leur concentration (Barceloux 1999).
1.2.4 Organismes vivants
Dans les organismes vivants, la concentration en sélénium dépend fortement de plusieurs
paramètres tels que leur positionnement dans la chaîne alimentaire, leur métabolisme, la
biodisponibilité et la concentration des formes auxquelles ils sont exposés.
Chez les végétaux, le sélénium est principalement assimilé depuis la forme de séléniate qui
semble utiliser les transporteurs spécifiques du sulfate au niveau des racines (Barceloux 1999). Se
est par la suite réduit en séléniures au sein de composés organiques comme les acides aminés
SeMet ou SeCys. Une voie d'élimination passe par la synthèse de composés méthylés (DMeSe,
DMeDSe) (Dumont, 2006). Généralement les fruits ne contiennent que de faibles fractions de
masse en Se, dépassant rarement les 10 µg·kg-1 (Barceloux 1999, Navarro 2008). Des
concentrations plus élevées sont rencontrées dans des plantes possédant de forts taux de
protéines, comme la noix du Brésil : valeur moyenne de 3800 µg·kg-1 (Navarro 2008). D’autres
plantes sont capables d’accumuler efficacement Se, comme l’ail, l’oignon ou le genre des Brassica
(choux, broccoli, moutardes…) en raison de son analogie avec le soufre (Dumont 2006). Les
plantes céréalières ont aussi la possibilité de stocker Se au niveau de leur graine : la moyenne
mondiale des fractions de masse du blé varie entre 20 et 600 µg·kg-1 (Lyons 2003).
Dans le règne animal, les concentrations en sélénium reflètent celles rencontrées dans leur
nourriture qui reste leur principal apport (Barceloux 1999). Se est ingéré sous forme d’espèces
organiques et stocké également sous la forme de composés organiques. Généralement, les
organes (rein, foie) accumulent plus le sélénium que les muscles (Reilly 2006, Navarro 2008).
Contrairement à d’autres éléments comme le mercure, le sélénium ne subit pas de bioamplification
tout au long de la chaîne alimentaire. Les processus rapides d’élimination de Se par les
organismes limitent ce phénomène. Les facteurs de bioconcentration les plus importants se
retrouvent en général sur les premiers niveaux trophiques de la chaîne alimentaire (Barceloux,
1999).
49
1.3 Effets sur la santé humaine
1.3.1 Métabolisme du sélénium
La Figure 7 représente un chemin métabolique pour le sélénium chez l’Homme proposé par
Rayman et al. (2008). Suite à son ingestion, Se peut être incorporé au sein de protéines
générales, avec la substitution d’une méthionine par la sélénométhionine (SeMet). Dans ce cas Se
n’est pas incorporé de façon spécifique (Gromdzinska 2008). Le sélénium peut également être
intégré par le codon UGA au sein de séléno-protéines pour les rendre fonctionnelles (Johansson
2005). L’excès de Se est excrété par la respiration et les urines.
Figure 7 : Schéma du métabolisme du sélénium chez l’ Homme selon Rayman et al. (2008)
Chez l’Homme, il a été relevé la présence d’au moins 25 séléno-protéines (Lenz 2009,
Gromdzinska 2008). Elles sont en majorité associées a un rôle de protection des organismes
contre des agents oxydants, cependant l’ensemble de leur fonction n’a pu être identifiée (Tapiero
2003, Gromdzinska 2008). Le Tableau 5 récapitule quelques séléno-protéines et leur rôle reconnu.
50
Tableau 5 : Séléno-protéines et leur fonction chez l 'Homme (Tapiero 2003, Johansson 2005)
Séléno-protéines Fonction
Glutathiones peroxydases
(incluant les séléno-protéines P et W)
Enzymes anti-oxydantes,
responsables de la réduction des hydroperoxydes
Thioredoxine reductase
Régule les processus redox intracellulaires,
stimule la prolifération des cellules,
participe à la réduction des nucléotides impliqués dans la
synthèse et la réparation de l’ADN
Iodothyronine déionase Produit et régule les hormones thyroïdiennes
L’action des séléno-protéines semble à l’origine d’un rôle préventif du sélénium vis à vis du
cancer : la réduction du stress oxydatif (par la présence d’agents anti-oxydants) ou la réduction
des dommages sur l’ADN, sont des processus cellulaires pouvant limiter le développement d’un
cancer (Rayman 2005).
D’autres effets bénéfiques pour la santé humaine sont hypothétiquement associés à la présence
de sélénium dans l’organisme et souvent corrélés à son rôle antioxydant :
- amélioration du système immuno-défensif des patients atteints du HIV ou d’autres maladies
virales (Rayman 2000, Tapiero 2003)
- essentialité pour la reproduction, plus particulièrement dans la synthèse de la testostérone et
des spermatozoïdes (Rayman 2000)
- action sur l’humeur générale ; limitation de troubles comme la dépression, l’anxiété (Rayman
2000)
- protection contre les risque cardio-vasculaires (Rayman 2000)
- action sur la lutte contre le vieillissement (Tapiero 2003)
- protection des dommages de la peau entraînés par le rayonnement UV (Tapiero 2003)
- défense contre les métaux lourds (WHO 1987, Yoneda 1997, Li 2008).
1.3.2 Carences en sélénium
Etant donnée son importance dans la santé humaine, des maladies liées à un manque en
sélénium sont plus souvent observées que des intoxications. Hormis des troubles sur les fonctions
précédemment attribuées à Se, des affections peuvent survenir en cas de déficit en sélénium
(Tableau 6).
51
Tableau 6 : Exemples de maladies liées à un manque e n sélénium (Barceloux 1999)
Maladie Troubles engendrés
Maladie de Keshan Atteinte du système cardio-vasculaire,
risque mortel
Maladie de Kashin-Beck Atteinte des articulations avec atrophie,
dégénérescence et nécrose des cartilages
Dystrophie musculaire Dégénérescence des fibres musculaires
1.3.3 Excès en sélénium
Suite à une exposition à de fortes concentrations de sélénium, des cas d’intoxications peuvent être
observés.
Une exposition chronique mène à une sélénose et se manifeste par une odeur alliacée de
l’haleine, des éruptions cutanées, une fragilité des ongles et des cheveux (Yang 1983, Barceloux
1999). D’autres symptômes peuvent apparaître comme des caries, des vomissements, nausées,
tremblements ou troubles émotionnels (nervosité, dépression, irritabilité…) (Yang 1983, Barceloux
1999, Reilly 2006).
Une exposition aiguë au sélénium suite à une intoxication par voie orale ou par inhalation conduit à
des troubles respiratoires, une perte de l’odorat, diarrhées, vomissements, goût métallique dans la
bouche (Barceloux 1999, WHO 1987, INERIS 2008). La mort peut survenir suite à de trop fortes
expositions (Lech, 2002).
Bien que des indications semblent indiquer un caractère tératogéne d’une alimentation trop riche
en sélénium (Reilly 2006), aucun effet de cet ordre n’a pu être mis en évidence chez les
mammifères (Barceloux 1999).
Seul le sulfure de sélénium (SeS) peut s’avérer cancérigène (INERIS 2008).
1.4 Supplémentation alimentaire en sélénium
Il est à noter que dans le chapitre suivant, les concentrations évoquées sont les concentrations
totales en Se sans référence aux espèces du sélénium en raison du manque d’information de la
littérature sur la question.
1.4.1 Généralités
Une grande variabilité des valeurs de recommandation pour un apport adéquat en sélénium peut
être relevée dans la littérature :
- le Comité Scientifique pour les Aliments de la Commission Européenne (SCF) évoque une
valeur de 55 µg·j-1 pour les adultes (SCF 2000)
52
- l’Académie Américaine des Sciences (NAS) donne aussi la valeur de 55 µg·j-1 pour les adultes
(Rayman 2000, SCF 2000) bien que la révision du calcul, effectuée par Rayman, conduise à
une valeur de 73 µg·j-1 (Rayman 2000)
- un consortium réunissant l’Organisation Mondiale de la Santé (WHO), l’Agence Internationale
de l’Energie Atomique (IAEA) et l’Organisation des Nations Unies pour l'Alimentation et
l'Agriculture (FAO) estime l’apport minimal à 40 µg·j-1 pour les hommes et à 30 µg·j-1 pour les
femmes (Rayman 2000)
- Schrauzer (2003) évoque un apport optimal en sélénium de 70 µg·j-1 pour un homme de 79 kg.
Ces valeurs sont sensées correspondre à l’apport quotidien en sélénium supposé nécessaire pour
une activité optimale des glutathiones peroxydases (GPx) chez l’Homme adulte (Rayman 2000,
Schrauzer 2003). La différence peut s’expliquer par la provenance des données utilisées pour leur
calcul et de la non prise en compte de la spéciation pour mener les études toxicologiques.
Cependant, ces valeurs sont insuffisantes pour obtenir les qualités immunologiques
précédemment citées du sélénium (paragraphe 1.3). Rayman (2004) évoque une plage d’apport
se situant entre 75 et 125 µg·j-1 pour l’effet chémopréventif du sélénium tandis que Schrauzer
(2003) cite un apport de 200 µg·j-1 comme étant nécessaire pour une protection contre le cancer et
une production d’anticorps satisfaisante.
Au vu des apports moyens rencontrés dans certains pays (Tableau 7), certaines populations se
retrouvent en deçà d’un apport optimal en sélénium. Il s’avère donc crucial de réaliser une
supplémentation en sélénium pour éviter les effets notoires liés à une carence, et ce d’autant plus
que les activités humaines, comme l’utilisation de fertilisants soufrés, l’acidification des sols et
l’intensification des rendements des cultures, risquent de diminuer encore la mobilisation de Se du
sol dans la chaîne alimentaire (Lyons 2003, Murphy 2008).
53
Tableau 7 : Apports moyens par jour en sélénium (Ra yman 2000, Rayman 2004, Dumont 2006,
Navarro 2008)
Pays Apport (µg·j-1)
Allemagne 47
Chine (région du Enshi) 3200 - 6690
Chine (région du Keshan) 3 - 11
Etats-Unis 98
Avant l’utilisation de fertilisants 25 Finlande
Après l’utilisation de fertilisants 67 - 110
France 29 - 43
Japon 104 - 199
Royaume-Unis 29 - 39
Turquie 30
Plusieurs possibilités de supplémentation en sélénium des populations ont été proposées. Parmi
celles ci :
- l’utilisation de suppléments nutritionnels : en Chine, les travaux de Xia et al. (2005) ont
démontré une amélioration du statut de Se dans les populations vivant en zones séléniprives
grâce à l’utilisation de compléments alimentaires composés de sélénométhionine (SeMet) ou
de sélénite (SeIV),
- la fertilisation des sols : depuis 1984, les autorités finlandaises ont favorisé l’utilisation des
fertilisants séléniés pour enrichir leurs sols agricoles. En conséquence, des taux suffisants
d’apports en Se ont été atteints (Hartman 2002, Hawkesford 2007).
1.4.1.1 Supplémentation via les levures séléniées
Depuis plus de dix ans, le marché pharmaceutique s’est emparé de l’engouement face aux
propriétés anti-oxydantes de Se pour proposer plusieurs types de compléments nutritionnels. Cela
passe entre autres par le simple ajout de sélénium inorganique à des préparations de multi-
vitamines ou de multi-minéraux (Dumont 2006). Une seconde possibilité, déjà employée pour
d’autres oligo-éléments, est l’utilisation de levures (Mazo 2007). Ainsi, Saccharomyces cerevisiae
a la capacité d’accumuler de fortes concentrations de Se lors de sa croissance dans un milieu de
culture contenant du sélénite de sodium (Na2SeO3) (Korhola 1986, Suhajda 2000). Bien que de
nombreuses espèces organiques puissent y être détectées (McSheehy 2002), la majorité du
sélénium se retrouve sous la forme de SeMet (Korhola 1986, Gilon 1996, Casiot 1999a, Larsen
2001, Hinojosa 2004, McSheehy 2005, Ayouni 2006).
L’utilisation des levures présente plusieurs avantages :
54
- le comportement des composés de Se de la levure montre des similitudes avec la physiologie
des espèces rencontrées dans la nourriture (Schrauzer 2003, Hawkes 2008)
- le sélénium est plus biodisponible à partir de SeMet que depuis SeIV (Xia 2005)
- la sélénométhionine s’avère moins toxique que le sélénite de sodium à partir de tests de
toxicité menés sur des animaux (Schrauzer 2003, Dumont 2006)
- SeMet est un moyen efficace et réversible de stocker du sélénium puisque dès l’arrêt de la
supplémentation, les taux de Se diminuent rapidement (Schrauzer 2004, Hawkes 2008)
- un apport quotidien de 200 µg de Se depuis des levures pendant au moins sept ans n’a montré
aucun effet négatif notoire sur les personnes exposées ; une diminution de l’incidence de
certains cancers a même été constatée (Clark 1996)
- la culture des levures se caractérise par des cycles courts et rapides de production sur un
milieu de culture relativement peu onéreux, indépendants des conditions climatiques ou de
saisons (Mazo 2007).
L’utilisation de levures se révèle une solution efficace pour la supplémentation alimentaire en
sélénium à condition de connaître précisément la qualité de l’apport en sélénium, c’est à dire la
quantité des espèces présentes.
1.4.1.2 Fertilisations des sols agricoles
La fortification des sols agricoles par le sélénium permet d’introduire directement Se dans la
chaîne alimentaire sous forme d’espèces naturellement présentes dans les aliments. Dans le but
d’un maximum d’efficacité, les cultures soumises à une supplémentation doivent pouvoir être
largement consommées par la population visée et être capables d’assimiler suffisamment de Se.
Les céréales répondent à ces exigences et plus particulièrement le blé qui i) est largement utilisé
par l’ensemble de la population et ii) parmi les différentes plantes céréalières (maïs, riz, orge ou
avoine) semble être le plus efficace pour incorporer le sélénium (Lyons 2003). Par exemple, en
France, la consommation moyenne de produits céréaliers est de 203 et 294 g·j-1 chez les femmes
et les hommes respectivement (AFSSA 2007).
Le séléniate est l’espèce recommandée pour réaliser la supplémentation des sols car il est
facilement assimilable par la plante et n’est pas adsorbé sur les particules des sols (Barceloux
1999). Son utilisation repose aussi sur un coût faible de mise en pratique. Lyons et al. (2003)
évoquent un surcoût de 1.15 € à l’hectare pour fortifier un sol à hauteur de 10 g·ha-1 de séléniate.
En Finlande, la fertilisation a permis d’augmenter les fractions de masse en sélénium dans les
céréales d’une valeur initiale inférieure à 10 µg·kg-1 à des gammes allant de 50 à 250 µg·kg-1
(Hawkesford 2007).
Généralement, le sélénium se retrouve majoritairement sous forme de SeMet dans le blé (Polec
2005, Wolf 2007) ce qui lui permet d’être biodisponible (Barceloux 1999, Lyons 2003). Warburton
et al. (2007) ont montré qu’une fois assimilé dans le blé, le sélénium provenant d’un sol enrichi en
séléniate se retrouve encore majoritairement sous forme de SeMet dans la farine. Ils ont
55
également démontré que SeMet est le composé majoritaire dans le pain fabriqué à partir de cette
farine.
La fertilisation des sols doit également être effectuée avec pour but d’optimiser l’accumulation de
Se et non pas la maximiser. De plus, l’augmentation de la concentration des plantes ne doit pas
être réalisée en compétition avec d’autres éléments essentiels (comme le soufre) (Hawkesford
2007). Suite à la fortification du sol, aucun effet phytotoxique ni de pollution d’autres
compartiments environnementaux n’a été observé jusqu’à présent (Lyons 2003).
Les espèces utilisées dans les apports en sélénium doivent également être précisément connues
pour pleinement évaluer les risques associés à leur consommation.
1.4.2 Risques liés à la supplémentation
Le risque majeur lié à une supplémentation en Se est d’atteindre des niveaux d’apports où la
toxicité du sélénium se manifeste. Plusieurs études ont été menées pour déterminer la dose
maximale de sélénium n’induisant pas d’effets notoires.
Yang et al. (1983) ont étudié plusieurs populations chinoises de la région sélénifère du Enshi où
des cas de sélénose ont été observés. Une intoxication est survenue pour des apports en
sélénium compris entre 3200 et 6690 µg·j-1 (moyenne de 4990 µg·j-1 sur 6 individus) tandis
qu’aucun effet n’est enregistré pour des doses de 240 à 1510 µg·j-1 (moyenne de 750 µg·j-1 sur 3
individus).
Longnecker et al. (1991) ont suivi pendant un an deux populations composées de 78 et 64
individus vivant dans des zones sélénifères du Dakota et du Wyoming (USA). L’apport journalier
moyen y était de 239 µg·j-1 et aucun cas de sélénose n’a été observé y compris sur les sujets les
plus exposés (jusqu’à 724 µg·j-1).
De ces deux études il ressort donc qu’une dose d’environ 750 µg·j-1 en Se ne produit aucun effet
sur la santé humaine.
En 2000, le comité scientifique pour les aliments de la commission européenne s’est prononcé sur
des valeurs de limite supérieure d’apport en Sélénium selon l’âge (Tableau 8). Ces valeurs sont
dérivées de celles n’induisant aucun effet auxquelles sont affectées un coefficient de sécurité
tenant compte des incertitudes liées à leur détermination.
56
Tableau 8 : Limites supérieures d'apport quotidien en sélénium (SCF 2000)
Population Limite supérieure (µg·j-1)
1-3 ans 60
4-6 ans 90
7-10 ans 130
11-14 ans 200
15-17 ans 250
Adultes, femmes enceintes ou allaitant 300
La Figure 8 résume la connaissance des effets et des apports en sélénium sur la santé. Il apparaît
donc que la population peut se trouver en déficit mais, du fait d’une plage étroite des
concentrations entre essentialité et toxicité, la supplémentation peut s’avérer risquée si elle n’est
pas correctement contrôlée et encadrée.
Figure 8 : Classification des apports journaliers e n sélénium sur une échelle logarithmique
1.4.3 Législation
La législation sur les compléments alimentaires est fixée dans le droit européen par la directive
2002/46/CE. Elle définit les substances pouvant être utilisées pour leur fabrication. Concernant le
sélénium, ces substances sont le séléniate de sodium (Na2SeO4), l’hydrogénosélénite de sodium
(NaHSeO3) et le sélénite de sodium (Na2SeO3). L’ambiguïté de cette directive réside dans le fait
que seules apparaissent les espèces pouvant servir à la fabrication des suppléments et non celles
figurant dans leur composition finale. Dans le cas des levures, celles-ci sont largement différentes
dans le produit fini.
57
La transposition de cette directive dans le droit français (arrêté du 9 mai 2006) reprend les mêmes
contraintes de fabrication mais se révèle moins équivoque car la possibilité d’utiliser des levures
séléniées est autorisée jusqu’au 31 décembre 2009. De plus, l’arrêté fixe un apport maximal en
sélénium total par le traitement de 50 µg·j-1.
Récemment, l’autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA), au travers d’un avis
scientifique d’un groupe de travail sur les additifs alimentaires, a émis un rapport sur l’utilisation de
levures séléniées comme complément alimentaire (EFSA 2008). Ses conclusions portent sur
l’utilisation de cinq levures commerciales dont les caractéristiques de chacune ont été détaillées et
fournies par le fabricant :
- concentration totale en sélénium
- concentration en SeMet, Se inorganiques et autres espèces organiques
- source de sélénium pour la culture des levures.
Au vu de ces informations, de la possibilité d’un apport de la part des compléments de 100 ou 200
µg·j-1 de Se et d’une contribution liée à l’alimentation de 30 à 70 µg·j-1, le panel d’experts est arrivé
à la conclusion que la limite supérieure de 300 µg·j-1 n’était pas atteinte et que l’utilisation de ces
compléments, précisément caractérisés, ne présentait pas de problèmes de santé alimentaire.
Il est donc essentiel de pouvoir correctement et exactement définir les propriétés d’un complément
alimentaire mis sur le marché pour s’assurer de son innocuité. Leur caractérisation permet de
juger s’ils sont acceptables au yeux des autorités (AFSSA 2002a) ou s’ils ne risquent pas
d’entraîner des intoxications au sélénium (Sutter 2008).
L’utilisation de la fortification des champs agricoles relève plus du ressort des pouvoirs publics
pour décider d’une politique générale d’amélioration de la santé publique, comme celle menée
avec succès par la Finlande en 1984. Néanmoins, les méthodes servant à caractériser les
céréales doivent être également mises en place et éprouvées pour réaliser un suivi fiable des
concentrations en sélénium et de leur qualité au sein de tels échantillons.
1.5 Protocoles d’analyses
Comme vu précédemment, il est essentiel de pouvoir accéder aux caractéristiques des
échantillons de levures et de blé, et plus précisément à leur contenu en espèce majoritaire : la
sélénométhionine. Sa détermination permet de définir la qualité du produit, de s’assurer que le
sélénium sera bien disponible et assimilable pour l’organisme et surtout d’évaluer les dangers liés
à la toxicité du sélénium.
1.5.1 Méthodes de traitement de l’échantillon
L’étape d’extraction est cruciale pour l’analyse de spéciation. Son objectif premier est de rendre
solubles les analytes contenus dans l’échantillon solide afin qu’ils soient compatibles avec leur
58
analyse. Les contraintes associées à cette étape résident dans l’obligation d’être quantitatif pour
permettre un résultat fiable tout en ne modifiant pas la répartition originelle de l’échantillon.
1.5.1.1 Extraction depuis des levures
En fonction de la fraction du sélénium étudiée dans les levures, plusieurs agents et protocoles
d’extraction sont proposés dans la littérature.
Casiot et al. (1999a) ont comparé la capacité de plusieurs réactifs à mettre en solution les espèces
séléniées d’une levure :
- l’eau seule, un milieu tamponné par le Tris-HCl (Tris-(hydroxyméthyl)aminométhane) ou un
mélange HCl/méthanol pour récupérer la fraction hydrosoluble de la levure
- le dodécylsulfate de sodium (SDS) qui solubilise les chaînes polypeptidiques par formation de
paires d’ions avec les peptides
- la Driselase, composée du mélange d’enzymes (laminarinase, xylanase et cellulase), dont
l’action vise les parois cellulaires
- l’utilisation combinée d’une enzyme protéolytique (décomposition des protéines en acides
aminés) comme la pronase E et d’une enzyme capable de digérer les lipides : la lipase VII
- l’hydroxyde de tétra-méthyl ammonium (TMAH) qui produit une hydrolyse alcaline des
échantillons.
L’efficacité d’extractions de ces différents solvants a été comparée par ces auteurs. Hormis dans le
cas du TMAH, un résidu solide a été observé après la mise en solution. L’étude de la spéciation de
l’extrait de TMAH a démontré, bien que l’extraction fût quantitative, qu’elle ne respectait pas la
spéciation initialement présente dans l’échantillon. Le protocole utilisant le mélange pronase/lipase
a montré qu’il était le plus efficace avec 88% d’extraction. Les autres protocoles ont montré une
efficacité inférieure à 50%. Ce résultat confirme que le sélénium au sein des levures séléniées est
contenu majoritairement dans ses protéines sous forme d’acides aminés. Les principales
limitations de l’extraction enzymatique sont liées à i) une extraction non quantitative du sélénium et
ii) un temps d’action long puisque l’hydrolyse se réalise à 37 °C pendant 16 h. En dépit de ces
inconvénients, ce protocole s’est révélé comme la technique la plus utilisée dans la quantification
des acides sélénoaminés depuis son introduction par Gilon et al. en 1996. Des comparatifs ont été
menés sur les différentes enzymes disponibles pour mener cette extraction (Larsen 2003, Yang
2004c) cependant le mélange Protéase XIV/ Lipase VII (aux proportions 2/1 entre enzymes et 10/1
entre échantillon/protéase) s’avère l’un des plus efficaces.
Pour améliorer les rendements globaux d’extraction, des études ont été orientées vers l’utilisation
d’extractions séquentielles combinant les différentes propriétés des réactifs.
Ruiz Encinar et al. (2003) ont proposé le schéma d’extractions successives suivant :
- eau
- Driselase
59
- SDS
- hydrolyse enzymatique (pronase + lipase)
- TMAH.
Ce protocole permet d’atteindre une extraction quantitative mais sans garantie du maintien de la
spéciation tout au long du procédé (en particulier avec l’utilisation finale de TMAH). De plus, son
application sur plusieurs échantillons de levures a démontré la difficulté d’être reproductible entre
différentes matrices. Les recherches de Ruiz Encinar et al. avaient pour but d’étudier les chaînes
polypeptidiques dans lequel se situent les acides aminés séléniés. Ce protocole n’est donc pas
adapté pour l’analyse des acides aminés seules, et son utilisation pour cet objectif demande de
soumettre la plupart des surnageants à une hydrolyse enzymatique (Polatajko 2004).
Une autre possibilité pour améliorer l’extraction par des enzymes protéolytiques est la répétition de
leur action. Polatajko et al. (2005) ont reproduit trois fois l’extraction par le mélange Protéase XIV
et Lipase VII (37 °C pendant 17 h) avec pour but de déterminer la concentration en
sélénométhionine d’une levure. Ils obtiennent sur leur échantillon un rendement d’extraction de
93% en sélénium total. Ils ont testé par la suite l’extraction du résidu par de l’eau, de la Driselase,
du TMAH ou du SDS. La plus grande efficacité est atteinte par l’utilisation du SDS qui solubilise
35% du Se du culot. Dans cet extrait, ils ont reporté que SeMet représente 40 % du sélénium
résiduel, soit une part de 1 à 1.5 % de la totalité de SeMet extraite. La soumission de cet extrait
par les auteurs à une hydrolyse enzymatique a diminué la quantité de SeMet présente à cause de
son oxydation au cours du temps (même en présence d’agents anti-oxydants).
Hinojosa et al. (2006) ont aussi utilisé les propriétés complémentaires de plusieurs agents avec
l’action dans un premier temps de la Driselase sur la levure. Après une première incubation de 4 h,
ils ajoutent dans le mélange échantillon/Driselase de la protéase XIV pour une seconde incubation
de 20 h. Leur protocole permet d’être quantitatif sur la moitié des échantillons analysés mais il
n’est pas démontré que l’étape préliminaire avec la Driselase améliore l’efficacité de l’extraction
protéolytique.
La méthode développée par Peachey et al. (2008) repose sur deux étapes de 20 h avec en
premier lieu l’utilisation du mélange protéase/lipase puis l’action de la Driselase. Leur protocole a
pu être validé avec l’analyse d’un CRM de levure certifié pour sa fraction de masse en SeMet
(SELM-1) par dilution isotopique.
L’utilisation de la Driselase semble nécessaire pour mettre en solution un maximum de SeMet.
Outre sa présence au sein de protéines séléniées, atteintes par l’utilisation de protéases, SeMet
semble lié physiquement aux parois cellulaires (Polatajko 2004). L’action de la Driselase cible
celles ci et peut potentiellement améliorer le rendement d’extraction de SeMet.
60
Comme évoqué précédemment, l’utilisation de l’hydrolyse enzymatique demande un temps long
d’action avec une incubation variant de 16 à 20 h. Plusieurs études ont été menées afin de
diminuer le temps d’action.
Capelo et al. (2004) ont employé un stick à ultra-son permettant de focaliser l’énergie des ondes
directement dans l’échantillon. Ainsi, ils sont arrivés à réduire le temps de réaction à 30 s mais
avec seulement une efficacité d’extraction de 87% de la valeur estimée en SeMet. Hinojosa et al.
(2004) ont également testé cette technologie en utilisant la dilution isotopique (où l’extraction
quantitative n’est pas une nécessité si l’équilibre entre l’étalon marqué et analyte est atteint). Leur
résultat est aussi inférieur à celui obtenu par une extraction protéolytique. La modification de la
spéciation a également été observée par l’apparition de SeMet oxydée suite à l’application du stick
à ultra-sons (Pedrero 2007b). Une autre limite du dispositif réside dans l’introduction de la sonde
directement dans l’échantillon, ce qui peut être une source de contamination ou de pertes
d’analytes. De plus un seul échantillon est préparé à la fois.
Ayouni et al. (2006) ont utilisé le bain à ultrasons pour ne soumettre l’échantillon qu’à 3 h
d’extraction. Sur une levure séléniée et une tablette pharmaceutique, ils arrivent à identifier entre
60 et 65% des espèces de sélénium contenues en démontrant que SeMet est le composé
majoritaire dans chaque échantillon.
Peachey et al. (2008) ont réalisé une activation des enzymes assistée par les micro-ondes. Ils
utilisent un four permettant de focaliser les ondes sur l’échantillon. Les analyses d’un CRM (SELM-
1) et d’un échantillon provenant d’un exercice d’intercomparaison ont permis de valider la méthode
mise au point. Les limites d’un tel dispositif résident dans l’utilisation de faibles quantités
d’échantillon (40 mg) pour mener l’analyse. Généralement, les prises d’essais sont de l’ordre de
100 à 200 mg pour assurer l’homogénéité du matériau. De si faibles prises d’essai peuvent poser
des problèmes dans le cas d’analyse d’échantillons hétérogènes. De plus, l’observation sur les
chromatogrammes de la présence de SeMet oxydée laisse présumer d’une dégradation des
analytes au cours du protocole (même si l’emploi de la dilution isotopique a limité son impact sur la
détermination de SeMet).
L’hydrolyse acide des protéines est une technique alternative à l’utilisation d’enzymes pour libérer
les acides aminés des chaînes polypeptidiques (Anders 2002). L’échantillon est mis en présence
d’acide, dans un montage à reflux pour 1 à 24 h. Des conditions anoxiques sont souvent
nécessaires pour éviter l’oxydation des acides aminés libérés.
Wrobel et al. (2003) ont utilisé l’acide méthane-sulfonique (MeSA) en présence de
mercaptoéthanol pour limiter l’oxydation lors de l’hydrolyse de l’échantillon de levure. Ils sont
arrivés à la conclusion qu’un temps de 8 h était nécessaire pour atteindre une extraction maximale
(65% de Se extrait). La comparaison avec l’extraction enzymatique laisse suggérer d’une meilleure
efficacité de l’utilisation d’acide pour digérer les protéines (seulement 46% de Se extrait avec les
61
enzymes). Cependant ce résultat ne permet pas de totalement trancher entre les deux méthodes,
car le protocole utilisé pour les enzymes ne reposait par sur leur emploi dans des conditions
optimales : 100 mg de levure extrait par 20 mL de Tris-HCl en présence de 20 mg de protéinase K
pendant 18 h à 50 °C, puis répétition avec une nouv elle quantité de protéinase K pendant 6 h et
finalement ajout de 20 mg de protéase XIV et incubation à 37 °C pendant 6 h.
L’utilisation des micro-ondes en système ouvert a permis d’accélérer l’hydrolyse acide avec un
protocole de 2 h d’extraction à 300 W en présence de MeSA à 8 mol·L-1 (Yang 2004a). Cependant,
la comparaison menée par les auteurs a montré que cette extraction n’était pas aussi efficace que
l’hydrolyse acide (menée avec MeSA).
McSheehy et al. (2006) ont étudié l’efficacité de l’hydrolyse acide sur une chaîne polypeptidique
synthétique et sur une protéine de levure. Ils sont arrivés aux conclusions que cette technique est
efficace pour libérer et préserver les acides aminés pendant l’extraction.
La comparaison entre hydrolyse acide et hydrolyse enzymatique a été menée par Yang et al.
(2004c) : l’extraction par l’acide méthane-sulfonique se révèle plus efficace que celles utilisant les
enzymes (différents protocoles et d’enzymes sont testés).
Les auteurs ont également optimisé l’hydrolyse enzymatique pour arriver à être quantitatif. Il en
résulte deux choix de protocoles pour analyser 100 mg d’échantillons :
- utiliser 200 mg de protéase XIV pendant 72 h
- employer 400 mg de protéase XIV pendant 24 h.
L’utilisation de telles quantités d’enzymes pose cependant un problème sur la contamination des
échantillons par l’hydrolyse même des protéases qui peut libérer une quantité non négligeables
d’acides aminés séléniés (Cuderman 2009).
Une autre comparaison des techniques d’extraction a été réalisée au cours de la campagne de
certification du seul matériau garanti pour sa concentration en sélénométhionine : la levure
séléniée SELM-1 (Mester 2006). L’intercomparaison a montré que les deux techniques
d’extractions fournissent des résultats fiables. Elle met surtout en avant la difficulté que représente
la caractérisation d’un échantillon pour sa concentration en SeMet : sur les sept laboratoires
comparés, quatre seulement ont obtenu des résultats proches de la valeur certifiée alors que
l’échantillon ne contenait pas Se sous forme de traces (fraction de masse totale de 2059 ± 64
mg·kg-1).
1.5.1.2 Extraction depuis du blé
Au sein de la farine de blé, SeMet est principalement incorporée au niveau des chaînes
polypeptidiques (Barceloux 1999). L’extraction de SeMet doit donc être réalisée en ciblant ce
compartiment de la céréale.
62
La littérature permet de référencer les mêmes techniques que celle développées pour la levure. Il
est donc principalement utilisé pour extraire SeMet de la farine de blé :
- l'hydrolyse en présence d’acide méthane-sulfonique (Wolf 2007)
- l’extraction enzymatique (Diaz Huerta 2003, Moreno 2004, Polec 2005, Warburton 2007).
Les protocoles mis en place au cours de l’étude ont donc pu être testés sur chaque type
d’échantillon analysé (levure ou farine de blé).
1.5.2 Techniques séparatives
Différentes stratégies peuvent être envisagées pour réaliser la séparation des espèces du
sélénium. Les méthodes les plus utilisées reposent sur l’électrophorèse capillaire et la
chromatographie en phase gazeuse ou liquide (Uden 2005). Les choix analytiques dépendent des
objectifs visés qui sont de i) séparer efficacement les espèces de sélénium et ii) disposer d’un
mécanisme robuste pour assurer au maximum la répétabilité de cette étape en terme de rétention
et d’intensité de pic.
L’électrophorèse offre comme avantages une forte résolution sur la séparation, des temps
d’analyse relativement court. De plus, il n’y a pas d’interactions entre les analytes et une phase
stationnaire, ce qui limite la possible modification des équilibres entre les espèces au sein de
l’échantillon (Pyrzynska 2001). Cependant, son utilisation présente aussi des inconvénients. Une
faible quantité d’échantillons est analysée (quelques nanolitres) ce qui demande une parfaite
homogénéité de l’échantillon et soulève la question de la représentativité. Le haut voltage appliqué
à l’échantillon et la composition électrolytique du tampon peut aussi perturber l’équilibre des
espèces et limiter le respect de leur répartition en solution (Michalke 2003).
Pour ces raisons, la chromatographie a été le plus souvent préférée pour mener la séparation des
échantillons et plus précisément la chromatographie liquide haute performance (HPLC). Elle a
comme principal avantage, par rapport à la chromatographie gazeuse (GC), de ne pas nécessiter
d’étape de dérivation des composés pour leur volatilisation (Yang 2004b, Wolf 2007). Ainsi, les
risques de contamination, de perte ou de conversion des analytes peuvent être évités. De plus,
cette méthode dispose de nombreux mécanismes de séparation de composés de diverses
propriétés physico-chimiques.
Dans la littérature, parmi les principaux composés du sélénium sont étudiés le sélénite (SeIV), le
séléniate (SeVI), la sélénocystine (SeCys2) et la sélénométhionine (SeMet) dans différents types
de matrices (levures, eaux, végétaux ou tissus biologiques). Plusieurs mécanismes sont proposés
permettant le plus souvent la séparation simultanée des composés organiques et inorganiques.
63
Les principaux rencontrés sont :
- La chromatographie d’exclusion stérique (SEC) permettant de séparer les protéines et les
chaînes polypeptidiques selon leur taille (Yoneda 1997, Casiot 1999a, Cases 2001, Moreno
2004, Ogra 2005).
- La chromatographie chirale (CC) pour la séparation des différents énantiomères d’une même
molécule, comme les acides aminés séléniés (Sutton, 2000, Perez-Mendez, 2000, Ponce de
Leon, 2000).
- La chromatographie d’échange d’ions (IX : Ion eXchange) qui selon la charge des
groupements fonctionnels de la phase stationnaire permet la séparation des cations ou des
anions contenus dans l’échantillon injecté (Goessler 1997, Bird 1997, Casiot 1999a, Li 1999,
Moreno 2001, Larsen 2001, Ketavarapu 2005).
- La chromatographie de phase inverse avec appariements d’ions (IP-RP) où les composés
forment une paire d’ion avec l’agent présent dans la phase mobile. Celui-ci possède en général
une ou plusieurs chaînes alkyles qui interagissent avec la phase stationnaire apolaire (Bird
1997, Casiot 1999a, Zheng 2000).
Plusieurs mécanismes de séparations peuvent être mis en place simultanément par l’utilisation de
colonnes consécutives ou de chromatographie multidimensionnelle où les types de séparations
deviennent complémentaires (McSheehy 2002, Bierla 2008).
Les mécanismes de phase inverse avec appariement d’ions (IP-RP) et d’échange d’ions (IX) ont
démontrées leur capacités à séparer les espèces séléniées présentes dans des échantillons de
levures et de blé (Bird 1997, Casiot 1999a, B’Hymer 2000, Diaz Huerta 2003, Kotrebai 2000, Polec
2005, Warburton 2007). En conséquence, elles seront détaillées plus précisément du fait de leur
utilisation dans nos travaux.
Les phases mobiles compatibles avec le mécanisme de séparation retenu ont été utilisées. La
principale restriction sur leur composition, dans le cadre de notre étude, porte sur sa compatibilité
avec le détecteur choisi : l’ICP-MS. Les phases mobiles utilisées sur cet appareillage ne doivent
pas contenir de solvants organiques (tels que le méthanol ou l’acétonitrile) en trop grandes
proportions pour ne pas obturer les cônes de l’ICP-MS par un dépôt trop important de matières
organiques, déstabiliser le plasma ou entraîner une dérive du signal. Les concentrations en sels et
en solutions tampons sont également à limiter pour les mêmes raisons (nécessité d’une
concentration en sels inférieure à 1g·L-1).
Une précaution à prendre lors de l’utilisation de colonnes chromatographiques est de les équiper
d’une pré-colonne, composée de la même phase stationnaire ou de filtres, pour éviter leur
détérioration prématurée et la diminution de leur capacité de séparation par l’analyse de matrices
chargées.
64
1.5.2.1 Séparation par appariements d’ions
L’Annexe 1 regroupe les principales séparations par appariement d’ions couplées à une détection
par ICP-MS rencontrées dans la littérature pour l’analyse du sélénium.
La chromatographie d’appariements d’ions est utilisée dans la littérature majoritairement pour la
séparation des acides aminés séléniés.
La phase stationnaire est constituée d’un gel de silice greffé de chaînes de huit ou dix-huit
carbones.
Les différentes phases mobiles rencontrées dans la littérature comportent des compositions de
natures similaires. Un solvant organique est présent avec un agent d’appariement d’ions (composé
d’une tête chargée et d’une chaîne apolaire hydrophobe). Le méthanol est le solvant le plus
souvent rencontré avec des concentrations ne dépassant pas les 10% pour éviter les dépôts de
matières organiques au niveau de l’ICP-MS. Il est efficace pour diminuer la polarité de la phase
mobile, ce qui augmente sa force d’élution et réduit le temps d’analyse. Par contre il est préférable
d’éviter les gradients en phase organique car des effets mémoires au niveau du nébuliseur ont été
observés entraînant des augmentations de signal de Se sans lien avec sa concentration (Larsen
1998).
Habituellement, la séparation sur phase inverse avec appariement d’ions est réalisée en présence
d’une phase mobile composée majoritairement d’un solvant organique pour assurer l’élution des
composés. L’utilisation de l’ICP-MS limite sa présence, ce qui peut entraîner une séparation moins
performante. Cependant des solutions techniques existent pour permettre d’augmenter la quantité
de solvant organique. L’utilisation de micro-colonnes, d’un diamètre de 1 ou 2 mm au lieu de 4.6
mm, permet d’opérer avec des débits de phase mobile plus faibles, de l’ordre de 0.2 mL·min-1
(Montes 2006). La quantité de matière organique transportée est moindre même si la phase
mobile est plus chargée en méthanol. Ce type d’appareillage nécessite en contre partie un
nébuliseur adapté aux faibles débits pour la connexion avec l’ICP-MS. Une autre solution est
l’utilisation combinée d’un faible débit de phase mobile et l’ajout d’une arrivée d’oxygène dans le
plasma pour la combustion des matières organiques résiduelles. Bird et al. (1997) utilisent ainsi
une phase mobile composée de 65% de méthanol. Dans le cas de l’ajout d’oxygène dans le
plasma, l’utilisation de cônes en platine est préconisée pour éviter leur dégradation par oxydation.
La Figure 9 présente différents agents d’appariements d’ions reportés dans la littérature.
65
Figure 9 : Agents d’appariement d’ions utilisés
Les agents les plus employés pour la formation de paire d’ions sont (Bird 1997, Casiot 1999a,
Kotrebai 2000, Montes 2006) :
- l’acide trifluoroacétique (TFA)
- l’acide pentafluoropropionique (PFPA)
- l’acide heptafluorobutyrique (HFBA).
La partie ionique de ces trois agents est formée par une fonction acide. Leur différence provient de
la longueur de la chaîne carbonnée. L’utilisation de ces composés par rapport à d’autres agents
d’appariement, possédant généralement une chaîne alkyle et une fonction sulfonique, permet
d’obtenir de faibles pH idéaux pour la protonation de la fonction amine contenue dans certains
composés organoséléniés. De plus, la chaîne carbonnée perfluorée permet de meilleures
interactions hydrophobiques avec la phase stationnaire.
Kotrebai et al. (2000) ont testé ces trois agents sur des échantillons de levures et d’aulx. Ils sont
parvenus à la conclusion que le pouvoir de séparation augmentait avec le nombre de carbone
mais en contre partie le temps d’analyse était rallongé.
L’agent d’appariement d’ions le plus utilisé est le TFA. Ceci est dû au fait qu’il est plus volatil que
d’autres composés, ce qui permet de limiter les dépôts de carbone sur les cônes. Une autre raison
est qu’il est disponible en très grande pureté, limitant les possibilités de contamination des
échantillons.
Toutefois, l’utilisation de ce type d’agent ne permet pas toujours une résolution suffisante sur les
composés inorganiques du sélénium (B’Hymer 2000).
66
Une méthode pour permettre aussi la séparation des espèces inorganiques du sélénium est
l’utilisation combinée de deux agents de paires d’ions de charge opposée. Zheng et al. (2000)
utilisent l’hydroxyde de tétraméthyl d’ammonium (TMAH) pour les espèces anioniques et le 1-
butanesulfonate de sodium (1-BS) pour les cations en présence d’acide malonique contenant
0.05% de méthanol à un pH de 4.5. Ainsi, ils sont arrivés à séparer efficacement les deux formes
de sélénium inorganique et plusieurs composés organiques. Zheng et al. (2003) ont aussi testé
l’utilisation d’un agent cationique seul, l’hydroxyde de tétraéthyl d’ammonium (TEAH) à 10 mmol·L-
1 dans 4.5 mmol·L-1 d’acide malonique à un pH de 6.8. La plupart des composés du sélénium
(organiques et inorganiques) sont séparés efficacement par cette phase mobile, seuls la
sélénocystine (SeCys2) et l’ion triméthylsélénonium (TMeSe+) sortent à des temps de rétention
similaires gênant leur détermination.
