these de doctorat en sciences...

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université d’Alger I Benyoucef Benkhedda

Faculté de Médecine d’Alger

THESE DE DOCTORAT EN SCIENCES MEDICALES

Soutenue par le Dr. Nabila BENAMROUCHE – BENHASSAN

Membres du jury : Pr. Kamal KEZZAL Pr. Kheira RAHAL Pr. Mohamed TAZIR Pr. Zakia ARRADA Pr. Smail MESBAH

Président Directrice Membre Membre Membre

Discipline : MICROBIOLOGIE

Année : 2015

CARACTERISATION PHENOTYPIQUE ET GENOTYPIQUE DE

CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE

SOMMAIRE

i

SOMMAIRE

Numéro de page

Sommaire……….………………………………………………….…………………...

Liste des figures………………………………………………...…………………….

Liste des tableaux…………………………………………….………………..……..

Dédicace………………………………………………………………………………...

Remerciements………………………………………………………………………...

Liste des abréviations et sigles..………………………..…………………...........

Résumé……………………………………………………….…………………………

I. INTRODUCTION…………………………………………………….…………..…...

II. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE………………………………………………….......

II.1. Corynebacterium diphtheriae……………………………………………........

II.1.1. Classification……………………………………………………………..…….

II.1.2. Taxonomie et habitât………………………………………………………….

II.1.3. Historique……………………………………………………………………….

II.1.4. Identification de Corynebacterium diphtheriae………………………….

II.1.4.1. Morphologie……………………………………………………………...……

II.1.4.2. Culture…………………………………………………………………..……..

II.1.4.3. Identification biochimique……………………………………………...…….

II.1.4.4. Structure antigénique…………………………………………………..........

II.1.4.5. Toxine diphtérique………………………………………………..…………..

i

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SOMMAIRE

ii

II.1.4.6. Le génome de Corynebacterium diphtheriae………………………………

II.2. Le typage des souches de Corynebacterium diphtheriae………………..

II.2.1. Électrophorèse en champ pulsé (PFGE)…………………………………..

II.2.2. Ribotypage………………………………………………………………………

II.2.3. Multilocus enzyme electrophoresis (MLEE)………………………………

II.2.4. Multilocus sequence typing (MLST)………………………………….........

II.3. La diphtérie………………………………………………………………………..

II.3.1. La diphtérie classique………………………………………………………...

II.3.1.1. Les symptômes de la diphtérie………………………………………………

II.3.3. La diphtérie cutanée…………………………………………………………..

II.3.3. Les souches de Corynebacterium diphtheriae non

toxinogènes……………...……….......................................................................

II.3.4. La diphtérie animale…………………………………………………………..

II.3.5. Le traitement de la diphtérie…………………………………………………

II.3.6. La prévention de la diphtérie………………………………………………..

II.4. L’épidémiologie de la diphtérie………………………………………………..

II.4.1. Dans le monde……………………………………………………………........

II.4.2. En Algérie……………………………………………………………………….

II.4.3. Les souches de Corynebacterium diphtheriae non

toxinogènes…………………………………………………………………………….

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SOMMAIRE

iii

II.4.4. La caractérisation moléculaire des souches de Corynebacterium

diphtheriae……………………………………………………………………………..

II.4.4.1. La caractérisation moléculaire des souches de Corynebacterium

diphtheriae responsables de diphtérie……………………………………………

II.4.4.2. La caractérisation moléculaire des souches de Corynebacterium

diphtheriae non toxinogènes………………………………………………………..

II.4.5. Sensibilité aux antibiotiques et support génétique de la résistance

aux antibiotiques de Corynebacterium diphtheriae……………………………

II.5. Surveillance de la diphtérie……………………………………………….......

III. PROBLEMATIQUE ET OBJECTIFS………………………………………........

III.1. Problématique……………………………………………………………………

III.2. Objectifs…………………………………………………………………………..

IV. MATERIEL ET METHODES………………………………………………………

IV.1. Matériel d’étude………………………………………………………………….

IV.1.1. Population d’étude……………………………………………………..........

IV.1.2. Critères d’inclusion…………………………………………………………..

IV.1.3. Type d’étude…………………………………………………………………..

IV.2. Méthodes…………………………………………………………………………

IV.2.1. Les isolats cliniques…………………………………………………………

IV.2.2. Culture……………………………………………………………………........

IV.2.3. Technique microscopique : coloration de Gram…………………........

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SOMMAIRE

iv

IV.2.4. Identification biochimique et détermination du biotype……….………

IV.2.5. Détermination du toxinotype………………………………………….........

IV.2.5.1. Détermination du toxinotype par test d’Elek……………………….……...

IV.2.5.2. Détermination du toxinotype par PCR conventionnelle …………………

IV.2.5.3. Détermination du toxinotype par PCR en temps réel………………........

IV.2.6. Détermination des CMIs et étude de la sensibilité aux

antibiotiques……………………………………………………………………..…….

IV.2.7. Etude de la tolérance à la pénicilline……………………………….……..

IV.2.7.1. Détermination de la CMI…………………………………………….………

IV.2.7.2. Détermination de la CMB……………………………………………..…….

IV.2.7.3. Détermination de la tolérance……………………………………...……….

IV.2.8. Recherche de l’intégron de classe 1 par

PCR conventionnelle…………………………………………………………………

IV.2.9. Génotypage par technique MLST……………………………...………….

IV.2.9.1. PCR MLST…………………………………………………………..……….

IV.2.9.2. Séquençage…………………………………………………………………..

IV.2.10. Outils statistiques………………………………………………..………….

IV.2.11. Outils bioinformatiques…………………………………………………….

IV.2.11.1. Bionumerics…………………………………………………………………

IV.2.11.2. eBURST……………………………………………………………………..

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101

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SOMMAIRE

v

V. RESULTATS…………………………………………………………………………

V.1. Caractéristiques générales de la population d’étude……………………..

V.1.1. Analyse démographique……………………………………………………..

V.1.2. Analyse temporo-spatiale……………………………………………...........

V.1.3. Tableaux cliniques…………………………………………………….………

V.1.4. Sites anatomiques………………………………………………….…………

V.2. Caractéristiques phénotypiques des souches……………………..………

V.3. Toxinotypie par PCR en temps réel…………………………………..………

V.4. Sensibilité des souches aux antibiotiques………………………………….

V.5. Tolérance à la pénicilline……………………………………………………….

V.6. Support génétique de la résistance aux antibiotiques……………………

V.7. Caractéristiques génotypiques des souches………………………………

V.7.1. Analyse temporo-spatiale des STs des souches de Corynebacterium

diphtheriae circulants…………………………………………………………………

V.7.2. Analyse phénotypique des sequence types………………………………

V.7.2.1. Relation entre les sequence types et le tableau clinique………………….

V.7.2.2. Relation entre les sequence types et les sites anatomiques…….............

V.7.2.3. Relation entre les sequence types et les biotypes…………………………

V.7.2.4. Relation entre les sequence types et les toxinotypes…………………..

VI. DISCUSSION……………………………………………………………………….

V.1. Caractéristiques générales de la population d’étude…………….……….

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160

SOMMAIRE

vi

VI.1.1. Analyse démographique…………………………………………………….

VI.1.2. Analyse temporo-spatiale…………………………………………….........

VI.1.3. Tableaux cliniques……………………………………………………………

VI.2. Caractéristiques phénotypiques des souches…………………….………

VI.3. Toxinotypie par PCR en temps réel………………………….………………

VI.4. Sensibilité des souches aux antibiotiques………………………..………

VI.5. Tolérance à la pénicilline………………………………………………..........

VI.6. Support génétique de la résistance aux antibiotiques…………..………

VI.7. Caractéristiques génotypiques des souches……………………...……...

VI.7.1. Analyse temporo-spatiale des STs des souches de

Corynebacterium diphtheriae circulants…………………………………………

VI.7.2. Relation entre les sequence types et le tableau clinique……...........

VI.7.3. Relation entre les sequence types et les sites anatomiques……….

VI.7.4. Relation entre les sequence types et les biotypes………...………….

VI.7.5. Relation entre les sequence types et les toxinotypes………………..

VII. CONCLUSION……………………………………………………………………..

VIII. RECOMMANDATIONS…………………………………………………………..

VIII. BIBILIOGRAPHIE…………………………………………………………..........

IX. ANNEXES……………………………………………………………………..........

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218

SOMMAIRE

vii

Liste des figures

Chapitre II

Figure II.1. : Arbre phylogénétique du genre Corynebacterium……..……….

Figure II.2. Gram de C. diphtheriae biotype mitis……………………….………

Figure II.3. Gram C. diphtheriae biotype gravis………………………….………

Figure II.4. Gram de C. diphtheriae biotype belfanti…………………....………

Figure II.5. Colonies de C. diphtheriae sur gélose au sang frais…………….

Figure II.6. Colonies de C. diphtheriae sur milieu Tinsdale……………..........

Figure II.10. La paroi des corynébactéries………………………………............

Figure II.11. Structure tridimensionnelle de la toxine diphtérique…...………

Figure II.12. ADP-ribosylation de EF-2……………………………...…………….

Figure II.13. Processus de translocation et facteurs Sec……………...………

Figure II.14. Activité de la toxine diphtérique dans une cellule

Eucaryote…………………………………………………………………...…………..

Figure II.15. Représentation circulaire du génome de C. diphtheriae

NCTC13129…………………………………………………………………...………...

Figure II.16. Angine diphtérique……………………………………………….......

Figure II.17. Cou proconsulaire ou bull neck………………………….…………

Figure II.18. Diphtérie cutanée……………………………………………...………

Figure II.19. Cas annuels de diphtérie rapportés dans le monde et

couverture par le vaccin DTP3, 1980-2013. Données OMS, 2013……………

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SOMMAIRE

viii

Figure II.20. Couverture vaccinale avec les vaccins contenant le DTP3

chez les enfants, 2013. Données OMS, 2013……………………………………

Figure II.21. CMI du céfotaxime vis-à-vis d’une souche de

C. diphtheriae……...…………………………………………………………………

Figure II.22. CMI de la tétracycline vis-à-vis d’une souche de

C. diphtheriae….……………………………………………………………………..

Figure II.23. CMI du chloramphénicol vis-à-vis d’une souche de

C. diphtheriae.................................................................................................

Chapitre IV

Figure IV.1. Thermocycler GeneAmp PCR System 9700 (Applied

Biosystems)……………………………………………………………………………

Figure IV.2. Appareil Gel Doc XR System (Bio-Rad)……………………………

Figure IV.3. Light Cycler 480 version II (Roche)…………………………………

Figure IV.4a. CMIs de la tétracycline (TC), gentamicine (GM), co-

trimoxazole (TS) et érythromycine (EM) vis-à-vis d’une souche de

C. diphtheriae………………………………………………………………………….

Figure IV.4b. CMIs du céfotaxime (CT), pénicilline G (PG), vancomycine

(VA) et chloramphénicol (CL) vis-à-vis d’une souche de

C. diphtheriae…………………………………………………………………..………

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SOMMAIRE

ix

Figure IV.5. Concentration minimale inhibitrice de la pénicilline vis-à-vis

d’une souche de C. diphtheriae……………………………………………………

Figure IV.6. Concentration minimale bactéricide de la pénicilline vis-à-vis

d’une souche de C. diphtheriae…………………………………………………….

Figure IV.7. PCR MLST de souche de C. diphtheriae…………………………...

Figure IV.8. Centrifugeuse pour microplaques 2-16K (SIGMA)……………….

Figure IV.9. Analyseur génétique ABI 3130 (Applied Biosystems)…………..

Figure IV.10. Analyse d’une séquence d’ADN de souche de

C. diphtheriae………………………………………………………………………….

Figure IV.11. Base de données MLST de C. diphtheriae………..……………..

Chapitre V

Figure V.1. Caractéristiques démographiques des patients……..…………...

Figure V.2. Distribution par période de la population d’étude (n=150)……..

Figure V.3. Distribution géographique de la population d’étude (n=150)…..

Figure V.4. C. diphtheriae biotype mitis sur système Api Coryne……………

Figure V.5. C. diphtheriae biotype gravis sur système Api Coryne………….

Figure V.6. C. diphtheriae biotype belfanti sur système Api Coryne…………

Figure V.7. Répartition des souches selon le biotype et le toxinotype

(n=150)…………………………………………………………………………………..

Figure V.8. Souche de C. diphtheriae toxinogène sur milieu Elek…….........

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SOMMAIRE

x

Figure V.9. PCR du gène tox de souches de C. diphtheriae………………….

Figure V.10. Répartition des souches selon le biotype et la période

(n=150)……………………………………………………………………………………

Figure V.11. Répartition des souches selon le toxinotype et la période

(n=150)…………………………………………………………………………..………

Figure V.12a. PCR en temps réel du gène tox (sous-unité A) de souches de

C. diphtheriae………………………………………...………………………………..

Figure V.12b. PCR en temps réel du gène tox (sous-unité B) de souches de

C. diphtheriae………………………………………………………...………………..

Figure V.13. PCR intégron de classe I……………………………...……………..

Figure V.14. Répartition des souches par sequence type

(n=76)…………………………………………………………………………………….

Figure V.15. Répartition des souches par sequence type et par

Période (n=76)………………………………………………………………………….

Figure V.16. Répartition des souches par sequence type et par tableau

clinique (n=76)………………………………………………………………………….

Figure V.17. Répartition des souches par sequence type et par site

anatomique (n=76)…………………………………………………………………….


Biotype (n=76)………………………………………………………………………….

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SOMMAIRE

xi

Figure V.19. Répartition des souches par sequence type et par toxinotype

(n=76)…………………………………………………………………...……………….

Figure V.20. Arbre phylogénétique des 76 souches de C. diphtheriae….....

Figure V.21. Minimum spanning tree des 76 souches de C. diphtheriae…..

157

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SOMMAIRE

xii

Liste des tableaux

Chapitre V

Tableau V.1. Répartition temporo-spatiale des patients (n=150)……………..

Tableau V.2. Répartition des patients par wilaya (n=150)………………………

Tableau V.3. Répartition des patients selon le tableau clinique (n=150)……

Tableau V.4. Comparaison des deux techniques de détermination du

pouvoir toxinogène : Elek et PCR conventionnelle (n=150)……………………

Tableau V.5. Répartition des souches par biotype et

région sanitaire (n=150)………………………………………………………………

Tableau V.6. Répartition des souches par biotype et par wilaya (n=150)…..

Tableau V.7. Répartition des souches selon le toxinotype et la région

sanitaire (n=150)……………………………………………………………………...

Tableau V.8. Répartition des souches par toxinotype et par wilaya

(n=150)…………………………………………………………………………………..

Tableau V.9. Comparaison de la PCR conventionnelle et la PCR en temps

réel (n=30)………………………………………………………………………………

Tableau V.10. Valeurs limites des souches de référence……………………..

Tableau V.11. Intervalle des CMIs, CMI 50% et CMI 90% des souches de

C. diphtheriae (n=150)………………………………………………………………...

Tableau V.12. Fréquence de sensibilité et de résistance des souches aux

antibiotiques (n=150)………………………………………………………………….

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SOMMAIRE

xiii

Tableau V.13. Fréquence des antibiotypes (n=150)……………………………..

Tableau V.14. Tolérance à la pénicilline des souches de

C. diphtheriae (n=30)………………………………………………………………….

Tableau V.15. Répartition des souches par sequence type et par région

sanitaire (n=76)………………………………………………………………….……..

Tableau V.16. Répartition des souches par sequence type et par wilaya

(n=76)……………………………………………………………………………………..

Chapitre VI

Tableau VI.1. Répartition des STs responsables d’épidémies………………...

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175

xiv

Cette thèse est dédiée à la mémoire de mon père, à ma chère

mère, à mon mari,

à mes frères et sœurs : Djamel, Hakim, Rabéa, Hacina, Faiza,

Leila, Nora et Naima,

à mes amies : Amina, Assia et Leila

et à mes chers neveux et nièces : Lotfi, Sid Ahmed, Rafik,

Hanane et Yasmine

xv

REMERCIEMENTS

A Madame le Professeur Kheira Rahal, mon maître et ma directrice de

thèse au laboratoire de Bactériologie Médicale, tout en donnant

l’exemple, pour m’avoir initié à la recherche et à la rigueur scientifique,

appris à aller jusqu’au bout et pour m’avoir accordé cet axe de recherche

et de m’avoir guidé. Qu’elle trouve ici tout mon respect, ma

reconnaissance et ma profonde gratitude.

Au Président du jury, Professeur Kamel Kezzal, Directeur Général de

l’Institut Pasteur d’Algérie, pour avoir accepté d’être président de jury et

pour sa disponibilité malgré ses nombreuses occupations. Avec toute

ma gratitude et ma reconnaissance.

xvi

Aux autres membres du jury, les Professeurs Mohamed Tazir (Chef du

Service de Microbiologie, CHU Mustapha), Zakia Arrada (Chef du service

de Pédiatrie, CHU Parnet) et Smail Mesbah (Directeur Général de la

Prévention et de la Promotion de la Santé, MSPRH), pour avoir fait partie

de mon jury de thèse, accepter de lire et d’évaluer mon travail.

A madame le Pr. Nicole Guiso, responsable du Centre National de

Référence des corynébactéries du complexe diphtheriae à l’Institut

Pasteur de Paris, pour m’avoir accueillie dans son laboratoire et m’avoir

donné l’occasion de travailler avec ses collaborateurs.

A Mr. Edgar Badell Ocando du Centre National de Référence des

corynébactéries du complexe diphtheriae à l’Institut Pasteur de Paris,

pour m’avoir permis d’acquérir la technique MLST, m’avoir initié à

l’utilisation du logiciel de bioinformatique Bionumerics et à l’analyse des

résultats de séquençage.

xvii

Mes remerciements vont également

Au Pr. Akila Benslimani (Laboratoire Central, EHS Dr. Maouche) pour

m’avoir toujours encouragé et pour ces précieux conseils pour

l’aboutissement de ce travail.

Au Dr. Hassiba Tali Maamar, chef du laboratoire de Bactériologie

Médicale, pour ses encouragements et son soutien particulièrement

durant la période de finalisation de la thèse, nous avons eu à vivre

ensemble cette expérience inoubliable qu’est l’achèvement d’une thèse.

Merci.

A tous mes collègues du laboratoire de Bactériologie Médicale, en

particulier Mme Malika Lazri, Mme Sonia Hasnaoui, Mme Badia Guettou

et Mme Farida Assaous.

A tous ceux ou celles qui ont participé de prés ou de loin à la finalisation

de cette thèse.

xviii

LISTE DES ABREVIATIONS ET SIGLES

µl Microliltre

ACIP Actions Concertées Internationales Pasteuriennes

ADN Acide désoxyribonucléique

ADP Adénosine Di Phosphate

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

ARN Acide ribonucléique

ARNr Acide ribonucléique ribosomal

ATCC American Type Culture Collection

ATP Adénosine Tri Phosphate

ATPase Adénosine Tri Phosphatase

BET Bromure d’ethidium

C3G

CDSs

CLSI

Céphalosporines de 3ème Génération

Coding DNA Sequences

Clinical and Laboratory Standards Institute

CMB Concentration minimale bactéricide

CMI Concentration minimale inhibitrice

Ct Cycle threshold

CTP Cytosine Tri Phosphate

dATP Désoxy Adénosine Tri Phosphate

dCTP Désoxy Cytosine Tri Phosphate

ddATP Didésoxy Adénosine Tri Phosphate

ddCTP Didésoxy Cytosine Tri Phosphate

ddGTP Didésoxy Guanosine Tri Phosphate

ddTTP Didésoxy Thionine Tri Phosphate

dGTP

DLV

Désoxy Guanosine Tri Phosphate

Double Locus Variant

DSP Direction de la Santé et de la Population

dTTP Désoxy Thionine Tri Phosphate

xix

ECDC

EDTA

European Center for Disease And Prevention Control

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

EF-2 Elongation Factor-2

ET Electrophorétype

et coll et collaborateurs

GHT

GC%

Gélose Hémoglobine Tellurite

Guanosine Cytosine percent

GTP Guanosine Tri Phosphate

INSP Institut National de Santé Publique

IPA

j

Institut Pasteur d’Algérie

Jour

kb

kDa

kg

Kilobase

Kilodalton

Kilogramme

LCR Liquide céphalo-rachidien

MDR

mg

Multi Drug Resistance

Milligramme

ml

mm

mM

mn

Millilitre

Millimètre

Millimolaire

Minute

MLEE Multi Locus Enzyme Electrophoresis

MLST Multi Locus Sequence Typing

MSPRH Ministère de la Santé, de la Population et de la Réforme Hospitalière

N Nombre

NAD Nicotinamide adénine Dinucléotide

NCTC National Collection of Type Cultures

NIBSC

ng

National Institute of Biological Standards and Control

Nanogramme

NTTB Non Toxigenic Tox gene Bearing

https://www.google.dz/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&cad=rja&uact=8&ved=0CCYQFjAB&url=https%3A%2F%2Fen.wikipedia.org%2F%3Ftitle%3DEthylenediaminetetraacetic_acid&ei=uYuCVYzHFoGoUpj3gdAP&usg=AFQjCNGrAp2rsYlA7XszfUJsnhGOJBYtQA&bvm=bv.96041959,d.d24

xx

OMS Organisation Mondiale de la Santé

pb Paire de base

PCR Polymerase Chain Reaction

PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis

PT Pulsotype

PW8 Park Williams 8

RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RT Ribotype

SDF

SLV

Sans domicile fixe

Single Locus Variant

ST Sequence type

TAE Tris Acétate EDTA

TD Toxine diphtérique

TTP Thionine Tri Phosphate

UI Unité Internationale

URSS

V

Union des Républiques Socialistes Soviétiques

Volt

RESUME

xxi

RESUME

Une étude portant sur 150 souches de Corynebacterium diphtheriae collectées entre

1993 à 2013 chez des patients atteints de diphtérie ou d’ozène, incluant les périodes

épidémique et post-épidémique a été conduite. L’analyse de 76 isolats par MLST en

utilisant 7 loci (atpA, dnaE, dnaK, fusA, leuA, odhA et rpoB) a identifié un génotype

particulier (ST-116), associé à la période épidémique qui semble caractéristique de

notre pays et n’a pas encore été décrit dans d’autres régions du monde. La période

post-épidémique a été caractérisée par une plus grande diversité des génotypes

circulants. Aucune corrélation entre le ST et la zone géographique ou le toxinotype

n’était observée. Contrairement aux souches de biotype mitis et gravis, les souches

de biotype belfanti étaient distinctes phylogénétiquement. Ces dernières

appartenaient à des STs étroitement liés, regroupés dans un sous-groupe

phylogénétiquement distinct et isolées exclusivement chez des patients souffrant

d’ozène. La détermination des CMIs de la pénicilline, céfotaxime, érythromycine,

tétracycline, chloramphénicol et co-trimoxazole par la méthode du E-test a montré

que toutes les 150 souches étaient sensibles à la pénicilline et à l’érythromycine. La

majorité des isolats était résistante au céfotaxime, à la tétracycline et au

chloramphénicol. Cependant, toutes les souches de biotype belfanti étaient sensibles

à la tétracycline et le chloramphénicol.

C’est la première étude analysant par l’outil moléculaire, MLST les isolats algériens

de C. diphtheriae. Il est indispensable de continuer à surveiller les souches

circulantes pour détecter une éventuelle émergence de clone épidémique et évaluer

la diversité génétique des souches et leur évolution temporo-spatiale.

Mots clés : Corynebacterium diphtheriae, biotype, toxine, MLST, sensibilité aux

antibiotiques, Algérie

RESUME

xxii

ABSTRACT

A study of 150 Corynebacterium diphtheriae strains collected from 1993 to 2013 in

patients with diphtheria or ozena, including epidemic and post-epidemic periods was

conducted. The analysis of 76 isolates by MLST using 7 loci (atpA, dnaE, dnaK, fusA,

leuA, odhA and rpoB) identified a particular genotype (ST-116) associated with

epidemic period that seems characteristic of our country and has not yet been

described in other parts of the world. The post-epidemic period was characterized by

more diversity of circulating genotypes. No correlation between ST and the

geographical area or toxinotype was observed. Unlike biovar gravis and mitis strains,

the biovar belfanti strains were phylogenetically distinct. These strains belonged to

closely related STs, grouped in a phylogenetically distinct subgroup and isolated

exclusively in patients with ozena.

The determination of the MICs of penicillin, cefotaxime, erythromycin, tetracycline,

chloramphenicol and co-trimoxazole by E-test method showed that all 150 strains

were susceptible to penicillin and erythromycin. The majority of isolates were

resistant to cefotaxime, tetracycline and chloramphenicol. However, all belfanti

strains were susceptible to tetracycline and chloramphenicol.

This is the first molecular study, analyzing by MLST the Algerian C. diphtheriae

isolates. It is necessary to continue monitoring circulating strains to detect any

emergence of epidemic clone and assess genetic diversity of the strains and their

evolution in time and space.

Key words: Corynebacterium diphtheriae, biovar, toxin, MLST, antimicrobial

susceptibility, Algeria

I. INTRODUCTION

INTRODUCTION

1

I. INTRODUCTION

Corynebacterium diphtheriae est l’agent responsable de la diphtérie, maladie

évitable par la vaccination. Typiquement, la diphtérie respiratoire classique se

présente sous forme d’une angine à fausse membrane. L’extension loco-

régionale de la pseudomembrane (croup) et le syndrome toxinique associé

signent la gravité de cette infection.

Quatre biotypes sont décrits : gravis, mitis, intermedius et belfanti, tous les

biotypes excepté le biotype belfanti peuvent produire l’exotoxine diphtérique.

Le biotype gravis est classiquement responsable des formes graves ainsi que

des infections associées (streptocoques), alors que le biotype mitis est

responsable des formes modérées. Le biotype belfanti est impliqué dans la

rhinite atrophique primitive ou ozène ; très souvent en association avec

d'autres bactéries notamment Klebsiella pneumoniae ozaenae. Un tropisme

respiratoire a été rapporté pour ce biotype.

Bien que la diphtérie soit une maladie qui est contrôlée aujourd’hui grâce à la

vaccination massive, elle reste endémique dans plusieurs pays d’Asie, de

Moyen-Orient, d’Afrique, d’Europe de l’Est et d’Amérique du Sud, responsable

surtout d’infections cutanées. Cependant, depuis 2010 de larges épidémies

sont survenues au Brésil, en Thailande, en Indonésie, au Laos et en Inde.

INTRODUCTION

2

Dans les pays industrialisés où la maladie est contrôlée, ce sont surtout les

infections dues aux souches de C. diphtheriae non toxinogènes qui sont

observées. Cependant, la diphtérie tend à réapparaitre dans ces pays, très

souvent liée à des cas importés, à l’occasion de retour de voyageurs se

rendant en zones endémiques ou d’afflux de réfugiés venus aussi des pays

endémiques.

En Algérie, bien que la maladie est actuellement contrôlée (aucun cas de

diphtérie n’a été enregistré depuis 2007), grâce à la couverture vaccinale

élevée chez les enfants et les adultes ; le risque de réapparition de la diphtérie

n’est pas à écarter et la vigilance est requise. En effet, de part sa situation

géographique, limitrophe de pays où la maladie est endémique, l’Algérie

constitue d’une part une destination des immigrants venus d’Afrique et d‘autre

part une zone de transit d’une partie de ces immigrants vers l’Europe.

De plus, dans le contexte d’instabilité connu par plusieurs pays du Moyen-

Orient et d’Afrique, le pays est aussi une destination des réfugiés et

demandeurs d’asile.

Un des éléments clés de la surveillance de la maladie est la surveillance des

souches circulantes grâce à l’épidémiologie moléculaire. En effet, le typage

moléculaire des souches de C. diphtheriae permet d’une part d’identifier les

souches en circulation et de suivre leur évolution temporo-spatiale et d’autre

INTRODUCTION

3

part de distinguer les cas endémiques, potentiellement épidémiques,

autochtones et importés et aussi de mieux comprendre et surveiller les modes

de transmission de la diphtérie.

Ces éléments d’information permettent d’améliorer le système de surveillance

de la maladie et de mettre en place les moyens de prévention adaptés.

En Algérie, aucune étude relative à l’épidémiologie moléculaire de

C. diphtheriae durant les périodes épidémique et post-épidémique n’a été

menée en Algérie. Il n’existe pas de données sur la circulation des souches et

des génotypes de C. diphtheriae. Une surveillance continue des génotypes

circulants est importante pour identifier l’origine des souches circulantes et les

clones épidémiques et d’évaluer la diversité génétique des isolats et leur

évolution temporo-spatiale.

L’objectif principal de notre étude est de caractériser les souches de

C. diphtheriae collectées durant les périodes épidémique et post-épidémique

sur une période de 21 ans en utilisant l’outil moléculaire, la MLST.

II. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

4

II. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

II.1. Corynebacterium diphtheriae

II.1.1. Classification

Selon la dernière édition 2012 du Bergey’s manual (1),

C. diphtheriae appartient au :

Domaine : Bacteria

Phylum : Actinobacteria

Classe : Actinobacteria

Ordre : Corynebacteriales

Famille : Corynebacteriaceae

Genre : Corynebacterium

II.1.2. Taxonomie et habitat

Le genre Corynebacterium comporte 88 espèces (Figure II.1), dont 53 d’intérêt

médical, causant occasionnellement ou très rarement des infections chez

l’homme ou sont transmises à l’homme par contact avec un animal (2).

Corynebacterium diphtheriae constitue l’espèce type. Celle-ci est aussi

considérée comme étant étroitement liée à C. ulcerans et

C. pseudotuberculosis ; toutes ces trois espèces peuvent héberger le gène

tox, sont pyrazinamidase négative et sont rattachées au Corynebacterium du

groupe ou complex diphtheriae. En effet, l’analyse phylogénétique de l’ARNr


5

16S a révélé que C. diphtheriae possède une similarité de séquence avec

C. pseudotuberculosis et C. ulcerans avec 98,5% d’homologie (3).

Le réservoir de C. diphtheriae est principalement humain, la bactérie colonise

habituellement les voies respiratoires supérieures et les lésions cutanées.

