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TTHHÈÈSSEE
En vue de l'obtention du
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Délivré par l'Université Paul Sabatier Toulouse III
Discipline ou spécialité : Innovation Pharmacologique
JURY Professeur Dominique Langin- Président
Docteur Anne-Marie Cassard Doulcier- Rapporteur
Docteur Annie Quignard-Boulangé- Rapporteur
Dr Anne Bouloumié-Directeur de thèse
Ecole doctorale Biologie Santé Biotechnologies Toulouse Unité de recherche INSERM U858
Directeur(s) de Thèse : Dr. Anne Bouloumié et Dr. Jean Galitzky
Présentée et soutenue par: Carine Duffaut
Le: 16 Juillet 2009
Les lymphocytes du tissu adipeux humain: caractérisation et rôles
Remerciements Je tiens à remercier les docteurs Anne-Marie Cassard Doulcié et Annie Quignard-Boulangé d’avoir accepté d’évaluer ce travail en tant que rapporteur. J’exprime également ma gratitude au professeur Dominique Langin pour avoir gentiment accepté de participer à ce jury de thèse. Je tiens à remercier tout particulièrement le Dr Anne Bouloumié, qui m’a encadrée durant cette thèse tu m’as donnée ma chance et j’ai beaucoup appris sous ta direction. Merci pour m’avoir poussé dans mes retranchements parfois, pour m’avoir communiqué ton enthousiasme pour la science et pour avoir vécu d’aussi près les diverses rédactions d’article. Je remercie le Dr Jean Galitzky pour ses conseils techniques et scientifiques très avisés et constructifs, t’es un peu le mac gyver du labo , merci de m’avoir appris toutes tes petites techniques qu’on ne retrouve pas dans les protocoles officiels, merci pour ta gentillesse qui fait que personne ne t’en veut même si ta paillasse est une zone de non droit, pour ta sensibilité, et ton humour. Je tiens également à remercier Max Lafontan, tous les gens vous ayant côtoyé garderont sûrement la même impression que moi, le plaisir de la discussion, j’ai appris de chacune de nos discussions aussi bien en terme de sciences que de politique ou d’économie, que ce soit au comptoir d’un bistrot ou autour du thé de 17h, merci pour vos conseils toujours avisés mais aussi pour votre gentillesse. Je remercie également l’ex équipe de Jules, Alec pour sa disponibilité et son franc-parler, tu sais tout faire, on a partagé quasiment le même bureau en bordel puis l’amour du FACs, ta bonne humeur, je te laisse mes bébés lymphocytes en toute confiance je sais que tu en prendras grand soin. Marie-Adeline pour m’avoir appris la lipolyse c’était pas gagné et m’avoir supportée ronchonner pendant toutes ces heures de manip mais aussi comment mettre un coup de casque à quelqu’un, comment tout dire avec le sourire, la recette du riz au lait au chocolat, parce que (presque) rien ne te met en colère, pour ta bonne humeur communicative et tes conseils. Michel (maintenant je n’oublierais jamais qui est Claude Bernard), Virginie pour son sens de l’écoute et sa sensibilité, Coralie pour ses conseils et son humour, Babeth qui nous manque parfois(!!), Marie pour les searchers girls, les apéros aux allées, les quiz (qu’on a jamais gagné) et autres délires doctoresques, Mathieu pour les pauses aux allées et les apéros, Pauline pour son aide à tous les instants, pour avoir été mes mains manquantes quand j’en ai eu besoin, pour les barquettes repas qu’on a partagé
pendant 3ans, pour son coté schtroumph grognon (même pas vrai que j’ai le même!!). David qui est là depuis moins longtemps mais je te remercie pour ton écoute et ton soutien, dans cette dernière année tu as toujours été là pour moi dans les nombreux moments difficiles et tu as aussi été ma deuxième paire de bras même pour les isolements jusqu’à 23h… Auré pour la psychorigidité partagée (mais pourquoi personne ne comprend que les cônes se prennent de droite à gauche et de bas en haut ?!), les nombreuses pauses cafés au labo et les nombreuses pauses bières en dehors, pour les longues conversations sur la vie, la recherche, l’amour, les heures improbables à passer au labo et les lendemains difficiles. Je remercie aussi Mattéo pour les soirées, les week ends et les jours fériés passés au labo, ça semble presque normal quand on n’est pas tout seul à galérer. Sans oublier «ceux de Rangueil» qui étaient là au tout début de l’aventure: Estelle, Marion, Sandy, Carine, Anne, Charlotte, Sandra, Danièle, Marie-Françoise Philippe et Jean Sébastien. Je remercie mes parents qui m’ont toujours encouragée dans mes études et dans mon projet professionnel, vous m’avez permis d’arriver là où j’en suis et quoi qu’il se passe par la suite, cette expérience aura été bénéfique pour moi. Merci de m’avoir laissé piller votre frigo quand je n’avais pas le temps d’aller faire les courses, de m’avoir laissé squatter votre WE en amoureux à Venise parce que j’avais besoin de vacances, merci de m’avoir rendu la vie plus facile pendant ces 4 années de thèse et avant aussi. Je remercie ma sœur préférée (comment ça j’en ai qu’une?!) Céline qui est toujours là pour moi (même si ces quatre dernières années, moi je n’étais pas trop là), pour la mise en page de mon manuscrit jusqu’à 2h du mat parce qu’on fait toujours tout au dernier moment, pour tout ce qu’on partage depuis 26ans que les mots ne sauraient décrire, les marmots Juliette et Valentin, je suis pas la tante idéale vu que je peux jamais les garder mais promis quand vous serez grands je vous emmènerais voir des concerts!! Sans oublier Erik, parce que même si on est jamais d’accord on partage certains gouts musicaux, l’amour de ma sœur adorée, du vin et de la bonne nourriture… Je remercie les expatriés qui m’ont gardé une place dans leur cœur et qui étaient là malgré tout le jour J, c’est bon de savoir qu’après des années on a pas tant changé: les thésardes parisiennes Karima tu ne peux pas savoir à quel point les délires sur facebook m’ont fait me sentir moins seule pendant la rédaction, et claire parce le temps n’affaiblit pas notre amitié, parce que c’est toujours un plaisir de se voir même si ce n’est qu’une fois par an , parce qu’un certain WE de Mars 2008 toi et Manu vous m’avez un peu sauvée, t’es au bout de tes peines toi aussi alors quand est-ce qu’on repart en vacances ensemble ??? Florence, courage le bout du tunnel se rapproche, la vie te fait souvent prendre les choses du bon
coté, faut faire pareil avec la thèse, merci pour les aprems shopping, les longues conversations téléphoniques à se plaindre, les grands débats sur grey’s anatomy et d’autres séries inavouables, Ludo, mon grand frère d’adoption parce qu’on se retrouve toujours avec plaisir même quand on se voit pas pendant des mois j’espère que ça durera, la grande Claire pour toutes ces soirées à écumer les bars toulousains, pour le super we qu’on a passé à Grenoble, pour les 11années d’amitié qui ne sauraient se résumer en quelques lignes, les pintades parisiennes Sophie et Agnès, le club loose c’est fini mais finalement les bancs de l’amphi et les soirées mojito sont pas si loins, merci d’être vous!! Je remercie aussi les présents tout au long du parcours Pierre, Mary, Niko, Marianne, Phillippe, Fred, Damien grâce à qui je ne suis pas la plus râleuse du groupe, pour m’avoir appris qu’on ne nait pas tous égaux devant l’alcool, pour toutes ces soirées chez Roger, toutes ces longues conversations sur le sens de la vie. Bien sur je remercie Fab toujours présent pour moi pendant ces trois dernières années , pour les soirées dvds, bières, pour les concerts où tu voulais pas aller, pour les WE à AX, pour m’avoir appris ce qu’était la peuf (ou puf ou puff bref…), pour m’avoir soutenue, épaulée sur la fin comme personne, pour avoir toujours cru en moi, et pour ta persévérance parce que tu savais que ça en valait la peine. A présent j’ai du temps à nous consacrer. Enfin je remercie Anne, on a vécu cette thèse ensemble depuis le début (même le concours!!) et un peu moins à la fin. On a englouti des km pour de sombres festivals, des concerts semi privés, des week ends ou des vacances à l’autre bout du monde, du marché st aubin au camden market, merci pour les fou rires et les crises de larmes, pour continuer à croire au prince charmant ;), pour penser que les pâtes et les pizzas sont le sommet de la gastronomie, pour m’avoir appris à apprécier les films nuls pour les filles, (je sais pas si je dois vraiment te remercier!), pour me supporter sur la plage (fait trop chaud et d’abord je m’ennuie), pour savoir à un de mes regards que ça ne va pas et parce que tout le monde cherche l’amitié parfaite…. Je remercie les beautés vulgaires pour le soutien musical (certes involontaire) apporté durant ces 3 années de labeur (fallait pas y aller….), la dame de la coccinelle pour ses brownies la cafet de l’hôpital qui a la bonne idée de faire des muffins en cas de coup dur, les bars de la ville rose qui ont épongé les mauvais coups et les bons! Greys anatomy et domino’s pizzas pour avoir agrémenté les soirées entre copines, Roger parce que le killarney est devenu comme une 2nde
maison et le bikini qui fait revire la scène musicale à Toulouse, sans concerts je ne serais pas allée au bout!
2
3
Sommaire
Liste des figures………………………………………………………………………………..6
Liste des tableaux………………………………………………………………………………7
Principales abréviations utilisées………………………………………………………………8
Avant-propos…………………………………………………………………………….…....10
Partie 1 Contexte scientifique et Problématique……………………………….…….12
I Le système immunitaire…………...…………………………………………………....13
I-1L’immunité innée………………………………………………………………...………14
I-1.1 Les cellules présentatrices d’antigènes ou CPAs……………………………….15
I-1.1 a Les macrophages……………………………...……………….………17
I-1.1 b Les cellules dendritiques………………………………………………19
I-1.2 Les cellules cytotoxiques…………………………………………………….….20
I-1.2.a Les cellules Natural Killer (NK)……………………………………....20
I-1.2.b Les cellules NKT……………………………………………………...22
I-1.3 Les lymphocytes γδ..............................................................................................22222222
I-2 L’immunité adaptative………………………………………………………………….23
I-2.1 La réponse immunitaire à médiation humorale…………………………………24
I-2.1.a Les lymphocytes B………………………………………………….…24
I-2.1.b Déroulement de la réponse B………………………………..………...25
I-2.2 La réponse immunitaire à médiation cellulaire ………………………………...26
I-2.1.a Les lymphocytes T…………………………………………………….26
I-2.2.b Induction de la réponse CD4+……………………………………...….28
I-2.2.c Induction de la réponse CD8+ ……………………………………..…..32
I-2.3 La mémoire immunitaire………………………………………………………..33
II Les relations entre le tissu adipeux et le système immunitaire…….………...37
I I-1 Les principales fonctions du tissu adipeux blanc ….………………………………...37
II-1.1 Le tissu adipeux blanc : organe de stockage énergétique………………………38
II-1.1 a La lipogenèse……….……………………….………………………..38
II-1.2 b La lipolyse……………………….……………………..…………….41
II-1.2. Le tissu adipeux blanc: Organe hétérogène…….…...….………………………….43
4
II-1.2 a L’adipocyte…………………………………………………………...43
II-1.2 b Les cellules progénitrices…………………...………………………..44
II-1.2 c L‘adipogenèse…………………………………..……………………44
II-1.2 d Les cellules endothéliales et le réseau vasculaire……..……………..46
II-2 La réponse immunitaire altère l’état métabolique…………………………………...46
II-2.1 Conséquences de la réponse de phase aiguë…………………………………...47
II-2.1 a Modifications du métabolisme lipidique……………………………..47
II-2.1 b Modifications de la sensibilité à l’insuline…………………………...48
III-1.2 Réponse de phase aiguë et anorexie…………………………………………...48
II 3 Impact du métabolisme sur le système immunitaire………………………………....49
II-3.1 L’état nutritionnel altère la réponse immune……………………………….….49
II-3.1 a Effets des acides gras…………………………………………………49
II-3.1 b Malnutritions et infections………………………………………........53
II-3.2 Les pathologies associées au tissu adipeux………………………………….....54
II-3.2 a L’obésité……………………………………………………………...54
II-3.2 b L’inflammation chronique du tissu adipeux liée à l’obésité………....55
II-3.2 c L’insulinorésistance………………………………………………..…57
II-3.2 d La leptine ………………………………………………………….....58
II 4 Interactions directes entre le tissu adipeux et le système immunitaire ….……..…..60
II-4.1 Le rôle nutritionnel du tissu adipeux pour le système immunitaire….……...…60
II-4.2 Les cellules immunitaires au sein du tissu adipeux…………………….....……61
� Les macrophages du tissu adipeux……………………………………………………61
� Les lymphocytes du tissu adipeux………………………………………...………….63
Revue: Les lymphocytes du tissu adipeux……………………………….……64
Objectifs …………………………………………………………………………..….65
Partie 2 Résultats……………………………………………………….……..66
I Caractérisation des lymphocytes du tissu adipeux humain et de leur rôle sur le
métabolisme et la différenciation adipocytaire……………….………………...67
5
Article 1 Interplay between human adipocytes and T lymphocytes in obesity:CCL20 as
an adipochemokine and T lymphocytes as lipogenic modulators.......................................69
Discussion de l’article 1............................................................................................................70
II Caractérisation phénotypique des lymphocytes du tissu adipeux……………74
II 1 Facteurs potentiels impliqués dans la survie et/ou prolifération des lymphocytes T......74
II.2 Expression de marqueurs d’activation et influence de l’état d’obésité………………...79
II 3 Effets des lymphocytes sur les autres populations cellulaires du tissu adipeux humain 83
III Cinétique d’accumulation des lymphocytes au sein du tissu adipeux et rôles
sur le développement de l’obésité……………………………….……………...87
Article 2: Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue during the
onset of obesity........................................................................................................................87
Discussion de l’article 2:……………………….……………………………………………..88
Partie 3:Conclusion générale et perspectives……………………….……….….91
I Identification des lymphocytes du tissu adipeux humain…………….………………....92
II Accumulation des lymphocytes T dans le tissu adipeux humain……………….……...92
III Caractérisation phénotypique des lymphocytes du tissu adipeux humain…….…….94
IV Rôle des lymphocytes dans le tissu adipeux……………………………………………95
V Spécificité des lymphocytes du tissu adipeux humain…………………………...……..96
VI Différences observées avec les modèles murins………………………………………..97
Partie 4: Références Bibliographiques…………………………..………….…100
Titre et résumé en anglais…………………………………………………………………114
6
Liste des Figures
Figure 1: Présentation des pathogènes intra et extra cellulaires par les CPAs
Figure 2: La différenciation en macrophage
Figure 3: Le procédé de missing self recognition
Figure 4: La réponse B thymo-dépendante
Figure 5: Schéma d’une molécule de TCR
Figure 6: La synapse immunologique
Figure 7: La différenciation des lymphocytes auxiliaires
Figure 8: Voies de différenciation des cellules mémoires
Figure 9: Lipogenèse et synthèse des triglycérides dans l’adipocyte
Figure 10: Contrôle de la lipolyse dans l’adipocyte humain
Figure 11: Représentation des mécanismes par lesquels une modification des acides gras
alimentaires peut influencer la réponse immune
Figure 12: Rôles des principaux éicosanoides dans la régulation de l’inflammation et de
l’immunité
Figure 13: Les sécrétions du tissu adipeux
Figure 14: Effets de la leptine sur le système immunitaire
Figure 15: Anatomie du tissu adipeux entourant les ganglions lymphatiques
Figure 16: Technique d’isolement des différentes populations cellulaires du tissu adipeux
humain
Figure 17: Caractérisation des lymphocytes isolés du tissu adipeux par cytométrie en flux
Figure 18: Expression d’IL-15 et IL-7 dans les différentes fractions du tissu adipeux
Figure 19: Expression de la leptine et de son récepteur dans les lymphocytes sanguins et isolés
du tissu adipeux de patients d’IMC croissants
Figure 20: Expression de marqueurs pro-inflammatoires dans les lymphocytes sanguins et
isolés du tissu adipeux de patients d’IMC croissants
Figure 21: Expression d’IL-17 et de CCL20 dans les lymphocytes sanguins et isolés du tissu
adipeux
Figure 22: Effets des milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux sur la
différenciation des précurseurs adipocytaires
Figure 23: Effets des milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux sur les
régulations des transcrits macrophagiques
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Liste des Tableaux
Tableau 1: Principales cellules du système immunitaire
Tableau 2: Récapitulatif des principaux marqueurs de différenciation utilisés
Tableau 3: Classification des IMC selon l’OMS et définition de l’obésité
Tableau 4: Périmètre abdominal par sexe et risque de complications métaboliques associées
chez les sujets de race blanche (selon l’OMS)
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Principales abréviations utilisées
Ac Anticorps
Ag Antigène
AA Acide arachidonique
AGL Acide gras libre
AGNE Acide gras non estérifié
BCR B Cell Receptor (récepteur des cellules B)
CD Cluster de différenciation
CMH Complexe majeur d’histocompatibilité
CPA Cellules présentatrice d’antigène
CTL Cytotoxic T lymphocyte (lymphocyte T cytotoxique)
EAE Experimental autoimmune encephalomyelitis (encéphalomyélite auto-
immune expériementale)
FAS Fatty acid synthase (synthase des acides gras)
FSV Fraction stroma vasculaire
HDL High density lipoprotein
HLA Human leucocyte antigen (Antigène des leucocytes humains)
Ig Immunoglobuline
IL Interleukine
IMC Indice de masse corporelle
INFγ Interferon γ
ITAM Immunoreceptor tyrosine based activation motif (motif d’activation à la
base des tyrosines des immunorécepteurs)
KIR Killer-cell Ig-like receptor (récepteur aux Ig des cellules tueuses)
LDL Low density lipoprotein (lipoprotéine de faible densité)
LHS Lipase hormono sensible
LPL Lipoprotéine lipase
LPS Lipopolysaccharide
LT Leucotriène
M-CSF Macrophage colony stimulating factor (facteur de croissance des
macrophages)
NK Natural Killer (tueur naturel)
9
NKT Natural Killer T cell
PAMP Pathogen associated molecular pattern (motif moléculaire associé aux
pathogènes)
PG Prostaglandine
PRR Pattern recognising receptor (récepteurs de reconnaissance des motifs
moléculaires)
TCR T cell receptor
TG Triglycéride
TGF Tumor growth factor
TLR Toll like receptor
TNFα Tumor necrosis factor
Treg Lymphocyte T régulateur
10
Avant-propos
Les systèmes métaboliques et immunitaires sont parmi les plus fondamentaux requis
pour la survie. Plusieurs réponses métaboliques et immunitaires ou systèmes sensibles aux
pathogènes et aux nutriments ont été conservés au cours de l’évolution à travers les espèces.
De ce fait, la réponse immune et la régulation métabolique sont hautement intégrées et la
fonction propre de chacune est dépendante de l’autre. Cette interface peut être vue comme un
mécanisme central homéostatique dont la dysfonction peut créer un ensemble de désordres
associés.
La malnutrition est une cause de déficit immunitaire sévère. L’excès de masse grasse à
l’origine de l’obésité va avoir des conséquences immunes en initiant une inflammation
chronique systémique ainsi qu’un état inflammatoire de bas niveau au sein du tissu adipeux.
Cet état inflammatoire est considéré pour être à l’origine des pathologies associées à l’obésité
telles que le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires.
Dans l’introduction de ce manuscrit nous allons décrire le système immunitaire dans
une première partie puis les interactions entre la fonction immune et le métabolisme. Elles
seront abordées d’une part via les effets des cytokines et des hormones sécrétées et d’autre
part, par des contacts directs entre les dépôts de tissu adipeux et les cellules immunitaires.
L’essentiel de ce travail de thèse s’attache à caractériser les populations
lymphocytaires présentes au sein du tissu adipeux, l’évolution de leur nombre et de leur
phénotype lors de l’extension de la masse adipeuse, ainsi qu’avec la localisation anatomique
des dépôts adipeux. Cette caractérisation repose sur des études globales de la fraction stroma
vasculaire isolée de tissu adipeux de patients ayant eu recours à la chirurgie esthétique et de
patients obèses morbides avant une chirurgie bariatrique. Nous avons ensuite tenté de
comprendre les mécanismes de recrutement et/ou de prolifération de ces lymphocytes, ainsi
11
que leurs rôles potentiels sur le développement du tissu adipeux et sur le métabolisme des
adipocytes. Nous évaluerons également leur incidence sur les autres populations cellulaires
présentes au sein du tissu adipeux à l’aide d’expériences in vitro, par des méthodes originales
de sélection des cellules à partir de la fraction stroma vasculaire du tissu adipeux.
Enfin, l’emploi de modèles animaux nous a permis d’avoir une approche in vivo des
rôles potentiels des lymphocytes dans le développement de l’obésité. Nous avons pu suivre
l’évolution des cellules immunes dans le tissu adipeux au cours de l’installation de l’obésité et
étudier l’impact d’une déficience en lymphocytes sur la prise de poids.
12
Partie 1 : Contexte scientifique
et problématique
13
I Le système immunitaire
Le système immunitaire est chargé de la défense de notre organisme contre les
éléments extérieurs (virus, bactéries, parasites, champignons,..) et de l’élimination des
substances étrangères à l’organisme. Il consiste en un ensemble de moyens (organes, tissus,
cellules et molécules) permettant de répondre rapidement, de façon souvent spécifique et
efficace aux agressions de nombreux pathogènes auxquels nous sommes confrontés. En effet,
notre organisme est en contact permanent avec des pathogènes potentiels véhiculés par l’air,
les aliments, les contacts avec les autres ou à l’occasion de blessures. Les voies d’entrées sont
donc multiples: voie respiratoire, tractus digestif, peau, sang. Les épithéliums et les
substances qu’ils secrètent tels que le lysozyme par exemple, limitent considérablement
l’entrée de ces pathogènes. Toutefois, lorsque ces barrières physiques et chimiques sont
franchies, un ensemble de mécanismes complémentaires se met en place: la réponse
immunitaire. Il s’agit d’un système intégré mettant en jeu des cellules produites dans la
moelle osseuse et circulant dans notre sang ou résidant dans nos tissus. Ce système est
organisé en différentes lignes de défense que l’on peut définir comme l’immunité innée ou
naturelle et l’immunité acquise ou adaptative (Tableau 1). Ces deux réponses vont agir en
interaction permanente lors d’une réponse immunitaire et certaines cellules bien que définies
dans un type de réponse, jouent souvent un rôle dans les deux types d’immunité.
14
Tableau 1: Principales cellules du système immunitaire
I-1 L’immunité innée
C’est la première ligne de défense de l’organisme et la plus rapide, qui est mise jeu en
quelques heures. Constitutive, elle repose sur la dégradation non spécifique des pathogènes.
En effet les cellules de l’immunité innée n’ont pas de récepteur spécifique de l’antigène, mais
sont efficacement dirigées contre des motifs des pathogènes conservés au cours de
l’évolution: les PAMPs (Pathogen Associated Molecular Pattern), tels que l’ADN viral, le
LPS (lipopolysaccharide) ou encore le mannose (1). Les récepteurs à ces composants, les
PRRs (Pattern Recognising Receptor) sont présents essentiellement à la surface des cellules
� Immunité innée: min, heures non spécifique
� Cellules présentatrices d’antigène (macrophages, cellules dendritiques)
� Activation lymphocytes T � Production cytokines
� Cellules NK: � Destruction des cellules
infectées � Production IFNγ
� Cellules NKT : � cytokines IFNγ, TNFα, IL-4
� Lymphocytes Tγδ(cytotoxiques et immuno-régulateurs)
Immunité adaptative : jours spécifique
� Lymphocytes T CD4 auxiliaires:� Cytokines régulatrices : IL4,
IL10 � Cytokines effectrices : IFNγ
� Lymphocytes T CD8 cytotoxiques � Destruction des cellules cibles
� Lymphocytes B sécrétion d’Anticorps circulants
15
phagocytaires. Bien que non spécifique, la réponse innée présente l’avantage d’avoir à sa
disposition de façon immédiate un grand nombre de cellules portant les PRRs et donc prêtes à
combattre un pathogène et ce, sans l’avoir rencontré auparavant. D’une part, les monocytes,
les macrophages, les cellules dendritiques et les neutrophiles sont les phagocytes les plus
efficaces. D’autre part, les voies du complément ainsi que la lyse cellulaire par les cellules
cytotoxiques vont intervenir également dans cette réponse. Tous ces composants vont agir
d’une part en vue de la dégradation des pathogènes ou du non soi et d’autre part en stimulant
les voies de la réponse immune adaptative.
I-1.1 Les cellules présentatrices d’antigènes ou CPAs
Les CPAs telles que les macrophages et les cellules dendritiques ont la capacité
d’internaliser les pathogènes par endocytose, phagocytose ou pinocytose, de les dégrader puis
d’en présenter les antigènes à leur surface et de sécréter une grande variété de médiateurs
inflammatoires et de cytokines afin d’activer leurs partenaires cellulaires.
La phagocytose est l’internalisation de larges particules qui va être permise par la
détection de motifs PAMPs par les PRRs présents à la surface des CPAs. Au niveau du site
d’ingestion, il va y avoir une polymérisation du réseau d’actine qui va permettre
l’internalisation de la particule. Piégée dans la membrane plasmique, elle devient un
phagosome qui va subir une succession de fusions et de fissions avant de fusionner avec un ou
plusieurs lysozomes pour former un phagolysozome (2). Après dégradation, les peptides
antigéniques de la particule phagocytée vont se coupler à des molécules du complexe majeur
d’histocompatibilité ou CMH de classe II et être dirigés à la surface de la membrane pour être
présentés aux lymphocytes T auxiliaires. Les molécules du CMH désignent un ensemble de
glycoprotéines membranaires de structure comparable dont la fonction consiste à présenter
16
des antigènes aux lymphocytes T. Les molécules du CMH humain sont désignées par le
“système HLA (Human Leukocyte Antigen)”. Il en existe 2 grandes familles majeures:
� le CMH de classe I est présent à la surface de toutes nos cellules à l’exception des
globules rouges et des sites immuno-privilégiés (neurones, œil,..). Une fois associées à
des peptide antigéniques, ses molécules sont reconnues par les lymphocytes T
cytotoxiques CD8+ (3).
� le CMH de classe II est présent à la surface des CPAs, lorsqu’il s’associe à un peptide
antigénique, il est reconnu par les lymphocytes T auxiliaires CD4+ (3).
Les pathogènes intracellulaires se répliquant à l’intérieur des CPAs sont transportés dans le
réticulum endoplasmique et couplés à des protéines du CMH I afin d’être présentés à des
lymphocytes T cytotoxiques (4) (Figure1). Les CPAs ayant ingéré un pathogène sur un site
d’infection, s’activent et sont alors transportées par la lymphe afin de présenter les antigènes
aux lymphocytes naïfs circulants dans les organes lymphoïdes secondaires.
Voie endogène Voie exogène
Protéines virales
Virus
Noyau
Réticulum endoplasmique
Cross présentation?
CMH de classe I
CMH de classe II
TAP
Protéasome
Présentation des antigènes aux lymphocytes cytotoxiques
Pathogène extracellulaire
Phagosome
Présentation des antigènes aux lymphocytes auxiliaires
Voie endogène Voie exogène
Protéines virales
Virus
NoyauNoyau
Réticulum endoplasmique
Cross présentation?
CMH de classe I
CMH de classe II
TAP
Protéasome
Présentation des antigènes aux lymphocytes cytotoxiques
Pathogène extracellulaire
Phagosome
Présentation des antigènes aux lymphocytes auxiliaires
Figure 1: Présentation des pathogènes intra et extra cellulaires par les CPAs d’après Roy et
al.(4)
17
I-1.1 a Les macrophages
Les macrophages identifiés par le marqueur CD14 sont des cellules issues de la lignée
myéloïde. La stimulation des précurseurs macrophagiques par M-CSF (Macrophage
colony-stimulating factor) et GM-CSF (Granulocyte macrophage colony-stimulating
factor) va les conduire à se différencier en monocytes. Ces monocytes circulants vont, en
réponse à des stimuli inflammatoires, quitter la circulation et migrer vers les tissus, où ils
acquièrent les propriétés des macrophages. Les monocytes ne sont pas une population
homogène, ils peuvent être classés en deux types de populations : les monocytes
inflammatoires d’une part identifiés par les marquages CD14+ CD16- chez l’homme et
Gr1+ CX3CR1 (récepteur aux chimiokines CX3C de type 1 ou Ly6) faiblement positif
chez la souris, qui peuvent se différencier en cellules dendritiques inflammatoires et
repeupler les compartiments cellulaires de macrophages résidents (5). D’autre part, les
monocytes appelés « résidents » (CD14+ CD16+ chez l’homme et Gr1- CX3CR1+ chez la
souris) qui patrouillent dans les vaisseaux sanguins et vont permettre l’invasion rapide des
tissus en cas de dommages ou d’inflammation (6). Dans les tissus, deux grands types de
macrophages existent (Figure 2).
Les macrophages résidents se retrouvent dans le foie (cellules de Kupffer), dans la
peau (cellules de Langherans) et dans les conjonctifs associés au tractus digestif entre
autres. Le phénotype de ces cellules reste mal défini mais semble être très dépendant du
tissu et du microenvironnement dans lequel elles résident. Les macrophages résidents
cessent de proliférer mais leur synthèse d’ARNm et de protéines est très active (7).
Les macrophages recrutés au cours d’une inflammation sont à courte durée de vie. Ils
peuvent être activés de manière classique ou alternative en réponse à un antigène et
peuvent également s’activer de façon non spécifique d’un antigène en réponse à un corps
étranger ou à un agent inflammatoire stérile (7, 8).
18
Figure 2: La différenciation en macrophage d’après Gordon et al.(7)Des molécules d’adhésion contrôlent la migration des cellules sanguines à travers l’endothélium. Ces molécules incluent des intégrines (β1 et β2 entre autres), des molécules de la famille des immunoglobulines (comme CD31), des sélectines et des récepteurs de type facteur de croissance épidermique à 7 domaines transmembranaires comme (EGF-TM7).
