techniques d’analyse génomique pour caractériser les ... · * la technique débute par...
TRANSCRIPT
Techniques d’analyse génomique pour
caractériser les cellules souches
Dr. Said Assou
Institute for Regenerative Medecine and Biotherapy (I.R.M.B)
CHU deMontpellier
INSERM U1183« Groupe: Instabilité génétique des
cellules souches pluripotentes»
Pr. John De Vos
Taille de différents génomes
: = Annuaire téléphonique
de 1000 pages (Paris)
Drosophile (10)
Levure (1)
E. Coli (0,3)
Génome Humain (200)
Publication de la séquence du génome humain : 15 février 2001
International Human GenomeSequencing Consortium
Celera
Une ébauche de la séquence du génome humain a été publiée en début de l’année 2001 par deux équipes différentes simultanément dans Nature et Science
~30 000 gènesSéquences répétées
Le génome humain comporte:
Introns
2 % ADN codant
Autre : séquences régulatrices, etc.
Expression
ARNm
Protéine
Ø
Pas d’expression
Albumine
Foie
Albumine
Peau
Expression de gènes
Expression Pas d’expression
Génome
ADN
Transcriptome Protéome Métabolome
Chromosomes
Transcriptome
ARNm Protéine Métabolites
Transcriptome= La population des ARNm exprimés par un organisme à un instant donné
« Puces à ADN »
« OMICS »
Analyse du transcriptome
� RT-PCR: 1 gène, 10 échantillons
� Puces à ADN: 1 échantillon, 30 000 gènes
Principaux types de puces à ADN
FILTRES A HAUTEDENSITE
LAMES DE VERRE PUCES AFFYMETRIX
Support Membrane de nylon Lame de verre Silicium
Taille des spots 0.5- 100 µm 20 µm
Nombre de gènesreprésentés sur la puce
≈ 2.500 ≈ 10.000 ≈30.000
Nature des sondes Clones d’ADNc ouproduits de PCR
Oligonucléotides ou
produits de PCR
Oligonucléotides
Méthode de marquagedes cibles
Radioactif Fluorescence Fluorescence
PROKARYA EUKARYA
MouseMouse
HumanHumanRatRat
DrosophilaDrosophila
EcoliEcoli
P. aeruginosaP. aeruginosa
CanineCanineXenopusXenopus
S AureusS Aureus
BovineBovine
Affymetrix Genechips
YeastYeast
P. aeruginosaP. aeruginosa
B. subtilisB. subtilis
C. elegansC. elegans
Plasmodium FalciparumPlasmodium Falciparum
ZebrafishZebrafish
X3PX3P
BovineBovine
ArabidopsisArabidopsis
BarleyBarley
MaizeMaize
RiceRice
SoybeanSoybean
Sugar caneSugar cane
Vitis viniferaVitis vinifera
WheatWheat* Puce U133A+ U133B
* Puce U133Plus
* Puce Whole exon 1000 000 exons
Croissance exponentielle des publications
� Nombre de publications référencées dans PubMed comportant le mot «microarray» dans le titre ou l’abstract, par année
3000
3500
4000
4500
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003
� Les microarrays affymetrix sont de plus en plus utilisées
� Dotées de bonne reproductibilité
� Rendent possible la comparaison des données interlaboratoires
Sous le capot des puces à ADN (Affymetrix)
� Des milliers de fragments d’ADN
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( � Des milliers de fragments d’ADN ou d’oligonucléotides déposés sur un support solide = Sondes
(
(
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HO 000 0 0
HO0
HO 000 0 0
HO 0TT000 0 00TT000 0 00TT000 0 0 GTTGCAAC
TACTTAGG
GAAATCTA
GTTGCAAC
TACTTAGG
GAAATCTAMASQUE 2MASQUE 1
Protection
chimique
Source
lumineuse
Fabrication des puces Affymetrix
Photolithogravure (Affymetrix)
0000000 00000000 0 0TT0000 00TT0000 0 0TT00AA00TT00AA0000000 0 0000000 0 0000000 0 0 0 000 0 00 000 0 0 0TT000 0 00TT000 0 00TT000 0 0
Substrat
solide