Cependant les animaux semblent jouer aussi un rôle de réservoir de

C. diphtheriae. Des isolats de C. diphtheriae ont été rapportés chez des chats

domestiques, des vaches et des chevaux (4).


6

Figure II.1. Arbre phylogénétique du genre Corynebacterium. Goodfellow

et coll, 2012 (1).


7

II.1.3. Historique

La diphtérie était décrite pour la première fois par Bretonneau en 1815, qui

constate qu’elle débute toujours par une angine pseudomembraneuse et

l’appelle « diphtérie » (de diphtera : peau ou membrane).

Avant cette date, la maladie était connue sous différents noms à travers le

monde. Son ancienne dénomination était « strangling angel of children » ou

« l’ange étranglant les enfants ». En Angleterre, elle était connue sous le nom

de « Boulogne sour throat » ou « gorge aigre de Boulogne », la maladie

s’étant répandue en Angleterre depuis la France.

L’agent causal est mis en évidence pour la première fois par Klebs en 1883

qui observe des bacilles au niveau des fausses membranes d’un patient

atteint de diphtérie. Lœffler, en 1884, les cultive sur sérum coagulé, démontre

leur rôle dans l’étiologie de la diphtérie et suggère l’existence et la diffusion

dans l’organisme d’une toxine qui serait responsable des lésions tissulaires

étendues. En 1888, Roux et Yersin montrent que les filtrats obtenus à partir de

cultures de bacilles diphtériques provoquent la mort de l’animal en

reproduisant chez lui les signes essentiels de la maladie naturelle. Von

Behring et Kitassato en 1890 découvrent les propriétés antitoxiques du sérum

de cobaye vacciné avec une culture chauffée de bacille diphtérique. Roux,

Martin et Chailloux en 1894 appliquent la sérothérapie à l’homme. Ramon en

1923 met au point l’anatoxine utilisée pour la vaccination en traitant la toxine


8

par le formol et la chaleur. En 1951, Freeman découvre que seules les

souches de C. diphtheriae lysogènes pour un bactériophage tempéré porteur

du gène tox, le phage β, sont capables de produire la toxine. Enfin, les

dernières années, le mécanisme d’action moléculaire de la toxine diphtérique

est précisé (4, 5, 6, 7).

II.1.4. Identification de Corynebacterium diphtheriae

II.1.4.1. Morphologie

C. diphtheriae se présente sous forme de bâtonnets fins (0,3 à 0,8 µm de

diamètre) droits ou légèrement incurvés, de longueur variable (1 à 8 µm).

Ces bacilles sont associés en paires, dont les extrémités sont plus ou moins

effilées ou renflées, donnant un aspect en massue caractéristique.

Ils forment un angle plus ou moins ouvert, prenant un aspect en lettres

majuscules (L, M, N, V), en chiffres romains ou encore en caractères chinois

(Figures II.2, II.3 et II.4). Cette disposition s’explique par le mécanisme de

séparation par cassure asymétrique, les bactéries restant souvent accolées au

niveau de cette zone de cassure. Elles peuvent également se disposer en

palissade.

C. diphtheriae est immobile, non sporulé, non capsulé. C’est un bacille à Gram

positif mais résiste mal à une décoloration prolongée par l’alcool (Gram

variable). Ce caractère permet de le distinguer des corynebactéries

pseudodiphtériques qui sont fortement à Gram positif. Cultivé sur sérum


9

coagulé riche en phosphate, C. diphtheriae présente des granulations

métachromatiques ou grains de volutine qui peuvent être mises en évidence

par la coloration au bleu de méthylène, au bleu de toluidine ou par la

coloration d’Albert. Ces granulations, plus nombreuses chez C. diphtheriae,

sont des grains de polymétaphosphates représentant une forme de stockage

de phosphates inorganiques par la bactérie se développant dans un milieu

nutritif insuffisant. Le contenu G+C p. cent se situe autour de 55 (4, 5, 6, 7).

Figure II.2. Gram de C. diphtheriae biotype mitis

Laboratoire de Bactériologie Médicale, IPA


10

Figure II.3. Gram C. diphtheriae biotype gravis


Figure II.4. Gram de C. diphtheriae biotype belfanti



11

II.1.4.2. Culture

C. diphtheriae est aéro-anaérobie facultatif. Il se développe de façon optimale

en aérobiose à une température de 36-37°C, à un pH avoisinant 7,4. C’est une

bactérie exigeante, nécessitant de nombreux facteurs de croissance (acides

aminés et coenzymes). Elle pousse mal sur gélose ordinaire.

Sa croissance est accélérée par addition de sérum ou de sang. Sur gélose

additionnée de sang de mouton ou de cheval, les colonies sont lisses,

blanchâtres à grisâtres atteignent 1 à 3 mm en 24 h et présentent

classiquement un aspect en « taches de bougie ». Elles sont parfois entourées

d’une étroite zone d’hémolyse (Figure II.5).

Sur milieu enrichi : sérum de bœuf coagulé glucosé ou milieu de Loeffler,

C. diphtheriae se multiplie en 15 à 18 h. Il donne de petites colonies de 1 à 2

mm de diamètre, lisses, crémeuses et grisâtres, devenant légèrement

saillantes, en taches de bougie.

Sur milieu sélectif, milieu modifié GHT (Gélose Hémoglobine Tellurite),

C. diphtheriae réduit en tellure le tellurite de potassium contenu dans le milieu,

donnant aux colonies une couleur noire. L’aspect des colonies sur milieu au

tellurite a permis de décrire trois types culturaux distincts appelés gravis, mitis

et intermedius.


12

Ces trois types de colonies correspondent à des biotypes ayant des

caractères morphologiques et biochimiques propres et un pouvoir pathogène

d’intensité variable.

Le biotype gravis comprend des bacilles courts, irréguliers. Sur milieu au

tellurite, les colonies sont à centre noir et périphérie plus claire, à bord crénelé

irrégulier, atteignant 2 à 3 mm de diamètre en 24 h. La culture en bouillon de

ces souches est granuleuse et forme une pellicule en surface. Ces souches

ont été isolées à partir d’affections sévères.

Le biotype mitis correspond à des bacilles longs, incurvés, pléomorphes, très

granuleux. Il donne sur milieu au tellurite des colonies lisses, convexes, de

couleur gris foncé à noir, relativement homogènes, à bord régulier, atteignant

1 à 2 mm en 24 h. La culture en bouillon est homogène avec un voile fin. Ces

bactéries seraient le plus souvent associées à des localisations laryngées et à

des formes d’infections bénignes ; la plupart des souches non toxinogènes de

C. diphtheriae appartiennent au biotype mitis.

Le biotype intermedius correspond à des bacilles longs, peu granuleux. Les

colonies sont très petites, inférieures à 1 mm de diamètre en 24 h, noirâtres,

lisses ou rugueuses, ressemblant au biotype mitis. La culture en bouillon est

finement granuleuse. Ces formes seraient associées à des infections de

sévérité intermédiaire. Enfin des souches appartenant à chacun des trois

biotypes peuvent produire une toxine identique.


13

Sur milieu Tinsdale, dérivé du milieu GHT auquel sont rajoutés de la cystine et

du thiosulfate de sodium. C. diphtheriae en présence de thiosulfate est

capable de produire de l’H2S se traduisant par l’apparition, en 24 à 48 h, voire

72 h d’un halo brun noir autour des colonies qui elles-mêmes sont noires en

raison de la réduction du tellurite. C. diphtheriae est cystinase positive (Figure

II.6) (4, 5, 6, 7).

Figure II.5. Colonies de C. diphtheriae sur gélose au sang frais



14

Figure II.6. Colonies de C. diphtheriae sur milieu Tinsdale


II.1.4.3. Identification biochimique

C. diphtheriae fermente, sans production de gaz, le glucose, le galactose, le

maltose et la dextrine. La production d’acide à partir du sucrose peut aussi

s’observer, notamment pour certaines souches de C. diphtheriae (8).

C. diphtheriae ne fermente pas le lactose, le mannitol, le tréhalose, le xylose,

ni habituellement le saccharose. Certaines souches hydrolysent l’amidon et le

glycogène (biotype gravis).

C. diphtheriae ne dégrade pas l’urée, ne liquéfie pas la gélatine et ne produit

pas d’indole. Il produit de l’H2S. C. diphtheriae réduit les nitrates en nitrites


15

sauf certaines souches (biotype belfanti). Il possède une catalase ainsi que

des cytochromes a, b, c. Il possède en outre une désoxyribonucléase et une

neuraminidase liées à la membrane. Certains types sérologiques possèdent

des hémolysines non diffusibles, actives sur les hématies de cobaye et à un

degré moindre sur les hématies de lapin et de mouton (4, 7).

II.1.4.4. Structure antigénique

C. diphtheriae possède plusieurs types d’antigènes. Les antigènes O de

nature polyosidiques thermostables sont communs à toutes les

corynébactéries.

Les antigènes K variables et thermolabiles sont des protéines de surface

spécifiques de type. Ils sont importants pour la fixation aux muqueuses.

Le pouvoir invasif est facilité par le « cord factor », un glycolipide toxique.

Ils jouent un rôle dans la virulence du germe en participant à l’immunité

antibactérienne, ainsi que dans les réactions allergiques parfois observées au

cours de la réaction de Schick (5).

- La paroi

Elle est constituée d’un complexe de polymères composé de peptidoglycane,

d’arabinogalactane et d’acides mycoliques (Figure II.10).

Le peptidoglycane contient de l’acide méso-diaminopimélique, lié de manière

covalente à de l’arabinogalactane, lui-même lié à des acides mycoliques,

longues chaînes d’acides gras (9, 10, 11). Cette paroi a la caractéristique


16

d’être très riche en lipides qui se présentent en une double couche lipidique

(acides mycoliques et autres lipides), formant une barrière.

De récentes études ont démontré la présence de récepteurs à lectine avec

pour terminaison du N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, galactose,

mannose et d’acide sialique (ou acide N-acetylneuraminique) à la surface de

la bactérie. Ces sucres semblent se comporter comme des adhésines (12, 13)

et l’acide sialique aurait un rôle dans l’évasion de la bactérie du système

immunitaire. Une faible disponibilité en fer module les propriétés adhésives et

l’expression des fractions carbo-hydrates à la surface de la bactérie (14).

La production d’un mucus extracellulaire, un polymère de carbohydrates à

haut poids moléculaire, a été également décrite et reliée à l’adhésion et à la

pathogénicité de la bactérie car elle permet la formation de biofilm (15). Les

souches produisant ce mucus sont responsables des infections respiratoires

(biotype fermentant le sucrose) alors que celles n’en produisant pas sont

responsables de la colonisation des lésions cutanées (16, 17). Il a été

démontré qu’une limitation en fer inhibait la production de ce mucus par les

souches de biotype fermentant le sucrose (14).

Des polysaccharides sont présents à la surface et sont également impliqués

dans les processus d’adhésion et d’hémagglutination (12, 18).


17

Figure II.10. La paroi des corynébactéries. Burkovski et coll, 2013 (19).

LM : lipomannan

LAM : lipoarabinomannan


18

- Les pili ou fimbriae

Les pili ou fimbriae sont des protéines filamenteuses, médiateurs de

l’adhésion et de la colonisation des tissus de l’hôte (20). Ils peuvent également

interagir avec d’autres bactéries pour créer des biofilms (21), être impliqués

dans la translocation de l’ADN à travers les membranes biologiques (22, 23) et

peuvent servir de récepteurs aux phages (24). Il a été démontré que les pili

étaient impliqués dans l’attachement des corynébactéries aux cellules

épithéliales (25).

- Les adhésines

Durant les dernières décades, la recherche des facteurs microbiens

responsables du caractère invasif de C. diphtheriae a été initiée.

Les propriétés invasives et toxigéniques sont indépendantes l’une de l’autre

(26, 27, 28). La MLST a renforcé cette hypothèse du fait que les souches

invasives peuvent être trouvées dans différents complexes clonaux (29).

Les souches de C. diphtheriae sont capables d’adhérer aux macrophages

U937 induisant une nécrose et une apoptose. Ces deux activités sont

indépendantes de l’expression de la toxine diphtérique (30).

Aussi, il a été montré que les propriétés adhésives des souches sont

indépendantes de la production de la toxine. C. diphtheriae exprime des

protéines de surface capables de reconnaître et de se fixer aux récepteurs des

cellules de l’hôte (notamment les érythrocytes). Une protéine DIP0733


19

(combinaison de deux polypeptides de 67 et 72 kDa) a été identifiée et joue le

rôle d’adhésine (31). DIP0733 contribue à l’invasion bactérienne et l’apoptose

des cellules épithéliales. C. diphtheriae est capable d’adhérer au fibrinogène

et cette propriété peut être liée à la formation de la pseudomembrane.

La pseudomembrane est composée de bactéries, de cellules épithéliales

nécrotiques et inflammatoires, intégrées dans une matrice de fibrine qui

adhère fermement au tissu sous-jacent (32). Aussi bien, les souches

toxinogènes que non toxinogènes sont capable de s’agréger en présence de

plasma de lapin et de se lier au fibrinogène. Cette capacité d’adhésion est

moins intense chez les souches toxinogènes (31).

C. diphtheriae exprime à sa surface le Lipoarabinomannan-like lipoglycan

(CdiLAM) capable de médier l’adhérence bactérienne aux cellules épithéliales

humaines (33).

- Produits élaborés

C. diphtheriae possède une activité neuraminidase à sa surface. Les

neuraminidases (notamment la trans-sialidase), enzymes de type

glycoprotéines antigéniques ont la capacité de modifier la capacité de l’hôte à

répondre à l’infection. Leur production est indépendante de la toxigénicité des

souches (13, 26).


20

II.1.4.5. Toxine diphtérique

- Structure de la TD

C’est une protéine unique, identique pour toutes les souches de C. diphtheriae

toxinogènes, responsable des lésions diffuses de la maladie. Il s’agit d’une

exotoxine protéique panthrope. Elle contient 536 acides aminés et est

synthétisée sous la forme d’un peptide précurseur (proenzyme) de 62 kDa qui

est activé par clivage en deux sous-unités A et B (associées par un pont

disulfure (4) :

La sous-unité A : support de l’activité toxique ADP-ribolysation (environ 21

kDa). Cette sous-unité est très stable.

La sous-unité B : permet la fixation de la toxine sur le récepteur cellulaire

(environ kDa). Celle-ci est très instable.

Les deux sous-unités sont reliées par une liaison peptidique et un pont

disulfure.

Cette proenzyme comprend 3 domaines (Figure II.3) :

Un domaine de fixation aux récepteurs (R)

Un domaine hydrophobe de translocation à travers la membrane endosomale

(T)

Un domaine enzymatique (la sous-unité A ou domaine C)

La conformation tridimensionnelle des domaines de la toxine diphtérique est

en Y (Figure II.11), le domaine T formant la partie inférieure, les domaines C


21

et R formant les « bras » du Y. Le site actif de la sous-unité A est masqué par

le domaine R, expliquant pourquoi la toxine doit être clivée pour exercer son

activité enzymatique (34). Le domaine T est un assemblage d’hélices α et le

domaine R de feuillets β aplanis. Le domaine C est formé de 2 feuillets β et de

7 hélices α (35).


22

Figure II.11. Structure tridimensionnelle de la toxine diphtérique.

Source : Protein Data Bank

(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do).


23

- Synthèse de la TD

Celle-ci dépend de deux facteurs essentiels, la lysogénie de la souche et la

composition du milieu (rôle du fer).

Seules les souches de C. diphtheriae possédant un génome de bactériophage

porteur du gène de structure tox sont capables de produire la toxine

diphtérique.

La production de la toxine par C. diphtheriae a été initialement observée chez

des souches lysogènes pour le phage β. D’autres phages peuvent porter le

gène tox. Il s’agit de phages à ADN bicaténaire. L’intégration du prophage

dans les souches toxinogènes de C. diphtheriae se fait de façon stable.

C. ulcerans et C. pseudotuberculosis peuvent aussi être infectés par des

phages tox+ et produire de la toxine diphtérique. Si la présence du gène tox

est indispensable à la production de toxine, c’est la bactérie-hôte qui va

déterminer le taux de toxine produit. La concentration en fer du milieu joue le

rôle de facteur limitant. La concentration en fer assurant une toxinogénèse

optimale (100 µg/l) est très différente de celle permettant une croissance

optimale de la bactérie. Le taux de fer donnant cette croissance optimale

supprime la production de toxine. Inversement, c’est au moment où le fer

exogène est pratiquement épuisé que la toxine diphtérique est produite en

quantité importante (pouvant aller jusqu'à 5% des protéines synthétisées).


24

L’expression de la toxine diphtérique est aussi dépendante de gènes

chromosomiques. Dans le cas où les concentrations intracellulaires en fer sont

basses, le gène régulateur dtxR est inhibé, résultant de l’augmentation de la

production de la TD par les souches de C. diphtheriae (4, 5).

La toxine diphtérique est synthétisée sous la forme d’un précurseur de 66/68

kDa, constitué de la protéine mature (62 kDa) et d’un peptide signal de 25

acides aminés (36, 37).

Le peptide signal est constitué :

D’une région N-terminale, chargée positivement, reconnue par la protéine

SRP54 (SRP : Signal Recognition Particle) ;

D’une région hydrophobe (10-15 acides aminés), formant une hélice α

susceptible de traverser la membrane ;

D’une région C-terminale incluant une séquence consensus (en général Ala-X-

Ala) pour le site de clivage.

La pré-toxine est sécrétée de manière co-traductionnelle, la translocation est

initiée avant sa complète traduction. Elle emprunte la voie « Sec-

dépendante », qui permet la translocation de protéines nouvellement

synthétisées et qui vont acquérir leur structure finale plus tard.


25

Le système Sec comprend différents acteurs :

- SecA : ATPase qui dirige le précurseur dans et à travers la membrane

- SecYEG : trois protéines intégrales de la membrane constituant le canal

(38). L’association de SecA et SecYEG constitue la translocase

- SecDF : impliquée dans l’exportation ex vivo

- YajC : signal peptidase

Le précurseur de la toxine, en cours de traduction, se lie à SecA. Ce dernier,

ayant une grande affinité pour le complexe SecYEG et la membrane, vient s’y

fixer (formation de la translocase). Le peptide signal est reconnu par la

protéine SRP54, s’insère dans la membrane en une boucle de manière à ce

que la partie N-terminale ressorte dans le cytosol. Un changement de

conformation s’opère : SecYEG forme le tunnel permettant à SecA d’orienter

la translocation. Cette étape requiert de l’ATP mais pas son hydrolyse. Cela

conduit à un état dans le quel le site de clivage a atteint l’extérieur de la

membrane. Le peptide signal est alors clivé par YajC. S’ensuit ensuite des

cycles d’insertion et de désinsertion de SecA, tous les 20-30 acides aminés,

requérant l’hydrolyse d’ATP et la force proton motrice. Pour finir, la toxine est

libérée et repliée sous l’influence probable de SecDF (Figure II.13).


26

- Mécanisme d’action de la toxine diphtérique

- Effets de la toxine in vivo

Elle est toxique pour l’homme et l’animal à des doses très faibles. La toxine

diphtérique possède une dose minimale létale très basse, de 50-100 ng/kg de

poids corporel (39, 40).

Le pouvoir létal de la toxine s’exerce toujours après un temps de latence,

d’autant plus bref que la dose administrée est importante, mais ne descendent

jamais au dessous de 10 h. L’effet létal de la toxine, étudié sur l’animal, est dû

à des lésions tissulaires diffuses.

- Effets de la toxine en système acellulaire

Sur les systèmes acellulaires (extrait de réticulocytes de lapin, extrait de

cellules HeLa), la toxine diphtérique inhibe la synthèse protéique seulement en

présence du coenzyme NAD+. Le composant sensible à l’action de la toxine

est le facteur d’élongation EF-2 (protéine assurant en présence de GTP la

translocation du peptidyl ARNt du site A au site P du ribosome). La toxine

entraîne la fixation de la partie ADP-R (adénosine-diphosphoribose) du NAD+

sur EF-2. La réaction catalysée par la toxine est donc une ADP-ribosylation

d’EF-2. EF-2 est alors inactivé et la synthèse protéique s’arrête (Figure II. 12).

L’effet inhibiteur de la toxine peut être réverse en présence d’un excès de

nicotinamide. In vivo, la toxine diphtérique semble bien agir par ce même

mécanisme enzymatique.


27

Une seule molécule de toxine diphtérique sous-unité A, introduite directement

dans le cytoplasme, est suffisante pour tuer une cellule eucaryote (41). Outre

sa capacité d’inhiber la synthèse protéique (42), la toxine diphtérique est aussi

capable d’induire le clivage internucléosomal d’ADN (indicative de l’activité

induisant l’apoptose) assignée à la sous-unité A de la toxine diphtérique (42,

43, 45), processus qui précède la cytolyse et ne semble pas être du à

l’inhibition de la synthèse protéique.

- Description générale du mode d’action de la toxine diphtérique

Grâce à son domaine récepteur R qui forme la partie C-terminale de la sous-

unité B, la toxine se fixe à la surface des cellules de l’hôte au niveau du

récepteur cellulaire ubiquitaire, le pro-HB-EGF (heparin-binding epidermal

growth factor-like protein) aidé des co-récepteurs CD9 et HSPG (heparan-

sulfate-proteo-glycan) (46, 47, 48). Le complexe toxine-récepteur est

internalisé d’où la formation d’un endosome. Le domaine T, qui forme la partie

N-terminale de la chaine B, contient des séquences hydrophobiques qui

s’insèrent dans les membranes de l’endosome et facilitent la translocation de

la chaine A sous l’effet d’une acidification du pH (réduction du pont disulfure).

La sous-unité A (domaine catalytique C), est libérée dans le cytoplasme où

elle catalyse la réaction ADP-ribosylation du résidu diphthamide du facteur

d’élongation EF-2, une petite G-protéine qui permet la translocation du


28

peptidyl-tRNA du site A au site P des ribosomes en présence de GTP (Figure

II.14).

Figure II.12. ADP-ribosylation de EF-2. A, adénine ; N, nicotinamide ; R,

ribosyl ; P, phosphate de NAD. Collier et coll, 2001 (49).

L’inactivation de ce facteur EF-2 entraine l’arrêt de l’élongation des chaines

peptidiques et par conséquent l’inhibition de la synthèse protéique entrainant

la mort de la cellule (50, 51).


29

Figure II.13. Processus de translocation et facteurs Sec. Mori et coll, 2001 (38).


30

Figure II.14. Activité de la toxine diphtérique dans une cellule

eucaryote. Umata et coll, 2000 (52).


31

- Origine du gène tox

La toxine diphtérique est un déterminant majeur de virulence et qui est codée

par une famille de bactériophages étroitement liée (53).

Le gène tox est présent dans des corynébactériophages (β tox+, γ tox+, ω tox+)

capables d’intégrer les chromosomes de C. diphtheriae, C. ulcerans et

C. pseudotuberculosis) (39, 54).

Avec les travaux de Freeman (4), il a été constaté que des souches non

toxinogènes peuvent le devenir après infection par le corynéphage β (55).

En effet, le gène tox codant pour la toxine diphtérique, est situé sur le

chromosome du phage. Ainsi, seules les souches lysogènes de C. diphtheriae

(infectées par le corynéphage β) sont toxinogènes par insertion du gène dans

le chromosome bactérien (4).

- Diversité de la séquence du gène de la toxine diphtérique

Le gène de la toxine diphtérique de 72 souches de C. diphtheriae isolées en

Russie et en Ukraine a été séquencé par Nakao et al (56). Le gène tox de 28

souches était identique à la souche contrôle PW8. Pour les 40 souches

toxinogènes restantes, 4 mutations ponctuelles ont été détectées, une dans la

sous-unité A et trois dans la sous-unité B. Toutes étaient des mutations

silencieuses, indiquant que c’est un gène hautement conservé.


32

II.1.4.6. Le génome de Corynebacterium diphtheriae

Le génome d’une souche de C. diphtheriae de biotype gravis a été

entièrement séquencé en 2003 (Figure II.15). Il est constitué d’un

chromosome circulaire de 2,49 millions de paires de bases, sans plasmide,

possédant un GC% moyen de 53,48% et de 88% de régions codantes (2320

CDSs). La publication a indiqué que les facteurs de virulence, autres que la

toxine diphtérique peuvent jouer un rôle important dans la pathogénicité de

C. diphtheriae (57). En effet, 13 ilots de pathogénicité comprenant des gènes

acquis par transferts génétiques horizontaux et par infection prophagique ont

été identifiés (58). Ces gènes contribuent à la virulence de C. diphtheriae :

production de toxine, de fimbriae, système de capture du fer, biosynthèse de

sidérophores et d’antibiotiques.

Le génome de la souche de C. diphtheriae de biotype mitis, non toxinogène

(C7 -), comparé à celui de la souche de référence NCTC 13129 révèle

l’absence de 37 régions génomiques, dont 11 ilots de pathogénicité sur 13.

Chez la souche Park-Williams n°8 (PW8), souche majeure utilisée dans la

production d’anatoxine, la comparaison montre l’absence de 14 régions

génomiques, mais seulement 3 ilots de pathogénicité et cependant elle montre

des signes réduits de pathogénicité. Il existe donc un haut degré de plasticité

du génome de C. diphtheriae et une importante variabilité de la pathogénicité

(59).


33

Figure II.15. Représentation circulaire du génome de C. diphtheriae

NCTC13129. Cerdeno-Tarraga et coll, 2003 (57).


34

II.2. Le typage des souches de Corynebacterium diphtheriae

II.2.1. Électrophorèse en champ pulsé (PFGE)

La PFGE est basée sur la lyse de bactéries piégées dans des plugs d’agarose

et digérant l’ADN chromosomique avec des endonucléases de restriction

ayant des sites de restriction rares sur le chromosome bactérien (60). Les

sections de plug sont insérées dans un gel d’agarose et les fragments de

restriction sont séparés par un courant électrique alternatif périodiquement

permettant à des fragments d’ADN de grandes tailles d’être séparés de

manière efficace, en moyenne 10 à 20 fragments (61, 62). Les souches sont

identifiées et différentiées en comparant les profils des fragments de restriction

(nombre et taille des fragments) en accordance aux recommandations de

Tenover (60). Chaque profil unique des fragments représente un pulsotype

(PT). Les isolats donnant les mêmes pulsotypes représentent la même

souche, les souches étroitement liées diffèrent par 1-3 bandes ; alors que les

souches qui diffèrent par plus de six bandes sont considérées comme non

liées.

La technique de PFGE possède un excellent pouvoir de discrimination et les

résultats sont en corrélation aux données cliniques et à d’autres techniques de

typage (60, 63, 64). Cependant, elle est limitée par la longueur du temps qu’il

faut pour obtenir des résultats, le coût des réactifs et de l’équipement (65). De

plus, bien que les standardisations aient amélioré l’interprétation des données,


35

même de petites variations dans les conditions d’électrophorèse peuvent

altérer la migration des bandes (6, 66, 67).

II.2.2. Ribotypage

Le principe du ribotypage est basé sur la southern hybridation (4, 6). Suite à la

digestion partielle de l’ADN génomique par les enzymes de restriction,

l’hybridation avec des amorces 16S et 23S de l’ARN ribosomal révèle

approximativement 20 à 25 bandes (4, 6). Seuls les fragments contenant une

partie ou tout l’ADN ribosomal sont visualisés, permettant une interprétation et

une comparaison simplifiées des profils. Chaque profil unique obtenu

représente un ribotype (RT). Comme le ribotypage est une technique lourde et

laborieuse, un système de caractérisation microbienne automatisé

« Riboprinter » (Qualicon) a été développé et donne un typage de haut débit.

Cette méthode a été appliquée à plusieurs espèces bactériennes mais a

montré une pauvre résolution comparée au ribotypage manuel dans quelques

travaux (68 à 75).

Avant sa standardisation, la nomenclature du ribotypage a subit des

variations. Initialement le préfixe G ou M étaient utilisés pour désigner les

ribotypes des souches de biotype gravis et mitis respectivement (76).

Par la suite, il a été observé qu’il n’y avait pas de différence entre les biotypes.

Le préfixe D (pour Diphtheria) a été utilisé (75). D’autres auteurs ont utilisé

également une autre nomenclature, telle que le préfixe R (77, 78) et le préfixe


36

C (79). Devant cette variété de classification des ribotypes et dans le but de

standardiser la technique et de permettre l’échange de données, Grimont et

coll. ont proposé en 2004 une méthodologie du ribotypage et une

nomenclature internationale basée sur le lieu où la souche a été isolée pour la

première fois. Donc à titre d’exemple pour l’épidémie de Russie, les ribotypes

G1, G4 et M1, devenus par la suite D1, D4 et D7 ont acquis leur dénomination

définitive, Saint-Pétersbourg, Rossija et Otchakov respectivement (72).

Pour l’épidémie d’Algérie, le ribotype D21 a acquis sa dénomination définitive,

Constantine (72).

II.2.3. Multilocus enzyme electrophoresis (MLEE)

La technique de MLEE a été aussi utilisée pour examiner les structures de

population. Cette technique détecte les variations dans les séquences

d’acides aminés de 20 enzymes métaboliques approximativement en

analysant la mobilité électrophorétique des protéines sur gel de starch (80).

Un type électrophorétique (ET) est assigné à chaque unique profil de mobilité

et permet une caractérisation et une différentiation des souches. Bien que

cette technique donne une information utile pour plusieurs micro-organismes,

elle identifie seulement les mutations qui résultent dans les profils de mobilité

électrophorétique altérés et les mobilités électrophorétiques similaires peuvent

être obtenues de séquences de gènes très différentes (81). De plus, c’est une

technique lourde qui peut être entravée par une pauvre reproductibilité.