Si le pH de la phase mobile doit être ajusté, l’acide conseillé est l’acide nitrique. La base
préconisée est l’hydroxyde d’ammonium à cause de sa volatilité et pour éviter l’utilisation d’autres
bases composées de sodium, pouvant obstruer les cônes de l’ICP-MS et créer des interférences
non-spectroscopiques.
1.5.2.2 Séparation par échanges d’ions
L’annexe 2 répertorie les différentes analyses de spéciation du sélénium rencontrées dans la
littérature utilisant l’échange d’ions comme technique séparative, associée à une détection par
ICP-MS.
Sur la phase stationnaire de la colonne composée de polymères (styrène et/ou divinylbenzène) ou
de silice sont greffés des groupements sulfonique ou carboxylique pour l’échange de cations ou
des fonctions amines primaires ou quaternaires pour l’échange d’anions.
Pour ce mécanisme, le pH est un paramètre essentiel à maîtriser. En fonction de celui-ci, les
différents composés à analyser comportent différentes charges, ce qui modifie leurs interactions
avec la phase stationnaire. Pour cette raison, les phases mobiles rencontrées dans la littérature
sont composées de solutions tampons toutefois à des concentrations inférieures à 100 mmol·L-1
pour ne pas encrasser le nébuliseur (Szpunar 2000).
La force ionique de la phase mobile influe également sur l’élution des composés, une trop forte
concentration en ion développeur augmente l’élution des acides aminés séléniés, pouvant
provoquer leur recouvrement avec d’autres espèces en sortie de colonne (Moreno 2001).
Pour la chromatographie d’échanges d’anions, l’ion développeur qui semble le mieux adapté pour
une détection par ICP-MS est le citrate d’ammonium (Bird 1997, Li 1999, Moreno 2001, Darrouzès
2005). Contrairement à d’autres réactifs, il n’est pas composé de sels métalliques qui risquent de
déstabiliser le plasma. Moreno et al. (2001) l’ont comparé avec les tampons salicylate et tartrique.
Ils ont trouvé que le tampon citrate était le plus efficace pour éviter le recouvrement des pics et
qu’il améliorait le profil du pic de sélénométhionine.
67
Le citrate d’ammonium est utilisé à une concentration voisine de 5 mmol·L-1 et d’un pH de 5 (de
4.8 à 5.5) par les différents auteurs. Ainsi plusieurs espèces : TMeSe+, SeCys2, SeIV, SeMet et
SeVI peuvent être séparées efficacement à partir de leur mélange dans des solutions
synthétiques.
Lors de l’utilisation de la chromatographie d’échanges de cations, le solvant rencontré est la
pyridine en présence d’acide formique (Goessler 1997, Moreno 2001, Larsen 2003, Ketavarapu
2005). La pyridine est utilisée à cause de sa volatilité qui évite l’obstruction des cônes de l’ICP-MS.
Différentes conditions de concentrations et de pH sont testées par les auteurs. La comparaison
des résultats montre que la séparation des composés séléniés dépend fortement du type de
matrice étudiée. Afin de favoriser l’élution de certains composés, un gradient de phase mobile peut
être employé jouant sur différentes concentrations de pyridine à différents pH mais cela entraîne
une modification du bruit de fond et peut éventuellement déstabiliser le plasma (Ketavarapu 2005).
Afin d’augmenter la sensibilité de l’ICP-MS vis à vis du sélénium, comme pour la chromatographie
d’appariements d’ions, un pourcentage de 2 ou 3% de méthanol peut être ajouté à la phase mobile
(Bird 1997, Guerin 1997, Ketavarapu 2005).
1.5.3 Technique de détection : l’ICP-MS
1.5.3.1 Généralités
Afin de pouvoir utiliser la dilution isotopique comme méthode de quantification du sélénium, la
détection se réalise par un spectromètre de masse à couplage inductif du plasma (ICP-MS)
capable de trier les éléments selon leur masse, donc d’analyser individuellement chacun de ses
isotopes. Grâce à une grande sensibilité, cet appareillage permet une analyse des éléments à
l’état de traces et d’ultratraces.
Au sein d’un ICP-MS, l’échantillon nébulisé est introduit dans la torche à plasma (opérant à des
températures comprises entre 5 000 et 10 000 K) pour permettre l’atomisation des molécules et
l’ionisation au premier degré des éléments. Les cations ainsi formés sont guidés par une interface
composée de cônes et de lentilles optiques jusqu’à l’analyseur. Le plus souvent, ce dernier est
composé d’un quadripôle permettant de trier les particules selon leur rapport masse sur charge
(noté m/z). En fin de parcours, les ions sont ensuite comptés par un détecteur. La Figure 10
représente le schéma général d’un ICP-MS quadripolaire.
68
Figure 10 : Schéma général d'un ICP-MS de type quadr ipolaire (Potin Gautier 2001)
La détection par ICP-MS souffre principalement d’une forte sensibilité à la matrice de l’échantillon.
Cette sensibilité est également exacerbée par la formation d’interférences.
1.5.3.2 Interférences
Les interférences se divisent en deux catégories :
- spectroscopiques issues d’un recouvrement de signal par un élément de même masse,
doublement chargé, un assemblage de plusieurs éléments ou la formation d’oxydes.
- non spectroscopiques provenant de la viscosité de la matrice, d’effets d’espaces (ions les plus
légers déviés hors de la trajectoire) ou d’une perte d’ionisation par le transfert sur d’autres
éléments (Darrouzes 2006).
Alors que la résolution de la plupart des interférences non spectroscopiques peut être facilement
obtenue par le biais de la dilution de la matrice de l’échantillon, par l’utilisation d’étalons internes
ou de techniques de dosages autres que l’étalonnage externe (Vanhaecke 2003), les interférences
spectroscopiques posent plus de problèmes, d’autant plus pour un appareil muni d’un quadripôle
qui ne dispose que d’une faible résolution égale à une demi-unité atomique (Vanhaecke 2003).
Les isotopes du sélénium sont particulièrement perturbés par les interférences spectroscopiques
de par l’utilisation d’argon pour la génération du plasma (Tableau 9). Leur présence a d’ailleurs
limité l’analyse du sélénium avec ce détecteur pendant de nombreuses années.
69
Tableau 9 : Listes de plusieurs interférents possib les sur les isotopes du sélénium (May 1998)
Isotope Abondance (%) Interférences
74 0.89 37Cl37Cl+, 36Ar38Ar+, 38Ar36S+, 40Ar34S+
76 9.37 40Ar36Ar+, 38Ar38Ar+
77 7.63 40Ar37Cl+, 36Ar40Ar1H+, 38Ar21H+,
78 23.77 40Ar38Ar+
80 49.61 40Ar40Ar+
82 8.73 40Ar21H+, 35Cl2
12C+
L’introduction sur le marché des ICP-MS munis de cellules de collisions et/ou de réactions a
permis de limiter leur impact. Il s’agit d’analyseurs de type quadripolaire composés de quatre, six
ou huit barres (en fonction des fabricants) positionnés avant le quadripôle principal (Figure 11). La
cellule est le plus souvent remplie d’un gaz « tampon » (de type hélium) et d’un second gaz de
« réaction » (de type hydrogène).
Figure 11 : Configuration de l'ICP-MS PQ-Excell (Therm o)
Le gaz « tampon » permet la thermalisation partielle des ions par collisions, c’est à dire qu’il
ramène les particules introduites par le plasma dans un équilibre thermodynamique avec les
molécules présentes dans la cellule. Cette thermalisation a pour principale conséquence de
diminuer l’énergie cinétique des ions et ainsi d’augmenter les réactions dans la cellule et améliorer
l’efficacité de transmission des ions (Feldmann 1999, Tanner 2002). Les interférences sont par la
suite éliminées au contact du gaz de réaction (Iglesias 2002, Tanner 2002, Darrouzes 2006) :
- par transfert de charge : ++ +→+ XMXM
- par transfert de proton : MHHMH +→+ ++32
70
- par transfert d’hydrogène : XMHXHM +→+ ++
- par transfert d’atome : XMOXOM +→+ ++ .
Les collisions entre les interférents et le gaz tampon permettent également une réduction des
interférences par fragmentation de l’ion moléculaire mais ce phénomène est secondaire (Tanner
2002).
Un troisième phénomène prend place dans la cellule : la discrimination par l’énergie cinétique.
L’application d’un potentiel électrique continu et négatif à la cellule de collision/réaction génère une
barrière d’énergie permettant d’éliminer les ions de moindres énergies (comme les nouvelles
interférences produites dans la cellule) (Feldmann 1999, Tanner 2002). Ce phénomène n’est
possible que par la partielle thermalisation des ions issus du plasma ; si elle était complète tous les
ions disposeraient de la même énergie (Tanner 2002).
1.5.3.3 Sensibilité
En raison de son énergie de première ionisation élevée (9.75 eV), le sélénium n’est que
partiellement ionisé dans le plasma avec un taux de 33% (Jarvis 1992). Pour remédier à cet
handicap, plusieurs solutions ont été proposées.
L’augmentation de la quantité d’aérosol introduite dans le plasma peut s’avérer être une solution
intéressante. En effet, les nébuliseurs conventionnels de type pneumatiques ne transportent
seulement que 1 à 3% de l’échantillon vers le plasma. L’utilisation de modèles ultrasoniques
permet un transfert dix fois supérieur, de 10 à 30% (Potin-Gautier 2001). Ainsi, Goenaga et al.
(2004) ont amélioré avec ce système leur limite de détection (LD) d’un facteur 3 sur SeMet (3.7
ng·L-1). Ce procédé n’est pas dépendant de l’analyte, et un gain en sensibilité peut être espéré sur
l’ensemble du spectre de masse.
Pour améliorer le transport de Se dans le plasma, la génération d’hydrures peut également être
utilisée. Dans ce cas, le sélénium est transformé en phase gazeuse pour être directement introduit
dans la torche de l’ICP-MS. Darrouzes et al. (2008) ont diminué par deux la LD sur SeMet (8 ng·L-1
sur 80Se).
Larsen et al. (1994) ont agi sur l’ionisation du sélénium. Pour cela, ils utilisent un solvant organique
pour augmenter la densité de population de carbone ionisé dans un plasma à forte puissance
(1350 W). L’énergie de première ionisation du carbone (11.26 eV) étant supérieure à celle du
sélénium, les atomes de Se non ionisés le deviennent par transfert d’électrons aux cations du
carbone. Ainsi un gain de sensibilité compris entre 3 et 4 peut être obtenu et l’effet peut être utilisé
pour tout élément difficilement ionisable dont le potentiel de première ionisation est inférieur à celui
du carbone.
Warburton et al. (2007) ont utilisé le même effet en introduisant du méthane directement dans le
plasma d’argon. Ainsi, ils obtiennent une augmentation du signal par un facteur 9 et même par un
71
facteur 11 si l’échantillon est contenu dans 2 % de méthanol. La LD obtenue sur la détermination
de SeMet est de 0.49 ng·L-1.
L’utilisation de la cellule de collisions/réactions permet également une augmentation du signal par
l’augmentation de l’efficacité de transmission des ions jusqu’au quadripôle.
1.5.4 Dilution isotopique
Seulement quelques travaux ont été réalisés sur le dosage de la sélénométhionine par dilution
isotopique (DI) avec utilisation d’un ajout de SeMet marqué isotopiquement.
Wolf et al. (2001) ont été les premiers à utilisé un étalon de 74SeMet sur des échantillons de gluten
de blé et de levures analysés par GC-MS. Par la suite, ils ont amélioré leur technique afin d’arriver
à une méthode fiable et robuste sur ces deux types de matrices (Wolf 2004 et 2007, Mester 2006).
Le groupe de recherche du Conseil National de Recherches Canada (NRCC) a aussi appliqué la
dilution isotopique à l’analyse de SeMet dans le but de certifier une levure séléniée. Leur
démarche est passée par la mise en place de différentes techniques :
- utilisation d’un étalon marqué en 13C pour le dosage par GC-MS et HPLC-MS (Yang 2004a,
McSheehy 2005)
- utilisation d’un étalon marqué en 74Se pour le dosage par GC-MS, GC-ICP-MS, et HPLC-ICP-
MS (Yang 2004b, McSheehy 2005).
Leur approche a permis de valider les méthodes pour pouvoir certifier un CRM. La principale
restriction provient de l’emploi d’une unique technique d’extraction comme préparation de
l’échantillon, même si elle fut sélectionnée après une comparaison de plusieurs modes possibles
(Yang 2004c) et par la suite confortée par un essai d’intercomparaison (Mester 2006).
Ruiz Encinar et al. (2004) ont utilisé la dilution isotopique pour doser SeMet contenue dans les
protéines du sérum humain. Leur méthode n’a pas permis de bénéficier de tous les avantages de
la DI, vu que l’ajout de l’étalon marqué est réalisé en cours d’extraction et non pas dès le départ.
Un frein au développement de la dilution isotopique menée à partir des espèces marquées (SS-ID)
en sélénium est le manque d’étalons disponibles commercialement.
Plenneveaux et al. (1987) ont proposé un schéma réactionnel pour synthétiser SeMet à partir de
sélénium élémentaire pour son utilisation dans des diagnostics cliniques.
Hinojosa et al. (2004 et 2006) ont utilisé une voie biochimique par l’emploi de levures cultivées sur
un milieu riche en sélénite de sodium marqué isotopiquement. Une fois que l’étalon marqué de
SeMet est extrait de la levure et purifié, il est utilisé pour mener la dilution isotopique sur une
levure séléniée. Leur application de la DI a été élaborée en plusieurs étapes pour démontrer
l’efficacité de leur protocole. En particulier, ils mettent en évidence qu’un résultat issu d’une
72
intercomparaison n’est pas suffisant pour se prononcer sur une valeur de référence d’un matériau,
mais qu’il ressort seulement une valeur consensuelle.
Dans le développement de la dilution isotopique au sein des différents laboratoires, les principales
difficultés rencontrées concernent l’extraction des analytes de l’échantillon. Même avec l’utilisation
de la DI, les contraintes n’ont pas pu toutes être levées, en partie en raison de la difficulté d’obtenir
un équilibre entre la molécule d’intérêt (en phase solide) et celle marquée isotopiquement (en
phase liquide). Les avantages de la DI ne peuvent être acquis que par l’élaboration d’un protocole
d’extraction i) quantitatif et ii) ne créant pas de différences entre l’étalon marqué et l’analyte avant
sa mise en solution.
Malgré ces limitations, la DI s’avère la méthode la plus efficace pour doser des analytes. Elle offre
la plus grande justesse possible (Mester 2006) et la plus grande robustesse face à l’évolution des
analytes, une fois l’équilibre avec l’étalon marqué obtenu (Pedrero 2007b).
1.5.5 Approche métrologique
L’apsect métrologique est présent dans beaucoup d’articles précédemment cités, même si le
terme n’y apparaît pas toujours. A partir du moment où des questions sont soulevées concernant
le processus de mesure, sa fidélité, sa justesse, sa validation ou l’association d’une incertitude au
résultat, il s’agit de métrologie. Le problème provient du manque de comparabilité des mesures par
manque de traçabilité au SI.
Ce manque de traçabilité provient également d’une insuffisance dans l’estimation des incertitudes
de mesures. Jusqu’à présent, dans le cadre de l’analyse de SeMet, peu de bilans sur l’incertitude
ont été développés. L’usage veut qu’il soit seulement associé au résultat l’écart-type de la mesure,
éventuellement affecté d’un coefficient de student pour élargir sa probabilité de représenter la
dispersion des résultats. Pourtant l’association au résultat d’une incertitude, outre l’attribution d’une
donnée quantitative sur sa valeur, est un outil indispensable dans la démonstration de la traçabilité
de la méthode au SI. L’incertitude permet également, si le bilan est réalisé sous certaines
conditions, de mettre en avant les paramètres importants affectant la fidélité du résultat. Cette
mise en avant des paramètres influents est également une première étape dans l’amélioration du
processus de mesure pour renforcer la fidélité de la mesure.
Un autre aspect de la métrologie passe par sa dissémination aux niveaux des utilisateurs pour leur
permettre de se raccorder aux mêmes références. La production de CRMs est un des moyens
utilisés dans le cas de l’analyse des quantités de matière. Au niveau de l’analyse de spéciation du
sélénium, une première étape a pu être franchie avec la mise sur le marché du SELM-1 (Mester
2006), cependant ce matériau ne répond pas à tous les cas de figures et d’autres matériaux seront
à développer au cours des prochaines années. Il est donc du ressort des Instituts Nationaux de
73
Métrologie, et donc a fortiori du LNE, de mettre en place des protocoles métrologiques pour
permettre la certification de tels matériaux et leur raccordement au SI.
1.6 Bilan et choix analytiques
Au cours de cette revue bibliographique des choix ont pu être affirmés pour mener à bien le
développement d’un protocole métrologique pour l’analyse du sélénium dans des matrices
environnementales et agroalimentaires.
L’étude d’échantillons de levure et de blé s’avère intéressante au vu de leur potentiel d’apport
nutritionnel en sélénium. Pour pleinement juger de leur impact dans la chaîne alimentaire, une
simple étude de leur concentration en Se total ne suffit pas et la détermination de leur composition
en espèces se révèle nécessaire, en particulier l’accession à leur concentration en SeMet, du fait
de ses propriétés bénéfiques sur la santé.
La mise en place de l’analyse de la spéciation demande une optimisation à plusieurs niveaux :
- l’extraction des composés avec la plus grande efficacité possible tout en préservant la
répartition originelle des espèces dans l’échantillon, les hydrolyses acide et enzymatique ont
été retenues au vu de leur potentiel pour libérer SeMet dans ces types d’échantillons,
- la séparation efficace des espèces par l’utilisation de la chromatographie liquide avec soit un
mécanisme d’échange d’ions soit un mécanisme en phase inverse avec appariement d’ions,
- la détection par ICP-MS avec pour objectifs d’être sélectif, sensible et reproductible.
Une fois ces étapes maîtrisées, l’apport métrologique a été abordé avec i) le calcul de l’incertitude
sur les différents résultats, ii) la validation de méthode par l’analyse d’un CRM, iii) la
reconnaissance des capacités de mesures au niveau du BIPM par le biais d’une participation à
une intercomparaison. Au final la traçabilité au SI des mesures doit être assurée.
74
2 Le mercure
2.1 Généralités
2.1.1 Propriétés physico-chimiques
Depuis plus de 3000 ans, l’Homme a utilisé le mercure (Hg) pour de nombreuses applications. Les
chinois employaient le minerai rouge de cinabre, composé de sulfure de mercure (HgS), comme
colorant d’encre ; les orpailleurs utilisaient le mercure élémentaire pour extraire l’or (activité
toujours d’actualité) ; le calomel (Hg2Cl2) rentrait dans la composition de « poudres à dentition » au
XXéme siècle, utilisées pour prévenir les douleurs liées à la pousse des dents chez les nouveaux
nés (Clarkson 2006). Ces multiples utilisations ont surtout mis en évidence la toxicité du mercure
et de ses composés pour la santé humaine et sur l’environnement.
Le mercure est un métal qui présente l’unique particularité d’être liquide à température ambiante
avec un point de fusion de -38.8°C (Qvarnström 2003 ). Cette propriété justifie son nom latin :
Hydrargyrum signifiant « argent liquide » et son symbole Hg (Clarkson 2006). Cette faculté unique
dans le monde des métaux engendre des propriétés physiques comme une faible viscosité, une
haute densité ou une forte conductivité qui expliquent en partie ses nombreuses utilisations
(Clarkson 2006).
Les principales propriétés du mercure sont regroupées dans le Tableau 2.
Tableau 10 : Propriétés physico-chimique générales de Hg (WHO 1989 ; IUPAC 2003)
Numéro atomique 80
Période / groupe 12 / 6 (IIb)
Structure électronique [Xe] 4f14 5d10 6s2
0 +I +II Degré d’oxydation à l’état naturel
mercure mercureux mercurique
Masse molaire 200.59 ± 0.02 g·mol-1
Le mercure possède à l’état naturel sept isotopes stables (Tableau 11).
Tableau 11 : Composition isotopique du mercure à l’ état naturel (IUPAC, 2003)
Isotope 196 198 199 200 201 202 204
Répartition (%) 0.15 ± 0.01 9.97 ± 0.20 16.87 ± 0.22 23.10 ± 0.18 13.18 ± 0.09 29.86 ± 0.26 6.87 ± 0.15
75
2.1.2 Espèces mercurielles
Les espèces de Hg peuvent être regroupées en trois catégories (Qvarnström 2003, Tessier 2004,
Horvat 2005) :
i. Le mercure élémentaire ne regroupant qu’une seule espèce : Hg0 ;
ii. Le mercure inorganique réunissant le mercure monovalent (Hg+) et divalent (Hg2+)
sous forme de sels ou pouvant former des complexes avec des ligands ;
iii. Le mercure organique rassemblant les espèces formées à partir d’une liaison
covalente entre le mercure divalent (Hg2+) et au moins un atome de carbone.
Dans l’environnement, Hg se retrouve naturellement sous la forme de mercure élémentaire (Hg0),
mercure inorganique divalent (Hg2+), méthylmercure (MeHg+) et diméthylmercure (Me2Hg) (Tessier
2004, Horvat 2005). La dénomination méthylmercure peut regrouper un ensemble de composés
formé par l’association du cation MeHg+ avec un simple anion (comme Cl-) ou une molécule
chargée plus importante (comme une protéine) (Horvat 2005). D’autres espèces peuvent
éventuellement être identifiées dans l’environnement, comme l’éthylmercure, mais leur présence
est une conséquence de l’activité anthropique.
2.1.3 Utilisations
Le Tableau 12 regroupe les principales formes de Hg utilisées par l’Homme.
76
Tableau 12: Principaux composés du mercure utilisés dans l’industrie et leur application
(Qvarnström 2003, Jitaru 2004, Clarkson 2006)
Composé Espèce Utilisation
Mercure élémentaire Hg0 Appareil de mesures (baromètres, thermomètres),
lampes fluorescentes, orpaillage…
Méthylmercure CH3-Hg+
Ethylmercure CH3CH2-Hg+
Phénylmercure C6H5- Hg+
Métoxy-éthylmercure CH3OCH2CH2-Hg+
Applications agricoles
(fongicide, pesticide, désinfectant)
Mercurochrome
Antiseptique
Thimerosal
Conservateur pour l’industrie pharmaceutique
La Figure 12 détaille les principaux secteurs où le mercure est utilisé ainsi que sa consommation
associée. Ces applications industrielles font principalement appel à du mercure élémentaire ou
inorganiques. L’emploi d’espèces organiques tend à diminuer : plusieurs gouvernements ont
interdit leur utilisation dans les activités agricoles (Horvat 2005) tandis que dans l’industrie
pharmaceutique, le mercurochrome est remplacé par d’autres molécules antiseptiques pour éviter
tous risques d’allergies (Galindo 1997) et l’utilisation du thimerosal est réduite de par la suspicion
d’effets délétères sur la santé humaine (Clarkson 2002).
La production du mercure provient essentiellement de son extraction minière : à partir de cinabre
(50% du mercure produit en 2003) ou comme sous produit de l’extraction de certains métaux
(30%). Son recyclage permet également de répondre à environ 20% de la demande (Maxson
2005).
77
composants électriques
(150)
batteries (900)
électrolyse chlore-alcaline
(800)
catalyseur dans la
production de PVC (150)
autres (150)
amalgame dentaire (270)
appareils de mesures (160)
éclairage (100)
orpaillage artisanal (900)
Figure 12 : Consommation estimée de mercure dans le monde en 2003 - valeurs exprimées en tonne
(Maxson 2005)
2.2 Occurrence dans l’environnement
2.2.1 Sources de mercure
2.2.1.1 Emissions naturelles
Les sources naturelles de mercure concernent majoritairement le dégazage de la croûte terrestre
et les activités tectoniques comme les éruptions volcaniques et les sources géothermales (Nriagu
1989, WHO 1989, Tessier 2004). L’émission depuis les écosystèmes marins et terrestres constitue
également une source importante pour la mobilisation naturelle du mercure. Cependant, cette
seconde voie n’est souvent que la conséquence de précédents dépôts atmosphériques sur ces
environnements (dépôts pouvant provenir de sources naturelles ou anthropiques) (Pacyna 2006).
L’évaluation des émissions naturelles est sujette à de fortes incertitudes. Outre la difficulté
d’identification et de quantification des différentes sources à travers le globe, ces émissions ne
sont pas constantes d’une année sur l’autre rendant l’estimation délicate. Nriagu (1989) a évalué à
2500 tonnes par an les émissions du mercure libéré par voie naturelle.
2.2.1.2 Emissions anthropiques
Les principales émissions dans l’environnement de Hg ne sont pas uniquement liée à son
utilisation dans des procédés industrielles (responsable d’environ 25% des émissions totales
atmosphériques). La combustion d’énergies fossiles avec 65%, la production de ciment (6%) et
Consommation totale : 3580 tonnes
78
l’incinération des déchets (3%) représentent des sources importantes de mobilisation de Hg dans
l’atmosphère. L’ensemble des émissions anthropiques dans cet environnement est estimé à 2100
tonnes en 2000, soit un chiffre équivalent aux émissions naturelles (Pacyna 2006).
D’autres émissions de Hg peuvent survenir dans les cours d’eaux par l’évacuation de rejets
industriels ou sur les sols suite à l’épandage de boues et l’utilisation des composés de Hg dans
l’agriculture. Stein et al. (1996) ont annoncé une répartition des émissions anthropiques de 80%
pour les rejets atmosphériques, 15% au niveau des sols et 5% au niveau des écosystèmes
aquatiques.
Depuis les années 1970, des législations restrictives ont été mises en place au sein de l’Union
Européenne pour limiter voire interdire les rejets du mercure et de ses composés (Tessier 2004)
faisant chuter les émissions européenne de 860 à 239 tonnes entre 1980 et 2000 (Pacyna 2005).
Cependant, le mercure reste largement utilisé dans le monde et l’essor économique de certains
pays ne permet pas d’entrevoir une diminution durable de sa consommation ; entre 1995 et 2000,
les émissions atmosphériques ont augmenté de 90% en Afrique (à 400 tonnes), 10% en Asie
(1100 t), 20% en Océanie (130 t) et 56% en Amérique du Sud (90 t) (Pacyna 2002 et 2006).
2.2.2 Cycle bio-géochimique
Les rejets naturels et anthropiques de mercure sont principalement réalisés dans l’atmosphère en
raison de sa caractéristique de métal volatil. En conséquence, il est aisément diffusé via
l’atmosphère sur de longues distances pour atteindre des écosystèmes éloignés des sources
d’émissions ; Hg0 possède un temps de résidence dans l’atmosphère estimée entre 0.4 et 3 ans
(WHO 1990). Cette caractéristique fait de la pollution au mercure un problème global sur l’échelle
de la planète.
Les réactions et processus contrôlant la distribution des espèces du mercure dans l’environnement
sont basés sur des phénomènes d’oxydation/réduction, méthylation/déméthylation,
précipitation/dissolution et sorption/désorption (Jitaru 2004). Ces évolutions de Hg sont régies par
des phénomènes abiotiques et biotiques.
La Figure 13 illustre le cycle bio-géochimique du mercure dans la biosphère. Ce dernier a été
fortement perturbé depuis les révolutions industrielles par l’introduction massive de mercure liée
aux activités anthropiques : les concentrations des différents compartiments environnementaux
sont en moyenne trois fois supérieures à celles de l’ère pré-industrielle (Tessier 2004).
79
Figure 13 : Cycle du mercure dans la biosphère d’ap rès Horvat (2005)
La production de méthylmercure (MeHg+) au cours du cycle biogéochimique représente un des
principaux dangers liés à ce métal. En effet, après assimilation cette espèce est capable de former
une liaison stable avec les groupes thiols (-SH) des protéines (Harris 2003) qui n’est que
lentement dégradée et excrétée par les organismes (Horvat 2005). Ainsi, MeHg+ diffuse
rapidement et s’accumule le long de la chaîne alimentaire pour atteindre des fortes concentrations
sur les niveaux supérieurs des réseaux trophiques en dépit de faibles concentrations dans les
écosystèmes (WHO 1990, Horvat 2005).
Les différents compartiments environnementaux ne sont pas égalitaires face à ce risque. Les
systèmes aquatiques présentent une plus forte concentration en MeHg+ au niveau de leur biote en
comparaison avec les systèmes terrestres malgré des concentrations équivalentes dans leurs
sédiments (Dietz 2000). Une des raisons provient d’une meilleure biodisponibilité de cette espèce
dans les écosystèmes aquatiques liée à une méthylation de Hg2+ en MeHg+ pouvant aussi bien
intervenir dans les sédiments que dans la colonne d’eau (Monperrus 2004). Une seconde
explication proviendrait de réseaux trophiques plus étendus dans les milieux aquatiques qui
augmenteraient le facteur global de bioconcentration (Dietz 2000). Cependant, même si l’apport de
la contamination en MeHg+ impacte majoritairement les systèmes aquatiques à l’heure actuelle, la
pression anthropique toujours plus importante sur le cycle du mercure risque, à terme, de conduire
à l’introduction de MeHg+ dans une plus grande échelle au sein des écosystèmes terrestres
(Cristol 2008).
80
2.2.3 Exposition humaine
L’exposition des Hommes au mercure est principalement réalisée par l’inhalation de mercure
élémentaire et l’ingestion de méthylmercure. Hormis lors d’une exposition aiguë en relation avec
une activité professionnelle, la population ne semble que faiblement exposé à Hg0 (Gochfeld
2003). Les apports liés à la pollution atmosphérique et à l’utilisation d’amalgames en médecine
dentaire semblent négligeables (Clarkson 2002). Il est à noter qu’une grande incertitude est liée à
l’évaluation de l’impact sanitaire d’amalgame de mercure (Gotchfeld 2003) cependant ces effets
sur la santé semblent réversibles (Horvat 2005).
L’ingestion et l’exposition des populations au mercure se réalise majoritairement à travers la
consommation de produits de la pêche (WHO 1990, Dietz 2000) dans lesquels MeHg+ représente
75 à 95% du mercure total (Gotchfeld 2003). La consommation d’espèces se situant aux niveaux
supérieurs des réseaux trophiques y représente la plus grande exposition en MeHg+, comme
l’illustre la Figure 14. Elle éclaire surtout sur l’importance de contrôler les apports en mercure dans
ces denrées alimentaires.
Figure 14 : Bioconcentration et bioamplification du mercure dans les réseaux trophiques aquatiques
(Tessier 2005)
81
2.3 Effet sur la santé humaine
Les principaux symptômes d’une exposition chronique à de faibles doses de mercure sont
regroupés dans le Tableau 13.
Tableau 13 : Symptômes d'une exposition chronique à de faibles doses de composés du mercure
(Jitaru 2004, INERIS 2006)
Eréthisme (nervosité, irritabilité)
Changement de personnalité
Tendance suicidaire
Paresthésie
Altération auditive
Troubles du langage
Dégradation des réflexes
Troubles visuels
Urémie
Dommages rénaux
Tremblement
Gingivite
Insomnie
Infertilité
Pneumonite
Trouble du système immunitaire
Du point de vue des risques sur la santé humaine, les formes les plus préoccupantes sont la
vapeur de mercure élémentaire et les composés organiques à courtes chaînes alkyles (WHO
1976). En particulier, le méthylmercure représente une véritable menace en tant qu’espèce
majoritaire de l’exposition humaine.
Au cours du XXème siècle, l’extrême toxicité du méthylmercure a d’abord pu être illustrée à travers
plusieurs cas d’intoxications massives de populations, à Minamata et Niigata au Japon via la
consommation de poissons et en Irak avec la fabrication de pains à partir de graines traitées
(WHO 1990, Gochfeld 2003). Une fois dans l’organisme, le méthylmercure cible en premier lieu le
cerveau et le système nerveux (Mergler 2007). Cette espèce possède surtout une activité de
neurotoxique par l’inhibition de la synthèse des protéines et de l’ARN (WHO 1990, Monperrus
2004). Ses effets sont irréversibles (Horvat 2005) et peuvent entraîner la mort (WHO 1990, INERIS
2006). Dans le cas d’exposition prénatale, les dommages causés par MeHg+ sont encore plus
importants provoquant des malformations congénitales, des retardements psychomoteurs et
empêchant le bon développement du système nerveux (WHO 1990, Monperrus 2004). Des
enfants peuvent présenter des symptômes d’intoxication au mercure même si la mère ne présente
aucun signe d’empoissonnement (Mergler 2007, Grandjean 2008). Ceci démontre surtout que le
cerveau en cours de développement est encore plus sensible à une exposition au méthylmercure.
Bien que l’exposition générale des populations soit inférieure à celles observées lors
d’intoxications massives, un nombre grandissant de preuves existe démontrant que l’exposition de
certaines populations est suffisante pour induire des altérations de plusieurs systèmes, ce qui
représente un important problème de santé publique (Mergler 2007). Il est donc important de
82
pouvoir contrôler et quantifier les apports en méthylmercure dans les produits de la pêche pour
pleinement rendre compte des risques associés à leur consommation.
2.4 Evaluation du risque lié aux produits de la pêc he
Plusieurs organismes officiels ont évalué la Dose Hebdomadaire Tolérable Provisoire (DHTP) pour
le méthylmercure (EFSA 2004, INERIS 2006) :
- l’agence américaine pour la protection de l’environnement (US-EPA) propose la valeur de 0.7
µg par kg de poids corporel et par semaine (noté µg·kg-1·s-1)
- l’agence américaine d’enregistrement des substances toxiques et des maladies (ATSDR)
suggère une valeur de 2.1 µg·kg-1·s-1
- l’organisation mondiale pour la santé (WHO) propose la valeur de 1.6 µg·kg-1·s-1.
Toutes ces valeurs sont exprimées en concentration de méthylmercure. La différence entre les
doses hebdomadaires tolérables s’explique par les études épidémiologiques prises en comptes et
leur mode de calcul (EFSA 2004, INERIS 2006). Les agences en liaison avec les pouvoirs publics
(AFSSA pour la France et EFSA au niveau de l’Europe) prennent préférentiellement en compte la
valeur préconisée par la WHO (AFSSA 2004, EFSA 2004).
Plusieurs études ont été menées sur la probabilité de dépasser la DHTP en France via la
consommation de produits de la pêche (AFSSA 2004, Tressou 2004). Différents scénarios et
méthodes de calcul ont été utilisés. Les scénarios conservateurs (« données agrégées »), qui
peuvent mener à surestimer l’exposition réelle, révèlent que la probabilité de dépassement de la
DHTP est au moins égal à 10% pour l’ensemble de la population (de 10% pour les adolescents
jusqu’à 35% pour les enfants en bas âge). Les scénarios plus réalistes (« données
désagrégées »), qui peuvent sous estimer l’exposition, montrent que la probabilité d’exposition est
plus faible mais reste critique pour les populations jeunes (supérieure à 10% de 0 à 6 ans). Suite à
ces études, l’AFSSA a préconisé pour les femmes enceintes et allaitantes ainsi que pour les
jeunes enfants de favoriser une alimentation diversifiant les espèces de poissons en évitant une
consommation exclusive de poissons prédateurs sauvages tels que daurade, espadon, marlin,
requin ou thon (AFSSA 2002b et 2004).
Au vu des risques probables associés à la consommation des produits de la mer, il est essentiel
de disposer d’une législation permettant de contrôler ces denrées alimentaires. En Europe, la
législation est fixée par le règlement (CE) N°466/2 001, révisé par le règlement (CE) N°221/2002.
L’ambiguïté de cette loi réside dans l’utilisation du terme méthylmercure dans le texte pour
dénoncer les risques liés à une contamination au mercure, mais qui se traduit dans la fixation des
fractions de masse maximales par leur expression en mercure total. Une évolution de ce
règlement, avec des fractions de masse explicitement exprimées en méthylmercure, doit être
envisagée pour permettre de mieux appréhender les risques des denrées issus de la pêche. A
83
l’heure actuelle, les fractions de masse maximales autorisées sont de 0.5 mg·kg-1 en mercure total
pour tous les produits de la pêche sauf pour certaines espèces de poissons prédateurs (thon,
espadon, requin…) où la loi autorise jusqu’à 1 mg·kg-1 de mercure. Selon l’AFSSA, le respect des
limites réglementaires européennes entraîne un rejet de 3 à 4% des échantillons (AFSSA 2004).
Dans l’optique d’une possible évolution de la prise de risque, il est essentiel de pouvoir disposer de
méthodes fiables et traçables pour réaliser des mesures de méthylmercure dans les produits de la
pêche.
2.5 Protocoles d’analyses
2.5.1 Extraction du mercure depuis des matrices bio logiques marines
La première étape de l’analyse consiste à récupérer les analytes avant leur séparation. La
recherche bibliographique a principalement été limitée aux analyses menées par HPLC-ICP-MS,
qui a été le montage analytique utilisé, depuis des échantillons biologiques marins afin que les
solvants utilisés soient compatibles avec ce dispositif d’analyse. En effet, les fractions de masse
analysées sont faibles dans ce type d’échantillons (de l’ordre du mg(Hg)·kg-1) si bien que les
extraits sont souvent étudiés sans dilution après la mise en solution des analytes.
Souvent dans le cas d’échantillons frais, les auteurs ont dû procéder à une étape préliminaire à
l’extraction. Les échantillons frais ont soit subis une première étape de lyophilisation pendant 24 h,
puis un broyage pour augmenter leur homogénéité (Rai 2002), soit ils ont d’abord été séchés
avant d’être broyés puis tamisés à 100 µm (Chang 2007).
Plusieurs types de solvants d’extraction sont rencontrés dans la littérature pouvant être regroupés
en quatre catégories :
- l’hydroxyde de tétra-méthyle ammonium (TMAH) à une concentration de 5 à 25% (w/v) ou la
potasse (KOH) à 25% (w/v) pour réaliser une extraction alcaline de l’échantillon. Les réactifs
sont employés en phase aqueuse ou dilués dans du méthanol (Hintelmann 1997a, Qvarnstrom
2002, Vidler 2006, Reyes 2008),
- un composé soufré, tel que 2-ME et/ou L-Cys, employé en phase aqueuse (Chiou 2001, Hight
2006) ou en complément d’un solvant organique comme le méthanol (Clough 2003c, Chang
2007),
- une extraction acide menée avec l’utilisation d’acide chlorhydrique (Vallant 2007, Wang 2007)
ou de l’acide nitrique (Reyes 2008). Wang et al. (2007) combine son effet avec l’ajout d’un
composé soufré (2-ME) et de KCl,
- une extraction enzymatique avec l’utilisation de protéase XIV, en présence de cystéine et dans
un milieu tamponné par la présence de phosphate d’ammonium (Rai 2002).
84
Le traitement associé aux différentes extractions consise en une élévation de la température du
mélange solvant et échantillon. Seuls Wang et al. (2007) ont réalisé la solvatation à température
ambiante. Dans ce but, plusieurs méthodes ont été proposées. La plus simple réside à l’incubation
en bain-marie avec agitation (manuelle, mécanique ou magnétique), les températures allant de 25
à 60°C en fonction du solvant et le temps d’action variant de 2 à 25 heures (Hintelmann 1997a,
Rai 2002, Clough 2003c, Hight 2006, Wang 2007). Pour accélérer le temps de traitement de
l’échantillon, deux techniques sont disponibles. La première fait appel aux ultra-sons (US) :
l’énergie transmise par les ondes échauffe l’extrait et augmente les contacts entre la phase liquide
du solvant et celle solide de l’échantillon (Luque-Garcia 2003). Cette technique peut être employée
avec des solvants acides (Chang 2007) ou lors d’extractions alcalines (Qvarnstrom, 2002) avec
des temps d’action allant de 15 min à 2 h. La seconde technique pour accélérer l’incubation entre
le solvant et l’échantillon est l’utilisation de micro-ondes (Chiou 2001, Vidler 2006, Chang 2007).
Elle s’utilise en digestion alcaline (en présence de TMAH) et réduit le temps de traitement à moins
de 5 minutes pour une puissance d’onde de l’ordre de 40 W équivalent à une élévation de la
température jusqu’à environ 60 °C. Cependant, il es t nécessaire de vérifier la stabilité des
composés durant le traitement car l’action des micro-ondes peut provoquer une désalkylation du
méthylmercure en mercure inorganique (Tseng 1997).
Reyes et al. (2008) ont testé les différentes possibilités d’extraction du mercure pour des analyses
de spéciation. Ils ont ainsi démontré que dans le cas d’une analyse en routine les différentes
méthodes ne permettaient pas toujours d’obtenir une extraction quantitative. Cependant,
l’utilisation de la dilution isotopique, sous certaines conditions, a permis d’atteindre des résultats en
accord avec la valeur certifiée.
En marge des différentes techniques d’extraction présentées, Falter et al. (1997) ont développé
une méthode reposant sur la distillation de l’échantillon. Ils utilisent un solvant composé de
chlorure de potassium (20%) et d’acide sulfurique (8 mol·L-1). L’opération dure 45 minutes à 180°C
sous atmosphère d’azote et 9 mL de distillat sont récupérés. Outre la lourdeur d’un tel montage, il
est nécessaire de pré-concentrer sur une colonne spécifique les analytes avant toute séparation
des espèces.
Un paramètre important pour la conservation de la spéciation de l’échantillon est le matériau des
tubes utilisés pour la mise en solution et le stockage des extraits. En fonction des différents
matériaux, les espèces peuvent évoluer différemment (Yu 2003). Les tubes peuvent être en verre
(Rai 2002), verre ambré (Hight 2006), Téflon (Chiou 2001) ou polypropylène (Wang 2007). Hight et
al. (2006) ont testé leur effet en relation avec la quantité d’échantillon analysée et ont conclu que
pour une prise d’essai de 0.2 g de matériel lyophilisé, le récipient présentant le moins
d’interactions était le verre ambré. Pour la préparation des solutions étalons de mercure
85
inorganique et de méthylmercure pour une concentration proche de 1 g(Hg)·kg-1, il est conseillé
d’utiliser des tubes en verre pour les formes organiques et en polypropylène pour le mercure
inorganique ; la diminution du pH par l’ajout d’acide chlorhydrique (0.1% (v/v)) permet également
une meilleure stabilité de Hg2+ sur le long terme (Yu 2003). Leur stockage doit se faire dans
l’obscurité et ce jusqu’une période de six mois (Hight 2006, Yu 2003). Les solutions intermédiaires
d’étalons peuvent être préparées dans des tubes en polypropylène en présence de 0.02% L-Cys,
HCl, H2O et stockées dans l’obscurité jusqu’à quatre jours (Hight 2006).
Toutes ces différentes études ont permis l’analyse de plusieurs types d’échantillons marins : foie et
muscle de poissons, pancréas de homard, moules ou huîtres. Il en ressort que seulement deux
espèces de mercure ont pu être identifiées, le mercure inorganique et le méthylmercure ; la
seconde espèce étant largement majoritaire (> 90% Hgtotal) pour des matrices poissons et
légèrement inférieure à Hg2+ (environ 40% Hgtotal) pour les autres matrices (Hight 2006).