Photodéprotection Bases déprotégées Ajout de thymidine
sur les bases déprotégées
Répétition
n cycles
Ajout
d’adénosine
* La technique débute par l’attache à la surface de la puce de liaisons synthétiques munie de groupes chimiques qui peuvent être enlevés sous l’effet de la lumière
* On envoie ensuite de la lumière à certaines localisations définies via un masque photolithographique afin de déprotéger les liants
* Le rajout de deoxynucleosides avec un groupe photolabile permet la liaison avec les groupes déprotégés
* L'emplacement des différentes sondes oligonucléotidiques sur la puce et l'enchaînement des bases qui les composent sont très précisément connus
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RNA Total
cRNA biotinylé fragmenté
�et une cible
cDNA
Reverse
Transcriptio en 3’
In Vitro
Transcription
Une Puce�
Amplification / hybridation
(
(
hybridation
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scannerCTATTCGCC²…
ACGTGTTTCCTGAGAT
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bioinformatique
fragmenté
B B BB
BB
B cRNAbiotinylé
Transcription
ARN de départ
• Macroarrays : 100 µg ARN total 100 x 10e6
• Affymetrix : 1 µg ARN total 1 x 10e6
1 – 100 ng 10e3
16 ovules : ~ 4 ng ARN total
Assou, S. et al. Hum. Reprod. 2006
Single oocyte Single embryo
Day 3 embryo
MBD3L2
CCNA1
RFPL2
ZSCAN4
NALP11
Grøndahl M et al. Hum. Reprod. 2010;25:957-968
RFPL2
DPPA2
Assou S et al. PlosOne. 2012, 7(6):e39306 8
Profils d’ARN totaux
ARN Total parfaitARN Total parfait
Pics: marqueur - 18S – 28S parfois un peu de 5S
Ratio: 28S/18S =∼∼∼∼1,7
Contamination génomique ARN dégradé
2 protocoles de marquage
� 1 cycle de transcription in vitro:� Il faut 1 - 5 µg d’ARN total
� 2 cycles de transcription in vitro:� Il faut 50 ng d’ARN total (~ 10 000
cellules)
� NB: pas d’ARN de référence : résultat « absolu » (normalisation sur la totalité de l’image)
Les puces à ADN fournissent d’abondantes quantités de données. La matricephysique (puce à ADN ou matrice d’hybridation) permet de générer une matriceoptique (cartographie de fluorescence) à partir de laquelle est produite unematrice numérique
La bio-informatique et la biostatistique sont des outils indispensables pour letraitement et l’analyse des milliers de données générées par les puces à ADN.
Traitement des données
inclut tous les paramètres de
récapitule les résultats des différents contrôles
Anatomie du logiciel GCOS
l’image de la puce générée par le scanner
contient les intensités moyennées (normalisation)
inclut l’algorithme statistique pour l’analyse: c’est le fichier des résultats.
paramètres de l’expérience
différents contrôles de qualité
� A partir des données brutes de la puce
� Identifier les gènes sur ou sous exprimés dans chaque groupe d’échantillons : ovocytes, cellules souches, ….
Analyse bioinformatique
� Regrouper les échantillons ayant un profil d’expression de gènes similaire
� Définir la fonction de ces gènes
� Se focaliser sur les gènes codant pour des protéines candidates
� Analyse supervisée
� = connaissant deux groupes d’échantillons,
quels gènes les séparent?
Analyses supervisées et non supervisées
� Analyse non supervisée
� = comment se classent les échantillons et les
gènes?
� Classification hiérarchique
Effectue des permutations aléatoires
entre les puces pour générer un résultat
« au hasard » de référence.
