techniques d'identification

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Les techniques d’identifications utilisées dans le diagnostic bactériologique Boudjelida.H Bellal.C H

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Page 1: Techniques d'Identification

Les techniques d’identifications utilisées

dans le diagnostic

bactériologiqueBoudjelida.H

Bellal.CH

Page 2: Techniques d'Identification

Introduction • L’analyse bactériologique classique des prélèvements avec examen

microscopique, mise en culture et identification constitue la majorité des analyses bactériologiques réalisées au laboratoire. Néanmoins, cette démarche demande plusieurs jours et pour certaines infections graves nécessitant la mise en route rapide d’un traitement antibiotique

• L’identification rapide de la bactérie responsable présente un intérêt majeur. De même, pour certaines bactéries de croissance difficile, ces tests rapides constituent un moyen de diagnostic particulièrement intéressant.

• En bactériologie les techniques rapides doivent réduire le délai de réponse pour le clinicien et permettre l'instauration précoce d'un traitement adapté.

Page 3: Techniques d'Identification

Qu’est ce qu’un

diagnostic?

Qu’est ce que je fais ? Comment

interpréter les résultats ?

Comment traiter ?

Page 4: Techniques d'Identification

I. Définition

• Le diagnostique bactériologique est un ensemble de moyens permettant d’identifier et d’impliquer à partir d’un prélèvement réalisé chez le malade, une ou plusieurs bactéries, dans un processus infectieux.

Il intervient au début de la maladie pour détecter la présence du germe en cause, mais également dans le suivi du patient sous traitement, en notant la disparition ou la persistance du germe initialement présent, confirmant ainsi la guérison ou l’échec du traitement.

Page 5: Techniques d'Identification

• Les testes utilisés dans le laboratoire permettent de prouver l’implication d’une bactérie donnée, soit en révélant sa présence directement dans les prélèvements analysé (diagnostic direct), soit en détectant des anticorps spécifiques de cette bactérie dans le sang du patient (diagnostic indirect).

Page 6: Techniques d'Identification

II. Le diagnostique direct :

• C’est le seul diagnostique de certitude car il permet l’identification de la bactérie elle-même ou de ces composants antigéniques et/ou son génome directement dans le prélèvement. mais aussi de préciser sa sensibilité au ATB(antibiogramme)

• Des prélèvements, réalisés au niveau du foyer infectieux, sont soumis à différentes techniques de détection bactérienne.

Page 7: Techniques d'Identification

Schéma générale de diagnostique directe

Page 8: Techniques d'Identification

01.Les prélèvements destinés aux examens bactériologiques 

Ce sont des échantillons provenant du foyer infectieux et véhiculant le ou les agents bactériens susceptibles d’être impliqués dans le processus infectieux.

mono bactériens

• Les prélèvements sang, LCR, liquide pleural ..

poly microbiens

peau, cavités naturelles..

Page 9: Techniques d'Identification

Pour assurer la qualité et la fiabilité de l’analyse :

Le prélèvement doit réaliser avant toute antibiothérapie si non sous fenêtre thérapeutique : dans ce cas, on suspend pendant une durée d’au moins de 02 jours, le traitement antibiotique entrepris et on réalise des hémocultures à la fin de cette période .

 Il faut faire attention de ne pas introduire des germes étrangers au foyer d’infectieux.

Il faut respecter un volume suffisant du prélèvement destiné à l’analyse.

Page 10: Techniques d'Identification

Il faut préserver la viabilité des bactéries par des précautions supplémentaires :

o Envelopper les flacons de prélèvement dans du coton pendant la durée de transport ver le laboratoire d’analyse.

Exp:Les agents de Streptococcuspneumoniae

méningite purulente Neisseria meningitidis Hémophiles influenzae

o Utiliser des milieux de transport qui préservent la viabilité Exp: TGV (transport de germes vivants

STUART pour Neisseria gonorrhoeae.