Pour chaque méthode proposée, les auteurs ont testés la validité des protocoles par l’analyse d’un
matériau à références certifiés (CRM), en mercure total et en méthylmercure. Plusieurs effets
pouvant affecter la fiabilité du résultat ont pu être identifiés :
- méthylation du mercure inorganique (Hintelmann 1997a, Qvarnstrom 2002, Reyes 2008),
- déméthylation du méthylmercure (Qvarnstrom 2002, Hight 2006, Reyes 2008),
- extraction non quantitative (Clough 2003c, Vidler 2007, Reyes 2008),
- instabilité du stockage des extraits avant leur analyse (Hight 2006, Vidler 2007).
2.5.2 Analyse par couplage HPLC-ICP-MS
2.5.2.1 Techniques séparatives
L’analyse des espèces de mercure est préférentiellement réalisée par l’utilisation de la
chromatographie en phase gazeuse (Jitaru 2004, Monperrus 2004, Tessier 2004). Cependant,
depuis plusieurs années, la chromatographie liquide haute performance (HPLC) couplée au
spectromètre de masse avec ionisation par plasma induit (ICP-MS) se révèle comme une
technique intéressante (Boszke 2005). L’amélioration des limites de quantification de ce détecteur
élémentaire a rendu son utilisation compatible avec l’HPLC pour la détermination du mercure dans
des fractions de masse usuellement rencontrées au sein d’échantillons naturels (de l’ordre du
mg(Hg)·kg-1). Contrairement à la chromatographie en phase gazeuse (GC), l’HPLC permet
l’analyse de composés thermolabiles et ne nécessite pas d’étape de dérivation des analytes, ce
qui limite le risque de conversion des espèces et la contamination par l’ajout de réactifs. Point et
al. (2008) ont aussi démontré que la réponse des espèces à la dérivation était fonction de leur
état : la présence de ligands modifie leur réactivité par rapport à des espèces libres ce qui, en
dilution isotopique avec l’addition d’un étalon marqué, peut être critique pour la justesse du
86
résultat. Pour toutes ces raisons, il a été choisi d’utiliser l’HPLC comme technique séparative des
espèces mercurielles.
L’annexe 3 répertorie les différentes séparations utilisées dans la littérature pour réaliser l’analyse
de spéciation du mercure par couplage HPLC-ICP-MS.
L’emploi de l’HPLC engendre également des restrictions, principalement liée à la composition de la
phase mobile qui doit être compatible avec le type de détection choisie. L’analyse en phase liquide
du mercure souffre également d’effets mémoires par l’adsorption de Hg sur les parois des
matériaux. Pour remédier à ce phénomène, il est conseillé d’utiliser des composés soufrés pour
lesquels le mercure possède une certaine affinité ce qui entraîne la formation de complexes. Les
molécules les plus souvent utilisées sont le 2-mercaptoéthanol (2-ME) ou la L-cystéine (L-Cys).
Ceux ci possèdent une fonction thiol qui réagit avec le mercure (Boszke 2005) :
RHgCl + HS(CH2)2OH → RHgS(CH2)2OH + H+ + Cl-
L’utilisation préférentielle de poly-éther-éther-cétone (PEEK) au niveau de l’appareillage en
défaveur de l’acier inoxydable limite aussi l’effet mémoire du mercure. En particulier dans le
système HPLC, plusieurs éléments peuvent être en matière composite, tels que la boucle
d’injection, le système interne de l’échantillonneur ou même la colonne chromatographique.
La plupart des mécanismes de rétention déjà répertoriés pour mener l’analyse de spéciation du
sélénium peuvent être employées dans le cas du mercure. Plusieurs espèces mercurielles peuvent
être séparées : mercure inorganique (Hg2+), méthylmercure (MeHg+), l’éthylmercure (EtHg+), le
phénylmercure (PhHg+), l’acide mersalyle et des protéines liées à du mercure.
2.5.2.1.1 Séparation par appariement d’ions
La formation de paires d’ions est employée pour la séparation des espèces cationiques du
mercure (Hg2+, MeHg+, EtHg+ et PhHg+). L’agent de paires d’ions peut être du pentanesulfonate
d’ammonium (PS5) à une concentration de 5 mmol·L-1 (Shum 1992) ou de sodium à des
concentrations 7.5 mmol·L-1 (Acon 2001). Un autre réactif utilisé dans ce sens est le bromure de
tétrabutylammonium (Harrington 1997) selon le mécanisme suivant (Boszke 2005) :
2R4NX + HgX2 → (R4N)2HgX4
R4NX + R’HgX → (R4N)R’HgX2
87
De plus, la phase mobile peut contenir une proportion de solvant organique qui diminue sa polarité
(méthanol ou acétonitrile), ceci dans le but d’accélérer l’élution des composés. En fonction des
équipements disponibles, une plus ou moins grande proportion de solvant peut être tolérée. Acon
et al. (2001) ajoute 20% d’acétonitrile avec une colonne micro-bore (diamètre interne inférieur à 2
mm), tandis que Harrington et al. (1997), avec l’ajout d’oxygène dans le gaz nébuliseur et l’emploi
d’une chambre à nébulisation refroidie à -17 °C, on t utilisé une concentration de 60% pour le
méthanol et de 45% pour l’acétonitrile.
Harrington et al. (1997) ont aussi testé l’ajout de 2-mercaptoéthanol (2-ME) à 0.01% dans la phase
mobile pour la séparation de MeHg+ et de Hg2+ afin d’augmenter la sensibilité pour les deux
composés (hauteur de pics multipliée par deux pour MeHg+ et par cinq pour Hg2+). De plus l’ordre
de sortie des espèces a été inversée, avec une forte diminution du temps de rétention sur le
mercure inorganique. Il est possible que l’ajout du 2-mercaptoéthanol ait donné lieu à une
formation préférentielle du complexe Hg-S au détriment de la paire d’ions pour expliquer la
différence dans les temps de rétention et qu’une fraction du mercure qui pouvait s’adsorber sur la
colonne soit mis en solution par la formation du complexe. Chang et al. (2007) ont utilisé aussi le
mélange des deux agents (2-ME et PS5) mais pour réaliser l’analyse de spéciation simultanée du
mercure avec celle du plomb, en soulignant que le 2-ME est présent pour Hg et PS5 pour former
des paires d’ions avec les espèces de Pb.
2.5.2.1.2 Séparation par phase inverse
Les éluants de la phase inverse sont généralement composés d’un agent complexant soufré, avec
éventuellement l’ajout d’un solvant organique et l’emploi possible d’un tampon pH.
Concernant l’agent complexant soufré, le 2-ME et la L-Cys restent largement majoritaires pour des
concentrations allant de 0.005% à 0.5% dans la phase mobile. Chiou et al. (2001) ont comparé
leurs efficacités et démontrent que le 2-ME favorise l’interaction hydrophobe entre le complexe et
la phase stationnaire de la colonne, tandis que la cystéine possède un caractère plus hydrophile
qui ne permet pas toujours une bonne séparation des espèces, surtout sur une colonne C8. Ils ont
donc optés pour l’utilisation combinée des deux agents complexant pour une séparation efficace
de Hg2+, MeHg+ et EtHg+ en sept minutes. D’autres agents complexant Hg sont rencontrés dans la
littérature. Falter et al. (1997) et Wilken et al. (1998) ont utilisé l’ion pyrrolidinedithiocarbamate
dans le but de pré-concentrer en ligne les espèces sur une cartouche C18. L’inconvénient de ce
composé est sa durée de vie en solution limitée sous des conditions acides, il nécessite donc le
contrôle du pH des différents éluants. Un composé similaire, le diéthyldithiocarbamate de sodium,
a été utilisé par Chen et al. (2009) toujours dans le but de réaliser une pré-concentration des
espèces de Hg, cependant cette étape n’est pas réalisée en ligne avec le couplage HPLC-ICP-MS.
Hasegawa et al. (2005) ont employé le 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane
sulfonate (CHAPS) déposé sur la phase stationnaire et présent dans l’éluant. Ce réactif permet par
88
plusieurs interactions (hydrophiles et électrostatiques) de séparer des macromolécules, comme
des protéines liées aux composés du mercure.
Les solvants organiques utilisés en général sont l’acétonitrile et le méthanol. Tout comme pour la
séparation avec appariement d’ions leur concentration varie en fonction du système d’introduction
de l’échantillon dans l’ICP-MS ou de l’utilisation de colonne micro-bore. Morton et al. (2002) ont
spécifié qu’une plus grande instabilité du plasma est observée avec l’utilisation de l’acétonitrile
(même pour des concentrations de 5%), ils conseillent donc de préférer le méthanol comme
modificateur organique.
Bien que le pH ne semble avoir qu’une faible incidence sur la rétention des espèces du mercure
(Wan 1997, Castillo 2006), plusieurs auteurs ont proposé de tamponner la phase mobile. Le réactif
préférentiellement utilisé est l’acétate d’ammonium, avec des concentrations allant de 5 à 200
mmol·L-1 (Bushee 1988, Han 2003, Shen 2005). Une solution intéressante a été proposée par
Hight et al. (2006) avec l'emploi de la cystéine à la fois comme agent complexant et comme
tampon pH. Ils ont utilisé une solution de L-Cys à 0.1% en association avec L-Cys, HCl, H2O à
0.1% pour tamponner la phase mobile, et sont arrivés ainsi à séparer Hg2+, MeHg+ et EtHg+ en
neuf minutes.
Il est à noter aussi, que le mode isocratique est à préférer pour l’élution. Castillo et al. (2006) par
l’emploi d’un gradient avec la multiplication par un facteur dix des concentrations en agent
complexant, en solvant organique et en tampon, ont provoqué une augmentation du signal de la
ligne de base de leur chromatogrammes ; ceci pouvant s’expliquer par l’augmentation de la
contamination apportée par les réactifs.
D’autres possibilités de mécanismes ont été appliquées à l’analyse de la spéciation du mercure.
2.5.2.1.3 Séparation par exclusion stérique
Pour la séparation de protéines liées à du mercure, probablement par une liaison Hg-S, la
chromatographie d’exclusion stérique (SEC) peut s’avérer efficace bien que longue : entre 15 et 45
min pour un chromatogramme (Hasegawa 2005, Kameo 2005, Ketavarapu 2007, Shi 2007, Wang
2008). Dans cette séparation, le tampon Tris est le plus utilisé avec des concentrations comprises
entre 25 et 100 mmol·L-1. Ketavarapu et al. (2007) sont les seuls auteurs à avoir utilisé aussi du 2-
mercaptoéthanol dans leur phase mobile mais avec le risque de modifier les équilibres entre Hg et
les protéines.
2.5.2.1.4 Séparation par échange d’ions
Peu d’auteurs ont utilisé la chromatographie d’échange d’ions couplée à l’ICP-MS pour réaliser la
spéciation du mercure.
Ikemoto et al. (2004) ont utilisé une séparation par échange d’anions pour analyser le mercure lié
à des protéines après une première étape de préparation des échantillons par une
89
chromatographie d’exclusion stérique. Ils ont simplement employé un gradient de tampon Tris
comme phase mobile.
Une autre méthode a été développée consistant à la séparation par chromatographie d’échange
de cations. Vallant et al. (2007) ont utilisé une phase mobile comportant un agent complexant (L-
Cys), un modificateur organique (méthanol) et la présence de pyridine (solvant souvent rencontré
pour la séparation d’espèces cationiques). Ils parviennent ainsi à séparer Hg2+ et MeHg+ en sept
minutes.
2.5.2.2 Détection par ICP-MS
L’analyse du mercure en phase liquide par l’ICP-MS pose également des problèmes à cause de
l’effet mémoire de ce métal ; même à faible concentration, Hg adhère aux parois de la chambre de
nébulisation et des tubes du système d’introduction de l’échantillon (Li 2006). L’utilisation dans la
phase mobile de l’HPLC d’un agent complexant le mercure permet de résoudre ce problème, et
pour les analyses en mode total son utilisation est également préconisée (Li 2006).
Outre l’effet mémoire du mercure, l’ICP-MS ne souffre pas de problèmes majeurs spécifiques.
Contrairement au sélénium, les isotopes du mercure ne sont pas perturbés par des interférences
polyatomiques. Il n’est donc pas nécessaire d’utiliser une cellule de collision dans ce sens. En
revanche, certains de ses isotopes partagent des masses en commun avec d’autres éléments : 196Hg et 196Pt, 198Hg et 198Pt ou et 204Hg et 204Pb. La technique séparative doit donc permettre de
séparer Hg de ces interférents potentiels.
Le besoin en sensibilité, relativement important dans le cadre de l’analyse d’éléments traces peut
amener à utiliser plusieurs dispositifs pour augmenter le signal.
Une première solution réside dans l’utilisation de la cellule de collisions de l’ICP-MS pour améliorer
la transmission des ions (Tanner 2002). Dans ce cadre, la cellule doit être pressurisée avec des
gaz inertes (tels que l’hélium ou l’argon) pour ne pas réagir avec les ions présents et limiter la
formation d’interférences spectroscopiques.
Une seconde solution réside dans la génération de vapeur froide pour améliorer la quantité de
mercure introduite dans l’interface de l’ICP-MS. Lin et al. (2008) ont utilisé un montage leur
permettant de réaliser la séparation des espèces de mercure avant l’introduction de l’éluant dans
l’ICP-MS via une génération de vapeurs froides en ligne. Ils ont obtenu des limites de détection de
0.8, 0.6 et 1.2 pg pour Hg2+, MeHg+ et EtHg+ respectivement, c’est à dire des valeurs inférieures à
certains montages utilisant une préconcentration hors ligne des analytes avant leur analyse en
HPLC-ICP-MS (Cairns 2008).
90
2.5.3 Dilution isotopique
Les études menées sur l’analyse du méthylmercure par dilution isotopique reposent sur deux
approches. La première consiste à utiliser un ajout d’un étalon marqué en méthylmercure pour
permettre la seule quantification de MeHg+, la seconde comprend un autre ajout d’étalon marqué
sur une seconde espèce (Hg2+) qui autorise la quantification des deux espèces. Le marquage du
mercure inorganique doit aussi s’effectuer sur un autre isotope que l’étalon marqué en MeHg+.
Cette seconde approche est utilisée pour permettre d’observer des interconversions d’espèces et
corrigées ainsi les résultats.
2.5.3.1 Etude du méthylmercure seul
Plusieurs auteurs se sont intéressés au dosage du méthylmercure par dilution isotopique, que ce
soit en GC-ICP-MS (Snell 2000), en HPLC-ICP-MS (Clough 2003b), en simultané avec d’autres
éléments (Monperrus 2003) ou avec d’autres espèces de Hg mais sans corrections des
interconversions entre espèces (Taylor 2008).
Concernant l’utilisation du couplage HPLC-ICP-MS, Clough et al. (2003a, b et c) ont mené une
étude approfondie de la caractérisation du méthylmercure dans des CRMs (sol et poisson) par
dilution isotopique. L’étalon marqué de MeHg+ a été synthétisé puis caractérisé par spectroscopie
à résonance magnétique nucléaire (Clough 2003a). L’étude de l’ajout de l’étalon marqué a permis
de mettre en évidence que l’équilibre entre l’ajout marqué et l’analyte natif était obtenu au bout de
6 min d’agitation magnétique à 25°C en présence de méthanol (50%) et de 2-mercaptoéthanol
(0.01%). Le résultat en DI était compatible avec la valeur de référence du CRM malgré une
extraction non quantitative et avec un rendement inférieur à 50%, ce qui démontre de l’efficacité
d’une telle méthode de dosage (Clough 2003c).
La principale limitation concernant la mise en pratique de la dilution isotopique en analyse de
spéciation réside dans l’obtention d’étalons marqués d’espèces mercurielles. Ces étalons n’étant
pas encore largement disponibles commercialement, plusieurs auteurs les ont synthétisés pour
leurs applications (Hintelmann 1997b, Snell 2000, Demuth 2001). Cependant, plusieurs
organismes ont commencé à s’intéresser à la fabrication de tels composés pour pouvoir les
proposer commercialement. Snell et al. (2004) de l’IRMM ont synthétisé puis certifié une solution
étalon de chlorure de méthylmercure (Me202HgCl). L’analyse en GC-ICP-MS de la solution a
montré une contamination inférieure à 2% en mercure inorganique. La certification a été menée en
plusieurs étapes avec i) l’étude de la stabilité de MeHg+ sur une période de douze mois, ii) la
détermination de la composition isotopique de MeHg+, iii) la mesure de la concentration en
mercure inorganique par étalonnage externe et iv) l’analyse par dilution isotopique du mercure
total contenu dans la solution. La concentration certifiée de MeHg+ découle de ses informations
mais surtout, par ce protocole, Snell et al. ont permis d’assurer la traçabilité au SI de leur
certification en utilisant des références appropriées. Cependant, à l’heure actuelle cet étalon
91
enrichi de méthylmercure n’est plus disponible commercialement. Rahman et al. (2003) ont aussi
développé dans un but commercial, en association avec Applied Isotopes Technologies (AIT,
USA), un étalon de chlorure de méthylmercure enrichi en isotope 201. Il a été caractérisé par
dilution isotopique inverse et HPLC-ICP-MS, aucune impureté de mercure inorganique n’a pu être
détectée et la stabilité a été étudiée sur six mois. Cet étalon est à l’heure actuel toujours proposé
par AIT en complément avec d’autres marquages pour différents isotopes de Hg.
En analyse de spéciation, l’ajout d’un seul étalon marqué ne permet pas de quantifier d’éventuelles
conversions entre espèces comme la déméhtylation de MeHg+.
2.5.3.2 Etude de la conversion inter-espèces
La dilution isotopique en spéciation menée sur plusieurs espèces, outre leur quantification
simultanée, autorise l’identification et la quantification des conversions d’espèces. Ainsi la justesse
des résultats est améliorée et l’impact des protocoles expérimentaux est mieux évalué.
Depuis le premier calcul développer par Hintelmann et Evans (1997b), plusieurs méthodes ont été
développées pour permettre de remonter aux facteurs de transformations inter-espèces.
Rodriguez et al. (2007) ont comparé les différentes approches pour l’analyse de spéciation des
organoétains. Elles ont toutes permis d’obtenir les mêmes résultats sur les concentrations et
seulement de légères différences ont été observées sur les facteurs de conversion (ces
différences n’étant pas significatives au regard des incertitudes associées).
L’application à l’étude du méthylmercure et du mercure inorganique a été réalisée par plusieurs
auteurs pour différents types d’échantillon :
− sur des sols et des sédiments (Hintelmann 1997b, Martin-Doimeadios 2004, Rahman
2004 et 2005, Monperrus 2008)
− sur des eaux de surfaces (Monperrus 2008)
− sur des produits de la pêche lyophilisés (Qvarnstrom 2002, Clough 2005, Point 2007,
Monperrus 2008, Point 2008, Reyes 2008)
− sur des tissus biologiques marins frais (Qvarnstrom 2002, Davis 2007, Point 2007,
Monperrus 2008, Point 2008).
Dans l’étude des produits de la mer, la comparaison des résultats obtenus par dilution isotopique
sur une ou deux espèces montre que les résultats sur la détermination de MeHg+ ne sont pas,
pour la plupart des cas, statistiquement différents pour des échantillons frais ou lyophilisés
(Qvarnstrom 2002, Point 2007, Monperrus 2008). En effet la majorité des échantillons était
constitués de muscles de poissons dans lesquels le mercure inorganique n’est présent qu’à de
faibles concentrations, donc son éventuelle méthylation n’a que peu d’impact sur MeHg+. A fortiori,
la détermination de Hg2+ est plus délicate dans ces échantillons car elle est plus influencée par une
92
éventuelle déméthylation de MeHg+ (Qvarnstrom 2002). Il ressort ainsi qu’il est important de mettre
en place la DI sur deux espèces lorsqu’elles sont présentes à des concentrations équivalentes
dans les échantillons ou pour caractériser un composé minoritaire (Qvarnstrom 2002).
L’utilisation de la DI sur deux espèces semble également améliorer la justesse de la quantification
(Point 2007, Reyes 2008). Concernant la fidélité des résultats, Clough et al. (2005) montre qu’elle
est améliorée tandis que Monperrus et al. (2008), au contraire, obtiennent une incertitude
supérieure avec cette technique par rapport à la DI avec une seule espèce.
Des études ont été menées pour identifier les points favorisant les conversions d’espèces. Point et
al. (2008) démontrent que l’étape de dérivation des analytes en composés volatils peut être une
source importante de déméthylation au sein d’échantillons lyophilisés. Monperrus et al. (2008)
établissent également que l’évolution de la spéciation originelle n’est pas seulement dépendante
de la préparation de l’échantillon mais aussi de sa matrice. Qvarnstrom et al. (2002) démontrent
que l’utilisation d’ultrasons ne favorise pas les conversions d’espèces. Au final, plusieurs
paramètres influencent les interconversions d’espèces, il paraît donc délicat de pouvoir élaborer un
protocole d’analyse libre de toute évolution. En conséquence, les protocoles développés ont été
contrôlés pour identifier d’eventuelles conversions.
La principale limitation de la DI en présence de deux espèces est principalement liée à l’obtention
d’étalons marqués de pureté clairement connue pour limiter l’erreur sur l’interprétation des
conversions interespèces (Davis 2007).
2.5.4 Aspect métrologique
Les questions métrologiques liées à la détermination du méthylmercure dans des produits de la
pêche tout en assurant la traçabilité des mesures ont été traitées par plusieurs auteurs.
Clough et al. (2003c et 2005) ont mis en place une méthode primaire basée sur l’utilisation du
couplage HPLC-ICP-MS pour la DI avec une seule espèce (MeHg+) ou en dosant simultanément
les deux espèces de mercure présentes dans ces échantillons (MeHg+ et Hg2+). Une étude de
l’incertitude de mesure est réalisée et la traçabilité des analyses au SI est assurée.
Point et al. (2007) ont aussi élaboré un protocole métrologique assurant la comparabilité de leur
résultat au SI par le calcul de leurs incertitudes de mesures et la démonstration de leur traçabilité.
Ce protocole a été mis en place pour l’analyse simultanée du mercure inorganique et du
méthylmercure dans des échantillons marins frais et lyophilisés via leur analyse par le couplage
GC-ICP-MS.
La disponibilité de ces protocoles métrologiques sont un atout pour permettre la certification de
CRMs et en conséquence le transfert de la traçabilité aux utilisateurs. De par l’évolution des
législations, les besoins de demain seront plus exigeants sur le raccordement au SI des
laboratoires. La mise en place de protocoles métrologiques complémentaires permettront
93
d’améliorer l’évaluation des nouveaux CRMs. Il est donc important que les Instituts Nationaux de
Métrologie mettent en place en leur sein des méthodes qui puissent prétendre à la traçabilité au SI
de leur mesure des espèces mercurielles.
2.6 Bilan et choix analytiques
Pour réaliser l’analyse de spéciation du mercure dans des produits marins, il est essentiel de
pouvoir séparer les deux espèces majoritairement présentes dans ce type d’échantillon : Hg2+ et
MeHg+. La majorité des techniques répertoriées permettent d’atteindre cet objectif.
Nous avons retenu comme mécanisme de séparation la chromatographie de partage en phase
inverse sur colonne C18 permettant de séparer efficacement trois espèces de mercure : Hg2+,
MeHg+ et EtHg+ en moins de dix minutes. Les critères pris en compte pour le choix de la phase
mobile ont été la simplicité de sa composition (en nombre de réactifs et sur leur concentration) afin
i) de limiter les contaminations, ii) d’éviter l’instabilité du plasma et iii) d’empêcher les effets
mémoires inhérents à l’analyse du mercure par l’utilisation d’un composé soufré. Parmi la liste des
phases mobiles disponibles, celle qui permet d’atteindre le mieux ces objectifs semble être la
méthode développée par Hight et al. (2006). Ces auteurs utilisent un mélange de deux réactifs : L-
Cys et L-Cys, HCl, H20 à une concentration de 1 g·L-1 pour chaque composé. De plus, ce mélange
sert également de solution tampon (pH=2.3) ce qui permet une meilleure stabilité de la séparation
lors des injections des échantillons.
Pour réaliser l’extraction depuis des matrices poissons, le choix a été dicté par celui de la phase
mobile. En effet, les concentrations en mercure dans ce type d’échantillon, relevant du niveau de
traces, ne permettent pas toujours une dilution du surnageant avant son analyse. Celui ci doit donc
être adapté pour son introduction en HPLC avec seulement une étape de filtration (à 0.45 µm). Les
conditions choisies, dans un premier temps, ont été celles de Hight et al. (2006) : extraction par 10
g·L-1 L-Cys, HCl, H2O avec incubation à 60 °C pendant 2 h. Ce protocole a été optimisé par ces
auteurs puis validé par l’analyse de CRMs de produits de la mer.
Les essais réalisés ont porté dans un premier temps à s’assurer d’une séparation efficace des
espèces mercurielles. Par la suite, il a été étudié l’efficacité d’extraction du protocole sélectioné sur
le méthylmercure. Une étape d’amélioration de la mise en solution a été envisagée par la
diminution du temps de réaction grâce à l’utilisation des micro-ondes ou des ultrasons. Une fois le
protocole analytique établi, il a été mis en place le dosage du méthylmercure par dilution
isotopique. Dans un premier temps, il a été abordé le dosage seul de MeHg+ puis des essais avec
l’utilisation de deux espèces marquées ont pu être élaborés pour étudier les conversions entre
espèces.
94
La validation du processus a été réalisée par l’analyse de plusieurs CRMs se présentant sous la
forme de poudre lyophilisée ou de matériaux frais. L’étude de matériau frais a permis d’étudier le
comportement du protocole sur des échantillons réels, ceci dans le but de rendre la méthode
développée directement applicable pour le contrôle du méthylmercure sur des produits de la
pêche. Une fois toutes les étapes du processus de mesure validées, l’apport métrologique a été
abordé avec i) le calcul de l’incertitude sur les différents résultats, ii) la démonstration de la
traçabilité des mesures au SI.
95
Chapitre III : Mise en place des méthodes
98
99
1 Instrumentation
1.1 Four à micro-ondes
Le four à micro-ondes utilisé est un modèle Ethos 900 à système fermé de chez Milestone (Italie).
Les échantillons y sont minéralisés dans des godets en téflon. La minéralisation se déroule en
présence d’acide nitrique concentrée (65%, 5 mL) et d’eau oxygénée (30%, 1 mL) pour une
quantité d’échantillon de l’ordre de 200 mg s’il est solide ou de 2 mL s’il est liquide, ces choix
opératoires ont été déterminés après optimisation. Le Tableau 14 récapitule le programme retenu
pour la minéralisation de 9 échantillons. La puissance délivrée par le four est fonction du nombre
de minéralisats à réaliser.
Tableau 14: Programme du four à micro-ondes pour mi néraliser 9 godets simultanément
Etape Temps (min) Puissance (W)
1 10 280
2 5 0
3 10 550
4 5 0
5 6 720
6 7 0
7 10 280
1.2 HPLC
Le système de chromatographie liquide haute performance utilisé est un ensemble
SpectraSYSTEM (Thermo Fisher Scientific, USA). Il est composé d’un dégazeur en ligne à
membranes poreuses (SCM1000), d’une pompe quaternaire inerte (P4000) et d’un passeur inerte
avec système de refroidissement des échantillons (AS3500). La boucle d’échantillonnage utilisée
est de 100 µL pour les analyses du sélénium et de 50 µL pour celles liées au mercure.
La première séparation des composés séléniés a été effectuée sur une colonne en acier
inoxydable d’échange d’anions composée d’une phase stationnaire de polystyrène-divinylbenzène
avec des groupements échangeurs d’ions en ammonium quaternaires (PRP-X100, 250 mm x
4.1mm id x 10 µm taille des particules, Hamilton Company, USA) équipée d’une pré-colonne de
phase stationnaire identique. Les liaisons entre l’HPLC, la colonne et l’ICP-MS ont été réalisées
avec des tubes en Poly-éther-éther-cétone (PEEK, 0.010’’ ou 0.25 mm id et 1/16’’ ou 1.6 mm od).
100
La seconde séparation a été effectuée sur une colonne à phase inverse en acier inoxydable. Il
s’agit d’une colonne C18 avec des fonctions polaires greffées au niveau des silices pour permettre
d’accepter une phase mobile composée jusqu’à 100% de solvant aqueux. Le modèle de colonne
choisi a été la Synergi-Hydro de chez Phenomenex (150 x 4.6 mm ; 4 µm) équipée d’une pré-
colonne. Cette seconde colonne a également été utilisée pour les analyses de spéciation du
mercure.
Avant son introduction dans le système chromatographique, chaque phase mobile a été filtrée à
0.45 µm (nylon) par un système de trompe à eau. Chaque échantillon a aussi été filtré à 0.45 µm
(acétate de cellulose) sur seringue avant son injection dans le système chromatographique. Le
débit était fixé à 1 mL·min-1 pour chaque séparation.
1.3 ICP-MS
Le spectromètre de masse à ionisation par couplage inductif du plasma (ICP-MS) était le modèle
PQ-ExCell (Thermo Fisher Scientific, USA). L’appareil est de type quadripolaire avec une cellule
de collisions/réactions, nommée CCT (Collision Cell Technology, technologie de cellule à
collisions), composée d’un hexapôle. Les gaz de la CCT utilisés ont été l’hydrogène et l’hélium à
des débits de 3.1 et 3.8 mL·min-1 respectivement, ces réglages ont été choisis suite à l’optimisation
de la détection pour le sélénium. Dans le cadre de l’analyse de mercure, seul de l’hélium a été
introduit dans la CCT, à un débit de 4.5 mL·min-1. Le système d’introduction de l’échantillon était
composé d’un nébuliseur de type concentrique et d’une chambre à nébulisation refroidie par effet
Pelletier à 3°C. Les cônes étaient composés de nick el. Le Tableau 15 répertorie les réglages de
l’appareil.
101
Tableau 15: Paramètres de l'ICP-MS
Paramètre Réglage
Débit d’argon plasma (mL·min-1) 14
Débit d’argon auxiliaire (mL·min-1) 0.80 à 1.00
Débit d’argon de nébulisation (mL·min-1) 0.98 à 1.03
Se Hg Débit d’hydrogène dans la CCT
(mL·min-1) 3.1 0
Se Hg Débit d’hélium dans la CCT
(mL·min-1) 3.8 4.5
Puissance incidente (W) 1350
Tension de la lentille d’extraction (V) -320 à -380
Pole Bias (V) -5.2 à -4.8
Tension de la lentille de focalisation (V) 3.8 à 4.5
Lors d’analyses en mode total, l’acquisition s’est faité en mode « Peak Jump », avec 3 canaux par
masse et un balayage réalisé 650 fois. Lors du couplage avec l’HPLC, l’obtention du signal s’est
réalisée en mode transitoire avec un temps d’acquisition variant de 100 à 300 ms en fonction des
échantillons analysés et des masses suivies.
Le logiciel permettant de piloter l’ICP-MS était PlasmaLab fourni par Thermo (version 1.06.2007). Il
est également utilisé pour l’intégration des pics obtenus par des signaux transitoires.
L’ICP-MS a été pré-réglé chaque nouveau jour d’utilisation par une solution de Tune multi-
élémentaire à 1 µg·kg-1 en suivant la masse 115 (indium). Suite à la mise en route de la CCT,
l’intensité du signal était à nouveau optimisée sur une solution de l’élément d’intérêt à 20 µg·kg-1
(en suivant les masses 78 et 80 pour le sélénium et les masses 200 et 202 pour le mercure).
102
2 Réactifs et étalons
L’eau ultra-pure a été obtenue à partir d’un système composé de deux modules. Le premier était
un Elix 3 (Millipore Co., Bedford, Massachusetts, USA) permettant la production d’eau osmosée
depuis le réseau d’eau de ville. L’Elix était en liaison avec un système Milli-Q Element (Millipore
Co.) permettant la préparation d’eau ultra-pure (résistivité supérieure à 18.2 MΩ·cm).
L’eau oxygénée (30%, suprapur), l’acide chlorhydrique (30%, suprapur), l’acide nitrique (65%,
suprapur), l’acide fluorhydrique (40%, suprapur) et le gel de silice utilisé dans le dessiccateur (SiO2
avec indicateur d’humidité, gel orange) ont été fabriqués par Merck (UK) acquis chez VWR
(France). Le mercure métallique utilisé pour caractériser l’étalon marqué de mercure dans le cadre
des analyses en total a également été acquis chez Merck. Il affiche une pureté de 99.9999%
(Suprapur).
La solution de Tune servant à optimiser l’ICP-MS a été fournie par AccuStandard INC. (USA).
La majorité des réactifs ont été obtenus chez Sigma-Aldrich (France) :
- L-cystéine (pureté ≥ 98.5%)
- L-cystéine, HCl, H2O (pureté ≥ 99%)
- tris (Tris(hydroxyméthyl)aminométhane, pureté ≥ 99.8%)
- dodécylsulfate de sodium (SDS, pureté ≥ 99.0%)
- acide citrique (pureté ≥ 99.5%)
- citrate d’ammonium dibasique (pureté ≥ 99.0%)
- méthanol (LC-MS Chromasolv, pureté ≥ 99.9%)
- hydroxyde d’ammonium (concentration à 30-33%)
- pefabloc SC (4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride hydrochloride, pureté ≥98.0%)
- lipase de Candida rugosa type VII
- driselase de Basidiomycetes sp.
- protease de Streptomyces griseus type XIV
- acide méthane sulfonique (pureté ≥ 99.5%)
- β-mercapto-éthanol (pureté ≥ 99.0%)
- acide trifluoroacétique (TFA, ≥ 99.0%)
- acide heptafluorobutirique (HFBA, ≥ 99.5%).
L’acide pentafluoropropionique (PFPA) provenait de Acros Organics (pureté ≥ 97%).
Les étalons en sélénium provenaient de Sigma Aldrich :
- séléno-DL-méthionine (pureté à 99%), SeMet
- sélénite de sodium (pureté à 99%), SeIV
- séléniate de sodium (pureté à 99%), SeVI
- Se-méthyl-sélénocystéine (pureté à 95%), MeSeCys.
103
Un second étalon de SeMet (pureté > 99%) a été obtenu chez Acros Organics (Belgique).
Contrairement à l’étalon de chez Sigma, il n’est composé que de l’isomère L-SeMet. Le sélénium
élémentaire (pureté à 99.995%) provenait d’Alfa Aesar (Karlsruhe, Allemagne).
Les solutions étalons en sélénium ont été préparées gravimétriquement à 1 g·kg-1 dans de l’acide
nitrique à 2% (v/v) pour les sels inorganiques et dans de l’acide chlorhydrique à 0.1 mol·L-1 pour
les formes organiques. Ces étalons ont été conservés à -20 °C dans l’obscurité trois mois
maximum. Les solutions de travail ont été préparées quotidiennement par gravimétrie à partir
d’étalons dilués à 1 mg·kg-1 préparés chaque semaine et conservés à 4°C dans l’ obscurité.
Les étalons marqués de sélénium utilisés lors de la dilution isotopique en total ont été obtenus
chez Spectrascan (Teknolab, Kolbotn, Norvège), leur concentration est proche de 10 mg·kg-1 et
sont enrichis à plus de 95% en isotope 78Se ou 82Se. L’étalon de sélénométhionine enrichi en 76Se
(environ 1 mg de 76SeMet) a été fourni par les organisateurs lors des participations aux
intercomparaisons (CCQM-P86 et CCQM-K60).
Les étalons en espèces de mercure provenaient de Sigma Aldrich :
- chlorure de méthylmercure (pureté à 99.5%)
- dichlorure de mercure (pureté à 99.999%).
L’étalon de chlorure d’éthylmercure a été fourni par Alfa Aesar (France).
Les solutions étalons en mercure ont été préparées gravimétriquement à 1 g·kg-1 dans de l’acide
chlorhydrique à 0.1% (v/v) et dans des tubes en polypropylène pour le mercure inorganique et
dans 20% de méthanol dans des tubes en verres ambrés pour les espèces organiques. Ces
solutions ont été stockées à 4 °C dans l’obscurité et ont été utilisées sur une période 3 mois pour
les analyses en DI. Les solutions intermédiaires ont été diluées avec la phase mobile dans des
tubes en polypropylène et conservées à 4 °C dans l’ obscurité pendant une semaine.
L’étalon marqué de méthylmercure a été fourni par Applied Isotope Technologies (USA). Il est
enrichi en isotope 200 et se présente sous la forme d’une solution de chlorure de méthylmercure à
une fraction de masse de 10.5 mg(Hg)·kg-1 en présence de thiosulfate de sodium (0.5%).
Pour les analyses en mercure total, l’étalon marqué utilisé (IRMM-640) provenait de l’IRMM. Il est
enrichi en isotope 202 et se présente également sous la forme d’une solution (à 2.97 mg·kg-1). Un
troisième étalon a été utilisé dans le cadre des analyses de mercure. Il s’agissait d’une solution de
mercure (à 9.85 mg·kg-1) certifiée pour son isotopie (IRMM-639).
104
3 Optimisation du couplage HPLC-ICP-MS
3.1 Séparation des espèces séléniées
3.1.1 Mécanisme d’échange d’anions
Après la réception de l’unité chromatographique et la mise en place du couplage avec le
spectromètre de masse de type ICP, des tests de séparation de trois formes de Se (SeMet,
sélénite de sodium et séléniate de sodium) ont été entrepris sur la colonne d’échange d’anions. Ils
ont été réalisés avec une phase mobile à différents pH pour une concentration en citrate
d’ammonium de 5.10-3 mol·L-1 en présence de 2% de méthanol. L’objectif était d’arriver à séparer
les différents étalons en un minimum de temps. Les chromatogrammes obtenus en suivant le
rapport m/z=80 sont regroupés sur la Figure 15. Ces tests sur le pH n’ayant pas été menés le
même jour, les concentrations des étalons utilisés ne sont pas identiques, ceci explique la
différence dans la hauteur des pics.
0
10000
20000
30000
0 5 10 15 20t (min)
Inte
nsité
(cps
)
4.8 5.2 5.6
Figure 15 : Chromatogrammes de 3 étalons de Se en f onction du pH de la phase mobile
L’étude des charges apparentes pour les espèces de sélénium et pour l’acide citrique permettent
d’expliquer les différences de comportement en fonction du pH (Figure 16). Les valeurs des pKa
des composés séléniés proviennent de la littérature (Goessler 1997). Le calcul des charges
apparentes a été réalisée avec l’équation suivante :
(pH) SeIV SeMet
SeVI
105
∑∑=
i
iiapp C
zCz Éq. 1
avec :
- zapp : charge apparente
- Ci : fraction de masse de la forme i
- zi : charge de la forme i
Au pH étudiés, les trois espèces de Se restent sous la même forme ionique : à savoir anionique
pour les composés inorganiques et zwitterionique pour le sélénium organique. La différence de
comportement, provient de l’acide citrique dont les proportions des formes doublement et
triplement chargées augmentent avec le pH, ce qui améliore son pouvoir d’élution. Le fait que la
rétention SeMet ne soit pas affectée par le pH laisse présumer qu’elle n’est pas induite par des
phénomènes d’échange d’ions.
Le pH retenu de la phase mobile pour mener les analyses du sélénium est de 5.6. Cette valeur
permet d’obtenir la séparation des trois composés étudiés tout en limitant le temps d’analyse.
Figure 16 : Charge apparente et espèce prédominante en fonction du pH
106
Les performances analytiques du couplage ont été étudiées par le calcul des limites de détection
(LDs) pour SeMet sur plusieurs isotopes (76Se, 78Se, 80Se et 82Se). La détermination des LD s’est
faite selon la définition proposée par l’IUPAC :
p
tsLD = Éq. 2
avec :
− t : coefficient de Student, pris égal à trois pour un intervalle de confiance de 99.86%
− s : écart-type de la hauteur de pic obtenu sur la mesure de 10 blancs
− p : pente obtenue par l’analyse d’une gamme étalon en utilisant la hauteur de pic.
Les hauteurs des pics obtenus pour les solutions d’étalons de SeMet ont été utilisées pour la
détermination des LDs.
Le Tableau 16 regroupe les différentes LDs obtenues sur chaque isotope, exprimées en fraction
de masse et en quantité de matière pour 100 µL d’échantillon injecté.
Tableau 16 : Limites de détection pour la séparatio n avec échange d'anions couplée à l'ICP-MS,
exprimées en fraction de masse et en masse absolue pour 100 µL injecté
m/z µg(Se)·kg-1 pg(Se)
76 1.09 109
78 0.45 45
80 0.14 14
Limite de
détection
82 0.65 65
Chaque limite de détection a été validée par l’analyse d’un étalon à une fraction de masse égale à
sa valeur et la vérification de l’obtention de hauteurs de pic significativement différentes de la ligne
de base. Il est à noter que pour l’isotope 76, la LD est plus forte que celle obtenue pour l’isotope
82 alors que leur abondance isotopique est proche. Cette masse est la plus interférée au niveau
du bruit de fond, ce qui explique cette valeur plus élevée.
Darrouzes et al. (2005) avec des conditions similaires d’analyses ont obtenu des limites de
détections du même ordre de grandeur sur SeMet (32 pg, 18 pg et 47 pg pour 78Se, 80Se et 82Se
respectivement).
3.1.2 Mécanisme avec appariement d’ions
En raison du nombre et de la complexité des espèces de sélénium qu’il est possible d’extraire
depuis des matrices environnementales, des risques de co-élution de composés sont possibles.
107
Cette raison a motivé la mise en place d’une séparation complémentaire à la séparation par
échange d’anions.
Dans le cadre de l’appariement d’ions, la phase mobile était composée de l’agent d’appariement, à
hauteur de 0.1% (v/v), et de méthanol à 2% (v/v), toujours pour l’augmentation du signal de Se.
Trois agents d’appariements d’ions ont été étudiés :
- l’acide trifluoroacétique (TFA)
- l’acide pentafluoropropionique (PFPA)
- l’acide heptafluorobutyrique (HFBA).
Cette technique séparative n’est d’efficace, avec ces agents d’appariements, que pour la
séparation des espèces organiques du sélénium et en particulier l’analyte de principal intérêt :
SeMet. Les tests ont donc été réalisés sur des étalons de sélénométhionine (SeMet) et de Se-
méthyl-sélénocystéine (MeSeCys). La Figure 17 représente les séparations obtenues avec les
différents agents.
m/z=80
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
0 5 10 15 20 25t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
TFA PFPA HFBA
Figure 17 : Chromatogrammes de SeMet et de MeSeCys par différents agents d'appariement d’ions ;
SeMet est le second composé pour chaque phase mobil e
Comme prévu, l’augmentation de la chaîne perfluorée de l’appariement d’ions accroît les
interactions avec la phase solide et améliore la séparation des espèces. Toutefois, cette
amélioration se fait au détriment du temps d’analyse et de la largeur des pics. Cette propriété a
permis de s’assurer de la spécificité de la séparation lors de l’analyse d’échantillons réels : en effet
la comparaison des différents agents peut mettre en évidence d’éventuelles co-élution.
Les LDs sur SeMet de cette méthode ont été également déterminées pour évaluer les
performances de cette séparation (Tableau 17).
108
Tableau 17 : Limites de détection pour la séparatio n avec appariement d'ions couplée à l'ICP-MS,
exprimées en fraction de masse et en masse absolue pour 100 µL injecté
m/z µg(Se)·kg-1 pg(Se)
76 1.04 104
78 0.12 12
80 0.02 2
Limite de
détection
82 0.12 12
L’analyse d’étalons à des fractions de masse similaires à leur LD a permis de vérifier ces valeurs.