Compare ensuite les puces à cette
référence pour trouver les variations
significatives
Analyses supervisées: SAM
Calcule les variations,
donne les résultats
en fonction :
-du seuil de variation souhaité
(« fold change »)
- du % d’erreur souhaité
(False Discovery Rate)
Analyse non supervisée: classification hiérarchique
E01 E02 E03 E04 E05 E06 E07 E08
G01 1,03 5,42 0,03 8,25 0,14 3,34 5,78 0,00
G02 6,18 1,45 6,89 0,25 5,06 7,25 0,00 8,22
Mesures Colorisation Regroupement
G03 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66 0,41
G04 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00 3,85
G05 1,03 5,42 0,03 8,25 0,14 3,34 5,78 0,00
G06 6,18 1,45 6,89 0,25 5,06 7,25 0,00 8,22
G07 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66 0,41
G08 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00 3,85
G09 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66 0,41
G10 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00 3,85
G11 1,03 5,42 0,03 8,25 0,14 3,34 5,78 0,00
G12 6,18 1,45 6,89 0,25 5,06 7,25 0,00 8,22
G13 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66 0,41
G14 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00 3,85
G15 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66 0,41
G16 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00 3,85
G17 1,03 5,42 0,03 8,25 0,14 3,34 5,78 0,00
G18 6,18 1,45 6,89 0,25 5,06 7,25 0,00 8,22
G19 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66 0,41
G20 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00 3,85
Du gène à la fonction
� Ingenuity pathway analysis (IPA)
� Le logiciel permet de placer les gènes d’intérêt dans des mécanismes biologiques, des voies de signalisation et des fonctions
https://analysis.ingenuity.com/pa.
des voies de signalisation et des fonctions connues et décrites dans la littérature.
Metabolic regulators
NANOG pathway
TEICM
Réseau d’interaction
Epigenetic regulators
Day 3 Embryo
Day 5 Blastocyst
Assou S et al. PlosOne. 2012, 7(6):e39306 8
� Notre génome est connu: ~30 000 gènes
� Les puces à ADN permettent aujourd’hui
d’analyser le transcriptome (l’expression de
Conclusion
d’analyser le transcriptome (l’expression de
nos 30 000 gènes en une expérience)
� 50 ng ���� 30 000 RT-PCR!
� Libres
� R
� Cluster / TreeView
� Web : Babelomics
Mes logiciels préférés
� Web : Babelomics
� Payants
� Array Assist (Stratagene)
� Pathway Architect (Stratagene)
� Ingenuity
� Partek
� Pathway Studio
� GEO : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
� ArrayExpress : http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress
Quelques sites web!
� Atlas dédiés
� Amazonia! : http://amazonia.montp.inserm.fr/
� Outils d’analyse
� Privés : RAGE
� Publics: Oncomine
� Babelomics
http://www.geneontology.org/GO.tools.shtmlTool to display, browse and search the ontologies and/or annotations.
* CGAP GO Browser* COBrA* Comparative Toxicogenomics Database* EP GO Browser* GeneInfoViz* GeneOntology at RZPD* GenNav* GOblet* GoFish* MGI GO Browser* Ontology Lookup ServiceTools for annotating genes or gene products using GO
Tools for gene expression/microarray analysis* Avadis * BiNGO* CLENCH * DAVID* EASE * eGOn v2.0* ermineJ * FatiGO* FIVA * FuncAssociate* FuncExpression * GARBAN* GENECODIS * GeneMerge* GFINDer: Genome Function * GOALIE* GOArray * GOdist* GOHyperGAll * GoMiner and MatchMiner
Other tools* APID* Blast2GO* Db for Dummies!* Flash GViewer* FunSpec* FuSSiMeG* Generic GO Term Mapper* Genes2Diseases* GO Slim Mapper* GO Terms Classification Counter* GOBU* GOChase* Ontology Lookup Service
* PANDORA* QuickGO at EBI* TAIR Keyword Browser* Tk-GO
Tools for annotating genes or gene products using GO* g:Profiler* GeneTools* GOanna* GoAnnotator* GoFigure* GoPubMed* GOtcha* HT-GO-FAT* InGOt (proprietary)* InterProScan* JAFA* Manatee* PubSearch
* GOHyperGAll * GoMiner and MatchMiner* Gostat * GoSurfer* GO Term Finder * GOTM (Gene Ontology Tree Machine)* GOToolBox * L2L* Machaon Clustering and Validation Environment* MAPPFinder * MultiGO* NetAffx Gene Ontology Mining Tool* Onto-Compare * Onto-Design* Onto-Express * Onto-Miner* Onto-Translate * OntoGate* Ontologizer * Ontology Traverser* Probe Explorer * SeqExpress* SOURCE* Spotfire Gene Ontology Advantage Application* STEM: Short Time-series Expression Miner* T-Profiler * THEA
* GOChase* GOProfiler* GORetriever* GOSlimViewer* ProteInOn* TXTGate* WEGO* Whatizit
microARNs
Prix Nobel de Médecine 2006Andrew Fire & Craig Mello
� Les microARNs sont de courts brins d’ARNs, d’environ 22 nucléotides appartenant à
la famille des 'smallARN', ne codant pas pour des protéines mais modulant l’expression
de gènes précis.