Page 11: Techniques d'Identification

o Protéger les bactéries anaérobies strictes de tous contacte avec l’oxygène.

Exp :

Pus de collections fermées " lorsque on ponctionne la collection à la seringue, le pus est aspiré puis l’aire est totalement expulsé du piston.

o Utiliser des culturettes anaérobies qui garantissent la survie des bactéries pondant 48 h.

Exp :

Pus d’otite chronique, pied du diabétique, gangrène…

Page 12: Techniques d'Identification

le prélèvement doit être transporté rapidement au laboratoire d’analyse.

Pour les températures de transport on distingue :

les prélèvements qu’il est préférable de garder à + 4°c : cas des prélèvements poly microbiens.

Exp Les urines poste-mictionnelle,

les selles,

les expectorations pour la recherche

du BK

Page 13: Techniques d'Identification

Les prélèvements que l’on doit maintenir à +37°c (étuve) : cas des prélèvements mono microbiens qui renferment des bactéries pathogène fragiles

Hémocultures LCR, liquide de ponctionExp les pus d’abcès non fistulisés biopsies.

Page 14: Techniques d'Identification

Les prélèvements qu’il faut mettre immédiatement en culture en raison de risque de dessiccation encouru si la culture est retardée " de tels prélèvements doivent être réalisés au laboratoire même.

• Exp  Prélèvement de la gorge

des pus d’oreille des pus d’abcès fistulisés génitaux masculins et féminins

Page 15: Techniques d'Identification

02. Les procédures des principaux prélèvements bactériologiques

2.1 Les urines mictionnelles: Prélever les urines de la nuit où ayant séjourné au moins

4heure dans la vessie.

Le prélèvement est précédé d’un lavage soigneux des organes externes.

Le malade élimine le premier jet d’urine, puis prélève 20ml de milieu du jet, directement dans un flacon stérile en verre ou en plastique fourni par le laboratoire.

Page 16: Techniques d'Identification

Les urines doit être transportées au laboratoire d’analyse en moins d’1 heure.

Elle peut être conservées à +4°c pendant une durée ne dépassant pas 24 heure.

2.2 Les selle : Prélever les selles fraîches du matin, la quantité de selle

doit être suffisante pour l’analyse.

Les selles peuvent être temporairement conservées à +4°c en attendant l’analyse.

Page 17: Techniques d'Identification

• 2.3 Les prélèvement pour l’hémoculture Prélever le sang au moment des pics fébriles ou

des frissons s'il existe, sinon systématiquement toutes les 3-4 heures.

Désinfecter la veine du centre ver la périphérie à l’alcool iodé à 2% ou à la Bétadine.

Désinfecter le bouchon du flacon d’hémoculture à la Bétadine.

Utiliser un dispositif adapté pour effectuer simultanément un prélèvement de sang en anaérobiose et un prélèvement en aérobiose.

Page 18: Techniques d'Identification

Répartir 10ml de sang par flacon chez l’adulte, 5ml par flacon chez l’enfant, 1ml par flacon chez le nourrisson.

Homogénéiser les flacons et les incuber à 37°c Ne jamais mettre au réfrigérateur.

2.4 Les suppuration Désinfecter à la Bétadine le site cutané du centre ver la

périphérie. Ponction l’abcès à l’aiguille montée sur une seringue

stérile. Aspirer le pus. Adresser la seringue au laboratoire d’analyse.

Page 19: Techniques d'Identification

2.5 Le LCR

Désinfecter l’espace intervertébral L4-L5 ou L5-S1du centre vers la périphérie à la Bétadine.

Ponctionner à l’aide une aiguille stérile munie d’un mandrin stérile.

Laisser s’écouler 2 à 5ml de LCR dans un tube stérile. Retirer l’aiguille et nettoyer la plaie.

Envelopper le tube dans de coton et le transporter rapidement au laboratoire d’analyse.

Ne jamais mettre au réfrigérateur.