Pour l’isotope 76, l’analyse d’un étalon à 0.5 µg(Se)·kg-1 a montré qu’il était statistiquement
différent de la ligne de base et donc détectable. Cet effet montre les limites de la détermination de
LDs via une analyse statistique des données.
La comparaison des LDs entre les deux méthodes de séparations (Tableau 16 et Tableau 17)
montre que le mécanisme reposant sur l’appariement d’ions conduit à une meilleure sensibilité
pour la détection de SeMet. Ainsi, si des échantillons de faible fraction de masse sont analysés,
cette méthode séparative sera préférentiellement utilisée.
3.2 Séparation des espèces mercurielles
Les conditions de séparation des espèces du mercure retenues sont basées sur la littérature
(Clough 2003c, Hight 2006). Elles reposent sur la formation d’un complexe entre le mercure et un
composé soufré pour éviter les effets mémoires de Hg. Le composé soufré utilisé (L-cystéine) est
aussi employé pour réaliser une solution tampon (mélange des réactifs L-Cys et L-Cys, HCl, H2O).
L’effet d’un ajout de méthanol dans la phase mobile est également testé. La Figure 18 représente
l’optimisation de la composition de la phase mobile pour la séparation du mercure inorganique
(Hg2+) et du méthylmercure (MeHg+).
109
Figure 18 : Optimisation de la composition de la ph ase mobile pour la séparation, par ordre de sortie,
de Hg 2+ et MeHg+ ; les étalons sont à des concentrations voisines de s 10 µg·kg -1
Le premier essai a consisté à reproduire les conditions chromatographiques de Hight et al. (2006) :
L-Cys (1 g·L-1) et L-Cys, HCl, H2O (1 g·L-1) (Figure 18-a). La séparation obtenue laisse apparaître
une traînée à la suite des pics pouvant s’expliquer par des phénomènes d’adsorption dus à Hg ou
aux complexes. Une nouvelle composition de la phase mobile est donc testée pour augmenter sa
force d’élution avec l’ajout de méthanol (MeOH) à hauteur de 2% en présence de L-Cys (1 g·L-1) et
de L-Cys, HCl, H2O (1 g·L-1) (Figure 18-b). L’ajout de méthanol a pour effet de diminuer les temps
de rétention des composés mais n’empêche pas la traînée des pics chromatographiques et ne
représente donc pas une amélioration de la séparation. La première composition a donc été
retenue afin de limiter les réactifs. Cependant, l’utilisation répétée de cette phase mobile a
engendré des perturbations au niveau de la détection avec l’apparition d’intensité nulle lors de
l’acquisition de signaux transitifs (Figure 18-c). Ces troubles ont été attribués à la trop forte
concentration de réactifs (2 g·L-1 au total). Une nouvelle composition a donc été testé pour limiter
la concentration totale à 1 g·L-1 (0.5 g·L-1 de chaque réactif). Le chromatogramme obtenu (Figure
18-d) montre que dans ces conditions, les deux espèces sont efficacement séparées. Les
analyses suivantes ont donc été réalisée avec ces concentrations de réactifs (L-Cys à 0.5 g·L-1 et
L-Cys, HCl, H2O à 0.5 g·L-1). Dans ces conditions, il est également possible de séparer
110
l’éthylmercure (EtHg+) en moins de huit minutes (chromatogramme non montré). Cette nouvelle
composition de phase mobile n’a engendré aucune interférence au niveau de l’ICP-MS.
L’analyse du mercure depuis des matrices biologiques demande de quantifier des teneurs au
niveau de traces, voire d’ultratraces. Le montage analytique se doit donc d’afficher une sensibilité
optimale. Dans le but d’améliorer les capacités de détection du couplage HPLC-ICP-MS, la cellule
de collisions/réactions (dénommée CCT) est activée et pressurisée avec un gaz de collision
(hélium à 4.5 mL·min-1). La Figure 19 compare les chromatogrammes obtenus pour l’analyse d’un
étalon de méthylmercure avec et sans l’activation de la CCT. Les chromatogrammes ont été
obtenus au cours de la même journée d’analyse.
m/z=202
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
0 1 2 3 4t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
sans CCT avec CCT
Figure 19 : Chromatogrammes du méthylmercure avec e t sans CCT ; injection de MeHg + (5 µg·kg -1)
L’utilisation de la cellule CCT améliore la sensibilité du détecteur ; pour un même étalon injecté sa
hauteur du pic est multipliée par deux. Le bruit de fond subit également une élévation de son
signal. Cette augmentation de sensibilité est attribuée à une meilleure transmission des ions
jusqu’à l’analyseur quadripolaire (Tanner 2002).
Les performances du couplage HPLC-ICP-MS ont été évaluées en comparant les deux réglages
de l’ICP-MS (Tableau 18).
111
Tableau 18 : Limites de détection avec et sans CCT sur MeHg +, exprimées en fraction de masse et en
masse absolue pour 50 µL injecté
µg(Hg)·kg-1 pg(Hg) m/z
sans CCT avec CCT sans CCT avec CCT
199 0.43 0.02 22 1.1
200 0.26 0.03 13 1.5
201 0.27 0.03 13 1.6
Limite de
détection
202 0.27 0.02 14 0.9
La comparaison des LDs obtenues confirme la meilleure sensibilité avec l’utilisation de la CCT, le
gain de sensibilité est compris entre 8 et 20 selon les isotopes. Ces LDs sont comparables à celle
obtenue par Chang et al. (2007), égale à 1 pg, qui utilisent une colonne microbore (1 mm de
diamètre) et un nébuliseur à haute efficacité permettant d’être quantitatif sur la nébulisation. Même
si notre montage permet de se rapprocher de certaines valeurs obtenues en chromatographie en
phase gazeuse, Yan et al. (2008) évoquent une LD de 0.5 pg, il ne permet pas de tenir la
comparaison avec la plupart des couplages GC-ICP-MS : Martin-Doimeadios et al. (2002)
obtiennent des LDs de 21 et 28 fg pour les isotopes 202Hg et 201Hg respectivement.
3.3 Détection
Avant la mise en place de la dilution isotopique, des tests ont été réalisés pour améliorer
l’exactitude et la justesse des comptages de l’ICP-MS. Le biais en masse, le temps mort du
détecteur ou la formation d’hydrures dans la chambre de collisions (concernant le sélénium) sont
les principaux facteurs perturbant la justesse de comptage. Il faut donc en tenir compte afin de
limiter ces interférences soit par un réglage adéquat de l’ICP-MS soit par une correction des
données.
3.3.1 Temps mort du détecteur
Lors de l’utilisation d’un détecteur multiplicateur d’électrons fonctionnant en mode « Pulse
counting », son temps mort doit être préalablement réglé. Ce temps correspond à la période
nécessaire au détecteur pour prendre en compte l’impulsion induite par un ion. Durant cet instant,
tout nouvel ion arrivant au niveau du multiplicateur d’électrons n’est pas détecté, entraînant un
comptage erroné de l’ion suivi.
Le temps mort de l’appareil a été déterminé par la méthode proposée par Russ (Vanhaecke 1998).
Elle consiste à analyser des solutions de différentes concentrations pour plusieurs valeurs de
réglages du temps mort. Une fois les données recueillies, pour chaque concentration étudiée le
rapport isotopique normalisé (Robservé/Rthéorique) est tracé en fonction du temps mort. L’intersection
des différentes courbes donne la valeur du temps mort du détecteur (Figure 20).
112
Figure 20 : Méthode de Russ pour la détermination d u temps mort d’un détecteur, d’après Vanhaecke
et al. (1998)
Dans la pratique, plusieurs valeurs de temps mort peuvent être déterminées à partir du graphique
mais toutes assez proches les unes des autres. Pour obtenir la meilleure estimation, la moyenne
des différents résultats est retenue.
Il est à noter que des phénomènes (appelés « sag ») peuvent gêner la détermination du temps
mort et mener à une valeur plus importante de celui-ci (cf. courbe en pointillés sur la Figure 20).
Ceci peut arriver lors du comptage d’une solution trop concentrée. Les impulsions générées au
sein du détecteur par un trop grand nombre d’ions ne disposent pas toutes d’une amplitude
suffisante pour être détectées. Grâce à la méthode de Russ, il est aisé de repérer ces
phénomènes de « sag » (Vanhaecke 1998).
Dans le cadre d’un multiplicateur d’électrons à dynodes discrètes (utilisé dans le PQ-ExCell), le
temps mort est indépendant du rapport m/z observé (Vanhaecke 1998).
L’étude du temps mort du détecteur a été réalisée avec la solution de Tune à différentes
concentrations. Son utilisation a permis de suivre plusieurs éléments afin de s’assurer de
l’indépendance du temps mort du détecteur vis à vis du rapport m/z analysé.
La Figure 21 représente les résultats obtenus sur les éléments baryum (m/z suivies 138 et 137) et
thallium (m/z suivies 205 et 203).
113
Tl205/Tl203
0.950
0.960
0.970
0.980
0.990
1.000
20 25 30 35 40 45 50 55 60
temps mort (ns)
rapp
ort n
orm
alis
é
1ppb 10ppb 20ppb
Ba138/Ba137
0.900
0.950
1.000
1.050
0 10 20 30 40 50 60
temps mort (ns)
rapp
ort n
orm
alis
é
1ppb 10ppb 20ppb
b)
a)
Figure 21 : Rapport normalisé en fonction du temps mort réglé sur l'ICP-MS pour le baryum (a) et le
thallium (b)
Aucun phénomène de « sag » n’a été observé au cours de la détermination du temps mort. En
regardant chaque valeur de temps mort déterminée pour un élément, il a été observé une
estimation de 48 ns (s=4 ns) pour le baryum et une valeur de 52 ns (s=4 ns) pour le thallium. Il
apparaît donc que dans le cas du détecteur multiplicateur d’électrons à dynodes discrètes, le
temps mort soit indépendant de la masse suivie, comme observé dans la littérature (Vanhaecke
1998).
En relevant les différentes valeurs de temps mort observées, la valeur expérimentale moyenne est
de 50 ns (s=4 ns). Cette valeur a été utilisée pour le réglage de l’ICP-MS pour les futures
expériences. Il est conseillé de régulièrement déterminer le temps mort car il évolue avec l’âge du
détecteur (Hill 2000).
Une fois le temps mort déterminé, les intensités sont automatiquement corrigées par le logiciel de
l’ICP-MS grâce à l’équation suivante (Held 1999) :
)1( mesurée
mesuréecorrigée I
II
τ−= Éq. 3
114
avec :
- I corrigée et I mesurée : les intensités corrigée et mesurée, respectivement,
- ττττ : le temps mort du détecteur.
3.3.2 Correction de la formation d’hydrures de sélé nium
Lors de l’analyse par ICP-MS, l’hydrure de sélénium (SeH+) se forme au niveau de la cellule de
collisions/réactions, probablement à cause de la matrice de l’échantillon et de l’hydrogène introduit
(gaz de réactions). Cet hydrure peut affecter la mesure d’un rapport isotopique si les ions 77 ou 78
sont suivis. Il faut donc apporter une correction mathématique aux intensités obtenues après avoir
déterminé un facteur d’hydruration (fSe) (Hinojosa 2003).
Le suivi des rapports m/z 82 et 83 avec l’analyse d’une solution étalon de sélénium permet
d’évaluer fSe. La correction d’hydrures est appliquée aux masses 77 et 78 comme tels :
77Se = 77I - fSe76I Éq. 4
78Se = 78I - fSe77Se Éq. 5
avec :
- iI : intensité mesurée par l’appareil à m/z=i,
- iSe : intensité corrigée pour m/z=i.
Le facteur de formation d’hydrures (fSe) a été estimé à partir d’une solution étalon de
sélénométhionine à 50 µg·kg-1 analysées trois fois.
La valeur calculée est de 3.42 10-2 (s=2.1 10-3), ce qui représente un taux de formation d’hydrures
de presque 4%. Cette valeur est en accord avec la littérature (Hinojosa 2003 et 2004).
Ce facteur a besoin d’être estimé régulièrement, car il a été observé qu’il varie au cours du temps
(Figure 22).
Lors de l’analyse d’une séquence d’échantillon, il a été déterminé tous les deux échantillons.
115
R2 = 0.8942
0.0100
0.0300
0.0500
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
temps d'analyse (h)
f(Se)
f(Se)
Figure 22 : Evolution de fSe au cours d’une journée d’analyse
3.3.3 Biais en masse
De par le type d’ionisation utilisée (ICP), un phénomène, appelé biais en masse, doit être pris en
compte pour corriger les intensités délivrées par le détecteur.
Lors de la formation du plasma, les ions les plus légers subissent une discrimination par rapports
aux plus lourds. Ils sont envoyés à la périphérie du plasma et sont donc plus facilement exclus lors
du passage à travers l’interface de l’ICP-MS (Hill 2000). Deux phénomènes survenant au niveau
de l’interface peuvent expliquer ce biais (Heumann 1998) :
i. La séparation par effet de tuyère ou « nozzle separation effect » (Figure 23). La
production d’un jet supersonique venant buter sur le cône écorceur enrichit le centre du
faisceau d’ions en éléments lourds.
ii. La séparation par effet de charges. Les anions issus du plasma ont tendance à se
repousser et les plus légers sont donc plus facilement expulsés sur la périphérie du
faisceau.
116
Figure 23 : Illustration de l’effet de tuyère, d’ap rès Heumann et al. (1998)
Bien que le biais en masse soit influencé par la matrice de l’échantillon, il est déterminé grâce à
une solution étalon afin d’éviter la présence d’interférences isobariques qui fausseraient sa
détermination.
La correction s’effectue avec un modèle exponentiel (Hinojosa 2003). En prenant l’exemple du
sélénium, un étalon de Se a été analysé en suivant les masses de 76 à 82. Ces différentes
intensités sont d’abord corrigées de l’interférence SeH+ puis la courbe représentant le logarithme
népérien des rapports isotopiques normalisés en fonction de la différence de masse est tracée :
)()( expii
théo
i
MfR
RLn ∆=
Éq. 6
avec :
- iRexp : rapport isotopique entre la masse i et la masse 80, déterminé expérimentalement ;
- ithéoR : rapport isotopique entre la masse i et la masse 80 théorique, fourni par la table IUPAC
des abondances isotopiques (IUPAC 2003);
- iM∆ : différence entre la masse molaire i et la masse molaire de l’isotope 80.
Le coefficient directeur de cette courbe qui représente le facteur de correction du biais en masse
(K) a été obtenu grâce à une régression linéaire (Figure 24).
117
y = -0.025x + 0.0007R2 = 0.9941
-0.12
-0.08
-0.04
0.00
0.04
0.08
-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
M(80)-M(i)
Ln(Rexp/Rthéo)
Figure 24 : Estimation graphique du facteur de biai s en masse
Une fois K déterminé, les rapports isotopiques peuvent être rectifiés suivant l’équation :
)(exp
iMKiicorr eRR ∆−= Éq. 7
avec :
- icorrR : rapport isotopique entre la masse i et la masse 80 corrigé du biais en masse.
Grâce à ces corrections, les rapports isotopiques obtenus sont proches de l’isotopie naturelle
(Tableau 19).
Tableau 19 : Rapports isotopiques corrigés de la fo rmation d’hydrures puis du biais en masse, sur
l’aire de SeMet d’un extrait de levure analysé en H PLC-ICP-MS
Rapport expérimental
normalisé
Rapport corrigé des
hydrures
Rapport corrigé des hydrures
et du biais en masse
Rapport
isotopique Rexp/Rthéo Rcorr(SeH)/Rthéo Rcorr/Rthéo
76/80 0.9075 0.9075 1.0029
77/80 0.9813 0.9293 1.0017
78/80 0.9734 0.9587 1.0078
82/80 1.0603 1.0603 1.0086
La valeur du facteur de biais en masse semble évoluer au cours du temps avec une légère
tendance allant vers la diminution de sa valeur (Figure 25). Ce paramètre a donc été déterminé
régulièrement au cours des analyses (en même temps que le calcul du facteur fSe soit tous les
deux échantillons).
118
-0.0300
-0.0250
-0.0200
0 1 2 3 4 5 6
n° expérience
K
K
Figure 25 : Evolution du facteur de biais en masse au cours des analyses (moyenne sur trois
injections accompagnée de son écart-type)
Cette démarche (hormis pour la correction de la formation d’hydrures) est aussi utilisée pour la
détermination du biais en masse lors des analyses du mercure. Dans le cas de cet élément, il a
également été observé une évolution du facteur K au cours du temps, il est donc périodiquement
déterminé dans une journée d’analyse.
Le facteur du biais en masse est dépendant de l’élément analysé : sa valeur est d’environ 2.5%
par unité de masse pour le sélénium et inférieure à 0.5% dans le cadre du mercure. Ces valeurs
confirment une influence plus importante du biais en masse sur les éléments les plus légers.
3.3.4 Vérifications de l’absence d’interférences
L’utilisation de la dilution isotopique (DI) requiert la mesure d’isotopes libres de toutes
interférences. Des essais ont donc été réalisés pour vérifier cette hypothèse avec l’utilisation de
l’écart normalisé. Ce test provient de la norme ISO 13528, auquel nous avons introduit une
modification. Cet outil statistique permet de comparer deux valeurs au regard de leur incertitude
pour déterminer si elles sont significativement différentes. Le calcul de l’écart normalisé (EN)
s’effectue grâce à l’équation suivante :
222natSstd
SstdN
uuu
RRE
++
−= Éq. 8
avec :
- Rstd : le rapport isotopique issu de la mesure faîte sur une solution étalon
- RS : le rapport isotopique mesuré au sein de l’échantillon
119
- ustd et uS : les incertitudes de Rstd et RS respectivement
- unat : la variabilité naturelle sur le rapport théorique (IUPAC 2003). L’introduction de ce dernier
terme est la modification apportée à la formule originelle.
Le test est satisfait si EN est inférieur à 2 (pour un intervalle de confiance de 95%). Bien que EN
soit assez efficace pour mettre en avant une ou plusieurs interférences sur les isotopes, il ne peut
permettre de détecter que celles provenant de la matrice de l’échantillon. En effet, les valeurs
mesurées sur l’échantillon sont comparées à celle d’un étalon, donc si une interférence est
également présente sur cet étalon, EN ne suffit pas pour la détecter. Pour s’affranchir de cet
inconvénient, il suffit de comparer la valeur de l’étalon à la valeur théorique issue des tables
IUPAC (IUPAC, 2003).
L’écart normalisé est déterminé sur les différents échantillons (en l’absence d’étalon marqué) juste
avant la mise en place de la DI aussi bien en analyse totale qu’en analyse de spéciation.
120
4 Double dilution isotopique
4.1 Principe
La dilution isotopique consiste à déterminer la concentration d’un élément dans un échantillon par
ajout d’une quantité connue de ce même élément mais dont la composition isotopique a été
modifiée artificiellement, appelé étalon marqué par la suite.
La concentration de l’élément à doser est déterminée à partir de la mesure du rapport des deux
isotopes A et B dans le mélange échantillon-étalon marqué ; cette étape est la dilution isotopique
directe.
Lors de la double DI, l’étalon marqué utilisé est lui aussi caractérisé par dilution isotopique. Un
mélange entre l’étalon marqué et un étalon à l’abondance naturelle est réalisé. Cette étape est la
dilution isotopique inverse, en raison du rôle d’inconnu joué cette fois par l’étalon marqué.
La Figure 26 récapitule la démarche utilisée pour mener la double DI.
Figure 26 : Démarche de la double dilution isotopiq ue
Une fois les rapports isotopiques obtenus (étalon marqué plus étalon et échantillon plus étalon
marqué), les concentrations sont déterminées grâce aux équations suivantes :
• concentration de l’analyte dans l’étalon marqué Csp :
121
( ) ( )( ) ( )
−−=
spisp
etaetai
spi
etaetasp BRA
ABR
m
CmC Éq. 9
• concentration de l’analyte dans l’échantillon Cech :
( )( ) ( )
( ) ( )
−−
−=
echdech
spspd
ech
spspdech BRA
ABR
hm
CmC
1 Éq. 10
avec :
-meta : prise d’essai de la solution étalon
-Ceta : concentration de la solution étalon
-(A)eta : abondance naturelle de l’isotope A dans l’étalon
-(B)eta : abondance naturelle de l’isotope B dans l’étalon
-Ri : rapport isotopique pour la dilution isotopique inverse
-Rd : rapport isotopique pour la dilution isotopique directe
-(A)sp : abondance de l’isotope A dans l’étalon marqué
-(B)sp : abondance de l’isotope B dans l’étalon marqué
-mspi : masse de l’étalon marqué pour la dilution inverse
-mspd : masse de l’étalon marqué pour la dilution directe
-mech : prise d’essai de l’échantillon
-(A)ech : abondance naturelle de l’isotope A dans l’échantillon
-(B)ech : abondance naturelle de l’isotope B dans l’échantillon
-h : humidité de l’échantillon.
4.2 Spécificités
Les étapes préliminaires du dosage par dilution isotopique consistent à réaliser une évaluation de
la concentration de l’échantillon par étalonnage externe puis par ajouts dosés. Au delà de la semi-
quantification de l’échantillon, ces étapes permettent de repérer d’éventuels interférents, par le
calcul de l’écart normalisé, et de sélectionner le rapport isotopique de travail. Une fois celui-ci
choisi, la DI peut être mise en place.
La préparation de toutes les solutions et prises d’essai a été réalisée par pesée sur des balances
périodiquement étalonnées et quotidiennement vérifiées par des masses étalons. En particulier, la
concentration de la solution étalon de haute pureté servant à caractériser l’étalon marqué a été
obtenue par préparation gravimétrique (solution primaire). Pour chaque DI, deux solutions
primaires ont été réalisées avec l’étalon de l’analyte et depuis chacune d’entre elle, deux réplicats
122
de DI Inverse ont été préparés. Au final, l’étalon marqué a donc été caractérisé par quatre réplicats
de DI Inverse (indépendants deux à deux). Les solutions d’étalons primaires ont également été
utilisées pour la détermination du taux d’hydrures et du facteur du biais en masse afin de corriger
les rapports isotopiques mesurés par l’ICP-MS. Quatre réplicats de DI Directes ont été réalisés
pour caractériser l’échantillon.
La préparation des mélanges étalon marqué/échantillon pour la DI Directe et étalon marqué/étalon
pour la DI Inverse ont été réalisée de telle sorte que les rapports isotopiques mesurés soient
égaux entre eux (à 5% près). Cette méthode, dénommée « matched method » et traduite comme
méthode des analogues, a été développée par Henrion (1994) puis simplifiée par Catterick et al.
(1998). Son utilisation limite l’impact de sources d’erreurs (comme le biais en masse) sur le
résultat final de l’échantillon. Elle permet également de diminuer l’impact sur la détermination de
l’échantillon d’un étalon marqué mal caractérisé en isotopie ou en concentration (Catterick 1998).
Pour pleinement bénéficier des avantages de cette méthode, la même quantité d’étalon marqué (à
la même dilution) doit être employée pour la préparation des DI Inverses et Directes. Le rapport
isotopique à mesurer par ICP-MS doit également être proche de un. L’acquisition de deux isotopes
d’intensités similaires permet d’obtenir la meilleure justesse de mesure de la part du spectromètre
de masse (Fassett 1989, Sargent 2002). Les effets de paramètres comme le temps mort du
détecteur et la statistique de comptage des ions sont ainsi limités. La justesse est également
améliorée par l’analyse de fortes intensités (lorsque la concentration des échantillons le permet).
L’analyse des échantillons par le montage HPLC-ICP-MS a été réalisée à des temps de comptage
suffisants pour obtenir une justesse de mesure satisfaisante (typiquement de 250 à 300 ms sont
utilisées par isotope pour obtenir des écart-types relatifs de mesures inférieurs à 0.5%). Lors de
l’analyse en total, le temps de comptage a été fixé à 10 ms mais le nombre de comptage a été
augmenté jusqu’à 650 balayages. Chaque réplicat a été analysé cinq fois lors de son analyse.
La réalisation de la double dilution isotopique dans ces conditions a réuni les critères pour
reconnaître le processus de mesure comme une méthode primaire, à condition d’associer une
incertitude au résultat correctement définie.
123
5 Calcul d’incertitude
L’association de l’incertitude au résultat d’une mesure est une étape importante pour i) assurer la
traçabilité et la comparabilité des valeurs et ii) soutenir la validation de la méthode appliquée.
La démarche élaborée dans le cadre de cette étude pour associer une incertitude repose sur la
méthode analytique préconisée par le GUM (ISO/IEC 1995).
Il est possible de découper le calcul de l’incertitude en quatre étapes :
i. Définition du mesurande avec l’écriture du modèle mathématique le représentant.
Chaque grandeur d'entrée du modèle est estimée et la valeur du résultat (mesurande) est
déterminée. Dans le cadre de la DI, le mesurande est la concentration de l’échantillon à
déterminer (Cech), son modèle mathématique l’équation générale de la DI à laquelle se
rajoute les différentes corrections des données (taux d’hydrures, biais en masse…). Les
différents paramètres pris en compte dans le calcul de Cech et donc de u(Cech) sont
représentés dans un diagramme de cause et effets dans le cas su sélénium (Figure 27).
Figure 27 : Diagramme de causes et effets permettan t de visualiser les facteurs pris en compte dans
le calcul de l'incertitude de Cech
ii. Evaluation de l'incertitude-type de chaque grandeur d'entrée. A chaque paramètre de
l’équation de Cech est associé son type de variable (type A pour des valeurs expérimentales
ou type B pour des valeurs tabulées ou certifiées), son incertitude-type et une loi de
124
distribution (qui représente la répartition des valeurs selon leur probabilité de présence
dans l’intervalle donné). L’association d’une loi de distribution est primordiale pour les
incertitudes tabulées car elle permet de définir l’incertitude-type d’un paramètre à partir de
son incertitude élargie. Le Tableau 20 récapitule l’estimation des incertitudes-types pour
chaque catégorie de facteurs. L’intérêt de la méthode du GUM réside dans sa capacité à
traiter indifféremment des données expérimentales (Type A) et tabulées (Type B).
Tableau 20 : Estimation des incertitudes-types pour chaque catégories de paramètre pris en compte
dans l'incertitude finale sur la concentration de l 'échantillon déterminée par dilution isotopique
Catégorie de
paramètres
Type de
variables
Incertitude-type
u(xi) Mode de calcul de u(xi)
Masse B u(m) Incertitude établie lors de
l’étalonnage de la balance
Taux d’hydrures
( SeHf ) A )( SeHfσ
Ecart-type (σ) issu des 3 mesures
réalisées lors de sa détermination
Biais en masse (K) A ∑ − 2)(
)(
XX
V
i
iε
Incertitude d’une valeur déterminée par une
régression linéaire à partir des observations (Xi) et
de la variance (V) issue des résidus (εi) du modèle
Abondance
isotopique naturelle B
3
a
Loi uniforme où a représente l’incertitude fournie
par les tables IUPAC
Pureté de l’étalon B 18
)( ab−
Loi triangle rectangle où aet b représentent les
bornes de spécificités de la pureté de l’étalon
Répétabilité
instrumentale A )(Rσ
Ecart-type issu des 5 mesures
des rapports isotopiques
Répétabilité de la
méthode A
n
Yi )(σ Ecart-type issu des n résultats (Yi) obtenu avec
chaque réplicat indépendant de la méthode
iii. Détermination de l'incertitude-type composée du résultat grâce à la loi de propagation
des incertitudes qui donne la valeur de la variance (égale à l’incertitude-type au carré) de
Cech :
)()()(1
2
2
2i
N
i iechech xu
x
fCuCV ∑
=
∂∂== Éq. 11
avec :
-xi : paramètre de l’équation de Cech
125
-u(Cech), u(xi) : incertitude-type de Cech ou xi
-V(Cech) : variance de Cech
- f : équation mathématique de Cech.
Cette loi est valable dans l’hypothèse d’un développement à l’ordre 1 de Taylor de la
variance de Cech et dans le cadre de faibles variations des différents paramètres. De plus
cette expression ne tient pas compte des covariances des différents paramètres que l’on
considère nul (pas de corrélation entre les xi).
Les dérivés partielles (ix
f
∂∂
), appelées coefficients de sensibilité, décrivent comment varie
le résultat final en fonction des variations d’un paramètre. Elles permettent donc de
quantifier, en prenant aussi en compte l’incertitude du paramètre, son importance sur
l’expression finale de U. Le poids du paramètre se calcule donc par l’équation suivante :
)()( ii
i xux
fxP
∂∂=
Éq.12
La part du paramètre xi (en %) se calcule par la suite, tel que :
( ) ( )( )2
2
100%ech
ii
Cu
xPx = Éq. 13
iv. Expression du résultat accompagné de son incertitude élargie. Cette valeur représente
un intervalle dont il est attendu qu’il comprenne une fraction élevée de la distribution des
valeurs qui pourraient être raisonnablement attribuées au mesurande (définition du GUM).
)( echCkuU = Éq. 14
avec :
- U : incertitude élargie
- k : facteur d’élargissement ; généralement k=2 pour un intervalle de confiance
proche de 95% si le mesurande tend vers une loi de distribution normale.
Le calcul de l’incertitude-type du mesurande est effectué grâce au logiciel Wincert permettant la
propagation des incertitudes-types (version 3.11.2002.0115, Implex, France). Une fois la liste des
paramètres influant établie et leur incertitude-type déterminée, ces données sont entrées dans le
logiciel (Figure 28-a). Les différentes fonctions qui permettent d’aboutir au résultat final sont aussi
saisies dans le programme (Figure 28-b). L’étape suivante, consistant à la propagation des
126
incertitudes-types, est réalisée par Wincert. Ce logiciel a été validé au sein du LNE par la
comparaison des incertitudes de résultats délivrées avec celles obtenues suite au calcul manuel
des dérivées partielles.
Figure 28 : Paramètres (a) et fonctions (b) utilisé es dans le calcul de l’incertitude ; illustration a vec le
cas de la détermination de la sélénométhionine
Une fois les incertitudes déterminées sur les différentes mesures, il peut être comparé les valeurs
mesurées avec les valeurs certifiées. L’écart normalisé (ISO 13528) est aussi utilisé dans ce sens :
( ) ( )22certech
certechN
CuCu
CCE
+
−= Éq. 15
avec :
- Cech : valeur déterminée
- Ccert : valeur certifiée
- u(Cech) : incertitude-type de Cech
- u(Ccert) : incertitude-type de Ccert
Si EN est inférieur à 2 alors il n’y a pas de différence significative entre les deux valeurs (pour un
intervalle de confiance de l’ordre de 95%).
127
6 Traçabilité de l’analyse
Le guide Eurachem/Citac (2003) énonce les critères qui doivent être pris en considération pour
prétendre à la traçabilité de l’analyse :
- Définition du mesurande
- Choix d’une méthode de référence pour estimer sa valeur
- Démonstration à travers la validation que le calcul et les conditions de mesures incluent tous
les paramètres influents sur le résultat
- Identification de l’importance relative de chaque quantité prise en compte
- Choix et application des étalons de références appropriés
- Estimation de l’incertitude.
Le dosage des concentrations au sein des divers échantillons a été effectué avec l’utilisation de la
double dilution isotopique, reconnue par le Bureau International des Poids et Mesures (BIPM)
comme étant une méthode primaire. De ce fait, le mesurande est raccordé à la solution d’étalon
préparée de façon gravimétrique. Le calcul de l’incertitude par la méthode analytique du GUM
permet de mettre en avant parmi les paramètres pris en compte et ceux de plus grande influence.
La validation de la méthode se fait à travers l’utilisation de CRMs.
Le protocole développé au cours de ces travaux permet donc de prétendre à la traçabilité au SI
des résultats obtenus.
128
Chapitre IV : Applications aux analyses
de spéciation du sélénium
130
131
Le couplage HPLC-ICP-MS, les protocoles pour la mise en pratique de la DI et pour le calcul des
incertitudes des résultats étant établis, l’application à l’analyse d’échantillons réels a pu être
envisagée.
La démarche abordée repose sur des tests préliminaires pour extraire Se des échantillons et pour
séparer les espèces extraites. Suite à ces optimisations, le protocole métrologique
(DI→incertitude→traçabilité) a été appliqué pour caractériser les échantillons.
1 Analyses des levures
Les premiers échantillons testés ont été des levures séléniées, utilisées comme complément
alimentaire. Trois échantillons différents ont été analysés. Le premier était une levure
précédemment étudiée par le LCABIE dénommé dans ce mémoire LevTest (fraction de masse
totale proche des 2000 mg·kg-1). Le deuxième échantillon de levure (SELM-1) était un matériau
certifié (en sélénium total et sélénométhionine, Tableau 21) provenant du National Research
Council Canada (NRC, Canada). Le dernier échantillon a été fourni par les organisateurs lors de la
participation à l’intercomparaison CCQM-P86 et se présentait sous la forme de composés
pharmaceutiques dans lesquels la levure est enrobée d’excipients composés de cellulose, de
phosphate de calcium, de sels de magnésium et de dioxyde de titane (Goenaga 2008). Les
valeurs de références issues de l’intercomparaison pour ce matériau sont présentées dans le
Tableau 21. Les principaux défis liés à l’analyse de cet échantillon ont été i) la nouvelle matrice
avec les excipients recouvrant la levure qui peuvent modifier l’action de l’exraction et ii) sa
concentration en SeMet inférieure d’un facteur 6 par rapport au SELM-1. La participation du LNE à
l’intercomparaison CCQM-P86 ne s’est faîte qu’à travers la mesure du sélénium total, le couplage
n’étant pas encore réceptionné aux dates de soumission des résultats.
Tableau 21 : Valeurs certifiées du SELM-1 et valeur s de références pour la CCQM-P86
Analyte Sélénium total
(mg(Se)·kg-1)
Sélénométhionine
(mg(SeMet)·kg-1)
Selm-1 2059 ± 64 3389 ± 173
CCQM-P86 337.6, s=9.7 (n=13) 562, s=44 (n=11)
*valeurs issues de l’intercomparaison, représentant la moyenne et l’écart-type (s) sur
les n mesures (Goenaga 2008)
1.1 Optimisation de l’extraction sur LevTest
Les analyses ont débuté par l’étude des compléments alimentaires constitués de levures
séléniées. Le but final a été de disposer d’une méthode de référence pour la détermination de leur
concentration en sélénométhionine.
132
Des tests préliminaires ont visé à mettre en place un protocole d’extraction du sélénium la plus
quantitative possible. L’hypothèse de départ a été que si la totalité de Se se retrouve en solution, il
en sera de même pour SeMet à condition aussi de briser les liaisons entre cet acide aminé et les
macromolécules le contenant (les chaînes polypeptidiques par exemple). L’optimisation de la mise
en solution de Se a donc été réalisée en analyse totale du sélénium dans un premier temps. La
levure LevTest est utilisée pour mener ces essais préliminaires.
1.1.1 Comparaison des solvants d’extractions
La première étape a été la détermination du sélénium total contenu dans la levure. Ainsi 200 mg
de levure ont été minéralisés en présence d’acide nitrique (5 mL) et d’eau oxygénée (1 mL) sous
l’action d’un champ micro-onde. La valeur a été estimée à 1941 mg·kg-1 par étalonnage externe
sur produit humide avec un écart-type (s) de 69 mg·kg-1 pour 3 prises d’essais. La connaissance
de la concentration en sélénium dans la levure a permis d’établir des bilans de matières entre les
différentes fractions (extrait et culot) pour le calcul des rendements d’extraction.
Plusieurs modes d’extractions recueillis dans la littérature ont été comparés. Les protocoles testés
sur 200 mg de levures et sous agitation magnétique sont :
-5 mL d’eau milli-Q. Incubation à 90°C pendant 1 h. (Casiot 1999a)
-5 mL de tampon Tris-HCl (30 mmol·L-1, pH 7) en présence d’un inhibiteur de protéases (Pefabloc,
10 mmol.L-1) plus l’action de la driselase (200 mg). Incubation 1 h à 25°C. (Casiot 1999a)
-5 mL de tampon Tris-HCl (30 mmol·L-1, pH 7) avec un solubilisateur de protéines, le
dodécylsulfate de sodium (SDS à 200mg). Incubation 1 h à 25°C (Casiot 1999a).
-5 mL de tampon Tris-HCl (30 mmol·L-1, pH 7) avec 20 mg de protéase type XIV et 10 mg de
lipase VII. Incubation 16 h à 37°C. Protocole de Ca siot et al. (1999a) avec l’utilisation d’un tampon
Tris-HCl au lieu d’un tampon phosphate.
Afin d’accélérer l’incubation pour l’hydrolyse enzymatique de la levure, les échantillons ont
également été placés dans un bain à ultrasons (US) pendant trois heures au lieu de l’agitation
magnétique à 37 °C pendant 16 h.
Le dernier mode opératoire testé consistait en une hydrolyse acide de la levure. 500 mg
d’échantillon sont mis à reflux pendant 16 h en présence de 48 mL d’acide méthane sulfonique (4
mol·L-1) plus 1 mL de β-mercapto-éthanol pour éviter l’oxydation des acides aminés libérés
(Anders 2002, Wrobel 2003, Mester 2006, McSheehy 2005).
Après l’application de chaque protocole, le surnageant a été séparé du culot par centrifugation
(2500 rpm, 10 min). Les deux fractions (la totalité du culot ou 2 mL de surnageant) ont subi une
minéralisation en présence d’acide nitrique (5 mL) et d’eau oxygénée (1 mL) sous l’action d’un
champ micro-ondes. Suite à cette étape, les échantillons ont été dilués pour l’analyse du sélénium
133
total par ICP-MS avec un étalonnage externe. Les résultats ont permis de calculer le rendement
d’extraction grâce à l’équation suivante :
[ ] 100totéch
Se
Sem
mR = Éq. 16
avec :
- R : rendement d’extraction en pourcentage
- mSe : masse de sélénium dans le surnageant ou le culot
- méch : masse de la prise d’essai
- [Se]tot : concentration en sélénium de l’échantillon.
Les résultats obtenus en fonction du type d’extraction sont regroupés dans la Figure 29, où les
barres d’erreur représentent l’écart-type des 3 réplicats.
0
20
40
60
80
100
120
140
Drisela
seSDS
prona
se+lip
ase
eau
hydr
olyse a
cide
enzy
mes ave
c US
nature du solvant
%
% culot % extrait
Figure 29 : Pourcentages d'extraction du sélénium t otal en fonction du mode opératoire considéré
Il est important de noter que les divers protocoles employés permettent d’obtenir des rendements
en sélénium bien distincts. Ceci est attribué à leur mode d’action spécifique. Pour la plupart des
modes utilisés, le bilan de matière (somme des deux fractions) se situe à une valeur proche de
100% mais lors des extractions réalisées avec l’hydrolyse acide ou les enzymes plus des
ultrasons, l’estimation se situe vers 140%. Cela a représenté une motivation pour re-déterminer la
fraction de masse totale en sélénium de la levure. La nouvelle estimation a été de 1875 mg·kg-1
(s=23 mg·kg-1, n=3), soit sans différences significatives avec la première valeur. Pour expliquer ces
résultats, plusieurs hypothèses ont été envisagées, soit une contamination extérieure des fractions
134
soit un effet de matrice lors du dosage. Il a été difficile de conclure sur l’action de ces deux modes
d’extractions, même si l’accélération de l’action des enzymes avec les ultrasons peut être
supposée. L’utilisation du montage à reflux lors de l’hydrolyse acide s’avère délicate et ne permet
pas une action simultanée sur plusieurs réplicats, ce protocole n’a donc pas été retenu.
Concernant l’effet des autres réactifs, leur bilan de matière permet une interprétation des résultats.
L’action de l’eau seule permet de mobiliser la fraction hydrosoluble de Se qui représente 13% de
Se total. L’utilisation de la driselase permet d’atteindre 33% de Se représentant la partie contenue
dans les parois cellulaires et la fraction hydrosoluble. Le SDS libère 53% du sélénium total grâce à
la solubilisation des chaînes polypeptidiques qui contiennent une partie du sélénium. Enfin, l’action
du mélange protéase XIV et Lipase VII permet de recueillir jusqu’à 84% du sélénium total. Ceci
atteste le fait qu’il peut être contenu en grande partie dans les protéines, cible de l’action de la
protéase XIV. Ces résultats sont en accord avec ceux décrits par Casiot et al. (1999a).
Il peut donc être présumé que l’action successive des différents réactifs permettra d’atteindre une
mise en solution plus importante du sélénium. De par les rendements établis et ceux de la
littérature (Korhola 1986, Casiot 1999a, Wrobel 2003), il peut être supposé que la majorité du
sélénium se situe dans la fraction composée par les chaînes polypeptidiques, donc cibler l’action
de l’extraction sur ce compartiment de la levure. La suite des travaux a donc été consacrée à
l’étude d’extractions séquentielles.
1.1.2 Extractions séquentielles
Deux protocoles d’extractions séquentielles ont été testés, le premier (nommé protocole A) repose
sur un mode opératoire mis en place par Polatajko et al. (2005). Il consiste à répéter trois fois
l’extraction avec un nouveau mélange d’enzymes protéase XIV et lipase VII dans 5 mL de Tris-HCl
après chaque incubation de 16 h à 37°C. Les différe nts surnageants ont été analysés
indépendamment en sélénium total après la minéralisation d’une fraction de 2 mL. Le culot a
également été minéralisé pour déterminer le sélénium non extrait et pouvoir réaliser un bilan de
matière (Figure 30).
135
Figure 30 : Extraction par protéase/lipase réalisée trois fois, protocole A (d’après Polatajko 2005)
Les résultats sont présentés dans la Figure 31.
Protocole A
82
10
12
1 protéase+lipase I
protéase+lipase II
protéase+lipase III
culot
Figure 31 : Efficacité d'extraction (en %) de l'hyd rolyse enzymatique répétée trois fois (protocole A)
Le bilan de matière est de l’ordre de 105% (s=2 pour n=2). Le rendement global de ce mode
opératoire avoisine les 90% du sélénium total contenu dans la levure, soit une valeur comparable
à celle obtenue par Polatajko et al. (93 ± 4%) sur un autre échantillon de levure séléniée. Si
chacun des surnageants est analysé séparément, la première étape montre une efficacité
d’extraction d’environ 80%, la seconde mobilise 10% de Se tandis que l’ultime extraction n’offre
136
que 1% de rendement. Cette dernière étape apporte donc un gain relativement faible entre son
temps d’action (16 h d’incubation) et son efficacité.
Ce protocole est consommateur de temps pour le traitement de l’échantillon (trois fois 16 h
d’incubation), comme souvent dans le cadre d’analyses de spéciation depuis des matrices solides.
Il a donc été intéressant d’essayer de diminuer le temps relatif à l’extraction de Se par l’emploi de
réactifs différents mais en conservant une efficacité d’extraction au moins égale à celle obtenue.
Ainsi, un second mode opératoire (protocole B) a donc été mis en place. Comme vu
précédemment, les différentes propriétés des réactifs testés permettent d’atteindre différentes
fractions de sélénium dans la levure. Après application deux fois de l’extraction à l’aide d’un
mélange d’enzymes (lipase VII plus protéase XIV), le culot a subi une nouvelle extraction
enzymatique, cette fois ci non protéolytique, avec l’utilisation de la driselase qui vise son action sur
les parois cellulaires. La dernière étape de l’extraction a consisté à récupérer les chaînes
polypeptidiques n’ayant pu être digérées par les enzymes avec du SDS. Comme précédemment,
le dosage en Se total a été effectué par étalonnage externe après minéralisation des surnageants
et des culots pour établir les rendements d’extraction (Figure 32).