On distingue classiquement deux voies d’activation des macrophages :
• Les macrophages M1 pro-inflammatoires induits par l’IFNγ (Interferonγ) et le
LPS qui vont exprimer le CD16: récepteur à la fraction constante des anticorps et
vont produire des cytokines pro-inflammatoires comme le TNFα (Tumor Necrosis
Factor), l’interleukine 23 (IL-23), l’IL-12, et l’IL-6. Leur mission sera la
destruction des pathogènes et des cellules tumorales.
• La seconde population de macrophages recrutés en réponse à des stimuli de type
IL-4/IL-13 sera plutôt anti-inflammatoire ou réparatrice. Ces macrophages M2
vont exprimer le récepteur au mannose CD206 et produire de faibles quantités de
cytokines pro-inflammatoires mais de grandes quantités d’anti-inflammatoires
comme IL-10, IL-6 et IL-1. Ces macrophages vont être impliqués dans les
Moelle osseuse Sang
Macrophages recrutés
Macrophages résidents
Cellules dendritiques myéloïdes
Ganglions lymphatiques
Cellule progénitrice myéloide
Monocytes
Voie d’activation antigénique classique
Voie d’activation antigénique alternative
Réponse non spécifique d’un antigène
M-CSF GM-CSF
Macrophages endothéliaux
Intégrines β1 et β2Membres de la famille des Immunoglobulines Sélectines Récepteurs EGF-TM7
Tissus
Cellules de Langherans (peau) Cellules de Kupfer (foie) Ostéoclastes (os) Microglia (SNC)
19
mécanismes d’allergie, d’immunorégulation et de remodelage de la matrice
extracellulaire et des tissus en fin de réaction immunitaire (9, 10).
Il est à noter que cette classification a été réalisée à partir de données obtenues dans des
modèles murins ou sur des lignées macrophagiques et/ou sur des monocytes sanguins
différenciés in vitro en macrophages. Chez l’homme on dispose de très peu de données sur les
macrophages tissulaires.
I-1.1 b Les cellules dendritiques
Identifiées par le marqueur CD11c, les cellules dendritiques constituent une
population très hétérogène de CPAs. Leur capacité principale et conservée dans tous les types
de cellules dendritiques est leur fonction de présentation d’antigène à des cellules T naïves
alors que les macrophages et les lymphocytes B ne peuvent activer que des cellules T pré-
activées. Les fonctions des cellules dendritiques sont hétérogènes, dépendent de leur
maturation, des interactions avec les autres cellules et de l’environnement cytokinique dans
lequel elles se trouvent. Elles jouent un rôle dans la polarisation des lymphocytes en Th1 ou
Th2. Selon leur maturité et leur modulation elles peuvent activer ou supprimer les réponses T
auxiliaires ou encore induire l’anergie des lymphocytes T (7).
Les cellules dendritiques immatures ont de faibles capacités à présenter l’antigène
après maturation (activation par les ligands des TLRs ou par les cytokines) elles vont migrer
dans les organes lymphoïdes, leur CMH II va être redistribué à la membrane et les molécules
de co stimulation vont être activées (11). Leur fonction peut être régulée par les cellules NK
qui peuvent soit tuer les cellules dendritiques immatures soit au contraire entrainer leur
activation et leur maturation via la synthèse d’IFNγ et de TNF (12). Les cellules dendritiques
sont très présentes dans certains tissus notamment l’intestin, où elles jouent un rôle aussi bien
20
dans la tolérance à la microflore commensale que dans la génération d’une immunité
protective contre les pathogènes (13).
I-1.2 Les cellules cytotoxiques
I-1.2 a Les cellules Natural Killer (NK)
Initialement décrites comme une population de lymphocytes tueurs spécialisés dans la
lutte contre les tumeurs, les cellules NK constituent une population hétérogène de cellules
lymphoïdes. Elles représentent 10 à 15% des lymphocytes du sang périphérique et sont
décrites comme de grands lymphocytes granuleux contenant des granules lytiques: perforine
et granzymes. Les cellules NK sont sélectionnées au cours du développement pour leur
réponse au CMH I. Elles peuvent ainsi distinguer une cellule normale, exprimant le CMH I,
d’une cellule stressée qui ne l’exprime plus, afin de détruire cette dernière. C’est le procédé de
«missing self recognition», il est assuré par une famille de récepteurs inhibiteurs: les KIRs
(Killer Cell Ig-like receptor) (Ly 49 chez la souris) qui vont inhiber l’activation des cellules
NK si elles entrent en interaction avec le CMH I d’une cellule (Figure 3) (14).
Les cellules NK sont également capables de détecter des antigènes de non soi
présentés par le CMH I à la surface de cellules infectées. Lorsqu’elles sont activées, les
cellules NK vont détruire la cellule cible à l’aide du système perforine/granzymes. La
perforine va s’insérer dans la membrane de la cellule cible et y créer des pores. La formation
de ces pores n’est pas suffisante pour tuer la cible mais va permettre l’entrée des granzymes
dans la cellule. Les granzymes sont des protéases qui vont cliver de nombreux substrats dans
la cellule cible et conduire à la mort de celle-ci (15).
21
Protection
Pas d’activation
Sensibilité
Activation
CMH de classe I CMH de classe ILigands d’activation
Ligands d’activation
KIR inhibiteur KIR inhibiteurRécepteurs activateurs
Récepteurs activateurs
Tolérance au soi
Surveillance immune
Protection
Pas d’activation
Sensibilité
Activation
CMH de classe I CMH de classe ILigands d’activation
Ligands d’activation
KIR inhibiteur KIR inhibiteurRécepteurs activateurs
Récepteurs activateurs
Tolérance au soi
Surveillance immune
Figure 3: Le procédé de «missing self recognition» d’après Vivier et al.(14)
Le marqueur CD56 (ou N-CAM pour Neural Cell Adhesion Molecule) va discriminer
deux populations de cellules NK différentes. Tout d’abord, les cellules exprimant faiblement
le CD56 et positives pour le CD16, sont les cellules majoritaires dans le sang. Elles expriment
des marqueurs d’adressage pour les sites d’inflammation que sont les récepteurs aux
chimiokines CXCR1 et CX3CR1 ainsi que de la perforine pour médier rapidement la
cytotoxicité. L’autre population de cellules NK exprimant fortement CD56 mais pas CD16,
est très majoritaire dans les organes lymphoïdes secondaires pour lesquels elle va exprimer les
molécules d’adressage CCR7, CD62-L et CXCR3. Cette seconde population est peu
cytotoxique mais va produire de hauts niveaux de cytokines: IFNγ, TNFβ, IL-10 et IL-13
(16).
22
I-1.2 b Les cellules NKT
Les cellules NKT sont des lymphocytes T possédant des fonctions de l’immunité
adaptative et des caractéristiques des cellules NK dont l’expression du marqueur CD56 chez
l’homme et NK1.1 chez la souris C57Bl6 (17). Ces cellules peuvent réagir avec des antigènes
glycolipidiques présentés sur des molécules de surface non classiques: les CD1 qui présentent
de fortes ressemblances avec les molécules du CMH mais dont les gènes non polymorphes
n’appartiennent pas au CMH. Plusieurs types de cellules NKT ont maintenant été identifiés
selon leur reconnaissance au CD1 et leurs marqueurs de surface associés (18). Ces cellules
sont impliquées dans les réponses immunes contre les agents infectieux, les tumeurs mais
aussi dans de nombreuses maladies auto-immunes et inflammatoires (19). Ce sont de grandes
productrices de cytokines immunorégulatrices comme l’IFNγ, le TNFα et l’IL-4 (17). Elles
représentent moins de 1% des cellules immunitaires présentes dans le sang chez l’homme et
chez la souris (20, 21) mais sont présentes de façon préférentielle dans certains tissus,
représentant 20 à 30% des cellules T dans le foie et la moelle osseuse et 10 à 20% des
thymocytes matures chez la souris (22).
I-1.3 Les lymphocytes γδ γδ γδ γδ
Les lymphocytes T γδ sont des cellules issues de la lignée lymphoïde qui expriment à
leur surface un TCR (T cell receptor) constitué d'un hétérodimère γδ associé à deux molécules
de CD3. Au moment du développement, les chaines γδ du TCR sont réarrangées à la place des
chaînes αβ classiques (cf I-2.2). Contrairement aux lymphocytes T αβ, les lymphocytes T γδ
ont un biais dans la distribution de leur répertoire et chaque réarrangement préférentiel au
niveau des gènes codant le TCR, constitue une sous population aux caractéristiques
fonctionnelles particulières. Le sous-type le plus décrit chez l’homme est le lymphocyte T γδ
exprimant un TCR Vγ9Vδ2 (23). Chez l'homme et la souris, les lymphocytes T γδ sont des
23
populations minoritaires par rapport aux lymphocytes T αβ. Les lymphocytes T γδ sont des
cellules cytotoxiques et/ou régulatrices dont la réactivité est multiple et très étendue. Ils
interviennent aussi bien dans l'élimination de cellules infectées par un pathogène
intracellulaire que dans la défense antitumorale. Ce sont des cellules effectrices
essentiellement cytotoxiques (24) qui lysent leur cible notamment grâce au système
perforine/granzymes. Les lymphocytes T γδ humains sécrètent aussi de nombreuses cytokines
le plus souvent de type Th1 (25). Chez l'homme, les lymphocytes T γδ reconnaissent dans la
majorité des cas leur antigène directement, sans molécules du CMH (26, 27). Ils ont aussi la
particularité de reconnaître des antigènes solubles non peptidiques que l’on nomme
phosphoantigènes (28). Enfin, ils se retrouvent préférentiellement dans les tissus en contact
direct avec le milieu extérieur comme la peau, les poumon (29) et l’épithélium intestinal et où
ils représentent 20% des lymphocytes intraépithéliaux. (30).
I-2 L’immunité adaptative
C’est la seconde ligne de défense de l’organisme, elle se met en place plus lentement
(4 à 8 jours) et repose sur la détection spécifique d’antigènes étrangers conduisant à des
mécanismes d’élimination des microorganismes portant ces antigènes tout en restant tolérant
aux antigènes du soi.
La réponse adaptative présente deux volets: la réponse humorale, basée sur la
production d’immunoglobulines par les plasmocytes issus de la différenciation des
lymphocytes B et la réponse cellulaire basée sur l’action des lymphocytes T qui coordonnent
les différents axes de la réponse immunitaire et détruisent les cellules infectées. La mise en
jeu de ces différentes cellules nécessite une organisation spatiale et temporelle particulière qui
implique des organes spécialisés dans la maturation des lymphocytes (les organes lymphoïdes
24
primaires), des organes spécialisés dans la rencontre entre les lymphocytes et leurs antigènes
(les organes lymphoïdes secondaires), des cellules spécialisées dans la présentation des
antigènes aux lymphocytes (les CPAs) et enfin une recirculation efficace des lymphocytes
dans l’ensemble des tissus. Les lymphocytes au repos qu’ils soient T ou B présentent tous la
même apparence; le seul moyen de les différencier est de se baser sur l’expression de leurs
protéines membranaires. Contrairement à la réponse innée, la réponse adaptative est différente
lors d’une primo-infection ou d’une réinfection. Lors d’une primo-infection, la réponse
primaire va permettre à un individu de développer un état de mémoire immunologique, qui, si
le même pathogène (ou un pathogène très proche) est rencontré à nouveau, déclenchera une
réponse secondaire plus rapide et de plus forte intensité.
I-2.1 La réponse immunitaire à médiation humorale
I-2.1.a Les lymphocytes B
Les lymphocytes B naissent et se développent dans la moelle osseuse. Au cours de ce
développement, ils acquièrent l’expression de leur récepteur spécifique: le BCR (B-cell
receptor) et du complexe moléculaire CD21/CD19. Le BCR reconnaît l’antigène dans son état
natif, c’est à dire non dégradé par une CPA, sous forme soluble ou lié à une membrane.
Chaque BCR fonctionnel (ou immunoglobuline membranaire: IgM), protéine ne possédant
pas de queue cytoplasmique donc pas de fonction de signalisation, est associé à un
hétérodimère immunoglobuline α-β transmembranaire portant les motifs ITAMs
(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif) qui lanceront la cascade de transduction du
signal (31). Le complexe CD21/CD19 va assister la reconnaissance d’antigènes (32). Les
lymphocytes B sécrètent les immunoglobulines et exercent à ce titre une fonction importante
25
dans la réponse adaptative. Ils peuvent également internaliser un pathogène et le présenter sur
le CMH II. Cette fonction de CPA est indispensable aux lymphocytes B pour recevoir l'aide
des lymphocytes T (33).
I-2.1 b Déroulement de la réponse B
L’activation et la prolifération des lymphocytes B ont lieu dans les organes
lymphoïdes secondaires où des CPAs présentent l’antigène aux petits lymphocytes naïfs
circulants. Les cellules ainsi activées arrêtent alors leur migration, entrent en division et vont
former des clones qui vont se différencier en cellules effectrices, les plasmocytes, qui vont
migrer par chimiotactisme vers les sites d’infection grâce aux cytokines libérées dans les sites
inflammatoires. Après activation, l’expansion clonale dure 4 à 5 jours, ce qui explique le délai
nécessaire à une réponse adaptative pour être efficace. Les lymphocytes B assurent également
une fonction de mémoire: ils sont issus de lymphocytes B déjà sélectionnés qui ont subi
l’expansion clonale.
Dans de rares cas, l’interaction d’une cellule B naïve avec son antigène suffit à la
différenciation du lymphocyte B en plasmocyte (34). Cependant, le plus souvent, les
antigènes sont thymo-dépendants et l’activation des cellules B requiert la présence d’un
lymphocyte T. Dans ce cas, les lymphocytes B qui ont interagi avec l’antigène par
l’intermédiaire de leur BCR régulent positivement des molécules CD40 ainsi que de CMH de
classe II associées à des peptides antigéniques. Ces complexes peptide/CMH pourront être
reconnus par un lymphocyte T CD4+ et l’interaction entre les CD40L du lymphocyte T CD4
et les CD40 du lymphocyte B va constituer le signal de co-stimulation nécessaire aux cellules
B (33). Le lymphocyte B se différencie alors en effecteur capable de secréter des
immunoglobulines, de subir la commutation isotypique et la maturation d’affinité (Figure 4).
26
T CD4
Plasmocyte
Motif antigénique
CD40LCD40
Ly B
Cytokines
T CD4
Plasmocyte
Motif antigénique
CD40LCD40
Ly B
Cytokines
Figure 4 : La réponse B thymo-dépendante d’après Janeway et al. (1)
L’antigène qui se fixe au récepteur de la cellule B (LyB) la stimule tout en étant ingéré et apprêté en peptides qui vont activer les lymphocytes T auxiliaires armées. Les signaux provenant de l’antigène et de la cellule T CD4 vont déclenchent la prolifération et la différenciation de la cellule B en plasmocyte sécréteur d’anticorps spécifiques.
I-2.2 La réponse immune à médiation cellulaire
I-2.2 a Les lymphocytes T
Les lymphocytes T αβ sont les principaux lymphocytes T circulants. Ils désignent un
ensemble de cellules d’origine hématopoïétique dont la différenciation se déroule dans le
thymus. La reconnaissance spécifique des lymphocytes Tαβ se fait via son TCR (35),
récepteur à développement extracellulaire, constitué de deux chaînes: α et β. Les chaînes du
TCR sont associées à deux complexes multicaténaires, les CD3 (composés de deux chaînes
ε, deux ζ, une δ et une γ). Ces chaînes contiennent, dans leur région cytoplasmique, un ou
plusieurs motifs ITAMs (Figure 5). Ces régions (une sur chaque chaîne ε, δ et γ, et trois pour
chaque chaîne ζ) sont responsables de la transduction du signal dans les lymphocytes T en
induisant, après l’engagement du TCR, une cascade de phosphorylations aboutissant à
l’activation de la cellule.
Parmi les lymphocytes T, on distingue deux sous-populations importantes. Les
lymphocytes T auxiliaires exprimant le CD4 sont les cellules coordinatrices majeures du
système immunitaire. Les lymphocytes T cytotoxiques exprimant le CD8 participent
27
uniquement à la réponse cellulaire. Ces deux populations diffèrent de façon fondamentale
dans leurs modalités de reconnaissance de l’antigène et dans les fonctions régulatrices ou
effectrices qu’elles exercent.
Figure 5: Schéma d’une molécule de TCR d’après Schumacher et al.(36)
Dans les organes lymphoïdes secondaires, les lymphocytes T explorent la surface des
CPAs afin d’analyser les peptides antigéniques présentés. La reconnaissance des antigènes
protéiques par les lymphocytes T nécessite leur apprêtement par les CPAs, sur les molécules
du CMH. Lorsqu’ils reconnaissent le complexe peptide/CMH dont ils sont spécifiques,
l’interaction se stabilise et il se forme alors une zone étroite de contact et d’échange entre les
deux cellules (la synapse immunologique voir Figure 6) où le lymphocyte T réorganise sa
membrane plasmique et son cytosquelette sous-jacent. L’activation du lymphocyte T est un
CD3ε CD3γ CD3δ CD3ε
TCRα TCRβ
(CD3ζ)2
ITAM
28
terme qui regroupe les évènements de la signalisation menant à la survie de la cellule, sa
prolifération, le réarrangement de son cytosquelette, l’augmentation de son métabolisme et la
variation de son profil d’expression génique. Elle nécessite l’enregistrement de deux signaux
distincts et synergiques: l’engagement du TCR (qui va déclencher la phosphorylation des
motifs ITAMs présents sur ses chaînes CD3 et ζ et provoquer le recrutement d’un ensemble
d’enzymes) et l’engagement des molécules de co-stimulation. Il existe de nombreux co-
stimulateurs et co-inhibiteurs; c’est la sommation de ces signaux et le passage d’un seuil qui
déclenchent ou non le deuxième signal (37).
Figure 6: La synapse immunologique d’après Boes et al.(38)
I-2.2 b Induction de la réponse CD4+
L’interaction d’un lymphocyte T CD4+ naïf et d’une CPA activée conduit à
l’expression par le lymphocyte de la molécule CD28 capable d’interagir avec B7
(CD80/CD86) sur la CPA et qui potentialise le signal. La surexpression de la molécule
CD40L va induire la mise en place de l’interaction CD40L/CD40 qui va maintenir la CPA
dans un état activé. Le lymphocyte naïf se différencie alors en lymphocyte effecteur, Th1 ou
Th2 (39, 40), capable de produire des cytokines spécifiques et de réguler la réponse
29
immunitaire. La décision de la différenciation en Th1 ou Th2 est multifactorielle et dépend du
contexte cytokinique, des molécules de co-stimulation exprimées par la CPA et de la
concentration de peptide/CMH. Ainsi, la nature du stimulus reconnu par les CPAs, en
modulant la production de cytokines, influence fortement la polarisation T. De nombreuses
études indiquent que la polarisation Th1/Th2 est influencée par les types de microorganismes
que reconnaissent les CPAs via les PRRs qu’elles expriment ainsi que par l’environnement
des CPAs (41, 42). Une vision simple de la dichotomie Th1/Th2 indique que les lymphocytes
Th1, auxiliaires des lymphocytes T CD8+, sont impliqués dans la réponse cytotoxique et les
lymphocytes Th2, auxiliaires des lymphocytes B, initient des réponses humorales (43). La
production d’un type de cytokines par les lymphocytes d’un type cellulaire inhibe le
développement de l’autre population. Il a été montré plus récemment qu’il existait une autre
voie de différenciation pour les lymphocytes T auxiliaires naïfs, la voie des Th17 (44). Ces
différentes sous-populations sont «sous le contrôle» d’un autre type de cellules T CD4+, les
lymphocytes T régulateurs (Treg). Les principales caractéristiques de ces différents types de
cellules auxiliaires sont résumées ci-dessous (Figure7).
Th1
Th2
Th17
IL-12
IL-2
IL-2
IL-2
TGFβ, IL-6 IL-23
IL-4
TregTreg
TregTreg
IL-2 IFNγTNFα
IL-17
IL-4 IL-5 IL-10 IL-13
Immunité à médiation cellulaire pathogènes intracellulaires
Auto-immunité organe spécifique
Bactéries de l’intestin
Arthrite Inflammation chronique
Immunité à médiation humorale
Allergies, Atopie
IL-10 TGFβ,
IL-10 TGFβ,
CD4+
CD4+
CD4+
CD4+
NaïveNaïve
Naïve
Naïve
Cellules T régulatrice CD4+ CD25+ Foxp3+
Th1Th1
Th2Th2
Th17Th17
IL-12
IL-2
IL-2
IL-2
TGFβ, IL-6 IL-23
IL-4
TregTregTregTregTregTregTreg
TregTregTregTregTregTregTreg
IL-2 IFNγTNFα
IL-17
IL-4 IL-5 IL-10 IL-13
Immunité à médiation cellulaire pathogènes intracellulaires
Auto-immunité organe spécifique
Bactéries de l’intestin
Arthrite Inflammation chronique
Immunité à médiation humorale
Allergies, Atopie
IL-10 TGFβ,
IL-10 TGFβ,
CD4+
CD4+
CD4+
CD4+
NaïveNaïve
Naïve
Naïve
Cellules T régulatrice CD4+ CD25+ Foxp3+
Figure 7: La différenciation des lymphocytes auxiliaires d’après Cooke et al (45)
30
� Lymphocytes Th1: Ce sont les pro-inflammatoires principaux. Ils sont induits dans
un contexte IL-12, ΙFΝγ (46, 47), produisent des cytokines inflammatoires comme
l’IL-2, l’IFN γ ou le TNFα (48) et induisent le déclenchement des réponses
immunitaires cellulaires mettant en jeu en particulier les T cytotoxiques. Ils recrutent
les macrophages dans les sites d’infection et les activent afin de détruire les
pathogènes internalisés (39). Ils se développent préférentiellement durant les
infections par les bactéries intra cellulaires et les maladies chroniques inflammatoires
et sont impliqués dans l’auto-immunité organe-spécifique (49). L’IFNγ qu’ils sécrètent
possède de nombreuses propriétés effectrices. D’une part, il stimule la capacité
microbicide des macrophages et des monocytes, d’autre part, il a des propriétés anti-
virales importantes. En effet, il stimule l’expression du CMH et la présentation des
antigènes, optimisant la reconnaissance des cellules infectées par les lymphocytes T.
� Lymphocytes Th2: Ils sont induits en présence d’IL-4 et produisent essentiellement
les interleukines 4, 5, 6, 10 et 13. Les cellules Th2 participent à l’immunité humorale
en apportant une aide aux lymphocytes B pour qu’ils se développent en cellules
productrices d’anticorps. Ils vont également activer les éosinophiles (granulocytes
cytotoxiques de l’immunité innée) en vue d’une réponse indépendante des phagocytes
(50). Ces lymphocytes prédominent dans les réponses aux allergènes (49).
� Lymphocytes Th17: Découverts en 2005 par l’équipe de Langrich dans un modèle
murin d’EAE (Experimental autoimmune encephalomyelitis), cette nouvelle classe de
lymphocytes auxiliaires se caractérise par la production d’IL-17 (51). Ces cellules se
développent en présence de TGFβ (Tumor growth factor) et d'IL-6 et nécessitent la
présence d’IL-23 pour leur expansion (52, 53). Elles sont très pro-inflammatoires et
31
peuvent jouer un rôle dans les maladies auto-immunes (54). Chez l’homme, une étude
récente a caractérisé les Th17 isolés de l’intestin de patients atteints de la maladie de
Crohn: ces lymphocytes Th17 expriment le récepteur de l’IL-23, CCR6 et le facteur de
transcription RORγt (55). Ces cellules Th17 sont impliquées dans des maladies auto-
immunes telles que l’arthrite induite par le collagène et l’encéphalite autoimmune
expérimentale entre autres. L’IL-17 promeut l’inflammation en induisant la production
de nombreuses cytokines et chimiokines, en recrutant les neutrophiles, en augmentant
la production d’anticorps et en activant les cellules T (56). Chez l’homme,
contrairement à la souris, il a été décrit l’existence de lymphocytes Th17 produisant de
l’IFN γ, dénommés Th17/Th1 (55). Le rôle de cette population partageant des
caractéristiques communes aux cellules Th1 et aux cellules Th17 est encore inconnu.
� Lymphocytes T régulateurs (Treg): Ils expriment CD25 (qui est le récepteur de l’IL-
2) et CTLA-4 (Cytotoxic T lymphocyte associated protein 4) (57). Comme ces
marqueurs ne leur sont pas propres, le seul marqueur fiable des Treg est le facteur de
transcription Foxp3 dont l’invalidation va conduire à une absence totale du
développement de ce sous-type cellulaire (58, 59). Ils représentent 5 à 10% des
lymphocytes T CD4+ chez l’homme et la souris. Impliqués dans la tolérance, ils
peuvent être induits par des CPAs dites tolérogènes (60, 61), on parle alors de Treg
induits. Cependant, il existe également une population de Treg dits naturels qui se
développent directement à partir des précurseurs thymiques. Tous ces lymphocytes ne
sécrètent pas de cytokines pro-inflammatoires mais de l’IL-10 et du TGFβ (62). Ils
possèdent la capacité d’inhiber l’activation des cellules T soit par des mécanismes
directs de contact cellule/cellule, soit indirectement en modulant négativement
l’activation de la CPA (63).
32
I-2.2 c Induction de la réponse CD8+
L’induction de la réponse CD8 nécessite la présence d’un lymphocyte T CD4+ activé.
La CPA présente des antigènes simultanément par le CMH de classe I et de classe II aux
cellules T CD8+ et T CD4+ respectivement. La présence de la cellule CD4+ maintient un état
d’activation élevée de la CPA qui permet une co-stimulation efficace des cellules CD8+. A la
suite de cette interaction, le T CD8+ naïf se différencie en lymphocyte T Cytotoxique (CTL)
exprimant la perforine et les granzymes dans des vésicules intracellulaires et, capable de
produire des cytokines. Parfois, la CPA activée est suffisante à l’activation du lymphocyte T
CD8+, on parle alors de réponse CD8 indépendante des CD4. Cependant, il faut que la CPA
possède une très forte activité de co-stimulation intrinsèque pour induire la production d’IL-2
par les T CD8+ et provoquer la prolifération et la différenciation de ces derniers.
� La cytotoxicité des lymphocytes T: Les cellules T CD8+cytotoxiques ont la capacité
de lyser les cellules présentant l’antigène dont elles sont spécifiques. Cette cytotoxicité
nécessite un contact cellulaire entre le lymphocyte T et sa cible. Ce contact initié par
l’interaction du TCR avec le complexe peptide/CMH, est renforcé par l’interaction de
la molécule CD8 avec le TCR et également par des molécules d’adhésion cellulaire.
La lyse repose sur 3 grands mécanismes. Le plus rapide (quelques minutes) et souvent
le plus efficace met en jeu la perforine et les granzymes secrétés par le lymphocyte T
cytotoxique. Un second mécanisme met en jeu la protéine FasL membranaire ou
secrétée par le lymphocyte T, qui va se fixer sur un récepteur Fas situé sur la cible. La
liaison de FasL à Fas va déclencher la cascade des caspases, un programme
intracellulaire conduisant au suicide de la cible (15). Ce mode de lyse est plus lent
(plusieurs heures) et souvent moins efficace. Enfin, le TNFα secrété par le lymphocyte
T va pouvoir se fixer sur un récepteur au TNF conduisant aux mêmes types de
33
conséquences que l’interaction FasL/Fas (64). Dans tous les cas, la cellule cible meurt
par apoptose.
I-2.3 La mémoire immunitaire
Un des attributs cardinaux du système immunitaire adaptatif est le développement de
la mémoire immunitaire antigène spécifique. Les cellules mémoires sont celles qui survivent
après la phase de rétractation de la réponse immunitaire, c’est à dire après le moment où le
pathogène est éliminé et pendant lequel plus de 90% des cellules T effectrices meurent par
apoptose. Le compartiment mémoire T est constitué des T CD4+ et T CD8+ qui peuvent
acquérir rapidement des fonctions effectrices pour tuer les cellules infectées ou sécréter des
cytokines inflammatoires (65). Ce compartiment mémoire doit être au moins aussi diversifié
dans ses capacités fonctionnelles que le compartiment des effecteurs qui émergent après la
première exposition aux antigènes. Les lymphocytes T mémoires ont une grande capacité
migratoire (66). Ces cellules peuvent être classées en 2 types de cellules mémoires (Figure 8):
• les CM (central memory) expriment CCR7 et sont fortement positives au CD62-L.
Ces deux protéines ont des rôles précis. CCR7 (CC-chemokine receptor 7) va se lier à
CCL19 et CCL21 exprimés sur les cellules endothéliales dans les ganglions
lymphatiques. Il s’agit donc d’un marqueur d’adressage aux organes lymphoïdes.
CD62-L ou L-sélectine interagit avec PNAd (Peripheral-node adressin) sur les
veinules endothéliales qui favorisent l’attachement et le «rolling» des lymphocytes,
ce qui permet l’adressage aux tissus périphériques. Les cellules mémoires CM sont
retrouvées dans les organes lymphoïdes, la moelle osseuse, le sang et la rate mais
sont absentes des tissus non lymphoïdes (67). Ces cellules semblent être destinées à
34
activer les CPAs. Quand elles sont réactivées, elles peuvent repartir dans la
circulation, perdre le CCR7 et devenir des effecteurs mémoires (66, 68).
• les EM (effector memory) n’expriment pas CCR7 et sont faiblement positives au
CD62-L.
Présentes dans le sang, la rate et les tissus non lymphoïdes, ces cellules peuvent
répondre rapidement à l’antigène en produisant des molécules effectrices (68).
Contrairement aux cellules naïves, elles expriment de manière constitutive, de forts
taux d’ARNm de gènes codant pour l’IFNγ, ou la perforine et les granzymes. La
synthèse de ces protéines sera régulée de manière «on-off» par le contact avec
l’antigène et les protéines pourront être produites de façon beaucoup plus rapide que
par les cellules naïves (65).