Andrew Fire & Craig Mello
Exportin-5 : Transport le pre-miARN vers le cytoplasme
Les microARNs: Biogénèse
Le transcrit clivé par Drosha ���� pré-miARN (70 nt)
Les gènes codants pour les miRNAmiARN vers le cytoplasme
Les gènes codants pour les miRNAsont transcrits par l’ARN polymeraseII dans le noyau sous forme d’un longtranscrit ou pri-miRNA
Le duplex est incorporé dans le complexe protéique miRISC
Le brin mature du complexe estpréférentiellement retenu et varéguler négativement son ARNm cible
miRNA Publications/Reserach
miRNAs identifiedin viral genomes
miRNAs identifiedin leukemia
miRNAs discoveredin human, mouse and drosophila
Lin-4: anti-senseRNA c.elegansdevelopment
Nu
mb
er
of
miR
NA
Pu
bli
ca
tio
ns
and drosophila development
Nu
mb
er
of
miR
NA
Pu
bli
ca
tio
ns
Year of Publication
Le séquençage à haut débit
« Le début d'une nouvelle ère »
� 2007 : les séquenceurs à haut débit ont envahi le marché mondial.
� Plusieurs technologies différentes
� Modèles de paillasses plus accessibles
� Dans un futur très proche, on espère pouvoir séquencer un génome entier pour moins de 1 000$...
� Médecine personnalisée ?
Séquenceurs 2ème génération
Séquenceur 454 GS FLX HiSeq 2000 SOLiD 5500XL Ion Proton System
Terminateur de Réaction
séquençagePyroséquençage
Terminateur de
chaîne
réversible
Ligature"proton-
séquençage"
Temps run 10 heures 8 jours 10 jours 2 heures
Taille des lectures
(pb)1000 2x100 2x75 300
Nombre de lectures 1.106 3.109 1.4.109 3.106
Données générées 1 Gb 600 Gb 300 Gb 1 Gb
Les biologistes sont confrontés à un réel problème pour stocker et analyser les données qu'ils produisent
� Séquenceurs de 2ème génération
� révolution technologique : séquençage massif
Encourageant mais encore trop cher ?Encourageant mais encore trop cher ?
• Séquenceurs de 3ème générations
� pas encore au point mais très prometteurs
Longues molécules uniques, faible coût, très rapidementLongues molécules uniques, faible coût, très rapidement
Et dans les prochaines années?Et dans les prochaines années?
Applications du NGS
ARN
ARN immuno-précipité
ARNmARNNon codant
miARN
ADN
Génomeentier
ADNcodant
ADN immuno-précipité
ADNméthylé
ExomeSeq
Mutations/SNP
ChipSeq
Genome de novo
ClipSeq
SmallRNASeqRNASeq
Séquençage de novo
Re-séquençage
InteractionsADN/protéines
MéthylationDe l’ADN
ChipSeq
MeDIPSeqBisulfiteSeq
Interactions ARN/protéines
Séquençage d’ARN
Cellules souches Cellules souches embryonnaires humaines embryonnaires humaines embryonnaires humaines embryonnaires humaines
(CSEh)(CSEh)
Comprendre la pluripotence
Créer la pluripotence
Cellules
médicaments
Applications thérapeutiques majeures
Les cellules souches pluripotentes présentent un potentiel thérapeutique majeur
Cellule souche
pluripotente
Marqueurs membranaires:Antigènes (SSEA-3, SSEA-4)Glycoprotéines (TRA-1-60 et TRA-1-81)
Différenciation in vivo: Formation des tératomes
Génotype et un caryotype
Différenciation in vitro: Endoderme, Ectoderme, Mésoderme
Marqueurs nucléaires: Facteurs de transcription (OCT4, NANOG, SOX2…)
Génotype et un caryotype normaux
Facteurs intrinsèques
La pluripotence des CSEh est sous le contrôle de réseaux de facteurs de transcription (Oct4, NanogY.)