37

II.2.4. Multilocus sequence typing (MLST)

Proposée en 1998, la MLST est basée sur les concepts de génétique de

population employée par la technique Multilocus Enzyme Electrophoresis

(MLEE), car elle indexe la variation des nucléotides dans les gènes

domestiques (6, 81, 82, 83, 84). Comme les loci sélectionnés sont considérés

à être sous la sélection non adaptative, ils sont appropriés pour les

investigations épidémiologiques. Le pouvoir discriminant de la MLST est

déterminé par le nombre et la fonction des gènes analysés et la longueur et

les régions des loci qui sont sélectionnés pour l’analyse (85). La résolution est

aussi très dépendante de l’espèce étudiée.

Le schéma MLST est décrit en bref comme des fragments internes

(approximativement de 400 pb) de 7 gènes domestiques qui sont amplifiés par

PCR à l’aide d’amorces spécifiques puis séquencés. L’alignement des

séquences d’un locus donné permet d’identifier un allèle donné. Une

désignation d’allèle est assignée à chaque nouvelle séquence. La

combinaison des allèles obtenus pour chaque isolat à partir des 7 loci

examinés permet de décrire le profil allélique à l’origine de la désignation de la

sequence type (ST) (82).

En contraste avec les méthodes basées sur le gel qui sont entravées par une

reproductibilité et une portabilité pauvres. La MLST fournit des données non

ambigües et exportables. Les données peuvent être échangées entre


38

laboratoires et donc dédiées aux sites de MLST notamment

http://www.pubmlst.org et http://www.mlst.net permettant aux chercheurs de

part le monde de comparer leurs isolats à d’autres contenus dans la base de

données (86).

II.3. La diphtérie

II.3.1. La diphtérie classique

II.3.1.1. Les symptômes de la diphtérie

- Angine diphtérique commune

Après une incubation courte (2 à 5 jours), elle débute habituellement de façon

progressive, peu fébrile avec dysphagie et malaise.

L’examen retrouve des amygdales inflammatoires recouvertes d’un enduit

blanchâtre, évoluant vers une coloration grisâtre (fausses membranes), non

toujours présentes (Figure II.16). Celles-ci sont adhérentes et extensives,

initialement localisées (amygdales), puis s’étendant vers la luette, le palais

mou, les cavités nasales et le larynx (obstruction des voies aériennes

inférieures : croup).

L’angine s’accompagne d’adénopathies sous-angulomaxillaires parfois

volumineuses et douloureuses (cou proconsulaire ou bull neck) (Figure II.17).

C’est une urgence thérapeutique (87).

http://www.pubmlst.org/

http://www.mlst.net/


39

Les patients sont contaminants pour 2 à 3 semaines. Bien que, la plupart des

cas soient bénins, des taux de cas fatals de 5-10% ont été rapportés (4, 6,

87).

Figure II.16. Angine diphtérique

(www.cdc.org)

http://www.cdc.org/


40

Figure II.17. Cou proconsulaire ou bull neck

(www.cdc.org)

http://www.cdc.org/


41

- Manifestations toxiniques

Elles ne s’observent qu’avec les isolats tox+

- L’atteinte myocardique

Elle débute précocement (10e jour), se manifeste par des troubles de

conduction et/ou du rythme cardiaque avec un risque permanent de décès

brutal, nécessitant une surveillance électrocardiographique. Des séquelles

tardives sont possibles (32).

- L’atteinte neurologique

Rapportée chez 75% des patients avec maladie sévère (87). Typiquement

observée 10-28 jours après le début de la maladie, elle est dominée par les

paralysies périphériques qui grèvent le pronostic tardivement jusqu'à la fin du

3e mois (syndrome malin de Grenet et Mezart vers le 50e jour).

La paralysie des muscles respiratoires est particulièrement grave en raison du

risque de détresse respiratoire, ressemblant au syndrome de Guillain et Barré.

Les paralysies des membres sont plus tardives (après le 30e jour), diffuses et

extensives. L’analyse du LCR montre une dissociation albuminocytologique

comparable à celle du syndrome de Guillain et Barré.

- L’atteinte rénale

Plus rare, elle associe protéinurie, hématurie et insuffisance rénale oligo-

anurique.


42

- Autres localisations

La porte d’entrée de C. diphtheriae peut être extrarespiratoire : la localisation

la plus fréquente est alors cutanée, en particulier dans les pays en

développement et dans les populations précaires (SDF…). Il y a alors souvent

co-infection avec Streptococcus pyogenes et/ou Staphylococcus aureus.

Toutes les formes cliniques sont possibles de l’angine érythémateuse simple

paucisymptomatique, à la forme grave d’emblée ou forme maligne d’évolution

rapidement mortelle. Des formes bactériémiques sont possibles.

II.3.2. La diphtérie cutanée

Les lésions surviennent particulièrement au niveau des extrémités (Figure

II.18) et comme C. diphtheriae est capable de coloniser les lésions cutanées

préexistantes, les tableaux cliniques varient largement (88). L’ulcération ou

l’ecthyma sont les plus communs. Initialement une pustule remplie de fluide ou

une vésicule qui dégénère rapidement à un ou plusieurs ulcères de quelques

millimètres à quelques centimètres de diamètre (88). Une pseudomembrane

grise recouvrant la lésion est souvent présente dans les premières 1 à 2

semaines mais après sa séparation spontanée ou son élimination active de la

base de l’ulcère hémorragique, un exsudat séreux, devient apparent (88). Bien

que des cas, d’une durée supérieure à 1 an ont été rapportés, la guérison

spontanée survient généralement après 6 à 12 semaines (88).


43

Les complications toxiniques sont rares mais par précaution une sérothérapie

est administrée. Quand les complications systémiques surviennent, elles sont

plus bénignes et se développent plus tardivement que les cas respiratoires (4,

87).

Figure II.18. Diphtérie cutanée

(www.cdc.org)

http://www.cdc.org/


44

II.3.3. Les souches de C. diphtheriae non toxinogènes

Les souches de C. diphtheriae non toxinogènes ont été associées à de

nombreux tableaux cliniques, notamment endocardite, arthrite, ostéomyélite

mais causent particulièrement des infections ressemblant aux pharyngites

streptococciques (4).

Il est à noter l’association de C. diphtheriae biotype belfanti avec la rhinite

atrophique primitive ou ozène, pathologie nasale chronique. Celle-ci se traduit

par une atrophie progressive de la muqueuse nasale et des os sous-jacents

avec formation de lésions crouteuses, dures et malodorantes dans les cavités

nasales élargies et d’une rhinorhée fétide. Différents facteurs prédisposants

ont été évoqués (endocriniens, certains déficits nutritionnels,…).

Ce biotype belfanti semble avoir un tropisme respiratoire alors que les autres

biotypes causent le plus souvent des infections cutanées ou invasives (89).

Freeman, le premier a montré que la conversion lysogénique peut se traduire

chez les souches non toxinogènes devenant productrices de toxine après

incubation avec les corynéphages (87). Bien que ceci ait été observé

uniquement in vivo, des souches toxinogènes et non toxinogènes ont été

isolées chez un même patient (90).

Tandis que la plupart des souches non toxinogènes ne portent pas le gène

tox, quelques souches contiennent des séquences liées au gène tox qui ne

code pas une toxine diphtérique fonctionnelle (91 à 96).


45

II.3.4. La diphtérie animale

Il est souvent déclaré que le réservoir de C. diphtheriae est strictement humain

et il n’est pas considéré comme pathogène zoonotique. Cependant, bien que

rarement, la bactérie a été isolée chez les animaux. Des rapports d’infections

diphtériques ont été décrits dans les années récentes. Corboz et coll (97) ont

identifié un isolat de C. diphtheriae biotype belfanti dans une lésion cutanée

bovine. Henricson et coll rapportaient l’isolement de souche de C. diphtheriae

biotype gravis toxinogène d’une plaie équine (98). La bactérie a été aussi

isolée chez les chats et chevaux domestiques (87). D’où l’importance

d’examiner leur rôle comme réservoirs potentiels de la maladie et leur relation

aux isolats obtenus des cas humains.

II.3.5. Le traitement de la diphtérie

La diphtérie est une urgence thérapeutique imposant l’hospitalisation, parfois

en réanimation. Le traitement associant la sérothérapie et l’antibiothérapie,

doit être institué en urgence au moindre doute et avant la confirmation de

l’agent causal par le laboratoire.

- La sérothérapie

Elle fait appel à du sérum antidiphtérique équin. Il doit être injecté le plus

rapidement possible, par voie intramusculaire, la posologie étant adaptée à la

gravité ; une épreuve de tolérance par la méthode de Besredka (risque de

choc anaphylactique) doit être réalisée (injection sous la peau 0,1 ml de


46

sérum, puis 15 mn plus tard 0,25 ml ; si aucun effet secondaire n’est noté

dans le quart d’heure suivant, la dose restante est injectée (une moitié en

sous-cutané et l’autre moitié en intramusculaire), si un effet secondaire est

noté, le patient doit être transféré sans délai en milieu spécialisé). La dose

varie selon la gravité du tableau clinique, de 20000 UI à 40000 UI pour l’enfant

et de 40000 UI à 120000 UI pour l’adulte (99).

L’antitoxine diphtérique neutralise seulement la toxine diphtérique circulante et

ne peut affecter la TD déjà liée aux membranes (99).

- L’antibiothérapie

Elle repose sur la pénicilline G (dose adulte : 2 M UI et dose enfant : 100000

UI/kg/j) pendant 10 jours par voie intramusculaire.

En cas d’allergie, le traitement fait appel à l’érythromycine (dose adulte : 2 g/j

et dose enfant : 50 mg/kg/j) pour 10 jours (100).

Elle permet la suppression de la source de fausses membranes et de la

production de toxine.

Pour les formes systémiques, habituellement liées à des isolats tox-, les

posologies d’amoxicilline seront adaptées à la situation clinique et une

bithérapie parfois envisagée.

L’érythromycine, l’azithromycine, la clarithromycine et la pénicilline sont les

antibiotiques de choix et sont utilisés pour éliminer la bactérie et prévenir sa

diffusion (101).


47

- La vaccination

La vaccination par l’anatoxine diphtérique est systématique, en relais de la

sérothérapie et selon une modalité liée au statut vaccinal antérieur et aux

recommandations du calendrier vaccinal (Annexe 1).

II.3.6. La prévention de la diphtérie

- Collective

La diphtérie est une maladie à déclaration obligatoire, nécessitant un

signalement immédiat auprès de la DSP de la wilaya et l’INSP ainsi que la

direction de prévention du MSPRH.

Elle repose sur la vaccination obligatoire des nourrissons, des adolescents et

adultes, le schéma actuel est la primovaccination de 3 doses avec un rappel à

18 mois puis à 6 ans, 11-13 ans, 16-18 ans et tous les 10 ans (Annexe 1).

A partir de 11 ans, c’est le vaccin faiblement dosé qui est utilisé.

Il est à noter qu’a partir de l’âge de 7 ans, c’est uniquement le vaccin

faiblement dosé qui peut être administré (102).

Un nouveau calendrier vaccinal national a été adopté en novembre 2014 (en

cours d’application). Le schéma de vaccination contre la diphtérie repose sur

la primovaccination de 2 doses avec un rappel à 12 mois puis à 6 ans, 11-13

ans, 16-18 ans et tous les 10 ans (Annexe 2).

Pour les professions de santé, la vaccination est obligatoire tous les 10 ans.


48

- Individuelle

Le dépistage actif des cas est mis en œuvre pour identifier les sujets contacts

et les porteurs de la bactérie (101). Pour prévenir la propagation de la maladie

secondaire, les sujets contacts reçoivent la prophylaxie.

- Du patient

Le patient doit être soumis à un isolement respiratoire qui sera maintenu

jusqu’au résultat négatif d’un prélèvement de gorge de contrôle réalisé à J7.

- Des sujets contacts

Elle comprend deux volets :

Le dépistage et le traitement antibiotique systématique ; en cas de positivité

du prélèvement, la conduite à tenir sera identique à celle du patient source.

Le rappel vaccinal avec une adaptation de la dose d’anatoxine et des rappels

selon le statut vaccinal.

- Des voyageurs

Un rappel vaccinal est recommandé pour les voyageurs se rendant à la

Mecque. Le vaccin habituellement utilisé est le vaccin diphtérie-tétanos avec

concentration réduite en anatoxine diphtérique.


49

II.4. L’épidémiologie de la diphtérie

II.4.1. Dans le monde

La diphtérie est une maladie connue depuis l’antiquité, celle-ci semble

originaire du Moyen Orient et elle a probablement disséminé à l’Europe et plus

tard aux autres continents (4).

De nombreuses vagues d’épidémies de diphtérie sont survenues en Europe,

souvent liées aux temps de guerre. Les cycles incluaient un intervalle de 100

ans et plus (103) et les épidémies ont été rapportées au 16ème, 17ème et

18ème siècle en France et en Allemagne ; en Italie et en Espagne ; et en

Suède et en Allemagne respectivement. Durant le 18ème siècle, la diphtérie a

atteint la côte Est de l’Amérique du Nord. A la fin du 18ème siècle et le début

du 19ème siècle, la diphtérie est devenue prévalente et considérée comme la

principale cause de mortalité infantile.

La raison de cette augmentation de la morbidité et de la mortalité pourrait être

liée à l’augmentation concomitante de la population urbaine avec le début de

l’industrialisation associée aux mauvaises conditions socio-économiques de la

classe ouvrière. Avec le début de l’industrialisation, il y a eu aussi la

progression de la bactériologie, identification de l’agent causal et

développement du vaccin. Cependant, malgré le succès des stratégies

d’immunisation de masse qui ont permis de diminuer drastiquement la

morbidité et la mortalité, la diphtérie n’est pas éliminée aujourd’hui et reste une


50

maladie infectieuse endémique en Afrique, en Asie et dans certaines régions

de l’Amérique du Sud et résurgente dans certaines régions du monde illustrée

par son retour dramatique dans les pays de l’ex-Union Soviétique et en Algérie

au début des années 1990s (6).

De 2000 à 2014, entre quatre et onze mille cas ont été rapportés à l’OMS, soit

une moyenne d’environ six mille cas/an. Le nombre de décès rapporté en

2011 était de 2500 cas (Figure II.19) (104).

Une faible couverture vaccinale a été rapportée pour certains pays d’Afrique

centrale (<50%) et d’Asie (50 à 79%) (Figure II.20) (104).

En outre, la flambée épidémique particulièrement qui a débuté après la

décomposition de l’union soviétique en 1989 a montré que la diphtérie est

encore un risque sanitaire sérieux. Durant cette épidémie à large échelle qui a

commencé en 1990 en Russie et en Ukraine, plus de 15000 cas de diphtérie

ont été rapportés et près de 3000 cas pour l’Ukraine en 1993 (105 à 108). La

maladie a ensuite diffusé rapidement aux pays avoisinants.

La caractéristique la plus importante de la maladie était l’infection des

adolescents et des adultes au lieu des enfants, habituellement atteints par la

maladie. En plus de la Biélorussie, la Russie et l’Ukraine, la maladie était

particulièrement prononcée dans les états baltiques (Estonie, Lituanie et

Lettonie), où les sujets de 15 ans et plus comptaient 2/3 à 4/5 du total des cas

de diphtérie (109, 110). Par conséquent, l’immunisation de masse des adultes


51

qui a commencé en 1993, était une des étapes cruciales pour éradiquer la

maladie et stopper l’épidémie.

De nos jours, dans les régions endémiques en Asie, en Amérique Latine et en

Afrique, des épidémies ou des cas sporadiques de diphtérie continuent à être

enregistrés. Des épidémies au Brésil, au Laos et en Thailande, en Indonésie

et en Inde ont été rapportées entre 2010 et 2013 (111, 112, 113, 114, 115,

116, 117). En 2014, un cas sporadique a été notifié au Nigéria (118, 119).

Dans les pays développés, des cas sporadiques de diphtérie sont souvent

notifiés. Une notion de voyage récent dans un pays endémique est souvent

associée. Dans une étude récente au Royaume Uni, huit souches toxinogènes

ont été isolées entre 2007 et 2013. Dans sept cas, il s’agissait d’isolats de

biotype mitis collectés chez des sujets avec une notion de voyage dans un

pays endémique d’Afrique ou d’Asie. Un cas était lié à un isolat de biotype

gravis sans notion de voyage retrouvée (120).

En mai 2015, un cas de diphtérie autochtone chez un enfant de 6 ans, non

vacciné a été déclaré en Espagne. L’enfant est décédé des suites de la

maladie (121, 122).

La diphtérie cutanée, quant à elle est rare dans les pays développés, mais elle

est endémique dans de nombreuses régions tropicales et subtropicales et se

transmet par contact avec des sécrétions respiratoires et des lésions cutanées

(88). Cependant, des épidémies dans les régions développées ont été


52

rapportées aux USA chez les sujets alcooliques sans abri et chez les

personnes vivant dans des conditions socio-économiques défavorisées (123).

Les cas sporadiques sont particulièrement associés au voyage dans les

régions endémiques, 17 cas importés de diphtérie cutanée ont été rapportés

au Royaume-Uni durant la période 1995-2002 (124). En Allemagne, tous les

cas de diphtérie cutanée de 1997 à 2003 étaient liés au voyage dans des

régions endémiques (125). Comme ces cas peuvent entrainer l’augmentation

de cas secondaires et d’épidémies de diphtérie respiratoire, cela représente

une préoccupation majeure (125). Au Royaume-Uni, en 1985, un patient ayant

une forme clinique de diphtérie laryngée et un total de 16 porteurs (dont 8

d’entre étaient des contacts secondaires des porteurs) étaient associés à un

cas de diphtérie cutanée. La dissémination aux enfants et aux adultes est

survenue durant juste 20 jours, ce qui montre la nécessité d’une surveillance

vigilante (124). Entre le 16 et 27 juin 2015, trois pays d’Europe (Danemark,

Suède et Allemagne), ont déclaré 9 cas de diphtérie cutanée chez les réfugiés

et demandeurs d’asile venant d’Erythrée, d’Ethiopie, de Libye et de Syrie dues

dans sept cas à des souches de C. diphtheriae toxinogènes (126).

La diphtérie cutanée est liée aux mauvaises conditions socio-économiques,

notamment le surpeuplement, la pauvreté et les conditions d’hygiène

inadéquates. Les lésions cutanées absorbent la toxine diphtérique lentement

induisant ainsi des taux élevés d’antitoxine (124). A cause de la circulation


53

intensive de C. diphtheriae, la plupart des enfants développent une immunité

naturelle au jeune âge et les formes sévères de diphtérie respiratoire sont

rarement observées (105). Cependant, la diphtérie cutanée a été liée à des

taux de transmission plus élevés que l’infection respiratoire (124).

Cela peut être dû à une plus grande contamination de l’environnement grâce à

la poussière et les vecteurs passifs (vêtements, ustensiles, meubles) et le

diagnostic plus souvent tardif de la diphtérie cutanée (124).

II.4.2. En Algérie

Après l’introduction de la vaccination obligatoire en 1969, la morbidité et la

mortalité de la diphtérie ont considérablement diminué. Cependant en 1990,

une recrudescence de la maladie a été enregistrée, débutant par une

importante épidémie dans la wilaya de Batna avec une incidence de 3,3 cas

pour 100000 habitants alors que le taux national était de 0,12 cas pour 100000

habitants. En 1992, apparition de nouveaux foyers de diphtérie

essentiellement dans les wilayas du sud : Adrar, Illizi avec une incidence de

0,08 cas pour 100000 habitants.

En 1993, 1994 et 1995 3 flambées épidémiques sont apparues touchant

différentes régions du pays.

L’incidence annuelle était entre 1,09 et 3,51 cas pour 100000 habitants.


54

Le taux de létalité en 1993 a été de 10,8% (32 décès). Plus de la moitié des

wilayas du pays étaient touchées. Les taux d’incidence les plus élevés étaient

enregistrés par les wilayas de Tamanrasset, Bouira, Tizi-Ouzou, Ouargla,

El Oued, Ghardaia, Béjaia, Adrar, Biskra, Djelfa, Skikda, Sétif et Laghouat.

A partir de 1996, les taux d’incidence ont nettement baissé, passant de 0,51 à

0,19 cas pour 100000 habitants en 1998, cependant un taux de létalité de

21% a été rapporté pour l’année 1998. Les cas déclarés provenaient des

foyers résiduels (127).

Les campagnes de vaccination de masse menées dans les wilayas les plus

touchées du nord et du sud du pays ainsi que l’instauration des rappels

vaccinaux dans le calendrier national de vaccination à 11-13 ans, 16-18 ans et

tous les 10 ans ont permis de contrôler la maladie. De ce fait, de 1999 à 2006,

seulement des cas sporadiques étaient déclarés et à partir de 2007, aucun

cas de diphtérie n’a été enregistré (128).

Les caractéristiques les plus importantes de ces épidémies étaient :

- les groupes d’âge de la population atteinte qui concernaient surtout les

adolescents (10-19 ans) et les adultes jeunes (20-29 ans).

- le statut immunitaire des sujets, qui étaient non ou incomplètement vaccinés.

Ceci a soulevé des questions sur la couverture vaccinale et l’immunité de ces

populations sachant que l’infection ne peut diffuser dans une communauté où


55

75% des sujets sont immunisés ; ce niveau correspondait autrefois à l’infection

naturelle de la maladie (129).

Les facteurs incriminés dans l’éclosion de ces épidémies étaient :

- l’immunité insuffisante de la population adulte due à l’absence de contacts

répétés avec le germe empêchant son entretien, d’où une diminution de la

protection avec l’âge (129).

- la couverture vaccinale insuffisante permettant la propagation de l’infection et

l’émergence de foyers épidémiques.

-les mouvements de population importants, observés habituellement dans le

sud.

- l’instabilité socio-économique qu’a connue l’Algérie dans les années 1990s,

entrainant une désorganisation des infrastructures sanitaires, des

mouvements de population importants, même dans les régions du nord du

pays.

En résumé, les épidémies des années 1990s survenues dans différentes

régions du monde ont montré que l’instabilité socio-économique, les

mouvements de population à large échelle et l’absence ou la décomposition

des infrastructures sanitaires favorisent la diffusion de la diphtérie.

Il est aussi indiqué que C. diphtheriae pourrait persister dans la population

pour de longues périodes (130). Dans de nombreux cas, les porteurs ne sont


56

pas connus, quelquefois, ceux-ci sont des groupes de personnes avec un

accès insuffisant aux soins médicaux, notamment les programmes de

vaccination (131) ou les personnes abusant de drogues (131).

Pour les habitants des régions où la diphtérie est contrôlée, le facteur de

risque majeur d’infection par C. diphtheriae pourrait être lié au voyage dans un

pays où la diphtérie est endémique (132 à 134). Cependant, les populations

autochtones et les réfugiés ou demandeurs d’asile, venant des pays

endémiques sont des facteurs de risque réels. Le cas fatal de diphtérie

autochtone enregistré en mai 2015 en Espagne et les sept cas de diphtérie

cutanée dues à des souches toxinogènes déclarés en juin 2015 par le

Danemark, la Suède et l’Allemagne, chez les réfugiés et demandeurs d’asile

venant de pays endémiques, en sont l’illustration. La surveillance de la

maladie doit être continue et doit prendre en compte, outre les populations

autochtones, les sujets allant vers ou venant des régions endémiques

(voyageurs, réfugiés).


57

Figure II.19. Cas annuels de diphtérie rapportés dans le monde et

couverture par le vaccin DTP3, 1980-2013. Données OMS, 2013 (104).


58

Figure II.20. Couverture vaccinale avec les vaccins contenant le DTP3

chez les enfants, 2013. Données OMS, 2013 (104).


59

II.4.3. Les souches de C. diphtheriae non toxinogènes

Les souches de C. diphtheriae non toxinogènes ont augmenté au cours des

30 dernières années et ont été associées le plus souvent à des infections

ressemblant aux pharyngites streptococciques mais également à de nombreux

tableaux cliniques, notamment endocardite, arthrite, ostéomyélite (4).

L’alcoolisme, l’absence de domicile fixe pour certains sujets et l’usage de

drogues par voie intraveineuse sont des facteurs de risque. Dans les cas

d’endocardite, la présence d’une maladie cardiaque sous-jacente est un risque

majeur. Il est suggéré que l’augmentation des maladies dues aux souches non

toxinogènes est secondaire à la pression de sélection engendrée par la

vaccination de masse contre les souches toxinogènes (135).

Des cas groupés de diphtérie ont été rapportés dans les communautés

religieuses, des unités militaires et des institutions éducationnelles (135) et

dans les années récentes, C. diphtheriae a ré-émergé comme pathogène au

Royaume-Uni, causant des maux de gorge sévères récurrents (135, 136).

Des souches non toxinogènes ont été ribotypées au Royaume-Uni en 1995

(135). Vingt trois ribotypes ont été identifiés parmi les 121 isolats étudiés.

Quatre vingt dix souches parmi celles-ci étaient de même ribotype et ce

ribotype n’était pas observé chez les souches toxinogènes du Royaume-Uni.

L’augmentation du nombre des souches non toxinogènes n’a pas été

accompagnée de l’augmentation des souches toxinogènes, suggérant que la


60

conversion à la production de toxine ne s’est pas produite malgré la circulation

continue des souches non toxinogènes. Ces observations ont suggéré que

cette souche prédominante en circulation au Royaume-Uni peut avoir certains

avantages en termes de transmission et de potentiel pathogénique (135).

Il est à noter l’association de C. diphtheriae biotype belfanti avec la rhinite

atrophique primitive ou ozène, pathologie nasale chronique. Cette affection est

relativement fréquente dans la population d’Afrique du nord et asiatique mais

en régression en Europe, sauf pour certains pays de l’Europe de l’Est.

Différents facteurs prédisposants ont été évoqués (endocriniens, certains

déficits nutritionnels,…). L’ozène concerne plutôt la femme jeune et semble

surtout toucher les populations socio-économiquement défavorisées.

La bactérie est souvent retrouvée en association avec Klebsiella pneumoniae

ozenae et Moraxella catharralis (137).

II.4.4. La caractérisation moléculaire des souches de C. diphtheriae

II.4.4.1. La caractérisation moléculaire des souches de C. diphtheriae

responsables de diphtérie

Le ribotypage, « gold standard » des techniques de typage de

C. diphtheriae, a été utilisé pour identifier les complexes clonaux liés aux

épidémies de l’ex-Union Soviétique. De Zoysa et coll ont étudié 100 isolats

obtenus en 1993 du Nord Ouest de la Russie par ribotypage et PFGE (74).

Cinq ribotypes distincts étaient observés parmi les souches de C. diphtheriae


61

biotype gravis (G1 à G5) et deux parmi les souches de biotype mitis (M1 et

M2). Quatre vingt quatre pour cent (68/81) des souches gravis étaient de

ribotype G1 et 24/25 des souches mitis étaient de ribotype M1. Etant donné

que le ribotype G1 se différenciait du ribotype G2 par trois bandes et le

ribotype G1 se différenciait du ribotype G4 par seulement une bande, il a été

suggéré que les souches de l’épidémie dérivaient d’un seul complexe clonal

(74). Les ribotypes G3, G5 et M2, quant à eux étaient différents.

Popovic et coll ont élargi cette étude en effectuant une analyse temporo-

spatiale des souches (138). Cent cinquante six isolats obtenus de la Russie de

1985 à 1994 ont été analysés par ribotypage et MLEE. De nombreux ribotypes

ont été retrouvés avec la prédominance du ribotype M1, G1 et G4. Durant la

période pré-épidémique (1985-1990), les ribotypes G1 et G4 étaient rarement

observés. Leur augmentation a commencé en 1990 pour atteindre en 1994

plus de 80% des ribotypes identifiés. De manière similaire, l’analyse par MLEE

a montré que la période pré-épidémique était caractérisée par la présence de

nombreux électrophorétypes mais après 1990, la majorité des isolats étaient

regroupés au sein d’un electrophorétype distinct appelé ET-8.

Skogen et coll ont typé 47 isolats obtenus de 1957 à 1987 par MLEE et

ribotypage et ont montré que le ribotype G4 existait au moins 5 ans avant

l’épidémie (139). Alors que durant la période 1957-1985, le ribotype M11 était

en circulation, retrouvé dans 47% des souches, le ribotype G4 était observé


62

dans 13% des souches collectées durant la période 1984-1987 et toutes ces

souches ont été particulièrement isolées de différentes régions de Russie.

Ces dernières analysées par MLEE étaient regroupées aussi au sein de

l’electrophoretype ET-8. Ces résultats ont suggéré que ce ribotype G4 faisait

probablement partie intégrante du réservoir endémique qui existait dans l’ex-

Union Soviétique au moins 5 ans avant le début de l’épidémie.

L’étude d’autres isolats a révélé qu’il n’y avait pas de corrélation entre biotype

et ribotype et les préfixes G et M ont été remplacés par D (Diphtheria).

Pour faciliter les échanges des données sur la diphtérie, une nomenclature

internationale et une méthodologie du ribotypage ont été décrites par Grimont

et coll. en 2004 (72). Les noms des ribotypes étaient basés sur la région d’où

la souche a été isolée pour la première fois. Le ribotype G1 est actuellement

appelé Saint-Pétersbourg, G4 Rossija et M1 Otchakov (72) (se reporter au

chapitre II.2.2 sur le ribotypage).

La Biélorussie a été aussi affectée par l’épidémie et l’étude menée sur 102

souches collectées entre 1996-1997 a indiqué que l’épidémie était également

associée aux ribotypes D1 et D4 (Saint-Pétersbourg et Rossija selon la

nomenclature internationale) (140).

Les variations de l’épidémiologie moléculaire ont été étudiées par Kolodkina et

coll. sur 3513 souches de C. diphtheriae collectées de 1996 à 2006 en

Biélorussie (76).