Figure 32 : Schéma des extractions séquentielles (p rotocole B)
Les résultats de cette extraction sont présentés dans la Figure 33.
137
Protocole B
80
8.0
1.86
3
protéase+lipase I
protéase+lipase II
Driselase
SDS
culot
Figure 33 : Efficacité d’extraction (en %) du secon d protocole (B) mis en place
Le bilan de matière (99% s=4 pour n=3) est correct. Le rendement total des extractions est
d’environ 96%, soit la meilleure mise en solution testée. Dans le détail, les extractions révèlent
plusieurs informations. Pour les étapes identiques au précédent protocole, les mêmes rendements
d’extractions ont été retrouvés, respectivement autour de 80 et 10% d’efficacité. Ensuite, il est à
noter le faible taux de recouvrement de la Driselase. Comparée au rendement obtenu lors de son
utilisation seule, l’action de la Driselase est réduite par les deux premières étapes du protocole
(2% d’extraction contre 40%). Ceci s’explique d’abord par le fait que le sélénium hydrosoluble a
été lessivé par les deux premières extractions (mélange d’enzymes protéase plus lipase),
représentant moins de 20% de Se. Il est aussi supposé qu’une action similaire est menée par les
deux types d’enzymes sur la levure, bien que le mélange d’enzymes de la Driselase (laminarinase,
xylanase et cellulase) agisse plus spécifiquement sur les polysaccharides tandis que la protéase
cible les chaînes polypeptidiques. 6% du sélénium ont été extraits par le dernier solvant (SDS).
Généralement, le SDS est utilisé pour la solubilisation de peptides, ce qui laisse sous-entendre
qu’une fraction de sélénium serait encore contenue dans ce type de molécules. L’action des
enzymes protéolytiques ne serait donc pas totale mais ne peut être améliorée par le mélange
d’enzymes utilisé au vu des résultats obtenus lors de la précédente extraction séquencée (1% de
Se mis en solution au bout de la troisième action des enzymes).
La mise en place du protocole B a permis d’améliorer le rendement global d’extraction de Se en
mode total par rapport au protocole A. Cependant pour s’assurer du maintien de la répartition
initiale des espèces séléniées, il est important d’étudier la spéciation des extraits.
138
1.2 Analyses de la levure SELM-1 et de l’échantillo n de CCQM-
P86
LLaa ddéétteerrmmiinnaattiioonn ddeess ffrraaccttiioonnss ddee mmaassssee eenn SSeeMMeett ddeess ddeeuuxx éécchhaannttiilllloonnss nn’’aa ééttéé eeffffeeccttuuééee qquuee ppaarr
llaa ccoolloonnnnee dd’’éécchhaannggee dd’’aanniioonnss dduu ffaaiitt qquu’’aauu mmoommeenntt ddee llaa mmiissee eenn ppllaaccee ddeess pprroottooccoolleess dd’’aannaallyyssee
eenn DDII,, sseeuullee cceettttee ssééppaarraattiioonn ééttaaiitt ddiissppoonniibbllee aauu llaabboorraattooiirree..
Des tests ont été menés pour juger des espèces mises en solution par les deux protocoles A et B
depuis l’échantillon de levure SELM-1 certifié pour sa concentration en SeMet et sur l’échantillon
de l’intercomparaison CCQM-P86 (la levure LevTest n’étant pas certifiée pour sa teneur en
SeMet).
Les conditions chromatographiques de la séparation par la colonne d’échange d’anions sont :
- une phase mobile composée de 5.10-3 mol·L-1 citrate d’ammonium en présence de 2% de
méthanol
- un volume d’injection de 100 µL.
Du fait du calendrier des recherches, le LNE n’a pu participer à l’intercomparaison CCQM-P86
pour fournir une valeur sur l’analyse de la sélénométhionine. En effet à la date stipulée aux
participants de l’essai inter-laboratoires, le protocole métrologique pour mesurer SeMet n’était pas
encore en place. En conséquence, le LNE n’a pu fournir qu’une valeur sur la concentration en Se
total.
Les deux protocoles d’extractions séquentielles ont donc été testés avec le couplage HPLC-ICP-
MS. Les surnageants ont été conservés à 4°C et en p résence de β-mercapto-éthanol (0.1%) pour
limiter leur oxydation (Polatajko 2005) jusqu’à l’analyse.
1.2.1 Mise en solution des espèces par le protocole A
1.2.1.1 SELM-1
La Figure 34 représente le chromatogramme obtenu par l’échange d’anions de l’extrait seul après
sa dilution et avec un ajout de 20 µg·kg-1 d’un étalon de SeMet. Il est à noter qu’entre la mise en
place du couplage et les premières analyses d’échantillon, des réglages ont été apportés
permettant de diminuer le temps mort du système. Ceci explique la différence dans les temps de
rétention pour SeMet entre les étalons et les extraits.
Sur le chromatogramme de l’extrait de SELM-1, un composé est largement majoritaire tandis que
deux élévations de la ligne de base sont présentes respectivement à 1.3 et 1.8 min. L’ajout de 20
µg·kg-1 de SeMet a permis d’identifier le pic majoritaire comme étant la sélénométhionine ce qui
est en accord avec la bibliographie (Mester 2006). Les autres « pics » ne correspondent pas aux
formes inorganiques (SeIV et SeVI), ils ne sont donc pas identifiés.
139
m/z=80
0
25000
50000
75000
100000
125000
0 1 2 3 4 5 6 7
t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
extrait extrait+20µg/kg SeMet
Figure 34: Chromatogramme du surnageant issu du pro tocole A du SELM-1 (extrait seul et dopé avec
un étalon de SeMet) sur la colonne d’échange d’anio ns
1.2.1.2 CCQM-P86
Le protocole A a également été appliqué à l’échantillon de CCQM-P86, avec ajout d’une étape
préliminaire. Cet échantillon se présentant sous la forme de comprimés pharmaceutiques, ces
derniers ont été broyés à l’aide d’un mortier et d’un pilon en agate avant toute mise en solution.
La Figure 35 représente l’analyse de l’extrait par la colonne d’échange d’anions.
Le profil des pics est identique à celui obtenu pour l’extrait de SELM-1. SeMet est le composé
majoritaire et deux élévations de la ligne de base sont présentes à des temps de rétention de 1.3
et 1.8 min laissant supposer la présence des mêmes composés secondaires.
m/z=80
0
10000
20000
30000
40000
50000
0 1 2 3 4 5 6t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
Figure 35 : Chromatogramme du surnageant issu du pr otocole A de la CCQM-P86 sur la colonne
d’échange d’anions
140
1.2.2 Mise en solution des espèces par le protocole B
1.2.2.1 SELM-1
Lors de l’application du protocole B sur le SELM-1, les différents surnageants issus de l’extraction
séquentielle ont été analysés individuellement pour juger de leur efficacité propre à libérer SeMet.
La Figure 36 regroupe les chromatogrammes des différents extraits.
m/z=80
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
0 1 2 3 4 5 6 7
t (min)
Inte
nsi
té (
cps)
protéase/lipase driselase SDS
Figure 36 : Chromatogramme des extraits de SELM-1 p ar le protocole B sur la colonne d’échange
d’anions
Quel que soit le type de solvant utilisé pendant le protocole B, le composé majoritaire dans les
surnageants est la sélénométhionine (conforme à la première extraction). Au vu de l’intensité des
pics de SeMet et s’il est tenu compte des facteurs de dilutions des divers surnageants (x100 pour
prot./lip., x20 pour driselase et x50 pour SDS), l’étape du protocole qui solubilise le maximum de
SeMet est celle avec les enzymes protéase plus lipase. Les deux mêmes composés secondaires
sont observables avec cette seconde extraction séquentielle, seule l’utilisation de SDS semble
mettre en solution un composé supplémentaire au temps de rétention de 1.1 min.
1.2.2.2 CCQM-P86
La Figure 37 représente l’analyse de l’échantillon de CCQM-P86 par le protocole B (analyse des
surnageants mutualisés). Une fois de plus SeMet représente quasiment l’unique espèce présente
dans le surnageant. Comme pour le SELM-1, les mêmes pics sont observés sur les
chromatogrammes de l’échantillon de CCQM-P86 avec l’application des deux protocoles
d’extraction.
141
m/z=80
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
0 1 2 3 4 5 6t (min)
cps
Figure 37: Chromatogramme de l’extrait de CCQM-P86 issu du protocole B sur la colonne d’échange
d’anions
1.2.3 Evaluation de l’oxydation de SeMet
Afin de vérifier si les deux composés sortant entre 1 et 2 min pouvaient être attribués à une
oxydation de SeMet, l’oxydation de ce composé a été simulée.
L’oxydation a été réalisée par l’action d’eau oxygénée sur l’étalon de 76SeMet. L’étalon marqué a
été choisi pour éviter toute confusion des produits de l’oxydation avec une éventuelle
contamination pendant le temps de réaction. 25 mL de solution à une fraction de masse de 40
µg(SeMet)·kg-1 est mis en présence de 5 mL d’eau oxygénée (30%), le mélange est laissé à
température ambiante pendant 72 h. Avant son analyse, l’échantillon oxydé a été dilué par 2 avec
la phase mobile pour limiter d’interférer la séparation par la présence d’eau oxygénée.
La Figure 38 présente les chromatogrammes de l’étalon 76SeMet avant et après oxydation.
142
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
0 1 2 3 4 5 6
temps, min
SeMetOx
m/z=76
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
0 1 2 3 4 5 6temps, min
Inte
nsité
, cps
SeMet SeMetOx
Figure 38 : Chromatogramme de 76SeMet oxydé sur la colonne d’échange d’anions ; a)
chromatogramme entier b) zoom
La comparaison des chromatogrammes obtenus avant et après l’oxydation sur 76SeMet montre
que le protocole se révèle quantitatif. Par contre l’analyse de l’étalon de 76SeMet, révèle que
l’échantillon avait naturellement commencé à s’oxyder : le composé au temps de rétention
d’environ 1.3 min correspond à un produit issu de la réaction menée sur 76SeMet. Les conditions
de stockage, 6 mois à 4 °C et à une fraction de mas se de 40 µg(SeMet)·kg-1 ne sont pas optimaux
pour assurer la stabilité de l’étalon. L’oxydation de SeMet mène à la formation de trois espèces
séléniées. Il est à noter aussi la faible intensité des trois pics en comparaison avec celui de SeMet,
bien qu’il y ait un facteur de dilution de 2 entre SeMet et ses produits d’oxydation. Ce résultat a
déjà été observé et expliqué par Gammelgaard et al. 2003 qui ont proposé un schéma réactionnel
(Figure 39).
b)
a)
143
COOHNHCHCHSeCHCH )( 2223
COOHNHCHCHCHOSeCH )()( 2223
COOHOHCHCHCHOSeCH )()( 223
SeOOHCH3 33SeSeCHCH+
COOHNHCHCHSeCHCH )( 2223
COOHNHCHCHCHOSeCH )()( 2223
COOHOHCHCHCHOSeCH )()( 223
SeOOHCH3 33SeSeCHCH+
Figure 39 : Schéma réactionnel de l'oxydation de Se Met d’après Gammelgaard et al. (2003)
Il y est montré que l’oxydation de SeMet conduit à la formation de quatre produits dont le diméthyl-
disélénide qui se volatilise. Ceci expliquerait les trois pics observés dans cette étude plus la
diminution d’intensité des pics par la volatilisation de deux atomes de Se avec le diméthyl-
disélénide.
La Figure 40 montre les chromatogrammes de 76SeMet oxydée et de l’extrait avec le protocole B
du SELM-1.
m/z=76
0
25000
50000
75000
0 1 2 3 4 5 6
Inte
nsité
, cp
s
SeMetOx Selm-1 (Protocole B)
0
2000
4000
6000
8000
0 1 2 3 4 5 6
temps, min
Figure 40 : Comparaison de l'oxydation de 76SeMet avec l'extrait du protocole B du SELM-1 (tail le
normale et avec un zoom) ; chromatogrammes obtenus sur la colonne d’échange d’anions
Parmi les deux composés obervés sur l’échantillon de SELM-1, seul le premier à 1.3 min peut
correspondre à un des composés de la dégradation de SeMet. Au vu de la faible intensité du pic, il
144
est difficile d’être affirmatif. La présence éventuelle d’une oxydation de SeMet dans l’extrait de
levure pose la question de savoir si celle-ci est apparue au cours du traitement de l’échantillon ou
s’il s’agit d’espèces présentes au sein de l’échantillon. Néanmoins, la mesure de SeMet ne devrait
pas être affectée à condition que son oxydation intervienne après l’équilibre avec l’étalon marqué.
1.2.4 Mise en place du protocole métrologique
Suite à l’optimisation de l’extraction et de la séparation des espèces de sélénium, les échantillons
ont été caractérisés pour leur fractions de masse en sélénium total et en SeMet.
1.2.4.1 Détermination du taux d’humidité
La première étape a été la détermination de la teneur en humidité de l’échantillon.
La procédure consiste à sécher trois prises d’essai d’environ 200 mg (pesées précisément) à 100
± 5 °C (température contrôlée à l’aide d’une sonde de température dûment étalonnée) jusqu’à
l’obtention d’une masse constante (∆m < 1 mg). Entre la sortie de l’étuve et le relevé de la masse,
les échantillons ont été ramenés à température ambiante dans un dessiccateur pendant 30 min.
Les valeurs déterminées sont de 4.6% (s de 0.2%) pour le SELM-1 et de 3.6% (s de 0.2%) pour la
CCQM-P86.
1.2.4.2 Analyse du sélénium total
1.2.4.2.1 Procédure de préparation des échantillons
Les étapes préliminaires à la DI visant à la semi-quantification de l’échantillon ont permis
également de repérer d’éventuels interférents par le calcul des écarts normalisés (EN). Le Tableau
22 récapitule les EN déterminés.
Tableau 22 : Ecarts normalisés sur les rapports iso topiques utilisés pour la DI du sélénium total
EN sur les différents rapports
Echantillons 78/82 80/78
SELM-1 1.08 -
CCQM-P86 4.32 0.23
Concernant le SELM-1, le rapport 78/82 n’est pas interféré et a donc été utilisé pour mener la DI.
L’échantillon CCQM-P86 par contre montre la présence d’une interférence sur l’isotope 82Se,
probablement due à sa matrice plus complexe comprenant entre autres des excipients. Le rapport
80/78 libre de toute interférence a été utilisé pour cet échantillon.
Pour l’échantillon de SELM-1, les calculs ont montré que pour atteindre un rapport proche de
l’unité, il fallait introduire une masse d’étalon marqué trop importante (3 g à une fraction de masse
145
proche de 10 mg·kg-1) et des effets de dilution risquaient de diminuer l’efficacité de la
minéralisation. Il a donc été choisi de prendre un rapport égal à 2 avec une prise d’essai de 100
mg de levure pour n’introduire que 600 mg de l’étalon marqué en 82Se. Le mélange échantillon
plus étalon marqué a été minéralisé selon le protocole déjà détaillé (Chapitre III, paragraphe 1.1).
Pour la préparation des DI Inverses, deux solutions de sélénium ont été préparées à partir d’une
minéralisation de Se élémentaire. Elles ont servi d’étalons primaires de haute pureté pour
caractériser la concentration de l’étalon marqué. De la poudre de Se(0) (50 mg) a été placée dans
un tube en présence de 2 mL d’eau et de 3 mL d’acide nitrique concentré. Le tout a été porté en
température (80 °C) jusqu’à dissolution totale du s élénium puis complété jusqu’à 50 mL pour
obtenir une fraction de masse de 1 g·kg-1. Depuis chaque solution primaire, deux DI inverses ont
été préparées avec la même quantité d’étalon marqué que pour les DI Directes.
Pour l’échantillon de la CCQM-P86, la prise d’essai a été de 100 mg de comprimé broyé. 1 g de
l’étalon marqué en 78Se (à 10 mg·kg-1) a été rajouté pour mener à un rapport de un. Ce mélange a
été par la suite minéralisé comme précédemment, seulement un ajout de 200 µL d’acide
fluorhydrique dans les réactifs a été opéré afin d’améliorer la digestion (la présence d’excipients
rend plus difficile l’attaque de l’échantillon). Les DI Inverses ont été préparées de la même manière
que pour le SELM-1 mais avec la quantité de l’étalon marqué utilisée pour les DI Directes.
1.2.4.2.2 Résultats de la DI avec son incertitude
Les résultats sur le dosage du sélénium total sont rassemblés dans le Tableau 23.
Tableau 23 : Résultats de la DI en sélénium total s ur les deux échantillons de levures, l'incertitude
est fournie avec un coefficient d'élargissement (k) égal à deux
Echantillon [Se] mg·kg-1 Certificat mg·kg-1
SELM-1 2090 ± 110 2059 ± 64
CCQM-P86 347 ± 19 337.6 ; s=9.7 (n=13) *
*valeurs de l’intercomparaison, représentant la moyenne et l’écart-type sur les n mesures (Goenaga 2008)
Les résultats sur les deux échantillons sont compatibles avec leur valeur de référence (EN<2). Ils
ont donc permis de valider la méthode utilisée pour deux gammes de concentrations et surtout de
démontrer sa robustesse sur les différentes matrices envisageables pour les compléments
alimentaires (levure lyophilisée seule ou enrobée d’excipients).
Grâce au calcul des incertitudes par la méthode analytique du GUM (dont la démarche est
détaillée dans le chapitre III-5), la part de chaque facteur a pu être calculée. La Figure 41 donne le
pourcentage de la participation des plus influents sur le résultat final pour les deux échantillons.
146
0 5 10 15 20 25 30 35
masse du godet plus l'échantillon
masse du godet vide
répétabilité de la méthode pour Cech
répétabilité pour la mesure du rapport inverse
répétabilité pour la mesure du rapport direct
masse du tube plus étalon
masse du tube vide
effet sur l'incertitude finale (%)
Selm-1 CCQM-P86
Figure 41 : Contribution des principaux paramètres sur la détermination du sélénium total par DI
Les paramètres les plus influents sont les mêmes pour les deux échantillons. La plus grande part
de l’incertitude provient des masses des prises d’essais (> 50%). Ceci s’explique par le mode
opératoire consistant à peser la prise d’essai (de l’ordre de 100 mg) dans un godet de
minéralisation (d’une masse de 160 g) ce qui a pour effet de générer une forte incertitude sur la
prise d’essai.
Les autres paramètres influents sont la répétabilité de la méthode sur la détermination de la
concentration de la CCQM-P86 et la répétabilité de la mesure faite sur le rapport inverse pour le
Selm-1. Cette différence s’explique par le fait que certains paramètres (comme la répétabilité de la
mesure d’un rapport isotopique) sont dépendants de la concentration dans l’échantillon ; leur poids
relatif dans la participation à l’incertitude finale devient donc important comparé à ceux issus de
paramètres ne dépendant pas de la concentration de l’échantillon (comme la répétabilité de la
mesure de Cech).
La détermination des paramètres influents permet de se rendre compte des faiblesses pouvant
survenir dans un protocole analytique. En conséquence, l’amélioration des qualités métrologiques
de celui ci peut être envisagée. Dans ce cas présent, il sera possible d’améliorer la mesure de la
prise d’essais, de sorte qu’elle ne soit plus dépendante de la masse du godet de minéralisation ce
qui conduira à obtenir un résultat final avec une plus faible incertitude.
1.2.4.3 Analyse de spéciation
1.2.4.3.1 Préparation de la dilution isotopique
La première étape a été de s’assurer que suite aux corrections apportées aux intensités, il n’y avait
pas d’interférences résiduelles gênant la mesure du rapport isotopique choisi, 78/76. L’écart
147
normalisé a donc été calculé pour chaque échantillon (SELM-1 et CCQM-P86), et pour l’analyse
en spéciation ou en sélénium total (Tableau 24).
Tableau 24 : Ecart Normalisé pour le dosage avec l’ étalon marqué en 76SeMet
EN sur 78/76
Echantillon Analyse en total Analyse de spéciation
SELM-1 0.22 0.12
CCQM-P86 0.86 0.45
De l’étude des EN, il est ressorti qu’aucune interférence n’est détectée. Le rapport 78/76 a donc pu
être suivi pour réaliser la DI en mode total et en spéciation pour les deux échantillons. L’analyse
des surnageants en sélénium total (après leur minéralisation) a permis d’établir les rendements
d’extractions. La présence de l’étalon marqué 76SeMet a servi aussi bien à la DI en spéciation qu’à
la DI en mode total.
La seconde étape a été la caractérisation de l’isotopie de l’étalon marqué de sélénométhionine
(76SeMet) par son analyse avec le couplage HPLC-ICP-MS. Le couplage a été utilisé pour éviter
que la présence d’autres espèces ou de contaminations n’entâche la détermination d’erreurs. Les
résultats obtenus sont regroupés dans le Tableau 25.
Tableau 25 : Abondances déterminées de l’étalon mar qué en 76SeMet
Isotopes Abondance (%) Incertitude, k=2 (%)
74 0.14 0.06
76 99.44 0.23
77 0.21 0.22
78 0.08 0.02
80 0.11 0.07
82 0.02 0.03
Comme attendu, l’isotope majoritaire est celui de masse 76. En dehors de cet isotope, il est à
noter que les incertitudes sur chaque abondance sont particulièrement élevées (de 25 à 150% de
la valeur). Ceci est dû à la méthode et l’appareillage utilisés pour déterminer ces différentes
abondances. L’ICP-MS de type quadripolaire n’est pas la détection la plus adaptée pour ce type de
détermination de par son manque de résolution en masse (proche des 200). Malgré tout, le
résultat final ne devrait pas être influencé par ce manque de fidélité dans les résultats : en effet,
seule l’isotope 76 devrait avoir une influence sur l’incertitude du résultat final et son incertitude est
relativement faible (0.2 %).
148
Pour préparer les DI directes, les prises d’essai des échantillons ont été de 100 mg. 500 mg
d’étalon marqué 76SeMet à 20 mg(SeMet)·kg-1 pour le SELM-1 et 390 mg pour la CCQM-P86 ont
été ajoutés aux échantillons afin d’obtenir des rapports isotopiques (78Se/76Se) de 2 et 1
respectivement. Après l’ajout de l’étalon marqué, le mélange a été agité pendant une minute avant
le début de l’extraction.
Les DI inverses ont été préparées pour chaque échantillon et avec les mêmes quantités d’étalon
marqué. Les solutions d’étalon utilisées pour caractériser l’étalon marqué sont préparées pour
chaque échantillon à partir de l’étalon commercial de SeMet d’abondance naturelle.
1.2.4.3.2 Efficacité des protocoles d’extraction en sélénium total
La comparaison de l’efficacité sur les deux échantillons et pour les deux protocoles d’extraction a
été faite grâce au calcul du rendement en sélénium total. Pour cela, le rapport de la quantité de
sélénium présente dans le surnageant sur la quantité disponible dans la totalité de l’échantillon
avant extraction a été calculé.
Les résultats sont regroupés dans le Tableau 26.
Tableau 26 : Rendements d'extractions des deux prot ocoles sur les deux échantillons associés à
leur incertitude (k=2)
Echantillon Protocole
d’extraction
Efficacité
d’extraction (%)
A 87 ± 3 SELM-1
B 99 ± 3
A 93 ± 5 CCQM-P86
B 91 ± 4
Les résultats ont confirmé que le protocole B conduit à l’extraction quantitative du sélénium depuis
une levure séléniée conditionnée sous forme de poudre lyophilisée (SELM-1) ; les premiers tests
effectués l’avaient démontré sur une levure non certifiée (LevTest). Cependant, le dosage
s’effectuant en DI où la mesure n’est pas une quantité de matière mais celle d’un rapport
isotopique, ce résultat n’est pas une preuve sur l’efficacité d’extraction. Par contre, deux
hypothèses peuvent être émises pour expliquer ce résultat : i) l’équilibre entre l’étalon marqué et la
totalité des espèces de Se est atteint, ou ii) l’extraction est quantitative. Comme il est difficile
d’imaginer un équilibre total entre l’étalon marqué de 76SeMet et les différentes espèces de
sélénium présentes dans l’échantillon, ce résultat ne peut être obtenu que par l’extraction
quantitative du sélénium total.
L’obtention d’un tel résultat apporte plusieurs avantages : une plus grande crédibilité à l’analyse
peut être accordée au résultat final, il ne peut pas être suspecté de la présence significative de
149
SeMet dans le résidu solide. De plus, dans le cadre d’une dilution isotopique, il n’est pas
nécessaire de démontrer que l’équilibre entre l’étalon marqué et l’échantillon ait été atteint avant
l’extraction : la quantitativité assure que tout l’étalon marqué plus l’analyte issu de l’échantillon vont
se retrouver en solution. Elle permet également une meilleure traçabilité des analyses. En effet,
cette étape est souvent considérée comme une rupture de la chaîne de traçabilité du fait du
manque d’information et d’efficacité du rendement (Rivier 2007). La démonstration d’une étape
quantitative permet de relier les échantillons aux processus de mesure réalisés par le système
HPLC-ICP-MS sans rupture de la chaîne de traçabilité.
Sur le complément alimentaire CCQM-P86, le protocole B n’a pas permis d’atteindre une
extraction quantitative. La même efficacité a été observée quel que soit le mode opératoire. Une
explication peut être trouvée par la formulation sous laquelle se présente l’échantillon. En effet, il
s’agit d’une levure séléniée enrobée par des excipients. La présence de cette matrice peut avoir
diminué l’efficacité des agents d’extraction sur la levure avec, par exemple, un effet de dilution.
1.2.4.3.3 Détermination de la sélénométhionine
Suite à l’évaluation de l’efficacité des protocoles sur la mise en solution du sélénium total,
l’efficacité des protocoles A et B sur le respect de l’intégrité des espèces a été étudiée.
La Figure 42 représente les chromatogrammes des extraits obtenus à partir de chaque échantillon
pour les isotopes 78 et 76.
SELM-1 (protocole A)
0
10000
20000
30000
40000
m/z=76 m/z=78
SELM-1 (protocole B)
0
10000
20000
30000
40000
50000
0 1 2 3 4 5 6
t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
CCQM-P86 (protocole A)
0
10000
20000
CCQM-P86 (protocole B)
0
10000
20000
30000
40000
0 1 2 3 4 5 6t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
Figure 42 : Chromatogrammes des extraits de levures sur la colonne d’échange d’anions
150
Ces chromatogrammes confirment la présence de SeMet dans les extraits des deux échantillons
avec les protocoles A et B.
Les résultats obtenus sur le dosage de SeMet par DI sont regroupés dans le Tableau 27.
Tableau 27 : Résultats sur le dosage de la sélénomé thionine par DI associés à leur incertitude (k=2)
Echantillon Protocole
d’extraction
Analyse de spéciation
(mg(SeMet)·kg-1)
Valeur certifiée
(mg(SeMet)·kg-1)
A 3330 ± 210 SELM-1
B 3340 ± 290 3389 ± 173
A 580 ± 22 CCQM-P86
B 571 ± 17
562; S= 44 *
(n=11)
*valeurs issues de l’intercomparaison, représentant la moyenne et l’écart-type (Goenaga 2008)
Les résultats sont en accord avec les valeurs certifiée ou consensuelle. La compatibilité entre les
valeurs de références pour les deux échantillons permet de valider les deux protocoles
expérimentaux pour la détermination de SeMet sur les deux gammes de concentrations.
Il est à noter qu’aucune différence significative d’efficacité n’est observée entre les deux
extractions : elles permettent toutes les deux d’atteindre la sélénométhionine contenue dans les
deux types d’échantillons.
Outre le fait que le protocole B peut s’avérer plus efficace pour l’extraction du sélénium dans sa
totalité, il permet également d’avoir un traitement de l’échantillon plus court avec deux étapes
d’incubation pendant une heure plutôt qu’une seule de 16 h. Bien que le temps de traitement de
l’échantillon ne soit pas le seul paramètre jouant sur la conservation de l’intégrité des espèces, le
fait de limiter son temps permet de réduire le risque d’oxydation des espèces. Par contre,
l’augmentation des extractions successives peut entraîner une dilution plus importante des
échantillons (dans le cadre d’analyse de levures séléniées, ce problème ne se pose pas au vu des
concentrations élevées en Se rencontrées).
L’annexe 4 représente un exemple d’un calcul de l’inceritude mené avec le logiciel Wincert.
Les incertitudes associées à la concentration du Selm-1 sont relativement plus importantes (7% en
moyenne) que celles pour la CCQM-P86 (3%). Comme déjà expliqué pour l’analyse du sélénium
total, l’influence de certains paramètres est proportionnelle à la concentration de l’échantillon et en
conséquence leur effet est majoré sur le résultat de l’incertitude finale pour le SELM-1 dont la
teneur en Se est la plus importante. Cette différence inter-échantillons est plus accentuée dans le
cadre de l’analyse de spéciation par rapport à l’analyse de Se total (où l’incertitude relative est de
5% pour chaque échantillon) à cause de la différence des protocoles d’analyse (par exemple les
151
tubes d’extraction de SeMet sont beaucoup plus légers que les godets utilisés pour minéraliser et
ont donc une incidence moindre sur l’incertitude finale).
La Figure 43 présente les contributions des facteurs les plus importants sur l’incertitude pour les
deux échantillons avec chaque protocole d’extraction.
0 10 20 30 40 50 60 70
abondance naturelle de l'isotope 76
répétabilité de la méthode pour Csp
répétabilité de la méthode pour Cech
répétabilité pour la mesure du rapport inverse
répétabilité pour la mesure du rapport direct
effet sur l'incertitude finale (%)
Selm-1 (A) Selm-1 (B)
0 10 20 30 40 50 60 70
masse de l'échantillon humide
masse de l'échantillon sec
répétabilité de la méthode pour Csp
répétabilité de la méthode pour Cech
répétabilité pour la mesure du rapport inverse
répétabilité pour la mesure du rapport direct
effet sur l'incertitude finale (%)
CCQM-P86 (A) CCQM-P86 (B)
Figure 43 : Contribution des principaux paramètres sur la détermination de SeMet par DI
Pour le SELM-1, les facteurs les plus influents sont ceux proportionnels à la concentration de
l’échantillon, répétabilité des mesures et abondances isotopiques, étayant l’hypothèse expliquant
la différence des incertitudes relatives entre échantillons. Dans le cas de l’échantillon de la CCQM-
P86, ces paramètres ont également une influence non négligeable. D’autres paramètres
interviennent dans l’incertitude finale comme les masses liées à la détermination du taux
d’humidité. Un autre paramètre influent pour les deux échantillons est la répétabilité de la méthode
pour déterminer leur concentration. Ce terme permet de prendre en compte des paramètres dont
les effets ne peuvent être mesurés ou modélisés pour figurer directement sur le modèle
mathématique représentant le mesurande. Plus particulièrement, sa participation permet
d’introduire la variabilité du traitement de l’échantillon dans l’incertitude finale. De ce fait, il peut
152
être supposé une meilleure répétabilité dans l’action du protocole B car sur les deux échantillons
sa participation sur l’incertitude finale est moins importante qu’avec le protocole A.
Le Tableau 28 récapitule les pourcentages de sélénium dosé et identifié pour les différentes
extractions.
Tableau 28 : Récapitulatif des pourcentage de sélén ium extrait et identifié pour chaque échantillon
par les protocoles A et B
Se total extrait SeMet extraite
Echantillon Setotal
mg(Se)·kg-1
Protocole
d’extraction mg(Se)·kg-1 % mg(Se)·kg-1 % sur Se
extrait
% sur Se
total
A 1815 87 1341 74 64 SELM-1 2090
B 2080 99 1345 65 64
A 322 93 234 73 67 CCQM-P86 347
B 317 91 230 73 66
Il est à noter que le pourcentage de SeMet sur chaque échantillon équivaut à 65% du sélénium
total. Cette concentration en SeMet représente aussi de 65 à 75% du sélénium extrait mais
souligne surtout le fait qu’une fraction de Se extrait n’est pas identifiée lors de l’analyse.
1.2.4.3.4 Etude de l’étalon de SeMet d’abondance na turelle
Le protocole d’analyse a reposé sur la caractérisation de la fraction de masse en SeMet des
échantillons en référence à un étalon de SeMet commerciale dont la pureté n’est pas certifiée mais
simplement contrôlée. L’analyse de l’étalon par le couplage HPLC-ICP-MS a permis de s’assurer
qu’une seule espèce de Se est présente, cependant cette analyse n’autorise pas de la non
présence d’autres composés (autres que des espèces séléniées).
Des tests ont donc été menés avec deux étalons provenant de différents fournisseurs (Sigma-
Aldrich et Acros Organics). Ainsi, la DI sur le SELM-1 avec le protocole A a été reproduite dans les
conditions présentées précédemment (paragraphe 1.2.4.3.1) et en utilisant l’étalon de chez Acros
pour caractériser l’étalon marqué dans les DI Inverses.
Le Tableau 29 récapitule les résultats obtenus pour les DI menées avec chaque étalon.
153
Tableau 29 : Résultats de la DI sur le SELM-1 en fo nction de l’étalon de SeMet,
incertitude fournie en prenant k=2
Etalon Analyse de spéciation
(mg(SeMet)·kg-1)
Certificat
(mg(SeMet)·kg-1)
Sigma-Aldrich 3330 ± 210
Acros Organics 3330 ± 350 3389 ± 173
Les deux résultats sont similaires et justes ; ils ne montrent donc pas d’incidence du choix de
l’étalon sur le résultat de la DI en SeMet. De plus, le mélange d’isomères de l’étalon n’affecte pas
non plus le résultat (mélange de D- et L-SeMet pour Sigma et une composition à 99 % de L-SeMet
pour Acros).
La seule différence provient de l’incertitude du résultat final qui a augmentée passant de 6 à 10%
de la valeur mesurée. Elle s’explique par la valeur de la répétabilité obtenue sur la mesure du
rapport inverse supérieure pour ce second échantillon. Le jour de l’analyse, l’ICP-MS était deux
fois moins sensible sur la détection de Se ce qui a dégradé la répétabilité des mesures. Comme il
s’agit du paramètre ayant le plus d’influence sur U(SeMet) (cf. Figure 43), son augmentation
augmente l’incertitude finale. Ce phénomène met en lumière l’importance d’avoir de fortes
intensités pour améliorer la fidélité du résultat.
1.2.5 Validation de la séparation sur la colonne d’ appariements d’ions
Dès la diponibilité de la colonne de phase inverse, le mécanisme d’appariements d’ions a pu être
testé sur des échantillons réels. Les extraits préparés en DI et déjà analysés sur la colonne
d’échanges d’anions sont de nouveau analysés sur cette nouvelle séparation. La phase mobile est
composée de 0.1% de TFA en présence de 2% de méthanol. Le volume d’injection est de 100 µL.
Les échantillons ont été conservés à 4 °C en présen ce de β-mercapto-éthanol pendant plusieurs
mois. Le but étant de valider la séparation des espèces pour l’analyse de SeMet.
La Figure 44 montre les chromatogrammes obtenus pour ces différents extraits.
154
CCQM-P86 (Protocole A)
0
10000
20000
30000
SELM-1 (Protocole A)
0
10000
20000
30000
76 78
CCQM-P86 (Protocole B)
0
10000
20000
0 1 2 3 4 5t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
SELM-1 (Protocole B)
0
10000
20000
30000
0 1 2 3 4 5t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
Figure 44 : Chromatogrammes des extraits de levures sur la colonne d’appariements d’ions
Sur tous les extraits, SeMet est le composé majoritairement présent. Seul le surnageant issu de
l’analyse du SELM-1 avec le protocole B ne permet pas d’analyse de par la présence
d’interférences. Sur les différents extraits, il est possible de voir d’autres espèces non négligeables
(contrairement à la séparation par échange d’anions). En particulier, une espèce de Se dont le
temps de rétention est de 2.8 min est présente sur les différents chromatogrammes. L’observation
de son isotopie sur les extraits de la CCQM-P86 (où l’étalon marqué fut ajouté tel que 78Se/76Se
soit égal à un) met en évidence que cette espèce n’est pas issue de la dégradation de SeMet. En
conséquence, il peut être supposé que cette espèce est issue de la dégradation d’autres
composés présent dans le surnageant ou qu’elle n’était pas séparée sur la colonne d’échange
d’anions.
L’analyse des DI Inverses conservées dans les mêmes conditions que les DI Directes ne montre
aucune évolution de SeMet par l’apparition de nouveaux pics.
Les différents extraits ont donc été de nouveau analysés pour déterminer la concentration en
SeMet par DI (Tableau 30).
155
Tableau 30 : Résultat sur la DI de SeMet après stoc kage des surnageants ;
IP-RP : colonne de phase inverse avec appariement d ’ions ; AX : colonne échange d’anions
Echantillon Protocole
d’extraction
Age du
surnageant
(mois)
Résultat avec
IP-RP
(mg(SeMet)·kg-1)
Résultat avec AX
(mg(SeMet)·kg-1)
Certificat
(mg(SeMet)·kg-1)
A 17 3260 ± 250 3330 ± 210 SELM-1
B 18 Non analysé 3340 ± 290 3389 ± 173
A 15 553 ± 21 580 ± 22 CCQM-P86
B 14 554 ± 20 571 ± 17
562; S= 44 *
(n=11)
*valeurs issues de l’intercomparaison, représentant la moyenne et l’écart-type (Goenaga 2008)
Les résultats obtenus avec la séparation par appariements d’ions sont compatibles avec les
concentrations de références. Il n’y a pas de différences significatives avec la première analyse
par la colonne d’échanges d’anions, bien que les trois nouvelles valeurs sont toutes inférieures aux
précédentes déterminations. L’utilisation de la séparation par appariement d’ions a donc pu être
considérée comme validée pour l’analyse de SeMet dans des extraits de levures pour les deux
gammes de concentrations.
Même si le stockage des surnageants pendant une période aussi longue ne peut être envisagé
pour espérer caractériser de manière la plus juste possible un échantillon, l’accord des résultats
obtenus entre le jour de leur extraction et leur seconde analyse montre que la dilution isotopique
est une méthode robuste de quantification.
Les incertitudes des nouveaux résultats ont été calculées de la même manière que lors de la
première analyse avec la séparation par échange d’anions et montre les mêmes facteurs
prédominants que ceux précédemment pointés (paragraphe 1.2.4.3.3).
156
2 Analyses des farines de blé
Pour la participation à l’intercomparaison CCQM-K60, le LNE a reçu un échantillon de farine de blé
à analyser pour déterminer ses fractions de masse en sélénium total et en sélénométhionine. Cet
échantillon, hormis le fait qu’il s’agit d’une nouvelle matrice, a représenté, dans le présent travail,
un défi analytique de par la faible fraction de masse annoncée (de l’ordre de 10 µg·kg-1). Avant
d’appliquer la méthode de référence développée pour les levures sur ce nouvel échantillon, des
tests ont été effectués sur une farine commerciale afin d’identifier les points sensibles liés à
l’analyse d’une telle matrice. Cette farine de blé (dénomination commerciale : Kamut) a été
acquise auprès d’un magasin proposant des produits de l’agriculture biologique. Il s’agit d’une
farine produite en Amérique du Nord et distribuée par La Vie Claire (France). Le choix s’est porté
sur cet échantillon en espérant obtenir une farine suffisamment riche en sélénium de par sa
provenance : l’Amérique du Nord pouvant offrir des sols sélénifères, les concentrations en Se des
blés cultivés dans ces régions sont souvent plus élevées qu’en Europe (Hawkesford 2007).
2.1 Farine de Kamut
2.1.1 Détermination du sélénium total
La première étape a été de déterminer la concentration en sélénium total. 200 mg d’échantillons
ont donc été minéralisés suivant le protocole déjà détaillé (Chapitre III paragraphe 1.1).
Le dosage a été effectué en étalonnage externe et en ajouts dosés sur trois réplicats (Tableau 31).
Les résultats ont été corrigés de l’humidité de l’échantillon (10.25% ; s = 0.09%).
Tableau 31 : Analyse de la fraction de masse en sél énium total de la levure de Kamut ;
Dosage par étalonnage externe et ajouts dosés
Etalonnage externe
(mg·kg-1)
Ajouts dosés
(mg·kg-1) Isotope
moyenne s (n=3) moyenne s (n=3)
76 0.36 0.07 1.51 0.13
78 0.33 0.06 1.39 0.19
80 0.48 0.08 1.50 0.14
82 1.06 0.65 2.27 0.32
Moyenne des isotopes 0.56 0.42 1.67 0.41
Moyenne des isotopes (82 exclu) 0.39 0.09 1.47 0.15
157
La différence de résultats entre l’étalonnage externe et les ajouts dosés montre la présence d’un
important effet de matrice ; probablement lié à la quantité de carbone organique dissous dans la
solution suite à la minéralisation. De plus, une grande variabilité a été observée entre les isotopes
étudiés. En particulier, 82Se est fortement interféré. La variabilité observée entre chaque isotope
démontre également le manque d’homogénéité de l’échantillon pour une prise d’essai de 200 mg.
Pour tenter de s’affranchir des interférents liés à la matrice, il a été décidé d’analyser les
minéralisats après leur dilution par couplage HPLC-ICP-MS avec la colonne d’échange d’anions.
La minéralisation de l’échantillon doit permettre d’obtenir tout le sélénium sous une même espèce
inorganique qui devrait être séparée d’une partie des interférents de la matrice.
La concentration en sélénium total dans les minéralisats a été déterminée par ajouts dosés à partir
d’une solution préparée depuis la digestion de sélénium élémentaire et dont la fraction de masse
est connu par gravimétrie (protocole similaire à la préparation des solutions d’étalon primaires pour
l’utilisation en DI Inverse). Les résultats sont regroupés dans le Tableau 32.
Tableau 32 : Dosage des minéralisats de Kamut par a jouts dosés ; en utilisant la colonne d’échange
d’anions
Isotope Moyenne intra-isotopes
(mg·kg-1) Ecart-type
76 1.18 0.25
78 1.28 0.09
80 1.32 0.18
82 1.43 0.19
Moyenne inter-isotopes 1.30 0.18
Sur l’ensemble des isotopes et au vu des écarts-types associés, aucune différence significative
n’est observable. En particulier l’isotope 82 n’est plus interféré par la matrice. Il ressort donc que la
moyenne entre tous les isotopes peut être utilisée pour quantifier cet échantillon (1.30 mg·kg-1
avec 0.18 d’écart-type). La méthode employée visant à séparer l’analyte des interférents de la
matrice semble satisfaisante pour quantifier le sélénium total.
2.1.2 Détermination de la sélénométhionine
En raison de la faible concentration en sélénium total présente dans l’échantillon de Kamut, le
protocole d’extraction appliqué a été l’hydrolyse enzymatique répétée trois fois (protocole A). Le
protocole B s’effectuant en quatre étapes, il génère une plus grande dilution de l’échantillon.
La Figure 45 représente l’analyse de l’extrait par la colonne d’échange d’anions.