Page 20: Techniques d'Identification

3. Les techniques d’identification bactérienne

3.1 Les techniques bactériologiques

1.1 Les examens microscopiques (préalable d’orientation)

L’examen cytologique

Il permet :d’apprécier la réaction inflammatoire et de la chiffrer par

mm3 de prélèvement. de préciser le caractère des cellules inflammatoires

"lymphocytes ou polynucléaires, altérés ou non altérés.

Page 21: Techniques d'Identification

- En pratique des cellules présentes sous forme d’une lame de verre sont utilisées pour le contage.

Exp

Cellule de Malassez pour: LCR, liquides de ponction, urines .

Page 22: Techniques d'Identification

• La suspension est éventuellement colorée avec de bleu de méthylène.

• On peut utiliser le formol pour immobiliser les cellules mobiles

• Il est possible d’utiliser un agent mouillant (tween, laurylsulfate de sodium) pour éviter les agrégats en cas des bactéries en amas « staphylocoques ».

Page 23: Techniques d'Identification

L’examen microscopique à l’état frais

C’est l’examen d’une goutte de prélèvement entre lame et lamelle.

• Il permet

de voir les bactéries à l’état vivant.

leur morphologie.

leur mobilité.

Cet examen, réalisé au microscope à fond noir, permet de détecter Treponema pallidum dans une sérosité de chancre.

Page 24: Techniques d'Identification

L’examen après coloration :• L’examen après coloration permet d’observer des

bactéries tuées fixées sur une lame et ayant subi l’action d’un ou plusieurs colorant.

• Les colorations, réalisées sur des frottis secs et fixes, sont classées en :

Coloration simple (un seul colorant).

Coloration différentielle type Gram.

Coloration spéciales des structures bactériennes (capsules, spores…).

Page 25: Techniques d'Identification

Coloration simple "coloration au bleu de méthylène"

• La coloration au bleu de méthylène peut apporter des informations concernant l’agencement et la morphologie des germes.

• Elle est utilisée dans les cas suivants :

Cas de tuberculose : distinction des polynucléaires et les lymphocytes.

Cas de diplocoques en graine

de café(Neisseria).

Diplocoques en grain de café intracellulaires

Page 26: Techniques d'Identification

Coloration différentielles de GramC’est la coloration de base en bactériologie qui permet de

distinguer les bactéries en Gram positif et en Gram négatif, cette distinction est fondamentale pour leur identification.

Il est alors possible de suspecter en tenant compte de la réponse Gram+ ou - et des morphologies observées d'évoquer un probable diagnostic.

Page 27: Techniques d'Identification

o Exemples de probables diagnostics bactériologiques en fonction des commémoratifs :

suspicion de pneumonie (A)

de bronchopneumonie (B)

de méningite (C)

de pyélonéphrite (D)

Page 28: Techniques d'Identification

Les colorations spéciales • coloration de MGG "May-Grüwald- Giemsa La coloration de May-Grünwald Giemsa est une méthode

de coloration utilisée en hématologie pour différencier les cellules du sang lors des préparations cellulaires .

Elle donne une meilleure individualisation des éléments cellulaires tels polynucléaires, macrophages, lymphocytes...

neutrophile s, entourés de nombreux globules rouges Granulocyte basophile

Page 29: Techniques d'Identification

Les bactéries peuvent être observées avec leur capsule comme le pneumocoque (A). D'autres peuvent être spécialement recherchées telle Borrelia burgdorferi dans la maladie de Lyme (B).

Page 30: Techniques d'Identification

Coloration de Ziehl-Neelsen • utilisée pour l’identification directe et spécifique des

bactéries acide –alcoolo résistante du genre Mycobactérium et des espèces pathogènes du genre Nocardia.

• Les mycobactéries apparaissent comme de fin bacille rouge soit isolé par deux ou en amas, le fond de la lame est bleu.