63

La période post-épidémique était caractérisée par la diminution des souches

toxinogènes (47% en 1996, 6% en 2005) et la variation de la distribution des

ribotypes épidémiques, Saint-Pétersbourg et Rossija. Alors que la proportion

du ribotype Saint-Pétersbourg a diminué considérablement (24% en 1996-

2000, 2% en 2001-2005), celle du ribotype Rossija a augmenté de 25% à

49%. De façon concomitante, les souches non toxinogènes avec les ribotypes

Cluj et Rossija ont augmenté de 4% à 30% et de 37% à 49%.

Dans les années récentes, la couverture vaccinale chez la population de

Biélorussie était de 92%. Il est suggéré qu’une pression de sélection est

causée par la vaccination ce qui entraine la circulation de souches non

toxinogènes (76).

Sulakvelidze et coll ont étudié 62 souches de C. diphtheriae isolées en

Géorgie durant 1993 et 1998 par RAPD, PFGE et ribotypage. Un ribotype R1

prédominant a été retrouvé et qui était identique aux souches épidémiques

prédominantes isolées durant l’épidémie de diphtérie concomitante en Russie

(78).

En Algérie, Belhocine et coll. ont étudié 70 souches de C. diphtheriae isolées

durant la période épidémique entre 1993 et 1996 par ribotypage. 5 ribotypes

ont été identifiés (R1 à R5). Le ribotype R1 était prédominant et sans lien avec

le biotype, le toxinotype et l’antibiotype (77). Cependant, ces souches n’ont

pas été comparées au clones épidémiques ayant causé l’épidémie de Russie.


64

De zoysa et coll. ont étudié en 2008 la diffusion des souches de C. diphtheriae

et leur origine (cas autochtones ou importés). Sept cent cinquante cinq

souches collectées de 26 pays d’Europe, de Russie, d’Asie, des Etats-Unis,

d’Australie et de certains pays d’Afrique ont été analysées. L’étude a permis

de montrer que les épidémies de l’Europe de l’Est étaient causées par les

souches de ribotype Saint-Pétersbourg, Rossija et Otchakov. Les auteurs ont

montré aussi qu’en Russie le ribotype Saint-Pétersbourg prédominait dans

certaines régions et les ribotypes Rossija et Otchakov prédominaient dans

d’autres régions (75).

L’analyse des souches sporadiques de France, Italie, Roumanie et Pologne et

les souches épidémiques de Thailande, Vietnam, Suède et des USA a montré

que différents ribotypes sont observés dans différentes régions du monde et

que des clones distincts avaient causé chaque épidémie.

La majorité des cas importés au Royaume-Uni d’Afrique, d’Asie et du Moyen

Orient était causée par les isolats de biotype mitis toxinogènes et les ribotypes

de ces souches étaient distincts de ceux circulant en Europe et aux Etats-Unis

et apparaissent être caractéristiques des ribotypes trouvés dans ces pays.

Ces souches sont probablement endémiques dans ces pays.

L’étude a également rapporté la circulation de souches toxinogènes

endémiques dans certaines communautés durant au moins 25 ans.


65

Une étude récente menée en 2010 par Bolt et coll. a permis d’analyser 150

souches de distribution temporelle et géographique diverse couvrant une

période allant de 1957 à 2006 et originaires de 18 pays par MLST. Les

souches ont été comparées à 29 souches précédemment ribotypées et

regroupant 20 ribotypes. Au total 75 STs et 11 complexes clonaux ont été

identifiés (141). Deux complexes clonaux liés aux épidémies de diphtérie ont

été identifiés :

Le groupe eBURST 2 (composé de souches de ST-8, ST-12, ST-52 et ST-66)

associé à l’épidémie de l’ex-Union Soviétique avec 6 souches de ribotype

Saint-Pétersbourg ou Rossija appartenant au ST-8 (141).

Le groupe eBURST 9 (composé de ST-31 et de ST-4) associé à l’épidémie de

Haiti et la République Dominicaine de 2004 à 2006. Les souches appartenant

à ces STs étaient en circulation durant la période pré-épidémique (deux

souches de ST-31 et ST-4 collectées en 2000 et 1995 respectivement).

L’analyse MLST a indiqué également que certaines souches étaient

dispersées géographiquement (groupe eBURST 1 : Pologne, Russie,

Kazakhstan et Etats-Unis) alors que d’autres étaient associées à des régions

géographiques spécifiques (groupe eBURST 9 : région des caraïbes).

L’étude a permis de montrer de manière significative la diversité génétique

intra-espèce. Deux lignées principales ont été identifiées : la lignée 1,

regroupant les souches de biotype mitis, gravis et intermedius, toxinogènes et


66

non toxinogènes et la lignée 2, regroupant exclusivement les souches de

biotype belfanti non toxinogènes.

Actuellement en Europe, des souches de C. diphtheriae isolées de cas

sporadiques de diphtérie sont décrits. La MLST a permis de caractériser ces

souches. Both et coll. ont étudié en 2015 huit souches toxinogènes de

C. diphtheriae isolées en Angleterre entre 2008 et 2013 et ont montré que 7/8

souches représentaient de nouveaux STs. Toutes étaient associées à un

voyage récent à l’étranger. Il apparaît que malgré la couverture vaccinale

élevée, des souches de C. diphtheriae toxinogènes occasionnelles sont

identifiées. La surveillance continue est requise (120).

Des souches spécifiques ont été associées à des régions géographiques, par

exemples des souches atypiques de biotype mitis fermentant le sucrose sont

prédominantes au Brésil, alors que les souches de biotype gravis sont isolées

plus fréquemment dans les pays européens (142). Cependant des

changements périodiques de souches peuvent avoir lieu comme décrit (76).

II.4.4.2. La caractérisation moléculaire des souches de C. diphtheriae non

toxinogènes

L’émergence des infections invasives dues aux souches de C. diphtheriae a

été rapportée dans plusieurs pays ayant une couverture vaccinale élevée (28,

29, 143 à 148). Récemment, la MLST a été utilisée pour déterminer leur

origine clonale. Farfour et coll. ont mené une étude en 2012 sur 42 souches


67

invasives de C. diphtheriae provenant de France, de Pologne et de Nouvelle

Calédonie, isolées entre 1987 à 2010. Ils ont montré qu’un ST prédominant

impliqué dans des infections invasives non liées était retrouvé dans chaque

région géographique. ST-8 en Pologne, ST-82 en Nouvelle Calédonie et ST-

130 en France. Les souches invasives étaient de biotype mitis et gravis et non

toxinogènes. De plus, certains STs étaient localisés dans des régions

géographiquement éloignées reflétant leur capacité à diffuser et les souches

causant des bactériémies étaient également responsables d’infections non

invasives, notamment des cas de diphtérie (149).

Une autre étude menée en France sur 103 souches de C. diphtheriae non

toxinogènes isolées entre 1977 à 2011 a montré le remplacement des

souches toxinogènes de biotype mitis et gravis au profit des souches non

toxinogènes de biotype mitis, gravis et surtout belfanti. De plus, sa structure

de population est celle d’un important complexe clonal distinct des autres

biotypes. Divers STs ont été identifiés mais étaient regroupés dans un petit

nombre de complexes clonaux, dispersés géographiquement et représentés

en Europe de l’Ouest (groupes eBURST 1, 3, 11 et 13), en Amérique du Nord

(groupes eBURST 1, 3 et 12) et en Amérique du Sud (groupe eBURST 13).

Le séquençage du gène dtxR, gène régulateur de l’expression du gène tox a

montré qu’il est similaire au gène porté par les souches toxinogènes,


68

suggérant que si ces souches sont lysogénisées par un corynéphage β portant

le gène tox, elles pourront exprimer la toxine diphtérique (89).

En 2014, Zakikhany et coll. ont étudié 108 souches de C. diphtheriae biotype

mitis isolées au Royaume-Uni entre 2003 et 2012 et ont identifié 5 souches

non toxinogènes mais portant le gène tox appelées « non-toxigenic tox gene-

bearing » (NTTB), collectées entre 2011 et 2012. Parmi ces souches 4/5

étaient isolées chez des cas humains et appartenaient au même ST-212.

Une souche était isolée chez un chat de compagnie et appartenait au ST-40.

Ces observations indiquent la circulation continue de souches toxinogènes

potentielles (150).

II.4.5. Sensibilité aux antibiotiques et support génétique de la résistance

aux antibiotiques de C. diphtheriae

Les souches de C. diphtheriae sont sensibles à la plupart des β-lactamines

(notamment pénicilline G et amoxicilline) et aux macrolides. Cependant, la

tolérance ou la résistance à la pénicilline a été rapportée dans différents pays

(144, 151 à 155). Des souches résistantes à la pénicilline ont été isolées

d’infections invasives (149) et de cas de diphtérie (155, 156). Cependant la

résistance à cet antibiotique a été notifiée très rarement. Néanmoins,

l’insuffisance d’élimination de C. diphtheriae des patients atteints de diphtérie

et des porteurs sains traités avec la pénicilline a été rapportée depuis

plusieurs années (157, 158). Von Hunolstein et coll. ont étudié en 2002 la CMI


69

et la CMB de la pénicilline pour 24 souches de C. diphtheriae non toxinogènes

et ont trouvé que pour 71% des souches, le rapport CMB/CMI était ≥32,

indiquant une tolérance (154).

Une résistance ou une sensibilité réduite aux C3G est de plus en plus décrite,

notamment chez les souches de C. diphtheriae non toxinogènes (153, 155).

Une sensibilité réduite au céfotaxime a été décrite (Figure II.21) en Pologne

(144) et en Italie (159). Cette résistance est souvent associée à la résistance à

d’autres antibiotiques telles que macrolides, chloramphénicol, tétracycline, co-

trimoxazole et plus rarement pénicillines (89, 153, 155, 156, 160, 161).

Le mécanisme de résistance généralement invoqué est celui d’un défaut de

perméabilité ou d’affinité de la paroi bactérienne à ces antibiotiques (158).

Figure II.21. CMI du céfotaxime (1 µg/ml) vis-à-vis d’une souche de

C. diphtheriae



70

La résistance à l’érythromycine a été rapportée et supposée être associée aux

bactéries corynéformes colonisant la peau (162, 163).

La première description de la résistance à l’érythromycine et à la lincomycine

date de 1973 (4). La résistance de C. diphtheriae à l’érythromycine a été

rapportée plus souvent que la pénicilline. Les souches résistantes à

l’érythromycine ont été identifiées au Vietnam (164), en France (153), aux

USA (4) et en Russie (156). La fréquence de souches résistantes aux

macrolides isolées de cas de diphtérie au Vietnam en 1995-1996 était de 27%

(75).

La résistance à l’érythromycine peut être induite par des concentrations sub-

inhibitrices de l’antibiotique. Il est intéressant de noter que les concentrations

sub-inhibitrices de l’érythromycine induisent aussi une résistance à la

clindamycine (4, 164).

Il a été démontré que la résistance à cette famille d’antibiotiques était codée

par un gène ermCd (4). Cette résistance est à médiation plasmidique.

Schiller et Serwold-Davis ont montré que le plasmide est étroitement lié à celui

des corynéformes de la peau. Donc, il est supposé que la flore de la peau peut

servir comme réservoir de la résistance plasmidique pour ce pathogène.

Cependant, malgré la fréquence élevée de portage plasmidique par les

corynéformes de la peau, le portage plasmidique de C. diphtheriae est rare

(144, 155, 162).


71

D’autres résistances à d’autres antibiotiques incluant la rifampicine, la

tétracycline et l’aztréoname ont été rapportées (152 à 157, 165).

La résistance aux antibiotiques de C. diphtheriae diffère selon les pays. Les

variations du biotype et du toxinotype n’ont pas d’effet sur la résistance des

souches (155, 166).

Un haut niveau de résistance parmi les souches de C. diphtheriae au co-

trimoxazole a été décrit en Inde atteignant plus de 83% (167). Contrairement,

en France, Barraud et coll. ont rapporté une seule souche présentant un haut

niveau de résistance au triméthoprime, sulfaméthoxazole et co-trimoxazole sur

les 46 souches de C. diphtheriae étudiées. Cette souche possédait le gène

Int1 (168). En Russie, une résistance au triméthoprime atteignant 2% a été

également décrite (152). Dans une étude menée en France en 2013 sur 103

souches de C. diphtheriae isolées entre 1977 à 2011, Farfour et coll. ont

retrouvé une souche ayant une résistance intermédiaire à la pénicilline G, au

céfotaxime et au co-trimoxazole et résistante à la tétracycline. Les isolats

collectés depuis 1997 avaient une sensibilité diminuée aux antibiotiques (89).

Un haut niveau de résistance (86%) à la tétracycline a été rapporté en

Indonésie (165) mais aussi en Europe de l’Ouest (4) et au Brésil (155) (Figure

II.22).

Le plasmide pTP10 possédant deux gènes tet(A) et tet(B) dont les produits

appartiennent à la superfamille des transporteurs ABC a été détecté dans une


72

souche de C. striatum. Ils confèrent la résistance à la tétracycline et à

l’oxacilline en augmentant leur CMI d’au moins huit fois (158). D’autres

plasmides, pAG1 et pTET3, présents dans C. glutamicum possèdent un gène

codant pour une protéine similaire à celles impliquées dans les mécanismes

d’efflux transmemebranaire de ces antibiotiques. La modification d’une porine

chez C. glutamicum entraîne une résistance à plusieurs antibiotiques dont la

tétracycline (158, 159).

Figure II.22. CMI de la tétracycline (12 µg/ml) vis-à-vis d’une souche de

C. diphtheriae


Bien que rares, des souches de C. diphtheriae multi-résistantes (MDR) ont été

aussi décrites récemment (144, 155, 160). Les phénotypes de résistance

multiple ont été rapportés au Brésil où 95,7% des souches étaient résistantes


73

entre 4 à 7 antibiotiques testés. Parmi ces souches, 8,5% des souches avaient

une multirésistance à 7 antibiotiques : mupirocine, pénicilline et/ou ampicilline,

oxacilline, ceftazidime, aztréoname, tétracycline, et/ou lincomycine,

clindamycine et érythromycine (155). En Russie, une étude menée sur 130

souches de C. diphtheriae a montré 2,3% de souches résistantes à

8 antibiotiques : pénicilline G, ampicilline, oxacilline, chloramphénicol,

érythromycine, lincomycine, triméthoprime et nitroxoline (156) (Figure II.23).

Au Canada, la première souche de C. diphtheriae multirésistante a été décrite

en 2011. La souche était résistante à la clindamycine, érythromycine,

tétracycline, co-trimoxazole et de résistance intermédiaire au cèftriaxone et au

céfotaxime (160). Des souches multi-résistantes ont été aussi décrites au

Vietnam (164) et en France (153).


74

Figure II.23. CMI du chloramphénicol (24 µg/ml) vis-à-vis d’une souche de

C. diphtheriae


Un plasmide (R-pasmid p TP10) a été détecté chez des souches de

Corynebacterium xerosis résistantes au chloramphénicol, érythromycine,

kanamycine et tétracycline (170). Aussi, un transposon (Tn5564) a été

caractérisé chez des souches de Corynebacterium striatum résistantes au

chloramphénicol (171). La détection d’intégrons de classe 1 chez

C. glutamicum et C. striatum a été également rapportée (172, 173).

II.5. Surveillance de la diphtérie

Avant l’ère de la vaccination, la diphtérie était une cause fréquente de la

morbidité et la principale cause de la mortalité infantile dans le monde.

L’introduction de la vaccination, notamment l’établissement du programme


75

élargi de vaccination en 1974, a permis de diminuer considérablement la

maladie qui a atteint les plus faibles taux d’incidence dans les années 1980s.

Cependant au début des années 1990s, la résurgence de la diphtérie est

survenue dans la Fédération de Russie, affectant tous les états nouvellement

indépendants de l’ex-Union Soviétique. En Afrique, l’Algérie a également

connu la survenue d’épidémie de diphtérie à la même période atteignant en

1995 plus de 1000 cas avec plus de 10% de décès (127).

Bien qu’actuellement la diphtérie soit contrôlée, cette épidémie a mis la

lumière sur le danger continu de la diphtérie et le besoin de la vigilance même

dans les pays où le nombre de cas rapportés est habituellement faible.

Bien qu’aucun cas de diphtérie n’ait été enregistré en Algérie depuis 2007, elle

est régulièrement rapportée par d’autres pays occasionnant parfois des

épidémies notamment en Inde, en Indonésie et au Soudan.

Le risque de survenue de diphtérie ou d’importation de C. diphtheriae de pays

endémiques est réel. Le cas récent de diphtérie autochtone enregistré en

Espagne en mai 2015, les cas importés de diphtérie cutanée chez des

réfugiés, déclarés dans plusieurs pays d’Europe en juin 2015 en sont

l’illustration parfaite.

Le but de la surveillance est de donner suffisamment d’information pour

permettre aux pays de prendre dans les meilleurs délais les actions de santé

publique nécessaires pour la prévention et le contrôle de la diphtérie.


76

Les principaux objectifs de la surveillance sont :

- l’estimation du fardeau de la maladie dans la population, l’évaluation du

danger pour la santé publique et l’identification des facteurs de risque de

portage, de transmission et des complications.

- la surveillance de l’efficacité des programmes de contrôle, l’information des

autorités sanitaires et la diffusion de l’information de santé publique

appropriée.

- la surveillance des variations phénotypiques et génotypiques des souches en

circulation.

Pour les pays où la diphtérie est contrôlée, les principaux défis de la

surveillance (4) sont :

- l’identification et le traitement des cas dans les meilleurs délais.

- le maintien de cette expertise face à la faible prévalence de la maladie.

- la surveillance de la couverture vaccinale dans les différents groupes d’âge

et le maintien d’une couverture vaccinale élevée, atteignant une couverture

vaccinale au minimum à 95%, telle recommandée par L’OMS.

III. PROBLEMATIQUE ET

OBJECTIFS

PROBLEMATIQUE ET OBJECTIFS

77

III. PROBLEMATIQUE ET OBJECTIFS

III.1. Problématique

Depuis l’introduction de la vaccination, l'incidence de la diphtérie en Algérie a

diminué régulièrement de 3.97/100,000 habitants en 1963-1969 à 1,78

/100000 habitants en 1970-1980 et finalement à 0.07/100,000 habitants en

1981-1989. Depuis 1990, il y a eu résurgence de la maladie dans plusieurs

régions du pays (Batna, Bouira, Tamanrasset, El-Oued, Bejaia, Djelfa, Adrar,

Tizi-Ouzou), avec des épidémies importantes entre 1993 et 1995, année où la

mortalité a atteint 10, 8%. La maladie a essentiellement touché les

adolescents et les adultes jeunes (127, 174). Les campagnes de vaccination

menées ainsi que les rappels additionnels à 11-13 ans, à 16-18 ans et tous les

10 ans, inclus dans le calendrier vaccinal depuis 1997, ont aidé à diminuer

l'incidence de la maladie à moins de 3 cas par an pendant la décennie 2000-

2009. Aucun cas de diphtérie n'a été rapporté en 2002 et depuis 2007 à nos

jours. Par contre des cas ont été notifiés en 2003 (Tiaret 07 cas), en 2004

(Tamanrasset 08 cas), en 2005 (Mila 04 cas et Adrar 03 cas) et en 2006

(Adrar 03 cas) (128). Il s’agissait de cas sporadiques.

Sur le plan de l’épidémiologie moléculaire, des études réalisées en Russie

(108, 139, 175) ont révélé que les souches en circulation durant les 5 années

précédant une épidémie étaient retrouvées au cours de cette épidémie, ceci


78

prouve l’importance, pour mettre en place les mesures préventives

appropriées et distinguer entre les souches épidémiques, endémiques et

importées; d’établir une surveillance continue de ces souches à l’aide d’outils

performants et enfin de déterminer l’origine clonale des souches.

Les outils moléculaires les plus utilisés sont l’électrophorèse en champ pulsé

et le ribotypage. Cependant ces méthodes bien que considérées

comme « gold standard » pour leur pouvoir discriminant, présentent des

limites.

Concernant l’électrophorèse en champ pulsé, d’une part, des variations dans

les conditions d’électrophorèse peuvent modifier la migration des bandes

influant l’interprétation, d’autre part, plusieurs souches ne sont pas typables

par cette technique. De plus, elle nécessite un long délai pour l’obtention de

résultats. (75, 108, 175).

Le ribotypage, présente l’inconvénient de manque de répétabilité (variations

intra-laboratoires) et de reproductibilité (variations inter-laboratoires). Aussi, il

ne distingue pas de manière catégorique les souches épidémiques de celles

non épidémiques (73, 108, 175).

Egalement, c’est une procédure de travail lourde que l’automatisation des

étapes expérimentales (grâce à l’appareil RiboPrinter) a permis de pallier à

cette contrainte en offrant un débit élevé mais cette dernière a une résolution

moindre par rapport à la méthode manuelle dans certains cas (73).


79

L’électrophorèse en champ pulsé aussi bien que le ribotypage ne permettent

pas des analyses significatives sur les relations évolutives des bactéries (6).

La technique MLST, nouvellement adaptée pour le typage de

Corynebacterium diphtheriae, permet de surmonter ces ambiguités (6, 83, 84)

en fournissant des données basées sur la variation des séquences dans les

gènes constitutifs.

C’est une méthode automatisée claire, reproductible et adaptable et présente

une bonne capacité de discrimination permettant de différencier les souches.

Aussi, elle permet d’étudier les relations évolutives entre bactéries (6, 83, 84).

Aucune étude n’a été menée pour le typage moléculaire par MLST des

souches algériennes, en outre les résultats de ribotypie (données non

publiées) sont partiels et ne permettent pas un échange de données car n’ont

pas adopté la nomenclature internationale (décrite qu’en 2004 par Grimont et

coll) pour la classification des ribotypes.

Dans le cadre du diagnostic, les laboratoires ne disposent que de peu de

moyens pour la révélation du caractère toxinogène. En effet, seul le

laboratoire de référence de l’IPA pratique à ce jour la toxinotypie par test

d’Elek et PCR conventionnelle. De plus, aucun laboratoire n’effectue ce type

de recherche par techniques moléculaires automatisées, en l’occurrence la


80

PCR en temps réel qui pose dans un délai très court, le diagnostic de souche

toxinogène directement à partir des prélèvements pathologiques.

Devant la grande implication de la santé publique en cas d’isolement d’une

souche de Corynebacterium diphtheriae toxinogène, il est important que le

laboratoire soit capable de donner une réponse rapide lors d’épidémie. Pour

cela, les moyens adéquats doivent être mis à sa disposition.

Sur le plan de la sensibilité aux antibiotiques de Corynebacterium diphtheriae

dans notre pays, les souches isolées durant la période 1993-2013 ont

présenté les particularités suivantes : la quasi-totalité de ces isolats ont

présenté une résistance au céfotaxime, à la tétracycline et au

chloramphénicol. Suite aux recommandations du CLSI pour Corynebacterium

publiées en 2010, les antibiotiques suivants : pénicilline, céfotaxime,

érythromycine, gentamicine, vancomycine, tétracycline, chloramphénicol et co-

trimoxazole; ont fait l’objet d’une détermination de CMI ainsi que la

détermination de la CMB vis-à-vis de la pénicilline afin d’une part de mieux

étudier le phénomène de tolérance à la pénicilline et d’autre part, d’étudier la

sensibilité aux antibiotiques par la technique standardisée. Enfin, il a fallu

identifier le support génétique de la résistance au céfotaxime, à la tétracycline

et au chloramphénicol de nos souches.


81

III.2. Objectifs

- Objectifs principaux

o Déterminer les clones des souches de Corynebacterium

diphtheriae par MLST (Multi Locus Sequence Typing).

o Etudier temporellement et géographiquement la population des

souches de Corynebacterium diphtheriae.

o Examiner la relation entre biotypes, souches toxinogènes et non-

toxinogènes.

- Objectifs secondaires

o Mettre en place le diagnostic rapide de Corynebacterium

diphtheriae toxinogène par la technique de PCR en temps réel.

o Etudier la sensibilité des souches aux antibiotiques suivants :

pénicilline, céfotaxime, gentamicine, vancomycine, tétracycline,

chloramphénicol et co-trimoxazole.

o Etudier la tolérance des souches vis-à-vis de la pénicilline G.

o Déterminer le support génétique de la résistance des souches aux

antibiotiques.

IV. MATERIEL ET METHODES

MATERIEL ET METHODES

82

IV. MATERIEL ET METHODES

IV.1. Matériel d’étude

IV.1.1. Population d’étude

L’étude a porté sur des souches bactériennes de Corynebactérium diphtheriae

provenant de 122 patients atteints de diphtérie et 28 patients souffrant de

rhinite chronique atrophique (ozène), donc sur un total de 150 patients.

Il s’agit de patients de tout âge, des deux sexes, originaires de différentes

régions du pays, recrutés durant les périodes épidémique et post-épidémique,

allant de 1993 à 2013.

IV.1.2. Critères d’inclusion

Toutes les souches isolées et confirmées au laboratoire de bactériologie

médicale à l’IPA, provenant de patients atteints de diphtérie, colonisés par

C. diphtheriae ou atteints de rhinite chronique atrophique dont les infections ou

le portage étaient documentés ont été incluses.

IV.1.3. Type d’étude

Il s’agit d’une étude descriptive phénotypique et génotypique concernant des

souches provenant de patients infectés ou colonisés par C. diphtheriae.

Tous les paramètres ont été étudiés sur 150 souches de C. diphtheriae,

excepté pour la détermination du toxinotype par PCR en temps réel (n=30), de

la tolérance à la pénicilline (n=30), du support génétique de la résistance aux


83

antibiotiques (n=30) et des sequence types (n=76) pour cause d’épuisement

de réactifs.

Les facteurs étudiés dans cette population sont listés ci-dessous :

- la distribution temporo-spatiale des souches de C. diphtheriae (n=150).

- la biotypie et la toxinotypie des souches C. diphtheriae (n=150).

- la sensibilité aux antibiotiques notamment la pénicilline, le céfotaxime,

l’érythromycine, la gentamicine, la vancomycine, la tétracycline, le

chloramphénicol et le co-trimoxazole chez les souches de C. diphtheriae

(n=150).

Bien que la tétracycline et le chloramphénicol ne soient pas utilisés pour le

traitement de la diphtérie, l’étude de la sensibilité à ces molécules a été

effectuée dans le cadre de l’évaluation globale de la résistance des souches

de C. diphtheriae aux antibiotiques, surtout qu’actuellement des souches

multirésistantes aux antibiotiques sont décrites.

L’étude de la sensibilité aux sulfamides n’a pas été réalisée, d’une part parce

qu’il n’y a pas d’indication thérapeutique pour cet antibiotique et d’autre part

par absence de valeurs critiques. Elle a été remplacée par l’étude de la

sensibilité au co-trimoxazole.

- l’étude de la détermination du toxinotype par PCR en temps réel chez les

souches de C. diphtheriae (n=30).


84

- l’étude de la tolérance à la pénicilline chez les souches de C. diphtheriae

(n=30).

- l’étude du support de la résistance aux antibiotiques chez 30 souches de

C. diphtheriae (n=30).

- la détermination des sequence types (STs) des souches de C. diphtheriae

(n=76).

Les deux techniques à savoir le ribotypage et la PFGE n’ont pas été

effectuées parce que ces dernières ont été remplacées par la MLST.

En effet, bien que le ribotypage reste une technique de référence, elle est très

peu pratiquée et réservée actuellement à certains laboratoires de référence à

l’échelle mondiale ; c’est une technique lourde qui pose des problèmes de

reproductibilité. En conséquence, l’étude comparative des trois techniques n’a

pas été réalisée.

IV.2. Méthodes

IV.2.1. Les isolats cliniques

Les souches de C. diphtheriae sont listées en annexe 3. La répartition

temporelle et géographique des souches était diverse avec des isolats

provenant de 19 villes et couvrant une période de 21 ans.


85

IV.2.2. Culture

Les souches ont été ensemencées sur gélose base sang additionnée de 5%

de sang de mouton et sur milieu Tinsdale et incubées pendant 24 à 48 heures

à 35°C en atmosphère normale.

IV.2.3. Technique microscopique : coloration de Gram

La coloration de Gram a été effectuée sur des frottis de la suspension

bactérienne sur lame.

IV.2.4. Identification biochimique et détermination du biotype

L’identification biochimique et la détermination du biotype des souches ont été

effectuées en utilisant les galeries biochimiques miniaturisées API Coryne

(bioMérieux, Marcy l’Etoile, France) en suivant les instructions du fabricant.

IV.2.5. Détermination du toxinotype

IV.2.5.1. Détermination du toxinotype par test d’Elek

- Milieux et réactifs

- Milieu Elek

- Sérum de veau foetal

- Antitoxine diphtérique à 1000 UI/ml (Serum Institute of India, Inde ; NIBSC,

Royaume-Uni)

- Souches témoins (Institut Pasteur de Paris, France)

C. diphtheriae subsp mitis toxinogène A102 Pw8

C. diphtheriae subsp mitis non toxinogène ATCC 100127


86

Ou

C. diphtheriae subsp gravis fortement toxinogène NCTC 10648

C. diphtheriae subsp belfanti non toxinogène NCTC 10356

- Mode opératoire

20 ml de milieu d’Elek fondu et ramené à 45°C sont additionnés de 4 ml de

sérum de veau fœtal, verser dans une boîte de Pétri de 90 mm de diamètre.

Avant solidification, une bande de papier Whatman de 6 cm sur 1 cm

imprégnée d’antitoxine diphtérique à raison de 1000 UI/ml et égouttée est

introduite, laisser alors durcir.

La boîte inoculée par stries perpendiculaires à la bande avec les souches à

tester (en prenant soin de prélever 6 à 10 colonies différentes, car il y a le

risque de prélever une colonie tox-) en présence de deux souches témoins,

l’une toxinogène et l’autre non toxinogène.

Incuber à 35°C, observer après 24 et 48 heures l’apparition des lignes de

précipitation caractéristiques d’une réaction antigène-anticorps.