La réponse mémoire est une réponse accélérée et plus agressive provoquant une
expansion locale de cellules T antigène-spécifiques à un niveau maximum et une expression
renouvelée de la plupart des fonctions associées à la réponse immune primaire initiale (66).
Les cellules mémoires sont maintenues pendant plusieurs années par un processus de
prolifération homéostatique qui maintient le nombre de cellules mémoires relativement
constant. Les cytokines qui régulent la prolifération des lymphocytes T CD8 sont l’IL-2, l’IL-
15 et l’IL-7 mais leurs rôles relatifs ne sont pas complètement définis (69). La survie des
lymphocytes T CD4+ quant à elle ne dépend pas des IL-2, IL-15 ou IL-4 mais seulement de
l’IL-7 (68). Cet ensemble de cellules mémoires CD4+ va diminuer lentement avec le temps.
35
Cellule T naïve Cellule effectrice « précoce »
Cellule effectrice « tardive »
Pas d’antigène Pas d’antigène
Cellule mémoire centrale (tissus lymphoïdes)
Cellule effectrice mémoire (tissus non lymphoïdes)
Pas d’antigène
+ antigène + antigène
CCR7-CCR7+
CD62Lfaible-CD62Lfort
Cellule T naïve Cellule effectrice « précoce »
Cellule effectrice « tardive »
Pas d’antigène Pas d’antigène
Cellule mémoire centrale (tissus lymphoïdes)
Cellule effectrice mémoire (tissus non lymphoïdes)
Pas d’antigène
+ antigène + antigène
CCR7-CCR7+
CD62Lfaible-CD62Lfort
Figure 8: Voies de différenciation des cellules mémoires d’après Kaech et al. (70)
36
Marqueur Fonction protéique Cellules qui expriment ce marqueur
CD3 Co-récepteur du TCR Lymphocytes T, cellules NKT
CD4 Reconnaissance de l’antigène présenté
sur le CMH de classe II
Lymphocytes T CD4
CD8 Reconnaissance de l’antigène présenté
sur le CMH de classe I
Lymphocytes T CD8
CD14 Récepteur au LPS Monocytes, macrophages granulocytes
(plus faiblement), neutrophiles
CD16 Récepteur à la fraction constante des
anticorps
NK, macrophages, mastocytes
CD19 Co-récepteur du BCR Lymphocytes B, cellules dendritiques
CD45 Protéine tyrosine phosphatase, régule
la transduction de signaux notamment
ceux du TCR et du BCR
Cellules hématopoïétiques sauf
érythrocytes, thymocytes
CD45RA Isoforme de CD45 contenant l’exon A Lymphocytes T naïfs, lymphocytes B,
monocytes
CD45RO Isoforme de CD45 ne contenant pas
les exons A, B et C
Lymphocytes B, lymphocytes T
mémoires, monocytes, macrophages,
cellules dendritiques, granulocytes
CD56 NCAM neural cell adhesion molecule
(NCAM)
NK, NKT, lymphocytes larges et
granulaires
CD62L L-sélectine (permet l’adressage des
lymphocytes aux tissus périphériques)
Lymphocytes T naïfs
CD127 Récepteur à l’IL-7 Lymphocytes T effecteurs et
mémoires
CD206 Récepteur au mannose Macrophages (type M2), cellules
dendritiques, cellules endothéliales
Tableau 2: Récapitulatif des principaux marqueurs de différenciation utilisés
37
II Les relations entre le tissu adipeux et le système immunitaire
Il existe une relation intime entre le système immunitaire et le système métabolique
qui présentent en termes d’évolution beaucoup de similitudes. Le développement parallèle des
tissus adipeux et lymphoïdes dans les fœtus et les nouveaux nés chez les mammifères a été
mis en évidence il y a plus de 50 ans (71).
L’unité fonctionnelle qui contrôle les clés du métabolisme et des fonctions immunes
dérive d’une structure commune ancestrale. Une de ces structures est le corps gras de la
drosophile qui incorpore les homologues mammifères du tissu hépatique, hématopoïétique et
immun. De manière intéressante, ce site est également reconnu comme représentant
l’équivalent du tissu adipeux des mammifères en partageant des voies de développement et de
fonctionnement similaires. Au cours de l’évolution, les organes ont été individualisés dans les
organismes plus évolués, le tissu adipeux, le foie et le système immunitaire se sont spécialisés
dans différentes fonctions, unités ou organes (72). Il n’est donc pas surprenant de retrouver
des cellules immunitaires dans le tissu adipeux, ou encore du tissu adipeux englobant les
ganglions lymphoïdes.
II-1 Les principales fonctions du tissu adipeux blanc
Le tissu adipeux blanc constitue le tissu adipeux principal chez l’homme adulte. Outre
son rôle d’isolant thermique et mécanique, c’est la principale réserve énergétique de
l’organisme. Chez l’homme moyen de 70kg, il va représenter 15kg soit 21% de sa masse
corporelle, ce pourcentage est augmenté chez la femme et au cours de l’obésité. Chez
l’homme, le tissu adipeux est localisé principalement en sous-cutané entre le derme et
l’aponévrose musculaire. Mais il existe également du tissu adipeux interne comprenant: le
38
tissu adipeux viscéral, (thoracique et abdominopelvien) et le non viscéral (paravertébral et
intramusculaire) (73, 74).
Le rôle du tissu adipeux blanc est de réguler la balance énergétique en stockant l’énergie
en surplus sous forme de triglycérides (TGs) qui restent mobilisables pour les autres tissus en
fonction des besoins métaboliques. Globalement la gestion de l’énergie se fait grâce à deux
voies métaboliques principales:
II-1.1 Le tissu adipeux blanc : Organe de stockage énergétique
II-1.1 a La lipogenèse
Le stockage des lipides dans l’adipocyte se fait par 2 voies (Figure 9). La première voie
correspond à la capture directe des TGs associées aux chylomicrons et aux lipoprotéines de
très faible densité (ou VLDL «very low density lipoprotein») circulants, provenant de
l’alimentation ou de la lipogenèse hépatique. La LPL (lipoprotéine lipase), produite et
sécrétée par les adipocytes, ancrée à la surface endothéliale va hydrolyser les lipoprotéines
(75). Les acides gras non estérifiés issus de ce clivage sont ensuite recaptés par l’adipocyte à
l’aide d’un transporteur (CD36/FAT «fatty acid translocase» (76), FATP «fatty acid transport
protein» (77), ou FABP «fatty acid binding protein») (78) puis transformés en acyl-CoA par
une acyl-coA synthétase. Ils seront ré-estérifiés en TGs en présence de glycérol.
La deuxième voie correspond à la lipogenèse de novo. Le terme de lipogenèse proprement
dit désigne la néosynthèse d’acides gras à partir du glucose. Après l’entrée du glucose dans
l’adipocyte, grâce à des transporteurs spécifiques (GLUT-1 et 4), le glucose est dégradé en
pyruvate par le processus de la glycolyse. A partir du pyruvate, l’acétyl-CoA carboxylase
(ACC) et la synthase des acides gras (FAS, « fatty acid synthase ») interviennent de façon
successive pour catalyser la formation des acides gras à longue chaîne saturée. L’action des
différentes désaturases permet de synthétiser des acides gras plus ou moins saturés. Comme
39
précédemment, ces acides gras sont ensuite ré-estérifiés pour donner les TGs. Il est nécessaire
de préciser que chez les rongeurs, la lipogenèse est réalisée dans le foie et le TA. En revanche,
chez l’homme, la lipogenèse est majoritairement hépatique et elle n’est qu’accessoire dans le
TA (79). L’insuline, les cathécholamines l’hormone de croissance et la leptine contrôlent de
manière extrêmement précise le métabolisme de l’adipocyte. L’insuline est l’hormone anti-
lipolytique par excellence. Elle exerce un rôle positif sur le stockage par plusieurs
mécanismes :
Elle stimule la synthèse de LPL et son exportation vers la face interne des capillaires
sanguins favorisant ainsi la captation adipocytaire des acides gras (80).
Elle contrôle positivement la translocation des transporteurs GLUT-4 des
compartiments intracellulaires vers la membrane plasmique, ce qui permet l’entrée de glucose
dans l’adipocyte et son catabolisme dans la glycolyse afin de fournir les substrats nécessaires
à la lipogenèse et à l’estérification (81).
Elle agit positivement sur la lipogenèse en contrôlant directement l’activité de
certaines enzymes comme par exemple l’ACC via des mécanismes de phophorylation-
déphosphorylation. L’insuline agit également au niveau de l’expression des gènes qui codent
pour les enzymes, par des mécanismes de régulation transcriptionelle. Le facteur de
transcription SREBP1c (sterol responsive binding element protein 1c) a été identifié comme
médiateur d’une grande partie des effets transcriptionnels de l’insuline dans l’adipocyte (82).
Les catécholamines s’opposent aux effets de l’insuline sur la LPL, à l’activation des
enzymes de la lipogenèse et à l’augmentation de l’activité transcriptionnelle de SREBP-1c.
De façon intéressante, les effets inhibiteurs de la leptine et de l’hormone de croissance sur
le stockage des TGs passent par l’inhibition des effets stimulateurs de l’insuline (82).
40
Figure 9: Lipogenèse et synthèse des triglycérides dans l’adipocyte
GLUT: glucose transporter; DHAP: dihydroxyacétone phosphate; TG: triglycérides; ACC:
acétyl Coenzyme A (CoA) carboxylase; FAS: fatty acid synthase; AGNE: acide gras non
estérifié; LPL: lipoprotéine lipase; VLDL: very low density lipoprotein (83).
Glucose
41
II-1.1 b La lipolyse
La lipolyse assure la dégradation des TGs contenus dans les vacuoles lipidiques de
l’adipocyte, en glycérol et acides gras non estérifiés (AGNE). Plusieurs lipases interviennent
de façon séquentielle dans cette hydrolyse des réserves lipidiques. La lipase hormonosensible
(LHS) clive les TGs en diglycérides puis les diglycérides en monoglycérides, et constitue
l’enzyme limitante du processus lipolytique. La lipase des monoglycérides (LMG) dégrade
ensuite les monoglycérides en glycérol et acides gras non estérifiés. Cependant, la mise en
évidence d’une activité lipolytique diminuée mais toujours présente chez des souris invalidées
pour le gène de la LHS a laissé supposer l’existence d’au moins une autre lipase capable
d’hydrolyser les TGs dans les adipocytes (84). Trois laboratoires différents ont identifié une
nouvelle lipase dénommée « adipocyte triacyglycerol lipase » (ATGL) (85-87). L’ATGL
présente une spécificité de substrat pour les TGs dix fois supérieure à son affinité pour les
DGs ainsi qu’à l’affinité de la LHS pour les TGs (88). Elle joue un rôle limitant dans la
première étape de la lipolyse basale tandis que la LHS est limitante pour l’hydrolyse des DGs
(88).
Les mécanismes susceptibles de réguler l’activité de la LHS sont bien connus et sont
présentés dans la Figure 10 (89). L’activité de cette lipase dépend spécifiquement de sa
phosphorylation réversible par une kinase dépendante de l’AMPc (PKA) (90) ou du GMPc
(PKG) (91). La phosphorylation de la LHS active l’enzyme, en démasquant son site
catalytique. Par ailleurs, cette phosphorylation permet une redistribution de la lipase du
cytoplasme vers la vacuole lipidique. Les périlipines, protéines abondamment exprimées à la
surface des gouttelettes lipidiques, interviennent dans la localisation et la stabilisation de la
LHS à la surface des vacuoles. La phosphorylation des périlipines par la PKA et la PKG
réduit leur ancrage à la gouttelette lipidique et favorise ainsi l’accès de la LHS à ses substrats
lipidiques (92).
42
La régulation de l’ATGL est moins connue, elle est présente à la surface des vésicules
lipidiques à des quantités comparables à l’état basal comme activé (87), et son activité est
fortement augmentée par ABHD5/CGI58 (alpha, beta hydrolase domain containing protein 5/
comparative gene identification 58 (93). Il semble que lorsque les adipocytes ne sont pas
stimulés, CGI58 soit lié à la périlipine A et incapable d’activer l’ATGL. Lorsque les
adipocytes sont stimulés, les périlipines sont phosphorylées, entraînant la dissociation de
CGI58 qui va interagir avec l’ATGL et activer l’hydrolyse des TGs (94, 95).
Une fois dans la circulation, les acides gras libres (AGLs) vont être véhiculés par
l’albumine et vont servir de carburant pour les tissus métaboliquement actifs via leur
oxydation et la synthèse d’ATP. La βoxydation qui génère de l’ATP et des acétyl coenzyme
A à partir des acides gras est le procédé le plus important qu’utilisent les cellules pour obtenir
de l’énergie à partir des AGLs. Le glycérol généré par l’hydrolyse des AGLs est converti par
la glycérol kinase du foie et va ainsi fournir la fraction de glycérol nécessaire pour la synthèse
des TGs (96).
Figure 10: Contrôle de la lipolyse dans l’adipocyte humain d’après Lafontan et al.(97)
43
II-1.2 Le tissu adipeux blanc : organe hétérogène
Le tissu adipeux n’est pas composé uniquement d’adipocytes mais également d’une
fraction stroma-vasculaire (FSV) non adipocytaire. Il est aisé de séparer les adipocytes de la
FSV par digestion à la collagénase (98) ou à la libérase. Après centrifugation, les adipocytes
flottent à la surface et le culot contient les cellules de la FSV. Par une approche de cytométrie
en flux et le choix de marqueurs membranaires spécifiques, notre équipe a mis en évidence
différentes populations au sein de la FSV (99) (100) (101) du tissu adipeux blanc chez
l’homme; des cellules endothéliales microvasculaires (CD34+/CD31+); des cellules
progénitrices (CD34+/CD31-) et des macrophages (CD34-/CD31+/CD14+). Les travaux
menés sur la comparaison des capacités de production des adipokines, notamment les
chimiokines et les cytokines, entre les adipocytes et la FSV ont mis en évidence que ces
sécrétions étaient majoritairement dues aux cellules non adipocytaires (102).
II-1.2 a L’adipocyte
L’adipocyte mature est la cellule spécifique du tissu adipeux, grosse cellule sphérique
pouvant atteindre 100 à 200µm. Son cytoplasme est largement occupé par une vacuole
lipidique qui repousse le noyau en périphérie contre la membrane plasmique (96). L’adipocyte
présente deux fonctions principales, le stockage des lipides selon le processus de lipogenèse
ainsi que celui de la synthèse des TGs, et la mobilisation des lipides via le processus de
lipolyse. Ces activités métaboliques sont étroitement régulées par des signaux neuro-
humoraux. L’adipocyte mature est incapable de proliférer, l’augmentation du tissu adipeux
observée lors de l’obésité est due à une augmentation du volume (hypertrophie) et du nombre
de ces adipocytes (hyperplasie) par différenciation des préadipocytes présents en grande
quantité dans la FSV (103).
44
II-1.2 b Les cellules progénitrices
La présence de cellules progénitrices dans le tissu adipeux humain est reconnue depuis les
travaux de Bjorntop sur l’évolution de la cellularité de la masse adipeuse avec le
développement de l’obésité. Les travaux réalisés dans notre laboratoire ont montré que la FSV
du tissu adipeux humain contient des cellules caractérisées par l’expression du marqueur
CD34 et l’absence du marqueur CD31 qui, en conditions adipogéniques, vont exprimer des
transcrits spécifiques des adipocytes. De plus, ces cellules différenciées présentent des
activités fonctionnelles, métaboliques et sécrétoires des adipocytes matures (100). D’autre
part, ces cellules peuvent donner naissance à des cellules qui expriment des marqueurs
phénotypiques des cellules endothéliales lorsqu’elles sont cultivées dans des milieux adaptés
(101). De nombreux laboratoires ont montré par la suite que les cellules de la FSV humaine
pouvaient également acquérir in vitro des marqueurs biochimiques caractéristiques de
lignages cellulaires variés: ostoégénique (104), chondrogénique (105), myogénique (106)
entre autres. De plus, l’analyse des capacités de différenciation des cellules dérivant d’une
cellule unique après de multiples passages, a montré que plusieurs clones cellulaires
pouvaient se différencier en plusieurs lignages. Ces résultats suggèrent la présence de cellules
souches adultes de type multipotentes au sein du tissu adipeux humain (107 , 108 , 109).
II-1.2 c L’adipogénèse
La différenciation adipocytaire proprement dite ou adipogenèse représente le passage du
préadipocyte à l’adipocyte mature au sein du tissu adipeux. Après une phase de croissance
exponentielle, le précurseur déterminé vers la lignée adipocytaire ou adipoblaste marque un
arrêt de croissance à confluence. Ces cellules deviennent alors des préadipocytes et
s’engagent dans l’adipogenèse proprement dite. Tout au long du processus d’adipogenèse,
vont se succéder différents événements morphologiques, biochimiques et moléculaires, que
45
l’on regroupe en deux catégories; on distingue les événements précoces et tardifs. Il est à
noter que les mécanismes de différenciation adipocytaire ont été déterminés principalement à
partir d’approches réalisées sur des modèles murins et sur des lignées préadipocytaires
murines issues de la lignée de fibroblastes 3T3.
Les événements précoces concernent en particulier le remodelage de la matrice
extracellulaire (MEC) et du cytosquelette. Au cours de la différenciation adipocytaire, la
composition de la MEC est fortement modifiée. D’une structure riche en fibronectine, sa
composition va évoluer vers une structure de type lame basale, composée essentiellement de
laminine, de collagène IV et d’entactine (110). Des changements dans la forme de la cellule
sont possibles par une réorganisation du réseau intracellulaire d’actine (111). L’ensemble de
ces remodelages matriciels, du cytosquelette et de la forme de la cellule permet alors aux
préadipocytes de subir une étape d’expansion clonale liée à une série de réplications de
l’ADN ou mitoses dites post-confluentes. A la suite de ces événements précoces, les
préadipocytes sont dits « engagés dans la différenciation adipocytaire ». Enfin, une étape de
maturation terminale permet d’obtenir les adipocytes matures. Les changements
morphologiques majeurs qui accompagnent la différenciation adipocytaire, tels que
l’arrondissement des cellules et l’accumulation progressive de vacuoles lipidiques dans le
cytoplasme, sont la conséquence de variations d’expression d’un très grand nombre de gènes.
Cette reprogrammation génétique profonde est sous le contrôle de facteurs de transcription
pro- ou anti-adipogéniques dont les principaux sont les facteurs PPARs (Peroxisome
proliferator-activated receptors), les C/EBPs (CCAAT/enhancer binding proteins) et le facteur
ADD1/SREBP-1c (Adipocyte determination and differentiation factor 1/sterol regulatory
element binding protein-1c) (112 , 113).
46
II-1.2 d Les cellules endothéliales et le réseau vasculaire
Les cellules endothéliales capillaires sanguines régulent les échanges de métabolites,
d’hormones et de cellules entre les compartiments adipeux et sanguins. Le développement du
tissu adipeux est dépendant de sa vascularisation (114). L’importance du réseau vasculaire
sanguin dans la croissance du tissu adipeux est soulignée par des expériences réalisées in vivo
chez la souris. Ces travaux montrent que l’inhibition du remodelage des vaisseaux sanguins
par l’utilisation de composés anti-angiogéniques (115, 116) ou proapoptotiques dirigés contre
la vasculature du tissu adipeux (117) conduit à une prévention du développement du tissu
adipeux et à une réversion de l’obésité. Chez l’homme, peu de données sont disponibles quant
à l’organisation des systèmes vasculaires sanguins du tissu adipeux humain, et leurs rôles
potentiels dans le développement du dépôt adipeux. Notre équipe a récemment montré que le
tissu sous-cutané humain possède un réseau capillaire très développé dont l’extension suit le
développement de la masse grasse lors de l’installation de l’obésité. Des analyses
d’expression génique au sein du laboratoire, ont permis de montrer que les cellules
endothéliales fraîchement isolées du tissu adipeux à l’aide des marqueurs de surface
CD34/CD31, sont dans un état d’activation angiogénique et légèrement inflammatoire
(données non publiées Villaret 2009).
II-2 La réponse immunitaire altère l’état métabolique
La réponse immunitaire, par ses fonctions de défense et de réparation des tissus, a pour
conséquence de réorienter les substrats énergétiques et azotés de la périphérie (muscles et
tissus adipeux) vers le foie et les tissus agressés. Ils induisent des modifications métaboliques,
endocriniennes et le syndrome inflammatoire. Les médiateurs de l’inflammation augmentent
la réponse catabolique
47
II-2.1 Conséquences de la réponse de phase aiguë
L’infection et l’inflammation induisent la réponse de phase aiguë (APR) conduisant à
de multiples altérations protéiques ainsi que du métabolisme des lipides et des lipoprotéines.
Les protéines de la phase aiguë: protéine C réactive (CRP), protéine amyloide sérique (SAA)
(118) et fibrinogène sont augmentées tandis qu’une diminution des protéines comme
l’albumine, la tranferrine ou l’alpha-fœto protéine est observée (119). Ces changements sont
dus à l’altération des taux de synthèse protéique hépatique (118) mais aussi extra hépatiques.
L’augmentation de ces protéines de phase aiguë va permettre la neutralisation des
microorganismes, la participation à la réponse immune ainsi qu’à la régénération des tissus et
le «remplacement» des protéines utilisées lors du processus inflammatoire. Les variations de
la synthèse des protéines de phase aiguë sont médiées par les cytokines (TNFα, TNFβ,
interleukines, IFN α, β et γ) produites en réponse à une variété de stimuli dans de multiples
types cellulaires (macrophages, monocytes, lymphocytes T et cellules endothéliales).
II 2 1 a Modifications du métabolisme lipidique
L’inflammation s’accompagne d’altérations du métabolisme des lipides et des
lipoprotéines induites par les cytokines.
Ainsi, une altération précoce et consistante du métabolisme se traduit par
l’augmentation des taux de triglycérides sériques (120), en réponse à une augmentation de la
production hépatique de TGs. Cette augmentation de production résulte d’une plus grande
disponibilité des d’acides gras non estérifiés (AGNE) relargués par la lipolyse stimulée dans
les dépôts adipeux sous l’action du TNFα, d’IL-1 et de l’IFNα, β et γ. Elle résulte également
d’une augmentation de la synthèse hépatique d’acides gras dans le foie en réponse au TNFα,
et β à l’IL-1 et 6 et à l’IFNα (121 , 122).
48
Les infections produisent également des altérations dans la composition et la fonction
des lipoprotéines, incluant des changements dans les concentrations en sphingolipides et une
augmentation de l’oxydation des lipides. On observe également une diminution des HDL, et
une variation des protéines associées au métabolisme des HDL (121, 122).
II 2 1 b Modifications de la sensibilité à l’insuline
Sous l’influence des cytokines pro-inflammatoires telles qu’ IL-1β, IL-6 et TNFα
apparaissent également une néoglucogenèse augmentée, une production d’hormones et une
diminution de la sensibilité à l’insuline. Paradoxalement, l’insensibilité à l’insuline qui peut
contribuer au processus des pathologies peut exercer un effet bénéfique au cours de la réponse
aux infections (123). La néoglucogenèse augmente sous l’influence des cytokines pro-
inflammatoires, ainsi que l’utilisation de glucose par les cellules immunes.
Le glucose et la glutamine sont les principales sources d’énergie pour les cellules du système
immun. La création d’un état d’insensibilité à l’insuline pourra réduire l’utilisation de glucose
par les tissus insulino-dépendants au profit des tissus pour lesquels le processus est insulino-
indépendant comme les cellules immunes (124-126).
II 2 2 Réponse de phase aiguë et anorexie
Enfin, l’anorexie qui apparaît au cours de l’infection est une part de la réponse de
phase aiguë. En effet, la suppression de la faim permet d’éliminer la dépense énergétique de
recherche de nourriture. De plus, l’anorexie réduit la disponibilité des micro-nutriments
provenant de la nourriture essentiels à la croissance des micro-organismes (127). Plusieurs
cytokines pro inflammatoires dont IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNFα, IFNα et IFNγ inhibent la
prise de nourriture après administration parentérale, ce qui suggère que l’augmentation de leur
49
production au cours de la réponse immune contribue à l’anorexie survenant au cours de
l’infection (128, 129).
II-3 Impact du métabolisme sur le système immunitaire.
II-3.1 L'état nutritionnel altère la réponse immunitaire
En dehors de tout état pathologique, la nutrition peut influencer le système
immunitaire. Les effets du glucose, des protéines et des vitamines sur le système immunitaire
ont été largement décrits mais au cours des quinze dernières années le rôle crucial des lipides
alimentaires a commencé à émerger. De nombreuses pathologies sont aujourd’hui connues
pour être dues aux effets immunomodulateurs des lipides, celles-ci incluent le diabète,
l’athérosclérose et le syndrome d’insulino-résistance. Ainsi, l’exposition augmentée du
système immun aux acides gras pourrait potentiellement altérer les réponses immunes innées
et acquises (130).
II-3.1 a Effets des acides gras
La composition en acides gras (quantité et nature) de la ration lipidique alimentaire
modifie la réponse immunitaire. Les phospholipides des cellules immunes contiennent 15 à
20% d’acides gras (131, 132). En modifiant la composition en acides gras de la nourriture, on
entraîne une modification de la composition en acides gras des cellules immunes: avec une
augmentation de l’apparition d’acides gras avec lesquels la nourriture a été enrichie (133,
134). Les acides gras ont plusieurs rôles dans la fonction des cellules immunes. Ils agissent
comme substrats énergétiques et composants des phospholipides des membranes en
contribuant à leurs propriétés physiques et fonctionnelles. Ils agissent aussi comme
50
modificateurs des structures protéiques en influençant la structure et la fonction de ces
protéines. Enfin, ce sont des régulateurs de l’expression génique par des effets sur l’activité
des récepteurs nucléaires et ils interfèrent avec les voies de transduction du signal
intracellulaire ou la transcription des facteurs d’activation.
Altérations des membranes Rafts, ordre, circulation
Altérations des acides gras de l’alimentation
Altérations de la composition des phospholipides des cellules immunes
Voies de transduction du signal/
Expression génique
Médiateurs lipidiques
Altérations des fonctions des cellules immuns
Altérations de la réponse immune
Altérations des membranes Rafts, ordre, circulation
Altérations des membranes Rafts, ordre, circulation
Altérations des acides gras de l’alimentationAltérations des acides gras de l’alimentation
Altérations de la composition des phospholipides des cellules immunes
Altérations de la composition des phospholipides des cellules immunes
Voies de transduction du signal/
Expression génique
Voies de transduction du signal/
Expression génique
Médiateurs lipidiques Médiateurs lipidiques
Altérations des fonctions des cellules immuns
Altérations des fonctions des cellules immuns
Altérations de la réponse immune
Altérations de la réponse immune
Figure11: Représentation des mécanismes par lesquels une modification des acides
gras alimentaires peut influencer la réponse immune d’apreès Calder et al.(135)
� Acides gras poly-insaturés
Les acides gras poly-insaturés l’acide dihomo-γ-linolenique (DGLA; 20:3n-6), l’acide
arachidonique (AA; 20:4n-6), l’acide docosahexexaénoique (DHA; 22:6n-3) et l’acide
51
eicosapentanoique (EPA 20:5n-3) sont des précurseurs de la synthèse des éicosanoides (135).
Ils sont relargués des membranes par l’action de la phospholipase A2 activée en réponse à des
stimuli cellulaires. Comme les membranes de la plupart des cellules immunes contiennent des
grandes quantités d’AA (n-6), c’est en général le principal précurseur de la synthèse des
éicosanoides. Ils incluent la prostaglandine (PG), les thromboxanes, les leucotriènes (LT), les
lipoxines. Les effets principaux de la prostaglandine et des leucotriènes sont résumés dans la
figure 12.
Figure 12 : Rôles des principaux éicosanoides dans la régulation de l’inflammation et
de l’immunité d’après Calder et al (135)
PGE = prostaglandine E
Acide arachidonique
Leucotriènes
-Vasoconstriction
-Perméabilité vasculaire
-Chimiotactisme des
leucocytes
-Activité des neutrophiles
-Production de TNFα, IL-1
et IL-6
-Production de cytokines de
type Th1
-Prolifération des
lymphocytes
-Activité des cellules NK
+ -
PGE2
-Fièvre
-Douleur
-Vasodilatation
-Perméabilité vasculaire
-Production de TNFα,
IL-1 et IL-6
-Production de cytokines
de type Th1
-Production d’IgE par les
cellules B
-Prolifération des
lymphocytes
-Activité des cellules NK
-Expression du CMH II
+ -
52
Ainsi les dérivés de l’AA principalement pro-inflammatoires, peuvent également
exercer des effets anti-inflammatoires et être impliqués dans la résolution de l’inflammation.
L’effet physiologique final sera gouverné par la concentration locale de ces médiateurs, leur
délai de production et la sensibilité des cellules cibles à leurs effets.
Les acides polyinsaturés n-3 (EPA, DHA) quant à eux, vont s’incorporer dans les
membranes de manière temps et dose dépendante au détriment de l’AA et des acides gras n-6.
Leurs propriétés anti-inflammatoires sont dues à l’inhibition de la production des éicsoanoides
dérivés de l’AA et à la production de familles alternatives d’éicosanoides de type anti-
inflammatoire comme les résolvines et PGE3 (136). D’autre part, EPA et DHA peuvent
inhiber la production de cytokines pro-inflammatoires (TNFα, IL-1β, IL-6 et IL-8) par les
monocytes, les macrophages et les cellules endothéliales. Ces inhibitions semblent passer par
des altérations de l’activité des facteurs de transcription NF-ΚB et PPARγ. Enfin, l’activation
de PPARγ par les acides gras n-3 a été décrite entre autre pour avoir un rôle dans la
prévention du développement de l’insulino-résistance (137).