158
Kamut (Protocole A)
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
0 5 10 15 20t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
75 76 80
Figure 45 : Chromatogramme de l'extrait de Kamut (P rotocole A) sur la colonne d’échange d'anions
Le chromatogramme obtenu montre clairement la présence d’interférence sur la masse 76 : le
profil du pic de SeMet est différent sur cette masse de celui des autres isotopes de Se suivis. Par
le suivi de la masse 75, il est observé un pic de forte intensité au même temps de rétention qui
expliquerait ce profil différent sur l’isotope 76 par son hydruration. Il est peu probable que ce soit
une espèce d’arsenic (75As), car lors de l’analyse du total une faible intensité (inférieure à 3000
cps) a été observée dans le spectre de masse des minéralisats. Sur la masse 80, SeMet se
retrouve le composé majoritaire et seule une seconde espèce sort vers 1.3 min.
Le dosage de la fraction de masse a été réalisé par étalonnage externe sur les masses 78 ; 80 et
82. Sur trois réplicats d’extraction, elle est estimée à 1.07 mg(Se)·kg-1 (s=0.04).
Ce même extrait a également été analysé par phase inverse avec le TFA comme agent
d’appariement d’ions (Figure 46).
159
Kamut (Protocole A)
0
2000
4000
6000
8000
10000
0 1 2 3 4 5 6 7 8t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
76 80
Figure 46 : Chromatogramme de l'extrait de Kamut (P rotocole A) sur la colonne d'appariement d'ions
Avec cette seconde séparation, les interférents présents au temps de rétention de SeMet sur le
chromatogramme de l’échange d’anions se retrouvent en début du chromatogramme et aucune
interférence ne semble perturber la masse 76. Ce mécanisme de séparation (IP-RP) confirme la
présence du sélénium majoritairement sous forme de SeMet. Une seconde espèce est encore
observable sur le chromatogramme vers 3 min.
Le dosage des extraits a été réalisé par étalonnage externe. La fraction de masse est estimée à
0.93 mg(Se)·kg-1 (s=0.03 sur 3 réplicats). Les isotopes 76Se, 78Se, 80Se et 82Se ont pu être utilisés
pour la quantification et aucune différence significative n’a été détectée.
Une différence significative est observable entre les résultats obtenus sur les deux colonnes. Cela
peut provenir i) d’un effet de matrice plus important pour l’IP-RP marqué par le fait que le dosage
est effectué par étalonnage externe et qui engendre une sous estimation de SeMet ou ii) une co-
élution dans le cas de l’échange d’anions qui surestime SeMet. Le fait que SeMet soit déterminée
par au moins 3 isotopes de Se limite la possibilité d’interférences isobariques qui elles aussi
surestimeraient SeMet.
Au final, l’analyse de cet échantillon de farine a permis de mettre en avant des difficultés sur la
détermination de sa fraction de masse totale par ICP-MS. L’analyse par couplage HPLC-ICP-MS a
révélé être une alternative pour limiter l’impact des interférents de la matrice sur le dosage.
L’utilisation du protocole A pour l’extraction de SeMet a montré qu’il était possible d’atteindre cette
espèce mais le résultat sur la mesure de sa fraction de masse a été dépendant de la séparation
utilisée. En chromatographie d’échange d’anions, des interférents ont été observés sur la masse
76 et au temps de rétention de SeMet, ce qui peut limiter l’utilisation de l’étalon marqué 76SeMet
pour quantifier la sélénométhionine. L’utilisation de la phase inverse a permis de réduire ces
interférents sur la détermination de SeMet.
160
Ces informations ont permis d’aborder l’intercomparaison en connaissant les points critiques pour
l’analyse d’une farine de blé.
2.2 Echantillon de farine de la CCQM-K60
Les protocoles développés pour l’analyse des levures ont été appliqués à ce nouvel échantillon ce
qui a permis d’étudier leur robustesse entre les différents types de matrices.
La mesure du sélénium total a été réalisée selon les méthodes similaires déjà présentées lors du
dosage des levures mais par une autre équipe du LNE. Cette étude n’a donc pas été intégrée aux
travaux de thèse et ne sera pas détaillée dans ce document. La valeur déterminée est de 17.33 ±
0.46 mg(Se)·kg-1 (k=2).
2.2.1 Travaux préliminaires à l’utilisation de la D I
L’étude de la concentration en SeMet de la CCQM-K60 a débuté par une analyse par étalonnage
externe et par ajouts dosés. Au vu de la faible concentration en SeMet de l’échantillon, le protocole
A a été préféré pour mener l’extraction (l’effet de dilution de l’échantillon est moindre par rapport
au protocole B). Une autre raison d’utiliser ce protocole est de limiter des effets matrices par une
mise en solution trop importante de molécules pouvant interférer sur la séparation ou la détection.
L’emploi du protocole B avec différents agents complémentaires augmente le nombre des
molécules extraites de toutes natures (en particulier la solubilisation des chaînes polypeptidiques
par le SDS) et comme l’échantillon possède une faible concentration en Se il ne peut être dilué
avant son analyse par couplage HPLC-ICP-MS pour limiter leur impact.
Au final, une prise d’essai d’environ 200 mg a été extraite par l’action répétée des enzymes
Protéase XIV et Lipase VII dans le Tris-HCl (30 mmol·L-1). Trois réplicats ont été réalisés pour
réaliser l’analyse de spéciation du sélénium.
2.2.1.1 Séparation par la colonne d’échange d’anion s
La Figure 47 représente le chromatogramme obtenu pour l’analyse de l’extrait de blé.
161
CCQM-K60 (Protocole A)
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
0 2 4 6 8t (min)
Inte
nsité
(cps
)
80 76
Figure 47 : Chromatogramme de l'extrait de blé sur la colonne d’échange d'anions
Le chromatogramme montre la présence de SeMet comme espèce majoritairement présente et la
présence d’au moins deux autres espèces aux temps de rétention (tR) de 1.3 et 7.8 min. Le
composé au tR de 1.3 min a déjà été identifié comme un produit de l’oxydation de la
sélénométhionine (paragraphe 1.2.3). Sur la masse 76, une interférence est visible cependant et
contrairement à l’analyse du Kamut, le profil de 76SeMet ne diffère pas de celui de 80SeMet ce qui
ne devrait pas perturber la mesure de cette isotope.
Les résultats des dosages par étalonnage externe et ajouts dosés des trois extraits sont de 30.13
mg(SeMet)·kg-1 (s=0.63) et de 22.6 mg(SeMet)·kg-1 (s=2). La différence entre les deux méthodes
de quantification montre un fort effet de matrice lié à l’échantillon. La valeur déterminée est
également supérieure à celle annoncée par les organisateurs (10 mg(SeMet)·kg-1). L’évaluation de
l’écart normalisé pour détecter des interférences sur le rapport 78Se/76Se montre qu’il n’est pas
interféré (EN=1.33).
2.2.1.2 Séparation par phase inverse avec apparieme nt d’ions
Les surnageants précédemment préparés ont également été analysés par chromatographie de
phase inverse avec le TFA comme agent d’appariement d’ions. La Figure 48 présente le
chromatogramme obtenu.
162
CCQM-K60 (Protocole A)
0
10000
20000
30000
40000
0 1 2 3 4 5 6t (min)
Inte
nsi
té (
cps)
80 76
Figure 48 : Chromatogramme de l'extrait de blé sur la colonne d’appariement d’ions
Avec cette séparation l’espèce majoritaire est SeMet et un second composé est également
détecté. Comme pour l’analyse de l’échantillon de Kamut, les interférents observés sur la masse
76 se retrouvent en début de chromatogramme.
Les dosages de SeMet dans les extraits sont de 17.90 mg(SeMet)·kg-1 (s=0.50) par étalonnage
externe et de 12.68 mg(SeMet)·kg-1 (s=0.80) pour les ajouts dosés. Avec ce mécanisme
également, un effet de matrice induit une différence de résultats entre les deux techniques de
dosage. La valeur déterminée par ajouts dosés est en accord avec l’indication de concentration
fournie par les organiseurs. La différence de résultats entre les deux séparations soulève
l’hypothèse d’une co-élution sur la colonne d’échange d’anions. En conséquence la technique
séparative qui a été utilisée pour mener la DI est la phase inverse avec le TFA comme agent
d’appariement des ions.
L’écart normalisé pour le rapport 78Se/76Se (égal à 0.07) confirme qu’il peut être utilisé en DI.
2.2.2 Mise en place du protocole métrologique
Pour atteindre un rapport de un entre les isotopes 78 et 76, 200 mg d’échantillons ont été mis en
présence de 180 mg de l’étalon marqué 76SeMet à 2 mg(SeMet)·kg-1. Quatre réplicats ont été
réalisés. De même que pour la DI Inverse préparés avec le même ajout de l’étalon marqué et avec
une quantité d’étalon telle que le rapport isotopique soit de un.
L’étude du chromatogramme de l’étalon marqué obtenu sur la colonne de phase inverse et le TFA
comme agent d’appariement d’ions montre la présence d’impuretés (Figure 49). Elle met surtout
en avant la nécessité de caractériser l’étalon marqué pour sa teneur en SeMet par DI Inverse et
qu’il ne faut pas se fier à la fraction de masse obtenue par gravimétrie lors de la dilution de la
poudre de l’étalon marqué. Il est à noter que sur la colonne d’échange d’anions, aucune impureté
n’avait pu être détectée sur cet étalon.
163
m/z=76
0
200000
400000
600000
800000
0 1 2 3 4 5 6
t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
0 1 2 3 4 5 6
t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
b)
a)
Figure 49 : Chromatogramme de 76SeMet sur la colonne d’appariements d’ions - a) chr omatogramme
entier ; b) zoom
2.2.2.1 Rendement d’extraction
La minéralisation des surnageants des échantillons de DI Directe et de DI Inverse a été réalisée
afin de déterminer la fraction de masse totale présente dans les extraits.
Le résultat obtenu est de 20% (s = 2%), soit un rendement assez faible. Pour confirmer ce résultat,
un bilan de matière a été réalisé par le dosage par étalonnage externe des culots de l’extraction
minéralisés. La fraction de masse associée est de 28 mg(Se)·kg-1 (s=6). Cette valeur représente
moins de 0.2% du sélénium contenu initialement dans l’échantillon, soit une extraction quantitative
du sélénium par le protocole A.
Pour expliquer les différentes valeurs de rendement déterminées, il est probable qu’une
interférence sur l’isotope 76 soit responsable de la diminution du contenu dans l’extrait de blé
minéralisé. D’autant plus qu’en analyse de spéciation, il avait été remarqué la présence
d’interférents sur cette masse (Figure 48).
En conséquence, seul le résultat sur l’analyse des culots a été pris en considération et le
rendement de l’extraction est considéré quantitatif.
164
2.2.2.2 Dosage de SeMet
L’analyse des extraits de la farine de blé a été menée avec le mécanisme de phase inverse et
appariement des ions en présence de TFA.
Le résultat de la DI pour SeMet est de 28.16 mg(SeMet)·kg-1 (s de 0.65) avec une mesure du
rapport 78Se/76Se proche de 1.5. Cette fraction de masse est bien supérieure à celles déterminées
précédemment avec cette même séparation. Elle se situe plus dans l’ordre de grandeur des
fractions de masses définies avec la colonne d’échange d’anions. Cette détermination a mis en
avant la possibilité de co-élution avec le mécanisme de phase inverse et l’utilisation du TFA.
En conséquence, les extraits ont été analysés qualitativement avec une phase mobile composée
soit de PFPA, soit de HFBA comme agents d’appariement dans le but de s’assurer qu’aucune co-
élution n’était présente. La Figure 50 montre les chromatogrammes obtenus pour les extraits seuls
et avec un ajout de l’étalon de SeMet.
m/z=78 avec PFPA
0
10000
20000
30000
40000
50000
0 2 4 6 8 10 12 14t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
DI Directe DI Directe plus SeMet SeMet
m/z=78 avec HFBA
0
10000
20000
30000
40000
50000
0 5 10 15 20 25 30
t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
DI Directe DI Directe ajout deSeMet SeMet
Figure 50 : Chromatogrammes des DI directes avec di fférents appariements d’ions
L’analyse des extraits de DI directes avec différents agents d’appariements d’ions au pouvoir de
séparation plus importants que le TFA ne met pas en évidence la présence de composés
supplémentaires. Seuls les temps de rétention sont augmentés et avec l’utilisation du PFPA un
dédoublement de pic pour la SeMet dans l’extrait est observé. Ce dédoublement pourrait
s’expliquer par le pH de la phase mobile : en effet autour d’un pH de 2.2 SeMet se retrouve sous
deux charges différentes (cf. Figure 16) et celles ci peuvent être séparées grâce à l’augmentation
de la chaîne perfluorée des agents d’appariements d’ions.
L’hypothèse de co-élution d’autres composés avec SeMet n’étant pas vérifiée, la première
estimation par ajouts dosés de la fraction de masse en SeMet a donc été remise en question. Une
165
analyse de la farine de blé par DI a donc été répétée avec comme estimation de sa fraction de
masse celle obtenue par la première DI (28.16 mg(SeMet)·kg-1).
Un rapport de 1.2 a été choisi pour cette nouvelle DI, ce qui demande l’addition de 210 mg d’étalon
marqué d’une fraction de masse de 3 mg(SeMet)·kg-1 à 200 mg de prise d’essai.
Les extraits ont été analysés par les deux mécanismes de rétention.
La Figure 51 représente le chromatogramme obtenu sur la colonne d’échange d’anions.
DI directe
0
2500
5000
7500
10000
12500
15000
0 1 2 3 4 5 6
t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
76 78 80
Figure 51 : Chromatogramme de la DI Directe sur la CCQM-K60 sur la colonne d’échange d'anions
L’extrait de la DI directe met en évidence, sur la masse 80, un épaulement du pic de SeMet par
l’élution d’un composé sortant juste avant la sélénométhionine. De plus, le résultat de la DI menée
avec cette séparation est de 41 mg(SeMet)·kg-1 (s=3). Ceci confirme donc la mauvaise séparation
de SeMet pour l’échantillon avec cette colonne chromatographique ; les extraits ont donc été
analysés sur la colonne de phase inverse. Le TFA a été utilisé comme agent d’appariement des
ions du fait qu’aucune co-élution n’a pu être mise en avant sur cette séparation.
L’analyse des DI avec le TFA a donné un résultat final pour la farine de blé de 27.49 ± 0.79
mg(SeMet)·kg-1 (k=2). Ce résultat est en accord avec la première valeur fournie par DI et a donc
été la valeur de SeMet fournie pour la participation à l’intercomparaison. L’incertitude sur le résultat
final représente moins de 3% de sa valeur.
La Figure 52 représente la part des facteurs les plus influents sur le calcul de l’incertitude.
166
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
répétabilité de la méthode pour Csp
répétabilité de la méthode pour Cech
répétabilité pour la mesure du rapport inverse
répétabilité pour la mesure du rapport direct
masse (tube + solution mère étalon)
masse (tube + solvant de dilution)
masse (tube + spike), DI Inverse
pureté de l'étalon
effet sur l'incertitude finale (%)
CCQM-K60
Figure 52 : Contribution des principaux paramètres sur la détermination de SeMet de CCQM-K60
Les paramètres déjà mis en avant comme les plus influents sur le calcul de l’incertitude pour les
échantillons de levures (répétabilité des mesures et répétabilité des méthodes) sont aussi ceux
avec les plus fortes contributions sur l’incertitude finale.
Il est à noter que la farine étudiée affiche une teneur relative en SeMet de 65% (comme pour les
levures analysées) ce qui est en contradiction avec la littérature. Wolf et Goldschmidt (2007) ont
montré dans la farine de blé une possible corrélation entre les fractions de masse total en
sélénium et en SeMet : sur plusieurs farines le pourcentage de SeMet avoisinait les 53% pour des
fraction de masses en Se total allant de 0.076 à 44 µg(Se)·kg-1.
2.2.2.3 Résultats de l’intercomparaison
Les résultats de l’intercomparaison sur le sélénium total (Figure 53) montrent l’accord du résultat
fourni par le LNE (participant n°12) avec le reste des laboratoires. Sur la figure, les résultats
marqués en vert proviennent des différents Instituts Nationaux de Métrologie et ceux marqués en
noir de laboratoires invités reconnus pour leur expertise dans le domaine de l’analyse de
spéciation de Se.
167
9
11
13
15
17
19
21
23
25
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22Ten
eur
en s
élén
ium
tota
l / m
g(S
e).k
g-1
Participants
9
11
13
15
17
19
21
23
25
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22Ten
eur
en s
élén
ium
tota
l / m
g(S
e).k
g-1
Participants
Figure 53 : Résultats de l’intercomparaison CCQM-K6 0 sur la mesure du sélénium total
Les résultats sur la mesure de SeMet sont regroupés dans la Figure 54.
15
20
25
30
35
40
45
18 2 16 6 10 12 17 19 13 14 15 3 1 22
Ten
eur
en s
élén
omét
hion
ine
/ mg(
Se
Met
).kg
-1
Participants
15
20
25
30
35
40
45
18 2 16 6 10 12 17 19 13 14 15 3 1 22
Ten
eur
en s
élén
omét
hion
ine
/ mg(
Se
Met
).kg
-1
Participants
Figure 54 : Résultats de l’intercomparaison CCQM-K6 0 sur la mesure de la sélénométhionine
Le résultat obtenu dans le cadre de ce travail par le LNE en partenariat avec le LCABIE (n°12) est
en accord avec les valeurs consensuelles issues des différents participants : 28.30 mg(SeMet)·kg-1
pour la moyenne, 28.28 pour la médiane et un écart-type de 1.03 sur les 14 résultats. Pour la
majorité des participants, la méthode d’extraction utilisée a reposé sur l’extraction enzymatique.
Seuls deux laboratoires (n°6 et 13) ont utilisé une méthode différente : l’hydrolyse acide en
présence d’acide méthane-sulfonique. Ces deux équipes (n°6 et 13) ont obtenu des résultats en
accord avec les valeurs consensuelles (moyenne et médiane). La limitation de ce genre d’exercice
provient du manque de diversité des méthodes utilisées pour mener l’extraction.
168
Il est à noter aussi les performances du dosage par dilution isotopique menée avec le couplage
d’une technique séparative à l’ICP-MS : l’ensemble des résultats (n° 6, 10, 12, 17, 13, et 14) sont
compris dans les bornes issues de l’analyse statistique des données.
L’accord de la valeur déterminée dans ce travail avec les valeurs consensuelles permet de valider
le protocole métrologique pour cette nouvelle matrice mais aussi d’augmenter les capacités de la
méthode développée sur des fractions de masse 20 fois inférieures à celles déjà analysées.
Suite à la réussite de la participation à cette intercomparaison, une reconnaissance des capacités
de mesure de SeMet pour cette gamme de fraction de masse dans ce type d’échantillons par le
LNE va pouvoir être déposée auprès du BIPM.
169
3 Conclusions sur l’analyse du sélénium
L’objectif principal de l’étude du sélénium était de disposer d’un protocole métrologique pour
déterminer sa spéciation dans des compléments alimentaires. Cette analyse a été focalisée sur la
détermination de l’espèce majoritaire contenue dans de tels échantillons : la sélénométhionine. La
mise en place du protocole métrologique demandait de réaliser plusieurs développements d’ordre
analytiques ou métrologiques sur les différentes étapes d’une telle analyse.
Les défis analytiques reposaient premièrement sur la nécessité de développer un protocole
d’extraction efficace de SeMet, puis de séparer cette espèce et de détecter au moins deux
isotopes libres de toutes interférences pour permettre l’utilisation de la dilution isotopique. La mise
en solution du sélénium a été réalisée par deux protocoles faisant appel à des extractions
séquentielles, principalement basées sur l’utilisation d’enzymes protéolytiques. Ces deux
protocoles se sont révélés être quantitatifs pour solubiliser SeMet et sur certains échantillons ils
ont également permis d’atteindre la totalité du sélénium. La limite de leur utilisation repose sur la
durée de l’extraction. Le traitement nécessite trois jours de manipulation pour mettre en œuvre les
différentes étapes de l’hydrolyse enzymatique ou l’action des différents réactifs. Au final, en
comptabilisant le temps passé à analyser les échantillons, une semaine entière est requise pour
réaliser l’analyse d’un échantillon. Une diminution des temps d’extraction, par l’utilisation des
micro-ondes ou du stick à ultrasons, est donc à envisager pour faciliter l’application de la méthode
mise au point au cours de ces travaux.
La séparation des espèces de Se a été réalisée par deux mécanismes chromatographiques
différents dans le but d’augmenter la robustesse de la détermination de SeMet. En effet, la co-
élution de composés dans le cadre de Se étant possible, l’utilisation de deux types de séparation
permet de limiter le risque d’erreur sur la mesure de SeMet. Ainsi, sur chaque colonne
chromatographique, SeMet a pu être analysée en moins de six minutes et de par leur
complémentarité les erreurs peuvent être limitées. Cependant, hormis pour SeMet, il a été difficile
d’observer d’autres espèces via ces séparations.
La détection a été réalisée par ICP-MS pour permettre la mise en oeuvre de la dilution isotopique.
L’intérêt d’une telle technique repose également sur sa sensibilité ce qui permet d’analyser des
échantillons de faible concentration. Par contre, son utilisation engendre de multiples biais qu’il est
nécessaire de corriger au niveau des intensités délivrées. De plus, ce détecteur est sensible à la
matrice introduite. Il a donc limité le choix de la composition des phases mobiles avec pour effet de
diminuer les capacités de séparation des systèmes chromatographiques.
L’approche métrologique a été abordée par la mise en place de la double dilution isotopique
permettant la caractérisation de l’étalon marqué et de l’échantillon. La méthode a pu être validée
par l’analyse de plusieurs échantillons de référence dont un disposant de références certifiées.
Trois matrices différentes ont pu être analysées : une levure lyophilisée, un complément
170
pharmaceutique composé d’une levure enrobée d’excipients et une farine de blé, démontrant la
robustesse du protocole développé. Ainsi la méthode a été validée sur trois gammes de fractions
de masse différentes en SeMet (de 10 à 2000 mg(Se)·kg-1). Le budget d’incertitude associé au
résultat peut également être vu en soi comme faisant partie intégrante de la validation de méthode
grâce à la démarche de mise en avant des facteurs influents sur le résultat final. Les incertitudes
associées ont d’ailleurs permis de caractériser les échantillons avec une fidélité relative comprise
entre 3 et 10% de la fraction de masse. Cette fidélité de mesure est fonction du contenu de
l’échantillon.
Sous les conditions utilisées, la dilution isotopique appliquée au sélénium (total et SeMet) est
reconnue comme une méthode primaire de mesure ce qui permet de prétendre à la traçabilité des
analyses. Le calcul complet de l’incertitude finale prend également part à la démonstration de la
traçabilité par la prise en compte et la caractérisation de l’influence de chaque paramètre sur le
résultat final. Des réserves peuvent cependant être émises sur la traçabilité de l’analyse de
spéciation du fait que la référence utilisée pour caractériser l’étalon marqué repose sur l’utilisation
d’un étalon commercial de SeMet dont les caractéristiques ne sont par certifiées. Même s’il a été
vérifié que cette caractérisation n’était pas dépendante de la provenance de l’étalon commercial, il
est nécessaire de disposer d’un étalon clairement certifié sur sa pureté et son isotopie pour
prétendre à une parfaite traçabilité.
Au final, il est donc retenu que la méthode est au point pour assurer la traçabilité d’une mesure
d’un échantillon sur sa fraction de masse en SeMet. Cependant, il a été vu que cette fraction de
masse ne représente que 65% du sélénium total pour les différents types d’échantillons, ce qui
signifie que 35% du sélénium n’est pas encore caractérisé. Des progrès doivent donc encore être
réalisés sur les autres espèces présentes dans ce type d’échantillons pour permettre de
pleinement évaluer l’impact d’un complément alimentaire sur la santé.
171
Chapitre V : Applications aux analyses de
spéciation du mercure
174
175
Un protocole métrologique pour l’analyse de spéciation du mercure, et en particulier du
méthylmercure, dans les produits de la pêche a été développé. Les applications ont été réalisées
sur deux types de matériaux de références certifiés : lyophilisés ou frais. Depuis peu de temps,
l’Institut National de Métrologie Américain (NIST : National Institut of Standards and Technology)
propose des CRMs frais conservés à - 80 °C. Ce nouv eau type de matériaux permet de mieux
représenter les échantillons traités par les laboratoires d’analyses (Davis 2007). Il est donc
essentiel de s’assurer que les protocoles mis en place permettent la caractérisation de tels
matériaux.
Les conditions chromatographiques utilisées pour l’analyse de spéciation du mercure ont été celles
précédemment établies (chapitre III paragraphe 3.2) : une phase mobile composée de L-Cys à 0.5
g·L-1 et L-Cys, HCl, H2O à 0.5 g·L-1 et un volume d’injection de 50 µL.
1 Analyses des Matériaux de Références Certifiés
lyophilisés
Plusieurs CRMs ont été utilisés pour valider le protocole métrologique sur la détermination du
méthylmercure, le Tableau 33 regroupe leurs caractéristiques.
Tableau 33 : Caractéristiques des CRMs lyophilisés
Méthylmercure
CRM Matrice Mercure total
(mg(Hg)·kg-1) (mg(Hg)·kg-1) % par rapport
au Hgtotal
BCR-464 Muscle de thon 5.24 ± 0.10 5.12 ± 0.16 97
BCR-463 Muscle de thon 2.85 ± 0.16 2.83 ± 0.15 99
Dolt-4 Foie de chien-de-mer 2.58 ± 0.22 1.33 ± 0.12 52
L’analyse de ces matériaux a permis l’étude de différentes matrices pour différentes gammes de
concentrations en présence de plusieurs proportions des espèces : les muscles de thons
contiennent une teneur en MeHg+ représentant plus de 95% du mercure total tandis que pour le
foie de chien-de-mer, MeHg+ n’est présent qu’à hauteur de 50%. Le mercure restant est attribué
au mercure inorganique.
La mise en place du protocole métrologique a demandé d’étudier au préalable i) la mise en
solution de Hg et ii) la séparation d’espèces issues d’une matrice réelle. Suite à ces
développements, le protocole analytique a pu être appliqué au dosage du mercure total et du
méthylmercure avec quantification par la dilution isotopique.
176
1.1 Traitement de l’échantillon
Le CRM BCR-463, de concentration intermédiaire en MeHg+, a été utilisé pour mener l’étude de
l’extraction du mercure depuis des produits de la mer.
Les mises en solution testées reposent sur le protocole développé par Hight et al. (2006) avec
l’emploi d’un réactif soufré. Ils préconisent l’utilisation de 50 mL d’un solvant composé de L-Cys,
HCl, H2O à 10 g·L-1 pour extraire 200 mg d’échantillon, le mélange est ensuite placé au bain-marie
pendant 120 min à 60 °C avec une agitation manuelle aux temps : 0, 60 et 120 min. Toutefois,
l’application directe de ce solvant d’extraction n’a pu être envisagée dans notre étude : une aussi
forte concentration en cystéine contamine l’échantillon en mercure inorganique comme le confirme
la Figure 55 obtenue suite à l’analyse chromatographique du mélange d’extraction en phase
inverse.
m/z=202
0
250
500
750
1000
0 1 2 3 4t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
Hg2+
Figure 55 : Chromatogramme d'une solution à 10 g·L -1 de L-Cys, HCl, H 2O sur la colonne de phase
inverse
La quantification par étalonnage externe de cette contamination a révélé une fraction de masse de
l’ordre de 10 µg·kg-1 (s=1) de mercure inorganique au sein du réactif L-Cys, HCl, H2O. Cette
fraction de masse représente une contamination de l’ordre de 5 ng de mercure inorganique
apportée par le solvant d’extraction.
Afin de limiter la contamination des échantillons, des essais ont donc été menés en utilisant la
phase mobile, dix fois moins concentrée en cystéine et contenant 0.5 g·L-1 de L-Cys, HCl, H2O et
0.5 g·L-1 de L-Cys, comme solvant d’extraction. L’avantage a également été de disposer de
surnageants directement compatibles avec la séparation chromatographique.
177
En plus du protocole proposé par Hight et al. (2006), plusieurs modes d’assistance ont été testés
pour accélérer le temps de préparation des échantillons. Les essais ont porté sur l’extraction d’une
prise d’essai de 200 mg en présence de 40 mL de phase mobile avec suivant les cas :
- 120 min d’incubation au bain-marie à 60 °C avec a gitation magnétique,
- 15 min de bain à ultrasons (US) et agitation manuelle toutes les 15 min,
- 30 min de bain à US et agitation manuelle toutes les 15 min,
- 45 min de bain à US et agitation manuelle toutes les 15 min,
- 60 min de bain à US et agitation manuelle toutes les 15 min.
L’activation de l’extraction par un champ micro-ondes (MW) a également été testée. En raison de
la capacité des godets, les quantités de matières ont dû être réduites : 150 mg d’échantillon ont
été mis en présence de 20 mL de phase mobile. La puissance délivrée par le four micro-ondes
était de 70 W pendant 6 min, ces paramètres sont basés sur les travaux de Tseng et al. (1997)
qui activaient ainsi l’extraction par l’hydroxyde de tétraméthylammonium et obtenaient des
rendements d’extraction quantitatifs.
Pour juger de l’efficacité des protocoles d’extraction, la concentration en méthylmercure a été
déterminée, plutôt que la teneur totale en mercure, afin de s’assurer du respect de la spéciation
tout au long du protocole. A l’issue des mises en solution, les surnageants ont été dosés par
étalonnage externe. Cette valeur a été ramenée à la concentration initiale contenue dans la prise
d’essai et corrigée du taux d’humidité de l’échantillon (procédure détaillée dans le Chapitre IV,
paragraphe 1.2.4.1). Pour évaluer le rendement d’extraction du protocole, cette concentration a
été rapportée à la valeur de référence en MeHg+ fournie par le certificat.
La Figure 56 présente les résultats obtenus par les différents protocoles accompagnés de leur
écart-type (n=3).
178
0
20
40
60
80
100
2 hd'incubation à
80 °C
15 min US 30 min US 45 min US 60 min US 6 min à 70 WMW
% [MeHg+]extrait
Figure 56 : Efficacité d'extraction des protocoles testés
La modification du solvant d’extraction lors de l’utilisation du bain-marie (diminution de la teneur en
agent soufré) ne semble pas avoir d’effet sur l’extraction : ce protocole reste efficace pour atteindre
une mise en solution quantitative de MeHg+.
L’observation des résultats obtenus à partir de l’utilisation des ultrasons (US) montre que ce mode
opératoire ne permet pas une amélioration de la mise en solution, le rendement d’extraction
augmente avec le temps d’action mais pour n’atteindre qu’un maximum de 45% au bout d’une
heure de traitement. Cette technique n’étant pas concluante pour accélérer efficacement
l’extraction de l’échantillon, elle a été abandonnée pour la suite des tests.
L’action du champ micro-onde par contre est intéressante car avec seulement 6 min d’action à une
puissance de 70 W, un rendement de 70% est obtenu. Il a donc été choisi d’optimiser son action
avec des essais portant sur différents temps d’exposition (6 min et 11 min) et pour différentes
puissances d’ondes (70, 100, 140 et 210 W).
La Figure 57 présente les résultats obtenus accompagnés de leur écart-type (n=3).
179
0
20
40
60
80
100
70 W 100W 140 W 210 W
% [MeHg+] extrait
6 min 11min
Figure 57 : Efficacité d'extraction des protocoles utilisant les micro-ondes
De par la variabilité de certains résultats, il est délicat de comparer les efficacités d’extraction entre
les différents protocoles. Toutefois, le mode opératoire utilisant 140 W pendant 11 min mène à une
extraction quantitative du méthylmercure. Il a donc été sélectionné pour diminuer le temps de
traitement de l’échantillon. Ce protocole a été appliqué à 150 mg d’échantillon en présence de 20
mL de phase mobile. Il a été testé et comparé à l’incubation au bain-marie pendant 120 min (200
mg extrait par 40 mL de phase mobile) du CRM BCR-463.
L’application des deux protocoles sélectionnés à l’échantillon de BCR-463 permet de mettre en
solution du mercure inorganique et du méthylmercure, efficacement séparés par la colonne de
phase inverse (Figure 58).
180
m/z=202
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 1 2 3 4t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
Incubation MW
Hg2+
MeHg+
Figure 58 : Chromatogramme des espèces de mercure e xtraites depuis le BCR-463 par les deux
protocoles sélectionnés (Incubation au bain-marie o u micro-ondes : MW)
1.2 Mise en place des protocoles métrologiques
Les protocoles d’extraction de Hg étant sélectionnés, leur application sur des CRMs dans les
conditions d’une méthode primaire de mesure a permis de vérifier de leur validité. Les trois CRMs
lyophilisés ont été utilisés pour mener cette validation. La démarche a reposé sur i) la
détermination du taux d’humidité, ii) le dosage du mercure total et iii) la mesure de la fraction de
masse en méthylmercure.
Dans un premier temps, la dilution isotopique sur MeHg+ a été réalisée avec l’ajout d’un seul
étalon marqué (en Me200Hg+). Dans les échantillons pour lesquels les concentrations en mercure
inorganique sont faibles (BCR-463 et BCR-464), cette méthode a été satisfaisante au vu des
incertitudes de mesures : même si une forte méthylation de Hg2+ intervient l’augmentation du
signal de MeHg+ est comprise dans les valeurs du certificats (98% de Hg est sous forme de
MeHg+). Par contre pour les échantillons où les teneurs entre les deux espèces sont proches (le
Dolt-4 affiche 52% de Hg sous forme de MeHg+), l’évaluation des transformations des espèces,
par la DI avec deux étalons marqués (MeHg+ et Hg2+), est un plus pour améliorer la justesse de la
mesure du méthylmercure.
1.2.1 Détermination du taux d’humidité
La démarche utilisée pour la détermination des taux d’humidité repose sur celle employée pour les
échantillons de sélénium (procédure détaillée dans le Chapitre IV, paragraphe 1.2.4.1).
Le Tableau 34 présente les résultats obtenus sur trois réplicats.
181
Tableau 34 : Détermination des taux d'humidité des CRMs
CRM Moyenne (%) Ecart-type (s)
BCR-464 6.2 0.1
BCR-463 6.6 0.2
Dolt-4 6.9 0.3
1.2.2 Analyse en total
Les études préliminaires de la concentration en mercure dans les CRMs ont permis la sélection
d’un rapport isotopique (199Hg/202Hg) libre de toutes interférences (EN < 2) pour mener la DI.
L’étalon de Hg2+ marqué en isotope 202Hg (IRMM-640) a été utilisé pour caractériser les CRMs.
Après sa dilution à une fraction de masse de 0.09 mg·kg-1, des masses de 1 g (pour le BCR-463 et
le Dolt-4) ou de 2 g (pour le BCR-464) ont été introduites dans les prises d’essais des échantillons
afin de modifier le rapport isotopique naturelle (égal à 0.56) jusqu’à une valeur proche de 0.4. Les
mélanges ont par la suite été minéralisés sous champ micro-onde (procédure détaillée dans le
Chapitre III, paragraphe 1.1).
Les DI Inverses ont été préparées avec une quantité de 2 g de la même dilution de l’étalon
marqué. La caractérisation de l’étalon marqué a été effectuée à partir de 2 solutions
indépendantes obtenues par la dissolution de mercure métallique. Au total, trois réplicats de DI
directes et inverses ont été préparées pour la caractérisation des échantillons et de l’étalon
marqué.
L’étalon IRMM-639, d’abondances certifiées et proches des naturelles, a été analysé en continu le
temps des acquisitions pour la correction du biais de masse.
Les mesures des rapports isotopiques ont été réalisée avec la cellule de collision/réaction de l’ICP-
MS pressurisée par de l’hélium (à 4.5 mL·min-1) dans le but d’augmenter la sensibilité du
spectromètre de masse.
Les résultats obtenus accompagnés de leur incertitude sont présentés dans le Tableau 35.
Tableau 35 : Résultats en DI sur le mercure total, l'incertitude est fournie avec un coefficient
d'élargissement égal à deux
CRM [Hg] mg·kg-1 Certificat mg·kg-1
BCR-464 5.20 ± 0.22 5.24 ± 0.10
BCR-463 2.807 ± 0.097 2.85 ± 0.16
Dolt-4 2.76 ± 0.17 2.58 ± 0.22
182
Selon le calcul de l’écart normalisé, aucune différence significative n’a été observée entre les
valeurs déterminées et les certificats des CRMs. Le protocole métrologique mis en place a donc
été validé pour l’analyse du mercure total dans ces deux types de matrices (muscles et foie de
poissons), pour les deux gammes de concentration et avec différentes répartitions des espèces
dans les échantillons.
Les incertitudes relatives sont du même ordre de grandeur pour l’ensemble des CRMs (entre 4 et
6%). Comme dans le cas du sélénium, la part de chaque facteur contribuant à l’incertitude finale a
été calculée (Figure 59).
0 10 20 30 40 50 60
masse (barquette + Hg)
masse (barquette vide)
répétabilité de la méthode pour Cech
répétabilité de la méthode pour Csp
répétabilité pour la mesure du rapport inverse
répétabilité pour la mesure du rapport direct
abondance naturelle de l'isotope 199
effet sur l'incertitude finale (%)
BCR-464 BCR-463 Dolt-4
Figure 59 : Contribution des principaux paramètres sur le dosage du mercure total
Les facteurs les plus influents sur l’incertitude finale sont ceux déjà désignés lors de l’analyse du
sélénium : répétabilités associées aux mesures des rapports isotopiques et aux méthodes.
Lors du calcul des incertitudes pour le sélénium total, il avait été remarqué que le protocole utilisé
pour la pesée de la prise d’essai d’échantillon apportait une forte contribution à l’incertitude finale.
En conséquence, le protocole a été modifié pour limiter son impact en utilisant des barquettes de
faibles masses (de l’ordre de 5 g) plutôt que directement les godets de minéralisation (de masses
de 170 g). Ainsi, l’incidence de la masse associée à l’échantillon n’est plus visible comme un
paramètre important de l’incertitude et son impact est limité. Ceci met en évidence un intérêt du
calcul de l’incertitude par la méthode du GUM (ISO/IEC 1995) : la possibilité de diminuer la valeur
de l’incertitude de mesure en agissant sur les paramètres influents.
Les autres paramètres mis en évidence dans la Figure 59 sont les masses associées à la prise
d’essai du mercure métallique utilisé pour la caractérisation de l’étalon marqué (masses sur
lesquelles repose la quantification). Le dernier paramètre remarqué, seulement dans le cas du
BCR-464, est l’abondance isotopique naturelle de 199Hg. Dans le cadre de l’analyse de Se, il avait
été suggéré que pour certains paramètres, leur participation était fonction de la concentration de
183
l’échantillon comme les abondances isotopiques, ce qui peut expliquer une participation
prépondérante de l’isotopie de 199Hg pour l’échantillon de plus forte concentration : le BCR-464.
1.2.3 Analyse de spéciation
1.2.3.1 Préparation de la dilution isotopique
La première étape de la DI en spéciation a été la caractérisation de l’étalon marqué en
méthylmercure (Me200HgCl). Cet étalon est synthétisé par le fabricant (AIT Technologies) à partir
d’un étalon marqué de mercure inorganique (200HgO) en provenance du NIST et certifié pour son
isotopie. Au cours de la synthèse de MeHg+, des modifications sur son isotopie peuvent survenir. Il
est donc nécessaire de déterminer les abondances isotopiques. Le fabricant indique une isotopie
mesurée par ICP-MS, toutefois aucune traçabilité n’est associée aux mesures. Il a donc été décidé
de déterminer cette isotopie par le couplage HPLC-ICP-MS. L’étalon IRMM-639, certifié pour son
isotopie et se présentant sous la forme de mercure inorganique, a été utilisé pour la correction du
biais en masse. Le Tableau 36 présente les résultats obtenus pour la détermination de l’isotopie
de l’étalon comerciale de MeHg+.
Tableau 36 : Isotopie fournie et mesurée de l'étalo n marqué de méthylmercure (Me 200HgCl)
Isotopes Abondances fournies (%) Abondances déterminées (%)
196 0.0018 ± 0.0006 0.0035 ± 0.0090
198 0.1828 ± 0.0187 0.123 ± 0.027
199 1.1131 ± 0.0354 1.052 ± 0.086
200 96.0332 ± 0.1637 96.41 ± 0.22
201 1.5101 ± 0.0282 1.431 ± 0.057
202 1.0330 ± 0.0666 0.87 ± 0.11
204 0.1261 ± 0.0181 0.107 ± 0.047
Comme attendu, l’isotope 200 est majoritaire. Des différences significatives sont observables entre
les valeurs indiquées et déterminées. Elles peuvent être expliquées par les méthodes employées :
HPLC-ICP-MS qui ne prend en compte que l’isotopie de MeHg+, contre des mesures effectuées
directement par ICP-MS où la possiblité de contamination est plus importante. Les valeurs que
nous avons déterminées ont été utilisées dans la suite des travaux en raison de leur traçabilité
jusqu’à l’étalon de l’IRMM-639.
Des études préliminaires menées sur les CRMs pour les deux protocoles d’extraction ont montré
que le rapport 202Hg/200Hg ne souffrait d’aucune interférence (EN < 2). L’ajout d’étalon marqué a été
réalisé pour atteindre un rapport isotopique de 0.8 (à l’état naturel : 1.3).
184
La préparation des DI Directes s’est déroulée selon les étapes suivantes :
- prise d’essai de l’échantillon (150 mg pour le four micro-ondes MW et 200 mg pour l’incubation
au bain-marie),
- ajout de 10 mL de solvant d’extraction (composition similaire à la phase mobile),
- agitation manuelle pendant 10 s pour homogénéiser l’humidification de l’échantillon,
- ajout de l’étalon marqué (entre 0.4 et 1.3 g de solution, en fonction de la prise d’essai et de la
concentration de l’échantillon),
- agitation manuelle pendant 10 s,
- ajout de la quantité nécessaire de la solution d’extraction (10 mL pour MW et 20 mL pour
l’incubation).
Ce mode opératoire a été retenu afin d’assurer la meilleure homogénéisation possible entre
l’échantillon, l’étalon marqué et le solvant d’extraction. Il est à noter qu’un biais peut survenir avec
le début de l’extraction de l’échantillon avant l’ajout de l’étalon marqué. En raison du rendement
d’extraction total théorique des protocoles utilisés, l’influence de ce biais est limitée s’il est
considéré que durant l’intervalle de temps entre l’ajout de la solution d’extraction et l’ajout de
l’étalon marqué la spéciation de l’échantillon n’évolue pas.
Les DI inverses ont été préparées dans des conditions similaires aux DI directes (même quantité
d’étalon marqué et même rapport isotopique visé) à partir de deux solutions indépendantes de
chlorure de méthylmercure. L’isotopie de l’étalon naturel de MeHgCl a été vérifiée pour s’assurer
d’abondances naturelles en utilisant l’étalon IRMM-639 pour corriger le biais de masse.
Quatre réplicats ont été préparés pour chaque DI.
1.2.3.2 Dosage du méthylmercure
Les figures suivantes présentent les chromatogrammes obtenus en phase inverse pour les
différents extraits préparés en DI (Figure 60, Figure 61 et Figure 62).