Page 31: Techniques d'Identification

Coloration à l’uramine • variantes de la coloration de Ziehl-Neelsen • Les bacilles acido-alcoolo-résistants apparaissent en

vert jaune brillants sur fond rouge orangé.

• Un résultat positif par cette méthode doit toujours être confirmé par la méthode classique de Ziehl-Neelsen.

Photomicroscopique des BAAR traités par l’auramine

Page 32: Techniques d'Identification

• 3.2 Les cultures bactériennesElles sont réalisée en étalent une parcelle du prélèvement

sur différents milieux de culture, qui sont en suite incubés dans une étuve réglée à 37°c.

• Avant l’emploi le milieu doit :• être stérile.• être nutritif et équilibré • Avoir un PH, une viscosité, une pression osmotique, des

caractéristiques physico-chimique compatible à la vie bactérienne.

• Le carbone, hydrogène, oxygène, l’azote doit leur donner sous forma assimilable.

Page 33: Techniques d'Identification

3.2.1 Les milieux bactériologique

• On distingue deux milieux de culture :

01. Les milieux d’isolement

On distingue :

a) Les milieux ordinaires Exemple : La gélose nutritive (GN) "pour le développement

des Entérobactéries" b) Les milieux enrichis : Exemples : La gélose au sang frai pour la culture des

streptocoques prélevés par exemple à partir de pus.

Page 34: Techniques d'Identification

Prélèvement de gorge avec de nombreuses Pus sur une gélose au sang frais

colonies ß-hémolytiques (gélose au sang frais)

La gélose au sang cuit pour la culture de : Haemophilus influensae et Neisseria gonorrhoeae.

pneumocoque et Haemophilus influenzae (gélose au sang cuit ou gélose chocolat)

Page 35: Techniques d'Identification

Milieu à l’œuf coagulé ou de Loweinstein-Jensen .

La gélose salinite : milieu d’enrichis pour les différent types des Entérobactéries sauf Salmonella typhi.

Page 36: Techniques d'Identification

c) Les milieux sélectifs d’isolement

Exemples : Bouillon de Mac conkey : utilisé pour isoler les

bactéries entériques

Gélose Mac Conkey - Salmonella

Page 37: Techniques d'Identification

Milieu Chapman : sélectif pour les staphylocoques.

Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus sur sur gélose Chapman

Page 38: Techniques d'Identification

Milieu Drygalski, Hektoen : isolement des Entérobactéries.

Pseudomonas aeruginosa sur gélose Drigalski

C olonies lac+ sur Drigalski Colonies lac- sur Drigalski

Page 40: Techniques d'Identification

Milieu SS : isolement de Salmonella, shégilla.

Gélose SS – Salmonella E.coli.Salmonella

sur gélose SS

d) Milieux sélectif d’enrichissement

Eau perptonée alcaline EPA : permet

l’enrichissement du Vibrion cholérique.

Page 41: Techniques d'Identification

02.Les milieux d’identification• Ces milieux servent à mettre en évidence une ou plusieurs

propriétés des microorganismes précédant isolés.

• 3.3 Les techniques d’identification bactérienne "après culture"

3.3.1 Examen macroscopique "caractères culturaux

L’aspect des colonies dépond du milieu utilisé, de la durée et de température d’incubation.

Page 42: Techniques d'Identification

3.3.2 L’examen microscopique des bactéries « morphologie »

Ce fait par l’étude des bactéries isolées d’un prélèvement.

un frottis est réalisé à partir de la culture bactérienne est coloré au Gram et examiné au microscope.

Agencement des coques

Page 43: Techniques d'Identification

3.3.3 Etude des caractères biochimiques

Les testes préliminaires • basés sur la mise en évidance rapide d’un caractère

métabolique dont les plus recherchés sont : L’oxydase ,La catalase, • *La recherche de ces enzymes se fait généralement

pour l’identification des cocci Gram + "les staphylocoques et les streptocoques " et aussi pour les Entérobactéries.