� Acides gras saturés
Les acides gras saturés sont impliqués dans l’inflammation et dans le développement
de l’insulinorésistance dans le tissu adipeux et le muscle. Ils activent les TLR dans les
adipocytes et les macrophages murins provoquant ainsi l’activation et de NF-κB et de JNK et
la production de cytokines. Les acides gras saturés augmentent également l’inflammation et
l’apoptose dans le tissu adipeux blanc via le stress du réticulum endoplasmique, la génération
de céramides et d’espèces réactives de l’oxygène. De plus, ils inhibent la voie de signalisation
de l’insuline en diminuant l’activation de IRS1, PIK3 et Akt et sont donc des facteurs
potentiels de développement de l’ insulinorésistance (138).
53
II 3 1 b Malnutrition et infections
La malnutrition est une cause commune de déficit immunitaire secondaire et de
susceptibilité aux infections chez l’humain. Les malnutritions sévères affectent le
développement du thymus conduisant à son involution qui se répercute en périphérie par une
plus grande proportion de lymphocytes immatures circulants associée à une diminution du
nombre de lymphocytes T matures. Ces modifications sont sous contrôle neuroendocrine. En
effet, il a été montré que l’atrophie du thymus était associée à une augmentation des taux de
circulants de glucocorticoïdes ainsi qu’à une diminution de ceux de leptine. L’importance de
celle-ci a été confirmée car son injection limite l’atrophie du thymus et diminue les taux de
glucocorticoïdes en parallèle (139). L’immunodéficience représente un facteur clé dans la
susceptibilité aux infections. Chez les patients atteints de malnutrition sévère les fonctions de
l’immunité innée sont également touchées. Les composés du complément, notamment la
fraction C3, sont moins disponibles affectant le processus de phagocytose (140). Chez la
souris, on observe une diminution de la capacité des macrophages à phagocyter et à produire
des espèces réactives de l’oxygène ainsi qu’une altération de la capacité des cellules
dendritiques à présenter des antigènes aux cellules T. Le nombre de cellules au sein de la
population lymphocytaire CD4 est globalement réduit (141). D’autre part, on observe aussi
des altérations des capacités de migration et d’extravasion des lymphocytes T qui vont
présenter un phénotype intermédiaire (CD45RO faible CD45RA faible) plutôt qu’un
phénotype de cellules mémoires (142). De plus, ces cellules sont orientées vers un phénotype
de type Th2 avec une moindre sécrétion d’IFNγ/IL-2 et une augmentation d’IL-4/IL-10 (143).
54
II-3.2 Les pathologies associées au tissu adipeux
II-3.2.a L’obésité
L’obésité correspond à une surcharge pondérale résultant du développement excessif
du tissu adipeux. Elle est définie par l’indice de masse corporelle IMC (voir tableau 3). Cet
indice n’est pas correct pour les enfants, les sportifs et n’est pas indicatif de la quantité de
masse grasse mais cette classification reste néanmoins la plus utilisée car la plus simple à
déterminer. D’autres paramètres peuvent également être pris en compte pour définir
l’augmentation de la masse grasse viscérale :
• Le rapport taille /hanche: seront considérés obèses les hommes ayant un rapport >
1,0 et les femmes > 0,85
• Le périmètre abdominal mesuré seul à mi-distance de la cage thoracique et de la
crête illiaque (voir tableau 4)
Classification IMC (kg/m 2)
Sous-poids
Poids normal
< 18,5
18,5-24,99
Surpoids 25,00-29,99
Obésité ≥ 30,00
Obésité de classe I 30,00-34,99
Obésité de classe II 35,00-39,99
Obésité de classe III ≥ 40,00
Tableau 3: Classification des IMC et définition de l’obésité selon l’OMS (144)
55
Périmètre abdominal (cm) Risques de complications métaboliques
Hommes Femmes
≥ 94 ≥ 80 Augmenté
Sensiblement augmenté ≥ 102 ≥ 88
Tableau 4: Périmètre abdominal par sexe et risque de complications métaboliques associées
chez les sujets de race blanche (selon l’OMS) (144)
L’incidence de l’obésité a dramatiquement augmenté durant ces dernières décennies
de sorte que l’obésité et les désordres métaboliques qui lui sont associés constituent une
menace sérieuse pour la population mondiale. L’OMS estime que plus d’un milliard d’adultes
sont en surpoids et parmi eux 300 millions sont cliniquement obèses (Rapport OMS 2002).
L’obésité prédispose les individus à une augmentation des risques de développer de
nombreuses maladies comme l’athérosclérose, le diabète de type 2, la stéatose hépatique non
alcoolique, certains cancers et des désordres médiés par le système immunitaire comme
l’asthme (145).
II-3.2 b L’inflammation chronique du tissu adipeux liée à l’obésité
L’obésité est associée à une réponse inflammatoire chronique définie comme une
réponse inflammatoire qui n’est pas classique mais plutôt un état inflammatoire dit de bas
bruit qui serait à l’origine des pathologies associées à l’obésité (72). Le premier lien établi
entre l’inflammation et l’obésité est la découverte de la surproduction de TNFα par le tissu
adipeux des modèles de rongeurs obèses (146). Comme c’est le cas chez les rongeurs, le
TNFα est également produit en importante quantité dans le tissu adipeux humain des
56
personnes obèses (147, 148). On peut noter que certaines études n’ont pas retrouvé
d’augmentation de la production de TNFα chez l’homme (149). Le TNFα est décrit pour
altérer la fonction de transduction du signal du récepteur à l’insuline (150). Il inhibe
également la LPL et stimule la lipolyse dans les adipocytes. D’autre part, l’administration de
TNFα à des préadipocytes murins différenciés ou à des modèles animaux diminue l’effet de
l’insuline alors que les modèles de souris obèses déficientes pour le TNFα ou ses récepteurs
ont une sensibilité à l’insuline améliorée par rapport à leurs contrôles (151). Enfin, le tissu
adipeux des sujets obèses produit une quantité élevée de cytokines comme le TNFα, l’IL-6,
l’IL-1β , le MCP-1 et il est le siège d’une accumulation de cellules immunes (voir chapitre II
4). Dans le tissu adipeux viscéral décrit pour être le tissu adipeux le plus impliqué dans les
complications métaboliques, l’expression de certaines cytokines pro-inflammatoires IL-6, IL-
1β, IL-8 et MCP-1 ainsi que des gènes relatifs à l’inflammation est augmentée (152).
Tissu adipeux blanc
Métabolisme
Inflammation
Différenciation adipocytaire
IL-1/IL-1Ra, IL-6, TNFα, MCP-1
Régulation de la prise alimentaire Homéostasie énegétique
Contrôle du poids
Leptine , IL-6, IL-1/IL-1Ra
Sensibilité à l’insuline
TNFα, IL-6, IL-1/IL-1Ra, Adiponectine, Leptine , Résistine
Contrôle de l’inflammationIL-1/IL-1Ra, TNFα,IL-6, IL-8,
MCP-1, RANTES, IP-10
Inflammation vasculaire?
IL-8, MCP-1, RANTES, IP-10, Résistine
Protection cardiovasculaire
Adiponectine, IL-1Ra, IL-10
Tissu adipeux blanc
Métabolisme
Inflammation
Différenciation adipocytaire
IL-1/IL-1Ra, IL-6, TNFα, MCP-1
Régulation de la prise alimentaire Homéostasie énegétique
Contrôle du poids
Leptine , IL-6, IL-1/IL-1Ra
Sensibilité à l’insuline
TNFα, IL-6, IL-1/IL-1Ra, Adiponectine, Leptine , Résistine
Contrôle de l’inflammationIL-1/IL-1Ra, TNFα,IL-6, IL-8,
MCP-1, RANTES, IP-10
Inflammation vasculaire?
IL-8, MCP-1, RANTES, IP-10, Résistine
Protection cardiovasculaire
Adiponectine, IL-1Ra, IL-10
Figure 13: Les sécrétions du tissu adipeux (d’après Juge-Aubry (153))
57
L’état inflammatoire chez les sujets obèses se caractérise par une plus forte
concentration plasmatique des protéines de la phase aiguë de l’inflammation telles que le
fibrinogène, la CRP (154), la SAA, le PAI-1, l’angiotensinogène, le facteur tissulaire, l’alpha-
1 glycoprotéine acide, l’antagoniste du récepteur de l’IL1 (IL1Ra). On notera également une
élévation des taux plasmatiques de cytokines pro-inflammatoires MCP-1, IL-6, IL-8, leptine,
TNFα et des formes solubles des récepteurs aux cytokines comme les TNF-R ou l’IL1R ainsi
que des molécules d’adhésion E-sélectine, ICAM1 et VCAM1 (155, 156). Les données
épidémiologiques supportent l’idée que l’obésité est associée à des altérations de la fonction
immune (157) (158) (159). Dans la circulation des sujets obèses, a été rapportée une
augmentation du nombre de leucocytes, de monocytes et des lymphocytes T et B mais sans
variation de cellules NK (157). Les CD4+ sont décrits pour être augmentés et les CD8+
augmentent seulement chez les obèses morbides (159). Cependant, ces données sont
controversées et décrites pour être plus liées au syndrome métabolique qu’à l’obésité (158).
De plus, d’autres études décrivent une lymphopénie associée à l’obésité chez l’homme (160).
Cette lymphopénie s’observe également chez l’animal et se caractérise par une diminution de
la population de cellules B et une suppression de l’activité NK (161, 162).
II-3.2 c L’insulinorésistance
L’insulinorésistance est définie comme une diminution de la réponse des tissus
périphériques à l’action de l’insuline. Les individus insulinorésistants sont prédisposés à
développer un diabète de type 2. L’augmentation de l’insulinorésistance a été reconnue
comme un élément à part entière du syndrome métabolique qui inclut l’intolérance au
glucose, la résistance à l’insuline, l’obésité, l’hypertension, un taux faible de HDL, une
hypertriglycéridémie et une accélération de l’athérosclérose. Il a été montré qu’il y avait une
58
relation de cause à effet entre l’inflammation, l’insulinorésistance et le diabète de type 2
(163). L’inflammation systémique chronique est proposée comme ayant un rôle important
dans la genèse de l’insulinorésistance associée à l’obésité. Les bio-marqueurs de
l’inflammation comme le TNFα, la CRP ou l’IL-6 sont présents à des taux croissants chez les
patients obèses et insulino-résistants et ces bio-marqueurs prédisent le développement du
diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires (153).
II-3.2 d La leptine
La leptine est à l’interface du système métabolique et immun. Principalement produite
par le tissu adipeux, elle régule la fonction neuroendocrine, l’homéostasie énergétique,
l’hématopoïèse et l’angiogenèse mais cette adipocytokine est aussi un médiateur important
des processus inflammatoires (164).
En effet, les souris déficientes en leptine (ob/ob) ou en leptine récepteur (db/db)
présentent un panel d’anomalies immunitaires (165). Les souris ob/ob ont un thymus involué,
des défauts dans la réponse des cellules T (166, 167) ainsi qu’une capacité réduite des cellules
dendritiques à présenter l’antigène aux cellules T (168, 169). De plus, chez l’homme la
déficience congénitale en leptine entraînant l’obésité, est associée à une lymphopénie et une
diminution de la réponse T (170). Elle agit sur le système immunitaire aussi bien inné
qu’adaptatif (Figure 14). Au niveau de l’immunité innée, elle est susceptible de réguler
l’activation des neutrophiles en augmentant le chimiotactisme et l’activation des cellules
présentatrices d’antigène par l’expression accrue des molécules du CMH, et des molécules
d’adhésion de la phagocytose. D’autre part, elle va moduler la production macrophagique de
cytokines pro-inflammatoires comme TNFα, IL-1 et IL-6 et jouer un rôle sur la cytotoxicité
en augmentant la production de perforine par les cellules NK (171, 172).
59
Au niveau de l’immunité adaptative, la leptine régule la prolifération des cellules T
notamment naïves et inhibe leur apoptose. Elle peut aussi influencer la réponse Th1/Th2 en
stimulant la production de cytokines Th1 (IFNγ, IL-2) et en inhibant la production de
cytokines Th2 (IL-4) (173). Enfin, les lymphocytes T et B expriment constitutivement de
faibles taux du récepteur à la leptine. Cette expression est régulée de manière positive (en
terme de pourcentage de cellules positives et de densité du récepteur) en réponse à l’activation
des cellules B, T et des macrophages (165). De plus, les souris db/db montrent une capacité
proliférative des CD4+ réduite comparées aux hétérozygotes, ce qui suggère que le récepteur
à la leptine est important pour la prolifération et l’expansion des CD4+ lors de la stimulation
médiée par le TCR. Cependant, malgré les données in vitro, les résultats sur les modèles
animaux et l’évidence d’un effet pro-inflammatoire, la manière dont la leptine influence les
réactions inflammatoires chez l’homme reste encore à élucider (145).
Effets anti-apoptotiques sur les cellules T et les précurseurs hématopoïétiques
Stimulation cellules Th1 Switch IgG2-a Aide aux cellules CD8+
Activation macrophages
Homéostasie thymique nombre deethymocytescellules CD4+ CD8+
cellules CD4+ CD8-
apoptose
Activation des neutrophiles Chimiotactisme
Induction des cytokines par les monocytes/macrophagesréponse de la phase aigue anorexie inflammatoire fièvre
Activation des CPAsmolécule du CMH molécules d’adhésion Phagocytose
Cytotoxicité
Perforine
Leptine
Immunité innée Immunité adaptative
Th1
Th2
IL-2
Macrophage
Leucotriène B4
Cyclo-oxygenase 2
NK
TNF IL-6IL-1
H2O2
O2-
TNF IL-2
ProliférationCellules T naïves
leptineTNF
IFNγ
Stimulation cellules Th2 Switch IgG1
IL-10 IL-4
Effets anti-apoptotiques sur les cellules T et les précurseurs hématopoïétiques
Stimulation cellules Th1 Switch IgG2-a Aide aux cellules CD8+
Activation macrophages
Homéostasie thymique nombre deethymocytescellules CD4+ CD8+
cellules CD4+ CD8-
apoptose
Activation des neutrophiles Chimiotactisme
Induction des cytokines par les monocytes/macrophagesréponse de la phase aigue anorexie inflammatoire fièvre
Activation des CPAsmolécule du CMH molécules d’adhésion Phagocytose
Cytotoxicité
Perforine
Leptine
Immunité innée Immunité adaptative
Th1Th1
Th2Th2
IL-2
Macrophage
Leucotriène B4
Cyclo-oxygenase 2
NK
TNF IL-6IL-1
H2O2
O2-
TNF IL-2
ProliférationCellules T naïves
leptineTNF
IFNγ
Stimulation cellules Th2 Switch IgG1
IL-10 IL-4
Figure 14: Effets de la leptine sur le système immunitaire d’après La Cava et al. (164)
60
II-4 Interactions directes entre le tissu adipeux et le système immunitaire
II-4 1 Le rôle nutritionnel du tissu adipeux pour le système immunitaire
Tous les immunologistes expérimentaux le savent: les ganglions lymphatiques sont
intégrés dans du tissu adipeux. Les tissus adipeux péri ganglionnaires sont une caractéristique
anatomique conservée uniquement chez les mammifères. (174)
Les adipocytes qui sont anatomiquement associés aux ganglions lymphatiques
présentent des propriétés particulières qui leur permettent d’interagir localement avec les
cellules lymphoïdes. Généralement plus petits que la moyenne, ils accumulent et stockent de
façon sélective certains acides gras notamment des polyinsaturés (175), précurseurs essentiels
des eicosanoides et des docosanoides et les relarguent en réponse à des signaux lipolytiques
locaux. D’autre part, ces tissus adipeux répondent beaucoup mieux que les non péri
ganglionnaires aux stimulations lipolytiques des cellules immunes (176). Les acides gras et le
glycérol ainsi produits vont être une ressource nutritive pour les ganglions et les cellules
immunes qu’ils contiennent: lymphocytes et cellules dendritiques. Le contrôle paracrine de la
lipolyse par les cellules lymphoïdes réduit la compétition pour l’utilisation de l’énergie avec
les autres tissus (177). Cet approvisionnement énergétique local des tissus lymphoïdes
affranchit partiellement la fonction immune de changements dans la quantité et la
composition de la nourriture (Figure 15) (178).
Les vaisseaux des ganglions lymphatiques sont organisés en réseau très fin de sorte
que la surface de contact avec le tissu adipeux soit importante pour récupérer les produits
lipolytiques relargués par les adipocytes adjacents dans l’espace extracellulaire. Dans le tissu
adipeux viscéral et dans la moelle osseuse, les tissus lymphoïdes sont également en contact
direct avec les adipocytes. Les expérimentations animales démontrent que l’inflammation
chronique peut entraîner une altération de la composition en acides gras et une hypertrophie
61
des tissus adjacents particulièrement l’omentum et le mésentérique (179). Mais ces
interactions paracrines restent difficiles à déterminer/observer chez l’humain, étant donné
qu’elles n’ont pas de répercutions sanguines. Cependant, elles jouent certainement un rôle
dans certains changements de distribution des tissus adipeux associés à l’inflammation
chronique (174).
Vaisseau lymphatique afférent
Adipokines
Adipocytes
Capsule
Sinus
Cortex
Ganglion lymphatique
Cellules souches
Cellules dendritiquesTissu adipeux péri ganglionnaire
Vaisseau lymphatique afférent
Adipokines
Adipocytes
Capsule
Sinus
Cortex
Ganglion lymphatique
Cellules souches
Cellules dendritiquesTissu adipeux péri ganglionnaire
Figure15: Anatomie du tissu adipeux entourant les ganglions lymphatiques d’après Knight et
al. (178)
II-4.2 Les cellules immunitaires au sein du tissu adipeux
� Les macrophages du tissu adipeux
Il est décrit dans la littérature que des macrophages sont présents dans le tissu adipeux,
depuis 2003, où il a été montré une augmentation de l’expression des gènes relatifs aux
macrophages dans le tissu adipeux de divers modèles animaux obèses (163, 180) tandis que
62
des expériences d’immunohistochimie révélaient des corrélations positives entre les
marqueurs F4/80 et CD68 et le poids et la taille des adipocytes chez la souris et chez l’homme
(180). Ces résultats ont été confirmés chez l’homme (99, 181, 182) en microscopie et par des
expériences de cytométrie en flux révélant qu’environ 10% de la FSV du tissu adipeux de
l’homme était constituée de macrophages CD14+ (99) et qu’ils étaient positivement corrélés
avec l’IMC. Les expériences d’immunohistochimie ont montré que les macrophages étaient
localisés en couronne autour des adipocytes (180).
Les récentes études menées chez la souris sur la caractérisation des macrophages du tissu
adipeux ont montré qu’il existait des macrophages M1 recrutés ainsi que des M2 résidents
impliqués respectivement dans la promotion et l’atténuation de l’insulinorésistance. Dans
plusieurs modèles de souris obèses, il a été montré que les macrophages recrutés M1 étaient
dans un état plus pro-inflammatoire que la population résidente M2 observée chez les souris
contrôles. De plus, ces macrophages recrutés expriment les marqueurs de surface F4/80,
CD11b et CD11c et sont organisés en agrégats entourant les adipocytes nécrotiques tandis que
les résidents sont plus interstitiels (183, 184).
Les résultats de notre équipe montrent que les macrophages du tissu adipeux humain
expriment des marqueurs M1 et M2, et que seuls les macrophages M2 résidents
(CD14+CD206+CD16-) s’accumulent avec l’obésité. De plus, avec l’augmentation de l’IMC
les macrophages diminuent leur expression de marqueurs M1 au profit de marqueurs M2
(185). Ces résultats sont en accord avec les travaux de Zeyda et al. qui montrent que les
macrophages du tissu adipeux (CD14+CD206+) sont dans un état anti-inflammatoire tout en
étant capables de produire des médiateurs pro-inflammatoires (186). Dans le tissu adipeux
viscéral, cette accumulation de macrophages est augmentée et positivement corrélée avec les
paramètres cliniques de comorbidité de l’obésité (152, 182). Ces travaux montrent que la
polarisation des macrophages dans le tissu adipeux humain n’est pas clairement orientée dans
63
une voie. Ainsi les phénotypes observés diffèrent entre les modèles animaux et l’homme. Il
est important de rester critique quant à l’obésité génétique chez l’animal ou celle induite par
un régime gras. Il se peut qu’elle ne soit pas toujours un modèle représentatif de l’obésité et
de l’état inflammatoire chronique associé qui se sont installés au cours des ans chez les
patients obèses.
� Les lymphocytes du tissu adipeux
Bien que les macrophages aient fait l’objet de nombreuses études, leurs principaux
partenaires cellulaires au cours d’une réaction immunitaire c’est à dire les lymphocytes n’ont
été que partiellement étudiés chez l’animal et très peu chez l’homme. Les récentes données
sur le sujet sont décrites dans la revue suivante.
64
Revue: Les lymphocytes du tissu adipeux (soumis)
1
Les lymphocytes T du tissu adipeux
The adipose tissue T lymphocytes
Carine Duffaut, Virginie Bourlier et Anne Bouloumié
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), U858, Toulouse, France
Université Toulouse III Paul-Sabatier, Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil, Equipe
n°1 AVENIR, IFR31, Toulouse, France
2
Résumé
L’obésité et plus spécifiquement l’accumulation de tissu adipeux dans les localisations
viscérale et sous-cutanée abdominale est un facteur de risque majeur pour le développement
de pathologies cardiovasculaires dont l’hypertension et l’athérosclérose, et de désordres
métaboliques tels que le diabète de type 2. Au cours de ces dernières années, le concept
d’inflammation métabolique a émergé comme un processus clé impliqué dans l’ensemble de
ces conditions pathologiques. Le tissu adipeux apparaît comme un acteur clé en tant que
source et site de l’inflammation. Les macrophages ont été clairement impliqué dans la genèse
de l’état inflammatoire du tissu adipeux mais récemment certaines données mettent en
lumière une autre population cellulaire immune : les lymphocytes T. Cette revue décrit les
observations relatives aux relations entre adipocytes et lymphocytes T, présente les données
montrant une accumulation des lymphocytes dans le tissu adipeux avec l’obésité et propose
des mécanismes impliqués dans cette accumulation. Le rôle potentiel des lymphocytes du
tissu adipeux dans la genèse des pathologies associées à l’obésité est décrit.
3
Abstract
Obesity and more specifically the accumulation of adipose tissue in the visceral and
abdominal subcutaneous locations is a well defined risk factor for cardiovascular pathologies
such as hypertension and atherosclerosis and metabolic disorders such as type 2 diabetes. In
the last few years, the concept of metabolic triggered inflammation has emerged as a major
process responsible for the clustering of these conditions. The adipose tissue appears as a key
player as site and source of inflammation. The macrophages have clearly been involved in the
genesis of the inflammatory state of the fat mass. However recently, evidences have shed new
light on another immune cell population, i.e. the adipose tissue T lymphocytes. The present
review describes the observations that are relative to the inter-relation between adipocytes and
T lymphocytes, to the accumulation of T lymphocytes within the adipose tissue with obesity
and the mechanisms underlying such a process as well as the potential pathogenic role of the
adipose tissue T lymphocytes.
4
Introduction
L’obésité et plus spécifiquement l’accumulation de tissu adipeux dans les localisations
viscérale et sous-cutanée abdominale est un facteur de risque majeur pour le développement
de pathologies cardiovasculaires dont l’hypertension et l’athérosclérose, et de désordres
métaboliques tels que le diabète de type 2. Au cours de ces dernières années, le concept
d’inflammation métabolique a émergé comme un processus clé impliqué dans l’ensemble de
ces conditions pathologiques [1]. Alors que divers organes métaboliquement actifs tels que le
foie, le muscle et plus récemment l’intestin et la flore intestinale jouent certainement un rôle
dans la genèse et l’entretien de cet état inflammatoire chronique de bas niveau associé à
l’obésité, le tissu adipeux apparaît comme un acteur clé en tant que source et site de
l’inflammation [2]. L’accumulation de macrophages dans le tissu adipeux a été bien décrite
dans les conditions d’obésité dans des modèles murins et chez l’homme. De plus,
l’acquisition d’un phénotype inflammatoire par les macrophages du tissu adipeux a été
directement impliquée dans le développement de la résistance à l’insuline systémique chez la
souris. Finalement, le lien causal entre l’inflammation et la résistance à l’insuline a été mis en
évidence par l’utilisation de modèles murins invalidés spécifiquement dans les cellules
progénitrices myéloides pour des gènes impliqués dans la transduction du signal
intracellulaire de la réponse inflammatoire [1]. Récemment, certains travaux suggèrent que les
cellules de l’immunité adaptative et plus particulièrement les lymphocytes T pourraient
également jouer un rôle dans l’établissement de l’état inflammatoire associé à l’obésité et
dans la genèse des pathologies qui lui sont associées [3].
Les lymphocytes et le tissu adipeux
Les relations entre tissu adipeux et lymphocytes sont décrites depuis les travaux de C Pond
concernant les interactions entre ganglions lymphatiques et tissu adipeux [4]. En effet d’un
point de vue anatomique; les ganglions lymphatiques sont intégrés dans le tissu adipeux,
5
caractéristique conservée uniquement chez les mammifères. Le tissu adipeux péri-
ganglionaire est considéré comme une réserve énergétique dédiée au fonctionnement du
ganglion lymphatique. Les adipocytes péri-ganglionnaires ont été montrés comme accumulant
de façon sélective certains acides gras notamment poly insaturés, précurseurs essentiels des
eicosanoïdes et des docosanoïdes, second messagers majeurs des cellules immunes. De plus,
ces adipocytes sont sensibles aux stimulations lipolytiques du tumor necrosis factor alpha
(TNFα) et d’interleukine 6 (IL-6) sécrétés par les cellules immunes. Ainsi les échanges
locaux entre adipocytes et lymphocytes permettraient d’affranchir partiellement la fonction
immune des changements quantitatif et qualitatif nutritionnels [5]. En retour, la leptine,
adipokine majeure produite spécifiquement par les adipocytes de façon dépendante de leur
taille, exerce des effets puissants sur les lymphocytes [6]. Les souris déficientes en leptine
(ob/ob) ou en récepteur à la leptine (db/db) présentent de nombreuses anormalités au niveau
de leurs systèmes lymphocytaires [7] dont une involution du thymus et une hypo activation
des lymphocytes T. Chez l’homme, la déficience congénitale en leptine est associée avec une
lymphopénie et une diminution de la réponse T [8]. La leptine serait ainsi impliquée dans le
contrôle de la prolifération, de la différenciation et de l’activation des lymphocytes T de type
Th1 [6].
Accumulation de lymphocytes T dans le tissu adipeux avec l’obésité
Les lymphocytes constituent une famille étendue de types cellulaires distincts impliqués dans
l’immunité adaptative et innée. La présence de lymphocytes résidents dans le stroma de tissu
adipeux de rongeurs a été montrée par des analyses en cytométrie en flux sur la fraction
stroma-vasculaire de dépôts adipeux sous-cutanés et épidydimaires [9]. De façon intéressante,
les dépôts adipeux présentent une répartition différente des populations de lymphocytes selon
leur localisation, avec une prédominance des lymphocytes du système inné (lymphocytes
γδ, les cellules natural killer (NK) et NKT) dans les dépôts épididymaires alors que les dépôts
6
sous-cutanés montrent une majorité de lymphocytes du système adaptatif (lymphocytes B et
T) [9]. Le développement de l’obésité chez la souris soumise à un régime enrichi en lipides ou
dans des modèles d’obésité génétique s’accompagne d’une accumulation de lymphocytes T
(CD3+) présents dans le tissu adipeux qui s’organisent en clusters autour de certains
adipocytes [10,11, 12]. Toutefois ces données restent controversées [9, 13]. De plus, la nature
même des lymphocytes T qui s’accumulent avec l’obésité reste à être clairement définie
puisque certaines données suggèrent un effet spécifique aux lymphocytes T auxiliaires CD4+
[11] alors que d’autres travaux décrivent l’accumulation conjointe de lymphocytes T
auxiliaires et cytotoxiques CD8+ [12, 14]. Les différentes méthodes d’identification des types
cellulaires par immunohistochimie, cytométrie en flux et/ou expression génique de marqueurs
spécifiques lymphocytaires associées à une expression des résultats normalisée par surface
adipocytaire, par gramme de tissu et/ou par dépôt entier peuvent être à l’origine des résultats
divergents. Le fond génétique des souris mais également le type de régime hyperlipidique et
la période de mise sous régime peut également influencer l’accumulation de lymphocytes
dans le tissu adipeux. Nos résultats montrent que sous un fond génétique C57Bl6 avec un
régime composé à 40% de lipides; les lymphocytes T et B, identifiés par cytométrie en flux et
dont le nombre est exprimé par dépôt épidydimaire entier, présentent un trafic cellulaire dans
le tissu adipeux qui est fonction de la période de mise sous régime [15]. Enfin des différences
sexuelles et territoriales ont été mises en évidence avec une infiltration lymphocytaire plus
marquée chez les mâles que chez les femelles [10] et plus importante dans les tissus péri-
gonadiques que sous-cutanés [16]. Concernant les études chez l’homme, une accumulation de
lymphocytes CD3+ a été mise en évidence par des analyses d’expression géniques de
marqueurs de lymphocytes T [11] et des analyses d’immunohistochimie [17] [18] dans les
tissus adipeux sous-cutanés et viscéraux de patients obèses par rapport à des patients normo-
pondérés.
7
Les chimiokines et leurs récepteurs représentent un élément critique dans le trafic cellulaire
immun. Le tissu adipeux produit de nombreuses chimiokines dont la production est modulée
par le degré d’obésité. RANTES (Regulated upon activation normal T cell express sequence)
et SDF1α (Stromal derived factor 1) ont été suggéré comme pouvant jouer un rôle dans
l’adressage des lymphocytes au tissu adipeux. En effet, les expressions de RANTES et de son
récepteur CCR5 sont augmentées avec l’obésité dans des modèles murins et chez l’homme
[10]. La chimiokine SDF-1α est exprimée dans les cellules de la fraction stroma-vasculaire
chez l’homme [11, 19] et via son interaction avec son récepteur CXCR4 pourrait favoriser
l’accumulation de lymphocytes dans le tissu adipeux [11]. Récemment, la production par des
préadipocytes murins différenciés de deux chimiokines spécifiques des lymphocytes, IP-10 et
MIG, ont été décrites en réponse à des stimulations par des facteurs lymphocytaires [12].