CSEh
Niche
� 38 études originales
� 28 lignées CSEh
� Puce à ADN, SAGE, EST, etc.
� H1, H9, BG01
Comprendre la pluripotence
Une méta-analyse des données indépendantes de transcriptome CSEh
Nouveaux marqueurs de surface des CSEh
CD44 hFFCD24
Purification des CSEh cultivées sur fibroblastes humains par cytometrie de flux.
Assou, S. et al. Stem cells. 2007
CD24
hESC
Nouveaux marqueurs de surface des CSEh
Sémaphorine SEMA6A
Hoechst OCT3/4
SEMA6A OCT3/4 – SEMA6A
Assou, S. et al. Stem cells. 2007
Un bon guide dans la forêt du transcriptome!!
Oct4
Atlas d’expression CSEh25 000 gènes
4 500 échantillons
http://amazonia.montp.inserm.frAssou, S. et al. Stem cells. 2007
� CSEh:
�Système reproductible
�Capacité illimitée de multiplication
�Capacité de différenciation modulable�Capacité de différenciation modulable
�Modélisation in vitro du développement
humain
�Applications thérapeutiques majeures
� Prolifération intense�Différenciation + purification
� Source de cellules embryonnaires� Allogénicité (HLA incompatible)
Limites à un usage thérapeutique
� Allogénicité (HLA incompatible)� Immunosuppression
� Banque de lignées compatibles
� Ethique�Manipulation d’embryon
Reprogrammer une cellule d’un patient en cellule pluripotente pourrait être un moyen d’éviter ces limites
����
SCNT (somatic cell nuclear transfert) Fusion Infection virale
ovocyteCSEh
Stratégies pour induire la reprogrammation des cellules somatiques
� Prendre un ovocyte
� L’énucléer
� Injecter le noyau d’une cellule somatique:
� Fibroblaste � phénotype ES
� Les cellules fusionnées peuvent acquérir des propriétés de pluripotentialité qu’elles ne possédaient pas auparavant
� Tétraploïdes
� Reprogrammation de Fib. en cellules « pluripotentes » par la simple expression dans ces cellules de 4 protéines responsables dans les ES du maintien de l’état pluripotent
LA REPROGRAMMATION
• protocole de Thomson (2007)
• Cocktail de 4 lentivirus• Oct4 + Sox 2 + Nanog + Lin 28
Oct4 Sox2 Lin28Nanog
• Oct4 + Sox 2 + Nanog + Lin 28
• Reprogrammation de
fibroblastes
• Génération de la lignée des iPS
induced pluripotent stem cells (hiPS)
Lentiviruses
Fibro iPS cells CSEh
Qualification : Transcriptome
fibroblast
il est encore nécessaire d’approfondir les mécanismes qui conduisent à la pluripotence,
afin de permettre une meilleure compréhension des mécanismes de la reprogrammation
TheTheTheThe NobelNobelNobelNobel PrizePrizePrizePrize inininin PhysiologyPhysiologyPhysiologyPhysiology orororor MedicineMedicineMedicineMedicine
2012201220122012 waswaswaswas awardedawardedawardedawarded jointlyjointlyjointlyjointly totototo SirSirSirSir JohnJohnJohnJohn BBBB....
GurdonGurdonGurdonGurdon andandandand ShinyaShinyaShinyaShinya YamanakaYamanakaYamanakaYamanaka "for"for"for"for thethethetheGurdonGurdonGurdonGurdon andandandand ShinyaShinyaShinyaShinya YamanakaYamanakaYamanakaYamanaka "for"for"for"for thethethethe
discoverydiscoverydiscoverydiscovery thatthatthatthat maturematurematuremature cellscellscellscells cancancancan bebebebe
reprogrammedreprogrammedreprogrammedreprogrammed totototo becomebecomebecomebecome pluripotent"pluripotent"pluripotent"pluripotent"