185
BCR-463 MW
0
5000
10000
15000
20000
25000
0 1 2 3 4t (min)
Inte
nsité
(cp
s)200 202
0
500
1000
1500
2000
0 1 2
BCR 463 Incubation
0
5000
10000
15000
20000
0 1 2 3 4t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
200 202
0
500
1000
1500
2000
0 1 2
Figure 60 : Chromatogrammes des extraits de BCR-463 sur la colonne de phase inverse
BCR-464 MW
0
10000
20000
30000
40000
50000
0 1 2 3 4
t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
200 202
0
1000
2000
3000
4000
0 1 2
BCR 464 Incubation
0
10000
20000
30000
40000
50000
0 1 2 3 4t (min)
Inte
nsité
(cps
)200 202
0
1000
2000
3000
4000
0 1 2
Figure 61 : Chromatogrammes des extraits de BCR-464 sur la colonne de phase inverse
Dolt-4 MW
0
2500
5000
7500
10000
12500
15000
0 1 2 3 4
t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
200 202 Dolt-4 Incubation
0
2500
5000
7500
10000
12500
15000
0 1 2 3 4t (m in)
Inte
nsité
(cp
s)
200 202
Figure 62 : Chromatogrammes des extraits de Dolt-4 sur la colonne de phase inverse
Pour les trois CRMs avec les deux protocoles d’extractions utilisés, seules deux espèces ont été
détectées et identifiées : le mercure inorganique et le méthylmercure. Ceci est en accord avec les
186
données issues de la littérature. Les deux matrices étudiées révèlent aussi des répartitions
différentes pour ces espèces : les muscles semblent accumuler préférentiellement MeHg+ tandis
que le foie possède des teneurs équivalentes entre les deux espèces.
Les résultats de la quantification par DI pour les différents CRMs et en fonction du protocole
d’extraction appliqué sont présentés dans le Tableau 37.
Tableau 37 : Résultats sur la détermination du méth ylmercure par DI associés à leur incertitude (k=2)
Analyse de spéciation (mg(Hg)·kg-1) CRM
Incubation Micro-ondes
Certificat
(mg(Hg)·kg-1)
BCR-463 3.07 ± 0.19 2.87 ± 0.19 2.83 ± 0.15
BCR-464 5.21 ± 0.27 5.12 ± 0.29 5.12 ± 0.16
Dolt-4 1.390 ± 0.067 1.434 ± 0.078 1.33 ± 0.12
Tous les résultats obtenus sont compatibles avec les valeurs certifiées (EN<2). Les deux
protocoles peuvent donc être considéré comme validés pour la détermination du méthylmercure
dans les produits de la mer pour ces gammes de concentrations.
Cependant, même si statistiquement les valeurs obtenues ne sont pas différentes des valeurs
certifiées, des biais de mesure peuvent être suspectés. En particulier, l’application de l’incubation
sur le BCR-463 montre une surestimation de la fraction de masse en méthylmercure. De par la
faible concentration de Hg2+ supposée dans cet échantillon, sa méthylation ne peut être
responsable d’une telle augmentation de la concentration en méthylmercure (Hg total est certifié à
2.85 ± 0.16 mg(Hg)·kg-1). Des explications peuvent être avancées à partir i) d’une éventuelle
contamination du surnageant, ii) d’un mauvais équilibre entre étalon marqué et analyte, iii) d’une
adsorption de l’étalon marqué ou iv) de taux de conversion (en Hg2+) différents pour l’étalon
marqué et l’analyte durant le protocole d’extraction. Une étude complémentaire a donc été menée
pour élucider la cause de cette surestimation (voir le paragraphe 1.2.3.3).
L’observation de la mesure effectuée sur le Dolt-4 par micro-ondes souligne également une
possible surestimation de la valeur contenue. Une source de cette surévaluation peut être trouvée
dans la méthylation de Hg2+ présent dans cet échantillon. Contrairement aux muscles de thons
(BCR) où Hg2+ est présent à une faible teneur, une faible méthylation dans le Dolt-4 peut perturber
la mesure de la quantité de méthylmercure. Pour s’assurer de la justesse de l’analyse, la dilution
isotopique sur le Dolt-4 a été réalisée en présence de deux étalons marqués (Hg2+ et MeHg+).
La détermination des incertitudes de mesures a été menée suivant les indications précédemment
exposées (Chapitre III paragraphe 5). Des incertitudes relatives comprises entre 5 et 7% ont été
187
déterminées ce qui associe une fidélité convenable aux méthodes développées. L’étude des
facteurs prépondérants a mis en avant les mêmes paramètres : répétabilité des mesures des
rapports isotopiques et des méthodes (Figure 63).
0 10 20 30 40 50 60
répétabilité de la méthodepour Cech
répétabilité de la méthodepour Csp
répétabilité pour la mesuredu rapport inverse
répétabilité pour la mesuredu rapport direct
effet sur l'incertitude finale pour l'incubation (% )
BCR-464 BCR-463 Dolt-4
0 10 20 30 40 50 60 70
répétabilité de la méthodepour Cech
répétabilité de la méthodepour Csp
répétabilité pour la mesuredu rapport inverse
répétabilité pour la mesuredu rapport direct
effet sur l'incertitude finale pour les micro-ondes (%)
BCR-464 BCR-463 Dolt-4
Figure 63 : Contribution des principaux paramètres sur MeHg + pour chaque protocole d’extraction
Le dosage du méthylmercure a démontré que des biais peuvent être soulevés malgré une
validation et une traçabilité assurées des protocoles analytiques. Ceci démontre des limites de la
validation de méthodes par la simple analyse de CRMs. Pour son perfectionnement, il est essentiel
d’améliorer la justesse et surtout la fidélité des mesures effectuées et des valeurs certifiées car
des incertitudes trop importantes ne permettent pas de différencier des valeurs de résultats.
1.2.3.3 Etude de l’extraction de MeHg + par application de l’incubation sur le
BCR-463
Sur la base des résultats obtenus sur le BCR-463 extrait par incubation pendant 120 min, les
sources identifiées comme pouvant conduire à une surestimation de la concentration en
méthylmercure ont plus particulièrement été étudiées.
L’équilibre entre l’étalon marqué et l’échantillon a été étudié par une étape consistant à leur mise
en contact pendant 24h (sous agitation magnétique) en préambule de l’extraction (expérience 1).
188
Ce type d’ « équilibrage » est souvent réalisé lors du dopage de matériaux pour évaluer les
rendements d’extraction ou pour la mise en œuvre de la DI.
Pour éliminer la possibilité d’une éventuelle contamination durant la procédure, le protocole a été
répété dans les mêmes conditions que précédemment décrit au paragraphe 1.2.3.1 (expérience
2).
Les autres sources potentielles de biais identifiées sont soit l’adsorption de l’étalon marqué, soit sa
conversion spécifique en une autre espèce, conduisant à un comportement différent de celui de
l’analyte. L’adsorption sur le matériel employé (tube, barreau aimanté…) semble peu plausible au
regard des bons résultats obtenus sur les autres CRMs. Cependant cette possibilité a été étudiée
en même temps que l’éventualité d’une adsorption sur les particules du matériau. Ainsi, l’ajout de
l’étalon marqué a été réalisé après les deux heures d’incubation permettant d’extraire les espèces
du mercure (expérience 3). Cette expérience a permis de s’affranchir d’une éventuelle évolution de
l’étalon marqué durant l’incubation. Une dernière expérience a été envisagée afin d’éviter
l’adsorption de l’étalon marqué et son évolution spécifique, par son ajout réalisé en fin de
préparation des échantillons : après la filtration des surnageants et avant leur stockage pour
l’analyse (expérience 4).
Ces expérimentations ont été réalisées en simultanée avec quatre réplicats pour chacune d’entre
elles. La Figure 64 résume la démarche expérimentale utilisée.
Figure 64 : Démarche expérimentale pour l’identific ation du biais de mesure
189
La répétition de la DI dans les mêmes conditions (expérience 2) a conduit à une valeur de 3.07
mg(Hg)·kg-1 pour MeHg+, avec un écart-type (s) de 0.04. Une contamination durant le protocole
d’application de la DI est donc à exclure.
Avec un temps d’équilibre de 24h entre l’échantillon et l’étalon marqué en amont de l’extraction
(expérience 1), un résultat similaire a été obtenu : 3.04 mg(Hg)·kg-1, s = 0.04. L’équilibre n’est donc
pas atteint par cette étape préliminaire.
Les expériences 3 et 4 ont mené aux mêmes résultats de 2.83 mg(Hg)·kg-1, avec des écarts-types
de 0.12 pour l’ajout de l’étalon marqué juste après l’extraction (expérience 3) et de 0.04 pour l’ajout
après la filtration (expérience 4). L’obtention de cette justesse de résultats confirme i) qu’aucune
adsorption de méthylmercure n’est observable et ii) que la différence de comportement de l’étalon
marqué n’intervient pas durant son équilibre avec l’analyte lorsqu’ils sont tous deux en solutions (c.
à d. au terme de l’extraction), mais plutôt au cours de l’extraction. La surestimation des
concentrations de MeHg+ durant son analyse en DI a donc été identifiée comme le résultat d’une
conversion du méthylmercure issu de l’étalon marqué en mercure inorganique pendant les deux
heures d’extraction et survenant avant son équilibre en solution avec MeHg+ originel de
l’échantillon.
L’hypothèse abordée au cours de ce travail de thèse pour s’affranchir de l’équilibre entre l’étalon
marqué (en phase liquide) et l’analyte (en phase solide) avant l’étape d’extraction était de procéder
à une extraction quantitative. L’application de ce concept a montré les limites d’une telle démarche
dans le cas où il est possible que l’étalon marqué évolue durant la durée de l’extraction en
préambule de son équilibre avec l’analyte en solution.
Il est également intéressant de remarquer que ce comportement de l’étalon marqué n’a pas été
observé de manière significative pour l’analyse du BCR-464 et du Dolt-4 avec ce même protocole
d’extraction. Il peut donc être présumé que ce phénomène ne soit pas seulement dépendant du
mode d’extraction mais que d’autres paramètres, tels que les concentrations des espèces et la
matrice de l’échantillon peuvent également l’influencer.
1.2.4 Analyse en DI avec deux étalons marqués
Lors de l’analyse en simple DI en MeHg+ menée sur le Dolt-4, une fraction de masse élevée pour
cette espèce a été déterminée. La concentration élevée du mercure inorganique au sein de cet
échantillon a été présumée responsable de cet écart de justesse en raison d’une méthylation
possible de Hg2+ en MeHg+. L’étude de la conversion des espèces au cours du protocole d’analyse
a donc été étudiée sur le Dolt-4.
Les deux protocoles d’extraction ont été appliqués en présence cette fois de deux étalons
marqués : en méthylmercure (Me200Hg+) et en mercure inorganique (202Hg2+). L’isotope 201Hg, ne
présentant aucun signe d’interférences, a été sélectionné comme l’isotope de référence de
190
l’échantillon. Les étalons marqués ont été additionnés de telle sorte que les rapports mesurés
soient proches de 0.3 pour 201Hg/202Hg sur le mercure inorganique (égal à 0.44 à l’état naturel) et
de 0.4 pour 201Hg/200Hg sur le méthylmercure (égal à 0.57 à l’état naturel).
Les DI directes ont été préparées suivant le même protocole présenté pour la DI menée avec
seulement MeHg+ (paragraphe 1.2.3.1), seul l’ajout de l’étalon marqué de Hg2+ intervient après
celui du méthylmercure.
Pour la caractérisation des étalons marqués, les DI inverses ont été préparées en utilisant les
mêmes quantités d’espèces marquées et avec un rapport isotopique proche des DI directes.
Chaque étalon marqué a été préparé séparément pour éviter toute conversion au sein des DI
inverses. La pureté, en termes d’espèces de mercure, a été vérifiée par l’analyse avec le couplage
HPLC-ICP-MS pour s’assurer qu’aucun biais ne puisse impacter les résultats sur les taux de
conversions. Quatre réplicats ont été réalisés pour chaque DI.
Le traitement des données permettant d’identifier les conversions et de corriger leur effet peut se
réaliser selon quatre méthodes différentes détaillées par Rodriguez et al. (2007). Le mode de
calcul sélectionné pour notre étude reposait sur la déconvolution des profils isotopiques. Cette
approche, proposée pour la première fois par Meija et al. (2006), consiste en un traitement des
aires de pics obtenus en relation avec les profils isotopiques associés à chaque étalon marqué
ainsi qu’à celui de l’échantillon d’abondances naturelles. L’annexe 5 présente les détails des
calculs réalisés pour aboutir aux fractions de masses de l’échantillon et aux facteurs de
conversions. Deux possibilités d’évolution des espèces ont été prises en considération : la
déméthylation de MeHg+ et la méthylation de Hg2+.
Le Tableau 38 présente les résultats obtenus pour i) le traitement des données comme s’il
s’agissait de simples DI en utilisant l’isotope 201Hg comme référence (les abondances des étalons
marqués étant inférieures à 2% sur cette isotope, leur conversion n’impacte que faiblement le
résultat), noté DI simple et ii) les données corrigées des transformations d’espèces et
accompagnées des facteurs de conversions, notées DI corrigée.
191
Tableau 38 : Résultats du dosage sur le Dolt-4 avec traitements des données en simple DI ou avec
calcul des conversions des espèces (DI corrigée)
Incubation (mg(Hg)·kg-1) Micro-onde (mg(Hg)·kg-1)
Moyenne (Ecart-type) Moyenne (Ecart-type)
Certificat
(mg(Hg)·kg-1)
DI simple 1.41 (0.04) 1.47 (0.03) MeHg+
DI corrigée 1.37 (0.04) 1.41 (0.04) 1.33 ± 0.12
DI simple 1.44 (0.06) 1.33 (0.04) Hg2+
DI corrigée 1.41 (0.05) 1.31 (0.03) 1.25* ± 0.15
Facteur de déméthylation (%) 3.2 (0.8) 1.9 (1.0)
Facteur de méthylation (%) 2.2 (1.4) 3.4 (2.1)
* valeur indicative issue de la différence entre les valeurs de Hg total et du méthylmercure
Les valeurs déterminées par la correction du taux de conversion des espèces sont en adéquation
avec les valeurs certifiées ou consensuelles (EN<2). La comparaison des résultats des DI avant et
après corrections ne met pas en évidence une forte variation des fractions de masses : elles ont
seulement sensiblement diminué après corrections. En effet, pour chaque mode d’extraction, les
transformations, c’est à dire méthylation ou déméthylation, se sont faites à des taux sensiblement
identiques (entre 2 et 3%) et en raison des teneurs proches entre les deux espèces, leur impact
sur le résultat de la simple DI est limité. Les écart-types associés au facteur de conversion (entre
20 et 60% de la valeur) attestent de la difficulté de caractériser ses effets avec une bonne fidélité.
Qvarnstrom et al. (2002) ont déterminé pour le CRM Dolt-2, matrice similaire au Dolt-4, des taux
de conversions du même ordre de grandeur en utilisant une extraction alcaline assistée par
ultrasons (2.38 ± 0.09 % et 1.7 ± 0.56 % pour la déméthylation et la méthylation respectivement).
Bien que Monperrus et al. (2008) aient souligné la dépendance des conversions avec la matrice, la
détermination de faibles taux de transformations permet de supposer que pour des échantillons de
muscle de poissons, pour lesquels les teneurs en mercure inorganique sont beaucoup plus faibles
que celles en méthylmercure, la méthylation de Hg2+ ne peut avoir qu’un impact très limité sur la
détermination de MeHg+.
L’utilisation de la DI avec l’ajout multiple d’étalons marqués s’avère être un outil prometteur pour la
caractérisation des matériaux, mais également pour l’évaluation des protocoles analytiques.
L’application à des échantillons ayant des concentrations d’espèces similaires, ou pour la
quantification d’espèces minoritaires, peut permettre d’améliorer la justesse des résultats par la
mise en évidence, et la correction, d’évolutions de la spéciation au cours des protocoles
d’analyses. Cependant, tout comme pour l’utilisation de la simple DI, l’équilibre entre les ajouts
d’étalons et les analytes initialement présents dans l’échantillon est primordial pour assurer la
justesse des résultats et ne pas corriger artificiellement les teneurs en analytes (en raison d’un
comportement différent de l’étalon marqué vis à vis des espèces originelles).
192
2 Analyses des Matériaux de Références Certifiés fr ais
Après avoir développé les protocoles d’analyses sur des échantillons lyophilisés, leur efficacité sur
des échantillons plus représentatifs d’échantillons réels a été contrôlée. Pour atteindre ce but, des
matrices de poissons frais et contenant de plus faibles teneurs en MeHg+ ont été analysées.
Ainsi, les protocoles métrologiques développés sur les CRMs lyophilisés ont été appliqués à ces
échantillons frais. Le NIST propose des CRMs issus d’échantillons frais homogénéisés, conservés
à -80 °C et certifiés pour leur fraction de masse e n méthylmercure (Davis 2007). Le Tableau 39
présente les propriétés des deux CRMs étudiés. Outre la différence de matrice avec les analyses
précédemment développées, le défi analytique repose également sur les capacités des méthodes
mises en places à atteindre d’aussi faibles concentrations dans de tels échantillons (valeurs dix
fois moins importantes que pour l’analyse de matrices lyophilisées).
Tableau 39 : Propriétés des CRMs frais (en poids fr ais)
CRM Matrice Mercure total
(mg(Hg)·kg-1)
Méthylmercure
(mg(Hg)·kg-1)
SRM-1946 Filet de truite 0.433 ± 0.009 0.394 ± 0.015
SRM-1947 Filet de truite 0.254 ± 0.005 0.233 ± 0.010
2.1 Traitement de l’échantillon
Les deux protocoles d’extraction développés ont été appliqués aux CRMs frais. Seules les prises
d’essais ont été modifiées pour augmenter les quantités de mercure mises en solution : 300 mg
ont été extraits par 20 mL de phase mobile avec l’assistance micro-ondes et l’incubation au bain-
marie.
Leur efficacité a été testée dans un premier temps sur le SRM-1946. La Figure 65 présente les
chromatogrammes obtenus par l’analyse des extraits en phase inverse.
193
m/z=202
0
2500
5000
7500
10000
0 1 2 3 4t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
MW Incubation
Figure 65 : Chromatogrammes des extraits de SRM-194 6 sur la colonne de phase inverse
Les deux protocoles ont permis de mettre en solution le mercure inorganique et le méthylmercure
contenus dans le SRM-1946. Cependant, l’observation de la hauteur des pics laisse présumer une
différence de comportement de l’échantillon durant son extraction en fonction des protocoles
utilisés. En effet, le mercure inorganique fournit une plus forte intensité de pic pour l’extraction via
l’incubation alors que pour le méthylmercure, c’est la mise en solution avec l’utilisation des micro-
ondes qui donne le signal le plus intense. Plusieurs hypothèses peuvent expliquer ces différences :
soit l’un des modes opératoires est plus efficace sur une des espèces (le micro-onde pour MeHg+
ou l’incubation pour Hg2+), soit l’un des protocoles engendre des conversions entre espèces
(l’application du champ micro-ondes entraîne une méthylation de Hg2+ ou l’incubation engendre la
déméthylation de MeHg+).
Le dosage par étalonnage externe et ajouts dosés du méthylmercure dans les deux extraits a été
effectué pour vérifier l’efficacité des deux protocoles (Figure 66). Il est à noter, que de par une
faible quantité d’échantillon disponible, ces essais n’ont été réalisés que sur une seule prise
d’essai ; les intervalles associés aux mesures sont issus des écart-types obtenus entre les
isotopes de Hg (199, 200, 201 et 202), ce qui explique la faible variabilité associée.
194
0
20
40
60
80
100
120
140
extraction par micro-ondes extraction par incubation
Protocole
% [MeHg +] extrait
étalonnage externe ajouts dosés
Figure 66 : Efficacité des protocoles d'extraction appliqués sur le SRM-1946 en fonction de la
méthode de quantification utilisée
L’observation des résultats, compte tenu des incertitudes de mesure (de l’ordre de 10 à 20% avec
ces techniques de quantification), montre que l’extraction quantitative du méthylmercure est
atteinte. Les deux protocoles sont donc également efficaces sur des échantillons frais. Ils ont donc
été appliqués pour mener la DI sur le méthylmercure.
2.2 Mise en place des protocoles métrologiques
Les protocoles métrologiques développés pour les échantillons lyophilisés ont été appliqués de
façon similaire. Seule la détermination du taux d’humidité n’a pas été réalisée du fait que ces
matériaux sont certifiés sur leur poids frais. La valeur du mercure total a tout d’abord été
déterminée puis celle du méthylmercure, avec la seule utilisation d’un étalon marqué en Me200Hg+.
2.2.1 Analyse du mercure total
L’étalon marqué en 202Hg (IRMM-640) a été utilisé pour mener ces DI après sa dilution à une
fraction de masse de 20 µg·kg-1. Le rapport isotopique 200Hg/202Hg a été modifié pour atteindre une
valeur proche de 0.5 (à l’état naturel : 0.77). Ainsi, 1 g et 0.5 g d’étalon marqué ont été rajoutés
respectivement à une prise d’essai de 300 mg de SRM-1946 et SRM-1947. Quatre réplicats ont
été préparés pour chaque échantillon.
L’étalon marqué a aussi été caractérisé par dilution isotopique inverse, toujours à partir de deux
solutions mères indépendantes préparées à partir de mercure métallique. Pour cela, quatre DI
Inverses ont été réalisées à partir de 1 g d’étalon marqué auquel est ajouté la quantité nécessaire
d’étalon de mercure permettant d’atteindre un rapport proche de 0.5. Les analyses des deux
CRMs s’étant déroulées simultanément, les mêmes DI Inverses ont été utilisées pour chacun
195
d’entre eux et analysées en même temps que chacun des échantillons. Les deux fractions de
masses déterminées pour la solution de l’étalon marqué sont d’ailleurs identiques : 20.58 ± 0.82
µg·kg-1 lors de l’analyse du SRM-1947 et 20.60 ± 0.85 µg·kg-1 pour le SRM-1946.
Les résultats obtenus sur le dosage du mercure total sont présentés dans le Tableau 40.
Tableau 40 : Résultats en DI sur le mercure total, l'incertitude est fournie avec un coefficient
d'élargissement égal à deux
CRM [Hg] mg·kg-1 Certificat mg·kg-1
SRM-1946 0.448 ± 0.017 0.433 ± 0.009
SRM-1947 0.264 ± 0.015 0.254 ± 0.005
Malgrè les faibles incertitudes associées aux valeurs certifiées (de l’ordre de 2%), les deux valeurs
déterminées sont compatibles avec les certificats des CRMs (EN<2). Le protocole mis en place a
donc été validé pour l’analyse du mercure total dans des d’échantillons frais pour ces gammes de
concentrations. Cependant, l’obtention de deux résultats supérieurs à la limite haute fixée par le
certificat pour les deux échantillons soulève la question d’une éventuelle contamination au cours
du protocole. Avant de pouvoir directement appliquer ce protocole sur des échantillons similaires, il
sera nécessaire de mener une étude approfondie pour s’assurer qu’aucune contamination
n’intervient au cours de la méthode développée.
Les incertitudes associées aux résultats sont du même ordre de grandeur que précédemment
(entre 4 et 6%), et de même les composantes majoritaires sont identiques à celles déjà mises en
évidences (Figure 67).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
masse (barquette + Hg)
masse (barquette vide)
répétabilité de la méthode pour Cech
répétabilité de la méthode pour Csp
répétabilité pour la mesure du rapport inverse
répétabilité pour la mesure du rapport direct
effet sur l'incertitude finale (%)
SRM-1946 SRM-1947
Figure 67 : Contribution des principaux paramètres sur le dosage du mercure total dans des
échantillons frais
196
2.2.2 Analyse de spéciation
2.2.2.1 Préparation de la dilution isotopique
Les DI ont été préparées de la même manière que lors de l’analyse des CRMs lyophilisés : ajout
de l’étalon marqué de Me200Hg+ tel que le rapport mesuré soit proche de 0.8 pour 202Hg/200Hg,
après vérifications qu’aucune interférence ne soit présente (EN<2). Le protocole pour la réalisation
pratique des DI directes et permettant d’assurer l’homogénéité du mélange est resté identique :
ajout d’une partie du solvant d’extraction sur la prise d’essai puis ajout de l’étalon marqué avant de
compléter avec le reste du solvant.
L’étalon marqué a également été caractérisé par la préparation de DI Inverses à partir d’un étalon
de MeHgCl d’abondance naturelle et en utilisant les mêmes quantités de matière pour
correspondre aux concentrations des DI directes.
Quatre réplicats ont été préparés pour chaque DI.
2.2.2.2 Dosage du méthylmercure
La Figure 68 et la Figure 69 montrent les chromatogrammes obtenus après l’application des deux
modes d’extraction sur les matériaux frais.
SRM-1946 MW
0
2000
4000
6000
8000
10000
0 1 2 3 4
t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
200 202
0
500
1000
1500
0 1 2
SRM-1946 Incubation
0
2000
4000
6000
8000
10000
0 1 2 3 4t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
200 202
0
500
1000
1500
2000
2500
0 1 2
Figure 68 : Chromatogrammes des extraits de SRM-194 6 sur la colonne de phase inverse
197
SRM-1947 MW
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 1 2 3 4
t (min)
Inte
nsité
(cp
s)
200 202
0
500
1000
1500
2000
0 1 2
SRM-1947 Incubation
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 1 2 3 4t (min)
Inte
nsité
(cps
)
200 202
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 1 2
Figure 69 : Chromatogrammes des extraits de SRM-194 7 sur la colonne de phase inverse
Les deux espèces identifiées dans les échantillons de poissons lyophilisées ont également été les
seuls composés présents dans ces échantillons frais pour les protocoles d’extraction utilisés :
mercure inorganique et méthylmercure.
Les résultats sur le dosage du méthylmercure sont présentés dans le Tableau 41.
Tableau 41 : Résultats sur la détermination du méth ylmercure par DI associés à leur incertitude (k=2)
Analyse de spéciation (mg(Hg)·kg-1) CRM
Incubation Micro-ondes
Certificat
(mg(Hg)·kg-1)
SRM-1946 0.459 ± 0.053 0.407 ± 0.040 0.394 ± 0.015
SRM-1947 0.262 ± 0.029 0.256 ± 0.027 0.233 ± 0.010
Hormis pour le CRM-1946 extrait par l’incubation, les résultats sont compatibles avec les valeurs
certifiées (EN<2). Malgré le manque de fidélité des dosages (les incertitudes sont de l’ordre de
10%), l’efficacité du protocole avec les micro-ondes sur ces échantillons a été confirmée pour
atteindre la faible teneur en méthylmercure des échantillons frais. En conséquence seul ce
protocole a été validé pour des matériaux représentatifs d’échantillons réels (en termes de
concentrations et de matrices).
Un comportement différent de l’étalon marqué de Me200Hg+ par rapport à l’analyte originel a été
suspecté, expliquant le manque de justesse associé aux extractions par l’incubation.
L’analyse des incertitudes a révélé que ce sont toujours les mêmes paramètres qui influencent sa
valeur (Figure 70).
198
0 10 20 30 40 50 60
répétabilité de la méthodepour Cech
répétabilité de la méthodepour Csp
répétabilité pour la mesuredu rapport inverse
répétabilité pour la mesuredu rapport direct
effet sur l'incertitude finale pour l'incubation (% )
SRM-1946 SRM-1947
0 10 20 30 40 50 60 70
répétabilité de la méthodepour Cech
répétabilité de la méthodepour Csp
répétabilité pour la mesuredu rapport inverse
répétabilité pour la mesuredu rapport direct
effet sur l'incertitude finale pour les micro-ondes (%)
SRM-1946 SRM-1947
Figure 70 : Contribution des principaux paramètres sur le dosage du méthylmercure dans les
échantillons frais en fonction des protocoles d’ext raction
La nature de l’échantillon semble affecter la détermination des composés. En particulier, la mesure
des rapports isotopiques a été plus délicate dans les surnageants des échantillons frais : l’écart-
type relatif associé était de l’ordre de 1%, alors que sur les échantillons lyophilisés il se situait
autour des 0.5%. Lors de l’analyse d’extraits d’échantillons frais, une plus grande variabilité dans
les aires des pics a pu être observée. Des effets de matrice plus prononcés, en raison de la faible
quantité de mercure à analyser, peuvent affecter la séparation et la détection. Même si pour mener
la DI, ce sont les rapports des aires qui sont utilisés, leurs mesures sont affectées par la variabilité
des aires. Cette dispersion des mesures a été identifiée comme responsable de l’augmentation de
l’incertitude finale jusqu’à 10% de la valeur de la fraction de masse mesurée. Dans ces conditions,
il peut être envisagé que les limites de la procédure sont atteintes pour une détermination fidèle du
méthylmercure dans des échantillons de poissons. Les efforts futurs devront donc être consacrés
à améliorer la lecture des rapports isotopiques pour améliorer la fidélité de la méthode et permettre
une meilleure évaluation de la justesse des résultats. En effet, diminuer les incertitudes de
mesures permet une meilleure comparaison des données.
199
3 Conclusions sur l’analyse du mercure
La mise en place de protocoles métrologiques pour l’analyse du mercure (en mode total et en
spéciation) a été réalisée pour des matrices de poissons, ce type d’échantillons représentant l’une
des principales voies d’exposition de la population à travers leur consommation. L’analyse de
spéciation a été réalisée principalement pour la détermination d’une espèce présentant le plus
grand impact sur la santé humaine : le méthylmercure. La démarche utilisée permet de prétendre à
la traçabilité des résultats au SI de par une validation des protocoles sur des CRMs, le calcul des
incertitudes associées et l’utilisation de références à la traçabilité avérée.
Les développements analytiques ont surtout porté sur l’étape d’extraction des analytes. Un
protocole permettant un traitement rapide a pu être développé et s’est montré plus adapté pour la
mise en pratique de la dilution isotopique comme méthode de dosage.
Par contre, l’extraction quantitative a montré que, dans le cadre de l’analyse du mercure avec
l’utilisation de la dilution isotopique, son obtention n’assurait pas toujours une détermination juste
du méthylmercure. En effet, l’application du protocole d’extraction menée avec l’incubation a
montré que l’étalon marqué pouvait évoluer avant que la mise en solution ne soit totale. Cette
conversion entraînait par la suite une surestimation des résultats. Toutefois, cet effet n’a pu être
identifié lors de la mise en pratique du protocole d’extraction développé avec l’utilisation des micro-
ondes, ce qui laisse penser que, s’il intervient, il n’impacte pas le résultat de manière significative.
Malgré ce fait, la question de l’équilibre entre l’analyte contenu dans l’échantillon et l’étalon marqué
reste une interrogation importante à résoudre pour s’assurer de la justesse des résultats obtenus
en DI lors de l’analyse de composés de faible stabilité.
La dilution isotopique menée en spéciation avec l’ajout de plusieurs étalons marqués, développée
depuis quelques années dans plusieurs laboratoires pour permettre l’étude des conversions entre
espèces tout au long du protocole d’analyse, a également été testée sur un échantillon. Cette
méthode s’est révélée intéressante et prometteuse dans le cadre d’analyses où les conversions
peuvent influer de manière significative sur la détermination individuelle de chaque espèce.
L’utilisation d’un tel outil pourra aussi à l’avenir permettre une meilleure évaluation de l’utilisation
de plusieurs protocoles sur des analytes et permettre de sélectionner celui de moindre impact sur
les résultats finaux. Cependant, tout comme pour la DI avec l’utilisation d’un seul étalon marqué,
l’équilibre échantillon/étalon avant le début de l’analyse est primordial pour éviter toutes erreurs
dans la correction des concentrations. En conséquence, lors de son utilisation, des études devront
être au préalable menées pour s’assurer de l’atteinte d’un tel équilibre.
La mise en pratique des protocoles métrologiques a pu être réalisée sur différents types
d’échantillons. Premièrement, des CRMs se présentant sous forme de poudres lyophilisées, avec
200
des teneurs relativement élevées en mercure, ont été analysés. Dans un deuxième temps, des
échantillons plus représentatifs de ceux analysés par les laboratoires, ont été étudiés. La
différence provenait du fait qu’ils soient conservés frais et congelés. L’implication de ce mode de
conservation était une fraction de masse en mercure plus faible dans ces seconds types
d’échantillons. Les protocoles se sont révélés être, sur la plupart des échantillons, efficaces pour
doser le méthylmercure ou le mercure total. En particulier, la procédure développée pour mener
l’analyse de MeHg+ avec l’utilisation des micro-ondes a pu montrer ses capacités de mesures sur
deux matrices distinctes et pour différentes gammes de concentrations (typiquement allant de 0.2
à 5 mg·kg-1). Ce protocole est donc considéré comme validé dans le cadre des applications
abordées.
Les limites des protocoles développées ont pu également être en partie identifiées. Premièrement,
l’application de la simple DI en méthylmercure peut fournir une concentration erronée pour des
échantillons où le mercure inorganique se retrouve à une teneur non négligeable. En effet sa
méthylation peut mener à une surestimation de sa concentration. L’implication de la DI avec deux
étalons marqués devient alors indispensable pour améliorer la justesse des résultats. Une
seconde limitation des protocoles développés réside dans la fidélité de la détermination des
concentrations pour des valeurs basses. En effet, pour ces seconds échantillons les incertitudes
associées étaient de l’ordre de 10% ce qui ne permet pas toujours de détecter un écart de justesse
entre les valeurs déterminées et celles certifiées. L’étude des facteurs importants a révélé que
cette augmentation de l’incertitude relative (pour les échantillons lyophilisés elle n’était que
d’environ 5%) provenait majoritairement de la lecture des rapports isotopiques des DI.
L’amélioration des performances du couplage HPLC-ICP-MS par une augmentation des capacités
de détection de l’ICP-MS et également par une efficacité de la séparation pourra permettre
d’envisager de diminuer l’impact de la lecture des rapports isotopiques sur les incertitudes finales.
L’amélioration des capacités de mesures des techniques analytiques permettra également
d’abaisser les plages d’applicabilités de nos protocoles sur des échantillons aux teneurs plus
faibles en méthylmercure comme rencontrées chez les mollusques ou dans des sédiments.
Au final, la mise en place des protocoles métrologiques pour la détermination du méthylmercure
par le couplage HPLC-ICP-MS s’avère être efficace dans les gammes des échantillons analysés.
L’utilisation de telles techniques se révèle surtout être une alternative à l’application de la GC-ICP-
MS pour le dosage de MeHg+ dans ce type d’échantillons. L’existence de plusieurs possibilités
techniques pour mener une analyse s’avère intéressante pour améliorer la compréhension de
l’impact des procédés analytiques sur les résultats finaux en comparant les déterminations
obtenues avec chaque couplage.
201
Conclusion générale
204
Le but des recherches entreprises au cours de cette thèse reposait sur la mise en place de
protocoles métrologiques pour assurer la traçabilité des analyses de spéciation au Système
International des unités (SI), cette traçabilité permettant par la suite la comparabilité dans le temps
et dans l’espace. Le LNE, laboratoire national de métrologie pour la France, se devait de disposer
de telles techniques pour répondre aux besoins en qualité (actuels et futurs) des analyses
engendrées par les évolutions de la législation. Ainsi, en partenariat avec le LCABIE (UMR CNRS
de l’Université de Pau et des Pays de l’Adour), il a été décidé de développer des méthodes pour
réaliser des analyses de spéciation tout en assurant leur traçabilité au SI.
Les applications choisies reposaient sur l’étude d’éléments pouvant se retrouver dans le régime
alimentaire des populations. Ainsi, un élément essentiel pour la santé humaine, le sélénium, et un
élément reconnu pour son impact nocif, le mercure, ont été sélectionnés comme premières
applications du protocole métrologique développé. Sur ces deux éléments, les espèces retenues
ont été celles représentant la principale forme d’exposition des populations par les échantillons
choisis : à savoir la sélénométhionine (SeMet) présente dans les compléments alimentaires issus
de levures séléniées et dans la farine de blé et le méthylmercure (MeHg+) qui se bioaccumule le
long de la chaîne alimentaire des réseaux aquatiques pour atteindre des teneurs élevées au sein
des échantillons de poissons.
Les techniques analytiques utilisées pour mener à terme ces analyses ont reposé sur le couplage
de la Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) et de la Spectrométrie de Masse à
Couplage Inductif du Plasma (ICP-MS). Ce montage a été utilisé avec la mise en oeuvre de la
Dilution Isotopique (DI) comme méthode de dosage. La DI, menée sous certaines conditions, est
reconnue comme une méthode primaire par le Bureau International des Poids et Mesures (BIPM),
et son application autorise la traçabilité des mesures au Système International.
Dans le cadre d’analyses de spéciation menées en DI, l’équilibre entre l’étalon marqué liquide et
l’analyte à mesurer dans l’échanitllon solide est impossible à obtenir avant le début de l’extraction.
Pour pallier à cette difficulté, les travaux ont donc été orientés vers le développement de
protocoles de traitements des échantillons qui permettent d’obtenir une extraction quantitative des
formes chimiques de l’élément depuis la matrice. Le postulat est que si l’extraction est quantitative,
l’analyte se retrouve en phase liquide avec l’étalon marqué et, ainsi, l’équilibre devient possible.
Pour l’analyse du sélénium, les travaux ont donc débuté par la mise en place de traitements
permettant d’extraire un maximum de formes de Se depuis les différents types d’échantillons.
Deux protocoles d’extractions séquentielles ont donc été mis au point pour améliorer la mise en
solution de l’ensemble des espèces de sélénium. Ces deux protocoles ont présenté des efficacités
différentes sur l’extraction du sélénium total, dépendantes des échantillons analysés. Cependant
ces deux protocoles se sont révélés tout aussi efficaces pour l’extraction de la sélénométhionine
sur tous les types d’échantillons. La quantification de SeMet s’est déroulée après l’application d’un
205
ou deux protocoles, en fonction des contraintes imposées par l’échantillon (faible teneur en Se).
Les extraits ont pu être analysés par deux techniques chromatographiques différentes pour
assurer une séparation efficace de la sélénométhionine et limiter ainsi les risques de co-élution. La
détection par ICP-MS a été optimisée pour éviter ou corriger les interférences lors de la mesure
des isotopes impliqués dans la DI.
L’approche visant à obtenir une extraction quantitative pour assurer la justesse du résultat a aussi
été considérée pour mener l’analyse du méthylmercure. Deux modes opératoires ont été mis en
place pour réaliser l’extraction, et lors des tests préliminaires, chacun s’est montré efficace pour
atteindre la totalité du méthylmercure présent dans les échantillons. Cependant, lors de
l’application de la DI en analyse de spéciation, les résultats pouvaient se révéler biaisés avec
l’utilisation de l’une des deux méthodes (l’extraction par incubation). Il a été démontré que ces
résultats étaient obtenus à cause d’une évolution de l’étalon marqué au cours de l’extraction de
l’analyte et donc avant son équilibre avec celui ci. Cet effet a ainsi démontré les limites de
l’hypothèse de travail pour les composés pouvant facilement se convertir en d’autres espèces.
Toutefois, le second protocole développé, reposant sur l’activation par champ micro-ondes pour
diminuer le temps d’extraction, a montré son efficacité sur la détermination du méthylmercure pour
les deux types d’échantillons étudiés. La séparation par HPLC et la détection par ICP-MS ont été
optimisées pour la mesure du méthylmercure. En particulier, l’utilisation de l’ICP-MS avec cellule
de collision/réaction activée a permis d’améliorer les limites de détection des techniques
analytiques. L’utilisation du couplage HPLC-ICP-MS pour l’analyse de spéciation du mercure est
également une alternative dans la mesure du méthylmercure. En effet, la plupart des méthodes
développées jusqu’à présent reposent sur l’utilisation de la chromatographie en phase gazeuse
pour la séparation des espèces après dérivation de celles-ci. La disponibilité de méthodes
complémentaires et basés sur principes des physico-chimiques différents pour réaliser une mesure
est indispensable pour l’évaluation de l’impact des techniques analytiques sur le résultat final.
Une fois les modes opératoires pour l’analyse des échantillons élaborés, les protocoles
métrologiques ont pu être appliqués. Un travail important pour l’obtention de la traçabilité au SI a
été la détermination des incertitudes de mesures. A partir de l’équation générale de la DI, un
modèle mathématique a été construit pour permettre de faire figurer les paramètres pris en compte
pour obtenir le résultat final mais également ceux n’apparaissant pas directement dans son
équation. A partir de cette expression mathématique, l’incertitude générale associée à la
quantification des espèces dans les différents échantillons a pu être établi. Outre le fait que le
calcul de l’incertitude est une étape importante et nécessaire pour la démonstration de la traçabilité
d’une analyse, il a également permis de pointer les facteurs les plus influents sur le résultat final ;
ainsi l’optimisation du processus de mesure a pu (et pourra) être envisagée en modifiant ces
206
paramètres. Sur l’ensemble des résultats, des incertitudes relatives comprises entre 3 et 10% en
fonction des échantillons ont pu être établies.
La validation des protocoles s’est déroulée par i) l’analyse de matériaux de références certifiés
(CRMs) ii) la participation à une intercomparaison et iii) le calcul des incertitudes de mesures. Ainsi
les méthodes développées ont pu démontrer leur justesse sur des gammes de teneurs allant de 10
à 2000 mg·kg-1 pour le sélénium et de 0.2 à 5 mg·kg-1 pour le mercure. La robustesse des
méthodes vis à vis des échantillons a également été étudiée par leur application sur différentes
matrices : des levures séléniées, brutes ou enrobées d’excipients pharmaceutiques, ou de la farine
de blé pour le sélénium et des échantillons de poissons frais ou lyophilisés pour le mercure.
L’application de ces protocoles sur les échantillons de plus faibles teneurs a montré également les
limites des techniques utilisées.
Finalement, il peut donc être retenu que les protocoles métrologiques mis en place pour l’analyse
de spéciation du sélénium et du mercure ont montré leur capacité de mesure dans les échantillons
étudiés. La traçabilité au SI est démontrée grâce à l’utilisation de la DI sous certaines conditions et
l’estimation des différentes sources d’incertitudes, ce qui permet de qualifier ces modes
opératoires de « procédures de mesure primaire ». Les protocoles développés sont donc
utilisables pour permettre le transfert de la traçabilité au SI vers les utilisateurs, via leur implication
dans la certification de matériaux de références ou lors de la participation à des essais d’aptitudes.
Les travaux réalisés au cours de cette thèse représentent une première étape pour le LNE dans le
domaine de la spéciation. La mesure de la sélénométhionine n’est seulement qu’un premier pas
dans l’évaluation de l’impact sur la santé humaine des types d’échantillons étudiés. En effet, cette
espèce ne représente que 65% du sélénium total. Des efforts doivent donc être réalisés pour
l’identification et la mesure des espèces contenues à plus plus faibles teneurs. Dans le cadre de
l’analyse du mercure, les protocoles mis en places ont montré leur limitation lors de l’analyse
d’échantillons frais de faibles concentrations. Des efforts devront être consacrés à l’amélioration de
la sensibilité des techniques utilisées pour permettre i) d’améliorer la capacité de mesures et ii)
diminuer les incertitudes associées sur de tels échantillons.
Le devenir des espèces mesurées dans le corps humain est aussi à étudier pour permettre de
corréler des teneurs d’exposition à des concentrations de présence au niveau de la personne.
Pour permettre cela, il est donc nécessaire de développer des méthodes capables de réaliser la
spéciation de ces éléments dans les fluides humains. Ainsi, des progrès pourront être réalisés
pour mieux appréhender la biochimie associée à chacun de ses éléments, ce qui permettra, in
fine, une meilleure évaluation des risques.