Ainsi, les lymphocytes du tissu adipeux pourraient participer à une boucle d’auto-recrutement
via leurs effets stimulateurs sur les adipocytes. Enfin, une molécule d’adhésion exprimée à la
surface endothéliale VAP1/SSAO semble jouer un rôle déterminant dans l’infiltration des
lymphocytes dans le tissu adipeux puisque la souris invalidée pour ce gène présente une
accumulation réduite des lymphocytes dans le tissu adipeux avec l’obésité [20].
Phénotype et rôles des lymphocytes T du tissu adipeux
Les lymphocytes T effecteurs sont considérés comme des éléments clés dans le contrôle de
l’évolution de la cascade inflammatoire selon le type de cytokines prédominantes qu’ils
produisent. De façon classique, les lymphocytes T de type Th1 vont orienter la réponse vers
une immunité à médiation cellulaire stimulant les cellules présentatrices d’antigènes dont les
macrophages alors que les lymphocytes T de type Th2 dirigent une réponse à médiation
humorale en stimulant la production d’anticorps par les lymphocytes B. La démonstration de
la production plus importante d’interféron gamma (IFNγ), cytokine marqueur d’un état Th1,
par les lymphocytes T activés de tissu adipeux de souris obèses par rapport aux souris
8
contrôles [12] suggère que les lymphocytes T du tissu adipeux obèse présentent un phénotype
de type Th1. Chez l’homme, aucune étude directe n’a été réalisée, cependant une corrélation
positive entre l’expression de l’ IFNγ et l’index d’adiposité (tour de taille) a été montrée [11].
Le rôle des lymphocytes du tissu adipeux reste à être clairement établi, notamment lorsque
l’on considère que leur nombre dans le tissu adipeux est très inférieur à celui des
macrophages. Cependant certaines observations ont suggéré leur implication en tant que
orchestrateur de la réponse inflammatoire associée à l’obésité. En effet, des études cinétiques
réalisées chez la souris soumises à un régime hyperlipidique montrent que l’accumulation des
lymphocytes précède celle des macrophages [11,15]. De plus, les souris invalidées pour
l’IFN γ présentent une inflammation réduite du tissu adipeux et une meilleure sensibilité à
l’insuline. L’IFNγ stimule sur les lignées préadipocytaire murine l’expression de diverses
chimiokines dont MCP-1 [11,12]. En plus de ces effets médiés par des facteurs solubles, les
lymphocytes interagissent avec les adipocytes via des contacts cellules/cellules impliquant le
couple CD40 ligand/CD40 exprimé par les adipocytes humains [17]. Ainsi, les lymphocytes
pourraient, par la stimulation de la production de chimiokines adipocytaires, être à l’origine
de l’infiltration macrophagique du tissu adipeux, macrophages eux-mêmes impliqués dans le
développement de la résistance à l’insuline. Les travaux récents réalisés sur des souris
présentant une hyperlipidémie due à un fond ApoE-/- associée à une suractivation du type
Th1 des lymphocytes dus à la perte du contrôle exercé par le TGFβ (CD4dnTbR) apportent
quelques éléments en faveur d’une telle hypothèse. En effet, les souris maigres CD4dnTbR
ApoE-/- présentent une inflammation marquée dans le tissu adipeux similaires à celle
d’animaux obèses [21]. Il est toutefois à noter que la sensibilité à l’insuline n’est pas modifiée
dans ce modèle. Il serait donc intéressant d’étudier ce modèle placé en régime hyperlipidique
afin de définir réellement l’impact des lymphocytes activés Th1 sur la résistance à l’insuline
induite pas l’obésité. Afin de définir le rôle potentiel des lymphocytes dans l’accumulation
macrophagique du tissu adipeux, les souris invalidées pour le gène RAG2 (conduisant à une
9
absence de maturité des lymphocytes T et B) ont été placées en régime hyperlipidique. Les
souris immunodéficientes développent une obésité et une résistance à l’insuline similaire à
celles des souris sauvages [15]. Par contre, une augmentation drastique des cellules NK,
autres cellules productrices d’interféron gamma, et des macrophages est observée dans le tissu
adipeux des souris RAG2-/- [15]. Donc les lymphocytes T ne sont pas les seules cellules
causales de l’inflammation associées avec l’obésité. Leur absence pourrait être compensée par
une accumulation des cellules NK. De plus, ces résultats suggèrent que les lymphocytes
pourraient être des éléments protecteurs contre le développement d’une réaction
inflammatoire innée excessive dans le tissu adipeux lors de l’obésité induite par un régime
hyperlipidique.
Enfin une étude a suggéré que le tissu adipeux péri-vasculaire est un réservoir pour les
cellules T effectrices activées qui pourraient en retour promouvoir une dysfonction vasculaire
et l’hypertension [22]. Ainsi des interactions locales entre adipocytes et lymphocytes T
pourraient également participer à la genèse des pathologies vasculaires.
Conclusion
L’ensemble des travaux récents réalisés sur différents modèles murins mettent en lumière
l’implication potentielle des cellules de l’immunité adaptative et plus particulièrement des
lymphocytes T dans le développement de l’inflammation du tissu adipeux associée à l’obésité
et dans la genèse des pathologies associées à l’obésité. Le développement du tissu adipeux
dans les modèles murins d’obésité induite par un régime hyperlipidique ou génétique
s’accompagne d’une accumulation de lymphocytes T qui présentent une activation de type
Th1. Par leur production de facteurs solubles pro-inflammatoires et via des contacts
cellules/cellules, les lymphocytes T pourraient moduler le phénotype inflammatoire des
adipocytes et participer au développement des pathologies associées à l’obésité (Figure).
Cependant les différences de fond génétique, du type et de la période de régime doivent être
10
prises en compte afin de mieux définir le rôle de cette population cellulaire dans
l’établissement de l’obésité et des pathologies associées. Les données obtenues chez l’homme
sont moins nombreuses et nécessitent d’être approfondies. Les résultats obtenus sur les
macrophages du tissu adipeux montrent que ces cellules immunes ne présentent pas le même
phénotype dans les modèles murins et chez l’homme. En effet, le phénotype des macrophages
du tissu adipeux murin obèse est très clairement polarisé M1 inflammatoire [23] alors que
chez l’homme leurs caractéristiques sont celles de cellules impliquées dans des réactions
inflammatoires chroniques (phénotype mixte inflammatoire et pro-angiogénique) [24]. Ainsi
la définition du phénotype des lymphocytes qui s’accumulent dans le tissu adipeux humain,
les mécanismes responsables de cette accumulation, i.e. recrutement actif et/ou prolifération
locale, et leurs rôles restent à être clairement définis.
11
Références
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12
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Lymphocytes CD3+CD4+ Th1 / CD8+?
MacrophagesProlifération
locale?
RANTES,SDF1α,IP-10, MIG
IFNγ,autres?
Récepteurs d’adressage?
Interactions croisées locales?
?
CD3+ Monocytes Sang
Tissu adipeux
Cellules endothéliales
Adipocytes
VAP1/SSA0, SDF-1α
Les lymphocytes du tissu adipeux: mécanismes d’adressage et rôles.
65
Objectifs
Les données de la littérature suggèrent de très fortes interactions entre le système
métabolique et le système immunitaire au niveau des réponses inflammatoires aussi bien que
dans la régulation du métabolisme. Le tissu adipeux est lui-même le siège d’une réponse
inflammatoire de bas niveau et de l’accumulation de cellules immunes. La présence de
lymphocytes dans le tissu adipeux humain a été très peu étudiée et les phénotypes précis ainsi
que l’état inflammatoire de ces lymphocytes n’est pas décrit. Comme nous l’avons vu en
introduction, les populations de l’immunité adaptative sont variées et les marqueurs qu’elles
expriment sont indicateurs de leurs fonctions.
Dans la première partie de ce travail, nous nous sommes attachés à caractériser
précisément les lymphocytes présents dans le tissu adipeux de manière qualitative et
quantitative. Les types de cellules nous informent sur l’état d’activation inflammatoire dans
lequel ils se trouvent au sein du tissu adipeux humain et nous permettent d’émettre des
hypothèses quant à leur rôle potentiel sur le métabolisme et dans le développement de
l’obésité. Nous avons également étudié ces variations de phénotype en fonction de l’IMC et
de la localisation du tissu adipeux (viscéral versus sous cutané) sur un grand nombre de
patients. De plus, nous avons tenté d’apporter des précisions sur leurs rôles potentiels au sein
du tissu adipeux via des effets des sécrétions de ces cellules sur les autres cellules du tissu
adipeux (les macrophages, les cellules progénitrices et les adipocytes).
L’utilisation de modèles animaux en régime enrichi en lipides pendant des temps
variables nous a permis d’étudier les lymphocytes mais aussi les autres populations immunes
dans le développement précoce de l’obésité. Enfin, l’étude de modèles déficients en
lymphocytes nous renseigne sur le rôle potentiel des lymphocytes sur le développement de
l’obésité et sur le recrutement des autres cellules immunitaires dans le tissu adipeux.
66
Partie 2: Résultats
67
I Caractérisation des lymphocytes du tissu adipeux humain et de leur rôle sur le
métabolisme et la différenciation adipocytaire
Nous avons tout d’abord étudié la présence de lymphocytes dans le tissu adipeux d’un
grand nombre de patients d’indice de masse corporelle (IMC) variés ayant eu recours à la
lipoaspiration ou à la dermolipectomie abdominale, par des expériences de cytométrie en flux
et d’immunohistofluorescence.
Ces expériences nous permettent de déterminer la localisation des lymphocytes au sein
du tissu, les sous-populations de lymphocytes présents dans le tissu adipeux ainsi que les
modulations de leurs nombres avec l’index d’adiposité (défini par l’IMC).
D’autre part, un second groupe de patients obèses morbides ayant eu recours à la
chirurgie bariatrique nous donne accès à des prélèvements pairés de tissu sous-cutanés et
viscéraux. Ainsi nous avons pu explorer si la localisation viscérale reconnue pour être plus
délétère en terme de syndrome métabolique (187) affecte le nombre ainsi que les
caractéristiques des lymphocytes présents au sein du tissu adipeux.
Afin de compléter cette caractérisation, des analyses des transcrits exprimés par les
lymphocytes isolés du tissu adipeux humain par une technique d’immunosélection/déplétion
comparés à des lymphocytes sanguins, nous renseignent sur l’état inflammatoire et la
polarisation des lymphocytes présents dans le tissu adipeux, ainsi que sur les variations de ces
paramètres avec l’index d’adiposité.
Une fois cette caractérisation achevée, nous nous sommes intéressés au rôle potentiel
des lymphocytes dans le tissu adipeux en terme de régulation de la différenciation et du
métabolisme adipocytaire en étudiant les effets de facteurs solubles des lymphocytes du tissu
adipeux humain sur l’adipogenèse des cellules progénitrices CD34+/CD31-, sur la lipolyse et
la lipogenèse des adipocytes matures.
68
Enfin nous avons étudié les cytokines et les chimiokines sécrétées par les adipocytes
humains matures et les autres cellules de la fraction stroma-vasculaire (cellules progénitrices,
macrophages, cellules endothéliales) qui pourraient interagir avec les lymphocytes afin de
tenter d’expliquer le recrutement et la prolifération des lymphocytes au sein du tissu adipeux.
69
Article 1 Interplay between human adipocytes and T lymphocytes in obesity: CCL20 as
an adipochemokine and T lymphocytes as lipogenic modulators
Dans ce manuscrit, nous avons caractérisé les lymphocytes dans le tissu adipeux humain sous-
cutané de patients avec des indices de masse corporelle variables et nous avons regardé
l’impact de la localisation viscérale et sous-cutanée du tissu adipeux de patients obèses
morbides sur leur nombre et sous-types. Puis nous avons étudié l’effet des facteurs solubles
issus des lymphocytes T du tissu adipeux humain sur la lipolyse et sur la lipogenèse des
adipocytes matures humains d’une part, et défini d’autre part, une voie potentielle de
recrutement des lymphocytes via le système CCL20-CCR6.
ISSN: 1524-4636 Copyright © 2009 American Heart Association. All rights reserved. Print ISSN: 1079-5642. Online
7272 Greenville Avenue, Dallas, TX 72514Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology is published by the American Heart Association.
DOI: 10.1161/ATVBAHA.109.1925832009;
2009;29;1608-1614; originally published online Jul 30,Arterioscler Thromb Vasc BiolAnne Bouloumié
Maumus, Patrick Chiotasso, Coralie Sengenès, Max Lafontan, Jean Galitzky and Carine Duffaut, Alexia Zakaroff-Girard, Virginie Bourlier, Pauline Decaunes, Marie
an Adipochemokine and T Lymphocytes as Lipogenic ModulatorsInterplay Between Human Adipocytes and T Lymphocytes in Obesity: CCL20 as
http://atvb.ahajournals.org/cgi/content/full/ATVBAHA.109.192583/DC1Data Supplement (unedited) at:
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Fax:Kluwer Health, 351 West Camden Street, Baltimore, MD 21202-2436. Phone: 410-528-4050. Permissions: Permissions & Rights Desk, Lippincott Williams & Wilkins, a division of Wolters http://atvb.ahajournals.org/subscriptions/Biology is online at Subscriptions: Information about subscribing to Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular
by on September 17, 2009 atvb.ahajournals.orgDownloaded from
Interplay Between Human Adipocytes and T Lymphocytesin Obesity
CCL20 as an Adipochemokine and T Lymphocytes asLipogenic Modulators
Carine Duffaut, Alexia Zakaroff-Girard, Virginie Bourlier, Pauline Decaunes, Marie Maumus,Patrick Chiotasso, Coralie Sengenes, Max Lafontan, Jean Galitzky, Anne Bouloumie
Objective—Adipose tissue (AT) plays a major role in the low-grade inflammatory state associated with obesity. The aim of the
present study was to characterize the human AT lymphocytes (ATLs) and to analyze their interactions with adipocytes.
Methods and Results—Human ATL subsets were characterized by flow cytometry in subcutaneous ATs from 92
individuals with body mass index (BMI) ranging from 19 to 43 kg/m2 and in paired biopsies of subcutaneous and
visceral AT from 45 class II/III obese patients. CD3� ATLs were composed of effector and memory CD4� helper and
CD8� cytotoxic T cells. The number of ATLs correlated positively with BMI and was higher in visceral than
subcutaneous AT. Mature adipocytes stimulated the migration of ATLs and released the chemokine CCL20, the receptor
of which (CCR6) was expressed in ATLs. The expression of adipocyte CCL20 was positively correlated with BMI and
increased in visceral compared to subcutaneous adipocytes. ATLs expressed inflammatory markers and released
interferon gamma (IFN�). Progenitor and adipocyte treatment with ATL-conditioned media reduced the insulin-
mediated upregulation of lipogenic enzymes, an effect involving IFN�.
Conclusions—Therefore, crosstalk occurs between adipocytes and lymphocytes within human AT involving T cell chemoat-
traction by adipocytes and modulation of lipogenesis by ATLs. (Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2009;29:1608-1614.)
Key Words: inflammation � visceral fat � macrophages � T lymphocyte subsets � CCR6
Adipocytes are the site of metabolic activity of adipose
tissue (AT) ie, lipogenesis that corresponds to lipid
storage and lipolysis that is responsible for triglyceride
hydrolysis). In humans, lipogenesis is promoted by insulin,
whereas lipolysis is mainly under the control of catechol-
amines.1 Besides their metabolic activity, adipocytes produce
a wide range of factors grouped under the term adipokines.
Obesity is associated with alterations of the metabolic and
secretory activities of adipocytes and is characterized by a
chronic low-grade inflammatory state.2 Chronic inflammation
within the fat mass itself has been suspected to play a major
role in systemic inflammation. Initial studies, focused on the
myeloid cells (monocytes, macrophages and dendritic cells),
have shown AT accumulation of these cells in obese condi-
tions in both mice and humans.3–5 In mice, acquisition of a
proinflammatory phenotype by the AT macrophages (ATMs)
has been linked to the development of insulin resistance.6 In
human obesity, however, ATMs appeared less polarized with
proangiogenic abilities, hallmarks of cells involved in chronic
nonresolved inflammatory processes.7
Murine fat depots contain lymphoid cells from the innate
(natural killer [NK] cells, NKT cells and ��T cells) and the
adaptive (��T and B cells) immune systems.8 Recent studies
have described the accumulation of CD3� T lymphocytes in the
AT of obese mice9–12 and patients.13 However, there are no data
on the subsets and activation state of lymphocytes present in
human AT. Chemokine secretion by adipocytes may promote
lymphocyte homing within AT. Although T cell chemoattrac-
tants such as CCL5 and CXCL12 have been described to be
expressed within AT,9,13 their cellular origin as well as the
modulation of their expression according to adiposity are still
unclear. The work of Pond et al has stressed the close interac-
tions between lymphoid cells in lymph nodes and the surround-
ing AT in rodents.14 Recently, in mice models, lymphocytes
have been involved in the regulation of the inflammatory
response and insulin resistance associated with obesity through
their production of interferon gamma.11 The present study was
undertaken to characterize human ATLs in term of subsets and
activation state and relate this with the degree of adiposity and
anatomic location in human AT. The interrelation between
Received March 11, 2009; revision accepted July 22, 2009.From the Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM), U858, Toulouse, France, Universite Toulouse III Paul Sabatier, Institut
de Medecine Moleculaire de Rangueil, Equipe n°1 AVENIR (C.D., A.Z.-G., V.B., P.D., M.M., C.S., M.L., J.G., A.B.), Chirurgie generale et digestive(P.C.), CHU Purpan, Toulouse, France.
Correspondence to Anne Bouloumie, Equipe 1 AVENIR/INSERM U858, Hopital Rangueil Bat L4, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 04, France.E-mail [email protected]
© 2009 American Heart Association, Inc.
Arterioscler Thromb Vasc Biol is available at http://atvb.ahajournals.org DOI: 10.1161/ATVBAHA.109.192583
1608 by on September 17, 2009 atvb.ahajournals.orgDownloaded from
human ATLs and mature adipocytes was studied in terms of
adipocyte-derived T cell chemoattractant and ATL-mediated
metabolic effects.
Materials and Methods
MaterialsChemicals were purchased from Sigma. Collagenase NB4 was
purchased from Serva. Selection kits for CD34�, CD14�, and CD3�
cells were purchased from StemCell Technologies, and magnetic
microbeads coupled with anti-CD31 antibodies were purchased from
Dynal Biotech (Invitrogen). Culture media were from purchased
Promocell. Antibodies for flow cytometry analysis were purchased
from BD Biosciences.
Isolation of the Stroma-Vascular Fraction (SVF)
and Mature AdipocytesHuman subcutaneous adipose tissue (AT) was obtained from healthy
women undergoing elective procedures of fat removal for esthetic
purposes. Their body mass index (BMI) ranged from 19 to 43 kg/m2
(n�92, mean BMI�27.2�0.6kg/m2, mean age�42.6�1.2 years). In
addition, paired human omental and subcutaneous tissues were
obtained from a group of class II/III obese nondiabetic patients
undergoing bariatric surgery (n�45, 41 women/4 men, mean
BMI�43�1kg/m2, mean age�42�1 years). The protocols of fat
collection were approved by the Institutional Research Board of
INSERM and Toulouse University Hospital Ethics committee. The
cells from the stroma-vascular fraction (SVF) and mature adipocytes
from human AT were obtained after collagenase digestion as
previously described.5
Isolation of Human Adipose Tissue LymphocytesThe cells of the human AT-SVF were isolated using an immunoselec-
tion/depletion protocol as previously described5,15 with modifications to
isolate the CD3� ATLs. Briefly, after depletion of the progenitor cells
(CD34�/CD31�) and AT macrophages (ATMs; CD34�/CD14�) from
the AT-SVF, the CD34�/CD14� cells were incubated with a CD3�
Stem Cell System positive cocktail (Grenoble;15 minutes at room
temperature). After the addition of nanoparticles, cells were recovered
by successive magnetic sorting steps. Freshly isolated CD34�/CD14�/
CD3� defined as ATLs were counted, and either lysed (Qiagen) and
stored at �20°C until mRNA extraction, analyzed by flow cytometry, or
cultured. Conditioned media (CM) from ATLs and ATMs were col-
lected after 24-hour plating of the cells (200 000 to 250 000 cells/cm2)
in basal medium (ECBM/0.5% bovine serum albumin free fatty acids-
free [FFA-free BSA]), centrifuged (20 000g, 3 minutes, room temper-
ature), and the media was stored at �20°C until further use. To isolate
human blood CD3� cells, peripheral blood was collected in heparinized
tubes from 5 donors (3 women/2 men; mean BMI�20.7�0.6kg/m2;
mean age�35�4 years). After isolation of blood mononuclear cells and
removal of platelets by successive centrifugations, macrophages were
depleted using magnetic CD14� beads (Myltenyi Biotec), and the
CD3� cells were selected on the CD14 negative cell fraction with the
same protocol described for the AT CD3� cells. The blood CD3� cells
were then lysed (Qiagen) and stored at �20°C until mRNA extraction.
Flow Cytometry AnalysisHuman SVF cells, ATLs, or blood cells (100 000 cells) were
incubated with FITC- (CD4, ��TCR, CD25, CD62L) PerCP-
(CD45), PECy7- (CD45-RO), PE- (CD3, CD14, CD45-RA), APC-
(CD8, CD19, CD56) conjugated antibodies or respective isotype
controls. For IFN� intracellular staining, ATLs were incubated in the
presence or absence of brefeldin-A (BD Biosciences) and stained
with FITC-CD4, PECy7-IFN� and APC-CD8 antibodies or respec-
tive isotype controls. Analyses were performed using a FACSCalibur
flow cytometer and CellQuest Pro software (BD Bioscience).
Confocal Fluorescence Microscopy AnalysesAfter 1-hour fixation in 4% paraformaldehyde and extensive wash-
ing steps in PBS, pieces of human subcutaneous AT was incubated
for 30 minutes at room temperature in PBS/2% BSA followed by a
2-hour incubation with the rabbit polyclonal antibody directed
against human CD3 (Dako) (1:20). After washing (PBS/0.2% Tween
and PBS) and 1-hour incubation with anti-rabbit antibody coupled to
AlexaFluor488 (Invitrogen) (1:200), the tissues were placed on
slides and a 3-dimensional reconstruction was performed using a
Zeiss LSM 510 META confocal microscope.
Lipolysis and Modulation of Lipogenic EnzymeExpression in Mature Adipocytes andProgenitor CellsFor lipolysis measurement, mature adipocytes obtained after colla-
genase digestion of subcutaneous AT were plated in fibrin gels as
previously described.5 After gel polymerization, basal medium,
ATM-CM, or ATL-CM were added. After 24-hour incubation
pharmacological agents (0.1 �mol/L isoprotenerol [ISO] or
10 �mol/L noradrenaline [NA]) were added to the media for 90
minutes at 37°C. At the end of the incubation period, aliquots of the
media were taken for glycerol and FFA determination (Sigma-Al-
drich and Wako Unipath, respectively). Total lipid content was
determined gravimetrically after solvent extraction. For gene expres-
sion analysis, mature adipocytes in fibrin gels were treated with basal
medium in the presence or absence of 50 ng/mL human recombinant
IFN� or with ATL-CM in the presence or absence of 2 �g/mL
neutralizing antihuman IFN� antibody or its isotype control (BD
Bioscience) or with ATM-CM. After overnight incubation,
0.1 �mol/L insulin was or not added for 24 hours. Media was then
removed and adipocytes were lysed in Qiazol (Qiagen) (v/v) for
mRNA extractions.
Freshly harvested AT-progenitor cells (CD34�/CD31�) were
plated at a density of 120 000 cells/cm2 in ECBM supplemented with
10% fetal calf serum (FSC) for 24 hours at 37°C in an atmosphere of
5% CO2. Adipogenic differentiation was induced in defined medium
(ECBM supplemented with 66 nmol/L Insulin, 10 �g/mL Trans-
ferrin, 1 nmol/L Triiodothyronine, 1 �g/mL Rosiglitazone, and 100
nmol/L cortisol). Cells were cultured either in a mixture (v/v) of 2�
defined medium and ATL-CM or in a mixture (v/v) of 2� defined
medium and ECBM/0.1% BSA (control). Media were changed every
4 days. At day 8, cells were lysed by sonication in PBS/0.2% Tween,
and the triglyceride content was determined (GPO-trinder kit, Sigma,
respectively), or lysed in Qiazol for mRNA extraction.
Migration AssaysHuman ATL migration was assessed on 3 �m-pore HTS FluoroBlock
inserts (Falcon). After labeling for 60 minutes with 10 �mol/L
Calcein AM, ATLs (20 000 cells in 300 �L ECBM/0.1%BSA) were
incubated in the upper side of the insert and 800 �L mature
adipocyte-conditioned media, or conditioned media without cells
(control) was added to the companion plate under the insert. ATL
migration was evaluated by counting the number of labeled lympho-
cytes attached to the lower surface of the wells after 4 hours.
Cytokine DetectionThe RayBio Human Cytokine antibody Array V (RayBiotech Inc,
Cliniscience) provides antibody array membranes to detect expres-
sion of 79 cytokines. The experiment was performed according to the
manufacturer’s instructions. Briefly, 1 mL of conditioned medium by
human mature adipocytes originating (n�6) maintained in fibrin gels
for 24 hours was added to the antibody-coated membrane and
incubated on a plate shaker at 4°C overnight. After incubation with
biotinylated antibodies and labeled streptavidin, the signal was
detected from the membrane by chemiluminescence using Chemi-
smart 3000 (Vilbert LourmatFrance). Data analysis was performed
using Bio1D software (Vilbert Lourma). Positive controls were used
to normalize the results from different membranes.
Duffaut et al Characterization of the Human Adipose Tissue T Cells 1609
by on September 17, 2009 atvb.ahajournals.orgDownloaded from
RNA Extraction and Real-Time PCRTotal RNA was extracted from ATLs, adipocytes. and progenitor cellsusing the RNeasy kit (Qiagen). The RNA concentration was measuredeither by a spectrophotometer nanodrop� ND-1000 (Labtech) or byfluorimetric assay (Ribogreen, Invitrogen). The RNA was reverse-transcribed using the “Superscript II” kit (Invitrogen). Reverse transcrip-tion was also performed without the superscript enzyme on RNAsamples to ensure the absence of contaminating genomic DNA. Primersfor tumor necrosis factor � (TNF-�), IFN�, RANTES (CCL5), CCL20,(CCR6), interleukin-2 (IL-2), IL-4, IL-6, perforin-1 (PRF-1), phospho-inositide-3-kinase, regulatory subunit 1 alpha (PIK3R1), fatty acidsynthase (FAS), lipoprotein lipase (LPL), and leptin receptor (Leptin-R)were from Applied Biosystems (Hs00174128_m1, Hs00174143_m1,Hs00174575_m1, Hs00171125_m1, Hs00171121_m1, Hs00174114_m1,Hs00174122_m1, Hs00174131_m1, Hs00169473_m1, Hs00381459_m1,Hs00188012_m1, Hs00173425_m1, Hs00174497_m1, respectively). Theamplification reaction was done in duplicate on 15 ng of the cDNAsamples in a final volume of 20 �L in 96-well reaction plates (AppliedBiosystems) in a GeneAmp 7500 detection system (Applied Biosys-tems). All reactions were performed under the same conditions: 50°Cfor 2 minutes, 95°C for 10 minutes, 40 cycles of 95°C for 15 seconds,and 60°C for 1 minute. Results were analyzed with the GeneAmp 7500software and all the values were normalized to the levels of 18S rRNA.
Statistical AnalysisValues are given as mean�SEM for (n) separate experiments.Correlations were performed using a Spearman rank correlation.Comparisons between groups were analyzed by ANOVA for exper-iments with more than 2 subgroups followed by post hoc tests andthe nonparametric Mann–Whitney test or using the Student t test,when appropriate (Prism 4, GraphPad Software, USA). Differenceswere considered significant when P�0.05.
Results
Characterization of the Lymphocyte Subsets in theHuman Subcutaneous Adipose TissueFlow cytometry analysis performed on the stroma-vascular
fraction (SVF) obtained after collagenase digestion of
human subcutaneous adipose tissue (AT) (n�92, mean
BMI�27.2�0.6kg/m2) showed 2 main CD45� leukocyte pop-
ulations. A predominant CD14� macrophage population
(19�1% of total SVF cells) was identified. The lymphocyte
population was mainly composed of CD3� T lymphocytes
(6�0.5% of total SVF cells), a minor CD56� NK cell popula-
tion (1.5�0.1% of total SVF cells), and few CD19�
B-lymphocytes (Figure 1A). Three dimensional reconstitution of
confocal fluorescence microscopy analyses using anti-CD3 an-
tibody revealed the presence of CD3� cells organized in clusters
around adipocytes (Figure 1B). Some individual CD3� cells
were identified in the stroma and few in the capillaries (data not
shown). Flow cytometry analyses performed under the same
conditions on the AT-SVF and peripheral blood showed that the
CD3� cells identified in the AT exhibited a lower size but a
higher granularity than the blood CD3� cells (supplemental
Figure IA). Moreover, the expressions of the homing receptor
CD62L and the naıve T cells CD45RA markers were markedly
lower in the AT SVF CD3� cells compared to peripheral blood
(supplemental Figure IB). To analyze the subsets of human AT
CD3� T lymphocytes, CD3� cells were immunoselected from
freshly-harvested SVF after depletion of the CD34 (progenitor
and capillary endothelial cells) and CD14 (macrophages) posi-
tive cells. Helper CD4� and cytotoxic CD8� T cells were the
major CD3� T-lymphocyte subsets (Figure 1C). A minor subset
of NKT cells (CD3�/CD56�) and few, if any, regulatory
CD25� and immature ��T lymphocytes were detected (data not
shown). The helper CD4� T cells were mainly memory
(CD45RO�) as well as effector T cells (CD45RO�/RA�),
whereas the CD8� cells were mainly effector cells (Figure 1D).