- Interprétation

L’apparition des arcs de précipitation est le signe de positivité, ils seront pris

en compte lorsqu’ils se trouvent à 10 mm de la jonction bande-strie.

La lecture se fait après 24 et 48 heures.


87

IV.2.5.2. Détermination du toxinotype par PCR conventionnelle

- Extraction d’ADN

L’ADN bactérien de C. diphtheriae a été extrait par le kit DNeasy® Blood &

Tissue (QIAGEN) et le kit PureLink® Genomic DNA (invitrogen™, life

technologies™) en suivant les recommandations des fabricants.

Les protocoles d’extraction sont détaillés en annexes 4 et 5.

- Amplification de l’ADN

- Principe :

Amplification par PCR point final d’un fragment de 910 pb du gène tox codant

la toxine diphtérique (176). L’amplification s’est effectuée selon le protocole

ci-dessous sur l’appareil thermocycler GeneAmp PCR System 9700 (Applied

Biosystems) (Figure IV.1).

- Amorces

DT1 : cggggatggtgcttcgcg

DT2 : cgcgattggaagcggggt

- Mélange réactionnel :

H2O : 25,25 µl

Tampon 10X : 5 µl

MgCl2 50 mM : 1,5 µl

dNTPs 2 mM : 5 µl

DT1 10mM : 5 µl


88

DT2 10mM : 5 µl

Taq polymerase 5 UI/µl : 0,25 µl

ADN : 3 µl

- Programme :

94°C (2 mn)

94°C (20 sec)

62°C (30 sec) 35 cycles

72°C (30 sec)

15°C (∞)


89

Figure IV.1. Thermocycler GeneAmp PCR System 9700

(Applied Biosystems)


- Révélation

L’électrophorèse s’est effectuée sur gel d’agarose à 1%. Le tampon utilisé

était le tampon TAE 1 X.

Dépôt des échantillons et migration : trois µl de bleu de bromophénol sont

ajoutés à 7 µl d’échantillon et déposés dans les puits. Trois µl de marqueur de

poids moléculaire 1 Kb sont déposés dans le premier puits du gel.

Faire migrer pendant ½ h à ¾ h à 80 V.

La lecture des résultats s’est faite sur l’appareil Gel Doc XR System (Bio-Rad)

(Figure IV.2).


90

Figure IV.2. Appareil Gel Doc XR System (Bio-Rad)



91

- Interprétation des résultats

Le témoin positif donne une bande à la taille attendue, le témoin négatif ne

donne pas de bande et l’échantillon est positif si la bande est alignée avec

celle du contrôle positif.

IV.2.5.3. Détermination du toxinotype par PCR en temps réel

- Principe

La détection de l’ADN du gène tox de C. diphtheriae par la technique 5’

nucléase fluorogénique est une technique de PCR en temps réel qui utilise

des sondes fluorogéniques, consistant en un oligonucléotide avec un

« reporter dye » attaché en 5’ et un « quencher dye » attaché en 3’. La sonde

s’apparie à une cible spécifique localisée entre les amorces « forward » et

« reverse ». Durant la phase d’extension de la PCR, l’activité 5’ nucléase de la

Taq polymerase dégrade la sonde causant la séparation du « reporter dye »

du « quencher dye » et le signal fluorescent est ainsi généré. A chaque cycle,

les molécules de « reporter dye » ajoutées sont clivées de leurs sondes

respectives et l’intensité de la fluorescence est surveillée durant la PCR (177).

Chaque échantillon d’extrait d’ADN réagit avec chacun des deux ensembles

d’amorce/sonde séparément. Ces ensembles amorces/sonde détectent la

présence de la sous-unité A et B du gène tox de C. diphtheriae et se réfèrent à

la sous-unité A et la sous-unité B.


92




technologies™) en suivant les recommandations des fabricants. Les

protocoles d’extraction sont détaillés en annexes 4 et 5.

- Contrôle de qualité :

Les extraits de blancs doivent être testés pour assurer l’absence de

contamination croisée durant l’extraction d’ADN.

Le témoin mix utilisant de l’eau stérile à la place de l’ADN doit être inclus pour

assurer l’absence de contamination croisée durant la PCR.

L’extrait d’ADN de la souche de C. diphtheriae subsp. gravis NCTC 10648 doit

être inclus comme témoin positif pour chaque expérience.

L’extrait d’ADN de la souche de B. pertussis est inclus comme témoin négatif.

- Amplification et détection de l’ADN

- Equipement et consommables :

Light Cycler 480 version II (Figure IV.3)

Plaques de 96 cupules

Bandelettes adhesives

- Amorces (Applied Biosystem) :

Primer A Fwd : ggcgtggtcaaagtgacgta

Primer A Rev : cttgctccatcaacggttca


93

Primer B Fwd : cgccctaaatctcctgtttatgtt

Primer B Rev : gtacccaagaacgcctatggaa

- Sondes Taq Man Tamra Probes (Applied Biosystem) :

FAM ttcacagaagcagctcggagaaaattcattc

FAM ccaggactgacgaaggttctcgcact

- Préparation du mélange réactionnel :

Fragment A (1 µM) ou Fragment B (1 µM) : 2 µl

Sonde 2 (0,1µM) ou Sonde 1 (0,1µM) : 2 µl

Eau ultra pure : 2 µl

LightCycler® 480 Probes Master mix (2X) : 10 µl

ADN : 2 µl

Eau : 2 µl dans master mix

Tester en duplicate et un triplicate avec une dilution au 1/5 pour chaque

échantillon.


94

- Programme :

Conditions thermiques des cycles

Cible Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4

Pré-

incubation

(1 cycle)

Dénaturation

(1 cycle)

Amplification

(45 cycles)

Refroidissement

(1 cycle)

Sous-

unité A

50°C - 2

mn

95°C - 10

mn

95°C - 5

sec

60°C –

30 sec

40°C – 1 mn

Sous-

unité B

50°C - 2

mn

95°C - 10

mn

95°C - 5

sec

60°C –

30 sec

40°C – 1 mn

Figure IV.3. Light Cycler 480 version II (Roche)



95


Le témoin positif donne une fluorescence avec un Ct 35, le témoin négatif ne

donne aucune fluorescence et l’échantillon est positif si fluorescence 40.

Le Ct (cycle threshold) ou cycle seuil est défini comme le nombre de cycles

nécessaires pour le signal fluorescent à franchir le seuil. Il représente

l’intersection entre la courbe d’amplification et la ligne seuil. C’est une mesure

relative de la concentration de la cible déterminée automatiquement par le

logiciel intégré dans l’appareil de PCR en temps réel. Les niveaux de Ct sont

inversement proportionnels à la quantité d'acide nucléique cible dans

l'échantillon (par exemple le niveau du Ct est d’autant plus faible que la

quantité d'acide nucléique cible dans l'échantillon est élevée).

IV.2.6. Détermination des CMIs et étude de la sensibilité aux

antibiotiques

La sensibilité aux antibiotiques des souches de C. diphtheriae a été réalisée

par la méthode du E-test (biomérieux, Marcy l’etoile, France) en milieu gélosé

Mueller-Hinton additionné de 5% de sang de mouton.

Les antibiotiques testés ont été : pénicilline, céfotaxime, érythromycine,

gentamicine, vancomycine, tétracycline, chloramphénicol et co-trimoxazole.

La technique de CMI préconisée est la technique de dilution en milieu liquide

selon les recommandations du CLSI pour Corynebacterium (178). Cependant,

vu que cette technique est lourde et tenant compte de la bonne corrélation des


96

performances de la méthode du E-test versus méthode de dilution en milieu

liquide rapportée dans des études précédentes (179), nous avons opté pour la

méthode du E-test (Figures IV.4a et IV.4b).

L’interprétation des résultats a été effectuée selon les recommandations du

CLSI 2010 pour Corynebacterium (178) et du CLSI 2015 pour les

streptocoques β-hémolytiques concernant le chloramphénicol (180), sachant

que pour ce dernier, le CLSI ne donne pas de valeurs critiques concernant

Corynebacterium.


97

Figure IV.4a. CMIs de la tétracycline (TC) (12 µg/ml), gentamicine (GM)

(0,75 µg/ml), co-trimoxazole (TS) (0,125 µg/ml) et érythromycine (EM)

(0,016 µg/ml) vis-à-vis d’une souche de

C. diphtheriae



98

Figure IV.4b. CMIs du céfotaxime (CT) (1 µg/ml) , pénicilline G (PG) (0,125

µg/ml) , vancomycine (VA) (0,5 µg/ml) et chloramphénicol (CL) (24 µg/ml)

vis-à-vis d’une souche de C. diphtheriae



99

IV.2.7. Etude de la tolérance à la pénicilline

IV.2.7.1. Détermination de la CMI

La détermination de la CMI de la pénicilline s’est effectuée sur milieu

Mueller-Hinton liquide additionné de 5% de sang de cheval selon les

recommandations du CLSI 2010 pour Corynebacterium (Figure IV.5) (178).

Figure IV.5. Concentration minimale inhibitrice de la pénicilline vis-à-vis

d’une souche de C. diphtheriae (CMI à 0,25 µg/ml)


IV.2.7.2. Détermination de la CMB

La détermination de la CMB de la pénicilline s’est effectuée selon le protocole

suivant (158) :

A partir des tubes ayant servi pour déterminer la CMI :

- dénombrer les bactéries du tube témoin en effectuant quatre dilutions

sériées de 10 en 10 et ensemencer le tube témoin et chaque dilution sur


100

la surface d’une gélose bien sèche, en stries de 5 cm de long, à l’aide

d’une anse calibrée (10 µl) [4 à 5 stries par boîte].

- incuber la boîte témoin 18 h à 35°C.

- prélever une anse (10 µl) dans chaque tube resté clair et l’étaler en une

strie de 5 cm sur la surface d’une gélose bien sèche (4-5 stries par

boîte) et incuber jusqu’au lendemain à 35°C. La boîte témoin est

conservée au réfrigérateur.

- comparer la densité de chaque strie avec celle des stries obtenues sur

la boîte témoin.

Si la densité est comparable à celle obtenue avec :

- l’inoculum pur, il y a 100% de survivants

- l’inoculum dilué au 1/10, il y a 10% de survivants

- l’inoculum dilué au 1/100, il y a 1% de survivants

- l’inoculum dilué au 1/1000, il y a 0,1% de survivants

- l’inoculum dilué au 1/10000, il y a 0,01% de survivants

La CMB est définie par la concentration ne laissant persister que 0,01% de

survivants au plus (Figure IV.6).


101

Figure IV.6. Concentration minimale bactéricide de la pénicilline vis-à-vis

d’une souche de C. diphtheriae (CMB à 128 µg/ml)


IV.2.7.3. Détermination de la tolérance

Le rapport CMB/CMI permet d’apprécier la tolérance. Si ce rapport est

supérieur ou égal à 32, une tolérance peut être suspectée (158).

IV.2.8. Recherche de l’intégron de classe I par PCR conventionnelle







102

- Amplification

- Principe

Le principe de cette technique consiste à amplifier un fragment de 483 pb du

gène int1 codant pour l’intégron de classe 1 (181).

L’amplification s’est effectuée selon le protocole ci-dessous sur l’appareil

thermocycler GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) (Figure IV.1).

- Amorces

int1. F : GGG TCA AGG ATC TGG ATT TCG

int1. R : ACA TGC GTG TAA ATC ATC GTC G

- Contrôle positif

La souche pAT674 dans Escherichia coli JM83 KmR Integron de classe

1(Int1F/Int1R)

- Mélange réactionnel

Tampon 5X, MgCl2 (25 mM), dNTPs (2mM), Oligo 1 (10 µM), Oligo 1 (10 µM),

Taq polymerase (5UI/mL), H2O (QSP 50 µl) et ADN (5 à 10 µl).

- Programme d’amplification

Dénaturation : 94°C : 1 cycle

Amplification : 94°C, 60°C et 72°C : 30 cycles

Refroidissement : 60°C, 72°C et 4°C : 1 cycle


103

- Révélation

L’électrophorèse s’est effectuée sur gel d’agarose à 1,5%. Le tampon utilisé


Dépôt des échantillons et migration : 3 µ l de bleu de bromophénol sont

ajoutées à 7 µl d’échantillon et déposées dans les puits. 3 µl de marqueur de



La lecture des résultats s’est effectuée en utilisant l’appareil Gel Doc XR

System (Bio-Rad) (Figure IV.2).

IV.2.9. Génotypage par technique MLST

Dans cette partie de travail, la PCR MLST et le séquençage effectués pour 76

souches, ont été réalisés pour une partie à l’Institut Pasteur de Paris dans le

cadre d’un projet de recherche de collaboration, ACIP (n=21). L’autre partie

(n=55) a été réalisée à l’Institut Pasteur d’Algérie suite à l’acquisition de ces

techniques.

IV.2.9.1. PCR MLST







104

- Amplification

- Principe

Amplification par PCR des 7 gènes de ménage utilisés pour le typage de

C. diphtheriae par MLST (Figure IV.7) (141, 182).

L’amplification s’est effectuée selon le protocole ci-dessous sur l’appareil

thermocycler GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) (Figure IV.1).

- Choix des amorces

Gènes utilisés pour le typage MLST

Gène Fonction

atpA ATP synthase alpha chain

dnaE DNA polymerase III alpha subunit

dnaK Chaperone protein

fusA Elongation factor G

leuA 2-isoprophylmalate synthase

odhA 2-oxoglutarate dehydrogenase E1 and

E2 components

rpoB DNA-directed RNA polymerase beta

chain


105

Amorces pour PCR

Gène Direction Séquence de

l’amorce

Taille de

l’amplicon (pb)

atpA Fwd gcgattgcgaactacacc 1029

Rev ctcgaggaatacctracc

dnaE Fwd tgcgtcatctgattgaaa 581

Rev cggtccaataagacacca

dnaK Fwd acttgggtggcggtactt 696

Rev tggtgaacgtctcggaac

fusA Fwd taccgcgagaagctcgtt 683

Rev gaaggttgggtcctcttc

leuA Fwd cgtgcacttctacaactc 865

Rev accgtgatcggtcttcat

odhA Fwd cggcaaggaaascatgac 505

Rev gttgtcgccraacatctg

rpoB Fwd aagcgcaagatccaggac 845

Rev tcgaactcgtcgtcatcc


106

- Mélange réactionnel

Tampon 10X, DMSO (1X), MgCl2 (25 mM), dNTPs (10 mM), Amorce Fwd (10

µM), Amorce Rev (10 µM), Taq polymerase (5 UI/ml), H2O (QSP 50 µl) et

ADN (3 µl).

- Programme d’amplification

MLST Corynebacterium spp.

Dénaturation (1 cycle) 94°C

Amplification (35 cycles) 94°C

58°C

72°C

Refroidissement (1 cycle) 72°C

- Contrôle d’amplification de l’ADN : électrophorèse sur gel d’agarose

- Préparation du gel d’agarose 1% poids/volume

Peser la quantité nécessaire de poudre d’agarose et la dissoudre dans du

TAE 1X. Utiliser un flacon ayant un volume deux fois celui de TAE 1X utilisé.

Porter à ébullition la préparation d’agarose au micro-onde, jusqu’à dissolution

complète de l’agarose. Attention : dans le micro-onde, bien ouvrir

complètement le bouchon du flacon.

Sous la hotte chimique :


107

Introduire 1 goutte de BET (bromure d’éthidium) pour 100 ml de gel préparé,

agiter et refroidir quelques mn.

Monter le porte-gel et les peignes adéquats.

Couler le gel et laisser prendre en masse.

- Migration sur gel

L’électrophorèse a été réalisée sur gel d’agarose à 1,5%. Le tampon utilisé


Dépôt des échantillons et migration : 3 µ l de bleu de bromophénol sont

ajoutés à 7 µl d’échantillon et déposés dans les puits. 3 µl de marqueur de



La lecture des résultats s’est faite sur l’appareil Gel Doc XR System (Bio-Rad)

(Figure IV.2).


108

Figure IV.7. PCR MLST de souche de C. diphtheriae


M : marqueur de poids moléculaire 1kb, 1 : atpA, 2 : dnaE, 3 : dnaK, 4 : fusA, 5 : leuA,

6 : odhA, 7 : rpoB, 8 : contrôle eau. Les tailles des bandes sont données sur la photo en

paires de base.

IV.2.9.2. Séquençage

- Purification des amplifias d’ADN

Les produits de PCR MLST de l’ADN bactérien de C. diphtheriae ont été

purifiés en utilisant différents kits tels que Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up

System (Promega), PureLink® PCR Purification (invitrogen™, life

technologies™), QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN).

Les recommandations des différents fabricants ont été suivies pour l’exécution

des purifications des produits de PCR. Les protocoles de purification sont

détaillés en annexes 6, 7 et 8.


109

- PCR séquençage

- Principe

Le séquencçage de l’ADN consiste à déterminer l’ordre d’enchaînement des

nucléotides d’un fragment d’ADN donné. Le principe de la méthode de Sanger

consiste à initier la polymérisation de l’ADN à l’aide d’un oligonucléotide

(amorce) complémentaire à une partie du fragment d’ADN à séquencer.

L’élongation de l’amorce est réalisée par des ADN polymérases

thermostables, celles qui sont utilisées pour la PCR. Les quatre

désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) sont ajoutés, ainsi qu’en

faible concentration de l’un des quatre didésoxynucéotides fluorescents

(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP). Un séquenceur à capillaires (modèle à 4

capillaires ABIPRISM 3300 DNA Analyser, Applied Biosystems) est utilisé

pour la séparation et l’analyse des réactions de séquence.


110

Amorces pour séquençage

Gène Direction Séquence de l’amorce Taille de

l’amplicon (pb)

atpA Fwd agaaggcgacgaagtmaagc 378

Rev crgaatcagaagctggwgca

dnaE Fwd gtgcgacaagctggtgtg 354

Rev ggcttwcggccattyttg

dnaK Fwd agatggctatgcagcgtct 345

Rev gatgagcttggtcatcacg

fusA Fwd cgtaagctgaccgttaactc 360

Rev ccatggactcraggatga

leuA Fwd ccyatcatcatcaayctgcc 384

Rev cagctggttgcagtaytc

odhA Fwd tbcaagatcgcatygarrc 382

Rev twggctcgatgtgkccttc

rpoB Fwd cgwatgaacatyggbcaggt 342

Rev tccatytcrccraarcgctg


111

- Mélange réactionnel pour une réaction de séquence dans un

volume final de 10 µl

Tampon 5X version 3.1, Big Dye version 3.1, Amorce Fwd ou Rev (4 µM), H2O

(QSP 10 µl) et ADN (1 à 3 µl).

- Programme sur thermocycler ABI 9700

96°C (1 cycle), 50°C (25 à 35 cycles) et 60°C (1 cycle).

- Précipitation à l’éthanol

Déposer 80 µl d’éthanol à 80% (gardé à -20°C) dans chaque cupule de la

plaque à 96 cupules. Laisser 30 mn à T° ambiante. Centrifuger à 2500 rpm à

+4°C dans une centrifugeuse pour microplaques (Figure IV.8). Jeter le tout par

retournement de la plaque.

Déposer 80 µl d’éthanol à 70% (gardé à -20°C). Centrifuger à 3500 rpm à

+4°C. Eliminer le surnageant par retournement de la plaque.

Centrifuger à 1000 rpm à +4°C. Laisser la plaque sécher pendant ¼ h à 2 h.

Déposer 10 µl d’EDTA à 0,3 mM. Mélanger sous agitation douce sur agitateur

de plaque pendant 15 à 20 mn.


112

Figure IV.8. Centrifugeuse pour microplaques 2-16K (SIGMA)



113

- Chargement de la plaque sur le séquenceur pour la migration (Figure

IV.9)

Figure IV.9. Analyseur génétique ABI 3130 (Applied Biosystems)



L’interprétation des résultats s’est effectuée en utilisant le logiciel intégré dans

l’appareil pour observer la qualité des séquences (Figure IV.10).


114

Figure IV.10. Analyse d’une séquence d’ADN brute de souche de

C. diphtheriae (Ex. Séquence réverse du gène atpA)


IV.2.10. Outils statistiques

Le test Kappa de Cohen a été utilisé à la recherche d’un agrément au risque

d’erreur de 5% entre les techniques de mise en évidence de la toxine

diphtérique : Elek, PCR conventionnelle et PCR en temps réel.

Les résultats sont considérés comme statistiquement significatifs pour des

valeurs de p<0,05.


115

On considère généralement que :

K < 0.2 indique un très faible agrément

0.2 < k < 0.4 indique un agrément faible

0.4 < K < 0.6 indique un agrément modéré

0.6 < K < 0.8 indique un agrément important

K > 0.8 indique un agrément presque parfait

IV.2.11. Outils bioinformatiques

IV.2.11.1. Bionumerics

Le logiciel Bionumerics version 7.5 a été utilisé pour l’alignement des

séquences, l’identification des allèles et des STs ainsi que pour l’analyse

phylogénétique par la réalisation du dendrogramme et du minimum spanning

tree dans le but de comparer les différentes souches.

La désignation des nouveaux STs a été effectuée via la base de données

MLST de C. diphtheriae (Edgar Badell Ocando) (Figure IV.11).


116

Figure IV.11. Base de données MLST de C. diphtheriae

www.pubmlst.org

IV.2.11.2. eBURST

Le logiciel eBURST version 3, disponible sur le site http://eburst.mlst.net/ a été

utilisé pour désigner les complexes clonaux ou groupes eBURST. Les profils

alléliques des 76 souches ont été inclus pour l’analyse.

L’algorithme eBURST permet d’identifier les complexes clonaux et de prédire

le membre fondateur de chaque groupe. Le ST ou membre fondateur doit

avoir le plus grand nombre de SLVs et d'autre part, il doit prédominer dans la

population.

http://www.pubmlst.org/

http://eburst.mlst.net/


117

Un complexe clonal ou groupe eBURST comprenant les isolats provenant d’un

ancêtre commun récent, était défini comme un groupe d’isolats partageant six

des sept allèles.

Les STs ayant des profils alléliques qui diffèrent de celui du membre fondateur

par seulement un locus des sept loci du schéma MLST sont appelés single

locus variants (SLVs). Eventuellement les SLVs vont se diversifier davantage

donnant des STs avec des profils alléliques qui diffèrent de celui du membre

fondateur par deux loci des sept loci du schéma MLST appelés double locus

variants (DLVs) et ainsi de suite.

V. RESULTATS

RESULTATS

118

V. RESULTATS

V.1. Caractéristiques générales de la population d’étude

Notre étude a porté sur 150 isolats de Corynebacterium diphtheriae collectés

durant les périodes épidémique et post-épidémique de 1993 à 2013.

Ces souches ont été isolées pour la plupart chez des patients atteints de

diphtérie, originaires de différentes wilayas d’Algérie (n=122) et dans certains

cas chez des patients atteints de rhinite atrophique chronique, ozène (n=28)

originaires uniquement de la région centre (Alger, Blida, Médéa et Tipaza).

Les caractéristiques épidémiologiques des 150 patients inclus dans l’étude

sont présentées en annexe 3.

V.1.1. Analyse démographique

Sur les 150 cas étudiés, l’âge moyen des patients était de 20 ans. La tranche

d’âge la plus représentée était celle des 11-20 ans suivie de celle des 21-30

ans. Les femmes étaient au nombre de 84 (56%) et les hommes étaient au

nombre de 66 (44%), avec un sex-ratio de 0,78 (Figure V.1).

RESULTATS

119

Figure V.1. Caractéristiques démographiques des patients (n=150)

V.1.2. Analyse temporo-spatiale

Le nombre de patients le plus élevé était enregistré durant la période 1993-

1995, soit 75 (50%) (Figure V.2).

La carte sanitaire de l’Algérie est subdivisée en 5 régions qui sont : région

centre (Alger), région est (Constantine), région ouest (Oran), région sud-est

(Ouargla) et région sud-ouest (Béchar). La carte sanitaire représentant la

répartition des wilayas par région sanitaire est présentée en annexe 9.

RESULTATS

120

Dans notre étude, la répartition des cas étudiés par région sanitaire montre

que la région sanitaire centre a été la plus représentée, avec un nombre de 97

(64,7%) cas suivie de la région sanitaire sud-ouest, avec un nombre de 22

(14,7%) cas (Tableau V.1 et Figure V.3).

Tableau V.1. Répartition temporo-spatiale des patients (n=150)

Variable Nombre (%)

Période

1993-1999

2000-2006

2007-2013

102 (68)

27 (18)

21 (14)

Région sanitaire

Centre (Alger)a

Est (Constantine)b

Ouest (Oran)c

Sud-est (Ouargla)d

Sud-ouest (Béchar)e

97 (64,7)

12 (8)

8 (5,3)

11 (7,3)

22 (14,7)

aAlger, Béjaia, Blida, Bouira, Djelfa, Médéa, Tipaza, Tizi-Ouzou, Zeralda; bBatna,

Constantine, Sétif, M’sila, Tébessa; cMostaganem, Tiaret; dEl-Oued, Illizi; eAdrar.

RESULTATS

121

La répartition des cas par wilaya a montré que la wilaya de Bejaia a compté le

maximum de cas, soit 36 (24%) suivie des wilayas d’Adrar, de Djelfa, d’Alger

et d’El-Oued, soit 22 (14,7%), 20 (13,3%), 19 (12,7%) et 10 (6,6%)

respectivement (Tableau V.2, Figure V.3).

Tableau V.2. Répartition des patients par wilaya (n=150)

Wilaya Nombre (%)

Alger 19 (12,7)

Béjaia 36 (24,0)

Blida 6 (4,0)

Djelfa 20 (13,3)

Tizi-Ouzou 6 (4,0)

Tiaret 7 (4,7)

El-Oued 10 (6,6)

Adrar 22 (14,7)

Autres wilayas* 24 (16,0)

*Autres wilayas : Bouira, Médéa, Tipaza, Zeralda, Batna, Constantine, Sétif, M’sila,

Tébessa, Mostaganem, Illizi.

RESULTATS

122

Figure V.2. Distribution des souches par période (n=150)

RESULTATS

123

Mostaganem

Alger

Blida

T-O

Adrar

90-100

20-30

1-10

10-20

Béjaia

ZéraldaTipaza

ConstantineBouira

BatnaMédéa

M’silaDjelfa

TébessaTiaret

El-Oued

Illizi

Sétif

T-O : Tizi-Ouzou

Figure V.3. Distribution géographique des souches (n=150)

RESULTATS

124

V.1.3. Tableaux cliniques

Les patients étaient composés dans 74,7% des cas de sujets atteints de

diphtérie. 2% étaient des sujets contacts, 1,3% avaient présenté des

complications à type de bactériémies et 18,7% étaient atteints d’ozène. Dans

3,3% des cas, il n’était pas possible de déterminer le statut clinique des

patients (patient atteint de diphtérie ou sujet contact) mais ces derniers étaient

recrutés durant la période épidémique (Tableau V.3).

Tableau V.3. Répartition des patients selon le tableau clinique (n=150)

Tableau clinique Nombre (%)

Diphtérie 112 (74,7)

Contact 3 (2)

Bactériémie 2 (1,3)

Ozène 28 (18,7)

Indéterminé 5 (3,3)

RESULTATS

125

V.1.4. Sites anatomiques

Parmi les 150 souches de C. diphtheriae collectées, 120 (80%) étaient isolées

de la gorge, 2 (1,3%) du sang et 28 (18,7%) du nez.

V.2. Caractéristiques phénotypiques des souches

L’étude phénotypique des souches a montré la prédominance du biotype mitis,

soit 117 (78%), suivi du biotype belfanti, soit 26 (17,3%) (Figures V.4, V.5 et

V.6 et V.7).

Concernant le toxinotype, les souches toxinogènes étaient au nombre de 72

(48%) et les souches non toxinogènes étaient au nombre de 78 (52%). Une

discordance entre le test d’Elek et la PCR a été observée pour 5 souches

(Figures V.7, V.8 et V.9).

Parmi les souches de biotype mitis, celles toxinogènes étaient prédominantes,

contrairement aux souches de biotype gravis, qui étaient dans la majorité non

toxinogènes. Les souches de biotype belfanti étaient exclusivement non

toxinogènes.

Figure V.4. C. diphtheriae biotype mitis sur système Api Coryne


RESULTATS

126

Figure V.5. C. diphtheriae biotype gravis sur système Api Coryne


Figure V.6. C. diphtheriae biotype belfanti sur système Api Coryne


RESULTATS

127

Figure V.7. Répartition des souches selon le biotype et le toxinotype

(n=150)

RESULTATS

128

Figure V.8. Souche de C. diphtheriae toxinogène sur milieu Elek


De haut en bas : strie 1, souche témoin A102 tox+ ; strie 2, souche test tox+ ; strie 3, souche

témoin A99 tox-.

Figure V.9. PCR du gène tox de souches de C. diphtheriae


M : marqueur de poids moléculaire 1kb, 1 : souche témoin A102 tox+, 2, 4-7, 9 : souches

tests tox+, 3, 8 : souches tests tox-

RESULTATS

129

La comparaison des deux techniques : Elek et PCR conventionnelle a donné

une excellente concordance. Le test kappa (k) effectué était à 0,93 et le

pourcentage de concordance à 96,7%. La valeur de p <0,001 (Tableau V.4).

Tableau V.4. Comparaison des deux techniques de détermination du

pouvoir toxinogène : Elek et PCR conventionnelle (n=150)

Elek positif Elek négatif Total

PCR positive 71 (47,3%) 1 (0,7%) 72 (48%)

PCR négative 4 (2,7%) 74 (49,3%) 78 (52%)

Total 75 (50%) 75 (50%) 150 (100%)

La répartition des souches selon le biotype et la période a montré la

prédominance du biotype mitis durant les deux périodes : 1993-1999 et

2000-2006, avec une fréquence plus faible pour cette dernière période. Le

biotype belfanti était prédominant durant la période 2007-2013 (Figure V.10).