Page 44: Techniques d'Identification

galerie biochimique permet en principe de finaliser l’identification de

l’espèce• Galerie classique

Figure : galerie biochimique classique

Page 45: Techniques d'Identification

Les galeries miniaturisées

Page 46: Techniques d'Identification

II.3.4 Etude des caractères antigéniques "Recherches complémentaires"

• La technique, généralement utilisée, est l'agglutination sur lame du germe isolé à partir d’une culture de 24h par un antisérum spécifique.

Exemple :• Sérotypage de Shigella, de Salmonella, de

Pseudomonas aeruginosa.• sérogroupage de streptocoques et de Neisseria

meningitidis.

Page 47: Techniques d'Identification

technique d'identification par agglutination.

Page 48: Techniques d'Identification

II 3.4 L’antibiogramme

Réalisé lorsque le diagnostic direct est positif.

La détermination de la sensibilité

permet l’élaboration des milieux d’isolement sélectifs, le contrôle d’une infection par chimio thérapeutique et enfin elle peut être utilisée comme approche dans la caractérisation et l’identification bactérienne.

la souche peut être déterminé en milieu liquide par la méthode de la CMI ou par la technique des disques en milieux solides.

milieu utilisé: gélose Mueller Hinton .

Page 49: Techniques d'Identification

L’activité de chaque antibiotique sera appréciée, par le diamètre de l’auréole d’inhibition provoqué autour du disque.

Page 50: Techniques d'Identification

II.3.5 Les techniques immunologiques

se fait directement dans les prélèvement. utilisées en cas d’infection décapitée par un

traitement antibiotique administré avant prélèvement.

utilisées pour la recherche des antigènes responsables de méningites.

Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae• Steptococcus pneumoniae

Page 51: Techniques d'Identification

1 recherche des antigènes solubles • c’est la détection d’antigènes bactériens libérés

dans les liquides biologiques au cours d’infection.La technique des particules de Latex

sensibilisées aux anticorps antimicrobiens spécifique

Elle permet dans un prélèvement (LCR, urine, liquides pleuraux…) de révéler la présence d’antigène bactériens responsables de méningites, de Listeria monocytogènes, d’Escherichia coli KI et de Streptococcus agalactiae.

Page 52: Techniques d'Identification

• La technique consiste à mélanger 25 mm3 de prélèvement à 10 mm3 de chaque latex et à agiter 3 minutes avant de lire.

Une suspension de particules de Latex sensibilisées à un anticorps spécifique est mise en contacte avec une goutte de prélèvement. La présence d’une agglutination permet d’incriminer le germe correspondant à l’anticorps spécifique.

Page 53: Techniques d'Identification

technique de centre-immuno-électrophorèse C’est une technique de migration électro phorétique

inversée sur gel.

Elle permet de révéler dans un prélèvement de LCR ou de liquide pleurale présence d’antigène de:

* N.meningitidis. *s.pneumoniae. * H.influenzae. *Lesteria monocytogenes. *Escherichia coli KI . * Streptococcus agalactiae..

Page 54: Techniques d'Identification

• Dans un gel d’agarose, sous une différence de potentiel, les antigènes migrent vers l’anode et les anticorps vers la cathode.

• S’il y a correspondance, un précipité fin se forme à leur rencontre dans la gélose.

• La position de l’arc de précipité dépond de la quantité d’antigènes présents.

Page 55: Techniques d'Identification

La technique immunchromatographique sur membrane

Elle permet de révéler la présence d’antigènes de Legionella pneumophilia sérogroupe 1 dans les urines du patient.

Ces antigènes apparaissent précocement au cours de la maladie et persistent pendant plusieurs mois

Page 56: Techniques d'Identification

2.recherche des antigènes bactériensTechnique ELISA- SANDWICH

• Utilisé pour la Recherche de Chlamydia trachomatis et Mycoplasme dans les prélèvements génitaux.