Influence of the Degree of Adiposity and Fat
Anatomic Location on the Number of Human
Adipose Tissue T LymphocytesThe number of AT lymphocytes (ATLs) determined by flow
cytometry analysis of the SVF of the subcutaneous AT
(n�92) increased with the degree of adiposity. Indeed, a
statistically significant correlation was detected between the
number of AT CD3�, CD4�, as well as CD8� cells and the
BMI of the individuals (data not shown). The patients were
grouped according to BMI, and obese patients (BMI �30)
exhibited a statistically significant higher numbers of AT
CD3�, CD4�, and CD8� than lean patients (BMI �25;
Figure 2A through 2C). The number of CD56�-NK cells
within the subcutaneous AT remained constant whatever the
BMI (data not shown). The analysis of the SVFs of paired
biopsies of subcutaneous and visceral ATs from class II/III
obese patients (n�45, mean BMI�43�1kg/m2) showed that
the number of CD14� cells (adipose tissue macrophages,
ATMs) was slightly higher in visceral compared with subcu-
taneous AT (1.2-fold, P�0.05, Figure 3A). The number of
AT CD3� cells showed a marked increase in the visceral
depot (3-fold, P�0.001, Figure 3A), because of a clear
enhanced effector CD8� cell number and a moderate increase
in memory CD4� cell numbers (Figure 3B through 3D).
Figure 1. Characterization of the lymphocyte subsets in thehuman subcutaneous adipose tissue. A, Multicolour FACS anal-yses were performed on the SVF of subcutaneous AT usingCD14–PE, CD3-PE, CD56-APC, and CD19-PerCP-Cy5.5 anti-bodies. Results are means�SEM (n�92 for CD14, CD3, andCD56; n�41 for CD19). B, Three-dimensional reconstitution ofconfocal fluorescence microscopy analyses of human adiposetissue with an antibody directed against CD3. The upper andlower views of CD3� cell clusters surrounding three adipocytesare shown. C, Multicolor FACS analyses were performed onimmunoselected AT CD3� cells using CD4-FITC and CD8-APCantibodies. A representative dot plot is shown. D, MulticolorFACS analyses were performed on immunoselected AT CD3�
cells with CD4-FITC/CD8-APC/CD45RO-PeCy7/CD45RA-PEantibodies. Results are means�SEM (n�9).
1610 Arterioscler Thromb Vasc Biol October 2009
by on September 17, 2009 atvb.ahajournals.orgDownloaded from
Adipocyte Expression of the T Cell
Chemoattractant CCL20To assess whether adipocytes attracted ATLs, we studied the
effects of the adipocyte-derived factors contained in the media
from human mature adipocytes of subcutaneous AT included in
fibrin gel for 24 hours on the migration of ATLs. As depicted in
Figure 4A, ATLs exhibited a marked migratory responsiveness
to human mature conditioned media (5.5-fold increase,
P�0.01). The human mature conditioned media were analyzed
on protein arrays allowing the simultaneous detection of 79
proteins (Figure 4B). As expected, strong positive signals were
detected for the adipokine leptin and the cytokines and growth
factors IL-6, vascular endothelial growth factor (VEGF), tumor
growth factor beta 2 (TGF�2), oncostatin M (OSM), as well as
tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1 (TIMP-1). Con-
cerning chemokines, positive signals were obtained for chemo-
kines active on neutrophils (CXCL1, CXCL2, and CXCL8), for
MCP-1/CCL2, RANTES/CCL5, and MCP-4/CCL13. Interest-
ingly, the lymphocyte chemoattractant chemokine CCL20 was
also identified. Notably, no signals above the baseline were
detected for CCL1, CCL8, CCL17, CCL18, CXCL5, CXCL6,
CXCL9, CXCL10, CXCL12, and CXCL13. To further charac-
terize the adipocyte-derived CCL20, real-time RT-PCR analyses
were performed on mature adipocytes from subcutaneous AT
(n�18 women, age�44�2 years, BMI�27�1 kg/m2) and from
subcutaneous and visceral AT from class II/III obese women
(n�12, age�41�3 years, BMI�44.7�1.3kg/m2). The levels of
CCL20 transcripts in adipocytes from subcutaneous AT corre-
lated with the adiposity degree assessed by the BMI (Spearman
r�0.5, P�0.05) but not with age. Adipocytes originated from
obese individuals exhibited 7-fold more CCL20 transcripts than
adipocytes from lean individuals (Figure 4C). The effects of
conditioned media (CM) originating from native immunos-
elected human ATLs and ATMs on adipocyte CCL20 expres-
sion were studied. Although treatment of adipocytes with
ATL-CM or IFN� did not modify CCL20 expression, ATM-CM
induced a marked increase in the levels of CCL20 transcript
(3.8-fold increase, P�0.05, Figure 4D). In class II/III obese
women, the expression of CCL20 in visceral adipocytes was
higher than in the paired subcutaneous adipocytes (5-fold in-
crease, P�0.05, Figure 4E).
Phenotype of the Human AdiposeTissue LymphocytesReal-time RT-PCR analysis was performed on the native
immunoselected ATLs and compared to immunoselected
CD3� cells from peripheral blood from different donors. The
study was restricted to subcutaneous AT because the amount
of cells recovered from the paired biopsies of subcutaneous
and visceral AT of obese patients was too low. ATLs
exhibited a marked higher transcript level for IFN�, TNF�,
Figure 2. Influence of the degree of adiposity on the number oflymphocytes in the subcutaneous adipose tissue. The number ofAT lymphocytes (normalized per gram of AT) was determined inthe subcutaneous AT-SVF by flow cytometry analyses using (A)CD3-PE, (B) CD3-PE/CD4–FITC, (C) CD3-PE/CD8-APC antibodiesin lean (open bars, n�41), overweight (hatched bars, n�26), andobese (filled bars, n�25) patients. *P�0.05, **P�0.01 obese vslean.
Figure 3. Influence of fat mass location on the number of lym-phocytes in class II/III patients. Multicolor FACS analyses wereperformed on the SVF obtained from paired biopsies from sub-cutaneous (open bars) and visceral (filled bars) AT of class II/IIIobese patients using CD14-PE, CD3-PE, CD4-FITC, CD8-APC,CD45RO-PeCy7, and CD45RA-PE antibodies. A, Number ofATMs (CD14�) and ATLs (CD3�; n�45). B, Numbers of CD4�
and CD8� ATLs (n�45; C and D) Number of memory(CD45RO�), naıve (CD45RA�), and effector (CD45RO-/RA-)CD4� and CD8� ATLs (n�19). Results are means�SEM.*P�0.05, **P�0.01 visceral vs subcutaneous.
Duffaut et al Characterization of the Human Adipose Tissue T Cells 1611
by on September 17, 2009 atvb.ahajournals.orgDownloaded from
RANTES, IL-2, as well as perforin-1 (PRF-1) when com-
pared with blood T lymphocytes (Table). The expression of
IL-4 was not detected in ATLs. Interestingly, the expression
of the CCL20 receptor CCR6 as well as the expression of the
leptin receptor (Leptin-R) were markedly upregulated in
human ATLs. The production of IFN� by ATLs was further
analyzed by flow cytometry (Figure 5A). Both CD4� and
CD8� cells produced IFN� (data not shown).
Specific Paracrine Effects of ATLs on HumanMature AdipocytesThe effects of conditioned media (CM) originating from
native immunoselected human ATLs and ATMs on adipocyte
metabolism were studied. Pretreatment of human mature
adipocytes with ATL-CM or ATM-CM did not alter either
basal lipolysis or the lipolytic activity stimulated with isopro-
tenerol (ISO) or noradrenaline (NA), as assessed by the
release of glycerol (data not shown) and free fatty acids
(Figure 5B). Pretreatment of human mature adipocytes with
ATL-CM altered the insulin responsiveness of the lipogenic
enzymes fatty acid synthase (FAS) and lipoprotein lipase
(LPL). Indeed, although ATL- and ATM-CMs did not alter
Figure 4. Production and expression of the T cell chemoattractantCCL20 by human mature adipocytes. A, Migration of human ATLsto human adipocyte-conditioned media. Results are expressed aspercentage of control (media without cells) and are means�SEMof n�6. B, Representative photomicrograph of a cytokine antibodyarray membrane performed on conditioned media from pooledhuman mature adipocytes (n�6). C, mRNA levels of CCL20 deter-mined by real-time RT-PCR analyses on mature adipocytes fromsubcutaneous AT of 6 lean and 6 obese patients. Results aremeans�SEM. **P�0.01. D, mRNA levels of CCL20 determined byreal-time RT-PCR analyses in adipocytes (n�4) treated or not(Control) with ATL-CM (n�4), 50 ng/mL IFN�, or ATM-CM (n�12).Results are expressed as percentage of control and are means�
SEM. *P�0.05 vs control. E, mRNA levels of CCL20 determined byreal-time RT-PCR analyses on mature adipocytes isolated frompaired biopsies of subcutaneous and visceral AT of class II/IIIobese patients (n�12). **P�0.01.
Table. Gene Expression in Blood and Adipose Tissue T Cells
Gene Blood CD3� Cells Adipose CD3� Cells
IFN� 0.1�0.02 2.3�0.4*
TNF� 0.2�0.06 8.1�1.3*
CCL5 12�2 47�6*
CCR6 5�10�3�1�10�3 47�10�3
�6�10�3**
Leptin-R 7�10�3�2�10�3 73�10�3
�10�10�3*
IL-2 1�10�3�0.2�10�3 8�10�3
�0.3�10�3*
IL-4 1.6�10�5�0.7�10�5 Nondetectable
PRF-1 2�0.2 5.8�0.8*
Gene expression was determined by real-time RT-PCR. Results were
normalized to the levels of 18S rRNA and expressed as 2�CT�10 000, blood
CD3� cells (n�5); adipose CD3� cells (n�30 for IFN�, TNF�, CCL5, PRF-1,
n�18 for CCR6 and Leptin-R, n�7 for IL-2 and IL-4), Results are mean�SEM.
*P�0.05, **P�0.01.
Figure 5. IFN� production by adipose tissue T lymphocytes andpararine effects on adipocyte metabolism. IFN� production byimmunoselected ATLs was determined by multicolour FACS analy-ses using CD4�FITC/CD8-APC/IFN�-PeCy7 antibodies. A, A repre-sentative dot plot is shown obtained on gated IFN� positive cells.B, FFA released by human mature adipocytes pretreated or not(open bars) by conditioned media from ATLs (filled bars, n�6) orfrom ATMs (hatched filled bars, n�6) and stimulated or not (basal)by 0.1 �mol/L isoprotenerol (ISO) or 10 �mol/L noradrenaline (NA).Results are expressed as percentage of the values obtained for thecontrol nonstimulated adipocytes (basal) and are means�SEM. ThemRNA levels of fatty acid synthase (FAS; C), lipoprotein lipase (LPL;D), phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 1 alpha (PIK3R1; E)were determined by real-time RT-PCR analyses in adipocytes (n�4)treated or not (Control, filled bars) for 36 hours with ATL-CM in thepresence (�Ab, hatched bars, n�4) or absence (open bars, n�12) of2 �g/mL neutralizing antihuman IFN� antibody or 50 ng/mL IFN� orATM-CM (hatched filled bars, n�12), in the presence or absence ofinsulin for 24 hours. Results are means�SEM and are expressed aspercentage of cells without insulin. *P�0.05, **P�0.01 vs control�insulin. F, The mRNA levels of FAS and LPL as well as the triglycer-ide content (TG) of human progenitor cells treated or not with ATL-CMs. Results are expressed as percentage of the control and aremeans�SEM of n�3.
1612 Arterioscler Thromb Vasc Biol October 2009
by on September 17, 2009 atvb.ahajournals.orgDownloaded from
the basal expression of FAS and LPL in human mature
adipocytes (data not shown), ATL-CMs strongly inhibited the
insulin-mediated upregulation of FAS and LPL transcript
levels (Figure 5C and 5D). Furthermore, it was associated
with the downregulation of a key component of the insulin-
dependent intracellular pathway, the phosphoinositide-3-
kinase, regulatory subunit 1 alpha (PIK3R1; Figure 5E). Such
an ATL-mediated inhibitory effect on FAS, LPL, and
PIK3R1 expression was reversed by a neutralizing IFN�
antibody and mimicked by 50 ng/mL IFN� treatment.
ATM-CM did not modulate the insulin responsiveness of the
adipocyte under the same conditions (Figure 5C, 5D, and 5E).
Human AT progenitor cells (CD34�/CD31� cells) were
treated with human ATL-conditioned media under adipo-
genic culture conditions. Human ATL-conditioned media led
to a marked decrease of the expression of FAS and LPL that
was associated with a lower triglyceride content (Figure 5F).
DiscussionThe present study demonstrates that, in humans, the degree of
adiposity is positively correlated with the accumulation of
adipose tissue lymphocytes (ATLs). Flow cytometry analyses
of the subcutaneous AT-SVF showed the presence of CD3�
T lymphocytes but few CD19� B lymphocytes and innate
lymphocytes (NK, NKT, and ��T-cells). These results clearly
show that human AT and murine AT are different in terms of
relative proportion of T lymphocyte subsets within the
SVF.8,16 Among the T lymphocytes, CD4� and CD8� cells
were characterized as memory (CD45RO�) and effector
(CD45RO�/RA�) cells. Compared to the blood cells, few
naıve CD45RA� as well as CD62L T cells were identified in
the human adipose tissue. Moreover, the mean size of the
tissue lymphocytes was lower than the blood CD3� cells,
whereas the higher granularity of the ATLs compared to the
blood suggested distinct activation states. The direct compar-
ison in the expression of several activation markers in the
immunoselected blood and AT CD3� cells confirmed that
human ATLs exhibited higher expression of inflammatory
markers. Taken together, the low levels of B cells and of
CD62L and naıve T cells together with the high proportion of
effector T cells demonstrate that the human ATLs exhibit a
specific and distinct profile than the one found in peripheral
blood. ATLs are therefore mostly infiltrated or resident cells.
This was confirmed by confocal analyses that revealed that
ATLs were localized in the stroma and more specifically
surrounding some adipocytes. However, we cannot rule out
the presence of a minor contamination from blood. Increased
adiposity, assessed by BMI, was associated with a specific
accumulation of CD4� as well as CD8� ATLs in subcutane-
ous AT, whereas the number of NK cells was not modulated.
In addition to an adiposity-dependent increase of ATL num-
bers, an AT location-dependent pattern of ATLs was ob-
served. Indeed, in paired biopsies from subcutaneous and
visceral AT of classII/III obese patients, a marked increase in
ATLs together with a modest increase in the number of
adipose tissue macrophages (ATMs) was observed in visceral
ATs. In mice, the AT infiltration of T lymphocytes during a
high-fat diet has been speculated to involve several chemo-
kines such as stromal-derived factor 1 alpha/CXCL1213 and
RANTES/CCL5.9 In the present study, ATLs exhibited an
enhanced migration in response to adipocyte-conditioned
media. Protein arrays performed on conditioned media from
human native mature adipocytes showed no adipocyte pro-
duction of CXCL12. Both CCL5 and CCL20 were detected in
the adipocyte conditioned media. Because CCL20 release by
adipocytes has not been reported previously, we further
analyzed the adipocyte expression of CCL20. Mature adipo-
cytes from subcutaneous AT of obese individuals expressed
higher levels of CCL20 than adipocytes from lean individu-
als. In class II/III obese patients, adipocytes from visceral AT
expressed higher levels of CCL20 than subcutaneous adipo-
cytes. Moreover, ATLs expressed the CCL20 receptor,
CCR6. The ligand-receptor pair CCL20-CCR6 has been
described to be responsible for the chemoattraction of effec-
tor/memory T-cells in skin and mucosal surfaces under
homeostatic and inflammatory conditions, as well as in
pathology, including cancer and rheumatoid arthritis.17 The
present results suggest that the adipocyte CCL20 may also
play a major role in the accumulation of T lymphocytes
within the AT. Interestingly, CCL20 expression in adipocytes
was increased in the presence of soluble factors originated
from human ATMs, suggesting that ATMs may contribute
via the stimulation of CCL20 expression in adipocytes to the
accumulation of ATLs. Freshly immunoselected ATLs exhib-
ited a proinflammatory profile of activation, with clear
expression of TNF�, IFN�, and RANTES, whereas the
expression of IL-4 (the TH2-type cytokine) was not detected.
The mechanisms involved in the promotion of the ATL
phenotype remain to be established. However, because ATLs
were found to express high transcript levels of the leptin
receptor and considering that leptin is well described to
promote TH1 activation,18 we propose that leptin locally
produced by human mature adipocyte may be involved in the
activation of ATLs. The lack of B cells together with the
accumulation of Th1 type effector T cells and the previously
reported characterization of human ATMs that were strongly
positive for MHC-II,7 suggest that a cell-mediated immune
reaction takes place in the AT with obesity. However,
additional experiments are clearly needed to define whether
the T lymphocytes of human adipose tissue are selected
toward specific antigens.
Because the lymphocyte clusters identified by immunohis-
tochemistry were localized in the vicinity of adipocytes,
paracrine effects of ATLs on adipocyte metabolism were
investigated and compared to that of human ATMs. Although
ATL- as well as ATM-derived secretory products did not
affect lipolysis, soluble factors originated from ATLs mark-
edly inhibited the insulin-mediated upregulation of both
lipogenic enzymes FAS and LPL. Such an effect was asso-
ciated with the lower expression of PIK3R1 (encoding the
85kD regulatory subunit of PIK), a key component in the
insulin-stimulated pathway.19,20 Moreover, the effect was
specific to lymphocyte-derived products because conditioned
media from human ATMs had no effect. Because human
ATLs were shown to produce IFN�, adipocytes were treated
by IFN�. IFN�, as ATL-conditioned media, reduced the
insulin sensitivity of FAS, LPL, and PIK3R1 and its neutral-
ization in ATL-conditioned media reversed the effects.
Duffaut et al Characterization of the Human Adipose Tissue T Cells 1613
by on September 17, 2009 atvb.ahajournals.orgDownloaded from
Therefore, IFN� produced by ATLs is a paracrine mediator of
the T-cells on adipocyte metabolism. The experiments per-
formed on the human progenitor cells confirmed the effects
of ATLs on the expression of both LPL and FAS. Moreover,
because a decreased triglyceride accumulation was also
observed, it is suggested that ATLs interact with the insulin-
mediated promotion of triglyceride storage. Accumulation of
visceral AT is now well recognized to be associated with an
increased risk of developing type 2 diabetes. Visceral AT
exhibits marked differences compared with subcutaneous AT
in terms of metabolic and secretory activities,21 and increased
local inflammation has been suspected to underlie such
differences.22,23 It is therefore tempting to speculate that the
increased accumulation of ATLs in human visceral AT
participate in the pathogenic potential of the visceral AT via
local paracrine effects on insulin-mediated lipogenesis.
To conclude, the present study focused on a large number
of normal weight, overweight, and obese patients and showed
that the accumulation of helper CD4� and cytotoxic CD8�
ATLs increases in parallel with adiposity and has a location-
dependent pattern. We report a new adipochemokine, CCL20,
the expression of which is modulated by the degree of
adiposity and the anatomic location of AT. We also show that
ATLs are potent local regulators of adipocyte metabolism and
more specifically insulin-mediated lipogenesis.
AcknowledgmentsThe authors thank Dr Dylan Thompson (University of Bath, UK) for hiscritical reading of the manuscript and Marie-Adeline Marques(INSERM U858, Team 4) for her technical support for the lipolysisexperiments. We are grateful to the excellent technical support andadvice of Bruno Payre (IFR31, Toulouse, France) for the confocalmicroscopy.
Sources of FundingThis study was supported by grants from INSERM (AVENIR), theAgence Nationale de la Recherche (ANR “RIOMA”), the EuropeanUnion (FP7 ADAPT HEALTH-F2-2008-2010), and Pierre FabreLaboratories. This work was sponsored by the University Hospital ofToulouse for regulatory and ethic submission (No. 06 029 03).
DisclosuresNone.
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1614 Arterioscler Thromb Vasc Biol October 2009
by on September 17, 2009 atvb.ahajournals.orgDownloaded from
Blood AT50
55
60
*
CD
3+ c
ell s
ize
(Mea
n F
SC
)Blood AT
911131517
*
CD
3+ c
ell g
ranu
lari
ty(M
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SS
C)
Blood AT Blood AT0
20
40
60
80
100
** **
CD62L CD45RA
% C
D3+
cel
lsA
B
Figure S1
by on September 17, 2009 atvb.ahajournals.orgDownloaded from
70
Discussion de l’article 1
Dans cette étude, nous avons caractérisé les lymphocytes du tissu adipeux humain sur
un grand nombre de prélèvements issus de lipoaspirations et de dermolipectomies
abdominales. Nous avons montré que des lymphocytes T (CD3+) sont présents dans le tissu
adipeux humain et qu’ils constituent environ 7% de la fraction stroma vasculaire (FSV).
Le nombre de lymphocytes T est positivement corrélé avec l’indice de masse
corporelle (IMC). Ils sont constitués de cellules effectrices et mémoires auxiliaires CD4+ et
cytotoxiques CD8+. Ils augmentent dans le tissu adipeux viscéral par rapport au tissu sous-
cutané de patients obèses morbides et plus particulièrement les lymphocytes cytotoxiques. Les
lymphocytes B sont absents et les cellules NK et NKT, identifiées en faibles quantités, ne sont
pas augmentées avec l’IMC. D’autre part, les expériences d’immunohistochimie, visualisées
en microscopie confocale, montrent que les lymphocytes T se trouvent à l’extérieur des
vaisseaux et organisés en amas de cellules immunes et en proche contact avec certains
adipocytes. Cette organisation particulière nécessite d’être étudiée plus avant. Toutefois, la
description récente de l’expression de CD40 par les adipocytes et l’observation d’interactions
CD40/CD40 ligand entre adipocytes et lymphocytes d’origine sanguine pourrait expliquer
cette association (188).
La suite des nos études s’est focalisée sur les lymphocytes T. Après isolement par une
technique d’immunosélection/déplétion à l’aide de nanobilles couplés à des anticorps anti
CD3 (Figure 16), nous montrons que ces cellules présentent un phénotype d’activation pro-
inflammatoire associé à une augmentation de l’expression de tous les marqueurs pro-
inflammatoires étudiés par rapport aux lymphocytes sanguins, excepté pour l’IL-4. Ces
analyses nous renseignent sur la polarisation des lymphocytes. En effet, l’absence
d’expression d’IL-4 exclut la possibilité d’avoir des lymphocytes Th2 au sein du tissu adipeux
et la présence d’IFNγ et d’IL-2 va dans le sens d’une polarisation Th1.
71
Les études de production de cytokines par les adipocytes humains matures maintenus
en gel de fibrine mettent en évidence pour la première fois à notre connaissance une
production de CCL20 par les adipocytes. Nous confirmons de plus la production de RANTES
et de MCP-1 parmi les autres chimiokines ainsi que de leptine et d’IL-6 entre autres.
L’expression de CCL20 déterminée par PCR en temps réel dans les adipocytes matures est
augmentée avec l’IMC et la localisation viscérale. Les lymphocytes du tissu adipeux humain
expriment CCR6, qui est le récepteur exclusif de CCL20. La stricte sélectivité de CCL20 pour
CCR6 est une des exceptions à la règle générale de la proximité des chimiokines et de leurs
récepteurs (189). CCR6 a été décrit comme étant exprimé notamment par les lymphocytes T
effecteurs/mémoires (CD45RO+CCR7-) (190). CCL20 quant à lui, joue un rôle important
dans l’arrêt du flux de cellules T au niveau des cellules endothéliales (191). Enfin,
l’interaction CCR6/CCL20 est reconnue comme influençant le recrutement des lymphocytes
dans les tissus au cours de nombreuses inflammations (192-194). De plus, nos données
montrent que l’expression de CCL20 par les adipocytes est augmentée lorsqu’ils sont traités
par des milieux conditionnés par les macrophages du tissu adipeux suggérant ainsi une boucle
de régulation entre les macrophages et les lymphocytes via les adipocytes afin de favoriser le
recrutement lymphocytaire.
Afin d’analyser le rôle des lymphocytes au sein du tissu adipeux, nous avons évalué
les effets des sécrétions des lymphocytes comparés aux macrophages, via des milieux
conditionnés par les CD3+ et/ou les CD14+ (macrophages) isolés du tissu adipeux sur les
adipocytes en culture primaire. Les résultats obtenus en ce qui concerne la lipolyse montrent
d’une part que les milieux conditionnés par ces deux types cellulaires n’affectent pas
l’expression des enzymes de la lipolyse (ATGL et LHS). D’autre part ils montrent que le
prétraitement des adipocytes matures de manière aigue (1h30) ou chronique (24h), par ces
milieux conditionnés ne modifie ni la lipolyse basale, ni l’activité lipolytique stimulée par
72
l’isoprotenerol, le peptide natriurétique, la noradrenaline ou encore l’adénosine déaminase et
déterminée par le dosage du glycérol et des acides gras libres dans les milieux (certaines de
ces données ne sont pas montrées).
Nous montrons également que seuls les milieux conditionnés des lymphocytes
bloquent les effets de l’insuline sur certaines des principales enzymes de la lipogenèse: la
lipase des lipoprotéines (LPL pour lipoprotein lipase) et la synthase des acides gras (FAS pour
Fatty acid synthase). Ces effets sont associés à une diminution de l’expression de PIK3R1
(codant pour la sous-unité p85 de PIK, composant clé de la réponse à l’insuline) (195, 196) et
sont en partie inhibés en présence d’anticorps neutralisant anti-IFNγ. Ainsi l’IFNγ semble
être un médiateur potentiel des effets de lymphocytes sur le contrôle du métabolisme
adipocytaire et pourrait participer au développement de l’insulino-résistance via ses effets
inhibiteurs sur la régulation de la lipogenèse par l’insuline.
En résumé, cet article démontre que les lymphocytes présents dans le tissu adipeux
sont des lymphocytes T auxiliaires et cytotoxiques effecteurs et mémoires principalement
dont le nombre augmente avec l’obésité ainsi qu’avec la localisation viscérale. Ces
lymphocytes pourraient être recrutés au moyen de l’interaction CCL20/CCR6 et leur état pro-
inflammatoire via la production d’IFNγ, inhiberait la stimulation de la lipogenèse par
l’insuline. Ainsi, les lymphocytes pourraient participer au développement de l’insulino-
résistance liée à l’état inflammatoire chronique du tissu adipeux lors de l’obésité et ils
pourraient également jouer un rôle limitant dans le développement de la masse grasse.
73
Figure 16: Technique d’isolement des différentes populations cellulaires du tissu adipeux
humain
Digestion collagénase
SVF Adipocytes matures
TA
CD34+ Progéniteurs
Cellules capillaires
endothéliales
Billes anti-CD34
CD34-
Billes anti-CD14
CD14+
Macrophages
CD14 -
CD3+
Lymphocytes T
Billes anti-CD3
74
II Caractérisation phénotypique des lymphocytes du tissu adipeux
II 1 Facteurs potentiels impliqués dans la survie et/ou prolifération des
lymphocytes T
Afin de caractériser plus précisément le statut des lymphocytes T présents dans le
tissu adipeux, nous avons complété la caractérisation phénotypique par des expériences de
cytométrie en flux (Figure 17). L’analyse des marqueurs CD62L (L-sélectine permet
l’adressage aux tissus périphériques) et CCR7 (se lie à CCL19 et CCL21 (197) sur les cellules
endothéliales des ganglions lymphatiques (198, 199)) montre que moins de 10% de ces
lymphocytes sont positifs pour CD62L donc dans un état naïf (200) confirmant ainsi nos
précédents résultats obtenus avec le marqueur CD45RA. De plus, ces deux marqueurs nous
permettent de préciser le statut des cellules mémoires. Ce phénotype CD62L faible et CCR7-
correspond à des cellules effecteurs mémoires (TEM) qui sont infiltrées dans les tissus alors
que les lymphocytes mémoires centraux (TCM) sont CD62L+/CCR7+ (68).
Comme L’IL-7 est impliquée dans l’induction du phénotype mémoire, dans la survie
et la prolifération des lymphocytes T (201), nous nous sommes intéressés à l’expression de
son récepteur CD127 dans le tissu adipeux. En fait, plus de 50% des lymphocytes sont positifs
pour CD127, dont 15% sont CD8+CD127+. Les combinaisons d’anticorps utilisés pour la
cytométrie en flux ne nous ont pas permis d’utiliser les anticorps anti-CD4 en combinaison
avec CD127, CD8 et CD3. Toutefois, le nombre de cellules NKT étant très faible dans le tissu
adipeux humain, on peut penser que les 35% restants de CD3+ positifs pour CD127
représentent les cellules CD4+. Les travaux de Maury et al. ont récemment montré la présence
de l’IL-7 dans le tissu adipeux humain ainsi que son augmentation avec l’obésité (202). Nous
avons donc précisé sa spécificité d’expression par les autres cellules du tissu adipeux (Figure
18). Notre analyse montre que toutes les fractions cellulaires du tissu adipeux, excepté les
adipocytes, expriment l’IL-7.
75
L’IL-15 a été impliquée dans la survie et la prolifération des lymphocytes CD8+ (69,
203). Les résultats d’analyses de transcrits (Figure 18) montrent que ce sont les macrophages
qui expriment le plus d’IL-15 dans le tissu adipeux humain, en moyenne 7 fois plus que les
adipocytes matures et 9 fois plus que les cellules progénitrices. Les lymphocytes l’expriment
aussi en quantité moindre. Ces résultats pourraient donc partiellement expliquer la survie des
lymphocytes T CD4+ par l’IL-7 et CD8+ par l’IL-15. De plus, nos données révèlent aussi un
rôle potentiel des macrophages ainsi que des autres des cellules de la FSV dans la survie des
lymphocytes, suggérant l’existence d’interactions entre ces types cellulaires.