CSEh & OvocyteCSEh & OvocyteCSEh & OvocyteCSEh & Ovocyte
mécanique de la reprogrammationmécanique de la reprogrammation
Ovocyte
Comprendre la mécanique de la reprogrammation
5 Days
Les ovocytes & CSEh sont deux types cellulaires capables de reprogrammer
les cellules somatiques en cellules pluripotentes
Ovocyte MII
CSEh
Ovocyte MII
CSEh
Tissues Number of
samples
human embryonic stem cells 29
human mature oocytes 9
human foreskin fibroblasts 4
ovary 3
central nervous system 44
peripheral nervous system 18
tissu
s s
om
ati
qu
es
167 Ech.
205 Ech.
skin and keratinocytes 6
lung 11
digestive tract 19
thyroid 5
adipocytes 2
kidney and prostate 6
heart and muscle 10
hematopoietic tissues 30
uterus 6
placenta 3
tissu
s s
om
ati
qu
es
Ovocytes et cellules souches embryonnaires : convergence de leur transcriptome
Principal component analysis (PCA)
Assou, S. et al. BMC Genomics. 2009
Signatures “ovocytaire” et “CSEh”
� Gènes sp ovocytes vsvs gènes sp CSEh
Ovocyte vs tissus
somatiques
CSEh vs tissus
somatiques
Assou, S. et al. BMC Genomics. 2009
Les gènes communs ovocyte/CSEh ont une localisation intracellulaire
Assou, S. et al. BMC Genomics. 2009
Remaniement chromatinien
Réseaux moléculaires (I)
exprimé
non détecté
Surexpression(ovocyte et hESC)
la machinerie cellulaire responsable du remaniement chromatinien est fortement surexprimée dans les ovocytes et les CSEh par rapport aux tissus somatiques
Réseaux moléculaires (II)le protéasome et le système d’ubiquitination
Protéasome 26S(composé du noyau protéolytique 20S et du domaine régulateur 19S).
Le protéasome exerce une activité protéasique et joue un rôle central dans le contrôle de la stabilité des protéines dans la cellule et peut être dans la transcription
Assou, S. et al. BMC Genomics. 2009
Diminution d’expression des sous-unités du protéasome au cours de la différenciation des CSEh
La forte expression des protéasomes dans les CSEh et leur diminution au cours de la
différenciation suggère le rôle important de la machinerie protéasome dans le
maintien de la pluripotence.
Assou, S. et al. BMC Genomics. 2009
les CSEh sont très sensibles à l'inhibition de l'activité du protéasome
MG132, a specific proteasome inhibitorAssou, S. et al. BMC Genomics. 2009
Les fibroblastes ne sont pas sensibles à l'inhibition de l'activité du protéasome
human foreskin fibroblasts (HFF)
P4H: Proline-4-Hydroxylase
Les fibroblastes like ne sont pas sensibles à l'inhibition de l'activité du protéasome
hES-dF (fibroblasts like)
Assou, S. et al. BMC Genomics. 2009
CSEh
les CSEh sont très sensibles à l'inhibition de l'activité du protéasome
Oct4Fibroblastes CSEh
RT-PCR Flow cytometry analysis
Assou, S. et al. BMC Genomics. 2009
� blocage protéasome ���� différenciation
Conclusion
� Puces à ADN : saut technologique +++
� Application aux cellules souches:
� Recherche� Recherche
� Routine
Assistance médicale à la procréation Assistance médicale à la procréation
Robert Geoffrey Edwards (Prix Nobel de médecine 2010)
L’apparition de la fécondation in vitro en 1978 a permis de traiter en partie les problèmes de stérilité humaine. Depuis, les demandes d’Assistance médicale à la procréation augmentent chaque année.
����
� De nombreux couples désirent une grossesse, mais ne peuventavoir d’enfants, parce que l’homme n’a pas de spermatozoïdes oula femme n’a pas d’ovocytes de bonne qualité. Une solution à cesproblèmes est le don de gamètes
Assistance médicale à la procréation
���� Depuis quelques années, les centres gérant le don despermatozoïdes et d’ovocytes connaissent une pénurie dedonneurs. L’offre de gamètes ne permet plus de répondre à lademande des couples.
Disposer d’une source abondante de gamètes modifierait lespratiques actuelles de l’AMP et pourrait résoudre en partie leproblème d’infertilité
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Fécondation Masse cellulaire
interne
Est-il concevable d’obtenir in vitro des gamètes artificiels à partir des CSEh ou iPS?
blastocyste
CSEh iPS
?