Page 57: Techniques d'Identification

Schéma : technique ELISA-SANDWICH

Page 58: Techniques d'Identification

Technique immunofluorescence directe (IFD)o Un anticorps spécifique de la bactérie recherchée, est fixé

sur une lame pour immunofluorescence.

o on met en contacte cet anticorps avec une goutte de prélèvement du patient.

o Si ce prélèvement renferme la bactérie recherchée, Il y a réaction antigène- anticorps

o on révèle cette réaction en ajoutant un anticorps monoclonal marqué soit par la fluorescéine.

o Le test est réalisé parallèlement avec des témoins positifs et négatifs.

Page 59: Techniques d'Identification

II.3.5 Les techniques moléculaires améliorent la sensibilité du diagnostique

bactériologique direct dans les infections impliquant des bactéries à croissance difficile.

ont un bénéfice clinique lié:

*gain de sensibilité

* gain de temps

* gain de spécificité

*détection d’organismes morts,

difficilement cultivables

Page 60: Techniques d'Identification

Prélèvement des échantillons Il faut: libérer des acides nucléiques des bactéries . empêcher la dégradation des acides nucléiques

libres. éliminer les inhibiteurs des réactions

d’amplification ou d’hybridation . utiliser un tampon approprié aux réactions à

effectuer. adapter le volume d’échantillon et de le

concentrer selon la sensibilité de la technique et le nombre de bactéries présentes dans l’échantillon s’il est connu.

Page 61: Techniques d'Identification

Technique de la polymérase chain reaction • La PCR consiste en une succession cyclique de

trois étapes : *dénaturation thermique *Hybridation des amorces *Elongation.

Page 62: Techniques d'Identification

Application de techniques moléculaires elle est applicable dans le diagnostique des

tuberculoses paucibacillaires, des infections génitales et des Endocardites à hémoculture négative.

peut dans certains cas s'appliquer directement à l'échantillon à analyser, supprimant ainsi les délais de mise en culture et les problèmes liés aux germes non cultivables.

Cette technique peut ainsi être utilisée pour détecter Neisseria gonorrhoeae et Chlamydia trachomatis de prélèvement gynécologique ou encore Mycobacterium tuberculosis dans un prélèvement pauvre en bacilles.

Page 63: Techniques d'Identification

Détection de gènes de résistance aux antibiotiques, soit directement dans le prélèvement, soit à partir d’une culture de la bactérie.

Détection de gène de résistance à l’oxacilline Mec A de Staphylococcus aureus au niveau d’un pus.

Détection de la résistance aux glycopeptides chez une souche d’Enterococcus faecalis.

Détection de gène conférant le caractère toxinogène de

Corynebacterium diphteriae Identification des bactéries inconnues à partir de leur

séquence nucléotidiques, grâce aux banques de gènes.

Page 64: Techniques d'Identification

Comparaison (très théorique) des méthodes classiques d'identification des bactéries avec une approche par PCR.

Page 65: Techniques d'Identification

Interprétation des résultats d’analyse bactériologiques

• 1 .Examen cytobactériologique des urines (ECBU)

associe à un examen cytologique et un dénombrement des bactéries urinaires (bactériurie ) à partir d’une culture sur gélose nutritive.

Cet examen concerne le dénombrement des leucocytes par mm3 d’urines, en plus on va rechercher la présence de microorganismes, d’hématies et de cellules de tractus urinaire.

Page 66: Techniques d'Identification

L’interprétation d’un ECBU sappuie sur une corrélation entre ; la leucocyturie, la bactériurie et les renseignements cliniques suivants :

• Les facteurs de risque : sonde urinaire …• Les symptômes : brulures mictionnelles, fièvre.• Le traitement antibiotique récemment administré au

malade.

Page 67: Techniques d'Identification

Tableau 1 : Interprétation de l’ECBU chez le non sondé

Page 68: Techniques d'Identification

• 2. Hémoculture Les bouillons d’hémoculture sont examinés dés la 6ème

heur d’incubation, puis tous les jours, à la recherche d’un trouble .