Il a été vu en introduction que la leptine avait des effets anti apoptotiques et pro-
proliférants sur les cellules immunitaires (164). Nous nous sommes donc intéressés à
l’expression génique de cette cytokine et de son récepteur. Nos résultats montrent que le
récepteur à la leptine est exprimé dans les lymphocytes T du tissu adipeux. Son expression est
augmentée avec l’obésité. De plus, les lymphocytes T isolés du tissu adipeux expriment la
leptine qui est régulée de manière positive avec l’IMC croissant (Figure 19). Ainsi la leptine
d’origine adipocytaire et dont la production augmente avec l’obésité pourrait maintenir les
lymphocytes T du tissu adipeux dans un état prolifératif. De plus, l’expression de leptine
décrite dans les Th1 (164) et que nous retrouvons dans cette étude pourrait réguler cette
activation et cette production de manière autocrine. Il est cependant à noter que l’expression
de la leptine par les lymphocytes du tissu adipeux est très inférieure à celle détectée dans les
adipocytes matures. Ces résultats sont à confirmer par des études de production de leptine par
les lymphocytes du tissu adipeux humain et par des approches in vitro sur le rôle de la leptine
dans le contrôle de la prolifération des lymphocytes.
76
CD127CD8/127CD62L CCR70
10
20
30
40
50
60%
de
cellu
les
CD
3+
Figure 17: Caractérisation des lymphocytes isolés du tissu adipeux humain par cytométrie en
flux
Les lymphocytes du tissu adipeux de patients d’IMC variés ont été isolés comme décrit dans
la figure 16, ils sont ensuite marqués à l’aide d’ anticorps couplés à des fluorochromes (FITC
antiCD127 et antiCD62L; PECy7 antiCCR7; APC antiCD8). Les résultats sont exprimés en
pourcentage de cellules positives ± SEM.
77
Figure 18: Expression d’IL-15 et d’IL-7 dans les différentes fractions du tissu adipeux humain
L’analyse des transcrits est déterminée par RT-PCR quantitative en temps réel. Les résultats
sont normalisés aux niveaux des 18S et exprimés comme 2∆CT×10000. L’IL-15 et l’IL-7 sont
analysées dans les adipocytes matures (AM n=5 et 4 respectivement), les cellules
endothéliales sanguines (CES n=5), les macrophages (MO n=15 et 5 respectivement), les
lymphocytes (LY n=5) et les cellules progénitrices (PROG n=4) fraîchement isolés du tissu
adipeux. Les résultats sont exprimés en moyennes ± SEM.
AM CES MO LY PROG0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
Exp
ress
ion
IL-7
(UA
)
AM CES MO LY PROG0.000
0.005
0.010
0.015
Exp
ress
ion
IL 1
5(U
A)
A B
78
Figure 19: Expression de la leptine et de son récepteur dans les lymphocytes sanguins et isolés
du tissu adipeux de patients d’IMC croissants
L’expression génique est déterminée par RT-PCR quantitative en temps réel. Les résultats
sont normalisés aux niveaux des 18S et exprimés comme 2∆CT×10000. Les lymphocytes isolés
du tissu adipeux (histogrammes noirs) sont classés selon l’IMC des sujets en normopondérés
(IMC≤25kg/m2 NP), surpoids (25≤IMC≤30kg/m2, SP) et obèses (IMC ≥30kg/m2, Ob). Les
lymphocytes isolés du sang sont représentés en blanc n=5.
Les résultats sont exprimés en moyennes ± SEM. Pour la leptine NP, n=12; SP, n=5 et Ob,
n=12, pour le récepteur à la leptine (Leptin-R) NP, n=5; SP, n=7 et Ob, n=11
* P<0.05 ** P<0.01 CD3+ du tissu adipeux versus sang.
Sang NP SP Ob0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
*
**
Exp
ress
ion
de
Lept
ine
(UA
)
Sang NP SP Ob0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35**
Exp
ress
ion
de L
eptin
-R(U
A)
A B
79
II.2 Expression de marqueurs d’activation et influence de l’état d’obésité
L’étude de l’effet de l’IMC sur la caractérisation phénotypique des lymphocytes T
isolés par immunosélection/déplétion à partir de tissu adipeux sous-cutané, montre des
résultats assez inattendus en terme de marqueurs pro-inflammatoires, (Figure 20). En effet, le
profil d’expression de TNFα, IFNγ, PRF-1 et RANTES présente une augmentation dans les
lymphocytes de tissus adipeux de patients en surpoids et présente chez les sujets obèses des
valeurs comparables aux sujets normopondérés. Ces données suggèrent l’existence d’un
processus inflammatoire classique de type Th1 qui présente un état maximal chez les sujets en
surpoids. Les lymphocytes T des sujets obèses, malgré leur accumulation plus forte,
expriment moins de marqueurs de polarisation Th1. Ces résultats démontrent que l’indice
d’adiposité module le phénotype des cellules T et suggère que les patients en surpoids
présenteraient une activation inflammatoire plus marquée que les patients obèses. Ces
résultats sont à confirmer sur des études regroupant plus de patients mais on peut émettre
l’hypothèse que l’obésité installée s’accompagne d’une inflammation chronique du tissu
adipeux et d’un phénotype particulier des cellules immunes. Cette particularité a déjà été
observée pour les macrophages du tissu adipeux dans notre laboratoire (185) (données non
publiées). Des études réalisées sur des cohortes de patients bien caractérisés en terme
d’historique de leur obésité et de leurs surpoids devraient permettre de relier durée de
l’obésité et/ou du surpoids et phénotype inflammatoire aigu ou chronique des cellules
immunes de leurs tissus adipeux. De façon intéressante, des données récentes montrent que
les tissus où siège une inflammation chronique sont hautement infiltrés par des lymphocytes
Th17 qui expriment des taux élevés de CCR6 à leur surface (204). Nos résultats montrent que
l’IL-17, cytokine principalement produite par les Th17 (52), est augmentée dans les
lymphocytes T isolés du tissu adipeux de patients obèses (Figure 21). Ces résultats nous
autorisent à penser qu’une partie des lymphocytes T du tissu adipeux des patients obèses
80
pourrait être constituée de lymphocytes Th17. Afin de déterminer réellement la présence d’un
phénotype Th17, l’expression d’autres marqueurs Th17 comme le facteur de transcription
RORγt (205) et l’IL-22 (204), pourrait être étudiée. On peut ainsi suggérer que le tissu
adipeux des patients en surpoids présentent des lymphocytes T majoritairement polarisés Th1
et donc pro-inflammatoires alors que le tissu adipeux des patients obèses expriment des
lymphocytes T de type Th17, moins inflammatoires mais marqueurs d’une inflammation
chronique. Les facteurs responsables d’une telle modulation du phénotype des lymphocytes T
du tissu adipeux avec l’index d’adiposité restent à être caractérisés.
81
Figure 20: Expression de marqueurs pro-inflammatoires dans les lymphocytes sanguins et
isolés du tissu adipeux de patients d’IMC croissants
L’expression génique est déterminée par RT-PCR quantitative en temps réel. Les résultats
sont normalisés aux niveaux des 18S et exprimés comme 2∆CT×10000. Les lymphocytes isolés
du tissu adipeux (histogrammes noirs) sont classés selon l’IMC des sujets en normopondérés
(NP n=12), surpoids (SP, n=7) et obèses (Ob, n=13). Les lymphocytes isolés du sang sont
représentés en blanc n=5.
Sang NP SP Ob0
5
10
15
20
*
*
**
Exp
ress
ion
de T
NF α
(UA
)
Sang NP SP Ob0
1
2
3
4
5
6**
* *
Exp
ress
ion
d'IF
N γ (
UA
)
Sang NP SP Ob0123456789 *
Exp
ress
ion
de P
RF
-1(U
A)
Sang NP SP Ob0
20
40
60
80
100
120
140
**
Exp
ress
ion
de R
AN
TE
S(U
A)
A
D
B
C
82
Figure21: Expression d’IL17 et de CCL20 dans les lymphocytes sanguins et isolés du tissu
adipeux
Les expressions géniques d’IL-17 et de CCL20 sont déterminées par RT-PCR quantitative en
temps réel. Les résultats sont normalisés aux niveaux des 18S et exprimés comme
2∆CT×10000. Pour IL-17, les lymphocytes isolés du tissu adipeux (LY histogrammes noirs)
sont classés selon l’IMC des sujets en normopondérés (NP, n=11), surpoids (SP, n=7) et
obèses (Ob, n=14). Pour CCL20 les lymphocytes sont isolés de tissu adipeux (histogrammes
noirs) de patients d’IMC variés (n=14).
Les lymphocytes isolés du sang sont représentés en blanc n=5.
Les résultats sont exprimés en moyennes ± SEM. * P<0.05 ** P<0.01 LY versus lymphocytes
sanguins
Sang LY0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.45 **
Exp
ress
ion
CC
L20
(AU
)
A B
Sang NP SP Ob0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125
0.150
**
**
Exp
ress
ion
IL-1
7 (
UA
)
83
II 3 Effets des lymphocytes sur les autres populations cellulaires du tissu
adipeux humain
Nous avons étudié les effets des facteurs solubles issus des lymphocytes sur les autres
partenaires cellulaires présents dans la fraction stroma-vasculaire plus particulièrement sur
l’adipogenèse des cellules progénitrices CD34+/CD31- natives du tissu adipeux humain
(Figure 22), ainsi que sur la régulation des transcrits macrophagiques. (Figure 23). Pour cela
les cellules fraîchement isolées du tissu adipeux par la méthode d’immunosélection/déplétion
décrite en figure 16 ont été traitées par des milieux conditionnés par les lymphocytes isolés du
tissu adipeux humain.
Nos résultats montrent que les milieux conditionnés par les lymphocytes du
tissu adipeux ont un effet anti adipogénique sur la différenciation des cellules progénitrices
(Figure 22). En effet, après 8 jours de traitement en milieu adipogénique, on observe une
diminution du contenu en triglycérides ainsi qu’une diminution de la quantité d’ADN des
cellules progénitrices dus à un effet anti-proliférant ou apopototique des sécrétions
lymphocytaires. De plus, l’expression des enzymes de la lipogenèse (LPL et FAS) est
également diminuée par ce traitement, ce qui suggère un effet anti-adipogénique des
lymphocytes sur les précurseurs des adipocytes. Ces résultats confirment ceux décrits sur la
lignée murine de préadipocytes 3T3-L1 (206). Il est maintenant nécessaire de déterminer si
cet effet anti-adipogénique est également médié par l’IFNγ comme cela a été décrit sur les
préadipocytes de rongeurs (207). Il serait donc intéressant de traiter directement des cellules
progénitrices en présence d’IFNγ et/ou par des milieux conditionnés en présence d’anticorps
neutralisant. Toutefois, sachant que l’insuline est nécessaire à la différenciation adipocytaire,
il est tentant de spéculer que les effets anti-adipogéniques des produits lymphocytaires
pourraient être reliés à une altération de la voie de signalisation de l’insuline. Ainsi, les
lymphocytes via leurs effets inhibiteurs sur la lipogenèse et l’adipogenèse pourraient
84
contribuer à la limitation de l’extension du tissu adipeux sous-cutané en diminuant ses
capacités de stockage et contribuer ainsi à la genèse des pathologies associées à l’obésité.
Enfin, les facteurs solubles produits par les lymphocytes isolés du tissu adipeux
augmentent de façon significative l’expression des marqueurs M1 (IL-23) comme M2 (IL-10)
et ont tendance à augmenter les marqueurs M1 (IL-6 et IL-1β) et le TGFβ (M1) dans les
macrophages du tissu adipeux (Figure 23). De manière intéressante, l’IL-23 et l’IL-1β ont été
décrites comme induisant «in vitro» un phénotype Th17 dans les lymphocytes humains, de
même que le TGFβ qui régule indirectement la voie Th17 en inhibant la polarisation en Th1
et/ouTh2 (208). Les milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux n’induisent
donc pas de phénotype M1 ou M2 particulier chez les macrophages du tissu adipeux.
Toutefois, il semble que ces macrophages «activés» par les sécrétions lymphocytaires
produisent un contexte cytokinique favorable à l’induction de cellules Th17 impliquées dans
l’inflammation chronique.
85
Figure 22: Effet des milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux sur la
différenciation des précurseurs adipocytaires
Photos représentatives des cellules progénitrices humaines (CD34+/CD31-) issues du tissu
adipeux cultivées pendant 8jours en conditions adipogéniques (A) en absence ou en (B)
présence de milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux humain (MC-LY). (C)
Les quantités de triglycérides (TG) et d’ADN ainsi que (D) les taux de transcrit de FAS et de
LPL des cellules progénitrices du tissu adipeux humain sont exprimées en moyennes ± SEM
des pourcentages du contrôle à J8 de traitement en conditions adipogéniques sans MC-LY
pour 3 expériences différentes avec 3 MC différents par expérience. Les différences sont
considérées comme significatives pour * P< 0.05, ** P < 0.01 versus contrôle.
A B
C D
TG ADN0
25
50
75
100
** *
% d
u co
ntrô
le
FAS LPL0
25
50
75
100
** **E
xpre
ssio
n gé
niqu
e(%
du
cont
rôle
)
86
Cont IL-6 IL-23 TGFβ IL-10 IL1β0
255075
100125150175200225 **
*
MC-LY
Exp
ress
ion
des
cyto
kine
s pa
r le
s M
O(%
du
cont
rôle
)
Figure 23: Effets des milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux sur les
régulations de transcrits des macrophages isolés du tissu adipeux
Les macrophages isolés du tissu adipeux sont traités pendant 24h avec des milieux contrôles
(Cont) ou bien conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux (MC-LY). Les taux de
transcrits des marqueurs M1 (IL-6 et IL-23) et M2 (IL-1β, IL-10 et TGFβ) sont ensuite
analysés par RT-PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés aux niveaux des 18S et
exprimés comme 2∆CT×10000. Ils sont exprimés en moyennes ± SEM des pourcentages des
cellules traitées par les milieux contrôles de 4 expériences distinctes. * P< 0.05, ** P < 0.01
versus contrôle.
87
III Cinétique d’accumulation des lymphocytes au sein du tissu adipeux et rôles
sur le développement de l’obésité
Article 2 : Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue during the
onset of obesity
Dans cet article, nous nous sommes intéressés au rôle des lymphocytes dans le
développement du tissu adipeux au cours de l’obésité. Dans un premier temps, nous avons
regardé comment évoluent les différentes cellules immunes au cours de l’induction de
l’obésité en débutant les observations à un stade très précoce de prise de poids. Dans un
second temps, nous avons regardé l’effet d’une déficience globale en lymphocytes sur le
développement de l’obésité. Pour cela, nous avons travaillé sur un modèle de souris
B6/RAG2(-/-) qui sont déficientes pour la RAG2 (Recombination activating gene 2), ces
souris n’ont pas la capacité d’initier la recombinaison VDJ et n’ont donc pas de lymphocytes
T et B matures (209). Ce modèle nous a permis d’étudier la prise de poids et le statut
métabolique de souris déficientes en lymphocytes et d’étudier les autres populations immunes
présentes dans le tissu adipeux.
Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue
during the onset of obesity
Carine Duffaut *, Jean Galitzky, Max Lafontan, Anne Bouloumié
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), U858, Toulouse, France
Université Toulouse III Paul-Sabatier, Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil, Equipe n�1 AVENIR, IFR31, Toulouse, France
a r t i c l e i n f o
Article history:
Received 30 April 2009
Available online xxxx
Keywords:
Lymphocytes
Macrophages
NK cells
Immunodeficient mice
High fat diet
Insulin resistance
Innate cells
Adaptive cells
a b s t r a c t
The primary inflammatory events occurring in the adipose tissue (AT) during high fat diet (HFD)-induced
obesity are poorly defined. The present study was undertaken to characterize, in wild-type(+/+) and
lymphocyte deficient RAG2(�/�) mice under HFD, the changes in AT immune cells by flow cytometry
analyses. In (+/+) mice, early accumulation of AT B-cells was observed, followed by increased AT T-cell
numbers and finally by the appearance of insulin resistance and AT macrophage accumulation. Lack of
lymphocytes in the RAG2(�/�) mice did not affect the onset of obesity and the state of insulin resistance.
However, a striking accumulation of AT NK cells and activated macrophages was detected. The present
study demonstrates that AT is the site of an unexpected dynamic in innate and adaptive cells during
diet-induced obesity and insulin resistance. Moreover it appears that early AT lymphocyte infiltration
could be considered a protective process to temper adipose tissue inflammation.
� 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.
Introduction
Inflammation is now considered a common link between obes-
ity and type 2 diabetes [1]. Several studies performed on a mouse
model of diet-induced or genetic obesity as well as in humans have
demonstrated that increased adipose tissue mass is associated
with a moderate elevation in the plasma levels of several markers
of inflammation. Moreover, in the obese state, adipose tissue pro-
duces more chemokines as well as pro-inflammatory cytokines
that are known to interfere with insulin signaling [2]. Finally, in
mice models of obesity as well as in humans, macrophages accu-
mulation within the adipose tissue itself has been demonstrated
together with the recently described increase in adipose tissue
T-lymphocytes [3]. Altogether, these observations have led to the
concept that the inflammatory process occurring within the adi-
pose tissue may contribute to the settlement of a systemic and
chronic low-grade inflammatory state responsible for insulin resis-
tance and ultimately type 2 diabetes [4]. However, few data are
available concerning the early primary inflammatory events occur-
ring within the fat depots during the onset of diet-induced obesity.
The present study was undertaken to characterize the changes in
the major immune cells (macrophages, T- and B-lymphocytes
and NK cells) in adipose tissue of wild-type C57BL/6 mice under
a high fat diet (HFD) during the onset of obesity and insulin resis-
tance. To further define the possible role of lymphocytes in the
initiation of the obesity-associated inflammation, mice with no
B- and T-lymphocytes due to RAG-2 deficiency (B6RAG2 �/�) were
investigated under normal diet (ND) and HFD.
Material and methods
Materials. Chemicals were purchased from Sigma (Saint-Quen-
tin Fallavier, France). Collagenase worthington was purchased from
Serlabo Technologies (Entraigues, France). Antibodies for flow
cytometry analysis were purchased from BD Biosciences (Le Pont
de Claix, France) or AbD serotec (Oxford UK).
Animals. Animals were handled in accordance with the princi-
ples and guidelines established by the National Institute of Medical
Research. C57BL6/J mice were obtained from Charles River Labora-
tory (l’Arbresle, France). Mice deficient in RAG2 (B6RAG2(�/�))
were kindly provided by Dr. Van Meerwijk (U563 INSERM, Tou-
louse, France). Mice were housed conventionally in a constant tem-
perature (20–22 �C) and humidity (50–60%) animal room, with a
12/12 h light/dark cycle (lights on at 8:00 am) and free access to
food and water. Mice were assigned to ND (C57BL6/J n = 16,
RAG2(�/�) n = 11) and HFD (C57BL6/J n = 15, RAG2(�/�) n = 11)
(DIO Research diet, Jackson Laboratory, Brogaarden, Denmark) for
3, 6 and/or 12 weeks. Due to the weak fertility of RAG2(�/�) mice,
0006-291X/$ - see front matter � 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.bbrc.2009.05.002
* Corresponding author. Address: Equipe AVENIR/INSERM, U858, Hôpital Rangueil
Bat L4, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 04, France. Fax: +33 (0) 5 61 32 56 21.
E-mail address: [email protected] (C. Duffaut).
Biochemical and Biophysical Research Communications xxx (2009) xxx–xxx
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Biochemical and Biophysical Research Communications
journal homepage: www.elsevier .com/locate /ybbrc
ARTICLE IN PRESS
Please cite this article in press as: C. Duffaut et al., Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue during the onset of obesity, Biochem.
Biophys. Res. Commun. (2009), doi:10.1016/j.bbrc.2009.05.002
the animals were studied only after 12 weeks of diet. Energy con-
tents of the specific diets were (% kcals): 20% protein, 70% carbohy-
drate, and 10% fat for ND; 20% protein, 35% carbohydrate, and 45%
fat for HFD. At 3, 6 and 12 weeks of either diet, an intra-peritoneal
glucose tolerance test (1 g glucose/kg body weight) was performed
after the deprivation of food overnight and the time course of gly-
cemia was measured in the tail vein for 240 min with a glucometer
(Accu-Chek� Roche France). At 3, 6 and 12 weeks, the body compo-
sition was determined by quantitative magnetic resonance using
an EchoMRI-100TM 3 in 1 (Echo Medical Systems, Houston TX).
At 3, 6 and/or 12 week of either diet, mice were sacrified by cervi-
cal dislocation and epididymal adipose tissues were taken and
weighed.
Isolation of the stroma-vascular fraction (SVF) from adipose tissue
(AT) and flow cytometry analyses. The SVF cells were obtained by
collagenase digestion of the adipose tissue as previously described
[5]. After digestion, the suspension was filtered 150 lm filter and
centrifuged (100g, 10 s) to collect the infranatant containing the
SVF. The lower phase was centrifugated at 400g for 10 min and
the pellet containing the SVF was incubated for 10 min in erythro-
cyte-lysing buffer (155 mM NH4Cl, 5.7 mM K2HPO4 and 0.1 mM
EDTA), filtered through 40 lm filters and centrifugated again
(400g, 10 min). The pellet was then resuspended in PBS containing
2 mM EDTA and 0.5% bovine serum albumin and the total number
of cells was counted using trypan blue (Gibco, Courbevoie, France)
and a neubauer hematocytometer (Poly Labo, Paul Block & Cie,
Starsbourg, France). The cell count was confirmed by DNA determi-
nation using fluorimetric assay (Picogreen, Invitrogen Cergy
Pontoise, France). 100 000 cells of the SVF were incubated with
FITC-conjugated antibodies (CD4, F4/80), PE-conjugated antibody
CD3, PerCP conjugated antibody CD45, PerCP–Cy5.5 conjugated
antibody CD11b, APC-conjugated antibody (CD8, CD19 and
NK-1.1) and respective isotype control. Analyses were performed
using a FACSCalibur flow cytometer and the CellQuest Pro software
(BD Bioscience). The total number of each leukocyte population
present in the AT depot was calculated as a product of the percent-
age of each cell type determined by the flow cytometry analyses
and the total number of SVF cells.
Statistical analysis. Values are given as mean ± SEM for (n) sep-
arate experiments. Comparisons between groups were analysed
by ANOVA for experiments with more than two subgroups
followed by post hoc tests and the non-parametric Mann–Whit-
ney test or Student’s t test, when appropriate (Prism 4, GraphPad
Software, USA). Differences were considered significant when
P < 0.05.
Results
Lack of lymphocytes does not alter the onset of obesity and insulin
resistance
Wild-type and RAG2(�/�) male mice fed under normal or high
fat diet for 12 weeks exhibited similar weight gain (Fig. 1A). In
wild-type mice, the total body fat mass assessed by EchoMRI sta-
tistically increased after 6 weeks HFD (2-fold-increase, Fig. 1B).
After 12 weeks, both wild-type and RAG2(�/�) exhibited a similar
increase in total body fat mass when fed under HFD compared to
ND (3.3-fold increase, Fig. 1B). The epidydimal adipose tissues of
wild-type mice exhibited a marked increase in weight after
6 weeks HFD that was further enhanced after 12 weeks and was
identical to that observed in RAG2(�/�) mice (Fig. 1C). Glucose tol-
erance tests clearly showed the progressive development of insulin
resistance in wild-type mice under HFD (Fig. 2). Indeed, the area
under the curve of the glycemia concentration exhibited a time-
dependent increase in mice under a high fat diet that was statisti-
cally significant compared to animals fed with normal chow after
0 2 4 6 8 10 120.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
RAG2-/- ND+/+ ND
+/+ HFDRAG2-/- HFD
Time (weeks)
Body w
eight
gai
n (
g)
0
1000
2000
3000
3 6 12
Weeks
*
**
**
+/+ RAG2-/-+/+ +/+
Epid
ydim
al d
epot
(mg)
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
3 6 12
Weeks
*
**
**
+/+ RAG2-/-+/+ +/+
Bo
dy
fat
mas
s (g
)
A
B
C
Fig. 1. Onset of diet-induced obesity in wild-type and RAG2(�/�) mice under high
fat diet. (A) Body weight gain of wild-type(+/+) and RAG2(�/�) mice under high fat
diet (HFD filled symbol) or normal diet (ND open symbol) for 12 weeks. Values are
means ± SEM ((+/+) n = 15; RAG2(�/�) n = 11). (B) Body fat mass determined by
quantitative magnetic resonance and (C) epidydimal fat pad weight of wild-type fed
under normal (ND, open bars) and HFD (filled bars) for 3, 6 and 12 weeks (n = 5),
and of RAG2(�/�) mice after 12 weeks ND or HFD (hatched open and filled bars,
respectively, n = 11). Values are means ± SEM, *P < 0.05; **P < 0.01 HFD versus ND.
0
5.0×10 3
1.0×10 4
1.5×10 4
2.0×10 4
2.5×10 4
3 6 12
Weeks
*
+/+ RAG2-/-+/+ +/+
*
Gly
cem
ia
Are
a under
the
curv
e
Fig. 2. Glucose tolerance in wild-type and RAG2(�/�) mice under high fat diet.
Intra peritoneal glucose tolerance tests were performed in wild-type mice fed under
normal (ND, open bars) and HFD (filled bars) for 3, 6 and 12 weeks (n = 5), and in
RAG2(�/�) mice after 12 weeks ND or HFD (hatched open and filled bars,
respectively, n = 9). *P < 0.05; **P < 0.01 HFD versus ND.
2 C. Duffaut et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications xxx (2009) xxx–xxx
ARTICLE IN PRESS
Please cite this article in press as: C. Duffaut et al., Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue during the onset of obesity, Biochem.
Biophys. Res. Commun. (2009), doi:10.1016/j.bbrc.2009.05.002
12 weeks. The RAG2(�/�) mice fed for 12 weeks under HFD exhib-
ited similar insulin resistance than the wild-type mice (Fig. 2).
Lack of lymphocytes is associated with the promotion of the
accumulation of innate cells within the adipose tissue
Flow cytometry analyses were performed on the stroma-vascu-
lar fraction (SVF) obtained after collagenase digestion of adipose
tissues using CD19 as B-lymphocyte marker, both CD45 and CD3
to identify T-lymphocytes, the combination of CD11b and F4/80
as markers of activated macrophages and NK1.1 as a specific mar-
ker of natural killer cells. Adaptive immune B and T cells repre-
sented the minor populations of immune cells present in the fat
depots of wild-type mice. B-lymphocytes increased after 3 weeks
of HFD (3-fold increase in epidydimal compared to ND) and
remained at similar levels for the next 9 weeks of HFD (Fig. 3A).
T-lymphocyte numbers were enhanced after 6 weeks HFD (3-fold
increase in epidydimal compared to ND) but decreased in the fol-
lowing 6 weeks of HFD (Fig. 3B). The numbers of macrophages
were not modified during the first 6 weeks of diet but were mark-
edly increased after 12 weeks HFD compared to ND (1.8-fold in-
crease, Fig. 3C). The numbers of NK cells were not statistically
modified by the diet (Fig. 3D).
In RAG2(�/�) mice, flow cytometry analyses demonstrated as
expected the absence of B and T-lymphocytes within the SVF of
the fat depots (Fig. 3A and B). A marked accumulation of activated
macrophages was observed under HFD (3.6-fold increase com-
pared to ND, Fig. 3C). Moreover RAG2(�/�) mice under HFD exhib-
ited a 4-fold increase in AT macrophage number compared to
12 weeks HFD wild-type mice (Fig. 3C). The number of NK cells
was strongly increased under HFD (4.4-fold increase compared to
ND, Fig. 3D). Moreover, RAG2(�/�) mice under HFD exhibited a
9-fold increase in AT NK number compared to 12 weeks HFD
wild-type mice (Fig. 3D).
Discussion
Studies on the inflammatory process in obesity and insulin
resistance have mainly focused on the cells from the innate system
andmore specifically on macrophages. Indeed, mostly by the use of
immunohistochemical analyses and macrophage-specific tran-
script expression analyses, it has been established that long-term
HFD diet (20 weeks or more) is associated with an accumulation
of proinflammatory macrophages within adipose tissue and insulin
resistance [6,7]. Our studies performed in humans using flow
cytometry showed a body mass index-dependent increase in mac-
rophage number within the subcutaneous [5] as well as visceral [8]
adipose tissues. Since treatments with anti-diabetic drugs [6] and
mice deficient in chemokines or chemokine receptors [9,10] in-
volved in the recruitment of blood monocyte into tissues were
shown to affect both adipose tissue macrophage inflammatory
phenotype and insulin sensitivity, it was concluded that the accu-
mulation of adipose tissue inflammatory macrophages in the obese
state was a major event involved in insulin resistance. These re-
sults were also supported by a decreased number of inflammatory
cells after weight loss and parallel improvement in metabolic
parameters observed in humans [11]. Several recent studies shed
new light on another immune cell subset belonging to the adapta-
tive immune system, namely the T-lymphocytes. Indeed, the stud-
ies of Caspar-Bauguil et al. [12] have clearly described the distinct
lymphocytes subtypes present in fat depots. Recently, the work of
Kintscher et al. [3] have shown mostly by the use of immunohisto-
chemistry and gene expression analyses that T-lymphocyte spe-
cific markers are increased in mice fed under HFD. This precedes
the appearance of enhanced macrophage-specific markers and
was concomitant with the development of glucose intolerance. In
agreement with such observations, the results obtained in the
present study show that the accumulation of T-lymphocytes, iden-
tified by flow cytometry analyses, occurs after 6 weeks of HFD in
mice exhibiting a slight glucose intolerance. The T-lymphocyte
accumulation preceded the increase in macrophages detected after
0
1.5×10 4
3.0×10 4
4.5×10 4
3 6 12
Weeks
*
+/+ RAG2-/-+/+ +/+
*
AT
B l
ym
ph
ocy
tes
(Nu
mb
er/d
epo
t)
0
3.0×10 4
6.0×10 4
9.0×10 4
3 6 12
Weeks
+/+ RAG2-/-+/+ +/+
*
AT
T l
ym
ph
ocy
tes
(Nu
mb
er/d
epo
t)
0
2.5×10 5
5.0×10 5
7.5×10 5
1.0×10 6
3 6 12
Weeks
+/+ RAG2-/-+/+ +/+
*
**
*
AT
mac
rop
hag
es
(Nu
mb
er/d
epo
t)
0
3.0×105
6.0×105
9.0×105
3 6 12
Weeks
+/+ RAG2-/-+/+ +/+
**
**
AT
NK
cel
ls
(Nu
mb
er/d
epo
t)
A
B
C
D
Fig. 3. Immune cells present in adipose tissues in wild-type and RAG2(�/�) mice
under high fat diet. Multicolour FACS analyses were performed on the AT stroma-
vascular fraction (SVF) from wild-type(+/+) fed under normal (ND, open bars) and
HFD (filled bars) for 3, 6 and 12 weeks (n = 5), and in RAG2(�/�) mice after
12 weeks ND or HFD (hatched open and filled bars, respectively, n = 9). (A) Numbers
of AT CD19+ B-lymphocytes, (B) number of AT CD45+/CD3+ T-lymphocytes, (C)
number of F4/80+/CD11b+ AT macrophages and (D) number of AT NK1.1+ NK cells.*P < 0.05; **P < 0.01 HFD versus ND; RAG2(�/�) versus +/+.