RESULTATS

130

Figure V.10. Répartition des souches selon le biotype et la période

(n=150)

La répartition des souches selon le biotype et la région sanitaire a montré la

prédominance du biotype mitis dans toutes les régions. Le biotype belfanti

était exclusivement isolé dans la région du centre (Tableau V.5).

RESULTATS

131

Tableau V.5. Répartition des souches selon le biotype et la région

sanitaire (n=150)

Région sanitaire Biotype Nombre (%)

Centre (Alger)a mitis

gravis

belfanti

67 (44,7)

4 (2,7)

26 (17,3)

Est (Constantine)b mitis

gravis

belfanti

12 (8)

0

0

Ouest (Oran)c mitis

gravis

belfanti

8 (5,3)

0

0

Sud-est (Ouargla)d mitis

gravis

belfanti

10 (6,7)

1 (0,7)

0

Sud-ouest (Béchar)e mitis

gravis

belfanti

20 (13,3)

2 (1,3)

0



RESULTATS

132

La répartition des souches par biotype et par wilaya a montré la prédominance

du biotype mitis dans différentes wilayas, principalement Béjaia, Djelfa et

Adrar. Le biotype belfanti prédominait dans les wilayas d’Alger et de Blida

(Tableau V.6).

Tableau V.6. Répartition des souches par biotype et par wilaya (n=150)

Wilaya Biotype Nombre (%)

Alger mitis

gravis

belfanti

2 (1,3)

0

17 (11,3)

Béjaia mitis

gravis

belfanti

33 (22)

3 (2)

0

Blida mitis

gravis

belfanti

1 (0,7)

0

5 (3,3)

Djelfa mitis

gravis

belfanti

20 (13,3)

0

0

Tizi-Ouzou mitis

gravis

belfanti

6 (4,0)

0

0

RESULTATS

133

Tiaret mitis

gravis

belfanti

7 (4,7)

0

0

El-Oued mitis

gravis

belfanti

9 (6,0)

1 (0,7)

0

Adrar mitis

gravis

belfanti

20 (13,3)

2 (1,3)

0

Autres wilayas* mitis

gravis

belfanti

19 (12,7)

1 (0,7)

4 (2,7)

*Autres wilayas : Bouira, Médéa, Tipaza, Zeralda, Batna, Constantine, Sétif, M’sila,

Tébessa, Mostaganem, Illizi.

La répartition des souches par toxinotype et par période a montré que durant

les deux périodes : 1993-1999 et 2000-2006, la circulation des souches

toxinogènes et non toxinogènes était présente avec la prédominance des

souches toxinogènes. Durant la période 2007-2013, les souches non

toxinogènes circulaient exclusivement (Figure V.11).

RESULTATS

134

Figure V.11. Répartition des souches selon le toxinotype et la période

(n=150)

La répartition des souches par toxinotype et par région sanitaire a montré la

circulation aussi bien des souches toxinogènes que des souches non

toxinogènes. Dans la région du centre, les souches non toxinogènes étaient

prédominantes. Parmi ces souches, 26 (17,3%) étaient de biotype belfanti

(Tableau V.7).

RESULTATS

135

Tableau V.7. Répartition des souches selon le toxinotype et la région

sanitaire (n=150)

Région sanitaire Toxinotype Nombre (%)

Centre (Alger)a Tox +

Tox -

39 (26)

58 (38,7)*

Est (Constantine)b Tox +

Tox -

8 (5,3)

4 (2,7)

Ouest (Oran)c Tox +

Tox -

6 (4)

2 (1,3)

Sud-est (Ouargla)d Tox +

Tox -

7 (4,7)

4 (2,7)

Sud-ouest (Béchar)e Tox +

Tox -

12 (8)

10 (6,7)



*26 (17,3%) souches sont de biotype belfanti.

RESULTATS

136

La répartition des souches par toxinotype et par wilaya a montré la circulation

aussi bien des souches toxinogènes que des souches non toxinogènes.

Cependant, dans les wilayas de Djelfa, Tiaret et El-Oued, les souches

toxinogènes étaient prédominantes, alors que dans les wilayas d’Alger et de

Blida, ce sont les souches non toxinogènes qui prédominaient. Parmi ces

souches, 22 (14,7%) étaient de biotype belfanti (Tableau V.8).

Tableau V.8. Répartition des souches par toxinotype et par wilaya

(n=150)

Wilaya Toxinotype Nombre (%)

Alger Tox +

Tox -

0

19 (12,7)

Béjaia Tox +

Tox -

19 (12,7)

17 (11,3)

Blida Tox +

Tox -

1 (0,7)

5 (3,3)

Djelfa Tox +

Tox -

13 (8,7)

7 (4,7)

Tizi-Ouzou Tox +

Tox -

2 (1,3)

4 (2,7)

Tiaret Tox +

Tox -

6 (4,0)

1 (0,7)

RESULTATS

137

El-Oued Tox +

Tox -

6 (4,0)

4 (2,7)

Adrar Tox +

Tox -

12 (8,0)

10 (6,7)

Autres wilayas* Tox +

Tox -

13 (8,7)

11 (7,3)

*Autres wilayas : Bouira, Médéa, Tipaza, Zeralda, Batna, Constantine, Sétif, M’sila, Tébessa,

Mostaganem, Illizi.

V.3. Toxinotypie par PCR en temps réel

Parmi les 30 souches testées, la recherche du gène tox (sous-unité A et B)

était positive pour 24 souches, avec 100% de concordance avec les résultats

de la PCR tox conventionnelle. Les CTs variaient pour la sous-unité A et B de

15,03 à 28,89 et de 14,52 à 32,29 respectivement. La moyenne des CTs était

de 17,32 (médiane : 16,74) et de 17,25 (médiane : 16,6) respectivement

(Figures V.12a et 12b).

Les résultats détaillés de la PCR en temps réel du gène tox sont présentés en

annexe 10.

RESULTATS

138

Figure V.12a. PCR en temps réel du gène tox (sous-unité A) de souches

de C. diphtheriae


RESULTATS

139

Figure V.12b. PCR en temps réel du gène tox (sous-unité B) de souches

de C. diphtheriae


La comparaison des deux techniques moléculaires de détermination du

pouvoir toxinogène : PCR conventionnelle et PCR en temps réel a donné une

excellente corrélation. Le test kappa (k) était égal à 1 et le pourcentage de

concordance à 100%. La valeur de p <0,001 (Tableau V.9).

RESULTATS

140

Tableau V.9. Comparaison de la PCR conventionnelle et la PCR en temps

réel (n=30)

PCR en temps

réel positive

PCR en temps

réel négative

Total

PCR

conventionnelle

positive

24 (80%) 0 24 (80%)

PCR

conventionnelle

négative

0 6 (20%) 6 (20%)

Total 24 (80%) 6 (20%) 30 (100%)

V.4. Sensibilité des souches aux antibiotiques

- Contrôle de qualité :

Les valeurs limites des souches de référence, S. pneumoniae ATCC 49619 et

E. coli ATCC 25922 testées selon les recommandations du CLSI 2010 étaient

conformes (Tableau V.10).

RESULTATS

141

Tableau V.10. Valeurs limites des souches de référence (CLSI 2010)

Antibiotique Valeurs limites

Streptococcus pneumoniae

ATCC 49619

Escherichia coli

ATCC 25922

Pénicilline 0,25-1 -

Céfotaxime 0,03-0,12 -

Erythromycine 0,03-0,12 -

Gentamicine - 0,25-1

Vancomycine 0,12-0,5 -

Tétracycline 0,12-0,5 -

Chloramphénicol 2-8 -

Co-trimoxazole 0,12/2,4-1/19 -

Les CMIs les plus élevées concernaient la tétracycline, le chloramphénicol et à

un moindre degré le céfotaxime. Les CMIs les plus basses étaient celles de

l’érythromycine, du co-trimoxazole, suivies de celles de la pénicilline (Tableau

V.11). Les résultats des CMIs sont présentés en annexe 11.

RESULTATS

142

Tableau V.11. Intervalle des CMIs, CMI 50% et CMI 90% des souches de

C. diphtheriae (n=150)

Antibiotique Intervalle

des CMIs

Moyenne CMI 50% CMI 90%

Pénicilline 0,002-1 0,4 0,19 0,38

Céfotaxime 0,003-3 1,35 1,5 2

Erythromycine 0,016-0,25 0,03 0,016 0,047

Gentamicine 0,064-3 1,06 1 1,5

Vancomycine 0,25-1,5 0,61 0,5 1

Tétracycline 0,016-256 31,7 12 64

Chloramphénicol 0,19-64 13,8 16 24

Co-trimoxazole 0,004-0,5 0,14 0,125 0,19

Parmi les souches étudiées, les résistances observées ont concerné troix

antibiotiques : céfotaxime, tétracycline et chloramphénicol avec les taux de

résistance de 56,7%, 72% et 58% respectivement (Tableau V.12).

RESULTATS

143

Tableau V.12. Fréquence de sensibilité et de résistance des souches aux

antibiotiques (n=150)

Antibiotique Sensible

Nombre (%)

Résistant ou Intermédiaire

Nombre (%)

Pénicilline 150 (100) 0

Céfotaxime 65 (43,3) 85 (56,7)*

Erythromycine 150 (100) 0

Gentamicine 150 (100) 0

Vancomycine 150 (100) 0

Tétracycline 42 (28%) 108 (72)

Chloramphénicol 63 (42) 87 (58)

Co-trimoxazole 150 (100) 0

*Résistance intermédiaire

Les antibiotypes les plus fréquemment retrouvés étaient céfotaxime-

tétracycline-chloramphénicol et tétracycline-chloramphénicol avec

respectivement un taux de 37,3% et de 18,7% (Tableau V.13).

RESULTATS

144

Tableau V.13. Fréquence des antibiotypes (n=150)

Antibiotype Nombre (%)

CTX 14 (9,3)

TE 11 (7,3)

C 1 (0,7)

CTX+TE 13 (8,7)

CTX+C 2 (1,3)

TE+C 28 (18,7)

CTX+TE+C 56 (37,3)

CTX : céfotaxime, TE : tétracycline, C : chloramphénicol.

V.5. Tolérance à la pénicilline

La tolérance à la pénicilline étudiée chez 30 souches a montré la présence de

24 (80%) souches tolérantes (Tableau V.14).

Les résultats des CMIs et des CMBs sont présentés en annexe 12.

Les valeurs limites de la souche de référence S. pneumoniae ATCC 49619

vis-à-vis de la pénicilline étaient comprises entre 0,25 et 1.

RESULTATS

145

Tableau V.14. Tolérance à la pénicilline des souches de C. diphtheriae

(n=30)

Antibiotique Intervalle

des CMIs

CMI 50% CMI 90

%

CMB

50%

CMB

90%

Tolérance

Nombre

(%)

Pénicilline

0,125-1

0,25

0,5

64

128

24 (80)

V.7. Support génétique de la résistance aux antibiotiques

Parmi les 30 souches étudiées, aucune n’hébergeait l’intégron de classe I

(Figure V.13).

Figure V.13. PCR intégron de classe I


M : marqueur de poids moléculaire 1kb, 1 : souche témoin Int1 positive, 2-11 : souches tests

Int1 négatives.

RESULTATS

146

V.7. Caractéristiques génotypiques des souches

Différents sequence types (STs) ont été identifiés, soit au nombre de 16

(Annexe 13), cependant le ST-116 était prédominant. Six STs étaient

nouveaux (ST-186, ST-368, ST-369, ST-370, ST-371 et ST-372) [Figure V.14].

Quatre clusters ou groupes ont été distingués : I : ST-128, II : ST-183,

III : divers STs constitués majoritairement de souches de C. diphtheriae

biotype belfanti, IV : ST-116 (Figures V.20 et V.21).

L’analyse eBURST a permis d’identifier deux complexes clonaux ou groupes

eBURST :

Le groupe eBURST 1 (composé de ST-180, ST-187, ST-370 et ST-372)

associé aux souches de C. diphtheriae biotype belfanti non toxinogènes.

- Le ST-187 a été identifié comme membre fondateur. Peu de variants

SLV et DLV ont été retrouvés (se reporter au chapitre IV.2.11.2.

eBURST).

- Le groupe eBURST 2 (composé de ST-183 et ST-369) associé aux

souches de C. diphtheriae biotype mitis et toxinogènes isolées

majoritairement chez des cas groupés d’une même famille à Tiaret et à

Constantine entre 2000 et 2005.

RESULTATS

147

- Dix STs étaient des singletons et n’appartenaient pas à un complexe

clonal.

La distribution des STs et des groupes eBURST des 76 souches est

présentée en annexe 14.

Figure V.14. Répartition des souches par sequence type (n=76)

:

RESULTATS

148

V.7.1. Analyse temporo-spatiale des STs des souches de C. diphtheriae

circulants

Le ST-116 a été retrouvé durant les trois périodes (1993-1995, 1996-2000,

2001-2006) avec une prédominance durant la période 1993-1995. Durant la

période 2001-2006, les ST-116 et ST-183 ont été le plus retrouvés. Durant la

période 2007-2013, 6 STs différents ont été retrouvés, 5 d’entre eux n’étaient

pas retrouvés durant les années précédentes (Figure V.15). Absence de

ST-116.

RESULTATS

149

Figure V.15. Répartition des souches par sequence type et par période

(n=76)

Autres STs : 1993-1999 : 32, 186, 209, 368 ; 2000-2006 : 180, 293, 297, 369 ;

2007-2013 : 42, 370, 371, 372 (au nombre de 1 pour chaque ST).

Différents sequence types ont été retrouvés, avec une prédominance du

ST-116 dans les différentes régions (Tableau V.15).

RESULTATS

150

Tableau V.15. Répartition des souches par sequence type et par région

sanitaire (n=76)

Région sanitaire Sequence type (ST) Nombre (%)

Centre (Alger)a ST-32

ST-42

ST-116

ST-128

ST-180

ST-187

ST-297

ST-370

ST-371

ST-372

1 (1,3)

1 (1,3)

29 (38,1)

3 (3,9)

1 (1,3)

2 (2,6)

1 (1,3)

1 (1,3)

1 (1,3)

1 (1,3)

Est (Constantine)b ST-116

ST-183

6 (7,9)

3 (4)

Ouest (Oran)c ST-116

ST-128

ST-183

ST-186

2 (2,6)

1 (1,3)

2 (2,6)

1 (1,3)

Sud-est (Ouargla)d ST-116

ST-183

ST-209

ST-368

ST-369

3 (4)

1 (1,3)

1 (1,3)

1 (1,3)

1 (1,3)

RESULTATS

151

Sud-ouest (Béchar)e ST-116

ST-128

ST-293

11 (14,5)

1 (1,3)

1 (1,3)



Différents sequences types ont été retrouvés, avec une prédominance du ST-

116 dans les wilayas de Béjaia, Djelfa et Adrar (Tableau V.16).

Tableau V.16. Répartition des souches par sequence type et par wilaya

(n=76)

Wilaya Sequence type (ST) Nombre (%)

Alger ST-116

ST-128

ST-180

ST-370

ST-372

1 (1,3)

1 (1,3)

1 (1,3)

1 (1,3)

1 (1,3)

Béjaia ST-32

ST-116

ST-128

1 (1,3)

14 (18,4)

1 (1,3)

Blida ST-116

ST-187

ST-371

1 (1,3)

2 (2,6)

1 (1,3)

Djelfa ST-116 7 (9,2)

RESULTATS

152

ST-128

ST-297

1 (1,3)

1 (1,3)

Tizi-Ouzou ST-116 3 (4,0)

Tiaret ST-116

ST-128

ST-183

2 (2,6)

1 (1,3)

2 (2,6)

El-Oued ST-116

ST-183

ST-209

ST-368

3 (4,0)

1 (1,3)

1 (1,3)

1 (1,3)

Adrar ST-116

ST-128

ST-293

11 (14,5)

1 (1,3)

1 (1,3)

Autres wilayas* ST-42

ST-116

ST-183

ST-186

ST-369

1 (1,3)

9 (11,8)

3 (4,0)

1 (1,3)

1 (1,3)

*Autres wilayas : Bouira, Médéa, Batna, Constantine, Sétif, M’sila, Mostaganem, Illizi.

RESULTATS

153

V.7.2. Analyse phénotypique des sequence types

V.7.2.1. Relation entre les sequence types et le tableau clinique

Selon le tableau clinique, différents STs ont été retrouvés. Huit STs, dont 6

nouveaux, ont été retrouvés uniquement chez les souches isolées de patients

souffrant de rhinite atrophique. Ces souches étaient toutes non toxinogènes.

Une souche isolée chez une patiente présentant une bactériémie avait un

nouveau ST (Figure V.16).

RESULTATS

154

Figure V.16. Répartition des souches par sequence type et par tableau

clinique (n=76)

Autres STs : diphtérie : 32, 209, 293, 297, 368, 369 ; bactériémie : 186 ;

ozène : 42, 180, 370, 371, 372 (au nombre de 1 pour chaque ST).

V.7.2.2. Relation entre les sequence types et les sites anatomiques

Les sequence types les plus fréquemment retrouvés au niveau de la gorge

étaient : ST-116, ST-128 et ST-183. Au niveau du sang, un nouveau ST-186 a

été retrouvé uniquement dans ce site. Au niveau du nez, 6 sequence types,

soit, ST-42, ST-180, ST-187, ST-370, ST-371, ST-372 ont été retrouvés

uniquement dans ce site (Figure V.17).

RESULTATS

155

Figure V.17. Répartition des souches par sequence type et par site

anatomique (n=76)

Autres STs : gorge : 32, 209, 293, 297, 368, 369 ; sang : 186 ; nez : 42, 180, 370, 371, 372

(au nombre de 1 pour chaque ST).

V.7.2.3. Relation entre les sequence types et les biotypes

Aucune relation entre le ST et le biotype, excepté pour le biotype belfanti pour

lequel les ST retrouvés étaient étroitement liés (Figure V.18).

RESULTATS

156

Figure V.18. Répartition des souches par sequence type et par biotype

(n=76)

Autres STs : belfanti : 42, 180, 370, 371, 372 ; gravis : 32, 293 ;

mitis : 186, 209, 297, 368, 369 (au nombre de 1 pour chaque ST).

RESULTATS

157

V.7.2.4. Relation entre les sequence types et les toxinotypes

Aucune relation entre le toxinotype et le ST (Figure V.19).


toxinotype (n=76)

Autres STs : toxinotype positif : 209, 369 ; toxinotype négatif : 32, 42, 180, 186, 293, 297,

368, 370, 371, 372 (au nombre de 1 pour chaque ST).

RESULTATS

158

I

II

III

IV

Ville Biotype Toxinotype ST

*nouveau ST

Figure V.20. Arbre phylogénétique des 76 souches de C. diphtheriae


RESULTATS

159

*nouveau ST

Figure V.21. Minimum spanning tree des 76 souches de C. diphtheriae


Chaque cercle correspond à une ST. La surface et le code couleur de chaque cercle

correspondent au nombre des isolats. Les relations entre les souches sont indiquées par les

liaisons entre les isolats et les longueurs des branches qui les relient. Les lignes noires

reliant les paires de ST indiquent qu'ils diffèrent par deux ou trois allèles (lignes épaisses),

quatre allèles (lignes en pointillés), et cinq ou six allèles (lignes minces).

VI. DISCUSSION

DISCUSSION

160

VI. DISCUSSION

VI.1. Caractéristiques générales de la population d’étude

VI.1.1. Analyse démographique

Notre étude a montré que les patients appartenaient essentiellement aux

groupes d’âge des 11-20 ans et des 21-30 ans. Dans le passé, les cas

sporadiques de diphtérie notifiés étaient représentés surtout par la tranche

d’âge des 2-6 ans (84). Ce glissement vers les tranches d’âge des

adolescents et des adultes jeunes a été également rapporté dans les

épidémies qui sont survenues de façon concomitante dans les années 1990s

dans les pays de l’ex-Union Soviétique où le maximum des cas rapportés

concernait la population âgée de 4 à 10 ans, 15 à 17 ans et 40 à 49 ans (78,

79, 108, 139, 140).

Les explications données pour ce changement épidémiologique étaient la

diminution de l’immunité de cette tranche de la population par absence de

contact avec la bactérie en conséquence de la stratégie de vaccination

gratuite et obligatoire débutée en 1969 et l’absence des rappels, ce qui a

entrainé l’augmentation de la proportion des sujets non immunisés, les

rendant susceptibles à la maladie (110).

En Biélorussie, pays baltes, Russie et Ukraine, la proportion des cas de

diphtérie chez les sujets ≥15 ans variait de 64% à 82%. Alors qu’en Moldavie,

DISCUSSION

161

les pays de la région du Caucase et de l’Asie Centrale, la proportion d’adultes

infectés variait de 38% à 59% (110).

Concernant la distribution du sexe, une prédominance féminine avec un taux

de 56% a été observée dans notre série. Cette prédominance a été rapportée

dans les épidémies survenues dans les pays de l’ex-Union Soviétique et de

l’Asie Centrale. Au Kazakhstan, 63% des cas observés chez les adultes

étaient parmi les femmes. Des cas similaires ont été enregistrés en Ukraine

(110).

VI.1.2. Analyse temporo-spatiale

Les cas les plus importants étaient retrouvés durant la période 1993-1995 ; ce

fort taux correspondait aux flambées épidémiques. En effet, le maximum des

cas a été observé durant cette période. De 2000 à 2006, les cas ont nettement

diminué et à partir de 2007 aucun cas de diphtérie n’a été enregistré.

Les campagnes de vaccination de masse et l’instauration des rappels à 11-13

ans, 16-18 ans et tous les 10 ans ont permis de contrôler la maladie.

Les cas provenaient de différentes régions avec une fréquence plus élevée

pour le centre, ceci peut être expliqué par l’accès plus facile de cette région au

Laboratoire de Bactériologie Médicale de l’Institut Pasteur d’Algérie, seul

laboratoire ayant les capacités de confirmer bactériologiquement les cas de

diphtérie à l’échelle nationale.

DISCUSSION

162

Plusieurs explications ont été données pour tenter de comprendre les raisons

de la résurgence de la diphtérie en Algérie.

Parmi ces explications, l’introduction de souches toxinogènes suite au retour

d’algériens ayant séjourné en Afghanistan vers la fin de 1989 est une

hypothèse qui a été émise, sachant que la diphtérie est endémique dans ce

pays.

Cette même hypothèse à été postulée sans être confirmée lors des épidémies

qui ont touché les pays de l’ex-Union Soviétique (état fédéral formé de 15

républiques socialistes soviétiques, dissout en décembre 1991), suite à la

coïncidence du début de l’épidémie à Moscou en 1991 parmi les travailleurs

de construction paramilitaires avec la démobilisation d’au moins 100000

hommes des troupes soviétiques de l’Afghanistan entre Mai 1988 et Février

1989 et le mouvement des populations réfugiées d’Afghanistan. Malgré

l’endémicité de la diphtérie en Afghanistan, d’autres régions de l’ex-Union

Soviétique étaient aussi endémiques dans les années 1980s et avant la

démobilisation des troupes, les souches appartenant au clone épidémique

étaient déjà isolées dans différentes régions de Russie (75, 110).

Concernant l’Algérie, l’absence de données sur l’épidémiologie moléculaire de

la période pré-épidémique à cause de l’absence de souches isolées durant

cette période ne permet pas d’infirmer ou de confirmer cette hypothèse.

DISCUSSION

163

L’augmentation de la réceptivité des adolescents et des adultes est le facteur

le plus important qui a permis l’éclosion de cette épidémie par l’accumulation

d’un nombre important d’adolescents et d’adultes réceptifs comme

conséquence de la diminution de l’immunité induite et la diminution de

l’opportunité de l’immunité acquise naturellement (110). Les adultes étaient

susceptibles et pouvaient contracter et transmettre la maladie.

La diffusion de l’épidémie, quant à elle était facilitée par plusieurs facteurs,

dont les mouvements de population à large échelle, l’instabilité

socioéconomique, la détérioration partielle des infrastructures de santé, le

retard d’implémentation des mesures drastiques pour contrôler l’épidémie,

l’information inadéquate par les autorités pour les médecins et le public et

enfin l’absence d’approvisionnement adéquat en sérums et vaccins pour le

traitement et la prévention.

En Algérie, toutes ces conditions étaient réunies durant la décennie 1990 avec

l’instabilité socioéconomique connue durant cette décade.

VI.1.3. Tableaux cliniques

Les souches provenaient surtout de patients atteints de diphtérie suivis de

ceux atteints d’ozène. Ces derniers comptaient exclusivement des souches de

biotype belfanti non toxinogènes. L’ozène est une pathologie fréquente en

Afrique du nord (137). Un tropisme respiratoire a été rapporté pour ce biotype

(89).

DISCUSSION

164

Deux cas de diphtérie étaient dus à une complication septicémique, des cas

similaires ont déjà été rapportés dans la littérature (87). Il est intéressant de

rappeler que dans les deux cas, ce sont des souches non toxinogènes qui

étaient en cause. Par contre, aucun cas de diphtérie cutanée n’a été

enregistré. Cette forme clinique est endémique surtout en Afrique, en Asie et

dans certains pays d’Amérique du Sud (4).

Trois cas seulement étaient des sujets contacts, ceci peut être expliqué par

l’absence de prélèvements systématiques chez les porteurs sains.

VI.2. Caractéristiques phénotypiques des souches

Le biotype mitis était prédominant indépendamment de la région concernée.

Par contre, il était prédominant surtout durant la période épidémique. Pour la

période post-épidémique, il était encore prédominant de 2000 à 2006 et

pratiquement absent durant 2007-2013.

Pour les épidémies survenues en Russie et en Europe de l’Est, ce sont surtout

les souches du biotype gravis qui prédominaient (78, 79, 108, 139, 140).

Une autre étude a montré que les souches du biotype gravis étaient

prédominantes en Russie, Ukraine, Biélorussie, pays baltes et au nord du

Kazakhstan. Alors qu’en Uzbekistan, Kyrgystan et au sud de Kazakhstan, ce

sont les souches de biotype mitis qui étaient prédominantes (110).

Ces résultats sont également concordants avec ceux rapportés par De Zoysa

et coll. qui ont observé que les souches provenant d’Afrique, d’Asie et du

DISCUSSION

165

Moyen Orient étaient causées pour la majorité par des isolats du biotype mitis

toxinogènes (75).

Le biotype belfanti était de loin le plus fréquemment isolé durant la période

post-épidémique 2007-2013 et surtout au centre. Ceci est fort probablement

lié à la facilité d’accès de cette région au laboratoire ; en effet, les échantillons

cliniques provenaient surtout d’Alger et de Blida.

Le biotype belfanti était également isolé uniquement lors de rhinite atrophique,

ce qui est concordant avec les données de la littérature qui rapportent un

tropisme respiratoire pour ce biotype (89).

Comme décrit précédemment par d’autres études (78, 79, 108, 139, 140),

aussi bien, les souches toxinogènes que non toxinogènes étaient présentes

durant la période épidémique (1993-1999) avec la prédominance des souches

toxinogènes, alors que durant la période post-épidémique, les souches non

toxinogènes étaient prédominantes.

La comparaison des deux techniques de détermination du pouvoir

toxinogène : Elek et PCR conventionnelle a montré une concordance de 93%

(k=0,93).

Chez 4 souches, le test d’Elek était positif et la PCR était négative. Ceci peut

être du à la présence d’arcs non spécifiques comme rapporté dans d’autres

études (183).

DISCUSSION

166

Une souche était positive en PCR mais sans expression phénotypique en

Elek. Ceci peut être du à un mélange de population de C. diphtheriae

toxinogène et non toxinogène comme décrit par Simmons et coll. (184).

Ceci peut être expliqué aussi par la présence de souches de C. diphtheriae

NTTB portant le gène tox sans expression phénotypique qui ont été décrites

par différents auteurs (150).

Pallen et coll. ont décrit des réactions faussement positives en PCR (3%) ;

celles-ci sont généralement la conséquence de l’amplification d’une séquence

d’ADN partiellement mutée et non fonctionnelle (185).

Devant ces cas discordants, il est recommandé de refaire les deux tests.

VI.3. Toxinotypie par PCR en temps réel

La PCR en temps réel du gène tox était concordante à 100% avec la PCR

conventionnelle. Les Cts les plus tardifs (se reporter au chapitre IV.2.5.3)

étaient de 28,89 et de 32,29 pour la sous unité A et B respectivement, ce qui

renseigne indirectement sur la sensibilité de cette technique.

Pour rappel, par manque de moyens nécessaires pour la quantification de

l’ADN, la détermination des seuils de détection à titre de comparaison entre la

PCR en temps réel et la PCR conventionnelle n’a pas été effectuée. Celle-ci

permet de montrer l’apport de la PCR en temps réel en terme de sensibilité,

d’où son intérêt dans le diagnostic direct à partir des échantillons cliniques.

DISCUSSION

167

De plus, la rapidité de la PCR en temps réel en fait la technique de choix pour

le diagnostic d’urgence de la diphtérie.

VI.4. Sensibilité des souches aux antibiotiques

Les souches étaient sensibles à la plupart des antibiotiques testés excepté

pour le céfotaxime, la tétracycline et le chloramphénicol. L’antibiotype

tétracycline-chloramphénicol était le plus fréquent. Cependant, toutes les

souches de biotype belfanti étaient sensibles à la tétracycline et au

chloramphénicol.

Ce phénotype a également été rapporté précédemment par de nombreuses

études (144, 159, 152, 153, 155, à 158, 160, 164 à 167, 186).

Une sensibilité réduite au céfotaxime a été décrite en Pologne (144) et en

Italie (159). Au Canada, la première souche de C. diphtheriae multirésistante a

été décrite en 2011, avec une résistance intermédiaire au ceftriaxone et au

céfotaxime (160). Fricchione et coll. ont décrit une souche de C. diphtheriae

non toxinogène résistante à la pénicilline et au ceftriaxone, isolée chez un

enfant atteint d’endocardite (161).