Dés qu’un signe de culture apparait, on prélève un échantillon du bouillon. A partir de cet échantillon, on effectue une coloration de Gram et des cultures sur milieux enrichis en sang.

Si l’hémoculture reste négative, le délai maximal d’incubation est de 10 à 15 jours ; il est prolongé à 4 semaines dans les cas d’endocardite infectieuse et de suspicion de brucellose...

Page 69: Techniques d'Identification

• L’interprétation des hémocultures basées sur les critères suivants :

* Les signes cliniques et le diagnostique évoqué. *Le nombre d’hémocultures positifs au même germe

*Le terrain immunodéprimé ou non

Page 70: Techniques d'Identification

Tableau 2 : interprétation des résultats d’hémoculture

Page 71: Techniques d'Identification

• 3 Examen cytobactériologiques du LCR Examen macroscopique

Le LCR peut être clair (eau de roche)

rouge (hémorragique)

jaune citrin ou purulent

(eau de riz).

Examen cytologique• Il est réalisé sur une goutte de LCR non centrifugé, à la

recherche des cellules inflammatoires , on dénombre les leucocytes par mm3 et on en précise le type : lymphocytes ou polynucléaires .

LCR clair

Page 72: Techniques d'Identification

Frottis sur lame et culture• A partir du culot de centrifugation du LCR, un frottis est

préparé et est coloré au bleu de méthylène pour la recherche des bactéries intra et/ou extracellulaires.

• La culture est réalisée sur des milieux enrichis en sang puis incubés à 37c°pendant 48h

• Une analyse cytochimique peut être effectuée au lit du malade par une culture d’un prélèvement du LCR sur un tube de gélose au sang cuit.

Page 73: Techniques d'Identification

La recherche des antigènes solubles permet la détection rapide d’antigènes bactériens

libérés dans le LCR au cours d’une méningite purulente.

on utilise généralement la technique des particules de latex sensibilisées aux anticorps.

permet de poser un diagnostique étiologique rapide chez le nouveau-né et le nourrisson surtout si la méningite a été décapitée par des antibiotiques.

Page 74: Techniques d'Identification

• L’ECB du LCR est toujours complété par le dosage des protéines et du glucose.

• L’interprétation d’un ECB de LCR est basée sur les données cliniques et les résultats de la cytorachie, de la protéinorachie, complétés si nécessaire par la glycorachie et la chlororachie.

Page 75: Techniques d'Identification

Tableau 2 : Interprétation de l’ECB du LCR

Page 76: Techniques d'Identification

En cas de méningite purulente dont la culture de LCR est négative, on parle de Méningite Puriforme Aseptique (MPA) : les causes sont :

- prise d’antibiotique avent la PL(Ponction lombaire)

- implication de germe à croissance difficile.

• On ce cas, d’autres techniques de diagnostic sont nécessaires (cultures sur milieux spéciaux, Immunofluorescence directe, PCR).

Page 77: Techniques d'Identification

• Le diagnostic bactériologique indirect consiste à mettre en évidence les anticorps

sériques spécifiques du germe responsable et engendrés par le conflit immunologique qui se produit lors de la maladie.

dans certains cas, le sérodiagnostic est seul réalisable :

o Si le germe responsable ne peut pousser en culture, exemple  Treponema pallidum.

o S’il est très difficile ou impossible à isoler exemple : brucellose à la phase de foyers viscéraux profonds.

Page 78: Techniques d'Identification

o S’il a été détruit par un traitement antibiotique

il est réalisé en effectuant au moins deux sérodiagnostics à quinze jours d’intervalle et en conservant les prélèvements de sérum afin de déterminer rétrospectivement les titres d’anticorps en présence du même antigène.