Des développements devront aussi être réalisés pour étendre l’utilisation des protocoles
métrologiques à d’autres espèces susceptibles d’affecter la santé humaine ou l’environnement. En
effet, plusieurs éléments soulèvent à l’heure actuelle des questions sur leur impact, que ce soit
207
d’un point de vue de la santé comme l’utilisation d’espèces platinées dans certaines formulations
médicamenteuses ou de leur conséquence environnementale comme les organoétains. Ainsi, des
applications de la spéciation pourront apporter des compléments d’informations que ce soit dans le
domaine de l’environnement ou du biomédical.
208
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spectrometer as detector, Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 1998, 13, 141-149.
- K. Wrobel, S. Kannamkumarath, K. Wrobel, J.A. Caruso, Hydrolysis of proteins with
methanesulfonic acid for improved HPLC-ICP-MS determination of seleno-methionine in yeast
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selenium area of China, The American Journal of Clinical Nutrition, 2005, 81, 829-834.
- L. Yan, L. Shu-Juan, J. Dong-Qing, J. Yan, Y. Xiu-Ping, Gas Chromatography-Inductively
Coupled Plasma-Mass Spectrometry for Mercury Speciation in Seafood, Chinese Journal of
Analytical Chemistry, 2008, 36, 793-798.
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quantification of methionine and selenomethionine in yeast by species specific isotope dilution
gas chromatography-mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 2004c, 1055, 177-184.
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Selenized Rice Using High-Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma
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reversed-phase liquid chromatography using inductively coupled plasma mass spectrometry as
element-specific detection, Journal of Chromatogrphy A, 2000, 874, 55-64.
- J. Zheng, Y. Shibata, N. Furuta, Determination of selenoamino acids using two-dimensional
ion-pair reversed phase chromatography with on-line detection by inductively coupled plasma
mass spectrometry, Talanta, 2003, 59, 27-36.
233
Annexes
Annexe 1 : Revue bibliographique des séparations pa r
HPLC-ICP-MS avec appariements d’ions pour l’analyse
des espèces de sélénium
238
239
Type de séparation
Volume d’injection
(µL) Phase mobile
Dimension de la colonne
(mm)
Temps d’analyse
(min) Composés séparés
Type d’échantillon Référence
IP-RP
(appariement
d’ions)
10 0.1% acide trifluoro-acétique (TFA),
2% méthanol (MeOH) 150 x 4.6 25
SeMet, MeSeCys,
propyl-SeCys
Levures et
aulx
Bird
1997
IP-RP 100 0.1% acide acétique 150 x 4.6 20 Se-adénosyl-homo-cystéine Levure Casiot
1999b
IP-RP 25 0.1% TFA, 10% MeOH 250 x 4.6 22 Se inorganique, SeCys2,
SeMet, Se-éthionine (SeEt) Levure
B’Hymer
2000
0.1% TFA, 1% MeOH 20
0.1% acide pentafluoropropionique (PFPA), 1%
MeOH 40
IP-RP -
0.1% acide heptafluorobutyrique (HFBA), 1%
MeOH
150 x 3.9
75
Mélange de 23 étalons - Kotrebai
2000
IP-RP 100
2.5 mmol·L-1 1-butane sulfonate de sodium,
8 mmol·L-1 hydroxyde de tétraméthylammonium
(TMAH), 4 mmol·L-1 acide malonique,
0.05% MeOH, pH=4.5
250 x 4.6 20
SeIV, SeVI, SeCys2,
TMeSe+, SeET, SeMet,
sélénocystamine et
sélénouréa
Levure Zheng
2000
IP-RP 50
30 mmol·L-1 formate d’ammonium,
10 mmol·L-1 acétate de tétrabutylammonium,
5% MeOH, pH=3.0
250 x 4.0 12 SeEt, SeMet, SeVI, SeIV,
sélénocystamine et SeCys2 Urine
Marchante
2001
IP-RP 15 50% MeOH, pH=5.3 avec tampon acide
acétique/acétate de sodium 250 x 2.0 45 SeMet, SeEt Levure
Montes-Bayon
2001
IP-RP 20
5 mmol·L-1 acide citrique
5 mmol·L-1 acide hexanesulfonique,
5% MeOH, pH=4.5
150 x 4.6 7 SeMet Levure et
noix
Wrobel
2003
IP-RP 20 10 mmol·L-1 hydroxyde de tétraéthylammonium
(TEAH), 4.5 mmol·L-1 acide malonique, pH=6.8 250 x 4.6 20
SeIV, SeVI, SeCys2, SeET,
TMeSe+, SeMet, sélénouréa Levure
Zheng
2003
240
Type de séparation
Volume d’injection
(µL) Phase mobile
Dimension de la colonne
(mm)
Temps d’analyse
(min) Composés séparés
Type d’échantillon Référence
IP-RP 100 100 mmol·L-1 acétate d’ammonium,
2% MeOH, pH=4.5 250 x 4.6 10 SeMet Poisson
Diaz Huerta
2004
A : 0.1% TFA dans l’eau IP-RP 30 Gradient
B : 0.1% TFA dans MeOH 250 x 4.1 35 Chaînes polypeptidiques Levure
Polatajko
2004
IP-RP 20 0.1% HFBA, 5% MeOH, pH=2.5 150 x 4.6 20 Se inorganiques, SeCys2,
MeSeCys et SeMet Oignions
Shah
2004
0.1% acide formique, 2% MeOH IP-RP 50
0.1% TFA, 2% MeOH 250 x 4.6 12 SeIV, SeMet, MeSeCys Levure
Goenaga
2005
IP-RP 20 0.2% HFBA, 10% MeOH, pH=2.5 250 x 2.0 22 SeMet, MeSeCys
Ail et
moutarde
indienne
Montes-Bayon
2006
IP-RP 20 0.05% TFA, 0.1% HFBA, 2 % MeOH 150 x 2.0 25 Se inorganiques, SeCys2,
MeSeCys et SeMet Yahourt
Alzate
2007
IP-RP - 5 mmol·L-1 hydroxyde de tétrabutylammonium
(TBAH), 5% MeOH, pH=7.5 150 x 4.6 25 Composés seleno-arséniés -
Kanaki
2007
A : TBAH, 2.5 mmol·L-1 phosphate
d’ammonium, pH=6.0 IP-RP 100 Gradient
B : 10 mmol·L-1 sulfate d’ammonium
250 x 4.6 8 SeIV, SeVI, SeMet et
SeCys2
Eaux,
plantes et
urines
Afton
2008
A : 0.1% HFBA dans l’eau IP-RP Gradient
B : 0.1% HFBA dans MeOH
150 x 4.6 12 SeMet, SeCys Tissus
biologiques
Bierla
2008
A : 0.1% HFBA, 0.3% MeOH IP-RP 50 Gradient
B : 0.1% HFBA, 2% MeOH 150 x 3.9 14 - Riz
Zhang
2008
Annexe 2 : Revue bibliographique des séparations pa r
HPLC-ICP-MS avec échange d’ions pour l’analyse des
espèces de sélénium
244
245
Type de séparation
Volume d’injection
(µL) Phase mobile
Dimension de la colonne (mm)
Temps d’analyse
(min) Composés séparés
Type d’échantillon Référence
AX
(échange
d’anions)
2 5 mmol·L-1 citrate d’ammonium 10 x 1.6 12 SeIV et SeVI - Shum
1993
AX 30 5 mmol·L-1 citrate d’ammonium, 2% MeOH,
pH=4.8 150 x 4.6 14
SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,
MeSeCys, Se-allyl-SeCys Ail
Bird
1997
CX
(échange
de cations)
100 20 mmol·L-1 formiate de pyridine, pH de 2 à 5.7 250 x 4.6 7 SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,
SeEt, Seleno-homo-cystine -
Goessler
1997
AX 100 12.5 mmol·L-1 phosphate d’ammonium, 3%
MeOH, pH=8.5 250 x 4.1 16 SeIV et SeVI -
Guerin
1997
AX 100 6 mmol·L-1 salicylate de Tris, 3% MeOH, pH=8.5 120 x 4.6
CX 50 2 mmol·L-1 formiate de pyridine, 3% MeOH,
pH=2.9 100 x 3
9 SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2 Trèfle Pedersen
1997
AX 10 5 mmol·L-1 malonate d’ammonium - 4 SeIV et SeVI Eau
souterraine
Woller
1998
A : 6.25 mmol·L-1 phosphate
d’ammonium, pH=5.5 AX 100 Gradient
B : 25 mmol·L-1 phosphate
dammonium, pH=11
250 x 4.1 14 SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,
SeEt Levure
Casiot
1999a
AX 100 5.5 mmol·L-1 citrate d’ammonium 25 x 4 7 SeIV, SeVI, SeMet, TMeSe+ - Li
1999
AX 20 25 mmol·L-1 hydroxyde de sodium, 2% MeOH 250 x 2 10 SeIV, SeVI, SeMet Urine Gammelgaard
2000
10 mmol·L-1 acide oxalique, 20 mmol·L-1 sulfate
de potassium, 2% MeOH, pH=3 9 SeIV, SeVI, SeMet, TMeSe+
CX 20 30 mmol·L-1 formiate d’ammonium, 2% MeOH,
pH=3
250 x 2
12 SeIV, SeMet, TMeSe+
Urine Gammelgaard
2001
246
Type de séparation
Volume d’injection
(µL) Phase mobile
Dimension de la colonne (mm)
Temps d’analyse
(min) Composés séparés
Type d’échantillon Référence
AX 4 mmol·L-1 salicylate de sodium, 3% MeOH, pH=8 125 x 4.6 16
A : 0.75 mmol·L-1 formiate de
pyridine, 3% MeOH, pH=3 CX
50 - 200 Gradient
B : 8 mmol·L-1 formiate de pyridine,
3% MeOH, pH=3.2
100 x 3 52
SeIV, SeVI, 12 espèces de
sélénium organiques
Levure,
algue
Larsen
2001
A : 20 mmol·L-1 nitrate d’ammonium,
pH=8.7 AX 100 Gradient
B : 60 mmol·L-1 nitrate d’ammonium,
pH=8.7
250 x 4.1 9 SeIV et SeVI Eau de
surface
Martinez
2001
A : 30 mmol·L-1 Tris-HCl, 30 mmol·L-1
HEPES, pH=7.3 Gradient
B : 50 mmol·L-1 Tris-HCl, 20 mmol·L-1
sulphate d’ammonium, pH=8.2
- 12
A : 0.8 mmol·L-1 hydroxyde de
sodium
AX 100
Gradient B : 0.5% hydroxyde de tétraméthyl-
ammonium
- 12
SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,
SeEt, selenurea Bactérie
Michalke
2001
CX 4 mmol·L-1 formiate de pyridine, pH=2.9 250 x 4.1 30
3 mmol·L-1 salicylate de Tris, pH=6
5.5 mmol·L-1 citrate d’ammonium, pH=4.8 AX
100
15 mmol·L-1 tartrate d’ammonium, pH=2.9
250 x 4.1 8
SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,
TMSe+ Huîtres
Moreno
2001
AX 50 100 mmol·L-1 hydroxyde de sodium 250 x 4 10 SeIV et SeVI Eau
souterraine
Vassileva
2001
247
Type de séparation
Volume d’injection
(µL) Phase mobile
Dimension de la colonne (mm)
Temps d’analyse
(min) Composés séparés
Type d’échantillon Référence
A : 5 mmol·L-1 phosphate
d’ammonium, pH=8 AX 10 Gradient
B : 50 mmol·L-1 phosphate
dammonium, pH=8
250 x 2 25 SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2 Levure Chassaigne
2002
CX 20 mmol·L-1 formiate de pyridium, pH=3 20
A : 20 mmol·L-1 acide acétique, 10
mmol·L-1 triéthyl-amine, pH=4.7 AX
100
Gradient B : 200 mmol·L-1 acide acétique, 100
mmol·L-1 triéthyl-amine, pH=4.7
-
50
SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,
SeEt Levure
McSheehy
2002
5 mmol·L-1 citrate d’ammonium, 3% MeOH, pH=5 250 x 4.1 22 Levure
A : 5 mmol·L-1 citrate d’ammonium,
3% MeOH, pH=3.65 AX 100 Gradient
B : 5 mmol·L-1 citrate d’ammonium,
3% MeOH, pH=8
250 x 4.1 12
SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,
MeSeCys Blé
Diaz Huerta
2003
A : 50 mmol·L-1 Tris-HCl, pH=7.4
AX 100 Gradient B : 50 mmol·L-1 Tris-HCl, 0.5 mol·L-1
acétate d’ammonium, pH=7.4
50 x 5 30 Glutathion peroxidase,
protéine P
Sérum
humain
Hinojosa
2003
A : 0.75 mmol·L-1 formiate de
pyridine, 3% MeOH, pH=3
B : 2 mmol·L-1 formiate de pyridine,
3% MeOH, pH=3 CX 10 - 100 Gradient
C : 8 mmol·L-1 formiate de pyridine,
3% MeOH, pH=3.2
100 x 3 70 10 espèces de sélénium
organiques Levure
Larsen
2003
CX 100 4 mmol·L-1 formiate de pyridine, 3% MeOH,
pH=4.5 ou 2.8 250 x 4.1 20
SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,
TMSe+ Poisson
Cabanero
2004
248
Type de séparation
Volume d’injection
(µL) Phase mobile
Dimension de la colonne (mm)
Temps d’analyse
(min) Composés séparés
Type d’échantillon Référence
AX 100 5 mmol·L-1 citrate d’ammonium, 2% MeOH
pH=5.9 250 x 4.1 13
SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,
MeSeCys
Levure et
complément
s
alimentaires
Goenaga
2004
A : 10 mmol·L-1 phosphate
d’ammonium, 2% MeOH, pH=7 AX 100 Gradient
B : 100 mmol·L-1 phosphate
d’ammonium, 2% MeOH, pH=7
250 x 4.1 15 SeMet Levure Hinojosa
2004
CX 100 4 mmol·L-1 formiate de pyridine, pH=2.8 ou 4.7 250 x 4.1 24 SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,
TMSe+
Tissus
biologiques
Moreno
2004
A : 10 mmol·L-1 hydroxyde de
sodium AX 1000 Gradient
B : 100 mmol·L-1 hydroxyde de
sodium
- 30 SeIV, SeVI, seleno-cyanate Eaux de
surfaces
Wallschlager
2004
A : 0.75 mmol·L-1 formiate de
pyridine, 3% MeOH, pH=3 CX 50 Gradient
B : 8 mmol·L-1 formiate de
pyridine, 3% MeOH, pH=3.2
125 x 4 45 SeMet, SeCys2, MeSeCys,
MeSeMet
Moutarde
indienne
Ketavarapu
2005
AX 10 mmol·L-1 citrate d’ammonium, pH=4.8 100 x 4.1 8
CX 20 mmol·L-1 formiate de pyridine, pH=2.1 150 x 4.6
CX
20
10 mmol·L-1 formiate de pyridine, pH=1.6 250 x 4.1 14
SeIV, SeVI, SeMet,
sélénosucres Urine
Kuehnelt
2005
A : 20 mmol·L-1 acétate d’ammonium, pH=4.7
AX 100 B : 200 mmol·L-1 acétate d’ammonium, pH=4.7
250 x 4.6 40
SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,
seleno-adeno-homo-
cystéine
Levure McSheehy
2005
249
Type de séparation
Volume d’injection
(µL) Phase mobile
Dimension de la colonne (mm)
Temps d’analyse
(min) Composés séparés
Type d’échantillon Référence
A : 10 mmol·L-1 acide acétique AX 100 Gradient
B : 100 mmol·L-1 acide acétique 250 x 4 40 SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2
Levure et
farine de blé
Polec-Pawlak
2005
A : 5 mmol·L-1 acide para-
hydroxyde benzoïque (PHBA),
pH=9
24 SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2
AX 25 Gradient
B : 20 mmol·L-1 PHBA, pH=9
250 x 4.1
35 SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,
MeSeCys
Levure et
complément
s
alimentaires
Ayouni
2006
CX 2 mmol·L-1 formiate de pyridine, pH=2.8 150 x 4.6 11 SeIV, SeMet, SeCys2,
MeSeCys
A : 10 mmol·L-1 phosphate
d’ammonium, 1% MeOH, pH=5.0 AX
100
Gradient B : 50 mmol·L-1 phosphate
d’ammonium, 1% MeOH, pH=5.0
250 x 4.1 20 SeIV, SeMet, SeCys2, SeVI
Oignons Kapolna
2006
SEC-AX
(exclusion
stérique
combinée à
l’échange
d’anions)
20 10 mmol·L-1 acétate d’ammonium, pH=6.5 300 x 7.6 24 SeMet, MeSeCys
Ail,
moutarde
indienne
Montes-Bayon
2006
AX 100 10 mmol·L-1 citrate d’ammonium, 2% MeOH,
pH=5 250 x 4.1 14
SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,
MeSeCys Yahourt
Alzate
2007
AX 100 12.5 mmol·L-1 phosphate d’ammonium, 3%
MeOH, pH=8.5 250 x 4.1 20 SeIV et SeVI Eau de pluie
Darrouzes
2007
AX 10 mmol·L-1 citrate d’ammonium, 2% MeOH,
pH=5 - 12
SEC-AX
100 - 200
25 mmol·L-1 acétate d’ammonium, pH=6.7 - 25
SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,
MeSeCys, γ-glutamyl-Se-
méthyl-sélénocystéine
Lentille Pedrero
2007a
250
Type de séparation
Volume d’injection
(µL) Phase mobile
Dimension de la colonne (mm)
Temps d’analyse
(min) Composés séparés
Type d’échantillon Référence
5 mmol·L-1 citrate d’ammonium, 2% MeOH,
pH=5.9 10
SeMet, SeIV, SeVI,
MeSeCys et SeCys2
5 mmol·L-1 actétate d’ammonium, pH=4.8, 5.7 ou
7.7 - -
A : 20 mmol·L-1 acide acétique, 10
mmol·L-1 trethylamine, pH=4.7
AX 100
Gradient B : 200 mmol·L-1 acide acétique, 100
mmol·L-1 trethylamine, pH=4.7
250 x 4.1
35 SeMet, SeIV, SeVI,
MeSeCys et SeCys2
Farine et
pain
Warburton
2007
A : 0.5 mmol·L-1 citrate d’ammonium,
2% MeOH, pH=3.7 AX 200 Gradient
B : 20 mmol·L-1 citrate d’ammonium,
2% MeOH, pH=8.0
250 x 4.1 12 SeIV, SeVI, SeMet,
MeSeCys Urine
Kuo
2008
251
252
Annexe 3 : Revue bibliographique des séparations pa r
HPLC-ICP-MS pour l’analyse des espèces de mercure
254
Type de séparation
Volume d’injection
(µL) Phase mobile
Dimensions de la colonne (mm)
Temps d’analyse
(min) Composés séparés
Type d’échantillon Référence
pH=6.8 16 Hg2+; MeHg+; EtHg+ CRM de thon Phase Inverse
(RP) 100 60 mmol·L-1 acétate d’ammonium ;
3% acétonitrile ; 0.005% 2-mercaptoéthanol
pH=5.3
-
18 Hg2+; Thimerosal Solutions pour
lentilles de contact
Bushee 1988
150 x 1.6 8 Appariement d’Ions
(IP-RP) 2 5 mmol·L-1 pentanesulfonate d’ammonium
50 x 1.6 6
Hg2+; MeHg+; EtHg+; PhHg+ Urine
Shum 1992
RP 200 60 mmol·L-1 acétate d’ammonium ; 3% methanol ; 1.5% acétonitrile ;
0.005% 2-mercaptoéthanol 250 x 4.6 16 Hg2+; MeHg+; EtHg+
CRM de thon ; solutions pour
lentilles de contacts et eau
usée
Huang 1993
RP 100 60 mmol·L-1 acétate d’ammonium ;
1% acétonitrile ; 0.005% 2-mercaptoéthanol
150 x 3.2 10 Hg2+; MeHg+; EtHg+ CRM de homard
Bloxham 1996
RP 1 000
à 10 000 65% acétonitrile ; pH=5.5 80 x 4.6 10 Hg2+; MeHg+; EtHg+;
PhHg+ ; acide mersalyl
CRMs de poissons ; sédiments
Falter 1997
250 x 4.6 IP-RP 100
60% méthanol ou 45% acétonitrile ; 0.01% 2-mercaptoéthanol ;
10 mmol·L-1 bromure de tétrabutylammonium 100 x 3.0 6 Hg2+; MeHg+
Solution d’étalons
Harrington 1997
RP 100 0.5% L-Cystéine 150 x 4.6 7 Hg2+; MeHg+; EtHg+ Eau de robinet ;
eau de mer Wan 1997
RP 10 000 0.5 mmol·L-1 acétate d’ammonium pH=4.5; 65%
acétonitrile ; 0.5 mmol·L-1 pyrrolidinedithiocarbamate de sodium
80 x 4.6 6 Hg2+; MeHg+ Sédiments Wilken 1998
IP-RP 10 20% acétonitrile ;
7.5 mmol·L-1 pentanesulfonate de sodium ; pH=3.0
50 x 1.0 6 MeHg+; EtHg+; PhHg+ Solution d’étalons
Acon 2001
RP 100 0.05% 2-mercaptoéthanol ; 0.05% L-Cystéine ; pH=6.6 250 x 2.1 7 Hg2+; MeHg+; EtHg+
Poissons (CRM et naturel)
Chiou 2001
256
Type de séparation
Volume d’injection
(µL) Phase mobile
Dimensions de la colonne (mm)
Temps d’analyse
(min) Composés séparés
Type d’échantillon
Référence
RP 20 60 mmol·L-1 acétate d’ammonium ;
5 % méthanol ; 0.1% 2-mercaptoéthanol ; pH=6.8
150 x 3.9 11 Hg2+; MeHg+ Cheveux humains
Morton 2002
RP 50 0.02% L-Cystéine ;
10.4 mmol·L-1 acétate d’ammonium 150 x 3.0 5 Hg2+; MeHg+
Poisons (CRM et naturel) ;
CRM de homard ; huître
Qvarnström 2002
RP - 60 mmol·L-1 acétate d’ammonium ;
5% méthanol ; 0.1% L-Cystéine ; pH=6.8
- 2.5 Hg2+; MeHg+ Poissons (CRMs et naturel)
Rai 2002
RP 100 50% méthanol ;
0.01% 2-mercaptoéthanol 250 x 4.6 6 MeHg+
CRMS de poissons
Clough 2003c
RP 50 200 mmol·L-1 acétate d’ammonium ; 30%
methanol ; 0.001% 2-mercaptoéthanol
- 11 Hg2+; MeHg+; EtHg+ Sols et
sédiments Han 2003
RP 50 60 mmol·L-1 acétate d’ammonium ;
30% methanol ; 0.005% 2-mercaptoéthanol
- 6 Hg2+; MeHg+ Solutions d’étalons
Rahman 2003
A : 10 mmol·L-1 Tris-HCl, pH=7.4 Echangeuse d’Anions
(AX) - Gradient
B : 200 mmol·L-1 Tris-HCl, pH=7.4
750 x 7.5 14 Hg lié à des protéines Mammifères et oiseaux marins,
CRMs
Ikemoto 2004
RP 0.1 mol·L-1 Tris-HNO3 (pH=7.4) ; 0.2 mmol·L-1
CHAPS 250 x 4.6 7
Exclusion Stérique (SEC)
100 0.1 mol·L-1 Tris-HNO3 (pH=7.4) 1-300 kDa 45
Hg lié à des protéines Œufs de saumon
Hasegawa 2005
SEC - 25 mmol·L-1 Tris ; 12.5 mmol·L-1 HCl ;
20 mmol·L-1 KCl - 15 Hg lié à des protéines
Cerveaux de souris
Kameo 2005
A : 5 mmol·L-1 acétate d’ammonium, pH=6.0
RP 20 Gradient B : 5 mmol·L-1 acétate
d’ammonium, 50% méthanol pH=6.0
250 x 2.1 45 Hg lié à des protéines Rats Shen 2005
257
Type de séparation
Volume d’injection
(µL) Phase mobile
Dimensions de la colonne (mm)
Temps d’analyse
(min) Composés séparés
Type d’échantillon Référence
RP 50 0.1% L-Cystéine ;
0.1% L-Cystéine, HCl, H2O 150 x 4.6 9 Hg2+; MeHg+; EtHg+
Poissons frais, en boîte ; CRM de poissons,
d’eau et de sols
Hight 2006
A : 10 mmol·L-1 acétate d’ammonium ; 1% méthanol ; 0.05% L-Cystéine ; pH=3.0
150 x 1.0
RP 20 Gradient
B : 100 mmol·L-1 acétate d’ammonium ; 10% méthanol ;
0.5% L-Cystéine ; pH=3.0 100 x 1.0
15 Hg2+; MeHg+; EtHg+;
PhHg+
Eaux de nappe phréatique, de mer et usée
Castillo 2006
RP 20 50 % méthanol ;
0.01% 2-mercaptoéthanol 150 x 3.2 4 Hg2+; MeHg+
CRMs de poissons
Vidler 2006
RP 5
12 % méthanol ; 0.2% 2-mercaptoéthanol ;
1 mmol·L-1 pentanesulfonate de sodium 3.4 10-3 mmol·L-1 EDTA ; pH=2.8
150 x 1.0 15 Hg2+; MeHg+; EtHg+ Poissons (CRM
et naturel) Chang 2007
SEC 100 30 mmol·L-1 Tris-HCl ;
0.1% 2-mercaptoéthanol ; pH=7.5 300 x 10 45 Hg lié à des protéines
RP 50 60 mmol·L-1 acétate d’ammonium ; 0.1% 2-mercaptoéthanol ; pH=3.0
250 x 4.6 20 Hg2+
Plants de soja Ketavarapu
2007
RP 100 60 mmol·L-1 acétate d’ammonium ;
3 % methanol ; 0.1 % 2-mercaptoéthanol
150 x 3.9 25 Hg2+; MeHg+ Urine humaine Li
2007
300 x 8.0 (10-300 kDa)
40 SEC 50 -
300 x 8.0 (500-60 kDa)
20
Hg lié à des protéines
Rats Shi
2007
Echangeuse de Cations
(CX) 20
50 mmol·L-1 Pyridine ; 5% méthanol ;
0.5% L-Cystéine ; pH=2 250 x 4.1 8 Hg2+; MeHg+
CRMs de poissons
Vallant 2007
258
Type de séparation
Volume d’injection
(µL) Phase mobile
Dimensions de la colonne (mm)
Temps d’analyse
(min) Composés séparés
Type d’échantillon Référence
RP 50 60 mmol·L-1 acétate d’ammonium ;
5% méthanol ; 0.1% 2-mercaptoéthanol
150 x 3.9 X Hg2+; MeHg+
CRM de produits de la mer, cheveux,
et boeuf
Wang 2007
0.5% L-Cystéine
RP 100 0.5% L-Cystéine ; 0.05% 2-mercaptoéthanol
100 x 2.1 5 Hg2+; MeHg+
Phases dissoutes et particulaires d’eaux de surfaces
Cairns 2008
RP 100 60 mmol·L-1 acétate d’ammonium ;
3% méthanol ; 0.1% 2-mercaptoéthanol ; pH=6.8
50 x 2.1 11 Hg+; Hg2+; MeHg+; EtHg+ Sédiments (CRM et naturel)
Cattani 2008
A : 0.1% acide formique dans l’eau
RP 50 Gradient B : 0.25% acide formique dans le
méthanol
150 x 4.6 12 Hg2+; MeHg+ complexés
avec cystéine et glutathion Riz
Krupp 2008
RP 200 5% méthanol ;
0.5% 2-mercaptoéthanol ; pH=4.7 30 x 3 6 Hg2+; MeHg+; EtHg+
Faine de blé et de riz (CRMs et
naturelles), CRM de poisson
Lin 2008
RP 100 50 mmol·L-1 Pyridine ; 0.5% L-Cystéine ; 5%
méthanol 150 x 4.6 5 Hg2+; MeHg+ CRM de thon
Reyes 2008
SEC 100 100 mmol·L-1 Tris 300 x 7.8 25 Hg lié à des protéines Cerveaux de
rats Wang 2008
RP 20 40% acétonitrile ; 35% méthanol ; 25% eau contenant 0.1 mmol·L-1 diéthyldithiocarbamate de sodium
150 x 4.6 15 Hg+; Hg2+; MeHg+; EtHg+;
PhHg+
Eaux de surfaces, poissons, cheveux humains
Chen 2009
Annexe 4 : Exemple d’un calcul d’incertitude obtenu
avec Wincert
Les images suivantes représentent les feuilles de résultats obtenus après l’utilisation du logiciel
Wincert pour la détermination de l’incertitude de mesure. L’exemple pris en considération est la
détermination de la fraction de masse pour la sélénométhionine contenue dans l’échantillon de
SELM-1 après l’application du protocole A pour extraire SeMet.
Page 1 : Paramètres pris en considération pour l'in certitude de mesure accompagné de leur
incertitude-type
264
Page 2 : Suite des paramètres pris en considération , détails des fonctions utilisées comme modèles
mathématiques accompagnées de leur résultat et de l eur incertitude, et début des poids des
paramètres sur les différents résultats
265
Page 3 : Suite des détails des paramètres important s sur les différents résultats
266
Page 4 : Suite des détails des paramètres important s sur les différents résultats
267
Page 5 : Suite des détails des paramètres important s sur les différents résultats
268
Page 6 : Suite des détails des paramètres important s sur les différents résultats
269
Annexe 5 : Equations de la déconvolution des profil s
isotopiques
273
Les calculs présentés dans cette annexe sont repris de l’article publié par Meija et al. (2006) et
appliqué à notre cas de figure : DI menée avec l’ajout d’un étalon marqué en méthylmercure sur la
masse 200, l’ajout d’un étalon marqué en mercure inorganique sur la masse 202 et utilisation de la
masse 201 comme isotope de référence pour l’échantillon.
Deux conversions sont étudiées : la déméthylation (nommée α) et la méthylation (nommée β)
telles que :
++
←→ 2HgMeHg
β
α
En considérant :
- ki
jm , la masse associée à l’isotope i pour le composé j pouvant provenir de l’étalon en MeHg+,
celui en Hg2+, de l’échantillon (éch) ou du mélange (m) en fin de DI et pour l’espèce k, exprimée
en masse de mercure (et non pas en masse de l’espèce)
- ijA l’abondance associée à l’isotope i pour le composé j et exprimée en fraction de masse (et
non pas en fraction de mole)
- ki
mI , l’intensité mesurée à l’ICP-MS pour le mélange (m) et associée à l’isotope i et à l’espèce
k
- s le coefficient de sensibilité de l’ICP-MS qui relie les intensités mesurées aux abondances
isotopiques du mélange.
Alors, dans le mélange de la DI, la masse de mercure présente sous la forme de méthylmercure
est égale à la somme des masses issues : de la présence de l’étalon marqué en MeHg+ après sa
déméthylation, de l’étalon marqué en Hg2+ après sa méthylation et de l’évolution des espèces de
l’échantillon, telle que :
+++
+
+
+ =++ MeHgm
MeHgéch
MeHg
Hg
MeHg
MeHgmmmm 2 (1)
Si le raisonnement se fait sur chaque isotope, alors l’équation 1 devient :
=
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
MeHgm
MeHgm
MeHgm
MeHgéch
MeHgéch
MeHgéch
MeHg
Hg
MeHg
Hg
MeHg
Hg
MeHg
MeHg
MeHg
MeHg
MeHg
MeHg
m
m
m
m
m
m
m
m
m
m
m
m
,202
,201
,200
,202
,201
,200
,202
,201
,200
,202
,201
,200
2
2
2
(2)
274
En exprimant l’équation 2 avec les abondances isotopiques :
=
+
+
++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
202
201
200
202
201
200
202
201
200
202
201
200
2
2
2
2
m
m
m
MeHgm
éch
éch
éch
MeHgéch
Hg
Hg
HgMeHg
Hg
MeHg
MeHg
MeHgMeHg
MeHg
A
A
A
m
A
A
A
m
A
A
A
m
A
A
A
m (3)
En introduisant dans l’équation 3 les intensités mesurés au sein du mélange pour le
méthylmercure ainsi que le coefficient de sensibilité de l’ICP-MS ainsi que l’équation 1 :
++=
+
+
+
+
+
++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
MeHgm
MeHgm
MeHgm
MeHgéch
MeHg
Hg
MeHg
MeHg
éch
éch
éch
MeHgéch
Hg
Hg
HgMeHg
Hg
MeHg
MeHg
MeHgMeHg
MeHg
I
I
I
smmm
A
A
A
m
A
A
A
m
A
A
A
m,202
,201
,200
202
201
200
202
201
200
202
201
200
)( 2
2
2
2
2 (4)
L’équation 4 peut se transformer telle que :
(5)
En posant les coefficients représentatifs de la participation de chaque composé tels que :
smmm
ma
MeHgéch
MeHg
Hg
MeHg
MeHg
MeHg
MeHg
)( 2
1 ++
+
+
+
+
+
++= (6)
smmm
mb
MeHgéch
MeHg
Hg
MeHg
MeHg
MeHg
Hg
)( 2
2
1 ++
+
+
+
+
+
++= (7)
smmm
mc
MeHgéch
MeHg
Hg
MeHg
MeHg
MeHgéch
)( 2
1 ++
+
+
+
+
++= (8)
Alors l’équation 5 devient :
=
+++
+++
++ +
+
+
++
+
+
+
+
+
+
+
++
+
+
+
+
+
+
+
+
++
+
+
+
+
+
MeHgm
MeHgm
MeHgm
éch
éch
éch
MeHgéch
MeHg
Hg
MeHg
MeHg
MeHgéch
Hg
Hg
Hg
MeHgéch
MeHg
Hg
MeHg
MeHg
MeHg
Hg
MeHg
MeHg
MeHg
MeHgéch
MeHg
Hg
MeHg
MeHg
MeHg
MeHg
I
I
I
A
A
A
smmm
m
A
A
A
smmm
m
A
A
A
smmm
m
,202
,201
,200
202
201
200
202
201
200
202
201
200
)()()( 2
2
2
2
2
2
2
275
=
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
MeHgm
MeHgm
MeHgm
éch
éch
éch
Hg
Hg
Hg
MeHg
MeHg
MeHg
I
I
I
A
A
A
c
A
A
A
b
A
A
A
a,202
,201
,200
202
201
200
1
202
201
200
1
202
201
200
1
2
2
2
(9)
En posant l’équation 9 sous forme matricielle :
=
++
++
++
+
+
+
1
1
1
202202202
201201201
200200200
,202
,201
,200
2
2
2
c
b
a
AAA
AAA
AAA
I
I
I
échHgMeHg
échHgMeHg
échHgMeHg
MeHgm
MeHgm
MeHgm
(10)
La résolution de l’équation 10 s’effectue grâce à une régression linéaire multiple par la méthode
des moindres carrés, effectuée par la fonction « Droitereg » sur une feuille de calcul
Excel (Microsoft®) en fixant le passage des droites par l’origine des axes.
Si ce raisonnement est appliqué aux intensités délivrées par l’ICP-MS pour le mercure
inorganique, le même système d’équations est obtenu, où les coefficients représentatifs de la
participation de chaque composé sont notés
2
2
2
c
b
a
.
La connaissances des facteurs
1
1
1
c
b
a
et
2
2
2
c
b
a
permet de remonter aux taux de déméthylation (α) et
de méthylation (β) ainsi qu’aux valeurs initiales de MeHg+ et Hg2+ présentes dans l’échantillon
avant leur conversion.
Avec :
+
+
+
+
=MeHg
Hg
MeHg
MeHg
m
m
b
a
21
1 (11)
+
+
+
+
= 2
2
2
2
2
Hg
Hg
Hg
MeHg
m
m
b
a (12)
276
Or, ces masses sont reliées aux quantités initialement introduites au cours de la DI telles que :
)1( α−= +
+
+ MeHg
MeHg
MeHgmm (13)
β+
+
+ = 22 Hg
MeHg
Hgmm (14)
α+
+
+ =MeHg
Hg
MeHgmm
2
(15)
)1(2
2
2 β−= +
+
+ Hg
Hg
Hgmm (16)
En introduisant les équations 13 et 14 dans l’équation 11, et en opérant de même pour 15 et 16
dans 12 :
βα
+
+ −=
2
)1(
1
1
Hg
MeHg
m
m
b
a (17)
)1(22
2
βα
−=
+
+
Hg
MeHg
m
m
b
a (18)
Ce système consiste à résoudre deux inconnus avec deux équations. Les coefficients de
conversions des espèces (α et β) sont ainsi déterminés.
En opérant avec le même raisonnement sur les facteurs associés à l’échantillon :
+
+
+
=MeHgéch
MeHg
MeHg
m
m
c
a
1
1 (19)
+
+
+
= 2
2
2
2
2Hgéch
Hg
Hg
m
m
c
b (20)
277
Or les masses associées à l’échantillon sont corrélées avec celles initialement présentes avant la
conversion des espèces telles que :
βα initHgéch
initMeHgéch
MeHgéch mmm ,, 2
)1(+++
+−= (21)
αβ initMeHgéch
initHgéch
Hgéch mmm ,, )1(
22 +++
+−= (22)
En introduisant les équations 13 et 21 dans l’équation 19, et 16 et 22 dans 20 :
βα
αinitHg
échinitMeHg
éch
MeHg
mm
m
c
a,,
1
12
)1(
)1(++
+
+−
−= (22)
αβ
βinitMeHg
échinitHg
éch
Hg
mm
m
c
b,,
2
2
)1(
)1(2
2
++
+
+−
−= (23)
De nouveau, il est obtenu un système de deux équations avec deux inconnus permettant de
déterminer les masses de chaque espèce initialement présentes au sein de l’échantillon. Les
connaissances de la quantité d’échantillon utilisée pour la DI et de son taux d’humidité permettent
la détermination de la fraction de masse associée à chacune des espèces dans l’échantillon et
corrigée des conversions.
278
Annexe 6 : Publications et communications sur ces
travaux de thèse
281
Articles publiés ou à paraître :
- Développement de l’analyse de spéciation du sélénium dans des compléments alimentaires
S. Sannac, F. Pannier, G. Labarraque, P. Fisicaro, M. Potin-Gautier
Accepté et à paraître dans La Revue Française de Métrologie
- Development of a reference procedure for the determination of methylmercury in fish products
S. Sannac, P. Fisicaro, F. Pannier, G. Labarraque, M. Potin-Gautier
Accreditation and Quality Assurance, 2009, 14, 263-267
- Validation of a reference measurement procedure for the assessment of selenomethionine in
nutritional supplements
S. Sannac, F. Pannier, C. Oster, G. Labarraque, P. Fisicaro, M. Potin-Gautier,
Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 2009, 24, 237-241
Actes de congrès :
- Development of a reference procedure for the determination of methylmercury in fish products
P. Fisicaro, S. Sannac, G. Labarraque, F. Pannier, M. Potin-Gautier
International Conference on Metrology of Environmental, Food and Nutritional Measurements,
Budapest (Hongrie), septembre 2008
- Importance de la préparation de l’échantillon pour une analyse de spéciation du sélénium par
HPLC-ID-ICP-MS.
Détermination d’incertitudes du rendement d’extraction au résultat sur la sélénométhionine
S. Sannac, C. Oster, G. Labarraque, G. Hervouët, F. Pannier, M. Potin-Gautier
13ème Congrès International de Métrologie, Lille (France), juin 2008
Communications orales :
- Development of a reference procedure for the determination of methylmercury in fish products
P. Fisicaro, S. Sannac, G. Labarraque, F. Pannier, M. Potin-Gautier
International Conference on Metrology of Environmental, Food and Nutritional Measurements,
Budapest (Hongrie), septembre 2008
282
- Development of a reference method for the analysis of selenomethionine in selenized yeasts
S. Sannac, F. Pannier, G. Labarraque, P. Fisicaro, M. Potin-Gautier
4th International Conference on Trace Element Speciation in Biomedical, Nutritional and
Environmental Sciences, Munich (Allemagne), mai 2008
- Importance de la préparation de l’échantillon pour une analyse de spéciation du sélénium par
HPLC-ID-ICP-MS.
Détermination d’incertitudes du rendement d’extraction au résultat sur la sélénométhionine
S. Sannac, C. Oster, G. Labarraque, G. Hervouët, F. Pannier, M. Potin-Gautier
13ème Congrès International de Métrologie, Lille (France), juin 2007
- Evaluer les incertitudes lors d’analyses de spéciation par HPLC-ID-ICP-MS, application au
sélénium présent dans des levures
S. Sannac, C. Oster, G. Labarraque, G. Hervouët, F. Pannier, M. Potin-Gautier
Spectr’Atom, Pau (France), mai 2007
Communication par affiche :
- Development of a reference method for speciation analysis of methylmercury in fish by HPLC-
ICP-MS and specie specific isotope dilution
S. Sannac, F. Pannier, G. Labarraque, P. Fisicaro, M. Potin-Gautier
European Winter Conference on Plasma Spectrochemistry, Graz (Autriche), février 2009
283
285
Titre : Développement d’un protocole métrologique pour l’analyse de spéciation du sélénium et du
mercure dans des matrices environnementales et agroalimentaires par HPLC-ID-ICP-MS.
Mots clés : spéciation, sélénium, mercure, métrologie, traçabilité, HPLC, ICP-MS, dilution
isotopique.
Résumé : Les éléments pouvant se rencontrer sous différentes formes chimiques, la pleine
évaluation de leur impact passe par la quantification de leurs diverses espèces, en d’autres termes
par la réalisation de leur analyse de spéciation. Au niveau de la législation, cette notion commence
à être prise en compte ce qui entraîne des besoins dans la qualité et la fiabilité de ces analyses.
En association avec l’Université de Pau et des Pays de l’Adour, le Laboratoire National de
Métrologie et d’Essais a donc développé des méthodes qui assurent la relation des mesures au
Système International des unités, c’est à dire leur traçabilité métrologique.
Ce mémoire de thèse présente la mise en place d’un protocole métrologique pour la réalisation
d’une analyse de spéciation. Son application a été réalisée à la mesure de la sélénométhionine
dans des échantillons représentatifs de l’apport en sélénium et pour la détermination du
méthylmercure dans des produits de la mer, caractéristiques de l’exposition au mercure. La
traçabilité des analyses est assurée par i) l’utilisation de la double dilution isotopique comme
méthode de dosage, et ii) le calcul des incertitudes de mesures.
Title : Development of a metrological procedure for the speciation analysis of selenium and
mercury in environmental and food samples by HPLC-ID-ICP-MS.
Abstract: Speciation analysis, i.e. the identification, quantification and characterisation of the
chemical forms of a given element, is one of the key challenges of modern analytical chemistry.
With the legislation evolution, the needs for the achievement of reliable results are required. In
collaboration with the University of Pau, LNE, the French Metrology Institute, has developed
procedures that enable the link of results to the SI units, i.e. metrological traceability.
The work presented in this memory is centred on the development of a metrological procedure for
the realisation of speciation analysis. Appliances are made for the evaluation of selenomethionine
content in samples representative of the selenium intake and for the assessment of methylmercury
in sea products, emblematic of the mercury exposure. Traceability is reached by i) the involvement
of double isotope dilution as the quantification method and ii) the calculation of measurement
uncertainties.