D’où l’importance de considérer la résistance au céfotaxime, sachant que

cette molécule est indiquée pour le traitement des infections systémiques,

dues très souvent à des souches de C. diphtheriae invasives non toxinogènes.

DISCUSSION

168

Un haut niveau de résistance (86%) à la tétracycline a été rapporté en

Indonésie (165) mais aussi en Europe de l’Ouest (4) et au Brésil (155).

En Russie, une étude menée sur 130 souches de C. diphtheriae a montré

2,3% de souches résistantes à 8 antibiotiques : pénicilline G, ampicilline,

oxacilline, chloramphénicol, érythromycine, lincomycine, triméthoprime et

nitroxoline (156).

VI.4.1. Tolérance à la pénicilline

Parmi les 30 souches testées, 80% étaient tolérantes à la pénicilline avec des

CMB élevées, supérieures au niveau de concentration critique de 2-4 mg/L

dans le sérum.

La tolérance de C. diphtheriae à la pénicilline est connue dans la littérature (6).

Des études précédentes ont rapporté des résultats similaires (157, 158).

Hunolstein et coll. ont étudié la tolérance de 24 souches de C. diphtheriae

biotype gravis non toxinogènes isolées de cas de pharyngites ou

d’amygdalites, plus de 70% des souches étaient tolérantes. Dans cette étude,

une corrélation significative entre la CMB ou la tolérance de la pénicilline in

vitro et la réponse au traitement à la pénicilline in vivo n'a pas été trouvée.

Cependant, un échec thérapeutique a été souvent observé quand une souche

de C. diphtheriae tolérante a été isolée seule en l'absence de streptocoques

du groupe A (154).

DISCUSSION

169

L’insuffisance d’élimination de souches de C. diphtheriae non toxinogènes

chez des patients atteints de diphtérie et des porteurs sains traités avec la

pénicilline a été également rapportée depuis plusieurs années (157, 158).

Dans une autre étude menée par Hunolstein et coll sur 11 souches de

C. diphtheriae biotype gravis et mitis non toxinogènes isolées chez des cas de

pharyngite et amygdalite, les auteurs ont rapporté que dans 5/8 cas, le

traitement à la pénicilline pendant 10 jours n’a pas éradiqué C. diphtheriae de

la gorge. Une deuxième cure d’antibiothérapie, souvent à base de macrolides

était nécessaire. L’échec de traitement était relié au fait que les souches ont

présenté des CMBs de la pénicilline élevées (souvent supérieures aux

concentrations de la pénicilline dans le sérum de l’ordre de 2-4 µg/ml) et la

majorité étaient tolérantes à cet antibiotique (159).

Ainsi, il est important de considérer que dans les cas de pharyngites ou

d’amygdalites où C. diphtheriae est isolé comme seul agent pathogène, il

pourrait être l'agent étiologique de l'infection et que la pénicilline n’est pas

l'antibiotique le plus approprié. Par conséquent, le traitement de ces infections

avec l'érythromycine est recommandé (154, 161).

La tolérance aux β-lactamines de C. diphtheriae doit être aussi considérée

dans les infections systémiques, où C. diphtheriae tolérant à l’amoxicilline a

été également isolé de cas d’endocardites (154, 161).

DISCUSSION

170

VI.4.2. Support génétique de la résistance aux antibiotiques

Sur les 30 souches étudiées, aucun gène d’integron de classe I n’a été

détecté.

Trois principales classes d’intégrons ont été décrites et sont impliquées dans

la dissémination de la résistance bactérienne aux antibiotiques.

La classe 1 est la plus retrouvée chez les isolats cliniques. Les intégrons ont

été principalement décrits chez les bactéries à Gram négatif.

Seulement quelques études ont rapporté des intégrons chez certaines

espèces du genre Corynebacterium, C. glutamicum et C. striatum (169, 172,

173). Barraud et coll a rapporté une seule souche résistante au triméthoprime,

sulfaméthoxazole et co-trimoxazole sur les 46 souches de C. diphtheriae

étudiées et qui possédait le gène Int1 (168).

VI.7. Caractéristiques génotypiques des souches

Ce travail a permis d’étudier par la technique MLST les souches de

C. diphtheriae collectées durant les périodes épidémique (1993-1999) et post-

épidémique (2000-2013) dans le but d’identifier les souches circulantes dans

les différentes phases et d’étudier les variations éventuelles à travers ces

périodes.

N’ayant pas de souches collectées avant la survenue des épidémies, il n’a pas

été possible d’étudier la période pré-épidémique et distinguer les souches

endémiques des souches épidémiques.

DISCUSSION

171

Dans notre étude, l’analyse phylogénétique des souches a permis de

distinguer quatre clusters ou groupes: I : ST-128 (ribotype Broussais France),

II : ST-183 (Bristol Australie), cas groupés chez une même famille, notamment

ceux de Tiaret et de Constantine, III : ST différents mais concernaient

majoritairement C. diphtheriae biotype belfanti (76, 78, 79, 89, 120, 140, 145,

150, 187), IV : ST-116, typique de l’Algérie (ribotype Constantine Algérie)

(données non publiées).

Deux groupes eBURST englobant 6 STs étaient identifiés et 10 STs étaient

des singletons et ne faisaient pas partie d’un complexe clonal.

Le premier groupe eBURST était composé du ST-180, ST-187, ST-370 et

ST-372, montrant qu’ils dérivent d’un ancêtre commun récent. Le ST-187 a été

identifié comme membre fondateur. Peu de variants SLV et DLV ont été

retrouvés, suggérant qu’il s’agisse d’un groupe eBURST jeune.

Ce groupe était composé uniquement des souches de C. diphtheriae biotype

belfanti non toxinogènes, ce qui suggère que ces souches sont étroitement

liées.

Le deuxième groupe eBURST était associé à des cas groupés de diphtérie.

Il était composé de souches de C. diphtheriae biotype mitis toxinogènes,

majoritairement isolées à Tiaret et à Constantine chez des membres de la

même famille entre 2000 et 2005.

Sur la base de nos connaissances actuelles, aucune étude n’a rapporté le

DISCUSSION

172

ST-116, celui-ci semble donc caractéristique de notre pays comme soutenu

dans l’étude de De Zoysa et coll qui ont rapporté que des clones distincts

étaient en cause de chaque épidémie dans le monde (75). Sachant qu’il a été

responsable de l’épidémie, la surveillance doit être continue afin de mettre en

place les moyens de prévention adaptés pour une éventuelle réémergence.

Les souches appartenant au ST-128 ont été déjà rapportées en France et en

Roumanie. Le ST-183 quant à lui a été enregistré en Australie.

Les ST-32, ST-42, ST-180, ST-187, ST-209, ST-293 et ST-297 ont été déjà

rapports dans d’autres régions du monde (89, 141), alors que les ST-186,

ST-368, ST-369, ST-370, ST-371 et ST-372 étaient nouveaux.

Comme décrit par d’autres études (89, 120, 141, 149), l’analyse

phylogénétique de nos souches a montré une diversité génétique intra-

espèce.

VI.7.1. Analyse temporo-spatiale des STs des souches de C. diphtheriae

circulants

- Analyse temporelle :

Durant la période épidémique (1993-1999), prédominance du ST-116 dans les

différentes régions, les souches de biotype mitis et toxinogènes étaient

majoritaires.

La période post-épidémique (2000-2013) peut être subdivisée en deux :

DISCUSSION

173

La période allant de 2000 à 2006 (période où des cas de diphtérie étaient

encore enregistrés) avec prédominance du ST-116 et du ST-183 (cas groupés

chez une même famille à Tiaret). Les souches de biotype mitis et toxinogènes

étaient majoritaires.

La période allant de 2007 à 2013 (période où aucun cas de diphtérie n’a été

enregistré) avec différents STs retrouvés sans prédominance d’un ST

quelconque et absence du ST-116. La région du centre était prédominante

(Alger et Blida). Toutes les souches étaient non toxinogènes et appartenaient

dans la quasi-totalité des cas au biotype belfanti. Les souches étaient isolées

de patients souffrant de rhinite atrophique (ozène).

Ces résultats sont concordants avec ceux d’études précédentes portant sur

les épidémies de diphtérie qui rapportent la circulation d’un même clone

durant la période épidémique et la diversité des clones circulants dans la

période post-épidémique avec diminution importante voire disparition du clone

isolé durant la période épidémique (76).

- Analyse spatiale :

La distribution géographique des souches montre une prédominance du

ST-116 dans les différentes régions. Les souches de biotype mitis toxinogènes

étaient majoritaires.

De plus, dans la région du nord, présence de STs variables identifiés dans la

majorité des cas chez des souches de biotype belfanti et non toxinogènes.

DISCUSSION

174

Nos résultats sont différents des ceux observés lors des épidémies de l’ex-

Union Soviétique où des ribotypes particuliers (Saint-Pétersbourg, Rossija et

Otchakov) étaient responsables de l’épidémie. Bolt et coll. ont identifié ces

souches par MLST, ils correspondaient au ST-8, ST-12 et ST-45 (141).

Les souches appartenant au ST-116 n’ont pas été rapportées par aucune

étude précédente et sont donc probablement caractéristiques de notre pays.

De Zoysa et coll ont étudié 755 souches originaires de 26 pays et ont rapporté

que différents clones étaient observés dans différentes régions du monde et

que des clones distincts avaient causé chaque épidémie. Egalement, les

clones provenant d’Afrique, d’Asie et du Moyen Orient étaient distincts de ceux

circulant en Europe et aux Etats-Unis et semblaient caractéristiques des ces

régions (75).

Une étude récente menée par Bolt et coll. en 2010 a concerné 150 souches

de distribution temporelle et géographique diverse couvrant une période allant

de 1957 à 2006 et originaires de 18 pays par MLST (141). Les souches ont

été comparées à 29 souches précédemment ribotypées et regroupant 20

ribotypes. Au total 75 STs et 11 complexes clonaux ont été identifiés.

Deux complexes clonaux liés aux épidémies de diphtérie ont été identifiés

(Tableau VI.1) :

Le groupe eBURST 2 (composé de souches de ST-8, ST-12, ST-52 et ST-66)

a été associé à l’épidémie de l’ex-Union Soviétique.

DISCUSSION

175

Le groupe eBURST 9 (composé de ST-31 et de ST-4) a été associé à

l’épidémie de Haiti et la République Dominicaine de 2004 à 2006. Les souches

appartenant à ces STs étaient en circulation durant la période pré-épidémique

(deux souches de ST-31 et ST-4 collectées en 2000 et 1995 respectivement).

L’analyse MLST a indiqué que certaines souches étaient dispersées

géographiquement (groupe eBURST 1 : Pologne, Russie, Kazakhstan et

Etats-Unis) alors que d’autres souches étaient associées à des régions

géographiques spécifiques (groupe eBURST 9 : région des caraïbes).

Tableau VI.1. STs responsables d’épidémies

STs épidémiques Pays

ST-8

ST-12

ST-52

ST-66

ex-Union Soviétique

ST-4

ST-31

République dominicaine, Haiti

DISCUSSION

176

VI.7.2. Relation entre les sequence types et le tableau clinique

Aucune corrélation claire entre le tableau clinique et le ST n’a été identifiée.

Une seule souche isolée d’un sujet contact a été analysée, elle appartenait au

même ST retrouvé chez les souches responsables de la maladie.

Néanmoins, parmi les deux souches isolées de patients ayant eu comme

complications une bactériémie, une appartenait à un ST nouvellement

identifié et sans lien avec les souches isolées lors de l’épidémie.

Des études ont rapporté que les STs identifiés chez les souches invasives non

toxinogènes étaient éloignées de ceux identifiés chez les souches

responsables de diphtérie (4). Le très faible effectif de ces souches dans notre

collection ne permet pas d’avancer des conclusions.

Pour les cas atteints d’ozène, les différents STs retrouvés étaient étroitement

liés mais sans lien avec le ST-116 prédominant. La quasi-totalité des souches

étaient de biotype belfanti et non toxinogènes. De manière similaire, Bolt et

coll a montré que ce biotype représentait un sous-groupe génétiquement

distinct (141).

VI.7.3. Relation entre les sequence types et les sites anatomiques

Prédominance du ST-116 chez les souches isolées de la gorge. Des STs

variables mais étroitement liés étaient identifiés chez les souches isolées du

nez. Les souches de biotype belfanti et (toutes non toxinogènes) étaient

majoritaires.

DISCUSSION

177

VI.7.4. Relation entre les sequence types et les biotypes

Aucune relation entre les biotypes mitis et gravis et le ST n’a été retrouvé.

Cependant pour le biotype belfanti, différents STs ont été retrouvés

exclusivement chez ces souches.

Des études précédentes ont montré l’absence d’association entre la séquence

type et le biotype (108). Donc un ST peut avoir des isolats de biotypes

multiples. L’analyse phylogénétique a révélé qu’à l’exception du biotype

belfanti, les biotypes mitis et gravis ne représentent pas des sous-groupes

génétiquement distincts. Les isolats des biotypes mitis et gravis sont

clairement dispersés dans le « neighbor joining tree » (Figure VI.21).

Cependant, comme montré dans la Figure VI.20, un clade, appelé lignée III,

composé dans la quasi-totalité de souches de C. diphtheriae biotype belfanti

était clairement distingué des autres isolats de C. diphtheriae (lignées I, II et

IV) et donc les isolats de C. diphtheriae biotype belfanti dans notre collection

représentent un sous-groupe génétiquement distinct. Ceci est en corrélation

avec les résultats de l’étude effectuée par Bolt et coll qui ont analysé

phylogénétiquement 150 souches collectées de 18 pays et de distribution

temporelle et géographique diverse et qui ont identifié deux lignées : lignée 1,

regroupant les biotypes mitis, gravis et intermedius, toxinogènes et non

toxinogènes et lignée 2, regroupant exclusivement le biotype belfanti non

DISCUSSION

178

toxinogène (141) et ont montré donc que les souches de biotype belfanti

constituaient un sous-groupe génétiquement distinct.

Bien que dans certains cas, les isolats avec différents biotypes appartenant à

la même séquence type ont été rapportés, 64 (84,2%) des 76 séquence types

analysés, dont 50 isolats ayant un même ST, étaient associées à un seul

biotype.

Quand des biotypes multiples sont présents dans un seul ST, un biotype

prédominant représente la majorité des isolats (2 à 98% des isolats dans un

ST avec différents biotypes). Un maximum de deux biotypes était observé

dans un même ST.

VI.7.5. Relation entre les sequence types et les toxinotypes

Parmi les souches toxinogènes, prédominance du ST-116, suivi du ST-183.

Les souches de biotype mitis étaient majoritaires.

Pour les souches non toxinogènes, prédominance du ST-116, suivi de STs

variables. Les souches étaient dans la majorité de biotype mitis, suivies du

biotype belfanti.

Aussi bien les souches toxinogènes que non toxinogènes analysées

phylogénétiquement étaient dispersées dans l’arbre (Figure VI.20), indiquant

que les souches n’étaient pas génétiquement distinctes.

L’examen de l’association des STs aux toxinotypes a été effectué. Pour les

STs avec deux isolats ou plus, 56 (73,7%) étaient associées aussi bien à des

DISCUSSION

179

souches toxinogènes et non toxinogènes et 6 (7,6%) étaient associées

uniquement à des souches toxinogènes.

VII. CONCLUSION

CONCLUSION

180

VII. CONCLUSION

Cette étude a permis de montrer pour la première fois, la diversité génétique

au sein des souches de C. diphtheriae circulantes durant les périodes

épidémique et post-épidémique en Algérie. Le ST-116 est largement

prédominant durant la période épidémique. Ce dernier a été isolé pour la

première fois en Algérie. Cependant il n’a pas encore été décrit dans d’autres

pays suggérant que ce clone est caractéristique de notre pays. Ces résultats

sont en rapport avec ceux retrouvés dans les épidémies observées dans les

pays de l’ex-URSS où un type prédominant (ST-8) a été retrouvé durant les

périodes épidémiques.

En Algérie, durant la période post-épidémique de 2000 à 2006, le ST-116 est

retrouvé chez seulement 6 souches sur 23 et à partir de 2007, il est totalement

absent. Durant la période post-épidémique, différents STs sont retrouvés sans

prédominance nette d’un ST déterminé. Le ST-183 est nettement plus

fréquent durant la période post-épidémique comparativement à la période

épidémique.

Dans notre série, le biotype mitis est prédominant contrairement en Europe où

le biotype gravis prédominait. Le biotype belfanti est exclusivement

respiratoire, retrouvé dans les rhinites atrophiques.

CONCLUSION

181

Aucune relation entre le ST et le biotype, excepté pour le biotype belfanti pour

lequel les ST retrouvés étaient étroitement liés, confirmant l’appartenance de

ce biotype à une lignée génétiquement distincte.

Les souches toxinogènes sont plus prédominantes en période épidémique,

alors qu’en période post-épidémique, ce sont les souches non toxinogènes qui

prédominent.

La surveillance doit être continue. En effet, il faut toujours se rappeler que la

diphtérie est présente et représente une menace potentielle. Les cas de

diphtérie rapportés en Angleterre entre 2008 et 2013, chez des patients ayant

effectué un voyage récent dans des régions endémiques, le cas de diphtérie

autochtone enregistré en mai 2015 en Espagne, chez un enfant de 6 ans ainsi

que les cas de diphtérie cutanée déclarés en juin 2015 au Danemark, en

Suède et en Allemagne chez des réfugiés venant de pays endémiques, en

sont la parfaite illustration.

Nos souches ont présenté des taux de résistances élevés au céfotaxime, à la

tétracycline et le chloramphénicol. Cependant elles restent sensibles à la

pénicilline et à l’érythromycine, principaux antibiotiques utilisés dans le

traitement de la diphtérie.

Néanmoins, comme décrit dans d’autres études, nos souches sont tolérantes

à la pénicilline dans 80% des cas. D’où la nécessité de considérer le

CONCLUSION

182

traitement par la pénicilline des infections à C. diphtheriae, notamment celles

dues aux souches non toxinogènes.

Cette étude a permis de déboucher sur un projet de recherche ACIP réalisé en

2010 en collaboration avec l’Institut Pasteur de Paris et qui a regroupé 4

pays : France, Roumanie, Russie et Algérie. Le but du projet était de renforcer

la surveillance de la diphtérie dans ces pays.

Le projet a permis d’atteindre les principaux objectifs fixés à savoir :

- le transfert de l'identification moléculaire d'espèces de corynébactéries du

complexe diphtheriae (C. diphtheriae, C. ulcerans, C. pseudotuberculosis) ;

- la comparaison des différentes techniques d’étude de la sensibilité aux

antibiotiques des isolats cliniques de C. diphtheriae (test du disque, technique

du E-test, CMI en milieu liquide) ;

- le transfert de la technique moléculaire Multilocus Sequence Typing (MLST)

afin de comparer les isolats circulants ;

- la formation à l’utilisation du logiciel Bionumerics et la réalisation des études

phylogénétiques de C. diphtheriae

VIII. RECOMMANDATIONS

RECOMMANDATIONS

183

VIII. RECOMMANDATIONS

Compte tenu des résultats de cette étude et dans la perspective d’une

surveillance continue de la diphtérie, nous proposons :

Sur le plan de la veille épidémiologique :

- continuer la surveillance vigilante, permettant la détection précoce et le

diagnostic des cas de diphtérie sporadiques et des épidémies.

- maintenir un taux de couverture vaccinale ≥95% en prévention primaire.

-surveiller la couverture vaccinale dans les différents groupes d’âge (enquêtes

de séroprévalence).

- confirmer au laboratoire tout cas suspect (y compris, typage moléculaire de

toute souche isolée éventuellement) et associer une enquête autour du cas.

Ces actions doivent être suivies d’une évaluation du risque d’épidémie et de la

capacité de réponse des acteurs de santé.

- conseiller les voyageurs vers les pays endémiques de vérifier s’ils ont une

vaccination primaire complète contre la diphtérie avant leur départ et recevoir

une dose de rappel si 10 ans sont passés depuis la dernière dose.

RECOMMANDATIONS

184

- considérer tous les immigrés, les réfugiés et demandeurs d’asile venant des

pays endémiques dont le statut vaccinal n’est pas connu, comme non

protégés et les vacciner selon le calendrier vaccinal national en vigueur.

- informer les cliniciens sur la possibilité de diphtérie cutanée chez les

réfugiés, les demandeurs d’asile et les voyageurs de retour des régions

endémiques (programmes de formation médicale continue, circulaires

ministérielles,…).

- maintenir l’expertise du laboratoire dans le cadre de la surveillance continue,

permettant d’une part de déterminer le biotype et le pouvoir toxinogène et

d’autre part de typer par MLST tout isolat de C. diphtheriae isolé pour détecter

précocement toute souche épidémique ainsi que les souches endémiques et

importées et permettre la mise en place des moyens de prévention adaptés.

- maintenir la disponibilité du sérum antidiphtérique pour le traitement, sachant

qu’il doit être administré aussi précocement que possible pour être efficace

dès la suspicion de la diphtérie avant la confirmation au laboratoire. Il est utile

d’inventorier la disponibilité du sérum antidiphtérique au niveau national et

d’avoir un stock centralisé pour parvenir à parer à toute situation d’urgence

éventuelle.

Pour rappel, le sérum antidiphtérique est classé par l’OMS parmi les

médicaments essentiels. Ces derniers doivent être disponibles

RECOMMANDATIONS

185

continuellement, en quantités adéquates, à des dosages appropriés, avec une

garantie de la qualité et à des prix accessibles. A ce jour, dans le monde,

quatre laboratoires seulement produisent et commercialisent ce sérum, il s’agit

de : Serum Institute of India (Inde), Institut d’immunologie (Croatie),

Laboratoire Microgen (Russie) et Institut de Butantan (Brésil) (188, 189).

Sur le plan du diagnostic :

- renforcer les capacités du laboratoire de diagnostic rapide par la mise en

place de la PCR en temps réel en routine pour diagnostiquer rapidement une

suspicion de cas de diphtérie, vu l’urgence posée par cette maladie et sa

résurgence dans certains pays (en perspective, transfert de la technique aux

laboratoires hospitaliers).

- maintenir l’expertise du laboratoire, permettant d’identifier les souches de

C. diphtheriae et de déterminer leur pouvoir toxinogène.

- maintenir l’expertise du laboratoire dans l’étude de la sensibilité aux

antibiotiques qui doit être continue, pour détecter les résistances éventuelles,

sachant que, de part le monde, des souches résistantes à plusieurs

antibiotiques y compris à la pénicilline et l’érythromycine, sont décrites.

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X. ANNEXES

ANNEXES

218

X. ANNEXES

ANNEXE 1

Calendrier vaccinal Algérien en 2007

(Arrêté du 15 juillet 2007, www.joradp.dz)

BCG : bacille de Calmette et Guérin (vaccin contre la tuberculose)

VPO : vaccine polio oral (vaccine contre la poliomyélite)

HBV : vaccin contre l’hépatite virale B

DTC-HIB : vaccin combiné contre la diphtérie, le tétanos, la coqueluche et

Haemophilus influenzae b

DT : vaccin combiné contre la diphtérie et le tétanos

dT : vaccin combiné contre la diphtérie (faiblement dosé) et le tétanos

Age de la vaccination Vaccins

Naissance BCG+VPO+HBV1

1 mois HBV2

3 mois VPO+DTC-HIB

4 mois VPO+DTC-HIB

5 mois VPO+DTC-HIB+HBV3

9 mois Anti-rougeoleux

18 mois VPO+DTC-HIB

6 ans DT+VPO+Anti-rougeoleux

11-13 ans dT+VPO

16-18 ans dT+VPO

Tous les 10 ans dT après 18 ans

ANNEXES

219

ANNEXE 2

Nouveau calendrier vaccinal

(Arrêté du 24 novembre 2014, www.joradp.dz)

ANNEXES

220

ANNEXE 3

Caractéristiques épidémiologiques et bactériologiques des isolats de

C. diphtheriae étudiés

ID N° de

souche

Année d’isolement Ville

Diagnostic

clinique

Age (année)

Site anatomique Biotype

Toxinotype

Elek PCR

cod1 7413/93 1993 Bouira Diphtérie 21 Gorge mitis Positif Positif

cod2 7580/93 1993 Bouira Diphtérie 11 Gorge mitis Positif Positif

cod3 7584/93 1993 Bouira Diphtérie ND Gorge mitis Positif Positif

cod4 8111/93 1993 El oued Diphtérie 12 Gorge gravis Positif Positif

cod5 s63/94 1994 Tizi ouzou Diphtérie ND Sang mitis Négatif Négatif

cod6 1812/94 1994 Batna Diphtérie ND Gorge mitis Positif Positif

cod7 5618/94 1994 Bejaia Diphtérie 11 Gorge gravis Négatif Négatif

cod8 5904/94 1994 Bejaia Diphtérie 18 Gorge mitis Positif Positif

cod9 5910/94 1994 Bejaia Diphtérie 14 Gorge mitis Négatif Négatif

ANNEXES

221




cod13 6085/94 1994 Bejaia Diphtérie ND Gorge mitis Positif Positif








cod21 6731/94 1994 Bejaia Diphtérie ND Gorge mitis Négatif Négatif


cod23 6738/94 1994 Tizi ouzou Diphtérie ND Gorge mitis Positif Positif

cod24 7083/94 1994 Tizi ouzou Diphtérie ND Gorge mitis Positif Négatif

ANNEXES

222

cod25 7084/94 1994 Tizi ouzou Diphtérie ND Gorge mitis Négatif Négatif

cod26 7086/94 1994 Tizi ouzou Diphtérie ND Gorge mitis Positif Positif



cod29 7101/94 1994 Tizi ouzou Diphtérie ND Gorge mitis Négatif Négatif



cod32 7475/94 1994 El oued Diphtérie 12 Gorge mitis Négatif Négatif








ANNEXES

223






cod45 7871/94 1994 Bejaia Diphtérie 25 Gorge mitis Positif Négatif

cod46 7978/94 1994 El oued Diphtérie 11 Gorge mitis Positif Positif


cod48 8216/94 1994 Adrar Diphtérie 11 Gorge mitis Positif Positif


cod50 8220/94 1994 Adrar Diphtérie 31 Gorge mitis Négatif Négatif

cod51 8221/94 1994 Adrar Diphtérie 14 Gorge mitis Négatif Positif




ANNEXES

224





cod59 s75/95 1995 Batna Diphtérie 21 Gorge mitis Négatif Négatif

cod60 s128/95 1995 Djelfa Diphtérie ND Gorge mitis Positif Positif

cod61 s154/95 1995 Djelfa Diphtérie 21 Gorge mitis Positif Positif

cod62 s157/95 1995 Bejaia Diphtérie ND Gorge mitis Positif Positif

cod63 s182/95 1995 Sétif Diphtérie 56 Gorge mitis Négatif Négatif

cod64 s183/95 1995 Sétif Diphtérie 25 Gorge mitis Négatif Négatif



cod67 543/95 1995 Adrar Diphtérie ND Gorge mitis Négatif Négatif

cod68 544/95 1995 Adrar Diphtérie ND Gorge mitis Positif Positif


ANNEXES

225

cod70 5277/95 1995 Djelfa ND 35 Gorge mitis Positif Positif

cod71 6690/95 1995 Bejaia ND 8 Gorge mitis Négatif Négatif





cod76 7758/96 1996 Médéa ND 12 Gorge mitis Positif Positif

cod77 8317/96 1996 El oued ND 14 Gorge mitis Positif Positif

cod78 8928/96 1996 El oued ND 18 Gorge mitis Négatif Négatif

cod79 s284/97 1997 Mostaganem Diphtérie 42 Sang mitis Négatif Négatif

cod80 7935/97 1997 Djelfa Diphtérie 16 Gorge mitis Négatif Négatif


cod82 8390/97 1997 Zeralda Diphtérie 19 Gorge gravis Négatif Négatif

cod83 8630/97 1997 Djelfa Diphtérie 32 Gorge mitis Positif Positif


ANNEXES

226






cod90 8157/98 1998 M'sila Diphtérie 51 Gorge mitis Négatif Négatif

cod91 164/99 1999 Médea Diphtérie 20 Gorge mitis Négatif Négatif

cod92 980/99 1999 Tebessa Diphtérie 8 Gorge mitis Positif Positif




cod96 5950/99 1999 Djelfa Diphtérie ND Gorge mitis Positif Positif


cod98 6016/99 1999 Djelfa ND 16 Gorge mitis Négatif Négatif


ANNEXES

227


cod101 6226/99 1999 Djelfa Diphtérie ND Gorge mitis Positif Positif


od103 405/00 2000 Batna ND 10 Gorge mitis Positif Positif

cod104 406/00 2000 Batna ND 26 Gorge mitis Positif Positif

cod105 s08/01 2001 Blida ND 21 Gorge mitis Positif Positif


cod107 1727/01 2001 Tiaret Diphtérie 20 Gorge mitis Négatif Négatif

cod108 268/03 2003 Tiaret Diphtérie 10 Gorge mitis Positif Positif



cod111 361/03 2003 Tiaret Diphtérie ND Gorge mitis Positif Positif



cod114 3286/04 2004 Alger RCA 56 Nasal belfanti Négatif Négatif

ANNEXES

228

cod115 s101/05 2005 Constantine Diphtérie 13 Gorge mitis Positif Positif

cod116 s102/05 2005 Constantine Sujet contact 13 Gorge mitis Positif Positif



cod119 s136/05 2005 Adrar ND 10 Gorge mitis Positif Positif

cod120 s137/05 2005 Adrar ND 13 Gorge gravis Positif Positif

cod121 660/05 2005 Illizi ND 17 Gorge mitis Positif Positif




cod125 594/06 2006 Adrar Diphtérie 36 Gorge gravis Positif Négatif

cod126 1448/06 2006 Adrar Diphtérie 10 Gorge mitis Positif Négatif


cod128 3531/06 2006 Alger RCA 7 Nasal mitis Négatif Négatif


ANNEXES

229







cod136 2264/08 2008 Alger RCA 35 Nasal mitis Négatif Négatif

cod137 2564/08 2008 Médéa RCA 20 Nasal belfanti Négatif Négatif

cod138 2578/08 2008 Blida RCA 54 Nasal belfanti Négatif Négatif



cod141 313/09 2009 Tipaza RCA 29 Nasal belfanti Négatif Négatif


cod143 1595/09 2009 Médéa RCA 46 Nasal belfanti Négatif Négatif

cod144 51/11 2011 Tipaza RCA 22 Nasal belfanti Négatif Négatif

ANNEXES

230



cod147 s193/12 2012 Blida RCA 43 Nasal belfanti Négatif Négatif




ID : identification, RCA : rhinite chronique atrophique, ND : non disponible

ANNEXES

231

ANNEXE 4

Protocole d’extraction d’ADN des souches de C. diphtheriae par le kit

DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN)

Principe :

Utilisation d’un kit prêt à l’emploi pour la réalisation des extractions d’ADN

génomique de bactéries à Gram positif à partir de différentes sources (tissus,

cellules, bactéries, etc) sans extraction organique.