C. Duffaut et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications xxx (2009) xxx–xxx 3
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Please cite this article in press as: C. Duffaut et al., Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue during the onset of obesity, Biochem.
Biophys. Res. Commun. (2009), doi:10.1016/j.bbrc.2009.05.002
12 weeks of HFD. Whereas the initial accumulation of T-lympho-
cytes was due to an active recruitment, enhanced retention and/
or increased proliferation of T-lymphocytes within the adipose tis-
sue remains to be clearly established. However, the other major
cell population involved in adaptive immune response, i.e. the B
cells, was found to accumulate into the fat pads as early as 3 weeks
after initiation of HFD, before any statistical modulation of fat
mass. The presence of B cells in the murine fat depots has already
been documented [12] but no study has been dedicated to the po-
tential early changes in adipose tissue B cells with HFD. It is thus
tempting to speculate that the HFD per se in mice induces an initial
early adaptive cell-mediated immune reaction within the adipose
tissue that is, once resolved and/or exceeded as a consequence of
the chronic HFD treatment, followed by the activation of the innate
system.
Two recent studies have suggested that adipose tissue T-lym-
phocytes might be involved in the recruitment of adipose tissue
macrophages through their production of interferonc (IFNc), a typ-
ical Th1 type cytokine [3,13]. Therefore, to further analyse the
respective contribution of adipose tissue lymphocytes in macro-
phage accumulation and genesis of insulin resistance, we studied
mice deficient in functional T-and B-lymphocytes, i.e. RAG2(�/�)
mice. After 12 weeks HFD, the RAG2(�/�) mice exhibited a similar
gain in total fat and adipose mass and insulin resistant state than
the wild-type mice. It is therefore suggested that the adaptive cells
alone are not necessary for the initiation of obesity-associated
insulin resistance, in agreement with the recent study published
during the preparation of the paper [14]. Interestingly, the lack of
T-and B-lymphocytes was associated with a dramatic increase of
cells from the innate system, both NK cells and macrophages, with-
in the adipose tissue. Though primarily considered as an integral
part of the innate immune response with potent cytotoxic effector
functions, NK cells also produce chemokines and cytokines such as
IFNc and TNFa [15]. Such products might thus be involved in mac-
rophage recruitment and genesis of insulin resistance. Although
the exact role of the NK cells in macrophage recruitment and the
mechanisms responsible for accumulation of NK cells under HFD
remain to be defined, the present results demonstrate that the lack
of B- and T-lymphocytes promotes a marked innate immune reac-
tion within the adipose tissue. A study performed in various strains
of immunodeficient mice, including RAG mice, has shown that the
lack of lymphocytes was associated with an over reaction of innate
immunity and, more particularly, NK cells [16]. Based on these
observations, it was suggested that lymphocytes may act as nega-
tive regulator of the innate system to control for an unwanted
excessive inflammatory response. It is thus tempting to speculate
that the early lymphocyte infiltration within the adipose tissue
that was observed in wild-type mice might be considered a protec-
tive and specific process to temper the HFD-induced adipose tissue
inflammation, rather than a positive reinforcement to the innate
response.
In conclusion, the present study demonstrates that the adipose
tissue is the site of an unexpected dynamic in immune cell traffick-
ing during the onset of diet-induced obesity and insulin resistance.
It involves both adaptive B and T immune cells as well as innate NK
cells and macrophages. Therefore, the settlement of the inflamma-
tory profile described during the onset of diet-induced obesity and
the relative roles of the adaptive and innate cells are certainly more
complex and dynamic than previously suspected. Moreover, the
clear delineations between early and late inflammatory events tak-
ing place within the adipose tissue as a consequence of acute and
chronic changes of diet, obesity and/or insulin resistance are re-
quired to definitively understand the relative role of adipose tissue
immune cells.
Acknowledgments
This study was supported by grants from the INSERM (AVENIR),
Agence Nationale de la Recherche (ANR ‘‘RIOMA”), Seventh Frame-
work Programme of the European Community (EC) for research
(FP7 ADAPT) and Pierre Fabre Laboratories. We thank the staff of
the animal facilities (IFR31, Toulouse, France) and the functional
exploration team (S. Le Gonidec, IFR31, Toulouse, France). The
authors thank Dr. Dylan Thompson (University of Bath, UK) for
his critical reading of the paper.
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4 C. Duffaut et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications xxx (2009) xxx–xxx
ARTICLE IN PRESS
Please cite this article in press as: C. Duffaut et al., Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue during the onset of obesity, Biochem.
Biophys. Res. Commun. (2009), doi:10.1016/j.bbrc.2009.05.002
88
Discussion de l’article 2:
Les résultats obtenus montrent une dynamique assez complexe des cellules immunes
dans le tissu adipeux des souris au cours de la prise de poids. L’accumulation des
lymphocytes T a été décrite pour être un évènement précoce dans le développement de
l’obésité qui précède l’entrée des macrophages et correspond à l’installation de
l’insulinorésistance (210). Dans notre étude, nous mettons en évidence une accumulation plus
précoce des lymphocytes B à 3 semaines de régime enrichi en lipides qui précède celle des
lymphocytes T à 6 semaines. A 12 semaines, lorsque l’obésité et l’insulinorésistance sont
présentes, ce sont les macrophages qui augmentent dans le tissu adipeux épididymaire tandis
que les cellules NK ne varient pas de manière significative. Ces résultats ne confirment pas
exactement les premières études de cytométrie sur les lymphocytes dans le tissu adipeux dans
lesquelles 12 semaines de régime enrichi en lipides ne modifiaient pas les pourcentages de
lymphocytes T et diminuaient le pourcentage de cellules NK (211). Cependant, notre manière
d’exprimer les données n’est pas similaire. En effet, dans cette étude, les auteurs exprimaient
leurs résultats en pourcentage des cellules de la fraction stroma-vasculaire alors que nous
exprimons les nôtres en nombre par dépôt entier. Nous pensons en effet qu’il est plus
représentatif de ramener les pourcentages obtenus au nombre total de cellules de la fraction
stroma-vasculaire par dépôt adipeux entier. Ceci permet d’évaluer dans le dépôt, la
dynamique des cellules immunes indépendamment des autres cellules de la fraction stroma-
vasculaire, cellules endothéliales et cellules progénitrices et indépendamment de l’état
d’hypertrophie et/ou d’hyperplasie adipocytaire. Les résultats que nous avons obtenus
suggèrent donc que le trafic des cellules immunes dans le tissu adipeux lors de l’établissement
de l’obésité induite par un régime hyperlipidique est plus complexe que celui décrit. Il reste à
déterminer si ces modulations de nombre de cellules sont dues à un recrutement actif et/ou
prolifération et/ou apoptose et/ou une émigration cellulaire et à déterminer les mécanismes
89
impliqués. De plus, il conviendra de déterminer si ces modulations cellulaires sont liées à
l’obésité per se et/ ou au régime. En effet, des études récentes suggèrent que le LPS associé au
régime enrichi en lipide pourrait être à l’origine d’une inflammation du tissu adipeux (212).
Les études de Kintscher et al. ont proposé l’hypothèse d’un rôle primaire des
lymphocytes dans l’établissement de l’état inflammatoire du tissu adipeux avec l’obésité
(210). De plus, les études de Rocha et al. ont suggéré que les lymphocytes via leur production
d’IFNγ stimuleraient la production de facteurs chemoattractants des macrophages par les
adipocytes et les préadipocytes (213). Afin d’étudier le rôle potentiel des lymphocytes sur le
recrutement des macrophages dans le tissu adipeux avec l’obésité, nous avons évalué l’effet
de la déficience en lymphocytes, chez les souris B6/RAG2(-/-), sur le développement de
l’inflammation dans le tissu adipeux au cours de la mise en place de l’obésité et de la
résistance à l’insuline. Les souris déficientes en lymphocytes ont à 12 semaines de régime
enrichi en lipides, une prise de poids et une tolérance au glucose comparables à leurs
homologues sauvages. Cependant, la déficience en lymphocytes, confirmée par cytométrie en
flux, dans le tissu adipeux s’accompagne d’une augmentation massive de cellules NK et de
macrophages. Ces résultats suggèrent donc que la présence des lymphocytes n’est pas
nécessaire à l’installation de l’obésité et de l’insulinorésistance et sont en accord avec les
travaux récents de Sultan et al. (214). Cependant, des mesures complémentaires seraient
nécessaires, plus particulièrement sur l’expression de facteurs inflammatoires dans le tissu
adipeux des souris RAG2(-/-) et des souris sauvages en régime hyperlipidique afin de
déterminer si l’augmentation marquée du nombre des cellules du système inné s’accompagne
ou non d’un développement plus marqué d’un phénotype inflammatoire associé à l’obésité
comparé à celui des animaux sauvages. De plus, une étude permettant de suivre plus
longtemps les animaux en régime hyperlipidique, devrait permettre de déterminer si cette
90
augmentation des cellules innées dans le tissu adipeux s’associe avec une apparition plus
rapide d’un diabète de type 2.
Enfin, le rôle des cellules NK reste à définir. Deux hypothèses peuvent être posées:
• Les cellules NK compensent la déficience en lymphocytes. En effet, il a été
décrit que la déficience en lymphocytes dans différents modèles murins (215,
216) s’accompagne d’une compensation par les cellules NK qui seraient
capables de jouer le rôle de lymphocytes mémoires et à reconnaissance
spécifique en répondant à une stimulation antigénique plus classique (215). De
plus, les cellules NK sont capables de produire des cytokines pro-
inflammatoires, comme les lymphocytes T activés, telles que l’IFNγ et le
TNFα (217). Il serait donc intéressant d’analyser la présence potentielle de
macrophages dans le tissu adipeux de souris déficientes en cellules NK afin de
déterminer si les cellules NK ont un rôle dans le recrutement des
macrophages. De plus l’analyse du nombre et de la taille des adipocytes
matures isolés de ces souris ainsi que de leurs capacités lipolytiques et
lipogéniques pourrait nous indiquer si l’absence de cellules NK provoque une
altération du métabolisme adipoctyaire.
• Les lymphocytes ont un rôle freinateur sur la réponse innée et en leur absence
une réponse innée excessive se développe. Cette hypothèse a été posée par
l’équipe de Kim et al. à partir d’observations réalisées sur des modèles de
souris immunodéficientes. Dans ces souris, en l’absence de lymphocytes, se
développe une réaction innée excessive due à la production massive de
cytokines par les cellules NK et dendritiques (218). Ainsi dans nos modèles,
RAG2(-/-) en régime hyperlipidique, la réponse innée non tempérée par la
réponse adaptative pourrait se développer de manière excessive.
91
Partie 3 : Conclusion générale
et perspectives
92
I Identification des lymphocytes du tissu adipeux humain
Ce travail de thèse avait pour premier objectif de caractériser les lymphocytes du tissu
adipeux humain. Ces travaux ont mis en évidence que les populations de lymphocytes
présentes dans le tissu adipeux humain sont principalement des lymphocytes T (CD3+)
auxiliaires (CD4+) et cytotoxiques (CD8+). Les lymphocytes B, identifiés par le marqueur
CD19, et les cellules NKT (CD3+/CD56+) sont détectés à de très faibles niveaux dans le tissu
adipeux. Quant aux lymphocytes de l’immunité innée, NK et γδ, ils sont également présents
dans de faibles proportions. Les lymphocytes T sont des effecteurs (CD45RO-RA-) et des
mémoires (CD45RO+). Nous avons également montré que les nombres de lymphocytes T
CD4+ et CD8+ du tissu adipeux sont positivement corrélés avec l’indice de masse corporelle
(IMC) comme index d’adiposité. En revanche, cet indice n’est pas associé à une modification
du nombre de cellules NK et NKT au sein du tissu adipeux. Le nombre de lymphocytes T est
également augmenté dans le tissu adipeux viscéral par rapport au tissu sous-cutané chez les
obèses morbides. Les CD4+ mémoires ainsi que les CD8+ effecteurs et mémoires
s’accumulent préférentiellement dans le tissu adipeux interne.
Enfin il serait intéressant d’étudier l’influence de l’index d’adiposité des patients sur le
nombre de lymphocytes T et de sous-types de cellules mémoires et effectrices.
II Accumulation des lymphocytes T dans le tissu adipeux humain
L’accumulation des lymphocytes au cours de l’obésité pourrait s’expliquer par un
recrutement, une prolifération ou une anti-apoptose des lymphocytes dans le tissu adipeux.
Nous avons montré que le tissu adipeux produit des chimiokines de lymphocytes comme
CCL20 ou encore RANTES qui sont connues pour influencer le recrutement des lymphocytes
93
aux lieux d’infection (192-194, 206). CCL20, via son interaction avec son récepteur CCR6,
dont nous avons montré l’expression spécifique par les lymphocytes du tissu adipeux humain,
pourrait influencer le recrutement actif des lymphocytes au sein du tissu adipeux. En effet,
son expression dans l’adipocyte mature est augmentée chez les patients obèses par rapport aux
patients normo-pondérés et est plus forte dans les adipocytes viscéraux que sous-cutanés. Il
est cependant nécessaire de confirmer ces résultats avec des approches permettant de
quantifier les protéines correspondantes à l’aide d’ELISA sur des milieux conditionnés par les
adipocytes matures et d’analyses par cytométrie en flux sur les lymphocytes isolés du tissu
adipeux. De plus, nos résultats montrent que les macrophages du tissu adipeux pourraient
augmenter l’expression de CCL20 dans l’adipocyte et suggèrent donc que les macrophages
pourraient indirectement participer au recrutement des lymphocytes.
Par ailleurs, l’accumulation de lymphocytes pourrait être due à une prolifération active
des lymphocytes résidents dans le tissu. De fait, nous avons montré que les cellules de la
fraction stroma-vasculaire expriment de l’IL-7 qui est impliquée dans l’induction du
phénotype mémoire, dans la survie et la prolifération des lymphocytes T (201). De plus, nos
résultats de cytométrie en flux montrent que plus de 50% des lymphocytes du tissu adipeux
humain expriment le récepteur à l’IL-7. Nous avons également montré que les macrophages
expriment également de l’IL-15 qui favorise la prolifération et la différenciation des
lymphocytes T CD8+ (69). Pour finir, le tissu adipeux est le site principal de production de la
leptine dont les propriétés pro-proliférantes sur certains types de lymphocytes et anti-
apoptotiques ont été décrites (164). Ainsi, les lymphocytes du tissu adipeux humain sont donc
dans un contexte cytokinique favorisant leur prolifération et limitant leur apoptose qui
pourrait participer à l’expansion de cette population.
Des test de prolifération in vitro sur les lymphocytes isolés du tissu adipeux nous
renseigneraient de manière plus précise sur l’effet in situ des ces différentes cytokines.
94
III Caractérisation phénotypique des lymphocytes du tissu adipeux humain
L’approfondissement du phénotype des lymphocytes auxiliaires montre qu’ils ne sont
pas Th2, l’absence d’expression d’IL-4 excluant cette voie. Ces lymphocytes sont plutôt
engagés dans une voie Th1 (ils expriment IL-2 et IFNγ et produisent IFNγ) qui semble
prédominante chez les patients en surpoids. Chez les obèses un nouveau phénotype Th17
pourrait apparaître puisque certains de ces lymphocytes expriment de l’IL-17. Il aurait été
intéressant d’étudier les variations de phénotype liées à la localisation, malheureusement les
très faibles quantités de lymphocytes isolés de tissu adipeux sous-cutané et viscéraux des
patients obèses morbides n’ont pas permis cette étude.
Les polarisations en Th1 et Th17 dépendent, comme nous l’avons vu en introduction,
d’un contexte cytokinique très précis (45). Les autres cellules présentes au sein du tissu
adipeux peuvent donc influencer ces polarisations. Nos résultats montrent que les
macrophages du tissu adipeux traités par les sécrétions lymphocytaires expriment de l’IL-23
et de l’IL-1β reconnus pour stimuler chez l’homme la voie Th17 (219), et du TGFβ qui
participe à l’initiation la voie Th17 de manière indirecte en inhibant les autres types de
polarisation (208).
Des travaux complémentaires sont nécessaires afin de préciser par détection
intracellulaire la production d’IL-17 en cytométrie en flux et d’analyser les effets de milieux
conditionnés par les macrophages mais également par les adipocytes sur le phénotype des
lymphocytes.
95
IV Rôle des lymphocytes dans le tissu adipeux
Au niveau histo-morphologique, les lymphocytes sont organisés dans le tissu adipeux
en amas de cellules immunes à proximité des macrophages et des adipocytes comme le
suggèrent nos résultats d’immunohistofluorescence ainsi que la littérature (188, 210). Ces
contacts étroits au sein du tissu adipeux nous ont conduits à regarder les effets des
lymphocytes sur les adipocytes et les macrophages via leur production de facteurs solubles.
Nous avons montré que les lymphocytes influençaient l’expression de marqueurs
macrophagiques M1 (IL-23) comme M2 (IL-10), on peut donc supposer qu’ils ne jouent pas
un rôle direct sur la polarisation des macrophages mais plutôt un rôle indirect sur leur propre
polarisation via l’expression de cytokines qui pourrait les induire dans une voie plutôt qu’une
autre.
Ces produits solubles affectent également les cellules progénitrices en inhibant leur
différenciation. Ces observations sont en accord avec les études de Wu et al. montrant que la
différenciation des précurseurs adipocytaires murins 3T3-L1 était inhibée en présence de
lymphocytes T activés (206). Enfin, les sécrétions lymphocytaires ont un effet anti-
lipogénique via l’inhibition de l’effet de l’insuline sur les enzymes de la lipogenèse. Cet effet,
reversé par un anticorps neutralisant anti-IFNγ, semble du à l’IFNγ sécrété par les
lymphocytes. Ces résultats nous autorisent à penser que les lymphocytes dans le tissu adipeux
pourraient, en inhibant des voies métaboliques dépendantes de l’insuline, participer au
développement de l’insulinorésistance associée à l’état inflammatoire du tissu adipeux.
Il n’est pas exclu que les effets des lymphocytes puissent impliquer des interactions
cellule/cellule au sein des amas cellulaires. De fait, les adipocytes expriment le CD40 et son
activation par le CD40L exprimé par les lymphocytes altère le métabolisme de l’adipocyte en
inhibant l’expression des gènes de la lipogenèse et en activant la lipolyse (188).
96
Nos expériences de microscopie révèlent que ces amas de cellules immunes sont
localisés au contact de certains adipocytes dans le tissu adipeux. Ce résultat est en accord avec
les études histo-morphologiques de Cinti et al. qui avaient déjà révélé que les macrophages se
localisaient en couronne autour des adipocytes nécrotiques (220).
Nous pouvons donc nous interroger sur l’initiation de ces contacts cellulaires. Les
lymphocytes ne sont-ils localisés qu’à proximité des adipocytes en souffrance? Les adipocytes
expriment-ils à leur surface un facteur spécifique qui va attirer les lymphocytes directement
ou indirectement via l’attraction des macrophages qui pourraient recruter à leur tour les
lymphocytes?
V Spécificité des lymphocytes du tissu adipeux humain
La présence des lymphocytes au sein du tissu adipeux et son augmentation par
l’obésité pose la question de savoir si le recrutement est potentiellement un phénomène actif
médié par une réaction immune spécifique dans laquelle les lymphocytes seraient impliqués.
La présence de lymphocytes avec un phénotype particulier à l’intérieur du tissu
adipeux trace le schéma d’une réaction immune classique où les CPAs pourraient présenter un
antigène spécifique aux lymphocytes du tissu adipeux. Ce phénomène pourrait expliquer leur
recrutement et leur prolifération au sein du tissu adipeux. Cet antigène pourrait être de nature
peptidique présenté de manière classique par le CMH II présent sur les macrophages du tissu
adipeux (185). La présentation d’un antigène peptidique requiert des CPAs qui sont présentes
en grand nombre dans le tissu adipeux et dont le pourcentage est augmenté avec le
développement de la masse grasse. Cette hypothèse est actuellement en cours d’étude dans le
laboratoire par une analyse du répertoire TCR des lymphocytes isolés du tissu adipeux. En
effet, il est possible d’analyser le répertoire TCRβ en utilisant des anticorps dirigés contre le
domaine Vβ des molécules du TCRαβ qui couvrent 65-70% des domaines Vβ présents dans
97
les lymphocytes T circulants (221, 222). De plus, la découverte d’un antigène spécifique relié
à l’activation et à la prolifération des lymphocytes au sein du tissu adipeux permettrait de
cibler spécifiquement cette population dans un but thérapeutique, soit afin d’activer les
lymphocytes de façon à permettre à la réaction immune de se mettre en place, soit au contraire
de les inhiber afin de limiter leur entrée dans le tissu adipeux. Cette question sur la nécessité
de les inhiber afin de freiner le développement de l’insulinorésistance ou bien au contraire de
les activer afin de limiter l’extension de la masse grasse reste ouverte à ce niveau de nos
investigations.
VI Différences observées avec les modèles murins
Les études menées sur les animaux nous ont permis de mettre en évidence que les
populations cellulaires immunes du tissu adipeux étaient en partie différentes de celles
présentes chez l’homme. On retrouve dans le tissu adipeux de souris soumises à un régime
hyperlipidique des lymphocytes B, des cellules de l’immunité innée NK et NKT en plus des
lymphocytes T et des macrophages. Ces différences montrent qu’il faut rester prudent
lorsqu’on étudie l’obésité sur les modèles animaux qui ne sont pas toujours représentatifs des
observations faites chez l’homme. De plus les temps de régime chez la souris nous permettent
d’observer le développement de l’obésité et le début de son installation, mais ne sont pas
indicateurs des évènements qui ont lieu dans le tissu adipeux humain lorsque l’état d’obésité
s’est installé.
Les résultats d’analyses des cellules de la fraction stroma vasculaire par cytométrie en
flux chez la souris montrent une inflammation qui se développe très précocement avec la prise
de poids, les premières cellules immunes ie les lymphocytes B augmentent dès 3 semaines de
régime, suivis par les lymphocytes T à 6 semaines puis par les macrophages à 12 semaines.
Ces résultats sont «en accord» avec le phénotype très inflammatoire observé chez les
98
lymphocytes isolés de patients en surpoids. L’absence d’informations précises sur l’historique
de nos patients nous empêche de tirer des conclusions. Toutefois, chez l’homme, l’ensemble
de nos résultats tend à montrer que le phénotype Th1, pro-inflammatoire des cellules T lors du
développement de l’obésité, pourrait évoluer en phénotype chronique Th17 lorsque l’obésité
est installée. Il serait intéressant de travailler sur des patients dont on connaît précisément
l’historique de prise et de perte de poids ainsi que le nombre d’années d’obésité. Un modèle
animal plus représentatif de l’homme serait de visualiser «l’effet yoyo» chez les souris en les
mettant en alternance de régime gras et de régime normal. La méthode permettrait d’analyser
l’effet de la prise et de la perte de poids successives sur les populations immunes du tissu
adipeux. Enfin, l’utilisation de modèles animaux plus âgés, en régime enrichi en lipides
pendant plusieurs mois, nous permettrait probablement d’accéder à des tissus dans lesquels
une inflammation chronique a lieu.
Pour finir nous avons tenté, dans un modèle animal déficient en lymphocytes,
d’étudier le rôle précis des lymphocytes. Nos résultats sur ces souris semblent indiquer que
l’absence de lymphocytes n’altère pas le développement de l’obésité, ni de l’insulino-
résistance. Cependant, après 12 semaines de régime enrichi en lipides, les NK et les
macrophages s’accumulent dans le tissu adipeux des souris RAG2(-/-). Ces résultats
permettent de s’interroger sur le rôle des lymphocytes dans l’initiation de cet état
inflammatoire chez l’animal. Il est possible que les lymphocytes soient des modérateurs d’une
immunité innée qui réagit de manière (trop?) importante au développement du tissu adipeux.
Il est également envisageable que les lymphocytes et les cellules NK jouent le même type de
rôle pro-inflammatoire au sein du tissu adipeux et qu’une population soit capable de
compenser l’autre lors d’invalidations génétiques. En effet il a été montré que les cellules NK
pouvaient, dans certains cas d’immunodéficience, prendre le relais des lymphocytes et
99
répondre à une stimulation antigénique plus classique (215). Cette hypothèse est renforcée par
les travaux menés chez l’homme qui ne présentent pas d’augmentation des cellules NK avec
l’IMC. Afin de répondre à ces questions, il serait nécessaire de travailler sur des modèles de
souris déficientes en cellules NK, par déplétion spécifique des cellules NK in vivo à l’aide
d’anticorps dirigés contre NK1.1 ou encore AGM1 (223, 224) afin d’étudier leur réponse au
régime en terme de métabolisme et de recrutement des autres partenaires immunitaires.
100
Partie 4 : Références
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Titre et résumé en anglais
Human adipose tissue lymphocytes: characterization and roles.
Obesity is associated to a low level systemic inflammatory state and to an excessive
production of pro-inflammatory cytokines in adipose tissue. These cytokines are mainly
produced by macrophages, previously described to accumulate in adipose tissue (AT) during
obesity. My PhD work has been focussed on characterizing and analyzing the potential role of
lymphocytes, immune partners of macrophages. Our results show that the number of
lymphocytes presents in AT increases with the body mass index (BMI) and with the visceral
AT location. Human AT lymphocytes are mainly effector and memory CD3+ CD4+ and
CD3+ CD8+ T cells. A study on AT CD3+ lymphocyte-conditioned media allowed us to
demonstrate an anti-adipogenic effect of lymphocytes on AT progenitor cells. In addition,
these media inhibit the insulin-mediated effect on the expression of lipogenic enzymes from
mature adipocytes. Murine models show a complex traffic of immune cells in adipose tissues
during the onset of obesity and a marked accumulation of natural killer cells and macrophages
in AT from immunodeficient mice. All these results allowed us to characterize the
lymphocyte populations of the human AT and to demonstrate that their productions can
modulate both the metabolism and the adipocyte differentiation. The data obtained on murine
models suggest that adipose tissue lymphocytes could have a protective role limiting the
development of an excessive innate inflammatory reaction.
115
Auteur : Carine DUFFAUT
Titre : Les lymphocytes du tissu adipeux humain : caractérisation et rôles
Directeur de thèse : Dr Anne BOULOUMIE et Dr Jean GALITZKY
Lieu et date de soutenance : Toulouse, le 16 Juillet 2009
Résumé : L’obésité est associée à un état inflammatoire systémique de bas niveau et à
une production excessive de cytokines pro-inflammatoires dans le tissu adipeux (TA). La
principale source cellulaire de ces cytokines est le macrophage qui a été décrit pour
s’accumuler dans le TA au cours de l’obésité. Ces travaux de thèse ont pour but de
caractériser et d’analyser le rôle potentiel des partenaires immunitaires des macrophages, les
lymphocytes dans le TA. Nos travaux montrent que le nombre de lymphocytes présents dans
le TA humain augmente avec l’indice de masse corporelle (IMC) des patients ainsi qu’avec la
localisation viscérale du TA. Les lymphocytes du TA humain sont majoritairement des
cellules TCD3+, CD4+ et CD8+, effecteurs et mémoires. Nos études sur les milieux
conditionnés par les lymphocytes CD3+ isolés du TA ont permis de démontrer que les
lymphocytes ont un effet anti-adipogénique sur les cellules progénitrices. Sur les adipocytes
matures, ils inhibent l’effet de l’insuline sur l’expression des enzymes de la lipogenèse. Les
modèles animaux montrent une cinétique complexe de trafic des cellules immunes dans le TA
au cours du développement de l’obésité et une accumulation forte de cellules natural killer et
de macrophages dans le TA de souris immunodéficientes. L’ensemble de ce travail a permis
de caractériser les populations lymphocytaires présentes dans le TA humain et de montrer que
leurs productions peuvent moduler le métabolisme mais également la différenciation
adipocytaire humaine. Les résultats obtenus sur les modèles murins suggèrent que les
lymphocytes du TA pourraient exercer un rôle protecteur en limitant le développement d’une
réaction inflammatoire innée excessive.
Mots clés : lymphocytes, obésité, inflammation, tissu adipeux, lipogenèse
Discipline : Innovation pharmacologique
Intitulé et adresse du laboratoire : Equipe 1 - Réseau vasculaire, cellules progénitrices et
cellules immunitaires du tissu adipeux- INSERM U858/I2MR, Bat L4 Hôpital de Rangueil, 1
avenue Jean Poulhès 31059 Toulouse