Page 79: Techniques d'Identification

l’interprétation du sérodiagnostic• au début de la maladie le sérodiagnostic est

négatif, il ne devient positif que huit à dix jours après le début clinique

• dans certains cas, cet examen peut même rester négatif si le conflit antigène-anticorps a été limité dans le temps ou dans son intensité (maladie «décapitée » par les antibiotiques).

• on peut rattacher au diagnostic microbiologique

indirect la détection immunochimique des antigènes bactériens.

Page 80: Techniques d'Identification

Diagnostique bactériologique de quelque bactéries

Les mycobactériesExamen cytobactériologique de cracha Prélèvement:Le prélèvement est obtenu le matin, avant antibiothérapie

et après rinçage de la bouche au sérum physiologique stérile, puis examiné dans les deux heures suivantes par le laboratoire

Crachat sanglant

Page 81: Techniques d'Identification

• 1-Examen direct du prélèvement * La coloration de ziehl-Neelsen à la fuchsine. * La coloration de Dugommier à l'auramine.

• Mycobacterium tuberculosis est un bacille à coloration Gram positive, immobile, sans capsule et sans spore. Après coloration de Ziehl-Neelsen , il apparaît comme un bacille rouge de 0,2 à 0,3 µm de large sur 3 à 5 µm de long, légèrement incurvé, à extrêmités arrondies.

Page 82: Techniques d'Identification

2-La culture: ne donne une réponse que plusieurs semaines après

le prélèvement, alors que le traitement a déjà été entrepris s’il existe des signes cliniques suffisants et un examen direct positif.

utile pour confirmer le diagnostic, identifier l’espèce en cause et en pratiquer l’antibiogramme.

Bacilles tuberculeux après coloration de Ziehl-Neelsen

Page 83: Techniques d'Identification

3- L’isolement• Milieux: solide: Löwenstein-Jensen, Coletsos.

liquide: Milieu d Dubos, Youmans

Certains prélèvements rares tel liquide de ponction sont centrifugés puis ensemencés directement.

L’isolement des mycobactéries se fera après décontamination et fluidification.

Les tubes ensemencés sont d’abord incubés 2 jours à 37c° en position horizontale, et non capuchonnés pour que la totalité de la surface du milieu soit ensemencée, et que le liquide s’évapore

Page 84: Techniques d'Identification

• Les tubes seront examines après 48H, puis chaque semaine pendant 2 à 4 mois pour rechercher les colonies de mycobactéries.

• Toutes les colonies qui apparaissent après 4 jours sont des mycobactéries.

• Les tubes de culture sont gardés au moins 8 semaines à l'étuve à 37°C avant de considérer la culture comme négative. La lecture est faite 1 fois par semaine.

Page 85: Techniques d'Identification

Cultures de Mycobacterium tuberculosis

Colonies de mycobacterium tuberculosis sur milieu Lowenstein-Jensen

Page 86: Techniques d'Identification

• Biochimie : • aérobie strict, catalase positive, nitrate positif. • Au cours de sa croissance il synthétise une

quantité importante d'acide nicotinique ou niacine qui peut être mise en évidence par une épreuve biochimique, le test de Konno ou niacine-test.

• La positivité de cette épreuve est spécifique de Mycobacterium tuberculosis.

Page 87: Techniques d'Identification

Conclusion • Le rôle du laboratoire de bactériologie clinique repose

sur l’isolement et l’identification de l’agent pathogène, ainsi que l’étude de la résistance aux agents antibactériens.

• Les méthodes dites traditionnelles comprennent l’examen direct, la culture et l’identification ainsi que la phénotypie alors que la bactériologie moléculaire repose sur la mise en évidence d’acides nucléiques bactériens et la génotypie.

• Une deuxième approche diagnostique, cette fois si indirecte, est utilisée en microbiologie : la sérologie. Elle peut être plus ou moins tardive, présentant des problèmes des réactions croisées, mais elle a comme avantage d’être un dernier rempart de diagnostic.