Le kit est basé sur une technologie qui allie l’utilisation rapide d’une colonne-

filtre et l’optimisation de tampons qui lysent les cellules et qui permettent la

fixation de l’ADN sur un gel de silice.

Protocole :

Préparation de la solution de tampon de lyse enzymatique

Réactif Quantité Concentration finale

H2O 4,8 ml

Tris HCL 1 M, pH 8 100 µl 20 mM

EDTA 0,5 M 20 µl 2 mM

Triton X-100 60 µl 1,2%

Lysozyme 100 mg 20 mg/ml

ANNEXES

232

Le tampon peut être utilisé immédiatement après sa préparation ou conservé

pendant 2 semaines à – 20 +/- 2°C.

Extraction à partir d’une culture bactérienne sur milieu gélosé

Incuber la souche sur une boîte de gélose Columbia au sang de mouton 5%

24 h à 35 °C + ou - 2°C.

Distribuer 180 µl de tampon de lyse enzymatique dans des tubes Eppendorf

de 1,5 ml. Mettre en suspension dans le tampon une oese bien pleine (1 µl) de

culture bactérienne. Mettre dans le bain à sec à 37 °C + ou - 1°C pendant 1 h.

Ajouter 25 µl de protéinase K.

Ajouter 200 µl de tampon AL.

Mélanger à l’aide d’un vortex.

Mettre dans un bain à sec à 56 °C + ou - 1°C pendant 30 mn.

Préparer sur un portoir : 1 DNeasy mini spin colonne

2 tubes de collecte

1 tube Eppendorf

Ajouter 200 µl d’éthanol et mélanger à l’aide d’un vortex immédiatement.

Transférer le contenu du tube Eppendorf dans une DNeasy mini spin colonne

placée dans un tube de collecte.

Centrifuger à 8000 rpm pendant 1 mn.

Eliminer le tube de collecte et placer la colonne dans un nouveau tube de

collecte.

ANNEXES

233

Ajouter 200 µl de tampon AW1.


Eliminer le tube de collecte et placer la colonne dans un nouveau tube de

collecte.

Ajouter 200 µl de tampon AW2.


Eliminer le tube de collecte et placer la colonne dans un tube Eppendorf de

1,5 ml.

Ajouter 100 µl de tampon AE, directement sur la memebrane de la colonne

sans toucher la membrane avec le cône (à partir des cultures, on peut ajouter

200 µl).


Eliminer la colonne.

Récupérer le matériel élué dans le tube Eppendorf.

Prévoir toujours un tube témoin extraction

Faire migrer 5 µl de l’éluât sur un gel d’agarose à 0,7% pour vérifier la qualité

de l’extraction.

Conserver l’ADN à + 4°C + ou - 2°C jusqu’au rendu du diagnostic puis le

conserver à – 20 °C + ou - 2°C. Eviter les congélations-décongélations.

ANNEXES

234

ANNEXE 5

Protocole d’extraction d’ADN des souches de C. diphtheriae par le kit

PureLink® Genomic DNA (Invitrogen)

Préparation du lysat des bactéries à Gram positif

1. Préparer le tampon lysozyme Digestion (25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.5 mM

EDTA, 1% Triton X-100). Pour ~ 200 µl de tampon lysozyme Digestion /

échantillon, ajouter du lysozyme pour obtenir une concentration finale à 20

mg/mL.

2. Mettre en suspension dans 180 µl de tampon lysozyme Digestion

contenant le lysozyme une oese bien pleine (1 µl) de culture bactérienne.

Vortexez.

3. Incuber à 37 ºC pendant 30 minutes.

4. Ajouter 20 µl de proteinase K. Vortexez.

5. Ajouter 200 ul de tampon PureLink® Genomic Lysis / Binding et vortexez.

6. Incuber à 55 °C pendant 30 minutes.

7. Ajouter 200 µl d'éthanol à 96-100% au lysat. Vortexez pendant

5 secondes.

Liaison à l'ADN

1. Placer une colonne PureLink® Spin dans un tube de collecte.

2. Charger le lysat (~ 640 µl) avec le tampon Lysis / Binding et l’éthanol

préparés dans la colonne PureLink® Spin.

ANNEXES

235

3. Centrifuger la colonne à 10.000 x g pendant 1 minute à température

ambiante.

4. Jeter le tube de collecte et placer la colonne dans un nouveau tube de

collecte.

5. Laver la colonne avec 500 µl de tampon de lavage 1, préparé avec de

l'éthanol.

6. Centrifuger la colonne à 10.000 x g pendant 1 minute à température

ambiante. Jeter le tube de collecte et placer la colonne dans un nouveau tube

de collecte.

7. Laver la colonne avec 500 µl de tampon de lavage 2 préparé avec de

l'éthanol.

8. Centrifuger la colonne à la vitesse maximale pendant 3 minutes à

température ambiante. Jeter le tube de collecte.

9. Placer la colonne dans un tube stérile de centrifugation de 1,5 ml.

10. Eluer l'ADN avec 25-200 µl de tampon d'élution PureLink® génomique.

11. Incuber la colonne à température ambiante pendant 1 minute.

12. Centrifuger la colonne à la vitesse maximale pendant 1 minute à

température ambiante. Le tube contient de l'ADN purifié.

13. Effectuer une seconde élution au besoin pour augmenter la récupération

qui abaisse la concentration dans l’ensemble. Le tube contient de l'ADN

purifié. Retirer et jeter la colonne.

ANNEXES

236

14. Conserver l’ADN purifié à + 4°C à court terme ou à - 20 °C pour le

stockage à long terme.

ANNEXES

237

ANNEXE 6

Protocole de purification des produits de PCR MLST des souches de

C. diphtheriae par le kit QIAquick PCR Purification (QIAGEN)

1. Ajouter 5 volumes de tampon PB pour 1 volume de la réaction PCR et

mélanger. Si la couleur du mélange est orange ou violet, ajouter 10 µl de 3 M

d'acétate de sodium, pH 5,0, et mélanger. La couleur du mélange jaunit.

2. Placez une colonne QIAquick dans un tube de collecte.

3. Pour lier l'ADN, appliquer l'échantillon sur la colonne QIAquick et

centrifuger pour 30-60 s. Jeter le surnageant et placer la colonne QIAquick

dans le même tube.

4. Pour laver, ajouter 0,75 ml de tampon PE et centrifuger pour 30-60. Jeter le

surnageant et placer le QIAquick colonne dans le même tube.

5. Centrifuger la colonne QIAquick une fois de plus dans un tube de collecte

de 2 ml pour 1 min pour éliminer le tampon de lavage résiduel.

6. Placer chaque colonne QIAquick dans un tube à centrifuger de 1,5 ml

propre.

7. Pour éluer l'ADN, ajouter 50 µl de tampon EB (Tris 10 mM · Cl, pH 8,5) ou

de l'eau (pH 7.0-8,5) au centre de la membrane QIAquick et centrifuger la

colonne pour 1 min. Pour augmenter la concentration d'ADN, ajouter du

tampon d'élution de 30 µl au centre de la membrane QIAquick, laissez la

colonne reposer pendant 1 min, puis centrifuger.

ANNEXES

238

8. Conserver l'ADN purifié à +4°C ou -20°C.

ANNEXES

239

ANNEXE 7


C. diphtheriae par le kit PureLink® PCR Purification (Invitrogen)

Liaison à l'ADN

1. Ajouter 4 volumes de PureLink® Binding Buffer (B2) avec de l'isopropanol

ou Binding Buffer HC (B3) avec de l'isopropanol à 1 volume de produit de PCR

(50-100 µl). Bien mélanger.

2. Introduire une colonne PureLink® de spin dans un tube de collecte.

3. Ajouter l'échantillon avec le tampon de liaison approprié (étape 1) à la

colonne PureLink® Spin.

4. Centrifuger la colonne à température ambiante à 10 000 g pendant

1 minute.

5. Jeter le surnageant et placer la colonne de spin dans le tube de collecte.

Lavage de l’ADN

6. Ajouter 650 µl de tampon de lavage avec de l'éthanol à la colonne.

7. Centrifuger la colonne à température ambiante à 10 000 g pendant

1 minute. Jeter l'écoulement à travers le tube de collecte et placer la colonne

dans le tube.

8. Centrifuger la colonne à la vitesse maximale à température ambiante

pendant 2 à 3 minutes pour enlever tout résidu de tampon de lavage. Jeter le

tube de collecte.

ANNEXES

240

Élution de l'ADN

9. Placer la colonne spin dans un tube de 1,7 ml PureLink® élution.

10. Ajouter 50 µL de tampon d'élution (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) ou de l’eau

distillée stérile (pH> 7,0) au centre de la colonne.

11. Incuber la colonne à température ambiante pendant 1 minute.

12. Centrifuger la colonne à la vitesse maximale pendant 2 minutes.

13. Le tube d'élution contient le produit de PCR purifié. Retirer et jeter la

colonne. Le volume d'élution récupéré est d'environ 48 µl.

14. Stocker le produit de PCR purifié à -20 ° C ou utiliser le produit de PCR

pour l'application souhaitée.

ANNEXES

241

ANNEXE 8


C. diphtheriae par le kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System

(Promega)

1. Ajouter un volume égal de solution de liaison de membrane au produit de

PCR.

Liaison à l'ADN

1. Insérez la colonne SV dans le tube de collection.

2. Transférer le produit de PCR dans la colonne. Incuber à température

ambiante pendant 1 minute.

3. Centrifuger à 16 000 g pendant 1 minute. Jeter le surnageant et réinsérer

La colonne dans le tube de collection.

Lavage de l’ADN

4. Ajouter 700μl de la Membrane Wash Solution (éthanol ajouté). Centrifuger à

16.000 × g pendant 1 minute. Jeter le surnageant et réinsérer la colonne dans

le tube de collection.

5. Répéter l'étape 4 avec 500 µl de la Membrane Wash Solution.

Centrifuger à 16.000 × g pendant 5 minutes.

6. Vider le tube de collection et re-centrifuger l'ensemble de colonne pendant

1 minute avec le couvercle ouvert pour permettre l'évaporation de toute trace

résiduelle d'éthanol.

ANNEXES

242

Élution de l’ADN

7. Transférer soigneusement la colonne dans un tube à centrifuger de 1,5 ml

propre.

8. Ajouter 50 µl de Nuclease-Free Water dans la colonne. Incuber à

température ambiante pendant 1 minute. Centrifuger à 16.000 g pendant

1 minute.

9. Jeter la colonne et conserver l’ADN à + 4 °C ou - 20 °C.

ANNEXES

243

ANNEXE 9

Carte sanitaire de l’Algérie (source : www.ands.dz)

01- Adrar 13- Tlemcen 25- Constantine 37- Tindouf

02- Chlef 14- Tiaret 26- Médéa 38- Tissemsilt

03- Laghouat 15- Tizi Ouzou 27- Mostaganem 39- El Oued

04- O.E.Bouaghi 16- Alger 28- M’sila 40- Khenchla

05- Batna 17- Djelfa 29- Mascara 41- Souk Ahras

06- Béjaia 18- Jijel 30- Ouargla 42- Tipaza

07- Biskra 19- Setif 31- Oran 43- Mila

08- Béchar 20- Saïda 32- El Bayadh 44- Ain Defla

09- Blida 21- Skikda 33- Illizi 45- Naama

10- Bouira 22- Sidi Bel Abbés 34- Bordj B Arreridj 46- Ain Temouchent

11- Tamanrasset 23- Annaba 35- Boumérdes 47- Ghardaïa

12- Tebessa 24- Guelma 36- El Tarf 48- Relizane

ANNEXES

244

ANNEXE 10

PCR en temps réel du gène tox des souches de C. diphtheriae (n=30)

N° d'ordre RT-PCR tox Sous unité A (CT) Sous unité B (CT)

Contrôle

positif

(NCTC

10648)

Positif 15,61 15,59

Contrôle

négatif

Négatif - -

7413/93 Positif 17,45 16,84

7580/93 Positif 18,35 17,74

6265/94 Positif 15,87 15,90

7479/94 Négatif - -

7668/94 Positif 15,04 14,52

7673/94 Négatif - -

7713/94 Positif 17,49 16,71

8216/94 Positif 17,05 16,60

8218/94 Positif 15,50 16,54

8292/94 Positif 16,28 15,84

s154/95 Positif 17,51 17,58

s183/95 Négatif - -

7765/95 Positif 18,01 18,28

8243/95 Positif 17,03 16,49

s284/97 Négatif - -

5942/99 Positif 15,90 15,71

5946/99 Positif 17,84 16,84

ANNEXES

245

5948/99 Positif 15,03 15,30

6014/99 Positif 18,22 17,57

405/00 Positif 16,74 17,03

406/00 Positif 20,03 16,66

268/03 Positif 15,30 15,37

362/03 Positif 16,08 32,29

363/03 Positif 15,54 15,60

274/03 Positif 28,89 18,11

s101/05 Positif 16,23 16,22

s108/05 Positif 16,17 15,95

s136/05 Positif 18,12 18,30

2578/08 Négatif - -

2613/08 Négatif - -

ANNEXES

246

ANNEXE 11

CMIs des antibiotiques vis-à-vis des souches de C. diphtheriae (n=150)

N° d'ordre Pénicilline Céfotaxime Erythromycine Gentamicine Vancomycine Tétracycline Chloramphénicol Co-trimoxazole

7413/93 0,016 1 0,016 1 0,75 24 16 0,38

7580/93 0,016 1,5 0,016 1,5 0,5 0,25 0,75 0,094

7584/93 0,5 2 0,016 1,5 0,75 32 32 0,19

8111/93 0,5 1,5 0,023 0,75 0,5 8 24 0,125

s63/94 0,38 3 0,016 1,5 1 24 16 0,19

1812/94 0,19 1 0,023 1 0,5 12 16 0,125

5618/94 0,25 1,5 0,023 1,5 0,38 0,064 1,5 0,064

5904/94 0,25 1,5 0,023 1,5 0,25 0,094 1 0,064

5910/94 0,125 1 0,016 1,5 0,38 12 24 0,125

6004/94 0,032 1 0,023 1,5 0,5 24 32 0,25

6007/94 0,25 1,5 0,023 1 0,25 16 24 0,19

6010/94 0,25 0,5 0,016 0,125 0,5 12 16 0,19

6085/94 0,19 1,5 0,016 1 1 256 24 0,125

ANNEXES

247

6257/94 0,38 3 0,016 1,5 1 8 24 0,19

6265/94 0,125 2 0,125 0,064 0,5 32 8 0,25

6267/94 0,19 1,5 0,016 0,75 0,38 0,064 0,75 0,047

6270/94 0,19 1 0,023 1 0,38 16 24 0,125

6272/94 0,19 1,5 0,016 1 0,5 12 24 0,19

6669/94 0,38 1,5 0,032 1,5 0,75 12 32 0,19

6690/94 0,25 2 0,016 0,064 0,38 12 24 0,19

6731/94 0,125 2 0,023 2 1 16 1,5 0,047

6735/94 0,25 1,5 0,016 1,5 0,38 32 16 0,19

6738/94 0,19 1,5 0,023 1,5 0,75 64 16 0,19

7083/94 0,125 1,5 0,016 1,5 0,38 16 24 0,19

7084/94 0,094 0,75 0,016 1,5 1 32 1 0,094

7086/94 0,25 1,5 0,016 1,5 0,38 32 16 0,19

7094/94 0,25 1,5 0,016 1,5 0,5 32 16 0,125

7099/94 0,5 2 0,016 1 0,5 8 16 0,19

7101/94 0,19 1,5 0,016 1,5 0,38 16 16 0,19

ANNEXES

248

7179/94 0,25 2 0,023 1,5 0,5 0,094 1,5 0,064

7300/94 0,125 0,75 0,016 1,5 0,38 24 1 0,064

7475/94 0,125 1 0,016 1,5 1 24 1 0,064

7479/94 0,125 0,75 0,125 1 0,5 0,25 1 0,064

7486/94 0,125 1,5 0,023 1 0,75 16 32 0,19

7661/94 0,125 1,5 0,023 2 0,75 16 1,5 0,047

7665/94 0,5 1,5 0,016 1 0,75 256 24 0,125

7666/94 0,19 1,5 0,023 1 0,5 24 1,5 0,032

7668/94 0,094 1 0,094 0,125 0,5 32 24 0,125

7673/94 0,125 3 0,125 1 1 64 48 0,19

7674/94 0,12 2 0,016 0,125 0,38 16 16 0,19

7681/94 0,25 1 0,016 0,064 0,75 12 16 0,19

7713/94 0,064 0,75 0,064 1 0,5 32 24 0,125

7718/94 0,5 1,5 0,016 1 0,75 64 16 0,125

7870/94 0,12 0,5 0,016 0,19 0,5 8 12 0,125

7871/94 0,25 1,5 0,016 2 0,38 32 24 0,25

ANNEXES

249

7978/94 0,25 1,5 0,016 1,5 0,75 256 16 0,19

8045/94 0,25 1,5 0,032 1,5 0,5 12 32 0,125

8216/94 0,047 0,75 0,047 1,5 0,5 32 24 0,19

8218/94 0,19 0,38 0,19 0,75 0,38 32 32 0,094

8220/94 0,047 0,38 0,016 0,5 0,75 4 16 0,064

8221/94 0,19 1 0,023 0,5 1 16 48 0,125

8223/94 0,064 1 0,023 0,5 0,75 12 16 0,19

8224/94 0,25 1,5 0,016 1 0,38 24 32 0,19

8225/94 1 2 0,023 1,5 0,75 48 24 0,19

8226/94 0,19 1 0,016 1,5 1 0,094 1,5 0,094

8291/94 0,19 1,5 0,016 0,75 0,5 12 32 0,064

8292/94 0,094 1,5 0,094 1,5 0,38 64 24 0,047

8293/94 0,38 1,5 0,016 1 0,75 64 24 0,19

s75/95 0,5 1 0,016 0,064 0,38 16 16 0,19

s128/95 0,25 1 0,016 1 1 24 24 0,19

s154/95 0,25 2 0,25 1,5 0,5 128 24 0,19

ANNEXES

250

s157/95 0,25 3 0,016 1,5 1 24 24 0,19

s182/95 0,25 3 0,016 1 0,5 12 24 0,19

s183/95 0,125 1,5 0,125 0,064 0,38 24 16 0,38

539/95 0,25 1,5 0,016 1,5 1 256 24 0,19

541/95 0,25 2 0,016 1 1 24 16 0,25

543/95 0,25 1 0,016 1 1 12 16 0,19

544/95 0,25 1 0,016 0,094 0,38 8 24 0,19

774/95 0,25 1,5 0,016 1,5 1 12 24 0,19

5277/95 0,38 1,5 0,016 1 1 12 24 0,19

6690/95 0,25 2 0,016 1 0,75 12 24 0,125

6876/95 0,38 2 0,023 1,5 0,38 16 24 0,19

7765/95 0,047 3 0,016 1,5 1,5 0,25 16 0,125

8243/95 0,047 1,5 0,016 1 0,38 0,25 0,75 0,125

8245/95 0,19 1 0,016 2 1 0,094 0,75 0,094

7758/96 0,5 1,5 0,023 1 0,75 8 24 0,19

8317/96 0,19 1 0,023 0,75 0,5 12 16 0,25

ANNEXES

251

8928/96 0,25 1 0,016 0,75 0,5 48 24 0,19

s284/97 0,016 1,5 0,016 1,5 0,5 64 0,75 0,125

7935/97 0,25 1 0,016 1,5 0,5 32 24 0,19

8342/97 0,19 1 0,023 2 0,5 0,094 1,5 0,064

8390/97 0,25 1 0,016 2 0,5 0,094 0,75 0,094

8630/97 0,5 1,5 0,023 1 0,5 8 24 0,19

8631/97 0,5 1 0,023 1 0,5 8 16 0,19

8713/97 0,25 3 0,023 0,5 0,75 256 16 0,5

270/98 0,125 2 0,016 1,5 0,5 12 48 0,19

844/98 0,19 1 0,023 0,5 0,38 8 24 0,25

2116/98 0,125 0,75 0,016 1 0,5 24 24 0,064

4568/98 0,5 1,5 0,016 1 0,5 48 24 0,094

8157/98 0,25 1 0,016 0,094 0,38 16 24 0,094

164/99 0,5 1,5 0,016 1,5 0,75 64 24 0,19

980/99 0,25 1,5 0,016 0,75 0,38 12 24 0,125

5942/99 0,016 2 0,016 1,5 0,5 0,19 24 0,125

ANNEXES

252

5946/99 0,19 1,5 0,016 1 0,5 192 1,5 0,19

5948/99 0,094 2 0,016 0,75 0,25 256 1,5 0,25

5950/99 0,5 2 0,032 1 0,5 8 16 0,125

6014/99 0,016 1 0,016 0,125 0,5 96 32 0,19

6016/99 0,125 1,5 0,047 1,5 1 32 32 0,19

6116/99 0,25 1,5 0,023 1,5 0,38 12 0,75 0,125

6019/99 0,19 1,5 0,023 1,5 1 48 24 0,19

6226/99 0,5 1,5 0,047 1 0,5 8 24 0,19

6314/99 0,25 1,5 0,016 1,5 1 32 64 0,19

405/00 0,064 1 0,016 1 0,5 128 0,75 0,094

406/00 0,125 1,5 0,125 0,125 0,75 64 0,19 0,125

s08/01 0,25 2 0,023 1 1 24 16 0,25

578/01 0,38 2 0,016 2 1 32 0,5 0,064

1727/01 0,25 1 0,023 1 0,38 24 16 0,094

268/03 0,016 1 0,016 0,5 0,5 64 1 0,064

274/03 0,19 1 0,016 1,5 0,38 12 16 0,19

ANNEXES

253

359/03 0,19 0,75 0,023 1,5 0,5 32 0,75 0,064

361/03 0,125 1 0,016 1,5 1 48 0,75 0,125

362/03 0,023 0,75 0,016 1,5 0,38 96 0,75 0,094

363/03 0,094 1 0,094 0,75 0,38 192 0,75 0,047

3286/04 0,125 0,5 0,032 0,75 0,75 0,064 0,75 0,25

s101/05 0,064 1 0,016 2 0,5 0,19 0,75 0,5

s102/05 0,19 1,5 0,016 1,5 0,38 12 16 0,125

s108/05 0,094 0,75 0,016 1,5 0,38 0,125 1,5 0,094

s112/05 0,25 2 0,016 0,75 1 12 16 0,19

s136/05 0,094 1,5 0,094 1,5 0,75 32 1,5 0,19

s137/05 0,25 3 0,023 2 0,75 32 2 0,19

660/05 0,38 1,5 0,016 1,5 0,5 48 1 0,064

933/05 0,047 0,75 0,016 0,75 0,5 0,047 0,5 0,064

3365/05 0,094 0,75 0,023 0,19 0,25 0,064 0,5 0,064

2301/06 0,094 1,5 0,016 0,38 0,38 0,047 1 0,064

594/06 0,19 1,5 0,023 2 0,75 16 0,5 0,012

ANNEXES

254

1448/06 0,19 1 0,016 1,5 0,5 12 1 0,19

2416/06 0,19 2 0,125 2 1 2 0,75 0,19

3531/06 0,19 1,5 0,016 1,5 0,75 12 24 0,125

4192/06 0,125 1,5 0,064 1 1 0,064 1 0,125

1140/07 0,064 0,75 0,016 0,75 0,38 0,047 0,5 0,064

3128/07 0,064 1,5 0,047 0,75 0,75 0,125 0,75 0,064

189/08 0,032 0,125 0,023 0,5 0,5 0,125 0,75 0,094

948/08 0,06 0,19 0,023 0,064 0,5 0,064 0,19 0,047

1076/08 0,064 1 0,016 0,5 0,38 0,047 1 0,064

2166/08 0,064 1,5 0,016 0,75 0,25 0,064 0,5 0,064

2264/08 0,125 1 0,016 3 1 24 0,75 0,125

2564/08 0,064 1 0,047 0,75 0,75 0,125 1 0,064

2578/08 0,25 1,5 0,023 1,5 0,75 0,038 1 0,094

2613/08 0,125 0,75 0,032 0,5 0,5 0,016 1 0,064

245/09 0,064 1 0,032 1,5 1 0,094 1 0,064

313/09 0,032 0,75 0,023 0,25 0,75 0,094 1 0,064

ANNEXES

255

1452/09 0,094 0,75 0,016 0,25 0,38 0,094 0,75 0,047

1595/09 0,125 2 0,023 0,5 1 0,125 1 0,125

51/11 0,023 0,75 0,016 0,5 0,5 0,023 1,5 0,064

767/11 0,19 2 0,016 0,38 1 0,094 1 0,064

1821/11 30 36 40 33 30 32 34 30

s193/12 0,008 0,003 0,016 0,094 0,25 0,094 0,75 0,064

346/12 0,12 0,25 0,016 0,19 0,5 0,023 1 0,047

2183/12 0,002 0,008 0,032 0,125 0,5 0,25 1 0,032

948/13 0,002 0,023 0,023 0,064 0,38 0,094 2 0,004

ANNEXES

256

ANNEXE 12

Tolérance à la pénicilline des 30 souches de C. diphtheriae étudiées

N° d'ordre CMI CMB CMB/CMI Tolérance

7413/93 0,25 0,25 1 Négatif

7580/93 0,5 0,5 1 Négatif

6265/94 0,125 128 1024 Positif

7479/94 0,25 128 512 Positif

7668/94 0,5 64 128 Positif

7673/94 0,125 32 256 Positif

7713/94 0,25 4 16 Négatif

8218/94 0,125 0,125 1 Négatif

8216/94 0,125 64 512 Positif

8292/94 0,25 8 32 Positif

7765/95 0,25 2 8 Négatif

8243/95 0,25 64 256 Positif

s154/95 0,25 64 256 Positif

s183/95 0,25 32 128 Positif

s284/97 0,25 128 512 Positif

5942/99 0,5 32 64 Positif

5946/99 0,25 8 32 Positif

5948/99 0,5 128 256 Positif

6014/99 0,25 128 512 Positif

405/00 0,25 128 512 Positif

406/00 0,25 128 512 Positif

ANNEXES

257

268/03 0,25 64 256 Positif

362/03 0,25 64 256 Positif

273/03 0,25 64 256 Positif

274/03 1 4 4 Négatif

s101/05 0,25 128 512 Positif

s108/05 0,25 32 128 Positif

s136/05 0,25 128 512 Positif

2578/08 0,25 128 512 Positif

2613/08 0,125 8 64 Positif

ANNEXES

258

ANNEXE 13

Profils des allèles des 16 STs identifiés parmi les isolats de

C. diphtheriae étudiés

ST atpA dnaE dnaK fusA leuA odhA rpoB

32 3 1 18 4 13 3 5

42 6 7 10 8 9 12 10

116 22 18 6 1 3 1 4

128 2 1 47 19 13 3 6

180 6 7 10 8 35 12 11

183 1 2 9 7 8 3 2

186* 2 1 6 19 5 16 9

187 6 7 10 12 16 12 11

209 3 3 4 2 3 3 3

297 2 12 54 13 3 3 4

293 19 1 64 2 3 16 6

368* 2 12 54 1 3 3 18

369* 2 2 9 7 8 3 2

370* 6 7 10 8 16 12 11

371* 6 7 10 8 9 7 11

372* 6 7 10 12 16 12 10

*nouveau ST

ANNEXES

259

ANNEXE 14

Sequence types des 76 souches de C. diphtheriae

N° Année Type de prélèvement Biotype Toxinotype Groupe

Eburst

ST

7413/93 1993 Gorge mitis Positif - 116


8111/93 1993 Gorge gravis Positif - 116

s63/94 1994 Sang mitis Négatif - 116


5910/94 1994 Gorge mitis Négatif - 116











7179/94 1994 Gorge gravis Négatif - 32





ANNEXES

260








s75/95 1995 Gorge mitis Négatif - 116

s154/95 1995 Gorge mitis Positif - 116










8243/95 1995 Gorge mitis Positif 2 183


s284/97 1997 Sang mitis Négatif - 186





ANNEXES

261

















3286/04 2004 Gorge belfanti Négatif 1 180

s101/05 2005 Gorge mitis Positif 2 183

s108/05 2005 Gorge mitis Positif 2 183



594/06 2006 Gorge gravis Négatif - 293

3531/06 2006 Nez mitis Négatif - 116

948/08 2008 Nez belfanti Négatif 1 370

2264/08 2008 Nez mitis Négatif - 128

ANNEXES

262

2578/08 2008 Nez belfanti Négatif 1 187*

2613/08 2008 Nez belfanti Négatif - 371

1595/09 2009 Nez belfanti Négatif - 42

1821/11 2011 Nez belfanti Négatif 1 187*

948/13 2013 Nez belfanti Négatif 1 372

*membre fondateur

these de doctorat en sciences...

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