Ovocyte
In vitro
Chez la souris
Des CSE aux gamètes
Assou, S. et al. GOF, 2008
L’impact du microenvironnement dans lequel sont cultivées les CSE semble êtred’importance capitale pour l’obtention de l’ovogenèse ou la spermatogenèse
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Cellules souches embryonnaires
Culture en 2D
Obtention des ovocytes à partir des CSEm
ovocyte
Blastocyste
Activation spontanée
En 2003 Hübner et al ont pour la première fois
rapporté l’obtention de gamètes femelle
dérivés de CSE de souris
Early Primary Follicle-like
Formation of FollicleFormation of Follicle--like Structureslike Structures
Obtention des structures ovocytaires et folliculaires à partir des CSEm
Follicle-like Structure
Secondary Follicle-like Structure
Hübner et al. 2003 Science
Detection of Androgen Precursors
� Detection of estradiol in cultures suggest functional activity of somatic cells in follicle-like structures
� Levels of estradiol detected around day 12 and peaked around day 20
BlastocystBlastocyst--like like CellsCells
OocyteOocyte--like like CellsCells
Obtention des ovocytes puis des blastocystes à partir des CSEm
Hübner et al. 2003 Science
Après 26 jours Après 43 jours
L’équipe dirigée par le Pr SaitoMitinori à réussi à obtenir des cellulesgerminales à partir des iPS de souris
Placées dans des ovaires, ces cellulesgerminales ont permis d'obtenir desovocytes au bout de quatre semaines
Obtention des ovocytes fonctionelles à partir des iPS
K Hayashi et al. Science 2012;338:971-975
ovocytes au bout de quatre semaines
Après FIV, ces ovocytes ont étéréimplantés dans des utérus de souriset ont permis de donner naissancetrois semaines plus tard à trois bébéssouriceaux en parfaite santé.
Devenus adultes, ces rongeurs ont àleur tour pu donner naissance de façon‘classique’ à une portée.
Cellules souches embryonnaires
Culture en 3D (EB)
Obtention des gamètes mâles à partir des CSEm
L’équipe de K. Nayernia a mis en
évidence l’extraordinaire capacité des
CSE de souris à se transformer en
Sperme
Spermatide
Cellules germinales primordiales
CSE de souris à se transformer en
gamètes mâles fonctionnel
Obtention des gamètes mâles à partir des CSEm
Les chercheurs ont pu obtenir des spermatides en trois jours
Ils montrent que ces gamètes mâles sont fonctionnels et capables de féconder
l’ovocyte, produire un blastocyste et assurer la naissance de sept souriceaux
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Nayernia K et al. Dev Cell 2006
Principales études décrivant la différenciation in vitro de cellules germinales à partir des CSE
AC, aggregation cultures with cells producing growth factors
SD, spontaneous differentiation
EBs, embryoid bodies
Imaginons que la fertilité des femmes ne serait plus limitée à la
La génération des gamètes artificiels à partir des cellules souchesreprésente donc un intérêt majeur pour le traitement de l’infertilité
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Life is endowed
with a
mysterious and
divine life-force
Imaginons que la fertilité des femmes ne serait plus limitée à laménopause, et que les situations d’azoospermie verraient une solutionà la préservation ultérieure de la fertilité?
Imaginons qu’une personne pourra prétendre également à procréeravec des gamètes issus de ses propres cellules?
Serait-il possible un jour de déterminer à partir de même individu desgamètes mâles et femelles et leurs fécondation mutuelle donnerait unereproduction mono-parentale, avec les conséquences de laconsanguinité?
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Perspectives
L’ensemble des données obtenues à ce jour participe à unemeilleure compréhension des mécanismes impliqués dans ladifférenciation et le développement de la lignée germinale.Cependant, se posent de nouvelles questions dont la résolutionest indispensable pour la réalisation d’une ovogenèse ouspermatogenèse fonctionnelle.
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spermatogenèse fonctionnelle.
Séquençage à haut débit: Analyse du génome d’un
seul ovocyte humain
Hou et al. 2013 Cell. Dec 19;155(7)